JP2007332145A - ケモカイン結合タンパク質およびその使用 - Google Patents

ケモカイン結合タンパク質およびその使用 Download PDF

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Abstract

【課題】損傷、感染、および種々の疾患の状態に対する炎症および免疫反応における循環系から組織部位へのリンパ球および単球の移行に関連した広範囲の免疫病理学的状態を治療しうる抗免疫タンパク質を提供する。
【解決手段】ポックスウイルスによってコードされ、急性又は慢性の調節不全(dysregulated)炎症応答に関連した病徴に対するＴ７インターフェロン受容体相同体と相同のアミノ酸配列を有する新規のＩ型ケモカイン結合性タンパク質の使用。
【選択図】なし

Description

本発明は、一般的には免疫学の分野に関し、特に、種々のポックスウイルスによってコードされるケモカイン結合タンパク質およびその使用に関する。
高等脊椎動物の細胞内に生存するウイルスは特に宿主免疫系を回避すべく進化したにちがいないことが、次第に明らかになってきている（Gooding，L.，Cell, 91:5-7，1992; Marrack，P．and Kappler，J.，Cell，76:323-332，1994; Smith，G.，Trends in Micro.，82:80-88，1994）。実際に、ウイルスの生存は、外来侵入物に対する多彩な宿主反応を回避、抑制、阻止、さもなければ混乱させることができる方式に左右される。免疫系のエフェクタアームにより付与される選択圧は、明らかに進化圧の強力な要素であり、現在生存するすべての真核ウイルスは、コードされたタンパク質として、またはこれらのウイルスの特定の生物学的生存方式により実証されるように、免疫系との抗争のインプリントまたはレムナントを含有する。
より大きなＤＮＡウイルス（すなわち、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、イリドウイルス、およびポックスウイルス）は、特に、感染された宿主の免疫認識および／またはクリアランスからウイルスを保護すべく機能するタンパク質をコードする。こうして、これらの「破壊性」ウイルスタンパク質は、免疫系の機能的働きに関する情報を提供しており、この増大するファミリーの新しいメンバが将来は更に多く発見され、同定される可能性がある。
1980年代に「ウイロカイン」という用語が提案されたが、これはサイトカインまたは宿主免疫レパートリにとって重要な他の分泌される調節剤などの細胞外シグナル分子を模倣することによって機能する感染細胞から分泌されるウイルスコード化タンパク質を記述するものである（Kotwal，G．and Moss，B.，Nature，335;176-178，1988）。その後、1990年代に「ウイロセプタ」という用語が導入されたが、これは次のような観測結果を説明するためであった。すなわち、重要な細胞の受容体と類似したタンパク質で、しかも宿主のサイトカインをそれらの正常な受容体から遠ざけることによって機能するこうしたタンパク質をいくつかのウイルスがコードし、これにより初期の段階で免疫回路を阻害することが観測された（Upton，et al.，Virology，184:370，1991; Schreiber and McFadden，Virology，204:692-705，1994）。
特定のポックスウイルスすなわち粘液腫ウイルスに関する最近の研究から、ウイルスが様々な方式によって免疫系を破壊することが示された（McFadden and Graham，Seminars in Virology，5:421-429，1994）。粘液腫ウイルスは、粘液腫症と呼ばれる飼いならされたウサギの毒性全身性疾患の病原菌である。粘液腫はもともと18世紀に報告されたもので、実験動物に対して発見された最初のウイルス病原体であるとともに、ペスト撲滅というはっきりした目的のためにかつて意図的に環境に導入された最初のウイルス薬剤であった。40年以上前にオーストラリアおよびヨーロッパの野生ウサギ個体群へ導入されて以来、ウサギおよびウイルスの両方の野生種は相互に進化圧および選択圧の影響を受け、その結果、接種を受けた地域で定常的な地方病が発生した（Fenner，F．and Ratcliffe，F.N.，"Myxomatosis"，Cambridge University Press，London，1965））。
粘液腫は、他のポックスウイルスに関連した生物学的な特徴の多く、すなわち、複製の細胞質位置および大きな二本鎖ＤＮＡゲノム（160キロベース）、を共有している。複数の系統から得られた事実によって、すべてのポックスウイルスと同様に、粘液腫は、様々な宿主組織中におけるウイルスの蔓延および増殖を可能にする働きを有する複数の遺伝子産物をコードすることが示唆される。これらのウイルス性タンパク質のいくつかは、特に、宿主炎症反応および獲得細胞性免疫の発達を妨害または停止するが、ポックウイルスは、一般に、こうした免疫調節タンパク質の宝庫であった（Turner，P.C．and Moyer，R.W.，Cur．Top．Microbiol．Imm．163:125-152，1990; Buller，R.M.L.，and Palumbo，G.J.，Micro．Dev.，55:80-122，1991; Smith，G.L.，J.，Gen．Virol.，94:1725-1740，1993; McFadden，G.，(Ed.)，"Viroceptors，virokines and related immune modulators encoded by DNA viruses"，R.G．Larudes Co.，Austin Texas，1995）。
