JPH10201482A - カルシトニン遺伝子関連ペプチド受容体成分因子（ｈｏｕｄｃ４４） - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒト・カルシトニン遺伝子に関連したペプチ
ド受容体因子のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを
提供する。 【解決手段】 （ａ）配列番号：２のアミノ酸を含んで
なるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに
対して少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオ
チド； （ｂ）遺伝コードの縮重により、配列番号：２のアミノ
酸と同じアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチ
ド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに対して
相補的なポリヌクレオチド；および （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド
の少なくとも１５個の塩基を含んでなるポリヌクレオチ
ド からなる群より選択されるメンバーを含んでなる単離ポ
リヌクレオチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する分野】本発明は、一部には、新たに同定
されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド；該ポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドの変種および誘導体；該
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造方法、該ポ
リペプチドのアンタゴニストおよびアゴニスト；ならび
にポリヌクレオチド、ポリペプチド、変種、誘導体、ア
ゴニストおよびアンタゴニストの使用に関する。詳細に
は、これらの点および他の点において、本発明は、ヒト
・カルシトニン遺伝子関連ペプチド受容体成分因子（以
後「ＣＧＲＰ−ＲＣＦ」という）のポリヌクレオチドお
よびポリペプチドに関する。

【０００２】

【従来の技術】カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧ
ＲＰ）は３７個のアミノ酸から構成されるカルボキシ末
端がアミド化された神経ペプチドであり、中枢神経およ
び末梢神経系により分泌され、ヒトおよびラットの両方
において高度に相同的なαまたはβイソ形態として存在
する（Amara,et al.Nature 298:240-244(1982);Amara,e
t al.Science 229:1094-1097(1985)）。α−およびβ−
ＣＧＲＰは非常に類似した生物学的活性を示し、該活性
には末梢および脳の血管拡張（Brain,et al.,Nature 31
3:54-56(1985)）、心拍数増加（Sigrist,et al.,Endocr
inilogy 119:381-389(1986)）、カルシウム代謝調節（G
runditz,et al.,Endocrinology 119:2313-2324(198
6)）、腸運動低下（Fargeas,et al.,Peptides 6:1167-1
171(1985)）、グルコース代謝調節（インスリン分泌お
よびインスリン感受性の低下）（Hermansen,et al.,Re
g.Peptides 27:149-157(1990)）、食欲抑制（Molina,et
al.,Diabetes 39:260-265(1990)）および成長ホルモン
放出抑制（Tannenbaum,et al.,Endocrinology 116:2685
-2687(1985)）が包含される。２種のＣＧＲＰペプチド
は、ヒトにおいては３個のアミノ酸が異なり、ラットに
おいては１個のアミノ酸が異なる。ＣＧＲＰペプチドの
アミノ酸配列は種間で十分に保存されており、関連ペプ
チドであるアミリン（相同性４６％）、サケ・カルシト
ニン（相同性３２％）、およびアドレノメジュリン（相
同性２４％）を包含するペプチドのファミリーのメンバ
ーであると考えられる。一般的には、これらのペプチド
は、ジスルフィド架橋を含む６ないし７個のアミノ酸の
Ｎ−末端環構造およびアミド化されたＣ末端を有してい
る（Muff,et al.,Eur J Endocrinol.133:17-20(1995);G
oodman,et al.,Life Sci.38:2169-2178(1986);Poyner,
D.R.Pharmac.Ther.56:23-51(1992)）。

【０００３】ＣＧＲＰペプチドは主に感覚求心性神経お
よび中枢神経に局在化している（Goodman,et al.,Life
Sci.38:2169-2178(1986);Poyner,D.R.Pharmac.Ther.56:
23-51(1992)）。細胞から放出されると、そのペプチド
は、主にアデニルシクラーゼの活性化に連動した特異的
細胞表面受容体への結合によって生物学的応答を開始す
る（Brain,et al.,Nature 313:54-56(1985);Kubota,et
al,Biochem Biophys Res Commun 132:88-94(1985)）。
ＣＧＲＰ受容体は同定されており、脳、心臓血管系、内
皮および平滑筋を包含するいくつかの組織および細胞に
おいて薬理学的に評価されている（Poyner,D.R.Pharma
c.Ther.56:23-51(1992)）。薬理学的特性に基づいて複
数のＣＧＲＰ受容体が観察されている。これらの受容体
は少なくとも２つのサブタイプに分類され、Dennisおよ
びその共同研究者の分類（Dennis,et al.,Brain Res.53
9:59-66(1991)）によればＣＧＲＰ₁およびＣＧＲＰ₂と
呼ばれる。７個のＮ末端アミノ酸残基を欠くＣＧＲＰ
（Molina,et al.Diabetes 39:260-265(1990);Tannenbau
m,et al.,Endocrinilogy 116:2685-2687(1985);Muff,et
al.,Eur J Endocrinol.133:17-20(1995);Goodman,et a
l.,Life Sci.38:2169-2178(1986);Poyner,D.R.,Pharma
c.Ther.56:23-51(1992);Kubota,et al.,Biochem Biophy
s Res Commun.132:88-94(1985);Dennis,et al.,Brain R
es.539:59-66(1991);Adams,et al.,Science 252:1651-1
656(1991);Adams,et al.,Nature 355:632-634(1992);Ad
ams,et al.,Nature 377:3-174(1995);Chang,et al.,Neu
ron 11:1187-1195(1993);Fluhmann,et al.,Biochem.Bio
phys.Res.Commun.206:341-347(1995);Jelinek,et al.,S
cience 259:1614-1616(1993);Kozak,M.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.(USA),92:2662-2666(1995);Aiyar,et al.,Mol.Ce
ll.Bio.131:75-86(1994);Sambrook,et al.,Molecular C
loning.Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989);N
uovo,J.G.,PCR in situ Hybridization:protocols and
applications.Raven Press,New York(1992);Aiyar,et a
l.Endocrinology 129:965-969(1991);Lin,et al.,Scien
ce 254:1022-1024(1991);Hirata,et al.,Biochem.Bioph
y.Res.Commun.151:1113-1121(1988);Nawa,et al.,Natur
e 312:729-734(1984);Kozak,M.J.,Mol.Biol.196:947-95
0(1987);Dohlman,et al.,Annu.Rev.Biochem.60:653-688
(1991);Jackson,T.,Pharmacol.Ther.50:425-442(1991);
Ishihara,et al.,EMBO J.,10:1635-1641(1991);Juppne
r,et al.,Science 254:1024-1026(1991):Thorens,B.,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA,89:8641-8645(1992);van Valen,
et al.,Neurosci.Lett.119:195-198(1990);Stangl,et a
l.,Endocrinology 132:744-750(1993);Kitamura,et a
l.,FEBS Lett.,338:306-310(1994)）はＣＧＲＰ１受容
体の選択的アンタゴニストであるが、ＣＧＲＰの直鎖状
アナログであるジアセトアミドメチルシステインＣＧＲ
Ｐ（{Ｃｙｓ(ＡＣＭ)２,７}ＣＧＲＰ）はＣＧＲＰ２受
容体の選択的アゴニストである（Dennis,et al.,Brain
Res.539:59-66(1991)）。

【０００４】上記のごとく、ＣＧＲＰは体内において雑
多な機能を有しており、最も有効な血管拡張剤および神
経転調物質であることが知られている。我々はヒト・Ｃ
ＧＲＰ−タイプＩ受容体をコードしているｃＤＮＡを最
近報告したが（Aiyar et al.,Journal of Biological C
hemistry 271:11325-11329(1996)）、我々は特徴づけの
研究の過程において、その受容体はXenopus卵母細胞、
一時的に発現しているＣＯＳ細胞および安定に発現して
いるバキュロウイルスおよびDrosophila細胞においてＣ
ＧＲＰ応答性を付与しないことを観察した。これらの観
察結果とは対照的に、我々は、安定にトランスフェクシ
ョンされたヒト・胚腎臓２９３細胞においてかなりのレ
ベルのＣＧＲＰ応答性を付与することができた。これら
の観察結果は、これらの異種系のすべてにおけるＣＧＲ
Ｐ受容体の機能のカップリングのためのさらなるヒト・
相補的因子の必要性を示唆するものである。

【０００５】最近、Luebkeら（Proc.Natl.Acad.Scienc
e,93:3455-3460(1996)）は、卵母細胞においてＣＧＲＰ
応答性を付与する蛋白（ＣＧＲＰ受容体成分蛋白）をコ
ードしているモルモット・ｃＤＮＡを単離するための発
現クローニング法を用いた。この情報を用い、発現配列
タグ（ＥＳＴ）分析（Adams,et al.,Nature 355:632-63
4(1992);Adams,et al.,Nature 377:3-174(1955)）を用
いて、我々は、モルモット・ＣＧＲＰ−ＲＣＰに対する
ヒト・相同体を同定した。全長のｃＤＮＡクローンはヒ
ト・脂肪細胞破骨細胞腫ｃＤＮＡライブラリーから同定
されている。

【０００６】多くのグループが、いくつかの７ＴＭ受容
体のための異種系における機能的シグナリングのための
相補的ＲＣＦｓに対する絶対的必要性を示しているが
（JBC266:12560,1991およびFEBS Lett.291:208,199
1）、これらの特別な因子をコードしているｃＤＮＡを
単離することに成功していない。

【０００７】異種系におけるＣＧＲＰタイプＩ受容体の
発現に必要な相補的ヒト・因子の同定および単離は、当
該受容体により活性化されるシグナリング経路をより正
確に記述し、あるいは該経路を促進するための機会を提
供する。このことは、まだリガンドが未知であるＧ−蛋
白結合受容体をコードしていると考えられる増加しつつ
ある希少疾病ｃＤＮＡｓを機能的に同定するための新規
方法も提供する。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】ＣＧＲＰ受容体のシグ
ナル変換を修正し、機能不全および疾病におけるそれら
の役割を調べるための因子が必要であることは明らかで
ある。それゆえ、糖尿病、偏頭痛、痛みおよび炎症のご
とき（これらに限らない）機能不全または疾病を予防、
改善または修正することにおいて役割を果たしうるかか
る因子の同定および特徴付けに対する必要性がある。

【０００９】

【課題を解決するための手段および発明の実施の形態】
上記事情に鑑み、本発明は、ポリペプチド、とりわけ、
図１に示すアミノ酸配列と、Luebke（Proc.Natl.Acad.S
ci.93:3455-3460(1966)）により記載されたモルモット
・ＣＧＲＰ−ＲＣＰのごとき他の蛋白の既知アミノ酸配
列との間の相同性により新規ＣＧＲＰ−ＲＣＦであると
同定されたポリペプチドを提供することを目的とする。

【００１０】そのうえ、ＣＧＲＰ−ＲＣＦをコードして
いるポリヌクレオチド、詳細には、本明細書においてＣ
ＧＲＰ−ＲＣＦと命名されたポリペプチドをコードして
いるポリヌクレオチドを提供することが本発明のさらな
る目的である。

【００１１】本発明の特に好ましい具体例において、該
ポリヌクレオチドは、図１に示す配列中のヒト・ＣＧＲ
Ｐ−ＲＣＦをコードする領域を含んでなる。

【００１２】本発明の態様によれば、ＡＴＣＣ番号９８
１０５中に含まれるヒト・ｃＤＮＡにより発現されるポ
リペプチドをコードしている単離核酸分子が提供され
る。

【００１３】本発明の態様によれば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡを包含するヒト・ＣＧＲＰ−ＲＣＦを
コードする単離核酸分子が提供され、さらに本発明態様
の具体例において、その生物学的に、診断上、臨床的に
または治療的に有用な変種、アナログまたは誘導体、あ
るいは上記変種、アナログおよび誘導体のフラグメント
を包含するそれらのフラグメントが提供される。

【００１４】ヒト・ＣＧＲＰ−ＲＣＦの天然に存在する
対立遺伝子変種は本発明の特に好ましい具体例に含まれ
る。

【００１５】治療目的、例えば、糖尿病、偏頭痛、痛み
および炎症、パーキンソン病、急性心臓疾患、低血圧、
残尿、骨粗鬆症、高血圧、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘
息、アレルギー、精神病、鬱病、嘔吐、良性前立腺肥大
症、パジェット病、肥満、癌、巨人症等を治療するため
に用いることのできるられうるＣＧＲＰ−ＲＣＦポリペ
プチド、詳細にはヒト・ＣＧＲＰ−ＲＣＦポリペプチド
を提供することも本発明の目的である。

【００１６】本発明の態様によれば、本明細書において
ＣＧＲＰ−ＲＣＦと呼ばれるヒト由来の新規ポリペプチ
ド、ならびにその生物学的、診断上または治療上有用な
フラグメント、変種および誘導体、そのフラグメントの
変種および誘導体、および上記のもののアナログが提供
される。

【００１７】ヒト・ＣＧＲＰ−ＲＣＦ遺伝子の天然に存
在する対立遺伝子によりコードされるヒト・ＣＧＲＰ−
ＲＣＦの変種が本発明のこの態様の特に好ましい具体例
に含まれる。

【００１８】本発明のもう１つの態様によれば、ＣＧＲ
Ｐ受容体またはＣＧＲＰ／ＣＧＲＰ−ＲＣＦ受容体ポリ
ペプチドに結合し、それを活性化または活性化阻害する
化合物のスクリーニング、および受容体リガンドのスク
リーニング方法が提供される。

【００１９】上記ポリペプチド、ポリペプチドフラグメ
ント、変種および誘導体、変種および誘導体のフラグメ
ント、ならびに上記のもののアナログの製造方法を提供
することが本発明のもう１つの目的である。

【００２０】本発明のこの態様の好ましい具体例におい
て、発現可能に導入された外来のヒト・ＣＧＲＰ−ＲＣ
Ｆをコードしているポリヌクレオチドを有する宿主細胞
を、宿主中でのヒト・ＣＧＲＰ−ＲＣＦの発現のための
条件下で培養し、次いで、発現したポリペプチドを回収
することを特徴とする、上記ＣＧＲＰ−ＲＣＦポリペプ
チドの製造方法が提供される。

【００２１】本発明のもう１つの目的によれば、特に、
研究、生物学、臨床および治療目的に上記ポリペプチド
およびポリヌクレオチドを用いる製品、組成物、手順お
よび方法が提供される。

【００２２】本発明の特定の好ましい具体例によれば、
特に、他の事に使用する製品、組成物および方法も提供
され、他の事とは：ＣＧＲＰ−ＲＣＦポリペプチドまた
はＣＧＲＰ−ＲＣＦをコードしているｍＲＮＡを調べる
ことによる細胞中のＣＧＲＰ−ＲＣＦ発現の評価；本明
細書開示のＣＧＲＰ−ＲＣＦポリペプチドまたはポリヌ
クレオチドに細胞を曝露することによるインビトロ、エ
クスビボまたはインビボでの糖尿病、偏頭痛、痛みおよ
び炎症、パーキンソン病、急性心臓疾患、低血圧、残
尿、骨粗鬆症、高血圧、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘
息、アレルギー、精神病、鬱病、嘔吐、良性前立腺肥大
症、パジェット病、肥満、癌、巨人症等の治療；ＣＧＲ
Ｐ−ＲＣＦ遺伝子における欠失のごとき遺伝学的変種お
よび変状のアッセイ；およびＣＧＲＰ−ＲＣＦ機能の増
大またはＣＧＲＰ−ＲＣＦ機能不全の治癒のための器官
へのＣＧＲＰ−ＲＣＦポリペプチドまたはその活性フラ
グメントまたはポリヌクレオチドの投与である。

【００２３】本発明のさらなる具体例によれば、ＣＧＲ
Ｐ−ＲＣＦの発現低下に関連した症状の治療のための、
ＣＧＲＰ−ＲＣＦ受容体ポリペプチドを刺激する活性化
化合物の使用方法が提供される。

【００２４】本発明のもう１つの態様によれば、ＣＧＲ
Ｐ−ＲＣＦの過剰発現に関連した症状を治療するための
阻害化合物の使用方法が提供される。

【００２５】本発明のさらなる態様によれば、非天然合
成、単離および／または組み換えＣＧＲＰ−ＲＣＦポリ
ペプチドが提供され、それらは、本発明ＣＧＲＰ−ＲＣ
Ｆのフラグメント、コンセンサスフラグメントおよび／
または保存的アミノ酸置換を有する配列、少なくとも１
のドメインであり、それらのＣＧＲＰ−ＲＣＦはＣＧＲ
Ｐ受容体リガンドまたはＣＧＲＰ受容体に結合でき、あ
るいはＣＧＲＰ受容体リガンド結合を定性的または定量
的に転調させることもできる。

【００２６】本発明のさらにもう１つの態様によれば、
合成または組み換えＣＧＲＰ−ＲＣＦポリペプチド、保
存的置換物およびそれらの誘導体、抗体、抗−イディオ
タイプ抗体、組成物および方法が提供され、それらは、
ＣＧＲＰ受容体リガンドまたはＣＧＲＰ受容体に結合
し、あるいはリガンド結合を転調させることにより、Ｃ
ＧＲＰ−ＲＣＦ機能の有効なモジュレーターとして有用
であり、それらは診断、治療および／または研究用途に
用いることができる。

【００２７】種々のＣＧＲＰ−ＲＣＦまたはそれらのフ
ラグメントを阻害または模倣するように設計された合
成、単離または組み換えポリペプチドを提供することが
本発明のさらにもう１つの目的である。

【００２８】本発明のこの態様および他の態様の好まし
い具体例によれば、ヒト・ＣＧＲＰ−ＲＣＦ配列にハイ
ブリダイゼーションするプローブが提供される。

【００２９】本発明のこの態様のさらなる好ましい具体
例において、ＣＧＲＰ−ＲＣＦポリペプチドに対する抗
体が提供される。この点において、特に好ましい具体例
において、抗体はヒト・ＣＧＲＰ−ＲＣＦに対して非常
に選択的である。

【００３０】本発明のこの態様のさらに好ましい具体例
において、ＣＧＲＰ−ＲＣＦアゴニストが提供される。
ＣＧＲＰ−ＲＣＦを模倣し、ＣＧＲＰ−ＲＣＦ−結合分
子または受容体分子に結合し、ＣＧＲＰ−ＲＣＦにより
誘導される応答を誘発または増大させる分子は好ましい
アゴニストに含まれる。ＣＧＲＰ−ＲＣＦまたはＣＧＲ
Ｐ−ＲＣＦポリペプチド、あるいはＣＧＲＰ−ＲＣＦ活
性を有する他のモジュレーターと相互作用し、そのこと
によりＣＧＲＰ−ＲＣＦの１つの効果またはＣＧＲＰ−
ＲＣＦの１つよりも多い効果を有効ならしめ、あるいは
増大させる分子も好ましいアゴニストに含まれる。

【００３１】本発明のさらなる態様によれば、ＣＧＲＰ
−ＲＣＦアンタゴニストが提供される。ＣＧＲＰ−ＲＣ
Ｆを模倣してＣＧＲＰ−ＲＣＦ受容体または結合分子に
結合するがＣＧＲＰ−ＲＣＦにより誘導される１つの応
答またはＣＧＲＰ−ＲＣＦにより誘導される１つよりも
多い応答を誘発しないものは好ましいアンタゴニストに
含まれる。ＣＧＲＰ−ＲＣＦと結合または相互作用して
ＣＧＲＰ−ＲＣＦの１つの効果またはＣＧＲＰ−ＲＣＦ
の１つよりも多い効果を阻害し、あるいはＣＧＲＰ−Ｒ
ＣＦの発現を妨げる分子も好ましいアンタゴニストに含
まれる。

【００３２】本発明のさらなる態様において、インビト
ロで細胞に、エクスビボで細胞に、さらにはインビボで
細胞に投与される、あるいは多細胞器官に投与されるＣ
ＧＲＰ−ＲＣＦポリヌクレオチドまたはＣＧＲＰ−ＲＣ
Ｆポリペプチドを含んでなる組成物が提供される。本発
明のこの態様の特定の好ましい具体例において、組成物
は、疾病の治療のための宿主生物中でのＣＧＲＰ−ＲＣ
Ｆポリペプチド発現のためのＣＧＲＰ−ＲＣＦポリヌク
レオチドを含んでなる。この点に関して、変化した内在
ＣＧＲＰ−ＲＣＦ活性に関連した機能不全の治療のため
のヒト患者における発現が特に好ましい。

【００３３】本発明の他の態様、特徴、利点および態様
は下記説明から当業者に明らかとなろう。しかしなが
ら、下記説明および特定の実施例は、本発明の好ましい
具体例を示すものであるが、説明のためだけのものであ
ることを理解すべきである。本発明の精神の範囲内での
種々の変更および修飾は、下記説明を読み、本開示の他
の部分を読めば当業者に容易に明らかとなろう。

【００３４】下記の説明は本明細書、特に実施例におけ
る特定の用語の理解を容易にするためのものである。

【００３５】「ＤＮＡの消化」とは、ＤＮＡ中の特定配
列にのみ作用する制限酵素でのＤＮＡの触媒的開裂をい
う。本明細書の種々の制限酵素は市販されており、それ
らの反応条件、コファクターおよび使用される他の必要
物は知られており、当業者にとり日常的である。

【００３６】分析目的には、典型的には、２０μｌの反
応バッファー中で１μｇのＤＮＡフラグメントを約２ユ
ニットの酵素で消化する。プラスミド構築用のＤＮＡフ
ラグメントの単離目的には、典型的には、反応規模に応
じて反応体積を増加させて５ないし５０μｌのＤＮＡを
２０ないし２５０ユニットの酵素で消化する。

【００３７】個々の制限酵素に適するバッファーおよび
基質量は標準的な研究室用マニュアル、例えば、後に引
用する文献に記載されており、それらは市販業者により
詳述されている。

【００３８】３７℃で１時間のインキュベーション時間
を通常使用するが、標準的手順、販売者の指示および個
々の反応に応じて条件を変化させてもよい。消化後、反
応物を分析することができ、当業者にとり日常的な既知
方法を用いてアガロースまたはポリアクリルアミドゲル
ゲルによりフラグメントを精製することができる。

【００３９】「遺伝学的エレメント」とは、一般的に
は、ポリペプチドをコードしている領域、あるいは転写
または翻訳または宿主細胞におけるポリペプチドの発現
にとり重要な他のプロセスを調節する領域を含んでなる
ポリヌクレオチドを意味し、あるいはポリペプチドをコ
ードしている領域および発現調節領域に作動可能に連結
された領域の両方を含んでなるポリヌクレオチドを意味
する。

【００４０】遺伝学的エレメントはベクター中に含まれ
ていてもよく、ベクターはエピソームエレメントとして
複製するものであり、すなわち、宿主細胞ゲノムとは物
理的に独立した分子として複製するものである。遺伝学
的エレメントは、真核細胞におけるメトトレキセート選
択によりトランスフェクションされたＤＮＡの増幅期間
中に生じるようなミニ染色体に含まれていてもよい。遺
伝学的エレメントは宿主細胞ゲノムに含まれていてもよ
く、それらは天然の状態でなないが、特に、精製ＤＮＡ
またはベクター中の形態で単離、クローニングおよび宿
主細胞中へ導入される。

【００４１】「単離」とは、「人の手」によって天然状
態から変化させられていることを意味し、すなわち、天
然において単離される場合には、本来の環境から変化さ
せられ、あるいは本来の環境から除去されること、ある
いはその両方を意味する。

【００４２】例えば、天然状態の生きた動物中に存在す
る天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単
離」されていないが、天然状態における共存物質から分
離されている同じポリヌクレオチドまたはポリペプチド
は、本明細書の用語によれば「単離」されたものであ
る。例えば、ポリヌクレオチドに関しては、用語「単
離」は、それが天然において存在している染色体および
細胞から分離されていることを意味する。

【００４３】単離工程の一部として、あるいは単離後
に、例えば、突然変異により融合蛋白を得るために、そ
して宿主中での増殖または発現のために、かかるポリヌ
クレオチドをＤＮＡのごとき他のポリヌクレオチドに結
合させることができる。単離ポリヌクレオチドは、単独
またはベクターのごとき他のポリヌクレオチドと結合さ
れて、培養細胞または生物そのものに導入されうる。培
養宿主細胞または生物そのものへ導入された場合、本明
細書の用語によれば、かかるＤＮＡはやはり単離される
ものである。なぜなら、それらは天然に存在する形態で
なく、あるいは天然環境に存在するものでないからであ
る。同様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、
例えば、培地処方、ポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ドの例えば細胞中への導入のための溶液、化学反応また
は酵素反応のための組成物または溶液（それらは天然に
は存在しない組成のものであり、その中で単離ポリヌク
レオチドまたはポリペプチドは本明細書にいう単離され
た状態となっている）の中に存在しうる。

【００４４】「連結」とは、しばしば２本鎖ＤＮＡであ
る２個またはそれ以上のポリヌクレオチド間のホスホジ
エステル結合形成プロセスをいう。連結方法は当該分野
においてよく知られており、連結プロトコールは標準的
な研究室用マニュアルおよび文献に記載されており、例
えば、Sambrook et al.,MOLECULAR CLONING,A LABORATO
RY MANUAL,2nd Ed;Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss,Cold Spring Harbor,New York(1989)（「Sambrook」
という）および下で引用するManiatis et al.,の１４６
頁に記載されている。

【００４５】「オリゴヌクレオチド」とは比較的短いポ
リヌクレオチドをいう。しばしば、該用語は１本鎖デオ
キシリボヌクレオチドをいうが、１本鎖または２本鎖リ
ボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドおよびと
りわけ２本鎖ＤＮＡも指すことがある。

【００４６】１本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチド
のごときオリゴヌクレオチドは、しばしば、自動オリゴ
ヌクレオチド合成のごとき化学的方法により合成され
る。しかしながら、オリゴヌクレオチドを種々の方法に
より製造することができ、それらはインビトロ組み換え
ＤＮＡによる方法ならびに細胞および生物におけるＤＮ
Ａ発現による方法を包含する。

【００４７】化学合成されたＤＮＡは、典型的には最初
に５’リン酸を欠く形で得られる。かかるオリゴヌクレ
オチドの５’末端は、典型的には組み換えＤＮＡ分子を
得るためにＤＮＡリガーゼを用いる連結反応によるホス
ホジエステル結合形成の基質ではない。かかるオリゴヌ
クレオチドの連結が所望の場合には、キナーゼおよびＡ
ＴＰを用いるような標準的方法によりリン酸を付加する
ことができる。

【００４８】一般的には、化学合成されたオリゴヌクレ
オチドの３’末端はヒドロキシル基を有しており、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼのごときリガーゼの存在下で、もう１
つのオリゴヌクレオチドのごとき別のポリヌクレオチド
の５’リン酸とホスホジエステル結合を容易に形成する
であろう。よく知られているように、所望ならば、連結
の前に他のポリヌクレオチドの５’リン酸を除去するこ
とにより、この反応を選択的に防止することができる。

【００４９】一般的には本明細書において「プラスミ
ド」は、当業者によく知られた慣用的命名法により、大
文字および／または数字が前および／または後に続く小
文字のｐにより命名される。本明細書開示の出発プラス
ミドは市販のもの、制限なく公的に利用可能なものであ
るか、あるいはよく知られた公表された方法を用いて利
用可能なプラスミドから日常的に構築可能なものであ
る。本発明により使用可能な多くのプラスミドならびに
他のクローニングおよび発現ベクターはよく知られてお
り、当業者が容易に入手できるものである。そのうえ、
当業者は、本発明における使用に適するどのような数の
プラスミドであっても容易に構築することができる。本
発明におけるかかるプラスミドならびに他のベクターの
特性、構築および使用は、本開示から当業者に容易に明
らかとなろう。

【００５０】一般的には、「ポリヌクレオチド」とはポ
リリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチ
ドをいい、未修飾ＲＮＡまたはＤＮＡあるいは修飾ＲＮ
ＡまたはＤＮＡであってよい。よって、本明細書の用語
ポリヌクレオチドは、特に、１本鎖および２本鎖ＤＮ
Ａ、１本鎖および２本鎖領域の混ざったＤＮＡ、１本鎖
および２本鎖ＲＮＡ、および１本鎖および２本鎖領域の
混ざったＲＮＡをいい、より典型的には、２本鎖のもの
または１本鎖および２本鎖領域の混ざったものをいう。

【００５１】さらに、本明細書の用語ポリヌクレオチド
は、ＲＮＡまたはＤＮＡあるいはＲＮＡおよびＤＮＡの
両方を含んでなる３本鎖をいう。かかる領域中の鎖は同
じ分子由来であってもよく、また異なる分子由来であっ
てもよい。その領域は１つまたはそれ以上の分子の全体
を含みうるが、典型的には、いくつかの分子の１の領域
を含む。３本鎖らせん領域の分子の１つは、しばしば、
１のオリゴヌクレオチドである。

【００５２】本明細書の用語ポリヌクレオチドは、１個
またはそれ以上の修飾塩基を含む上記ＤＮＡまたはＲＮ
Ａを包含する。よって、安定性または他の理由のために
修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細
書にいう「ポリヌクレオチド」である。そのうえ、例え
ばイノシンまたはトリチウム化されたような修飾塩基の
ごとき普通でない塩基を含んでなるＤＮＡまたはＲＮＡ
も本明細書にいうポリヌクレオチドである。

【００５３】当業者に知られた多くの有用な目的の非常
に多くの修飾がＤＮＡおよびＲＮＡについて行われてい
ることが認識されよう。本明細書の用語ポリヌクレオチ
ドは、かかる化学的に、酵素的、あるいは代謝的に修飾
された形態のポリヌクレオチド、ならびに、特にウイル
スの特徴および単一・複合細胞を包含する細胞の特徴を
示すＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。

【００５４】本明細書の用語「ポリペプチド」を以下に
説明する。ポリペプチドの基本的構造はよく知られてお
り、当該分野の多数の教科書および他の刊行物に記載さ
れている。この点からすると、用語ポリペプチドは、ペ
プチド結合により互いに直鎖状に結合した２個またはそ
れ以上のアミノ酸を含んでなるペプチドまたは蛋白をい
うために用いられる。本明細書において該用語は短鎖
（当該分野において通常にはペプチド、オリゴペプチド
およびオリゴマーという）および長鎖（当該分野におい
て一般的には蛋白といい、種々のタイプがある）の両方
をいう。

【００５５】ポリペプチドは、しばしば２０個の天然ア
ミノ酸といわれるもの以外のアミノ酸を含み、プロセッ
シングおよび他の翻訳後修飾のごとき天然プロセスのみ
ならず当該分野でよく知られた化学的修飾法によっても
末端アミノ酸を包含する多くのアミノ酸を一定のポリペ
プチド中で修飾できることが理解されよう。ポリペプチ
ドにおいて自然に起こる普通の修飾でさえも、ここに挙
げるには膨大すぎるが、それらは基本的な教科書および
さらに詳細な研究論文に記載されており、さらには膨大
な研究文献にも記載されており、それらは当業者によく
知られている。

【００５６】本発明ポリペプチド中に存在してもよい知
られている修飾のうち、少しの例を挙げると、アセチル
化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビ
ンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまた
はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導
体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、
架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共
有結合による架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタ
ミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、
グリコシレーション、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシ
ル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋
白分解的プロセッシング、ホスホリレーション、プレニ
レーション、ラセミ化、セレノイレーション、硫酸化、
アルギニン化のごとき転移−ＲＮＡにより媒介される蛋
白へのアミノ酸付加、およびユビキチネーションがあ
る。

【００５７】かかる修飾は当業者によく知られており、
科学文献に非常に詳細に記載されている。いくつかの特
によく行われる修飾、例えばグリコシレーション、脂質
付加は、PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIE
S,2nd Ed.,T.E.Creighton,W.H.Freemen and Company,Ne
w York(1993)のごとき最も基本的な教科書に記載されて
いる。多くの詳細なレビューがこの問題について利用で
き、例えば、POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATIO
N OF PROTEINS,B.C.Johnson,Ed.,Academic Press,New Y
ork(1983)中、Wold,F.,Posttranslational Protein Mod
ifications:Prespectives and Prospects,pgs.1-12；Se
ifter et al.,Analysis for protein modifications an
d nonprotein cofactors,Meth.Enzymol.182:626-646(19
90)およびRattman et al.,Protein Synthesis:Posttran
slational Modifications and Aging.Ann.N.Y.Acad.Sc
i.663:48-62(1992)にある。

【００５８】よく知られ、上記したように、ポリペプチ
ドは常に完全に直鎖状であるとは限らないことが理解さ
れよう。例えば、一般的には、天然に起こるプロセッシ
ングおよび自然には起こらない人間による操作を包含す
る翻訳後の出来事の結果として、ポリペプチドは至る所
で分枝しており、また、分枝ありまたはなしで環状であ
ったりする。非翻訳的天然プロセスおよび全くの合成法
によっても、環状、分枝および分枝つき環状のポリペプ
チドが合成されうる。

【００５９】ポリペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびア
ミノ末端およびカルボキシル末端を包含するポリペプチ
ドのいずれの場所においても修飾が起こり得る。実際、
ポリペプチド中のアミノまたはカルボキシル基、あるい
はそれら両方の共有結合によるブロックは、天然および
合成ポリペプチドにおいてよく起こるものであり、かか
る修飾が本発明ポリペプチド中に存在してもよい。例え
ば、蛋白分解プロセッシングの前にE.coliにおいて作ら
れるポリペプチドのアミノ末端残基はほとんど例外なく
Ｎ−ホルミルメチオニンである。

【００６０】ポリペプチドにおいて生じる修飾は、しば
しば、それがいかにして作られるのかという機能であろ
う。例えば、宿主中でクローンされた遺伝子を発現する
ことにより作られるポリペプチドは、宿主細胞翻訳後修
飾能およびポリペプチドのアミノ末端に存在する修飾シ
グナルによって、修飾の性質および程度の大部分が決定
される。例えば、よく知られているように、グリコシレ
ーションは、しばしば、E.coliのごとき細菌細胞におい
ては起こらない。したがって、グリコシレーションが望
まれる場合には、ポリペプチドをグリコシレーションす
る宿主中、一般的には真核細胞中で発現すべきである。
昆虫細胞は、しばしば、哺乳動物と同じ翻訳後グリコシ
レーションを行うので、昆虫細胞発現系は、特に無傷の
グリコシレーションパターンを有する哺乳動物蛋白を効
率よく発現するために開発されてきた。

【００６１】同じタイプの修飾が一定のポリペプチドに
おいて同じ部位またはいくぶん異なった部位においてい
くつか存在しうることが理解されよう。また、一定のポ
リペプチドは多くのタイプの修飾を含みうる。

【００６２】一般的には本明細書の用語「ポリペプチ
ド」は、かかる修飾すべてを含み、詳細には、宿主細胞
中でポリヌクレオチドを発現させることにより合成され
るポリペプチド中に存在する修飾物を含む。

【００６３】本明細書の用語ポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドの「変種」とは、もとのポリヌクレオチドま
たはポリペプチドとは異なるポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドをいう。この意味において変種は本開示の以
下の部分およびいずれかの部分においてより詳細に説明
される。

【００６４】（１）他のもの、すなわちもとのポリヌク
レオチドとはヌクレオチド配列が異なるポリヌクレオチ
ド。一般的には、相違は、もとのヌクレオチド配列と変
種ヌクレオチド配列が全体的に極めて類似し、多くの領
域において同一であるようなものに限られる。下記のご
とく、変種におけるヌクレオチド配列の変化がサイレン
トであってもよい。すなわち、それらは、ポリヌクレオ
チドによりコードされるアミノ酸を変化させなくてもよ
い。変化がこのタイプのサイレント変化に限定される場
合、変種はもとのポリペプチドと同じアミノ酸配列をコ
ードしているであろう。また、下記のごとく、変種にお
けるヌクレオチド配列の変化が、もとのポリヌクレオチ
ドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変
化させたものであってもよい。下記のごとく、かかるヌ
クレオチド変化は、もとの配列によりコードされるポリ
ペプチド中のアミノ酸置換、付加、欠失、融合および切
断を引き起こし得る。

【００６５】（２）他のもの、すなわちもとのポリペプ
チドとはアミノ酸配列が異なるポリペプチド。一般的に
は、相違は、もとのアミノ酸配列と変種アミノ酸配列が
全体的に極めて類似し、多くの領域において同一である
ようなものに限られる。変種ともとのポリペプチドと
は、１個またはそれ以上の置換、付加、欠失、融合およ
び切断によりアミノ酸配列が異なっていてもよく、それ
らはいずれの組み合わせにおいて存在してもよい。 融合蛋白：ＥＰ−Ａ−０ ４６４ ５３３（カナダ対応
出願２０４５８６９）には、別のヒト・蛋白またはその
一部と結合した免疫グロブリン分子の不戦領域の種々の
部分を含んでなる融合蛋白が開示されている。多くの場
合、融合蛋白のＦｃ部分は、治療および診断における使
用に非常に有利であり、よって、例えば改善された薬物
動態特性を生じる（ＥＰ−Ａ ０２３２ ２６２）一
方、いくつかの用途には、融合蛋白が本明細書記載の有
利な方法で発現され、検出され、精製された後、Ｆｃ部
分を欠失できるものであることが望ましいであろう。Ｆ
ｃ部分が治療および診断を妨げることがわかった場合、
例えば、融合蛋白が免疫のための抗原として用いられる
場合がこのような場合に相当する。薬剤の発見におい
て、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するための高処
理量アッセイの目的で、例えば、ｓｈＩＬ５−αのごと
きヒト・蛋白がＦｃ部分と融合されている。Bennett et
al.,Journal of Molecular Recognition,8:52-58(199
5)およびJohansonet al.,The Journal of Biological C
hemistry,270,No.16,9459-9471(1995)参照。

【００６６】よって、本発明は、ＣＧＲＰ−ＲＣＦ、ま
たはその一部、ならびに種々のサブクラス（ＩｇＧ、Ｉ
ｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）の免疫グロブリンの重鎖または
軽鎖の不変領域の種々の部分を含んでなる、遺伝子操作
により得られた融合蛋白にも関する。ヒト・ＩｇＧ、詳
細にはＩｇＧ１の重鎖の不変部分が免疫グロブリンとし
て好ましく、融合はヒンジ領域で起こる。特定の具体例
において、因子Ｘａとともに融合蛋白中に組み込まれ、
それとともに開裂されうる開裂部位による簡単な方法で
Ｆｃ部分を除去することができる。さらにそのうえ、本
発明は、遺伝子操作によるこれらの融合蛋白の製造方
法、ならびに診断および治療へのそれらの使用に関す
る。本発明のさらなる態様は、かかる融合蛋白をコード
しているポリヌクレオチドに関する。

【００６７】結合分子（または相互作用分子もしくは受
容体成分因子ともいう）は、本発明ポリペプチドに特異
的に結合しまたは相互作用するＣＧＲＰ受容体リガンド
またはＣＧＲＰ受容体以外の分子をいう。かかる結合分
子は本発明の一部である。結合分子は、本発明ポリペプ
チドに特異的にに結合する抗体および抗体由来の試薬の
ごとき非天然のものであってもよい。本明細書の用語、
ＣＧＲＰ−ＲＣＦ／ＣＧＲＰ受容体系またはＣＧＲＰ−
ＲＣＦ／ＣＧＲＰ受容体または単に受容体系とは、ＣＧ
ＲＰ受容体とＣＧＲＰ−ＲＣＦとの間に生じる複合体を
いう。

【００６８】発明の説明 本発明は、とりわけ、以下に詳細に説明される新規ＣＧ
ＲＰ−ＲＣＦポリペプチドおよびポリヌクレオチに関す
る。詳細には、本発明は、新規ヒト・ＣＧＲＰ−ＲＣＦ
のポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関し、それは
モルモット・ＣＧＲＰ−ＲＣＦポリペプチドに対するア
ミノ酸配列相同性により関連づけられる。本発明は、特
に、図１に示すヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有す
るＣＧＲＰ−ＲＣＦ、ならびにＡＴＣＣ番号９８１０５
中ヒト・ｃＤＮＡ（本明細書では寄託クローンまたは寄
託クローンのｃＤＮＡという）のＣＧＲＰ−ＲＣＦヌク
レオチドおよびアミノ酸配列に関する。寄託クローンの
ｃＤＮＡを配列決定することにより図１に示すヌクレオ
チドおよびアミノ酸配列が得られることが理解されよ
う。それゆえ、寄託クローンの配列は二者間の不一致に
関して支配的であり、図１の配列に関するいかなる言及
も寄託クローンのヒト・ｃＤＮＡの配列の言及を包含す
る。

【００６９】ポリヌクレオチド 本発明の１の態様によれば、図１の推定アミノ酸配列
（読み枠）を有するＣＧＲＰ−ＲＣＦポリペプチドをコ
ードする単離ポリヌクレオチドが提供される。