こうした免疫調節遺伝子産物としては、例えば、細胞表皮成長因子受容体を介してパラ分泌様式で隣接細胞を刺激する粘液腫成長因子(MGF)（Upton，et al.，J．Virol.，61:1271-1275，1987; Opgenorth，et al.，Virol.，186:185-191，1992; Opgenorth，et al.，Virol.，192:701-708，1992; Opgenorth，et al.，J．Virol.，66:4720-4731，1992）；セリンプロテアーゼインヒビタ活性をもつ分泌糖タンパク質であって、しかも初期炎症反応の発達を抑制するSerpl（Upton，et al.，Virol.，179:628-631，1990; Lormas，et al.，JBC，268:516-521，1993; Macen，et al.，Virol，195:348-363，1993）；細胞性腫瘍壊死因子(TNF)受容体の分泌ウイルス性同族体であって、しかもウサギのTNFと結合し、かつそれを抑制するT2（Smith，et al.，BBRC，176:335-342，1991; Schreiber，M．and McFadden，G.，supra，1994; Upton，et al.，supra，1991）；細胞性インターフェロンγ受容体の分泌ウイルス性同族体であって、しかもウサギのインターフェロンγと結合し、かつそれを抑制するT7（Upton et al.，Science，258:1369, 1992; Upton and McFadden，Methods in Molecular Genetics，4:383，1994; Mossman，et al，In: "Viroceptors，virokines and related immune modulator s" p．41-54 Ed．McFadden，R.G．Landers，Co.，1995）；および機構は分かっていないが炎症反応内で妨害を示す表面受容体様タンパク質であるM11L（Opgenorth，et al.，supra; Graham，et al.，Virol，191:112-124，1992）が挙げられる。
免疫調節タンパク質にはまた、「ケモカイン」と呼ばれる化学走化性サイトカインも含まれる。ケモカインとは、特に好中球、好塩基球、単球、およびT細胞などの白血球に対する化学親和性物質である低分子量の免疫リガンドを指す。ケモカインには2つの主要なクラスがあり、いずれにもタンパク質の三次構造中にジスルフィド結合を形成する4個の保存システイン残基が含まれる。αクラスはC-X-C（ただし、Xは任意のアミノ酸である）と記述され、IL-8、CTAP-III、gro/MGSA、およびENA-78が含まれ、βクラスはC-Cと記述され、MCP-1、MIP-1αおよびβ、ならびに活性化調節性の正常T発現および分泌タンパク質(RANTES)が含まれる。これらのクラスの表記は、モチーフ中の最初の2個のシステインを介在残基が離間させるか否かに対応している。一般に、ほとんどのC-X-Cケモカインは、好中球に対する化学親和性物質であるが、単球に対しては化学親和性物質とはならず、一方、C-Cケモカインは、単球に対する親和性を示すが、好中球に対しては親和性を示さない。最近、リンホタクチンと呼ばれる新しいタンパク質が発見されたことにより、ケモカインの第3のグループすなわち「C」グループが示された（Kelner，et al.，Science，266:1395-1933，1994）。ケモカイングループは、リンパ球および単球を炎症部位へ浸潤させるうえで極めて重要であると考えられている。
更に多くの免疫調節ウイルス遺伝子が今後発見される可能性が強い。これらのおよび関連する遺伝子産物は、宿主の抗ウイルス防御機構の様々なアームを開裂させる有用な手段を提供するのみならず、細胞免疫レパートリの新しい要素を同定するプローブならびに炎症および免疫系の異常調節を抑制する新しいクラスの薬剤をも提供可能である。
本発明は、一括して「ケモカイン」と呼ばれる白血球化学走化性に関与する1クラスのサイトカインに対する、予期せずに発見された新規な溶解性ウイスル特異的抑制剤に関する。本発明のタンパク質はタイプIの「ケモカイン結合タンパク質(CBP-I)」であるとともに、粘液腫のT7遺伝子の遺伝子産物でもあるが、このT7遺伝子は既にインターフェロンγ(IFN-γ)受容体の同族体をコードすることが分かっている。しかしながら、ウサギのリガンド(IFN-γ)に対してT7遺伝子産物が極めて特異的であるこことは対照的に、本発明のCBP-Iは、マウスおよびヒトのc-ヘモカインと非常によく結合する。他のポックスウイルスによりコードされるCBP-Iおよび関連同族体は、過剰の白血球の流入が病原性突起と関連する種々の炎症性疾患の治療に役立つ。
本発明の知見は、損傷、感染、および種々の疾患の状態に対する炎症および免疫反応における循環系から組織部位へのリンパ球および単球の移行に関連した広範囲の免疫病理学的状態を治療しうる抗免疫タンパク質の重要で新しい供給源を提供する。
本発明のタイプＩケモカイン結合タンパク質(CBP-I)の具体例としては、粘液腫ウイルスが感染した細胞から得られる主要分泌タンパク質があり、M-T7オープンリーディングフレームによりコードされている（Upton，et al.，Science，258:1369，1992;ならびにGenBank Accession No: M81919; SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:2）。このタンパク質は、インターフェロンγ(IFN-γ)に対するヒトおよびマウス受容体と有意な配列類似性を有する。更に、粘液腫M-T7タンパク質は、ウサギTFN-γと特異的に結合するが、マウスまたはヒトTFN-γとは特異的な結合を示さない（Mossman，et al.，J．Biol．Chem.，270:3031-3038，1995）。
「ケモカイン結合タンパク質」という用語は、1つ以上のケモカインと結合し、かつこれを抑制するタンパク質を意味する。「ケモカイン」は、白血球化学走化性に寄与するサイトカインの1クラスである。ケモカインのαクラスはC-X-C（ただし、Xは任意のアミノ酸である）と記述され、インターロイキン(Il-8)、結合組織活性化タンパク質(CTAP-III)、メラニン細胞成長刺激活性(MGSA)gro/MGSA、IFN-γ誘導性タンパク質(IP-10)、好中球活性化ペプチド2(NAP2)、β-トロンボグロブリン、および上皮誘導好中球親和性物質(ENA-78)が含まれ；βクラスはC-Cと記述され、T細胞活性化遺伝子3(TCA-3)、単球化学走化性タンパク質(MCP-1、2、および3)、マクロファージ炎症タンパク質(MIP-1αおよびβ)、ならびに活性化調節性の正常T発現および分泌タンパク質(RANTES)が含まれる。