【００７０】図１に示すポリヌクレオチド配列のごとき
本明細書の情報を用いれば、破骨細胞腫由来のヒト・脂
肪細胞から得られたｍＲＮＡを出発物質として用いるｃ
ＤＮＡクローニングのための方法のごとき標準的クロー
ニングおよびスクリーニング法を用いてヒト・ＣＧＲＰ
−ＲＣＦポリペプチドをコードしている本発明ポリヌク
レオチドを得ることができる。本発明の説明として、発
現配列タグ（ＥＳＴ）分析（Adams,et al.,Science 25
2:1651-1656(1991);Adams,et al.,Nature 355:632-634
(1992);Adams,et al.,Nature 377 Supp,3-174(1995)）
を用いれば、図１に示すポリヌクレオチドはヒト・脂肪
細胞由来のｃＤＮＡライブラリー中に見いだされる。

【００７１】寄託クローン中のヒト・ＣＧＲＰ−ＲＣＦ
をコードしているｃＤＮＡの配列決定の結果により示さ
れるように、本発明ヒト・ＣＧＲＰ−ＲＣＦはモルモッ
ト・ＣＧＲＰ−ＲＣＦと構造的に関連している。かくし
て得られたｃＤＮＡ配列を図１（配列番号：１）に示
す。該配列は、推定分子量約１７．７ｋＤａの１４８個
のアミノ酸残基から構成される蛋白をコードしている読
み枠を含んでいる。図１のＣＧＲＰ−ＲＣＦは、モルモ
ット・ＣＧＲＰ−ＲＣＦのアミノ酸配列に対して約８８
％の同一性があり、約９４％の相同性がある。

【００７２】本発明ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡのご
ときＲＮＡ形態であってもよく、あるいは例えばクロー
ニングまたは化学合成法またはそれらの組み合わせによ
り得られるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを包含するＤＮ
Ａ形態であってもよい。ＤＮＡは２本鎖または１本鎖で
あってよい。１本鎖ＤＮＡはコーディング鎖（センス鎖
としても知られる）であってもよく、あるいは非コーデ
ィング鎖（アンチ−センス鎖としても知られる）であっ
てもよい。

【００７３】ポリペプチドをコードしているコーディン
グ鎖は、図１（配列番号：１）に示すポリヌクレオチド
のコーディング鎖と同じであってもよい。コーディング
鎖は別の配列を有するポリヌクレオチドであってもよ
く、それは、遺伝コードの縮重の結果として図１のＤＮ
Ａのポリペプチドをコードしているものであってもよ
い。

【００７４】図１のポリペプチドをコードしている本発
明ポリヌクレオチドは、それらにより示されるポリペプ
チドに関するコーディング配列；当該ポリペプチド配列
およびリーダー配列または分泌配列（プレ−またはプロ
−またはプレプロ−蛋白配列）をコードしているような
付加的配列に関するコーディング配列；さらなる非コー
ディング配列（例えば、イントロンおよび転写されるが
翻訳されない非コーディング５’および３’配列（転
写、ｍＲＮＡプロセッシング−スプライシングおよびポ
リアデニレーションシグナルを包含−リボソーム結合お
よびｍＲＮＡ安定性において役割を果たす）；さらなる
コーディング配列（さらなる官能基を提供するさらなる
ようなアミノ酸をコードしている）を伴った上記の付加
的配列を有するあるいは有していないポリペプチドに関
するコーディング配列（これらに限らない）を包含して
もよい。よって、例えば、ポリペプチドがペプチドのご
ときマーカー配列に融合していてもよく、該マーカー配
列は融合ポリペプチドの精製を容易にするものであって
よい。本発明のこの態様の特定の好ましい具体例におい
て、マーカー配列は、特にｐＱＥベクター（Qiagen,In
c）中のタグのごときヘキサヒスチジンペプチドであ
り、それらの多くが市販されている。例えば、Gentz et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 86,821-824(1989)に記
載のごとく、ヘキサヒスチジンは融合蛋白の精製を便利
にする。ＨＡタグはインフルエンザ・ヘマグルチニン蛋
白に対応するものであり、例えば、Wilson et al.,Cell
37:767(1984)に記載されている。

【００７５】上記によれば、本明細書の用語「ポリペプ
チドをコードしているポリヌクレオチド」は、本発明ポ
リペプチド、詳細には、図１に示すアミノ酸配列を有す
るヒト・ＣＧＲＰ−ＲＣＦをコードしている配列を含む
ポリヌクレオチドを包含する。該用語は、さらなる領域
（コーディングおよび／または非コーディング配列を含
んでいてもよい）を伴ったポリペプチド（例えば、イン
トロンにより分断されている）をコードしている単一の
連続領域または不連続領域を含むポリヌクレオチドを包
含する。

【００７６】さらに本発明は、上記ポリヌクレオチドの
変種に関する。該変種は図１の推定アミノ酸配列を有す
るポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体
をコードしている。ポリヌクレオチドの変種は、天然に
存在する対立遺伝子変種のごとき天然に存在する変種で
あってもよく、あるいは天然に存在することが知られて
いない変種であってもよい。かかるポリヌクレオチドの
非天然変種を、ポリヌクレオチド、細胞または生物に適
用される突然変異法を包含する突然変異法により作成し
てもよい。

【００７７】この点において、ヌクレオチド置換、欠失
または付加によって上記ポリヌクレオチドと異なる変種
も「変種」に含まれる。置換、欠失または付加には１個
またはそれ以上のヌクレオチドが関与しうる。変種はコ
ーディング配列または非コーディング配列あるいはそれ
らの両方において変化していてもよい。コーディング配
列の変化が保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失ま
たは付加を生じるものであってもよい。

【００７８】この点において本発明の特に好ましい具体
例は、図１に示すＣＧＲＰ−ＲＣＦのアミノ酸配列を有
するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド；
その変種、アナログ、誘導体およびフラグメント、なら
びにその変種、アナログおよび誘導体のフラグメントで
ある。

【００７９】この点において、ＣＧＲＰ−ＲＣＦ変種、
アナログ、誘導体およびフラグメント、ならびにそのフ
ラグメントの変種、アナログおよび誘導体をコードして
いるポリヌクレオチドであって、図１のＣＧＲＰ−ＲＣ
Ｆポリペプチドのアミノ酸配列を有するものがさらに特
に好ましく、該アミノ酸中、いくつかの、少数の、５な
いし１０個、１ないし５個、１ないし３、２、１個また
は０個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加されてお
り、あるいはそれらが組み合わされている。これらのう
ち特に好ましいのは、サイレント置換、付加および欠失
であり、それらはＣＧＲＰ−ＲＣＦの特性および活性を
変化させない。また、この点において、保存的置換が特
に好ましい。置換を有しない図１のアミノ酸配列を有し
ているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド
が最も好ましい。

【００８０】本発明のさらに好ましい具体例は、図１に
示すアミノ酸配列を有するＣＧＲＰ−ＲＣＦポリペプチ
ドをコードしているポリヌクレオチドに対して少なくと
も７０％同一であるポリヌクレオチド、およびかかるポ
リヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドである。あ
るいはまた、本明細書記載のライブラリーから得られる
ヒト・ｃＤＮＡのＣＧＲＰ−ＲＣＦポリペプチドをコー
ドしているポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％
同一である領域を含んでなるポリヌクレオチドおよびそ
れに相補的なポリヌクレオチドが非常に好ましい。この
点において、上記ポリペプチドに対して少なくとも９０
％同一であるポリヌクレオチドが特に好ましく、これら
のうちでも特に好ましいのは、少なくとも９５％同一の
ものである。さらにそのうえ、少なくとも９５％同一の
ものの中でも少なくとも９７％同一のものが非常に好ま
しく、その中でも少なくとも９８％同一のものおよび少
なくとも９９％同一のものが特に非常に好ましく、少な
くとも９９％のものがより好ましい。

【００８１】そのうえ、この点において特に好ましい具
体例は、図１のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチ
ドのいずれかと実質的に同じ生物学的機能または活性を
保持しているポリペプチドをコードしているポリヌクレ
オチドである。

【００８２】さらに本発明は、本明細書において上で述
べた配列とハイブリダイゼーションするポリヌクレオチ
ドに関する。この点において本発明は、特に、厳密な条
件下で本明細書において上で述べた配列とハイブリダイ
ゼーションするポリヌクレオチドに関する。本明細書の
用語「厳密な条件」とは、少なくとも９５％、好ましく
は少なくとも９７％同一である配列間においてのみハイ
ブリダイゼーションが起こることを意味する。

【００８３】本発明のポリヌクレオチドアッセイに関し
てさらに本明細書で議論するように、例えば、上記本発
明ポリヌクレオチドをｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用の
ハイブリダイゼーションプローブとして用いて、ＣＧＲ
Ｐ−ＲＣＦをコードしている全長のｃＤＮＡおよびゲノ
ムクローンを単離してもよく、また、ヒト・ＣＧＲＰ−
ＲＣＦ遺伝子に対して高度の配列類似性を有するｃＤＮ
Ａおよび他の遺伝子のゲノムクローンを単離してもよ
い。一般的には、かかるプローブは少なくとも１５個の
塩基を含んでなる。好ましくは、かかるプローブは少な
くとも３０個の塩基を有し、少なくとも５０個の塩基を
有していてもよい。特に好ましいプローブは少なくとも
３０個の塩基を有し、５０個またはそれ以下の塩基を有
するであろう。

【００８４】例えば、オリゴヌクレオチドプローブを合
成するための既知ＤＮＡ配列を用いてＣＧＲＰ−ＲＣＦ
遺伝子のコーディング領域を単離することができる。次
いで、本発明遺伝子配列に対する配列相補性を有する標
識オリゴヌクレオチドを用いてヒト・ｃＤＮＡ、ゲノム
ＤＮＡまたはｍＲＮＡライブラリーをスクリーニングし
てライブラリーのどのメンバーがプローブにハイブリダ
イゼーションするのかを決定する。

【００８５】本発明ポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドを、ヒトの疾病の治療および診断のための研究試薬お
よび材料として用いてもよい（特に、ポリヌクレオチド
アッセイに関して本明細書でさらに議論する）。

【００８６】ポリヌクレオチドは、当該蛋白およびさら
なるアミノもしくはカルボキシル末端アミノ酸、あるい
はポリペプチドに対するさらなる内部アミノ酸（ペプチ
ド形態が１種よりも多いポリペプチド鎖を有する場合）
であるポリペプチドをコードしていてもよい。かかる配
列は、前駆体から個々の形態への蛋白のプロセッシング
において役割を果たしている可能性があり、蛋白輸送を
容易にする可能性があり、蛋白半減期を延長または短縮
する可能性があり、あるいは特に、アッセイまたは製造
のために蛋白の取り扱いを容易にする可能性もある。in
situにおける一般的な場合には、細胞酵素により、さ
らなるアミノ酸がプロセッシングにより蛋白から除去さ
れうる。

【００８７】１またはそれ以上のプロ配列に融合した特
別の形態のポリペプチドを有する前駆体蛋白は、そのポ
リペプチドの不活性形態であってもよい。プロ配列が除
去される場合、一般的にはかかる不活性前駆体が活性化
される。プロ配列のいくつかまたはすべてが活性化前に
除去される。一般的にはかかる前駆体はプロ蛋白と呼ば
れる。

【００８８】まとめると、本発明ポリヌクレオチドは、
成熟蛋白、成熟蛋白＋リーダー配列（プレ蛋白ともいわ
れる）、プレ蛋白のリーダー配列でない１個またはそれ
以上のプロ配列を有する蛋白の前駆体、あるいは１個ま
たはそれ以上のプロ配列（一般的には、活性形態または
他の形態のポリペプチドを生じるプロセッシング工程の
間に除去される）を有するプロ蛋白の前駆体であるプレ
プロ蛋白をコードしていてもよい。

【００８９】寄託材料 ヒト・ＣＧＲＰ−ＲＣＦ ｃＤＮＡを含んでいる寄託物
は上記American Type Culture Collectionに寄託されて
いる。上記のごとく、ヒト・ｃＤＮＡ寄託物は「寄託ク
ローン」または「寄託クローンのｃＤＮＡ」と呼ばれ
る。

【００９０】American Type Culture Collection,12301
Park Lawn Drive,Rockville,Maryland 20852,USAに、
１９９６年７月１７日に寄託された寄託クローンは寄託
番号ＡＴＣＣ ９８１０５（Escherichia coli pHOUDC4
4/SolR）を付与された。

【００９１】寄託材料は、全長のＣＧＲＰ−ＲＣＦ ｃ
ＤＮＡを含んでいるpBluescript SK(-)プラスミド（寄
託時pHOUDC44と称した）である。寄託は特許手続上の微
生物の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて行
われた。特許付与により、該寄託材料は制限なく公衆に
解放されるであろう。寄託は当業者の便宜のためだけに
行われ、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２の下で要求されるよ
うな規定を満たすことを寄託が要求されるという承認で
はない。寄託材料中に含まれるポリヌクレオチドの配
列、ならびにコードされているポリペプチドのアミノ酸
配列は、本明細書のいずれの配列の記載と矛盾する場合
であっても支配的である。寄託材料の製造、使用または
販売びはライセンスが必要となるであろう。

【００９２】ポリペプチド さらに本発明は、図１（配列番号：２）の推定アミノ酸
配列を有するヒト・ＣＧＲＰ−ＲＣＦポリペプチドに関
する。

【００９３】また本発明は、これらのポリペプチドのフ
ラグメント、アナログおよび誘導体に関する。用語「フ
ラグメント」、「誘導体」および「アナログ」は、図１
のポリペプチドについていう場合、かかるポリペプチド
と本質的に同じ生物学的機能（すなわち、ＣＧＲＰ−Ｒ
ＣＦとしての機能）を保持しているか、あるいはＣＧＲ
Ｐ−ＲＣＦとして機能しない場合であってもＣＧＲＰ受
容体リガンドまたはＣＧＲＰ受容体への結合能を保持し
ているポリペプチド（例えば、可溶性形態のＣＧＲＰ−
ＲＣＦ）を意味する。よって、アナログは、プロ蛋白部
分の開裂により活性化されて活性ポリペプチドを生じう
るプロ蛋白を包含する。

【００９４】本発明ポリペプチドは組み換えポリペプチ
ド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであって
もよい。特定の好ましい具体例において、本発明ポリペ
プチドは組み換えポリペプチドである。

【００９５】図１のポリペプチドのフラグメント、誘導
体またはアナログは以下のものである：（ｉ）１個また
はそれ以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミ
ノ酸残基（好ましくは、保存的アミノ酸残基）で置換さ
れており、かかる置換アミノ酸残基は遺伝コードにより
コードされているものであっても、コードされていない
ものであってもよく、あるいは（ｉｉ）１個またはそれ
以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、あるいは（ｉ
ｉｉ）ポリペプチドの半減期を延長させるような別の化
合物にポリペプチドが融合しているもの、あるいは（ｉ
ｖ）リーダーまたは分泌配列、またはポリペプチドの精
製に用いられる配列、またはプロ蛋白配列のごときさら
なるアミノ酸がポリペプチドに融合しているもの。かか
るフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書の
教示から当業者の範囲内であると考えられる。

【００９６】この点において、図１に示すＣＧＲＰ−Ｒ
ＣＦのアミノ酸配列を有するポリペプチド、その変種、
アナログ、誘導体およびフラグメント、ならびに該フラ
グメントの変種、アナログおよび誘導体は本発明の特に
好ましい具体例に属する。あるいはまた、この点におい
て、本発明の特に好ましい具体例は、ＣＧＲＰ−ＲＣＦ
のアミノ酸配列を有するポリペプチド、その変種、アナ
ログ、誘導体およびフラグメント、ならびに該フラグメ
ントの変種、アナログおよび誘導体である。

【００９７】保存的アミノ酸置換によって元のものとは
異なる変種も好ましい変種に属する。かかる置換は、ポ
リペプチド中のあるアミノ酸を同様の特性の別のアミノ
酸で置換するものである。典型的に見られるのは、脂肪
族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ間での
相互置換；水酸基を有するＳｅｒおよびＴｈｒの相互置
換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの相互置換、アミド残
基ＡｓｎおよびＧｌｎ間の置換、塩基性残基Ｌｙｓおよ
びＡｒｇの置換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ間
の置換である。

【００９８】この点において、いくつかの、少数の、５
ないし１０個の、１ないし５個の、１ないし３、２、１
個の、または０個のアミノ酸残基が置換、欠失または付
加されている（あるいはそれらのいずれかの組み合わ
せ）図１のＣＧＲＰ−ＲＣＦポリペプチドのアミノ酸配
列を有する変種、アナログ、誘導体およびフラグメン
ト、ならびに該フラグメントの変種、アナログおよび誘
導体がさらに特に好ましい。ＣＧＲＰ−ＲＣＦの特性お
よび活性を変化させないサイレント置換、付加および欠
失がこれらのうちで特に好ましい。また、この点におい
て、保存的置換が特に好ましい。置換のない図２のアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドがもっとも非常に好まし
い。

【００９９】好ましくは、本発明ポリペプチドおよびポ
リヌクレオチドは単離形態で提供され、好ましくは均一
にまで精製されている。

【０１００】本発明ポリペプチドは、配列番号：２のポ
リペプチドならびに配列番号：２のポリペプチドに対し
て少なくとも８０％同一性を有し、より好ましくは配列
番号：２のポリペプチドに対して少なくとも９０％の類
似性を有し、さらにより好ましくは配列番号：２のポリ
ペプチドに対して少なくとも９５％の類似性を有するポ
リペプチド（さらにより好ましくは、少なくとも９５％
の同一性を有す）を包含し、また、かかるポリペプチド
の部分も包含する（ポリペプチドに対するかかる部分は
一般的には少なくとも３０個のアミノ酸、より好ましく
は少なくとも５０個のアミノ酸を含む）。

【０１０１】当該分野において知られているように、２
つのポリペプチド間の「類似性」は、アミノ酸配列およ
び１のポリペプチドの別のポリペプチドに対する保存的
アミノ酸置換を比較することにより決定される。そのう
え、当該分野で知られているように、「同一性」（２つ
のポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチド配列間の
配列関連性の程度を意味する）は、かかる２つの配列間
の合致を確認することにより決定される。同一性および
類似性はともに容易に計算されうる（Computational Mo
lecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Pr
ess,New York,1988;Biocomputing:Informatics and Gen
ome Projects,Smith,D.W.,ed.,AcademicPress,New Yor
k,1993;Computer Analysis of Sequence Data,Part I,G
riffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New
Jersey,1994;Sequence Analysisin Molecular Biolog
y,von Heinje,G.,Academic Press,1987;およびSequence
Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M
Stockton Press,New York,1991）。２つのポリヌクレ
オチドまたはポリペプチド配列間の同一性および類似性
を測定する方法が数多く存在するが、用語「同一性」お
よび「類似性」は当業者によく知られている（Sequence
Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Acade
mic Press,1987;Sequence Analysis Primer,Gribskov,
M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1
991;およびCarillo,H.,and Lipman,D.,SIAM J.Applied
Math.,48:1073(1988)）。２つの配列間の同一性または
類似性を決定するために通常用いられる方法は、Guide
to Huge Computers,Martin J.Bishop,ed.,Academic Pre
ss,San Diego,1994,およびCarillo,H.,and Lipman,D.,S
IAM J.Applied Math.,48:1073(1988)に開示されている
ものを包含するがこれらに限らない。同一性決定のため
の好ましい方法は、２つの試験配列間で合致が最大とな
るように設計されたものである。同一性および類似性を
決定するための方法はコンピュータープログラムに入っ
ている。２つの配列間の同一性および類似性を決定する
ための好ましいコンピュータープログラム法は、ＧＣＧ
プログラムパッケージ（Devereux,J.,et al.,Nucleic A
cids Research 12(1):387(1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、Ｂ
ＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Atschul,S.F.et al.,J.Mole
c.Biol.215:403(1990)）を包含するが、これらに限らな
い。

【０１０２】本発明ポリペプチドのフラグメントまたは
部分を、ペプチド合成による対応する全長のポリペプチ
ドの合成に使用してもよい。それゆえ、フラグメントを
全長のポリペプチドの製造のための中間体として使用し
てもよい。本発明ポリペプチドのフラグメントまたは部
分を用いて本発明の全長のポリヌクレオチドを合成して
もよい。

【０１０３】フラグメントＣＧＲＰ−ＲＣＦポリペプチ
ドのフラグメント、最も詳細には図１に示すアミノ酸配
列を有するＣＧＲＰ−ＲＣＦポリペプチドのフラグメン
トを含んでなるポリペプチド、および図１のＣＧＲＰ−
ＲＣＦポリペプチドの変種および誘導体のフラグメント
を含んでなるポリペプチドも、本発明のこの態様の好ま
しい具体例に含まれる。