他のケモカインは、当該技術分野で使用される普通の方法によって検出することができる。例えば、化学親和性物質のin vitro研究に対する好ましいマイクロ化学走化性アッセイ系であるボイデンチャンバを使用して分子を試験してもよい。一連のウェルをプレキシガラスブロック中に形成するが、このウェルは上下2つのチャクバから成り、ニトロセルロースおよびポリカーボネートなどのいくつかのタイプの多孔性フィルタのいずれか1つで分離されている。対象細胞、例えば末梢血単核細胞、を各ウェルの上側チャンバへ添加し、試験物質、例えば化学親和性物質、を下側チャンバへ添加する。上側チャンバ中の細胞が下側チャンバ中の物質に親和性を示す場合、細胞は溶液中に存在する理論濃度勾配に沿って移行し、フィルタの孔を通ってゆっくりと進み、フィルタの下側に付着する。
こうしてケモカインファミリーのメンバであると思われるポリペプチドが、本発明のCBP-Iを使用してスクリーニングできる。従って、1実施態様において、本発明は、新規なケモカインをスクリーニングおよび同定する方法を提供する。該方法には、遊離のまたはマトリックスに結合した本発明のCBP-Iと1つ以上のケモカインを含有すると思われる組成物とを接触させる工程と、CBP-Iと組成物との結合を検出する工程とが含まれる。CBP-Iと組成物（ケモカイン）との結合を検出する方法は、当業者には分かるであろうが、本明細書中の実施例中に記載の方法が含まれる。
必要な場合には、CBP-Iとケモカインとの結合を検出する手段として種々の標識を使用することができる。ケモカインまたはCBP-Iを直接的または間接的に検出可能なように、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート化剤、または酵素を用いて標識することができる。当業者は他の好適な標識を知るかまたは通常の実験によりこうした標識を確認することができるであろう。
もう1つの実施態様において、本発明は、被検者の免疫病理学的疾患を治療する方法を提供する。該方法には、グリコシル化の程度にもよるがSDS-PAGEの減少により測定される分子量が約30〜40kDであること、粘液腫T7インターフェロンγ受容体の同族体とアミノ酸配列相同性を有すること、および粘液腫T7インターフェロンγ受容体の同族体の生物学的機能を有することを特徴とする治療上有効量の抗炎症タンパク質の被検者への投与が含まれる。「抗炎症」という用語は、炎症反応の減少または抑制を意味する。
本発明の具体的CBP-Iのグリコシル化および分泌型は、SDS-PAGEの減少条件下で測定した見かけの分子量が約38kDである。更に、このタンパク質は、粘液腫T7 IFN-γ受容体の同族体との相同性を有する。「相同性」という用語は、CBP-IとウイルスIFN-γ受容体とのアミノ酸レベルでの一致度を意味する。好ましくは、CBP-Iは粘液腫T7 IFN-γ受容体と50%〜95%のアミノ酸配列相同性を有する。相同性要件は厳しくはないが、CBP-Iは粘液腫T7 IFN-γ受容体の生物学的機能を保持していなければならない。言い換えると、この相同性は、CBP-Iがケモカインと結合し、かつこれを抑制するかぎり、それで十分である。
本発明は、官能性ポリペプチドCBP-Iとその官能性断片とを含む。本明細書中で使用する場合、「官能性ポリペプチド」という用語は、所定の官能性アッセイを介して同定され、かつ特定の生物学的、形態学的、または表現型の応答と関連する生物学的機能または活性を有してなるポリペプチドを意味する。CBP-Iペプチドの官能性断片としては、CBP-I活性が残存するCBP-I断片（例えば、ケモカインと結合する断片）が挙げられる。CBP-Iの生物学的活性を有するより小さいペプチドは本発明に含まれる。こうしたペプチドのケモカインに対する結合は、本明細書中に記載の方法を含めて当業者に一般的に知られた方法によって検定することができる。生物学的機能は、抗体分子が結合するエピトープ程度に小さいペプチド断片から細胞内の表現型の特徴的な誘導またはプログラミングに寄与しうる大きなペプチドまで様々である。「官能性ポリヌクレオチド」とは、本明細書中に記載された官能性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。
CBP-I第一級アミノ酸配列に少量の変更を加えても、本明細書中に記載のCBP-Iポリペプチドと比較して実質的に同等な活性を有するタンパク質となる場合がある。こうした変更は、位置指定突然変異誘発などにより意図的に行ってもよいし、自発的に行ってもよい。こうした変更を加えて生成したポリペプチドはすべて、CBP-I活性が保持されているかぎり本発明に含まれる。更に、1つ以上のアミノ酸を除去することにより、その活性の有意な変化を伴わずに、得られる分子の構造の改質を行うこともできる。これによって、更に広範な有用性をもつより小さな活性分子の開発を行うことができる。例えば、CBP-I活性をもたせるうえで必要とならないアミノ末端またはカルボキシ末端アミノ酸を除去することが可能である。
本発明のCBP-Iポリペプチドにはまた、該ポリペプチド配列の保存的変異体も含まれる。本明細書中で使用される「保存的変異」という用語は、アミノ酸残基を生物学的に類似した他の残基で置換することを意味する。保存的変異としては、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、またはメチオニンなどの疎水性残基で他の疎水性残基を置換すること、または極性残基で他の極性残基を置換すること、例えば、アルギニンでリシンを、グルタミン酸でアスパラギン酸を、もしくはグルタミンでアスパラギンを置換することなどが挙げられる。「保存的変異」という用語にはまた、無置換の母核アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することも含まれるが、この場合、置換ポリペプチドに対して産生された抗体が無置換ポリペプチドとも免疫反応を行うものとする。
本発明の方法に使用されるCBP-Iのウイルス供給源としては、粘液腫ウイルス、牛痘ウイルス、ショープ繊維腫ウイルス、エクトロメリアウイルス、ウサギ痘ウイルス、および他の哺乳類ポックスウイルスが挙げられるが、この場合、CBP-Iは、グリコシル化の程度にもよるが分子量約30〜40kDを有すること、粘液腫T7インターフェロンγ受容体の同族体との相同性を有すること、および粘液腫T7インターフェロンγ受容体の同族体の生物学的機能を有することを特徴とする抗炎症タンパク質の生物学的機能をもつものとする。
本発明の方法により治療される免疫病理学的疾患は、ケモカインの産生およびそれに続く罹患組織における反応性白血球の蓄積と関連付けることができる。この方法には、治療上有効量のCBP-Iの被検者への投与が含まれる。「免疫病理学的疾患」という用語は、一般に免疫応答または免疫性が関与する任意の疾患を意味する。本明細書中で使用される「治療上有効」とは、免疫病理学的疾患の原因を軽減するのに十分なCBP-I量を意味する。「軽減」とは、治療を受ける患者の疾患の有害な作用を減少させることを意味する。本発明の被検者は好ましくはヒトであるが、免疫病理学的疾患を患った任意の動物、例えば、ヒトの骨髄が移植されたSCIDマウス（ヒューマナイズドSCID）、を本発明の方法により治療できると考えられる。本発明の方法により治療可能な免疫学的疾患としては、例えば、後天性免疫不全症(AIDS)、毒素ショック症候群、同種異系移植片拒絶、関節硬化性プラーク成長、紫外線および放射線応答、ならびにT細胞、B細胞、マクロファージ、および免疫応答や急性期応答における他の炎症白血球の活性化が関連する疾患、更に腫瘍壊死因子媒介悪液質などの進行癌が関連する疾患が挙げられる。
本発明は、内毒血症もしくは敗血症性ショック（敗血症）などの免疫病理学的疾患または敗血症の症状を1つ以上を含む免疫病理学的疾患を治療または軽減する方法を提供する。該方法には、敗血症の症状を呈するかまたは敗血症が進行する恐れのある被検者に治療上有効量のCBP-Iを投与することが含まれる。「軽減」という用語は、治療される疾患の症状を減少または弱めることを意味する。
免疫学的疾患の症状を呈する患者については、CBP-Iを用いた治療に加えて、抗生物質または抗ウイルス剤を用いた治療を行ってもよい。典型的な抗生物質としては、ゲンタマイシンなどのアミノグリコシドまたはペニシリンもしくはセファロスポリンなどのβラクタムが挙げられる。従って、本発明の治療法には、殺菌量の抗生物質または十分量の抗ウイルス化合物の投与と実質的に同時に治療上有効量のCBP-Iを投与することが含まれる。
本明細書中で使用される「殺菌量」という用語は、治療を受ける患者中に細菌死滅血液濃度を得るのに十分な量を意味する。ヒトへの投与に対して安全であるとして一般に認知されている抗生物質の殺菌量は、当該技術分野で周知であり、また当該技術分野で知られているように、この殺菌量は特定の抗生物質および治療される細菌感染のタイプにより変わる。CBP-Iの投与は48時間以内に行うのが好ましく、好ましくは約2〜8時間以内、最も好ましくは抗生物質の投与と実質的に同時に行う。
本発明の方法においてCBP-Iの投与を行って再灌流後傷害を軽減することも可能である。動脈血栓症を治療する場合、組織プラスミノーゲン活性化因子(t-PA)などの血餅溶解剤による再灌流の誘発には、しばしば組織損傷が伴う。こうした組織損傷の少なくとも一部は、白血球（例えば、多形核白血球(PMN)が挙げられるが、これに限定されるものではない）が媒介していると考えられる。従って、CBP-Iの投与により白血球またはPMN‐内皮相互作用が阻害され、これによって再灌流後傷害が減少または抑制されるのであろう。CBP-Iの投与はまた、動脈傷害後に新たに生じる再発性アテローム硬化性プラーク成長を抑制するのに有用である。再狭窄およびプラークの新たな成長は、動脈壁の内層に対する局所的炎症応答によって悪化するものと考えられる。
本発明の方法はまた、アレルギー性疾患または自己免疫疾患に起因する炎症の治療に有用である。アレルギー性疾患としては、例えば、アレルギー性鼻炎、喘息、アトピー性皮膚炎、および食物性アレルギーが挙げられる。免疫系が宿主自身の組織を攻撃する自己免疫疾患としては、例えば、インシュリン依存性糖尿病、炎症性腸疾患、皮膚炎、髄膜炎、血栓性血小板減少性紫斑病、シェーグレン症候群、脳炎、ブドウ膜炎、白血球粘着性欠損症、リウマチ様および他の形態の免疫性関節炎、リウマチ熱、ライター症候群、乾癬性関節、進行性全身性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、天疱瘡、類天疱瘡、壊死性脈管炎、重症筋無力症、多発性硬化症、紅斑点性狼瘡、多発性筋炎、類肉腫症、肉芽腫症、脈管炎、悪性貧血、CNS炎症性疾患、抗原抗体複合体媒介疾患、自己免疫性溶血性貧血、橋本甲状腺炎、グレーブス病、習慣性突発性流産、ルナール症候群、糸球体腎炎、皮膚筋炎、慢性活動性肝炎、セリアック病、AIDSの自己免疫性合併症、萎縮性胃炎、強直性脊椎炎、およびアジソン病が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
この方法はまた、非悪性または免疫関連細胞増殖疾患の治療に有用である。こうした疾患としては、例えば、乾癬、尋常性天疱瘡、ベーチェット症候群、急性呼吸困難症候群(ARDS)、虚血性心疾患、アテローム硬化症、透析後症候群、白血病、後天性免疫不全症候群、敗血症性ショックおよび他のタイプの急性炎症、脂質性組織球増殖症などがある。本質的には、ケモカイン産生（例えば、IL-8、MIP-1αまたはβの発現の誘発）に起因する炎症前突起や細胞浸潤と病理論学的に関連する任意の疾患が治療の対象となりうるものと考えられる。
本発明の方法はまた、微生物感染症の治療にも有用である。細菌、リケッチア、種々の寄生虫、およびウイルスなどの多くの微生物は、血管内皮および白血球に結合し、炎症反応を誘発して、例えば、インターロイキンが産生される。従って、本発明の方法に使用されるCBP-Iを患者に投与して、こうした感染症と関連した炎症を防止することができる。
本発明のCBP-Iの投与に対する用量範囲は、免疫応答の症状がある程度抑えられる所望の効果を得るのに十分な大きさの範囲である。不必要な交叉反応、アナフィラキシー反応などの有害な副作用を引き起こすほど用量を多くしてはならない。一般に、用量は、年齢、症状、性別、および患者の病気の程度により変わるが、当業者により決定することができる。悪い徴候が現れた場合は、個々の医師によって用量を調節することができる。1日もしくは数日にわたり毎日1回以上の投与で1回あたり約10pg〜100μgの範囲で用量を変化させることができる。