【０１０４】この点において、フラグメントは、上記Ｃ
ＧＲＰ−ＲＣＦポリペプチドおよびその変種または誘導
体のアミノ酸配列の一部（全部ではない）と完全に同じ
アミノ酸配列を有するポリペプチドである。

【０１０５】かかるフラグメントは「フリー−スタンデ
ィング（free-standing）」、すなわち、他のアミノ酸
またはポリペプチドの一部でなく、それらに融合してい
ないものであってよく、あるいはかかるフラグメントが
大きなポリペプチド中に含まれていて、その一部分また
は領域となっていてもよい。大きなポリペプチド中に含
まれている場合、現在議論中のフラグメントは、最も好
ましくは単一の連続した領域を形成する。しかしなが
ら、いくつかのフラグメントが単一のより大きなポリペ
プチド中に含まれていてもよい。例えば、特定の好まし
い具体例は、宿主における発現のために設計された前駆
体ポリペプチド中に含まれていて、ＣＧＲＰ−ＲＣＦフ
ラグメントのアミノ末端に融合した異種プレおよびプロ
−ポリペプチド領域ならびに該フラグメントのカルボキ
シル末端に融合したさらなる領域を有している本発明Ｃ
ＧＲＰ−ＲＣＦポリペプチドのフラグメントに関する。
それゆえ、本明細書における意味の１の態様において、
フラグメントは、ＣＧＲＰ−ＲＣＦ由来の融合ポリペプ
チドまたは融合蛋白の一部または部分をいう。

【０１０６】本発明ポリペプチドフラグメントの典型例
として、長さが約５ないし１５個、１０ないし２０個、
１５ないし４０個、３０ないし５５個、４１ないし７５
個、４１ないし８０個、４１ないし９０個、５０ないし
１００個および７５ないし１００個、９０ないし１１５
個、１００ないし１２５個、および１１０ないし１１３
個のアミノ酸のものを挙げることができる。

【０１０７】この文脈において、特に列挙した範囲、な
らびに数個、少数、５、４、３、２、１個のアミノ酸の
分だけ大きいまたは小さい範囲（上限または下限、ある
いはそれらの両方の範囲において）を包含する。例え
ば、この文脈において、約４０ないし９０個のアミノ酸
は、４０プラスマイナス数個、少数、５、４、３、２、
１個から、９０プラスマイナス数個、少数、５、４、
３、２、１個までのポリペプチドフラグメントを意味
し、すなわち、広くは４０マイナス数個から９０プラス
数個のアミノ酸、狭くは４０プラス数個から９０マイナ
ス数個のアミノ酸の範囲である。

【０１０８】この点において、列挙した範囲プラスまた
はマイナス５個程度のアミノ酸（上限または下限、ある
いはそれらの両方の範囲において）が非常に好ましい。
列挙した範囲プラスまたはマイナス３個程度のアミノ酸
（上限または下限、あるいはそれらの両方の範囲におい
て）が特に非常に好ましい。列挙した範囲プラスまたは
マイナス１個程度のアミノ酸（上限または下限、あるい
はそれらの両方の範囲において）または列挙した範囲そ
のものが特に非常に好ましい。この点において、約５な
いし１５個、１０ないし２０個、１５ないし４０個、３
０ないし５５個、４１ないし７５個、４１ないし８０
個、４１ないし９０個、５０ないし１００個および７５
ないし１００個のアミノ酸の長さのフラグメントが最も
好ましい。

【０１０９】ＣＧＲＰ−ＲＣＦの切断された変異種は本
発明の特に好ましいフラグメントに含まれる。切断され
た変異種は、図１のアミノ酸配列を有するＣＧＲＰ−Ｒ
ＣＦポリペプチド、あるいはその変種または誘導体を包
含するが、アミノ末端を含む連続した一連の残基（すな
わち、連続した領域、部分または一部分）の欠失、ある
いはカルボキシル末端を含む連続した一連の残基の欠
失、あるいは二重切断変異種中にあるような２つの連続
した残基の欠失（１つはアミノ末端を含み、もう１つは
カルボキシル末端を含む）は除く。上に示したサイズ範
囲のフラグメントも切断されたフラグメントの好ましい
具体例であり、一般的にはそれらはフラグメントのなか
でも特に好ましいものである。

【０１１０】本発明のこの態様において、ＣＧＲＰ−Ｒ
ＣＦポリペプチドの構造的または機能的属性によって特
徴づけられるフラグメントも好ましい。この点において
本発明の好ましい具体例は、ＣＧＲＰ−ＲＣＦポリペプ
チドのアルファ−ヘリックスおよびアルファ−ヘリック
ス形成領域（「アルファ−領域」）、ベータ−シートお
よびベータ−シート形成領域（「ベータ−領域」）、タ
ーンおよびターン形成領域（「ターン領域」）、コイル
およびコイル形成領域（「コイル−領域」）、親水性領
域、疎水性領域、アルファ両親媒性領域、ベータ両親媒
性領域、フレキシブル領域、表面形成領域および高抗原
性インデックス領域を含んでなるフラグメントを包含す
る。

【０１１１】この点において、いくつかの上記特徴のご
ときいくつかの構造的特徴を合わせたＣＧＲＰ−ＲＣＦ
の領域を含んでなるフラグメントは、非常に好ましいフ
ラグメントに属する。この点において、図１の、約１０
ないし約２０個、約４０ないし約５０個、約７０ないし
約９０個および約１００ないし約１１３個の残基により
決定される領域（そのすべてが、ターン領域、親水性領
域、フレキシブル領域、表面形成領域および高抗原性イ
ンデックス領域の特徴を顕著に有するアミノ酸組成によ
り特徴づけられる）は特に非常に好ましい領域である。
かかる領域は大きなポリペプチド中に含まれていてもよ
く、あるいは上記のごとくそれら自体本発明の好ましい
フラグメントでありうる。この段落の用語「約」は一般
的なフラグメントに関して上で説明した意味を有する。

【０１１２】さらに好ましい領域はＣＧＲＰ−ＲＣＦの
活性を媒介する領域である。この点において、ＣＧＲＰ
−ＲＣＦの化学的、生物学的活性または他の活性（類似
活性または改善された活性を包含、望ましくない活性は
減じられている）を有するフラグメントが最も好まし
い。この点において、モルモット・ＣＧＲＰ−ＲＣＦの
関連ポリペプチドのごとき関連ポリペプチドの活性領域
に対して配列または位置、あるいは両方が相同的である
領域を含むフラグメントは非常に好ましい。これらの点
において、上記の切断された変異種は特に好ましいフラ
グメントに含まれる。

【０１１３】さらに本発明は、特に、上記フラグメント
をコードしているポリヌクレオチド、該フラグメントを
コードしているポリヌクレオチドにハイブリダイゼーシ
ョンするポリヌクレオチド、詳細には厳密な条件下でハ
イブリダイゼーションするもの、および該フラグメント
をコードしているポリペプチドを増幅するためのＰＣＲ
プライマーのごときポリヌクレオチドに関することが理
解されよう。これらの点において、好ましいポリヌクレ
オチドは上記のような好ましいフラグメントに対応する
ポリヌクレオチドである。

【０１１４】ベクター、宿主細胞、発現 また、本発明は、本発明ポリヌクレオチドを含むベクタ
ー、本発明ベクターを用いて遺伝子操作された宿主細胞
および組み換え法による本発明ポリペプチドの製造に関
する。

【０１１５】宿主細胞を遺伝子操作してポリヌクレオチ
ドを含むようにして、本発明ポリペプチドを発現させる
ことができる。例えば、感染、形質導入、トランスフェ
クション、トランスベクションおよび形質転換のよく知
られた方法を用いてポリヌクレオチドを宿主細胞中に導
入してもよい。ポリヌクレオチドを単独または他のポリ
ヌクレオチドとともに導入してもよい。かかる他のポリ
ヌクレオチドを本発明ポリヌクレオチドとは別個に、同
時に、あるいは本発明ポリヌクレオチドと結合して導入
してもよい。

【０１１６】よって、例えば、哺乳動物細胞において同
時トランスフェクションおよび選択のための標準的方法
を用いて、例えば、本発明ポリヌクレオチドを選択可能
マーカーをコードしているもう１つの別個のポリペプチ
ドとともに宿主細胞中にトランスフェクションしてもよ
い。この場合、一般的には、ポリヌクレオチドは宿主細
胞ゲノム中に安定に取り込まれるであろう。

【０１１７】別法として、宿主中での増殖のための選択
可能マーカーを含むベクターにポリヌクレオチドを結合
させてもよい。上記方法によりベクター構築物を宿主細
胞中に導入してもよい。一般的には、プラスミドベクタ
ーを、リン酸カルシウム沈殿のごとき沈殿中、あるいは
荷電脂質との複合体中のＤＮＡとして導入する。エレク
トロポレーションを用いてポリヌクレオチドを細胞中に
導入してもよい。ベクターがウイルスである場合、それ
をインビトロでパッケージングし、あるいはパッケージ
ング細胞中に導入することができ、パッケージングされ
たウイルスを細胞中にトランスダクションすることがで
きる。本発明によるポリヌクレオチドの製造および細胞
中へのポリヌクレオチドの導入に適した広範囲の方法は
当業者によく知られており、日常的なものである。かか
る方法は上記Sambrook et al.の文献にようやく記載さ
れたものであり、その文献はこれらの方法を詳述する多
くの研究室マニュアルの説明である。

【０１１８】本発明のこの態様によれば、ベクターは、
例えばプラスミドベクター、１本鎖もしくは２本鎖のフ
ァージベクター、１本鎖もしくは２本鎖のＲＮＡまたは
ＤＮＡウイルスベクターであってよい。細胞中へのＤＮ
ＡおよびＲＮＡ導入のためのよく知られた方法によっ
て、かかるベクターをポリヌクレオチドとして、好まし
くはＤＮＡとして細胞中に導入することができる。ファ
ージおよびウイルスベクターの場合、感染および形質導
入のためのよく知られた方法によって、好ましくは、パ
ッケージングされ、あるいはカプセル封入されたウイル
スとしてベクターを細胞中に導入する。ウイルスベクタ
ーは複製可能であってもよく、複製欠損であってもよ
い。後者の場合、一般的にはウイルス増殖は相補的宿主
細胞においてのみ起こるであろう。

【０１１９】特定の態様において、本発明ポリヌクレオ
チドおよびポリペプチドの発現用ベクターが特に好まし
い。一般的には、かかるベクターは、発現されるべきポ
リヌクレオチドに作動可能に連結された宿主中での発現
に効果的なシス−作用性制御領域を含んでなる。適当な
トランス−作用性因子は宿主によっても提供され、ある
いは相補的ベクターによっても提供され、あるいは宿主
中への導入によりベクター自身により提供される。

【０１２０】この点において、特定の好ましい具体例に
おいて、ベクターは特異的発現を提供する。かかる特異
的発現は誘導可能な発現であってもよく、あるいはある
種のタイプの細胞においてのみ起こる発現であってもよ
く、あるいは誘導可能および細胞特異的の両方であって
もよい。温度および栄養添加物のごとき操作容易な環境
因子による発現に関して誘導されうるベクターが、特に
好ましい誘導可能ベクターである。原核細胞および真核
細胞において使用される構成的発現ベクターおよび誘導
可能発現ベクターを包含する本発明のこの態様に適した
種々のベクターは当業者によく知られており、日常的に
使用されている。

【０１２１】遺伝子操作された宿主細胞を慣用的な培地
で培養することができ、特にプロモーターの活性化、形
質転換体の選択または遺伝子の増幅に関して、適宜、培
地を修飾してもよい。発現用に選択された宿主細胞に関
して以前使用されていた温度、ｐＨ等の培養条件は、一
般的には、当業者に明らかであるように、本発明ポリペ
プチドの発現に適するであろう。

【０１２２】非常に多種にわたる発現ベクターを用いて
本発明ポリペプチドを発現させることができる。かかる
ベクターは、染色体、エピソームおよびウイルス由来の
ベクター、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、バ
クテリオファージ由来のベクター、酵母エピソーム由来
のベクター、酵母染色体エレメント由来のベクター、バ
クイロウイルスのごときウイルス、類人猿ウイルス４０
（「ＳＶ４０」）のごときパポーバウイルス、ワクシニ
アウイルス、アデノウイルス、フォウルポックスウイル
ス、偽狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス由来のも
の、ならびにコスミドおよびファージミドのごときプラ
スミドおよびバクテリオファージの遺伝エレメント由来
のベクターのごときそれらの組み合わせ由来のベクター
を包含し、それらすべてを本発明のこの態様による発現
に使用できる。この点において、一般的には、宿主細胞
中でのポリヌクレオチドの維持、増殖または発現に適し
たベクターを発現に用いることができる。

【０１２３】種々のよく知られた日常的方法のいずれに
よっても適当なＤＮＡ配列をベクター中に挿入すること
ができる。一般的には、発現させるＤＮＡ配列および発
現ベクターを１種またはそれ以上の制限酵素で開裂し、
次いで、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて制限フラグメン
トを結合させることにより、発現させるＤＮＡ配列を発
現ベクターに結合させる。この目的に用いることのでき
る制限的開裂および連結の手順は当業者によく知られて
おり、日常的なものである。この点において、別法を用
いる発現ベクターの構築のための適当な手順も当業者に
よく知られており、本明細書の他の場所で引用している
Sambrook et al.の文献に非常に詳細に説明されてい
る。

【０１２４】発現ベクター中のＤＮＡ配列を適当な発現
制御配列（例えば、ｍＲＮＡ転写を指令するプロモータ
ーを包含）に作動可能に連結する。かかるプロモーター
の典型例は、ファージラムダＰＬプロモーター、E.coli
lac、trpおよびtacプロモーター、ＳＶ４０初期および
後期プロモーターならびにレトロウイルスＬＴＲｓのプ
ロモーターを包含するが、それらは当業者によく知られ
ているもののほんの例示に過ぎない。ここで述べなかっ
た多くのプロモーターも本発明のこの態様に適し、それ
らは当業者によく知られており、本明細書で説明され、
実施例に示されたようにして容易に使用されうることが
理解されるであろう。

【０１２５】一般的には、発現構築物は、転写される領
域に転写開始部位および終止部位を有し、さらに翻訳の
ためのリボソーム結合部位を含むであろう。構築物によ
り発現される成熟転写物のコーディング部分は、翻訳さ
れるべきポリペプチドの初めの部分に翻訳開始ＡＵＧ
を、さらに終わりの部分に適当に位置している終止コド
ンを含むであろう。

【０１２６】さらに、構築物は、発現を調節ならびに発
生させる制御領域を含んでいてもよい。一般的には、多
くの通常行われる手順によれば、かかる領域は、特に、
リプレッサー結合部位およびエンハンサーのごとき転写
調節により作動するものであろう。

【０１２７】一般的には、増殖および発現のためのベク
ターは選択可能マーカーを含むであろう。かかるマーカ
ーも増殖に適するものであってよく、あるいはベクター
がこの目的のためにさらなるマーカーを含んでいてもよ
い。この点において、好ましくは、発現ベクターは１個
またはそれ以上の選択可能マーカー遺伝子を有しており
形質転換された宿主細胞の選択のための表現型の特徴を
提供するものである。好ましいマーカーは、真核細胞用
のジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、
E.coliおよび他の細菌用のテトラサイクリンまたはアン
ピシリン耐性遺伝子を包含する。

【０１２８】所望ポリペプチドの宿主中での発現に適し
た種々の既知方法を用いて、上記のような適当なＤＮＡ
配列ならびに適当なプロモーター、さらに他の適当な制
御配列を含むベクターを適当な宿主中に導入することが
できる。適当な宿主の典型例は、E.coli、Streptomyces
およびSalmonella typhimurium細胞のごとき細菌細胞；
酵母細胞のごとき真菌細胞；Drosophila S2およびSpodo
ptera Sf9細胞のごとき昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳおよ
びBowesメラノーマ細胞のごとき動物細胞；ならびに植
物細胞を包含する。多種の発現構築物用宿主がよく知ら
れており、当業者は本開示により本発明のこの態様にお
けるポリペプチドの発現のための宿主を容易に選択する
ことができよう。

【０１２９】より詳細には、本発明は、発現構築物のご
とき組み換え構築物も包含し、それらは１種またはそれ
以上の上記配列を含んでなる。構築物は、本発明のかか
る配列が挿入されたプラスミドまたはウイルスベクター
のごときベクターを含む。配列を順方向または逆方向に
挿入することができる。この点において、特定の好まし
い具体例において、構築物はさらに、例えば該配列に作
動可能に連結されたプロモーターを包含する調節配列を
含んでなる。多数の適当なベクターおよびプロモーター
が当業者に知られており、本発明における使用に適した
多くのベクターが市販されている。

【０１３０】市販されている下記ベクターを例示する。
それらのうち、細菌での使用に適するのはｐＱＥ７０、
ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９（Qiagenから市販）；ｐＢ
Ｓベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクタ
ー、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ
４６Ａ（Stratageneから市販）；ならびにｐｔｒｃ９９
ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４
０、ｐＲＩＴ５（Pharmaciaから市販）である。それら
のうち、好ましい真核細胞ベクターはｐＷＬＮＥＯ、ｐ
ＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ（St
ratageneから市販）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、
ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ（Pharmaciaから市販）であ
る。これらのベクターは多くの市販ベクターの例示のた
めにのみ挙げたのであり、それらは本発明のこの態様に
より使用するために当業者によく知られたものである。
例えば、宿主中における本発明ポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドの導入、維持、増殖または発現に適する他
のプラスミドまたはベクターを本発明のこの態様に使用
してもよいことが理解されよう。

【０１３１】制限部位または候補プロモーターフラグメ
ント（すなわち、プロモーターを含み得るフラグメン
ト）導入部位の下流のクロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼ（ＣＡＴ）転写ユニットのごとき、プ
ロモーター領域を欠くレポーター転写ユニットを含むベ
クターを用いて、プロモーター領域をいずれの所望遺伝
子からも選択できる。よく知られているように、プロモ
ーター含有フラグメントのベクター中のｃａｔ遺伝子上
流の制限部位への導入はＣＡＴ活性の発生を引き起こ
し、それを標準的ＣＡＴアッセイにより検出することが
できる。この目的に適するベクターはよく知られてお
り、容易に入手できる。２種のかかるベクターはｐＫＫ
２３２−８およびｐＣＭ７である。よって、本発明ポリ
ヌクレオチドの発現用のプロモーターはよく知られてい
て容易に入手できるものを包含するだけでなく、レポー
ター遺伝子を用いて上記方法により容易に得ることので
きるプロモーターも包含する。

【０１３２】E.coli lacIおよびlacZおよびT3およびT7
プロモーター、gptプロモーター、ラムダPR、PLプロモ
ーターならびにtrpプロモーターは、本発明によるポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に適した既知細
菌プロモーターに属する。

【０１３３】サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時初期
プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、
初期および後期ＳＶ４０プロモーター、例えばRousサル
コーマウイルス（ＲＳＶ）のごときレトロウイルスＬＴ
Ｒｓのプロモーター、ならびにマウス・メタロチオネイ
ン−Ｉプロモーターのごときメタロチオネインプロモー
ターは、この点において適切な知られている真核細胞プ
ロモーターに含まれる。

【０１３４】宿主細胞中での発現に適するベクターおよ
びプロモーターの選択はよく知られた手順であり、発現
ベクターの構築、宿主中へのベクターの導入および宿主
における発現に関する精妙な方法は当業者にとり日常的
なものである。

【０１３５】また本発明は、上記構築物を含む宿主細胞
に関する。宿主細胞は哺乳動物細胞のごとき高等真核細
胞であってもよく、あるいは酵母細胞のごとき下等真核
細胞であってもよく、また、宿主細胞は細菌細胞のごと
き原核細胞であってもよい。

【０１３６】リン酸カルシウムトランスフェクション、
ＤＥＡＥ−デキストランにより媒介されるトランスフェ
クション、カチオン性脂質により媒介されるトランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、トランスダクシ
ョン、感染または他の方法により宿主細胞中への構築物
の導入を行うことができる。かかる方法は多くの標準的
研究室マニュアル、例えばDavis et al.BASIC METHODS
IN MOLECULAR BIOLOGY,(1986)に記載されている。

【０１３７】宿主中の構築物を慣用的方法で使用して、
組み換え配列によりコードされた遺伝子産物を得ること
ができる。別法として、慣用的ペプチド合成装置により
本発明ポリペプチドを合成的に得ることもできる。