CBP-Iは、非経口投与、皮下投与、肺内投与、動脈内投与、直腸内投与、筋肉内投与、鼻腔内投与など、任意の好適な手段で投与される。非経口注入としては、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、または腹腔内投与が挙げられる。CBP-Iはまた、例えば徐放性皮下埋植の形態で経皮投与するか、またはカプセル、粉末、もしくは顆粒の形態で経口投与してもよい。また、吸入によりCBP-Iを投与することもできる。例えば、肺の炎症性疾患の治療に使用する場合、好ましい投与経路は肺へのエアゾール投与である。
医薬品として許容しうる非経口投与用キャリア製剤としては、無菌または水性もしくは非水性の溶液、懸濁液、および乳濁液が挙げられる。非水性溶剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの有機エステルである。水性キャリアとしては、水、アルコール性／水性の溶液、乳濁液、または懸濁液、例えば、食塩水および緩衝媒体、が挙げられる。非経口担体としては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガー、または固定油が挙げられる。活性治療成分は、医薬品として許容でき、しかも該活性成分と相溶化しうる賦形剤と共にしばしば混合される。好適な賦形剤としては、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、およびエタノール、またはこれらの組合せが挙げられる。静脈担体としては、液体および栄養素補液、電解質補液（例えば、リンガーデキストロースに基づくもの）などが挙げられる。また、保存料やその他の添加剤（例えば抗菌剤、酸化防止剤、キレート化剤、不活性ガスなど）が存在していてもよい。
本発明はまた、本発明のCBP-Iを含有する薬剤または医薬用組成物の調製方法を提供する。該薬剤は、有害な免疫応答／炎症反応（本発明のCBP-Iと結合するケモカインが免疫応答の結果として産生される）の治療に使用されるものである。
本発明は、グリコシル化の程度にもよるが約30〜40kDの分子量を有し、粘液腫T7インターフェロンγ受容体の同族体とのアミノ酸配列相同性を有し、更に医薬用キャリア中で、粘液腫T7インターフェロンγ受容体の同族体の生物学的機能を有する抗炎症性タンパク質の免疫治療上有効量の少なくとも1回の投与量を含む医薬用組成物を提供する。
本発明は、本発明の方法に使用される本発明のCBP-Iを含有する医薬用製剤および組成物を提供する。その形態は投与経路に依存する。例えば、注入用組成物は、それぞれ単位用量が含まれるアンプルの形態で、または複数回の投与量を含有する容器の形態で提供できる。
CBP-Iを処方して、医薬品として許容される中性塩の形態で治療用組成物を調製してもよい。こうした塩としては、無機酸（例えば、塩酸、リン酸など）または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸など）と共に形成される酸付加塩が挙げられる。塩としてはまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリシウム、水酸化第二鉄など）および有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）から形成される塩も含まれる。
適切な巨大分子（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレン‐酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロタミン、またはラクチド／グリコリド共重合体）を選ぶことによって、送達制御を行うことが可能である。CBP-Iの放出速度は、巨大分子の濃度を変化させることによって制御可能である。
作用持続時間を制御するもう1つの方法は、CBP-Iをポリマー材料（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリラクチド／グリコリド共重合体、またはエチレン酢酸ビニル共重合体）の粒子中に包含させるものである。この他、例えば、コアセルベーション技術または界面重合技術によって調製されたマイクロカプセル中に（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンのマイクロカプセル、またはポリ(メチルメタクロレート)マイクロカプセルを使用して）、あるいはコロイド薬物送達システム中にCBP-Iを封入することが可能である。コロイド分散系としては、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、脂質に基づく系（例えば、水中油エマルション、ミセル、混合ミセル、およびリポソーム）が挙げられる。
以下の実施例は本発明を説明するためのものであって、本発明を限定するものではない。これらは利用可能な典型的な例であるが、当業者にとって公知の他の手順を代わりに使用してもよい。
実施例１
材料及び方法
損傷誘発性アテローム硬化症のラットモデル：
９匹のＳＤ(Sprague Dawley)ラットにバルーン血管形成術を施すことによってその左腸骨大腿骨の動脈に損傷を与えた。全身性ペントバルビタール麻酔下で（体重 100ｇ当たり 6.5mgを筋肉内注射、Somnotrol、MTC Pharmaceuticals、ケンブリッジ、オンタリオ）、1.5mmのＵＳＣＩ血管形成用バルーンを静脈切開及び動脈切開によって動脈内に逆方向に進ませた。500pgのCBP-I（６匹のラット）又は生理食塩水（５匹のラット）を、後のバルーンによる損傷部位から上流に向かう血管形成用バルーンカテーテルの末端管腔内にCBP-I又は対照溶液を動脈内注射することによって与えた。次いで、バルーンを８バールの圧力に１分間膨らませた。血管形成術後、バルーンをすぼませて取り出し、動脈切開部位をn-ブチルシアノアクリレートモノマー(Nexaband、Veterinary Products Laboratories、フェニックス、アリゾナ)の局所塗布によって閉じた。各ラットを正常ラットの食餌で養って、手術後４週間追跡検査を行った。追跡検査では、ラットをユータニル(euthanyl)2.0ml/kg で殺し、大動脈を組織学的検査のために採収した。
損傷誘発性アテローム硬化症のウサギモデル：
７匹のコレステロール補給ニュージーランド白ウサギに末端(distal)腹大動脈のバルーン血管形成術を施した。全てのウサギ（ニュージーランド白系統）に２％コレステロールを含む10％落花生油食を４日／週与えた。これはバルーン損傷の２週前から始めた。麻酔（40mg/kg ケタリーン(ketalean)、８mg/kg キシラゼン(xylazene)及び 0.5mg/kg アセプロマジン(acepromazine)を筋肉内注射）後、３〜3.5mm の血管形成用バルーンカテーテル（バルーンと大動脈の直径の比は≧１：１）を、大腿動脈の静脈切開(femoral arterial cut down)によって導入した。バルーンを末端腹大動脈内で８バールの圧力に膨らませて、その末端胸大動脈に逆方向に進ませた。各ウサギにおいてＸ線透視による監視下でのバルーンの前進及び引き出しを３回行って確実に内皮を裸出させた。バルーン血管形成術による損傷の前後と、４週間の追跡調査において対比血管造影図を記録した。大腿アクセスの達成後すぐにヘパリン(400単位)を投与してカテーテル関連血栓症を低減させた。
４匹のウサギの末端腹大動脈内におけるバルーンによる損傷後、すぐに精製CBP-I(T7)タンパク質 500 pg/サンプルを注入した。３匹のウサギにおいて、生理食塩水の平行注入液を末端腹大動脈内に局所的に注入した。バルーンによる損傷後、すぐに各注入物を無菌 0.9％生理食塩水で総容量10mlに希釈してWolinskyカテーテルによって投与した。全ての注入は腸骨分岐の近位の腹大動脈内で3.25mmWolinskyバルーンによって行われた（最終圧力６±１バールに２分間膨らませた）。Ｘ線透視による監視下で、Wolinskyバルーンを腸骨分岐のすぐ上方に置いてその灌流バルーンがごく普通に腸骨分岐の 0.5〜2.5cm 上方に位置するようにし、第１の注入部位と呼んだ。上流の第２の部位は腸骨分岐に近位の 2.5cmよりも上方の領域に規定した。全ての検査において、バルーンによる損傷後、注入物をすぐに無菌 0.9％生理食塩水で総容量10mlに希釈してWolinskyカテーテルによって投与した。全ての注入は腸骨分岐の近位の腹大動脈内で3.25mm Wolinsky バルーンによって行われた（最終圧力６±１バールに２分間膨らませた）。
CBP-Iタンパク質の単離及び精製：
粘液腫T-7 タンパク質(CBP-I)は本明細書の実施例４に記載したようにして単離、精製した。
組織学的分析及び形態計測学的(morphometric)分析：
末端腹大動脈（ウサギ）の第１のWolinsky注入部位、又は灌流バルーンの最初の位置決めによって規定された第１の注入部位を示す上流の腸骨大腿骨動脈枝（ラット）にて組織学的分析を行った。ウサギにおいて、腸骨分岐近傍の下流の非注入部位（分岐の 0.5cm上方から分岐の0.5cm 下方まで）、及び上流の非注入部位（腸骨分岐の 2.5cm〜3.5cm 上方の上流腹大動脈）から内部対照切片を取り出した。腸骨分岐の 1.5〜2.5cm 上方の領域は、バルーン配置による潜在的に可変の注入量を有する境界ゾーンであると考えられ、したがってこの分析には含まれなかった。ラットにおいては、T-7 処置ラット及び生理食塩水注入ラット両方の第１のバルーン部位を組織学的評価に用いた。ホルマリン固定標本のヘマトキシリン及びエオシン染色を以前に記載されたようにして行った。簡単に言うと、以前に記載されたように各標本を10％(v/v)リン酸ナトリウム緩衝ホルマリンに固定し、処理し、含浸し、パラフィンに包埋してミクロトームによって５μm の切片に切断した。次いで、各標本由来の切片（最小で２切片／部位）をヘマトキシリン及びエオシンで染色し、光学顕微鏡検査法によって検査した。
シュワルツマン反応：
体重３kgの雌性ニュージーランド白ウサギに、E.coli血清型 0111:B4(Sigma)由来のリポ多糖(LPS)、及びカラムクロマトグラフィーを用いて均質に精製されたCBP-I(T7)タンパク質を注射した。0.1〜1.0 μg のCBP-Iが存在する50〜100 μg のLPS及びCBP-Iが存在しない50〜100 μg のLPSの８つの皮内注射液(各 0.1m)をウサギの背に注入した；片側に約 2.5cm毎に離された４つの注射部位がある。24時間後、ウサギの耳辺縁静脈に LPS100μg を静脈内投与する。静脈内注射の約４〜６時間後、内皮注射部位に壊死性炎症が発生した。その炎症が有意になるとすぐに、ユータノール(euthanol)の致死性注射によってウサギを殺した。損傷の大きさ及び赤みを評価して組織サンプルを集めた。
実施例２
新規ウイルスタンパク質へのサイトカインの結合
簡単に言うと、種々のヒトサイトカインを125Ｉで放射性同位元素標識し、対照又はポックスウイルス感染BGMK細胞から採取した分泌タンパク質に曝露し、架橋させ、次いでSDS-PAGEによって新規サイトカイン／タンパク質複合体を分析した。驚くべきことに、架橋アッセイは、何が明らかに試験される３つのヒトケモカイン（IL-8、RANTES、及び MIP-1βのそれぞれに結合した新規ウイルス特異的タンパク質）であるかをカバーしていない（図１）。図１Ａにヨウ素化リガンド及び組織培養上清を用いるゲル移動度変位アッセイを示す。組織培養上清(Sups)は以下のようにして調製した：BGMK（ベビーミドリザル腎細胞(Baby Green Monkey Kidney Cells)）に粘液腫(MYX)、ワクシニアウイルス(VV)、又はショープ繊維腫ウイルス(SFV)を感染多重度(MOI)３で感染させた。初期のSupsを採集するために、感染単層をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で３回洗浄し、次いで感染の４時間後に採集した血清フリー培地を補給した（Ｅ）。後期のSupsを、その単層をPBS で３回洗浄し、感染の４時間後に血清フリー培地を補給することによって調製し、次いで、これらのSupsを感染の18時間後に採集した（Ｌ）。偽(mock)Supsをウイルスの不存在下で同様の方法で調製した。SupsをAmicon濃縮器を用いて約15倍に濃縮した。製造業者のプロトコルに従って、ヨードビーズ(iodobeads)(Pierce)を用いてヒトケモカインIL-8、RANTES、及び MIP- βを125Ｉで標識した。