【０１３８】適当なプロモーターの制御下で、哺乳動物
細胞、酵母、細菌、または他の細胞において蛋白を発現
させることができる。本発明ＤＮＡ構築物由来のＲＮＡ
を用いる無細胞翻訳系を用いてかかる蛋白を得ることも
できる。原核宿主および真核宿主についての使用に適す
るクローニングおよび発現ベクターはSambrook et al.,
MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,2nd Ed.,Cold
Sprong Harbor Laboratory Press,Cold Spring Haybo
r,N.Y.(1989)により記載されている。

【０１３９】一般的には、組み換え発現ベクターは、複
製開始点、下流構造配列の転写を指令する高発現遺伝子
由来のプロモーター、およびベクターに細胞を曝露した
後のベクター含有細胞の単離を可能にする選択可能マー
カーを含むであろう。特に、３−ホスホグリセレートキ
ナーゼ（ＰＧＫ）のごとき糖分解酵素、ａ−ファクタ
ー、ホスファターゼ、および熱ショック蛋白をコードし
ている遺伝子由来のプロモーターが適当なプロモーター
である。選択可能マーカーは、E.coliのアンピシリン耐
性遺伝子およびS.cerevisiaeのｔｒｐ１遺伝子を包含す
る。

【０１４０】ベクター中にエンハンサー配列を挿入する
ことにより、本発明ポリペプチドをコードしているＤＮ
Ａの高等真核細胞による転写を増大させることができ
る。エンハンサーはＤＮＡのシス−作用性エレメントで
あり、通常には、約１０ないし３００ｂｐであり、特定
の宿主細胞タイプにおけるプロモーターの転写活性を増
大するように作用する。エンハンサーの例は、複製開始
点の後期側１００ないし２７０ｂｐに位置するＳＶ４０
エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモータ
ー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサ
ー、ならびにアデノウイルスエンハンサーを包含する。

【０１４１】一般的には、本発明ポリペプチドの異種構
造配列をコードしている本発明ポリヌクレオチドを標準
的方法を用いてベクター中に挿入してそれが発現用プロ
モーターに作動可能に連結されるようにする。転写開始
部位がリボソーム結合部位の５’付近に位置するように
ポリヌクレオチドを置く。リボソーム結合部位は、発現
されるポリペプチドの翻訳を開始するＡＵＧの５’であ
る。一般的には、開始コドン（通常にはＡＵＧ）から始
まる他の読み枠は存在せず、他の読み枠はリボソーム結
合部位と開始ＡＵＧとの間には存在しないであろう。ま
た、一般的には、ポリペプチド末端に翻訳終止コドンが
存在し、転写される領域の３’末端に適当に分散して存
在するポリアデニレーションシグナルおよび転写終止シ
グナルが存在するであろう。

【０１４２】翻訳された蛋白の小胞体ルーメン中、ペリ
プラスム空間中または細胞外環境中への分泌のために、
適当な分泌シグナルを発現されるポリペプチド中に含ま
せることができる。シグナルはポリペプチドに対する内
在性のものであってもよく、あるいは異種シグナルであ
ってもよい。

【０１４３】ポリペプチドを、融合蛋白のごとき修飾形
態で発現させてもよく、それは分泌シグナルのみならず
さらなる異種機能領域を含んでいてもよい。よって、例
えば、さらなるアミノ酸の領域、詳細には荷電アミノ酸
の領域をポリペプチドのＮ末端に付加して宿主細胞中、
精製中またはさらなる取り扱いおよび保存中の安定性お
よび維持を改善してもよい。また、精製を容易にする領
域をポリペプチド付加してもよい。最終的なポリペプチ
ドの調製の前にかかる領域を除去することができる。特
に、分泌または外分泌を引き起こすための、安定性を改
善するための、そして精製を容易にするためのペプチド
部分のポリペプチドへの付加は当業者によく知られてい
る日常的方法である。

【０１４４】本発明ポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドの増殖、維持または発現に適した原核宿主は、Escher
ichia coli、Bacillus subtilisおよびSalmonella typh
imuriumを包含する。Pseudomonas、Streptomycesおよび
Staphylococcusの種々の種はこの点において適当な宿主
である。そのうえ、この点において当業者に知られてい
る他の多くの宿主も使用可能である。

【０１４５】典型的であるが限定的でない例として、細
菌用途の有用発現ベクターは、選択可能マーカーおよび
市販プラスミド（よく知られたクローニングベクターｐ
ＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝学的エレメン
トを含んでなる）由来の細菌の複製開始点を含んでな
る。かかる市販ベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３
（Pharmacia Fine Chemicals,Uppsala,Sweden）および
ＧＥＭ１（Promega Biotec,Madison,WI,USA）を包含す
る。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分を適当なプロモ
ーターおよび発現すべき構造配列と結合する。

【０１４６】適当な宿主株の形質転換および適当な細胞
密度までの宿主株の増殖の後、選択したプロモーターが
誘導可能である場合には、適当な手段（例えば、温度シ
フトまたは化学誘導剤への曝露）によりそれを誘導し、
適当時間細胞を培養する。

【０１４７】典型的には、次いで、細胞を遠心分離によ
り集め、物理的または化学的手段により破壊し、得られ
た粗抽出物をさらなる精製に供する。

【０１４８】凍結−融解繰り返し、ソニケーション、機
械的破壊を包含する慣用的方法、あるいは当業者によく
知られた細胞溶解剤の使用により、蛋白発現に使用する
微生物細胞を破壊することができる。

【０１４９】同様に、種々の哺乳動物細胞培養系を発現
に使用することができる。哺乳動物発現系の例は、Gluz
man et al.,Cell 23:175(1981)に記載されたサル・腎臓
線維芽細胞ＣＯＳ−７細胞系を包含する。適合するベク
ターを発現させうる他の細胞系は、例えば、Ｃ１２７、
３Ｔ３、ＣＨＯ、Ｈｅｌａ、ヒト・腎臓２９３およびＢ
ＨＫ細胞を包含する。

【０１５０】哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適
当なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに必要な
リボソーム結合部位、ポリアデニレーション部位、スプ
ライスドナーおよびアクセプター部位、転写終止配列、
および発現に必要とされる５’隣接非転写配列を含んで
なる。この点において、特定の好ましい具体例におい
て、ＳＶ４０スプライス部位由来のＤＮＡ配列、および
ＳＶ４０ポリアデニレーション部位が、これらのタイプ
の所望の非転写遺伝学的エレメントとして用いられる。

【０１５１】硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、
酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィ
ー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互
作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーお
よびレクチンクロマトグラフィーを包含するよく知られ
た方法により、ＣＧＲＰ−ＲＣＦポリペプチドを組み換
え細胞培養物から回収し、精製することができる。単離
または精製中にポリペプチドが変性している場合には、
蛋白の再生のためのよく知られた方法を用いて活性コン
ホーメーションを再生することができる。

【０１５２】本発明ポリペプチドは、天然の精製産物、
化学合成法による産物、細菌、酵母、高等植物、昆虫お
よび哺乳動物細胞を包含する原核細胞または真核細胞か
ら組み換え法により得られた産物を包含する。組み換え
法に使用する宿主によっては、本発明ポリペプチドはグ
リコシレーションされていてもよく、されていなくても
よい。さらに、いくつかの場合、宿主によるプロセスの
結果として本発明ポリペプチドは最初の修飾されたメチ
オニン残基を含みうる。

【０１５３】本発明に従って、ＣＧＲＰ−ＲＣＦポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドを種々の適用例、詳細に
はＣＧＲＰ−ＲＣＦの化学的および生物学的特性を用い
る適用例に使用することができる。さらなる適用例は、
細胞、組織および器官の疾病の診断および治療に関す
る。本発明のこれらの態様を以下の議論によってさらに
説明する。

【０１５４】ポリヌクレオチドアッセイ 本発明は、例えば診断試薬としての相補的ポリヌクレオ
チドの検出のためのＣＧＲＰ−ＲＣＦポリヌクレオチド
の使用に関する。機能不全に関連した変異形態のＣＧＲ
Ｐ−ＲＣＦの検出は、ＣＧＲＰ−ＲＣＦの発現低下、発
現過剰または変化した発現から生じる疾病の診断または
かかる疾病に対する感受性に関する診断を付加し、ある
いは明確化しうる診断道具を提供するであろう。ヒト・
ＣＧＲＰ−ＲＣＦ遺伝子における変異を有する個体を、
種々の方法により、ＤＮＡレベルにおいて検出すること
ができる。診断のための核酸を、患者の細胞、体液（例
えば、血液、尿、唾液）、生検および剖検材料から得る
ことができる。ゲノムＤＮＡを検出用に直接使用しても
よく、あるいは分析前にＰＣＲ（Saiki et al.,Nature,
324:163-166(1986)）を用いることにより酵素的に増幅
してもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡを同じように使用し
てもよい。一例として、ＣＧＲＰ−ＲＣＦをコードして
いる核酸に相補的なＰＣＲプライマーを用いてＣＧＲＰ
−ＲＣＦの発現および変異を同定および分析することが
できる。例えば、正常遺伝子型との比較における増幅生
成物のサイズの変化により、欠失および挿入を検出する
ことができる。増幅したＤＮＡを標識ＣＧＲＰ−ＲＣＦ
ＲＮＡとハイブリダイゼーションさせることにより、
あるいは別法として放射性標識ＣＧＲＰ−ＲＣＦアンチ
センスＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションさせること
により点突然変異を同定することができる。好ましく
は、ＲＮａｓｅ Ａ消化または融点温度の相違により、
マッチした配列とミスマッチ２本鎖とを識別することが
できる。

【０１５５】直接ＤＮＡ配列決定により、もとの遺伝子
と変異を有する遺伝子との間の配列の相違も明らかとな
りうる。さらに、クローンされたＤＮＡセグメントをプ
ローブとして用いて特定のＤＮＡ配列を検出してもよ
い。ＰＣＲまたは他の増幅方法を適当に用いることによ
り、かかる方法の感度をおおいに向上させることができ
る。例えば、配列決定プライマーを、２本鎖ＰＣＲ生成
物またはＰＣＲ変法により得られた１本鎖鋳型分子とと
もに使用する。放射性標識を用いる慣用的手順により、
あるいは蛍光タグを用いる自動配列決定法により配列決
定を行う。

【０１５６】変性剤有りまたは無しにおけるゲル中のＤ
ＮＡの電気泳動の移動度の変化を検出することにより、
ＤＮＡ配列の相違に基づく遺伝学的試験を行うことがで
きる。高分解能ゲル電気泳動により、小規模な配列の欠
失および挿入を可視化することができる。個々の融点ま
たは部分的に融解する温度によってＤＮＡフラグメント
がゲル中の異なる位置において移動が阻止される変性ホ
ルムアミドグラジエントゲル上で異なる配列のＤＮＡフ
ラグメントを識別することができる（例えば、Myers et
al.,Science,230:1242(1985)参照）。

【０１５７】ＲＮａｓｅおよびＳ１保護のごときヌクレ
アーゼ保護アッセイまたは化学的開裂法により、特定の
位置における配列の変化も明らかとなる（例えば、Cott
on et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:4397-4401(198
5)）。

【０１５８】よって、ハイブリダイゼーション、ＲＮａ
ｓｅ保護、化学的開裂、直接ＤＮＡ配列決定または制限
酵素の使用（例えば、制限フラグメント長多型性（ＲＦ
ＬＰ））およびゲノムＤＮＡのサザンブロッティングの
ごとき方法により、特定のＤＮＡ配列の検出を行うこと
ができる。

【０１５９】本発明のさらなる態様によれば、糖尿病、
偏頭痛、痛みおよび炎症、パーキンソン病、急性心臓疾
患、低血圧、残尿、骨粗鬆症、高血圧、狭心症、心筋梗
塞、潰瘍、喘息、アレルギー、精神病、鬱病、嘔吐、良
性前立腺肥大症、パジェット病、肥満、癌、巨人症等、
または上記疾病に対する感受性の決定のための方法が提
供される。よって、ＣＧＲＰ−ＲＣＦにおける変異また
はＣＧＲＰ−ＲＣＦの発現は糖尿病、偏頭痛、痛みおよ
び炎症、パーキンソン病、急性心臓疾患、低血圧、残
尿、骨粗鬆症、高血圧、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘
息、アレルギー、精神病、鬱病、嘔吐、良性前立腺肥大
症、パジェット病、肥満、癌、巨人症等に対する感受性
を示すものであり、かかる感受性を確認するためのアッ
セイに上記核酸配列を用いることができる。よって、例
えば、該アッセイを用いて本明細書記載のヒト・ＣＧＲ
Ｐ−ＲＣＦ蛋白の変異、例えば欠失、切断、挿入、フレ
ームシフト等を検出することができ、かかる変異は上記
疾病に対する感受性を示すものである。

【０１６０】例えば、ＤＮＡ配列決定アッセイを用いて
変異を確認することができる。血液試料（これに限らな
い）を包含する組織試料ををヒト患者から得る。当該分
野で知られた方法により試料を処理してＲＮＡを捕捉す
る。ｍＲＮＡに存在するポリアデノシン伸長部分にハイ
ブリダイゼーションするポリチミジン残基からなるオリ
ゴヌクレオチドプライマーを添加することにより、第１
鎖ｃＤＮＡをＲＮＡ試料から合成する。逆転写酵素およ
びデオキシリボヌクレオチドを添加して第１鎖ｃＤＮＡ
を合成する。本発明ＤＮＡ修復蛋白のＤＮＡ配列に基づ
いてプライマー配列を合成する。一般的には、プライマ
ー配列は少なくとも１５個の連続した塩基を含んでな
り、少なくとも３０個またはちょうど５０個の連続した
塩基を含んでいてもよい。

【０１６１】よって、ハイブリダイゼーション、ＲＮａ
ｓｅ保護、化学的開裂、直接ＤＮＡ配列決定または制限
酵素の使用（例えば、制限フラグメント長多型性（ＲＦ
ＬＰ））およびゲノムＤＮＡのサザンブロッティングの
ごとき方法により、特定のＤＮＡ配列の検出および配列
レベルの定量を行うことができる。本発明は、患者由来
の試料から、図１（配列番号：１）の配列を有するポリ
ヌクレオチドの低下した発現レベルを決定することを特
徴とする、糖尿病、偏頭痛、痛みおよび炎症、パーキン
ソン病、急性心臓疾患、低血圧、残尿、骨粗鬆症、高血
圧、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、アレルギー、精神
病、鬱病、嘔吐、良性前立腺肥大症、パジェット病、肥
満、癌、巨人症等の診断方法を提供する。ポリヌクレオ
チド定量について当該分野でよく知られた方法、例え
ば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護、ノーザン
ブロッティングおよび他のハイブリダイゼーション法を
用いて、低下したポリヌクレオチドの発現を測定するこ
とができる。

【０１６２】より慣用的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配
列決定以外にも、in situ分析により変異を検出するこ
とができる。

【０１６３】中期染色体スプレッドに対するｃＤＮＡク
ローンの蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳ
Ｈ）を用いて正確な染色体位置を知ることができる。こ
れをいかにして行うのかという一例として、QIAEX II
ＤＮＡ精製キット（QIAGEN,Inc.,Chastworth,CA）を用
いてＣＧＲＰ−ＲＣＦ ＤＮＡを消化し、精製し、Super
CosI コスミドベクター（STRATAGENE,LaJolla,CA）に
連結する。Qiagen Plasmid Purification Kit（QIAGEN,
Inc.,Chastworth,CA）を用いてＤＮＡを精製し、BioNic
k Labeling Kit（GibcoBRL,Life Technologies Inc.,Ga
ithersburg,MD）を用いてビオチン−ｄＡＴＰの存在下
におけるニックトランスレーションにより１ｍｇを標識
する。GENE-TECT Detection System（CLONTECH Laborat
ories,Inc.Palo Alto,CA）を用いてビオチン化を検出す
る／した。ONCOR Light Hybridization Kit（ONCOR,Gai
thersburg,MD）を用いてin situハイブリダイゼーショ
ンをスライドガラス上で行って中期染色体上の単一コピ
ー配列を検出する。２０％ＦＣＳ、３％ ＰＨＡおよび
ペニシリン／ストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ
１６４０中で正常ドナーの末梢血を３日間培養し、１０
^-7Ｍメトトレキセートで１７時間同調させ、補足物不含
ＲＰＭＩで２回洗浄する。細胞を１０^-3Ｍチミジンとと
もに７日間インキュベーションする。コルセミド（０．
５ｍｇ／ｍｌ）共存下２０分のインキュベーション後、
細胞を中期に捕捉し、次いで、７５ｍＭ ＫＣｌ中３７
℃で１５分低張溶解を行う。次いで、細胞ペレットを遠
心分離し、Carnoyの固定液（３：１ メタノール／酢
酸）中で固定する。

【０１６４】１滴の懸濁液をスライドガラス上に滴下
し、風乾することにより中期スプレッドを調製する。ブ
ロックするヒト・胎盤ＤＮＡ（１ｍｇ／ｍｌ）を添加し
た１０ｍｌのハイブリダイゼーションミックス（５０％
ホルムアミド、２ｘＳＳＣ、１％デキストラン硫酸）中
に懸濁された１００ｎｇのプローブを添加することによ
りハイブリダイゼーションを行う。プローブミックスを
７０℃の水浴で１０分間変性させ、３７℃で１時間イン
キュベーションし、次いで、前以て暖めておいた（３７
℃）スライドガラス上に置く。前以てプローブミックス
を７０％ホルムアミド／２ｘＳＳＣ中７０℃で変性さ
せ、エタノールシリーズ中で脱水し、４℃に冷却してお
く。

【０１６５】スライドガラスを加湿チャンバ中３７℃で
１６時間インキュベーションする。スライドガラスを５
０％ホルムアミド／２ＸＳＳＣで１０分間４１℃で洗浄
し、次いで、３７℃で７分間洗浄する。製造者のプロト
コールに従ってスライドガラスをＦＩＴＣ−アビジン
（ONCOR,Gaithersburg,MD）とともにインキュベーショ
ンすることによりハイブリダイゼーションプローブを検
出する。Leitz ORTHOPLAN 2エピ蛍光顕微鏡を用いてス
ライドガラスを可視化し、Imagenetics Computerおよび
MacIntoshプリンターを用いて５つのコンピューター映
像を得る。

【０１６６】配列が正確な染色体位置にマッピングされ
たら、遺伝学的地図のデータを用いて染色体上の配列の
物理的位置を修正することができる。かかるデータは、
例えば、V.McKusick,Mendelian Inheritance in Man
（コンピューターによりオンラインで利用可能）に見い
だされる。次いで、連関分析（物理的に隣接した遺伝子
の同時遺伝）により、同じ染色体にマッピングされた遺
伝子と疾病との関連を確認する。

【０１６７】次に、罹病個体および罹病していない個体
間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定することが
必要である。変異は罹病個体の一部または全部において
観察されるが正常個体においては観察されない場合、変
異は疾病の病因の可能性がある。

【０１６８】染色体アッセイ 本発明配列は染色体の同定にも価値がある。配列は個々
のヒト・染色体上の特定位置に特別に標的化されてお
り、これとハイブリダイゼーションしうる。そのうえ、
染色体上の特定部位を同定する必要性が現在ある。現在
のところ、実際の配列データ（繰り返し多型性）に基づ
いて染色体をマーキングする少数の試薬が染色体のマー
キングに利用できる。本発明による染色体へのＤＮＡの
マッピングは、配列を疾病関連遺伝子と関連づけること
において重要な最初の工程である。

【０１６９】この点において、特定の好ましい具体例に
おいて、本明細書開示のｃＤＮＡを用いてＣＧＲＰ−Ｒ
ＣＦ遺伝子のゲノムＤＮＡをクローンする。種々のよく
知られた方法および一般的に市販されているライブラリ
ーを用いてこれを行うことができる。この目的のために
よく知られた方法を用いてゲノムＤＮＡをin situ染色
体マッピングに使用する。典型的には、染色体マッピン
グのための日常的手順に従う場合には、良好なin situ
ハイブリダイゼーションシグナルを生じるゲノムプロー
ブを同定するためにはいくつかの試行錯誤が必要である
かもしれない。

【０１７０】いくつかの場合、さらに、ｃＤＮＡからＰ
ＣＲプライマー（好ましくは１５ないし２５ｂｐ）を調
製することにより、配列を染色体にマッピングすること
ができる。遺伝子の３’非翻訳領域のコンピューター分
析を用いてゲノムＤＮＡ中の１つよりも多いエキソンに
またがらないプライマーを迅速に選択し、かくして、増
幅を複雑化する。次いで、これらのプライマーを、個々
のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲス
クリーニングに用いる。プライマーに対応したヒト遺伝
子を含有するハイブリッドのみが増幅フラグメントを生
じるであろう。

【０１７１】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、個々のＤＮＡを個々の染色体に帰属するための迅速
な手順である。類似の方法で同じオリゴヌクレオチドプ
ライマーに関して本発明を用いて、特定の染色体由来の
フラグメントのパネルまたは大きなゲノムクローンのプ
ールに関して下位の位置決めを行うことができる。染色
体へのマッピングに同様に用いることのできる他のマッ
ピング法は、in situハイブリダイゼーション、標識フ
ロー−ストアド（flow-stored）染色体に関するプレス
クリーニングおよび染色体特異的ｃＤＮＡライブラリー
を構築するためのハイブリダイゼーションによるプレセ
レクションを包含する。

【０１７２】中期染色体スプレッドに対するｃＤＮＡク
ローンの蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳ
Ｈ）を用いて、正確な染色体位置を１工程で知ることが
できる。この方法を５０または６０ｂｐ程度の短いｃＤ
ＮＡとともに用いることができる。この方法に関するレ
ビューについては、Verma et al.,HUMAN CHROMOSOME:A
MANUAL OF BASIC TECHNIQUES,Pergamon Press,New York
(1988)参照。

【０１７３】物理的マッピングおよび遺伝学的マッピン
グ法の現在の分離能によれば、疾病に関連した染色体領
域に正確に位置決めされるｃＤＮＡは５０ないし５００
個の潜在的病因遺伝子につき１つでありうる（１メガベ
ースのマッピング分離能とし、２０ｋｂにつき１個の遺
伝子と仮定）。

【０１７４】ポリペプチドアッセイ 本発明は、細胞および組織中のＣＧＲＰ−ＲＣＦ蛋白レ
ベルの検出のための定量および診断アッセイのごとき診
断アッセイにも関し、正常および異常なレベルの決定を
包含する。よって、例えば、正常対照組織試料と比較し
て本発明ＣＧＲＰ−ＲＣＦ蛋白の過剰発現を検出するた
めの本発明診断アッセイを用いて、例えば腫瘍の存在を
検出してもよい。宿主由来の試料中の本発明ＣＧＲＰ−
ＲＣＦ蛋白のごとき蛋白のレベルを決定するのに用いる
ことのできるアッセイ法は当業者によく知られている。
かかるアッセイ法は、ラジオイムノアッセイ、競争結合
アッセイ、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡア
ッセイを包含する。これらのうち、ＥＬＩＳＡがしばし
ば好ましい。主にＥＬＩＳＡアッセイは、ＣＧＲＰ−Ｒ
ＣＦに対して特異的な抗体、好ましくはモノクローナル
抗体を調製することを特徴とする。さらに、一般的に
は、モノクローナル抗体に結合するレポーター抗体を調
製する。レポーター抗体は、放射性試薬、蛍光試薬また
は酵素試薬検のごとき検出可能試薬に結合しているが、
この実施例ではセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ酵素
に結合している。

【０１７５】ＥＬＩＳＡを行うために試料を宿主から取
り、試料中の蛋白を結合する固体支持体、例えば、ポリ
スチレンディッシュ上でインキュベーションする。次い
で、ウシ・血清アルブミンのごとき非特異的蛋白ととも
にインキュベーションすることによりディッシュ上の遊
離の蛋白結合部位を被覆する。次に、モノクローナル抗
体をディッシュ中でインキュベーションし、その間にモ
ノクローナル抗体は、ポリスチレンディッシュに結合し
ているＣＧＲＰ−ＲＣＦ蛋白に結合する。未結合モノク
ローナル抗体をバッファーで洗浄除去する。セイヨウワ
サビ・ペルオキシダーゼに連結されたレポーター抗体を
ディッシュ中に置き、レポーター抗体とＣＧＲＰ−ＲＣ
Ｆに結合しているモノクローナル抗体との結合を生じさ
せる。次いで、未結合レポーター抗体を洗浄除去する。
次いで、発色基質を包含するペルオキシダーゼ活性のた
めの試薬をディッシュに添加する。１次抗体および２次
抗体によりＣＧＲＰ−ＲＣＦに結合し、固定化されてい
るペルオキシダーゼは着色反応生成物を生じる。一定時
間の発色量は試料中のＣＧＲＰ−ＲＣＦ蛋白量を示す。
典型的には、標準曲線に対する参照により定量結果を得
る。

【０１７６】固体支持体に結合したＣＧＲＰ−ＲＣＦ特
異的抗体および標識ＣＧＲＰ−ＲＣＦおよび宿主由来の
試料が固体支持体上に通され、固体支持体に結合した検
出標識量と試料中のＣＧＲＰ−ＲＣＦ量とが相関関係を
有するものである競争アッセイを用いてもよい。

【０１７７】抗体 ポリペプチド、それらのフラグメントまたは他の誘導
体、それらのアナログ、またはそれらを発現する細胞を
免疫原として用いて、それらに対する抗体を製造するこ
とができる。さらに本発明は、キメラ、１本鎖、および
ヒト化抗体、ならびにＦａｂフラグメント、またはＦａ
ｂ発現ライブラリーの生成物を包含する。当該分野で知
られた種々の手順をかかる抗体およびフラグメントの製
造に使用してもよい。

【０１７８】ポリペプチドを動物に直接注射、あるいは
動物（好ましくは、非ヒト）にポリペプチドを投与する
ことにより、本発明配列に対応したポリペプチドに対し
て生起する抗体を得ることができる。次いで、そのよう
にして得られた抗体はポリペプチド自体に結合するであ
ろう。このようにして、ポリペプチドのフラグメントの
みしかコードしていない配列であっても、これを用いて
無傷のポリペプチドに結合する抗体を得ることができ
る。次いで、かかる抗体を用いて、ポリペプチドを発現
する組織からポリペプチドを単離することができる。

【０１７９】モノクローナル抗体の調製のために、連続
的な細胞系の培養により得られる抗体を製造する方法を
用いることができる。例は、ハイブリドーマ法（Kohler
andMilstein Nature 1975 256:495-497）、トリオーマ
法、ヒト・Ｂ細胞ハイブリドーマ法（Kozbor et al.,Im
munology Today 1983 4:72）およびヒト・モノクローナ
ル抗体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Co
le et al.Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy.
Alan R.Liss,Inc,pp 77-96(1985)）を包含する。

【０１８０】１本鎖抗体の製造に関して記載された方法
（米国特許第４，９４６，７７８号）を適用して、本発
明の免疫原性ポリペプチド生成物に対する１本鎖抗体を
製造することができる。また、トランスジェニックマウ
スまたは他の哺乳動物のごとき他の生物を用いて、本発
明の免疫原性ポリペプチド生成物に対するヒト化抗体を
発現させてもよい。

【０１８１】上記抗体を用いて、ポリペプチドを発現す
るクローンを単離または同定してもよく、あるいはアフ
ィニティークロマトグラフィーによる単離および／また
は精製のための固体支持体への抗体の結合により本発明
ポリペプチドを精製してもよい。

【０１８２】よって、特に、ＣＧＲＰ−ＲＣＦに対する
抗体を用いて糖尿病、偏頭痛、痛みおよび炎症、パーキ
ンソン病、急性心臓疾患、低血圧、残尿、骨粗鬆症、高
血圧、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、アレルギー、精
神病、鬱病、嘔吐、良性前立腺肥大症、パジェット病、
肥満、癌、巨人症等を抑制してもよい。

【０１８３】ＣＧＲＰ−ＲＣＦ結合分子およびアッセイ
さらに本発明は、ＣＧＲＰ−ＲＣＦ／ＣＧＲＰ受容体に
結合する結合分子のごとき分子の同定方法も提供する。
当業者に知られた多くの方法、例えば、パンニング（pa
nning）およびＦＡＣＳソーティングにより、結合分子
のごときＣＧＲＰ−ＲＣＦ／ＣＧＲＰ受容体に結合する
蛋白をコードしている遺伝子を同定することができる。
かかる方法は多くの研究室用マニュアル、例えば、Coli
gan et al.,Current Protocoles in Immunology 1(2)：
第５章（１９９１年）に記載されている。

【０１８４】例えば、発現クローニングをこの目的に用
いてもよい。この目的のために、ＣＧＲＰ−ＲＣＦおよ
びＣＧＲＰ受容体に応答する細胞からポリアデニル化Ｒ
ＮＡを調製し、ｃＤＮＡライブラリーをこのＲＮＡから
作成し、ライブラリーをプールに分割し、α−またはβ
−ＣＧＲＰに応答しない細胞中に各プールをトランスフ
ェクションする。次いで、形質転換細胞を標識α−また
はβ−ＣＧＲＰに曝露する（放射性ヨウ素化または部位
特異的プロテインキナーゼ認識部位を含めることといっ
た標準的方法を包含する種々のよく知られた方法により
α−またはβ−ＣＧＲＰを標識することができる）。曝
露後、細胞を固定し、α−またはβ−ＣＧＲＰの結合を
測定する。便利には、これらの手順をスライドガラス上
で行う。

【０１８５】α−またはβ−ＣＧＲＰ結合細胞を生じる
ｃＤＮＡについてプールを同定する。これらの陽性物か
らサブ−プール（sub-pool）を調製し、宿主細胞中にト
ランスフェクションし、上記のごとくスクリーニングす
る。反復サブ−プーリングおよび再スクリーニングプロ
セスを用いて、推定上受容体分子のごとき結合分子をコ
ードしている１種またはそれ以上のクローンを単離する
ことができる。

【０１８６】別法として、受容体分子のごとき結合分子
を発現する細胞から調製された膜または膜抽出物のごと
き細胞抽出物に標識リガンドを光アフィニティー結合さ
せることもできる。ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＰＡＧＥ）により架橋材料を分離し、Ｘ線フィルムに
曝露する。リガンド−受容体を含む標識複合体を切断
し、ペプチドフラグメントにまで分解し、蛋白微小配列
決定に供することができる。微小配列決定から得られた
アミノ酸配列を用いて、ｃＤＮＡライブラリーをスクリ
ーニングして結合分子と思われる分子をコードしている
遺伝子を同定するためのユニークまたは縮重したオリゴ
ヌクレオチドプローブを設計することができる。

【０１８７】本発明ポリペプチドを用いて、細胞中また
は無細胞調製物中において、ＣＧＲＰ−ＲＣＦ阻害分子
のＣＧＲＰ−ＲＣＦ結合能を評価することもできる。

【０１８８】アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセ
イおよび分子 ＣＧＲＰ受容体またはＣＧＲＰ−ＲＣＦ（の機能）また
はＣＧＲＰ−ＲＣＦ／ＣＧＲＰ受容体系を活性化させる
化合物（アゴニスト）、あるいはそれらの活性化を阻害
する化合物（アゴニスト）のスクリーニングプロセスに
おいて本発明ＣＧＲＰ−ＲＣＦを用いてもよい。

【０１８９】一般的には、かかるスクリーニング手順
は、表面にＣＧＲＰ−ＲＣＦ／ＣＧＲＰ受容体を発現す
る適当な細胞を提供することを含む。かかる細胞は、哺
乳動物、酵母、ショウジョウバエまたはE.coli由来の細
胞を包含する。詳細には、本発明受容体系をコードして
いるポリヌクレオチドを用いて細胞をトランスフェクシ
ョンし、そのことによりＣＧＲＰ−ＲＣＦ／ＣＧＲＰ受
容体を発現させる。次いで、発現したポリペプチドを試
験化合物と接触させて結合、機能的応答の刺激または阻
害を観察する。

【０１９０】１のかかるスクリーニング手順は、ＣＧＲ
Ｐ−ＲＣＦ／ＣＧＲＰ受容体を発現するようにトランス
フェクションされた黒色素胞の使用を包含する。かかる
スクリーニング方法はＰＣＴ ＷＯ９２／０１８１０
（１９９２年２月６日公開）に記載されている。

【０１９１】よって、例えば、ポリペプチドをコードし
ている黒色阻胞細胞をスクリーニングされるＣＧＲＰ受
容体リガンドおよび化合物に接触させることによる、Ｃ
ＧＲＰ−ＲＣＦ／ＣＧＲＰ受容体の活性化を阻害する化
合物のスクローニングにかかるアッセイを用いてもよ
い。リガンドにより発せられるシグナルの阻害は、化合
物が受容体系に対する潜在的アンタゴニストであるこ
と、すなわち、ＣＧＲＰ−ＲＣＦ／ＣＧＲＰ受容体の活
性化を阻害することを示すものである。

【０１９２】細胞をスクリーニングされる化合物に接触
させ、かかる化合物がシグナルを発するかどうか、すな
わち、ＣＧＲＰ−ＲＣＦ／ＣＧＲＰ受容体を活性化する
かどうかを決定することにより受容体系を活性化する化
合物を決定するためにスクリーニングを用いてもよい。

【０１９３】他のスクリーニング法は、ＣＧＲＰ−ＲＣ
Ｆ／ＣＧＲＰｃ受容体活性化により引き起こされる細胞
外ｐＨ変化を測定する系におけるＣＧＲＰ−ＲＣＦ／Ｃ
ＧＲＰ受容体を発現する細胞（例えば、トランスフェク
ションされたＣＨＯ細胞）の使用を包含するものであ
り、例えば、Science,246:181-296（１９８９年１０
月）に記載されている。例えば、ＣＧＲＰ−ＲＣＦ／Ｃ
ＧＲＰ受容体を発現する細胞に化合物を接触させてもよ
く、次いで、第２のメッセンジャー応答（例えば、シグ
ナル変換またはｐＨ変化）を測定して化合物がＣＧＲＰ
−ＲＣＦ／ＣＧＲＰ受容体を活性化または阻害するかど
うかを決定してもよい。

【０１９４】もう１つのかかるスクリーニング法は、Ｃ
ＧＲＰ−ＲＣＦおよびＣＧＲＰ受容体の両方をコードし
ているＲＮＡｓをXenopus卵母細胞中に導入して一時的
にＣＧＲＰ−ＲＣＦ／ＣＧＲＰ受容体を発現させること
を包含する。次いで、卵母細胞をＣＧＲＰ受容体リガン
ドおよびスクリーニングされる化合物に接触させ、次い
で、カルシウム、プロトン等の阻害または活性化、ある
いは受容体活性化を阻害すると考えられる化合物のスク
リーニングの場合にはシグナルの阻害または活性化を検
出してもよい。

【０１９５】もう１つのスクーニング法は、受容体系が
例えばホスホリパーゼＣもしくはＤあるいは他の蛋白に
連結されているＣＧＲＰ−ＲＣＦ／ＣＧＲＰ受容体を発
現させることを包含する。かかる細胞の典型例として、
ない非細胞、平滑筋細胞、胚の腎細胞等が挙げられる。
例えばホスホリパーゼまたは他の活性化され／発現され
た蛋白についての第２のシグナルから受容体系の活性化
または受容体系活性化の阻害を検出することにより、上
記のごとくスクリーニングを行ってもよい。

【０１９６】もう１つの方法は、表面に受容体系を有す
る細胞への標識リガンドの結合に対する阻害を決定する
ことによる、本発明受容体系の活性化を阻害する化合物
のスクリーニングを包含する。かかる方法は、ＣＧＲＰ
−ＲＣＦおよびＣＧＲＰ受容体の両方をコードしている
ＤＮＡｓで真核細胞をトランスフェクションして、細胞
が受容体系をその表面に発現するようにし、次いで、標
識形態の既知リガンドの存在下で化合物に細胞を接触さ
せることを包含する。例えば放射活性によりリガンドを
標識することができる。受容体系の放射活性を測定する
ことにより、受容体に結合する標識リガンド量を測定す
る。受容体系に結合する標識リガンドの減少により決定
されるように化合物が受容体系に結合する場合には、標
識リガンドの受容体系への結合は阻害されている。

【０１９７】もう１つの方法は、ＣＧＲＰ−ＲＣＦ／Ｃ
ＧＲＰ受容体により媒介されるｃＡＭＰおよび／または
アデニル酸シクラーゼ蓄積の阻害を決定することによる
ＣＧＲＰ−ＲＣＦ／ＣＧＲＰ受容体阻害剤のスクリーニ
ングを包含する。かかる方法は、ＣＧＲＰ−ＲＣＦ／Ｃ
ＧＲＰ受容体系で真核細胞をトランスフェクションして
細胞表面に受容体系を発現させることを用いる。次い
で、受容体系の存在下で細胞を潜在的アンタゴニストに
曝露する。次いで、ｃＡＭＰ蓄積量を測定する。潜在的
アンタゴニストは受容体系に結合し、かくしてリガンド
結合を阻害し、その結果ＣＧＲＰ−ＲＣＦ／ＣＧＲＰ受
容体により媒介されるｃＡＭＰのレベル、またはアデニ
ル酸シクラーゼ活性が低下するであろう。

【０１９８】また本発明は、ＣＧＲＰ受容体またはＣＧ
ＲＰ−ＲＣＦ／ＣＧＲＰ受容体に結合しうることが知ら
れていないリガンドがかかる受容体または受容体系に結
合できるかどうかを決定する方法であって、ＣＧＲＰ−
ＲＣＦ／ＣＧＲＰ受容体系へのリガンド結合を可能にす
る条件下でＣＧＲＰ−ＲＣＦ／ＣＧＲＰ受容体を発現す
る哺乳動物細胞をＣＧＲＰ受容体と接触させ、受容体に
結合するリガンドの存在を検出し、そのことにより、リ
ガンドがＣＧＲＰ−ＲＣＦ／ＣＧＲＰ受容体に結合する
かどうかを決定することを特徴とする方法を提供する。
アゴニストおよび／またはアンタゴニストを決定するた
めの上記系を、受容体系に結合するリガンドの決定に用
いてもよい。

【０１９９】潜在的なＣＧＲＰ−ＲＣＦまたはＣＧＲＰ
−ＲＣＦ／ＣＧＲＰ受容体アンタゴニストの例は、抗
体、またはいくつかの場合にはオリゴヌクレオチドであ
り、それらはＣＧＲＰ−ＲＣＦまたはＣＧＲＰ−ＲＣＦ
／ＣＧＲＰ受容体に結合してポリペプチドを妨害する。

【０２００】潜在的なアンタゴニストは、ＣＧＲＰ−Ｒ
ＣＦ／ＣＧＲＰ受容体のリガンドに密接に関連した蛋白
も包含し、生物学的機能を失っていて受容体系に結合し
た場合に応答を誘発しないリガンドのフラグメントも包
含する

【０２０１】潜在的なアンタゴニストは、アンチセンス
法を用いて製造されるアンチセンス構築物も包含する。
アンチセンス法を用いて、三重螺旋形成またはアンチセ
ンスＤＮＡもしくはＲＮＡ（どちらの方法もＤＮＡまた
はＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づいている）
により遺伝子発現をコントロールすることができる。例
えば、本発明成熟ポリペプチドをコードしているポリヌ
クレオチド配列の５’コーディング部分を用いて、長さ
約１０ないし４０塩基のアンチセンスＲＮＡオリゴヌク
レオチドを設計する。転写に関与する遺伝子の領域に相
補的であるようにＤＮＡオリゴヌクレオチドを設計し
（三重螺旋−Lee et al.,Nucl.Acids Res.,6:3073(197
9);Cooney et al,Science,241:456(1988);およびDervan
et al.,Science,251:1360(1991)参照）、そのことによ
りＣＧＲＰ−ＲＣＦの転写および生成を防止し、そのこ
とにより、ＣＧＲＰ−ＲＣＦの転写および産生を防止す
る。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビ
ボにおいてｍＲＮＡにハイブリダイゼーションし、ｍＲ
ＮＡ分子のＣＧＲＰ−ＲＣＦへの翻訳をブロックする
（アンチセンス−Okano,J.Neurochem.,56:560(1991);Ol
igodeoxynucleotides asAntisense Inhibitors of Gene
Expression,CRC Press,Boca Raton,FL(1988)）。上記
オリゴヌクレオチドを細胞に送達して、アンチセンスＲ
ＮＡまたはＤＮＡがインビボにおいて発現されてＣＧＲ
Ｐ−ＲＣＦの生成を阻害するようにすることもできる。

【０２０２】もう１つの潜在的なアンタゴニストは、Ｃ
ＧＲＰ−ＲＣＦまたはＣＧＲＰ−ＲＣＦ／ＣＧＲＰ受容
体に結合する小型有機分子であり、それらはリガント近
接を不可能にして正常な生物学的活性を妨害する。