ゲル移動度変位アッセイは以下のようにして行った：ヨウ素化リガンド５μlをSUP 10μl と混合し、室温で２時間静置した。次いで化学架橋試薬1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド(EDC)(100mM リン酸カリウム溶液に200mM で溶かしたもの、pH7.5)2μl を15分間かけて添加し、さらに２μl を15分間かけて添加した。次いで、トリス-HCl(1.0M、pH7.5)2μl を添加することによって反応を止めた。得られた混合物をSDS-PAGE及びオートラジオグラフィーを用いて分析した。矢印はシフトした複合体を指し示すものである。
図１Ｂには、ヨウ素化 MIP-1βを偽、MYX 又はエクトロメリア(ECT)Sups と反応させたこと以外は図１Ａに記載したのと同様の実験を示す。このデータは、ショープ繊維腫ウイルス(SFV)又は粘液腫(MYX)が感染した細胞が、約50kDの架橋化学種（矢印で指したもの）を作り出す新規タンパク質を分泌するということを示しており、そして12kDのリガンドに結合した未知の化学種は約38kDであるということを示すものである。重要なことに、その新規複合体は、偽感染対照細胞、又はワクシニアウイルス(VV)、SFV のものとは異なる属（オルトポックスウイルス属）のポックスウイルス又は粘液腫（レポリポックスウイルス属）に感染した細胞由来の上清中には検出されない。
図２には125Ｉ-RANTES を競合相手とともに用いるゲル移動度変位アッセイを示す。ヨウ素化RANTESを０、１、10及び 100倍モル過剰の非標識ヒトRANTES、MIP-1β、MIP-1α、IL-8又はMCAFと混合した。次いで、この混合物を図１Ａに記載したようにして偽又は粘液腫初期Supsと反応させて、SDS-PAGE及びオートラジオグラフィーを用いて分析した。この図は、RANTESとの自己競合(self competition)並びに MIP-1β、MIP-1α、IL-8及びMCAFとの交差競合(cross competition)を示している。矢印はシフトした複合体を指し示すものである。
図３Ａにおいては、ヨウ素化 MIP-1βを０、１、10及び 100倍モル過剰の非標識ヒト MIP-1β、IFNγ、MCAF、MIP-1α、RANTES、又はIL-8と混合した。次いで、この混合物を図１Ａに記載したようにして偽又は粘液腫初期Supsと反応させて、SDS-PAGE及びオートラジオグラフィーを用いて分析した。この図は、MIP-1βとの自己競合、並びに IFNγ、MCAF、MIP-1α、RANTES、及びIL-8との交差競合を示している。矢印はシフトした複合体を指し示すものである。
図３Ｂにおいては、ヨウ素化 MIP-1βを、偽、MYX、雌ウシポックスウイルス(CPV)、ウサギポックスウイルス(RPV)、ECT、SFV、又はVV由来のSupsto混合して、SDS-PAGE及びオートラジオグラフィーを用いて分析した。矢印はシフトした複合体及び遊離のリガンドを指し示すものである。
図４においては、ヨウ素化IL-8を０、１、10及び 100倍モル過剰の非標識ヒト MIP-1β、MIP-1α、MCAF、又は IFNγと混合した。次いで、この混合物を図１Ａに記載したようにして偽又は粘液腫初期Supsと反応させて、SDS-PAGE及びオートラジオグラフィーを用いて分析した。この図は、IL-8との自己競合、並びに MIP-1α、MCAF、及び IFNγとの交差競合を示している。矢印はシフトした複合体を指し示すものである。
図２に示したように、リガンドとして125Ｉ標識RANTESを用いた場合、結合はRANTEd、MIP-1β、MIP-1α及びMCP-1を含むが、IL-8を含まない種々のコールド(cold)ケモカイン競合相手と競合することができた。同様に、125Ｉ-MIP-1βを標識リガンドとして用いた場合、非標識 MIP-1β、MCAF、MIP-1α及びRANTESとの競合が観察されたが、IL-8又はヒト IFNγとの競合は観察されなかった（図３）。しかしながら、標識IL-8をリガンドとして用いた場合、コールドIL-8並びに MIP-1α、MIP-1β、MCAFとの競合が観察されたが IFNγとの競合は観察されなかった（図４）。
C-X-C 及びC-C ケモカインがこのような珍しいパターンの交差競合を有するということは興味深いが、それはウイルスタンパク質を有するこれらの種々のヒトケモカインの様々な親和力定数に関係しているものと考えられる。ウイルス38kDa 分泌タンパク質種に結合しているケモカインの明白な広いスペクトルは、このタンパク質が多くのヒトケモカインの一般化された阻害剤であるということを示唆するものであり、したがって広範な白血球の化学走性を妨げる。
図５においては、Ｔ７タンパク質(CBP-I)を精製し（実施例３参照）、指示されたサイトカインと混合し、架橋し、SDS-PAGEによって分析し、抗Ｔ７抗体とのウェスタンブロッティングによって分析した。試験したサイトカインの中で、ヒトIL-8及びウサギ IFNγのみがＴ７と高分子複合体を形成し、結合特異性を示した。
図６においては、全ての３つの主要クラス（ＣＸＣ、ＣＣ及びＣ）由来の代表的なケモカインのスペクトルを図５に記載されたようにしてＴ７タンパク質(CBP-I)に対する結合について試験した。試験された全てのケモカインが比較できる結合活性を有するＴ７タンパク質を結合した。
実施例３
ＣＢＰ−Ｉの精製