【０２０３】潜在的なアンタゴニストは、可溶性形態の
ＣＧＲＰ−ＲＣＦ、例えばフラグメントも包含し、それ
はＣＧＲＰ受容体に結合し、リガンドと膜結合ＣＧＲＰ
−ＲＣＦ／ＣＧＲＰ受容体との相互作用を妨害する。

【０２０４】ＣＧＲＰ−ＲＣＦは、多くの病因を包含す
る多くの生物学的機能の要因である。したがって、一方
ではＣＧＲＰ−ＲＣＦまたはＣＧＲＰ−ＲＣＦ／ＣＧＲ
Ｐ受容体を刺激し、他方ではＣＧＲＰ−ＲＣＦまたはＣ
ＧＲＰ−ＲＣＦ／ＣＧＲＰ受容体を阻害しうる化合物お
よび薬剤を見いだすことが望ましい。

【０２０５】一般的には、ＣＧＲＰ−ＲＣＦまたはＣＧ
ＲＰ−ＲＣＦ／ＣＧＲＰ受容体に対するアゴニストを、
パーキンソン病、急性心臓疾患、低血圧、残尿の予防ま
たは治療のために使用する。

【０２０６】ＣＧＲＰ−ＲＣＦまたはＣＧＲＰ−ＲＣＦ
／ＣＧＲＰ受容体に対するアンタゴニストを、高血圧、
狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、アレルギー、精神病、
鬱病、偏頭痛、嘔吐および良性前立腺肥大症の予防また
は治療のために使用してもよい。

【０２０７】アゴニストを用いて骨粗鬆症を治療しても
よい。なぜなら、ＣＧＲＰは破骨細胞により媒介される
骨吸収を阻害し、骨形成を刺激するからである。これと
同じ様式で、高カルシウム血症を治療することもでき
る。同様に、アゴニストを用いてパジェット病を治療し
てもよい。

【０２０８】またアゴニストを用いて、内皮細胞増殖に
対するＣＧＲＰの刺激効果により血管形成を刺激し、傷
の治癒を促進してもよい。

【０２０９】またアゴニストを用いて肥満を治療しても
よい。なぜなら、ＣＧＲＰは、食欲および腸の運動を減
退させることにより摂食挙動をコントロールするからで
ある。

【０２１０】またアゴニストを用いて神経再生を刺激し
てもよい。なぜなら、ＣＧＲＰはＣＮＳにおける栄養剤
だからである。

【０２１１】またアゴニストを用いて、血管透過性を増
大させることにより免疫応答を促進してもよい。

【０２１２】アゴニストを用いてスーパーオキシド産生
を阻害してもよい。スーパーオキシド産生は細胞ダメー
ジを引き起こし、癌のごとき疾病を引き起こしうること
が、当該分野において知られている。

【０２１３】またアンタゴニストを用いてＣＮＳ痛覚伝
達を阻害し、長期にわたる血管拡張により引き起こされ
る慢性炎症を治療し、関節炎、成人性糖尿病、心臓血管
系疾患を治療し、偏頭痛を治療してもよい。

【０２１４】またアンタゴニストを用いて肺のカルチノ
イドを予防してもよい。なぜなら、ＣＧＲＰレベルの上
昇がこの疾病期間中の肺において見られるからである。

【０２１５】さらに本発明は、過剰なＣＧＲＰ−ＲＣＦ
活性に関連した異常な症状の治療方法であって、医薬上
許容される担体と一緒になった有効量の上記阻害化合物
（アンタゴニスト）を対象に投与して、ＣＧＲＰ−ＲＣ
Ｆ／ＣＧＲＰ受容体への受容体の結合をブロックするこ
とにより、あるいは第２のシグナルを阻害することによ
り活性化を阻害し、そのことにより、異常な症状を改善
することを特徴とする方法を提供する。

【０２１６】また本発明は、ＣＧＲＰ−ＲＣＦ活性の発
現低下に関連した異常な症状の治療方法であって、上記
の本発明受容体系を活性化する有効量の化合物（アゴニ
スト）を医薬上許容される担体と一緒に対象に投与し、
そのことにより、異常な症状を改善することを特徴とす
る方法を提供する。

【０２１７】組成物およびキット 可溶性形態のＣＧＲＰ−ＲＣＦ、およびかかるポリペプ
チド受容体系を活性化または阻害する化合物を、適当な
医薬担体と組み合わせて用いることができる。かかる組
成物は、治療上有効量のポリペプチドまたは化合物、お
よび医薬上許容される担体または賦形剤を含んでなる。
かかる担体は、セイライン、緩衝化セイライン、デキス
トロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれ
らの混合物を包含するが、これらに限らない。

【０２１８】また本発明は、上記ポリヌクレオチドまた
はポリペプチド、あるいはアゴニストまたはアンタゴニ
ストを含んでなる組成物に関する。よって、細胞、組織
または生物について使用される未滅菌または滅菌担体、
例えば、対象への投与に適した医薬担体と組み合わせて
本発明ポリペプチドを用いてもよい。かかる組成物は、
例えば、媒体、添加物または治療上有効量の本発明ポリ
ペプチドおよび医薬上許容される担体または賦形剤を含
んでなる。かかる担体は、セイライン、緩衝化セイライ
ン、デキストロース、水、グリセロール、エタノールお
よびそれらの混合物を包含するが、これらに限らない。
処方は投与モードに適合すべきである。

【０２１９】さらに本発明は、上記本発明組成物の１種
またはそれ以上の成分を充填した１個またはそれ以上の
容器を含んでなる医薬パックおよびキットに関する。

【０２２０】投与 本発明のポリペプチドおよび他の化合物を単独で、ある
いは治療化合物のごとき他の化合物と組み合わせて使用
してよい。

【０２２１】効果的で便利な方法、例えば、特に、局
所、経口、肛門、膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、
鼻腔内または皮内ルートによる投与を包含する方法で医
薬組成物を投与してよい。

【０２２２】一般的には、医薬組成物を、個々の徴候ま
たは徴候（複数）の治療または予防の有効な量で投与す
る。一般的には、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重の量
で組成物を投与する。大部分の場合、１日につき約８ｍ
ｇ／ｋｇ体重をこえない量で組成物が投与されるであろ
う。好ましくは、大部分の場合、１日につき用量は約１
０μｇ／ｋｇ体重ないし約１ｍｇ／ｋｇ体重である。症
状、その重さ、投与経路、合併症等を考慮して、各治療
様式についての標準的方法および症状により最適用量が
決定されることが理解されよう。

【０２２３】遺伝子治療 インビボにおいて、すなわちしばしば「遺伝子治療」と
呼ばれる治療様式においてポリペプチドを発現させるこ
とにより、ＣＧＲＰ−ＲＣＦポリヌクレオチド、ポリペ
プチド、ポリペプチドであるアゴニストおよびアンタゴ
ニストを本発明に従って使用することができる。

【０２２４】よって、例えば、ポリペプチドをコードし
ているＤＮＡまたはＲＮＡのごときポリヌクレオチドで
患者からの細胞をエクスビボで処理し、次いで、ポリペ
プチドで治療すべき患者に処理細胞を与えてもよい。例
えば、本発明ポリペプチドをコードしているＲＮＡを含
むレトロウイルスプラスミドベクターの使用により細胞
をエクスビボで処理してもよい。かかる方法は当該分野
においてよく知られており、本発明におけるそれらの使
用は本明細書の教示から明らかである。

【０２２５】同様に、当該分野において知られた方法に
より、インビボでのポリペプチドの発現のために細胞を
インビボで処理してもよい。例えば、上記のようにレプ
リコン欠損レトロウイルスベクター中での発現のために
本発明ポリヌクレオチドを処理してもよい。次いで、レ
トロウイルス発現構築物を単離し、パッケージング細胞
中に導入し、本発明ポリペプチドをコードしているＲＮ
Ａを含むレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入
して、パッケージング細胞が対象遺伝子を含有する感染
性ウイルス粒子を産生するようにすることができる。イ
ンビボでの細胞の処理およびインビボでのポリペプチド
の発現のためにこれらのプロデューサー細胞を患者に投
与することができる。かかる方法により本発明ポリペプ
チドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、
本発明の教示から当業者に明らかなはずである。

【０２２６】本明細書において上で述べたレトロウイル
スプラスミドベクターが由来するレトロウイルスは、モ
ロニーマウス・白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラ
ウスサルコーマウイルス、ハーベイサルコーマウイル
ス、トリ・白血病ウイルス、ギボンサル・白血病ウイル
ス、ヒト・免疫不全ウイルスのごときレトロウイルス、
アデノウイルス、ミエロプロリファレイティブサルコー
マウイルス（Myeloproliferative Sarcomavirus）、お
よび哺乳動物腫瘍ウイルスを包含するが、これらに限ら
ない。１の具体例において、レトロウイルスプラスミド
ベクターはモロニーマウス・白血病ウイルス由来のもの
である。

【０２２７】かかるベクターは、本発明ポリペプチド発
現のための１個またはそれ以上のプロモーターを含むで
あろう。使用できる適当なプロモーターは、レトロウイ
ルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびMiller et
al.,Biotechniques 7:980-990(1989)に記載されたＣＭ
Ｖプロモーター、または他のいずれかのプロモーター
（例えば、ヒストン、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、およ
びβ−アクチンプロモーター（これらに限らない）を包
含する真核細胞プロモーターのごとき細胞プロモータ
ー）を包含するが、これらに限らない。使用できる他の
ウイルスのプロモーターは、アデノウイルスプロモータ
ー、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、およびＢ
１９パルボウイルスプロモーターを包含するが、これら
に限らない。適当なプロモーターの選択は、本明細書に
含まれる教示から当業者に明らかであろう。

【０２２８】本発明ポリペプチドをコードしている核酸
配列は適当なプロモーターの制御下に置かれるであろ
う。使用できる適当なプロモーターは、アデノウイルス
大後期プロモーターのごときアデノウイルスプロモータ
ー；またはＣＭＶプロモーターのごとき異種プロモータ
ー；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；Ｍ
ＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーターのご
とき誘導可能プロモーター；熱ショックプロモーター；
アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒ
ト・グロビンプロモーター；単純ヘルペスウイルスのチ
ミジンキナーゼプロモーターのごときウイルスのチミジ
ンキナーゼプロモーター；レトロウイルスのＬＴＲｓ
（本明細書で上で述べた修飾レトロウイルスＬＴＲｓを
包含）；β−アクチンプロモーター；およびヒト・成長
ホルモンプロモーターを包含するが、これらに限らな
い。プロモーターは、本発明ポリペプチドをコードして
いる遺伝子を制御する無傷のプロモーターであってもよ
い。

【０２２９】レトロウイルスプラスミドベクターを用い
てパッキング細胞系に形質導入してプロデューサー細胞
系を得る。トランスフェクションされうるパッキング細
胞の例は、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｙ−２、Ｙ−Ａ
Ｍ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ
２、ＹＣＲＥ、ＹＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅ
ｎｖＡｍ１２、およびMiller,A.,Human Gene Therapy
1:5-14(1990)に記載されたＤＡＮ細胞系を包含するが、
これらに限らない。当該分野で知られたいずれかの手段
によりベクターをパッケージング細胞中に形質導入して
もよい。かかる手段は、エレクトロポレーション、リポ
ソームの使用、ＣａＰＯ₄沈殿を包含するが、これらに
限らない。１の別法において、レトロウイルスベクター
をリポソーム中に封入し、あるいは脂質と結合させ、次
いで、宿主に投与してもよい。

【０２３０】プロデューサー細胞系は感染性レトロウイ
ルスベクター粒子を生じるであろうし、該粒子はポリペ
プチドをコードしている核酸配列を含んでいる。次い
で、かかるレトロウイルスベクター粒子を用いて、イン
ビトロまたはインビボのいずれかにおいて真核細胞に形
質導入してもよい。形質導入された真核細胞はポリペプ
チドをコードしている核酸配列を発現するであろう。形
質導入されうる真核細胞は、胚幹細胞、胚カルシノーマ
細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽
細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、および気管支上皮細
胞を包含するが、これらに限らない。

【０２３１】

【実施例】下記実施例により本発明をさらに説明する。
実施例は、特定の具体例を参照することにより、本発明
の説明のためだけに提供される。これらの例示は、本発
明の特定の態様を説明するが、開示された発明の範囲を
何ら限定するものでない。本明細書に用いる特定の用語
はすでに上で説明してある。特記しない限り、すべての
実施例は、当業者によく知られた日常的な標準的方法を
用いて行われたものである。Sambrook et al.,MOLECULA
R CLONING:A LABORATORY MANUAL,2nd Ed.;Cold Spring
Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(19
89)（本明細書では「Sambrook」という）の標準的な研
究室用マニュアルに記載されているようにして下記実施
例の日常的な分子生物学の方法を行うことができる。特
記しないかぎり、下記実施例に示すすべての部または量
は重量によるものである。特記しないかぎり、Sambrook
および多くの他の文献、例えば、Goeddel et al.,Nucle
ic Acids Res.,8:4057(1980)による文献に記載のアガロ
ースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧ
Ｅ）の標準的方法を用いて下記実施例におけるフラグメ
ントのサイズによる分離を行った。特記しない限り、標
準的バッファー、インキュベーション温度および時間、
ほぼ等モル量の連結すべきＤＮＡフラグメント、ならび
に０．５μｇのＤＮＡにつき約１０ユニットのＴ４ Ｄ
ＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）を用いて連結反応を行っ
た。

【０２３２】実施例１ 細菌を用いるヒト・ＣＧＲＰ−
ＲＣＦの発現および精製 寄託ポリヌクレオチド中のヒト・ＣＧＲＰ−ＲＣＦをコ
ードしているＤＮＡ配列を特異的エンドヌクレアーゼ制
限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化してＣＧＲＰ−
ＲＣＦの読み枠をコードしているフラグメントを遊離さ
せ、そのフラグメントを精製し、適当な酵素で消化され
た細菌発現ベクター中に連結する。

【０２３３】制限部位は細菌発現ベクターｐＱＥ−９
（Qiagen,Inc.Chatsworth,CA）中の制限酵素部位に都合
がよい。これらの実施例においてｐＱＥ−９を細菌での
発現のために使用する。ｐＱＥ−９はアンピシリン抗生
物質耐性（Ａｍｐ^r）をコードしており、細菌の複製開
始点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ誘導可能プロモーター、リボ
ソーム結合部位（ＲＢＳ）６−Ｈｉｓタグおよび制限酵
素部位を含んでいる。ヒト・ＣＧＲＰ−ＲＣＦ ＤＮＡ
およびベクターｐＱＥ−９をともにＥｃｏＲＩおよびＸ
ｈｏＩで消化し、次いで、消化したＤＮＡｓを連結す
る。ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩにより制限消化されたベクタ
ー中へのＣＧＲＰ−ＲＣＦ ＤＮＡの挿入により、ベク
ターのＩＰＴＧ誘導可能プロモーターの下流にＣＧＲＰ
−ＲＣＦ ＤＮＡが挿入され、これにイン−フレームで
作動可能に連結される。ＣＧＲＰ−ＲＣＦの翻訳のため
に適当な位置に開始ＡＵＧが含まれている。

【０２３４】標準的手順を用いて連結反応混合物をコン
ピテントなE.coli細胞中に形質転換する。かかる手順は
Sambrook et al.,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MAN
UAL,2nd Ed.;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Co
ld Spring Harbor,N.Y.(1989)に記載されている。ｌａ
ｃリプレッサーを発現し、カナマイシン耐性（Ｋａ
ｎ^r）を付与する複数コピーのプラスミドｐＲＥＰ４を
含んでいるE.coliM15/rep4株を、本明細書記載の典型的
な実施例の遂行に使用する。ＣＧＲＰ−ＲＣＦ発現に適
した多くの株の１つであるこの株はQiagenから市販され
ている。

【０２３５】アンピシリン存在下のＬＢプレート上での
増殖能により形質転換体を同定する。プラスミドＤＮＡ
を耐性コロニーから単離し、クローン化されたＤＮＡの
同一性を制限分析により確認する。

【０２３６】所望構築物を含んでいるクローンを、アン
ピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカラナイシン（２
５μｇ／ｍｌ）の両方を補足したＬＢ液体培地で一晩
（Ｏ／Ｎ）培養する。

【０２３７】一晩培養物を用いて大規模培養に接種する
（希釈率は約１：１００ないし１：２５０）。６００ｎ
ｍにおける光学密度（ＯＤ⁶⁰⁰）が０．４ないし０．６
となるまで細胞を増殖させる。次いで、イソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し
て最終濃度１ｍＭとして、ｌａｃＩリプレッサーを不活
性化することによりｌａｃリプレッサー感受性プロモー
ターからの転写を誘導する。次いで、細胞をさらに３〜
４時間インキュベーションする。次いで、遠心分離によ
り細胞を集め、標準的方法により破壊する。日常的収集
方法を用いて破壊細胞から封入体を精製し、８Ｍ尿素中
で蛋白を封入体から可溶化する。可溶化蛋白を含有する
８Ｍ尿素溶液を、２Ｘリン酸緩衝化セイライン（ＰＢ
Ｓ）中のＰＤ−１０カラムに通し、尿素を除去し、バッ
ファーを交換し、蛋白を再生させる。エンドトキシンを
除去するためのさらなる工程のクロマトグラフィーによ
り蛋白を精製する。滅菌濾過された蛋白標品を、２ＸＰ
ＢＳ中に９５マイクログラム／ｍｌの濃度として保存す
る。

【０２３８】実施例２ バキュロウイルス発現系におけ
るヒト・ＣＧＲＰ−ＲＣＦのクローニングおよび発現

【０２３９】寄託クローン中の全長のヒト・ＣＧＲＰ−
ＲＣＦ蛋白をコーしているｃＤＮＡ配列をＥｃｏＲＩ／
ＸｈｏＩで消化してＣＧＲＰ−ＲＣＦフラグメントを遊
離させる。次いで、そのフラグメントを、同じ制限酵素
で消化した発現ベクターに挿入する。

【０２４０】Summers et al,A MANUAL OF METHODS FOR
BACULOVIRUS VECTORS AND INSECT CELL CULTURE PROCED
URES,Texas Agricultural Experimental Station Bulle
tinNo.1555(1987)記載のごとき標準的方法を用い、ベク
ターｐＲＧ１を用いてＣＧＲＰ−ＲＣＦ蛋白をバキュロ
ウイルス発現系において発現させる。この発現ベクター
は、便利な制限部位が後に続いているAutographa calif
ornica・核ポリヘドロシスウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の
強力なポリヘドリンプロモーターを含んでいる。Ｎ−末
端メチオニンを含むＡｃＭＮＰＶ ｐｇ６７のシグナル
ペプチドはＢａｍＨＩ部位のすぐ上流にある。類人猿ウ
イルス４０（ＳＶ４０）のポリアデニレーション部位を
効果的なポリアデニレーションのために使用する。組み
換えウイルスを簡単に選択するために、E.coli由来のベ
ータ−ガラクトシダーゼ遺伝子をポリヘドリンプロモー
ターと同じ方向に挿入し、ポリヘドリン遺伝子のポリア
デニレーションシグナルが後に続くようにする。ポリア
デニレーション配列の両側に、野生型ウイルスＤＮＡを
伴った細胞により媒介される同種組み換えのための配列
が隣接しており、クローンされたポリヌクレオチドを発
現する生きたウイルスを生じるようになっている。

【０２４１】ｐＲＧ１のかわりに他の多くのバキュロウ
イルスベクター（ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１およびｐ
ＡｃＩＭ１のごとき）を用いることができ、構築物は転
写、翻訳、調節等のための適切に配置されたシグナル
（例えば、所望により読み枠を合わせたＡＵＧおよびシ
グナルペプチド）を提供することを、当業者は容易に理
解するであろう。かかるベクターは、特にLuckow et a
l.,Virology 170:31-39に記載されている。

【０２４２】プラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸ
ｈｏＩで消化し、次いで、当ギア分野で知られた日常手
順を用い、子ウシ・腸ホスファターゼを用いて脱ホスホ
リレーションする。次いで、市販キット（Geneclean BI
O 101 Inc.,La Jolla,Ca.）を用いて１％アガロースゲ
ルからＤＮＡを単離する。このベクターＤＮＡを本明細
書では「Ｖ２」と命名する。

【０２４３】フラグメントＦ２および脱ホスホリレーシ
ョンされたプラスミドＶ２を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用
いて連結する。E.coli HB101細胞をライゲーションミッ
クスで形質転換し、培養プレートに撒く。ＥｃｏＲＩお
よびＸｈｏＩを用いてここのクローンからのＤＮＡを消
化し、次いで、消化物をゲル電気泳動により分析するこ
とによりヒト・ＣＧＲＰ−ＲＣＦ遺伝子を含むプラスミ
ドを含有する細菌を同定する。クローン化されたフラグ
メントの配列をＤＮＡ配列決定により確認する。このプ
ラスミドを本明細書ではｐＢａｃＣＧＲＰ−ＲＣＦと命
名する。

【０２４４】Felgner et al.,Proc Natl.Acad.Sci.USA
84:7413-7417(1987)により記載されたリポフェクチン法
を用いて、５μｇのプラスミドｐＢａｃＣＧＲＰ−ＲＣ
Ｆを１．０μｇの市販直鎖状バキュロウイルスＤＮＡ
（「BaculoGold^TMバキュロウイルスＤＮＡ」,Pahrminge
n,San Diego,CA.）とともに同時トランスフェクション
する。５０μｌの無血清Graceの培地（Life Technologi
es Inc.,Gaithersburg,MD）を入れた滅菌済みマイクロ
タイタープレートのウェル中に１μｇのBaculoGold^TMウ
イルスＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＢａｃＣＧＲ
Ｐ−ＲＣＦを混合する。次いで、１ｍｌの無血清Grace
の培地を入れた３５ｍｍ組織培養プレートに撒いたＳｆ
９昆虫細胞（ATCC CRL 1711）にトランスフェクション
混合物を滴下する。プレートを前後に揺すり、新たに添
加した溶液を混合する。次いで、プレートを２７℃で５
時間インキュベーションする。５時間後、トランスフェ
クション溶液をプレートから除去し、１０％ウシ胎児血
清を補足した１ｍｌのGraceの昆虫培地を添加する。プ
レートをインキュベーター中に戻し、２７℃で４日間培
養を継続する。

【０２４５】４日後、上清を集め、上で引用したSummer
sおよびSmithにより記載されたようにしてプラークアッ
セイを行う。「Blue Gal」（Life Technologies Inc.,G
aithersburg）を伴うアガロースゲルを用いてｇａｌ−
発現クローンの同定および単離を容易にする（このタイ
プの「プラークアッセイ」についての詳細な説明はLife
Technologies Inc.,Gaithersburg,9-10頁の昆虫細胞お
よびバキュロウイルス学の利用者案内にも見いだされ
る）。

【０２４６】系列希釈から４日後、ウイルスを細胞に添
加する。適当なインキュベーション後、青色に染まった
プラークをエッペンドルフピペットのチップで拾い上げ
る。次いで、組み換えウイルスを含んでいる寒天を、２
００μｌのGraceの培地の入ったエッペンドルフチュー
ブ中に再懸濁する。短時間遠心分離することにより寒天
を除去し、組み換えバキュロウイルスを含む上清を用い
て、３５ｍｍディッシュに撒かれたＳｆ９細胞を感染さ
せる。４日後、これらの培養ディッシュの上清を取り、
次いで、それらを４℃で保存する。制限マッピングおよ
び配列決定を包含するＤＮＡ分析により、正しく挿入さ
れたＣＧＲＰ−ＲＣＦを含むクローンを同定する。

【０２４７】１０％熱不活性化ＦＢＳを補足したGrace
の培地でＳｆ９細胞を増殖させる。感染の多重度（ＭＯ
Ｉ）約２で組み換えバキュロウイルスＶ−ＣＧＲＰ−Ｒ
ＣＦに細胞を感染させる。６時間後、培地を除去し、Ｓ
Ｆ９００II培地（メチオニンおよびシステイン不含（Li
fe Technologies Inc.,Gaithersburgから市販）に置き
換える。４２時間後、５μＣｉの３５Ｓ−メチオニンお
よび５μＣｉの３５Ｓ−システイン（Amershamから市
販）を添加する。細胞をさらに１６時間インキュベーシ
ョンし、次いで、遠心分離により細胞を集め、溶解し、
標識蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフ
ィーにより可視化する。

【０２４８】実施例３ ヒト・ＣＧＲＰ−ＲＣＦの遺伝
子治療発現 線維芽細胞を対象から皮膚生検により得る。得られた組
織組織培養培地に入れ、小片に分離した。組織の小さな
塊を組織培養フラスコの湿った表面に置く（各フラスコ
につき約１０片）。フラスコを転倒させ、密栓し、室温
で一晩放置する。室温で２４時間後、フラスコを転倒さ
せると組織の塊がフラスコの底に固着したままであり、
新鮮培地（例えば、１０％ ＦＢＳ、ペニシリンおよび
ストレプトマイシンを補足したHamのＦ１２培地）を添
加する。次いで、適当には３７℃で１週間インキュベー
ションする。この時、新鮮培地を添加し、次いで、数日
毎に交換する。さらに２週間培養後、線維芽細胞の単層
が出現する。単層をトリプシン処理し、剥ぎ取って大き
いフラスコに移す。発現されるフラグメントのクローニ
ングのために遺伝子治療用ベクターを制限酵素で消化す
る。消化されたベクターを子ウシ・腸ホスファターゼで
処理して自己連結を防止する。脱ホスホリレーションさ
れた直鎖状ベクターをアガロースゲルで分離精製する。

【０２４９】活性のあるＣＧＲＰ−ＲＣＦを発現するこ
とのできるＣＧＲＰ−ＲＣＦ ｃＤＮＡを単離する。必
要ならば、ベクター中へのクローニングのためにフラグ
メント末端を修飾する。例えば、５’オーバーハングを
ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端を作ってもよ
い。３’オーバーハングをＳ１ヌクレアーゼを用いて除
去してもよい。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いてリンカー
を平滑末端に連結してもよい。

【０２５０】同量のMolonyマウス白血球ウイルスの直鎖
状骨格およびＣＧＲＰ−ＲＣＦフラグメントを混合し、
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。連結混合物を
用いてE.coliを形質転換し、次いで、カナマイシン含有
寒天上に細菌を撒く。カナマイシン表現型および制限分
析により、ベクターが正しく挿入された遺伝子を有して
いることが確認される。

【０２５１】パッケージング細胞を組織培養（１０％子
ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシ
ンを補足したDulbeccoの修飾Eagles培地（ＤＭＥＭ））
で増殖させて集密とする。標準的方法を用いてＣＧＲＰ
−ＲＣＦ遺伝子を含むベクターをパッケージング細胞中
に導入する。ＣＧＲＰ−ＲＣＦ遺伝子を含む感染性ウイ
ルス粒子をパッケージング細胞（今度はこれをプロデュ
ーサー細胞という）から集める。

【０２５２】新鮮培地をプロデューサー細胞に添加し、
適当なインキュベーション時間後、集密プロデューサー
細胞のプレートから培地を集める。感染性ウイルス粒子
を含む培地をMilliporeフィルターにより濾過して、剥
がれたプロデューサー細胞を除去する。次いで、濾過さ
れた培地を用いて線維芽細胞を感染させる。線維芽細胞
の集密に至っていないプレートから培地を除去し、濾過
された培地に素早く置換する。ポリブレン（Aldrich）
を培地に含ませてトランスダクションを容易にする。適
当なインキュベーション後、培地を除去し、新鮮培地に
置換する。ウイルス力価が高い場合には、実質的にすべ
ての線維芽細胞は感染されており、選択の必要なないだ
ろう。力価が低い場合には、選択可能マーカー（ｎｅｏ
またはｈｉｓのごとき）を有するレトロウイルスベクタ
ーを用いて、トランスダクションされた細胞を増殖に関
して選択する必要がある。

【０２５３】次いで、組み換え線維芽細胞を、単独また
はサイトデックス３ビーズのごとき微小担体ビーズ上で
集密になるまで増殖した後、ラットに注射する。注射さ
れた線維芽細胞はＣＧＲＰ−ＲＣＦ生成物を生じ、その
蛋白の生物学的作用が宿主に伝達される。

【０２５４】上記説明および実施例に記載されたのとは
違うように本発明を実施してもよい。上記教示から本発
明の多くの修飾および変更が可能であり、それらは添付
した請求の範囲の範囲内である。

【０２５５】実施例４ インビトロ転写、Xenopus leav
is卵母細胞中へのマイクロインジェクションおよび電気
生理学 Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いて、直
鎖状ｐＣＧＲＰ−ＲＣＦまたはｐＣＧＲＰ−タイプ−Ｉ
−受容体ＤＮＡからキャップされたＲＮＡ転写物を合成
した。マイクロインジェクションには、上記のごとく
（Elshourbagy etal.,J.Biol.Chem.,268:3873-3879(199
3)）、X.leavis卵母細胞を調製した。段階Ｖ−ＶＩの卵
母細胞を選択し、卵胞膜を手で除去した。各実験群につ
き、２０ｎｇのＣＧＲＰ−ＲＣＦおよびＣＧＲＰタイプ
Ｉ受容体の相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）（Drummond injec
tion apparatus）を含有する５０ｎｌの水を用いて脱卵
胞された卵母細胞に同時注入を行った。注入された卵母
細胞を修飾Barth培地にて１８℃で４８時間維持して蛋
白合成させ、受容体蛋白複合体を細胞表面に移動させ
た。卵母細胞電圧クランプ装置（Warner Instruments）
を用いる電圧クランプ法を用いて電気生理学的研究を行
った。卵母細胞を−６０ｍＶにクランプし、１０^-7Ｍの
ヒト・アルファ−ＣＧＲＰまたはヒト・カルシトニン
（Bachem）に曝露し、活性化されたＣａ²⁺チャンネル活
性を室温のBarth培地にて記録した。

【０２５６】

【配列表】

【０２５７】（１）一般的情報 （ｉ）出願人：Ａｄａｍｏｕ，Ｊｏｈｎ Elshourbagy,Nabil （ｉｉ）発明の名称：カルシトニン遺伝子関連ペプチド
受容体成分因子（ＨＯＵＤＣ４４） （ｉｉｉ）配列の数：２ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）宛て名：スミスクライン・ビーチャム・コーポレ
イション （Ｂ）通り名：スウェードランド・ロード７０９番 （Ｃ）都市名：キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名：ペンシルベニア州 （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）ＺＩＰ：１９４０６−０９３９ （ｖ）コンピューター読み取り可能形式： （Ａ）媒体形式：ディスケット （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭコンパチブル （Ｃ）作動システム：ＤＯＳ （Ｄ）ソフトゥエア：FastSEQバージョン１.５ （ｖｉ）現在の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：Han,William T （Ｂ）登録番号：３４３４４ （Ｃ）代理人等における処理番号：Ｐ５００１０ （ｉｘ）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６１０−２７０−５２１９ （Ｂ）ファックス番号：６１０−２７０−５０９０ （Ｃ）テレックス番号：

【０２５８】（２）配列番号：１ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１４５０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし （ｖ）フラグメント型： （ｖｉ）起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１： GGCACGAGCA GCTGTGAAGT GTGAGGTTCT TTGTCTGCTG GCAGCTAGGG GCGACGAGGC 60 GGGACGTCAT GGAAGTGAAG GATGCCAATT CTGCGCTTCT CAGTAACTAC GAGGTATTTC 120 AGTTACTAAC TGATCTGAAA GAGCAGCGTA AAGAAAGTGG AAAGAATAAA CACAGCTCTG 180 GGCAACAGAA CTTGAACACT ATCACCTATG AAACGTTAAA ATACATATCA AAAACACCAT 240 GCAGGCACCA GAGTCCTGAA ATTGTCAGAG AATTTCTCAC AGCATTGAAA AGCCACAAGT 300 TGACCAAAGC TGAGAAGCTC CAGCTGCTGA ACCACCGGCC TGTGACTGCT GTGGAGATCC 360 AGCTGATGGT GGAAGAGAGT GAAGAGCGGC TCACGGAGGA GCAGATTGAA GCTCTTCTCC 420 ACACCGTCAC CAGCATTCTG CCTGCAGAGC CAGAGGCTGA GCAGAAGAAG AATACAAACA 480 GCAATGTGGC AATGGACGAA GAGGACCCAG CATAGAAGAG CACAGCTGGC CCCGGCGTTT 540 CATGAAGTCA GAAGGCCTGG CAGCCATTTC CTGGACGTTG AGAGGATTGT TTATTTGATT 600 TTTATCCTCA TCCCAGCAGG CCTGGCTTTG TGGTTAGTTG GGTACATCAC AAAAATAAGT 660 TAAAAAGAAA TATTTGTGCC TTGGGGAGAA GAAACATGGT GAAAACAGGC TGAGGTTGTC 720 AGGGCAGAGA GCTGAAGGTG GGGACAGTGA CCGCGGACCC CTCTGCGCTT GAAAGATTTC 780 CTCCACGGCC TTTGCCCCAG TTGTGGGGAG GTCTCTGTGC ACAGCGGGGA AAATGCTTGT 840 GTCGCCTTTG GTGGGCCATG TCCTAATTAG TTTCATCTGC TTCCCTGGGA ACTTACTAAG 900 GGGCCCAGAG CACTGTTGGA AGTCTGGTTA GAGTCCCCAG AGAGTTACTC TAAGTTAAAA 960 TGAGCCACTG ACCTTGGCTC ACCTTAGAGG AATTTCCTCG AGAACAACAG AGATAAGAAA 1020 AGAACCGGCC TGGCCAATCC TTCAACAGCT CTAGAGCCCC TTTTCTCTGC TGGCAGGGGC 1080 TTTGTTTACC AGCTCACTGT TTAGGCTAAA TGTTAGGGAC CAGATCACTG CAGTTGAAAA 1140 CAGCATCCAG GCTTAGTGAC AGTGGCAGCA GAAACAGTGT TGGCTGCCTT TCTGACCACC 1200 CCACTTTCCT GCCCTGAGAC AGCAGCCCAG GGCAGGTGCT TCATATTCAG ACCAGGTAAG 1260 CCTCATTTGC ACAACAGTCA AATTGTTTGT TCCTTTAAAA AGGACACAAT TAGCCTGGCA 1320 CGGTGACTCA TGCTTGTAAT CCCAGCACTT TGGGAGGGCA AGGCAGGCGG ATCACCTGAG 1380 GTCAGGAGTT TGAGACCAGC CTCACCAACA TGGAAAAACC CCATCTCTAT TAAAAAAAAA 1440 AAAAAAAAAA 1450

【０２５９】（２）配列番号：２ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１４８アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉｉ）ハイポセティカル：なし （ｉｖ）アンチセンス：なし （ｖ）フラグメント型：Ｎ−末端 （ｖｉ）起源： （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２： Met Glu Val Lys Asp Ala Asn Ser Ala Leu Leu Ser Asn Tyr Glu Val 1 5 10 15 Phe Gln Leu Leu Thr Asp Leu Lys Glu Gln Arg Lys Glu Ser Gly Lys 20 25 30 Asn Lys His Ser Ser Gly Gln Gln Asn Leu Asn Thr Ile Thr Tyr Glu 35 40 45 Thr Leu Lys Tyr Ile Ser Lys Thr Pro Cys Arg His Gln Ser Pro Glu 50 55 60 Ile Val Arg Glu Phe Leu Thr Ala Leu Lys Ser His Lys Leu Thr Lys 65 70 75 80 Ala Glu Lys Leu Gln Leu Leu Asn His Arg Pro Val Thr Ala Val Glu 85 90 95 Ile Gln Leu Met Val Glu Glu Ser Glu Glu Arg Leu Thr Glu Glu Gln 100 105 110 Ile Glu Ala Leu Leu His Thr Val Thr Ser Ile Leu Pro Ala Glu Pro 115 120 125 Glu Ala Glu Gln Lys Lys Asn Thr Asn Ser Asn Val Ala Met Asp Glu 130 135 140 Glu Asp Pro Ala 145

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１はヒト・ＣＧＲＰ−ＲＣＦのヌクレオチ
ド配列および推定アミノ酸配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＰ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＮ ＡＥＥ ＡＢＲ Ｃ０７Ｋ 14/72 ＡＣＪ Ｃ１２Ｎ 1/21 ＡＤＤ Ｃ１２Ｐ 21/02 ＡＤＰ Ｃ１２Ｑ 1/02 ＡＥＥ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ナビル・アブド・エルサラム・エルショー バギー アメリカ合衆国19380ペンシルベニア州ウ エスト・チェスター、ボートゥリー・ドラ イブ1648番

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）配列番号：２のアミノ酸を含んで
   なるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに
   対して少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオ
   チド； （ｂ）遺伝コードの縮重により、配列番号：２のアミノ
   酸と同じアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチ
   ド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに対して
   相補的なポリヌクレオチド；および （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド
   の少なくとも１５個の塩基を含んでなるポリヌクレオチ
   ドからなる群より選択されるメンバーを含んでなる単離
   ポリヌクレオチド。
2. 【請求項２】 ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項
   １のポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項
   １のポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 配列番号：１に示すポリヌクレオチドの
   セットを含んでなる請求項２のポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 配列番号：１に示すヌクレオチド６９か
   ら５１２までを含んでなる請求項２のポリヌクレオチ
   ド。
6. 【請求項６】 配列番号：２のアミノ酸を含んでなるポ
   リペプチドをコードしている請求項２のポリヌクレオチ
   ド。
7. 【請求項７】 （ａ）ＡＴＣＣ寄託番号９８１０５中に
   含まれるヒト・ｃＤＮＡにより発現されるのと同じ成熟
   ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに対し
   て少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチ
   ド； （ｂ）遺伝コードの縮重により、ＡＴＣＣ寄託番号９８
   １０５中に含まれるヒト・ｃＤＮＡにより発現されるの
   と同じ成熟ポリペプチドをコードしているポリヌクレオ
   チド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに対して
   相補的なポリヌクレオチド；および （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド
   の少なくとも１５個の塩基を含んでなるポリヌクレオチ
   ドからなる群より選択されるメンバーを含んでなる単離
   ポリヌクレオチド。
8. 【請求項８】 請求項２のＤＮＡを含んでなるベクタ
   ー。
9. 【請求項９】 請求項８のベクターを含む宿主細胞。
10. 【請求項１０】 上記ＤＮＡによりコードされるポリペ
    プチドを請求項９の宿主細胞から発現させることを特徴
    とするポリペプチドの製造方法。
11. 【請求項１１】 請求項８のベクターで細胞を形質転換
    またはトランスフェクションして、細胞がベクター中に
    含まれるヒト・ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチ
    ドを発現するようにすることを特徴とする、ポリペプチ
    ドを発現する細胞の製造方法。
12. 【請求項１２】 配列番号：２のアミノ酸に対して少な
    くとも７０％同一であるアミノ酸配列を含んでなるポリ
    ペプチド。
13. 【請求項１３】 配列番号：２に示すアミノ酸配列を含
    んでなるポリペプチド。
14. 【請求項１４】 請求項１２のポリペプチドのアゴニス
    ト。
15. 【請求項１５】 請求項１２のポリペプチドに対するア
    ンタゴニスト。
16. 【請求項１６】 請求項１２のポリペプチドの活性を阻
    害するアンタゴニスト。
17. 【請求項１７】 治療上有効量の請求項１２のポリペプ
    チドを患者に投与することを特徴とする、ＣＧＲＰ−Ｒ
    ＣＦを必要とする患者の治療方法。
18. 【請求項１８】 ポリペプチドをコードしており該ポリ
    ペプチドをインビボで発現するＤＮＡを患者に提供する
    ことにより治療上有効量の該ポリペプチドが投与される
    請求項１７の方法。
19. 【請求項１９】 治療上有効量の請求項１６のアンタゴ
    ニストを患者に投与することを特徴とする、ＣＧＲＰ−
    ＲＣＦポリペプチドの阻害を必要とする患者の治療方
    法。
20. 【請求項２０】 ポリペプチドをコードしている核酸配
    列中の変異を決定することを特徴とする、請求項１２の
    ポリペプチドの発現に関連した疾病または該疾病に対す
    る感受性の診断方法。
21. 【請求項２１】 宿主由来の試料中の請求項１２のポリ
    ペプチドの存在について分析を行うことを特徴とする診
    断方法。
22. 【請求項２２】 受容体への化合物の結合に応答して検
    出可能シグナルを発することのできる第２の成分に結合
    したポリペプチドに対する受容体を細胞表面に発現する
    細胞を、受容体への結合を可能にする条件下でスクリー
    ニングすべき化合物と接触させ；次いで化合物と受容体
    との相互作用により生じるシグナルの存在または不存在
    を検出することにより、化合物が受容体に結合するかど
    うか、そして受容体を活性化または阻害するかどうかを
    決定することを特徴とする、請求項１２のポリペプチド
    に対する受容体に結合し、これを活性化または阻害する
    化合物の同定方法。