CBP-Iを精製するために、粘液腫感染細胞の分泌タンパク質を濃縮し、MonoQクロマトグラフィーによって分画し、次いでサイズ濾過クロマトグラフィーによって分画した。図７には粘液腫ウイルス感染細胞の上清からのCBP-Iの均質になるまでの精製を示す。簡単に言うと、一晩置いた粘液腫ウイルス感染ベビーミドリザル腎(BGMK)細胞から上清を採収し、10,000RPM で１時間遠心分離し、攪拌限外濾過セル(Amicon)を用いて10倍濃縮した。ウイルスフリーの濃縮粘液腫上清(Sups)を20mMビス- トリスpH6.0(Sigma)中で透析し、精製前に４℃で保存した（レーン１）。CBP-Iを速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)を用いる２ステップ精製法によって粘液腫上清から均質になるまで精製した。簡単に言うと、粘液腫上清５mlを、低イオン強度出発緩衝液(20mMビス-トリスpH6.0)で予備平衡化したMonoQ HR5/5(Pharmacia)陰イオン交換カラム上に装填した。段階グラジエント法において溶離緩衝液(1M NaCl 20mMビス- トリスpH6.0)を500mM NaClまで増大させることによってタンパク質をカラムから溶離させた。タンパク質画分を集めてSDS-PAGEによって分離し、銀染色によって分析した。150〜200mM NaClで溶離されたタンパク質（画分21〜27）の分析によって、約37,000MW（CBP-I）及びウシ血清アルブミンのサイズに相当する未知の混入タンパク質の顕著なバンドが現れた（レーン２）。続いて、プールしたMonoQ 画分♯21〜27をHiLoad 16/60 Superdex 75ゲル濾過カラム(Pharmacia)上に装填し、20mMビス- トリスpH6.0を用いて流量 0.5ml／分にて溶離した。２カラム床容量と等しい容量に画分を集めて、SDS-PAGEによって分離し、銀染色によって分析した。Superdex 75 の通過流量(flow-through volume)から集めた画分♯26〜31には、精製CBP-Iに相当する約37kDの単一のタンパク質種が現れた（レーン３）。
最終CBP-I産物（図７）は、CBP-Iのグリコシル化不足の(under-glycosylated)変異体であると思われるより小さい成分(35kDa)と共精製された38kDa のグリコシル化タンパク質であった。
精製又は部分精製CBP-I１μg を、１μの組換え体ヒトRANTESとともに、又は組換え体ヒトRANTESなしに室温(RT)で２時間インキュベートした。インキュベート後、そのタンパク質にEDC(Sigma)を40mM（最終濃度）になるまで添加することによって室温で30分間架橋させ、1/10容量の１Ｍトリス(pH7.5)を添加することによって停止させた。この混合物にSDS 装填緩衝液を添加し、そのサンプルを３分間煮沸し、SDS-PAGEにかけ、銀染色によって検出した。精製又は部分精製CBP-IをRANTESとともにインキュベートした場合、銀染色分析によって約47kDの架橋複合体（CBP-I＋RANTES）が現れたが（レーン２及び４）、ゲル移動度が変位した複合体はRANTESが存在しない場合には観察されなかった（レーン１及び３）。
部分精製（すなわちMonoQ 単独）又は完全精製CBP-IをヒトRANTESとともに標準架橋アッセイで試験した場合、その結合活性がCBP-I単独によって与えられた特性であるかどうかを予測したように、CBP-I／ケモカインの特有の変位した１：１複合体が検出された（図８及び９）。図９には部分精製CBP-IへのヒトRANTESケモカインの結合を示す。部分精製CBP-I１μg を、組換え体ヒトRANTESなしで（レーン１）、又は組換え体ヒトRANTESの量を増加させながら（レーン２〜６）室温で２時間インキュベートした。インキュベート後、そのタンパク質にEDC(Sigma)を40mM（最終濃度）になるまで添加することによってRTで30分間架橋させ、1/10容量の１Ｍトリス(pH7.5)を添加することによって停止させた。この混合物にSDS 装填緩衝液を添加し、そのサンプルを３分間煮沸し、SDS-PAGEにかけ、銀染色によって検出した。CBP-IをRANTESとともにインキュベートした場合、銀染色によって約47kDの架橋結合複合体（CBP-I＋RANTES）が現れ（レーン２〜６）、この結合は、ケモカインリガンドの量を減少させることによって滴定することができる。現れた約66kDの単一の混入バンドは、MonoQ クロマトグラフィー中にCBP-Iとともに共分画されたが、Superdex 75 クロマトグラフィーによって除去されなかった未知のタンパク質である。
実施例４
ラット大腿動脈内の血管形成用バルーンによる損傷に見られるような抗再狭窄タンパク質としてのCBP-I(T-1)の効率の分析
炎症は、動脈壁内の促進されたアテローム硬化プラークと関連している。閉塞した動脈を開くために設計されたバルーン血管形成術及びその他の関連の血管形成術用装置の使用後、高い割合でプラーク再発、すなわち再狭窄が存在する。また、動脈損傷、ウイルス感染、脈管炎、ホモシスチン尿症、真性糖尿病、高血圧症、高脂血症、喫煙及び免疫複合体が引き起こした疾患に至る状況下でも促進されたアテローム硬化プラークの成長が報告されている。より大きなＤＮＡウイルスは、宿主免疫及び炎症防御機構による減退した阻害を有する宿主中でそのウイルスを増殖させる進化した機構、すなわち抗炎症タンパク質を有する。これらの例は、免疫を基礎とする疾患を治療又は予防する可能性がある抗炎症薬としてのウイルスタンパク質の使用を証明するものである。CBP-I(T-7)を、血管形成術後のプラーク成長を予防する可能性がある治療薬として試験した。CBP-Iはインターフェロンγ受容体相同体及びケモカイン阻害剤として作用するということが報告されている。CBP-Iを損傷誘発性アテローム硬化症の２つの動物モデル（ラット及びウサギ）において試験した。その結果は、注入の４週後にプラーク形成の有意な減少を示している。
CBP-I注入後では生理食塩水注入との比較においてプラーク成長における有意な減少が存在する（図10Ａ〜Ｃ）。ラットモデルにおいては、CBP-I注入の４週間後の追跡検査ではプラークの平均面積は 0.005±0.002mm2であり（図10Ｂ、Ｃ）、プラークの平均厚さは8.33±4.01μm である（図10Ａ）（ｐ＜0.0003）。生理食塩水注入の場合、４週間後の追跡検査ではプラークの面積は 0.036±0.006mm2であり、プラークの厚さは62±7.35μm である（ｐ＜0.0003）。これはCBP-I注入の場合、プラークの面積及びプラークの厚さが７倍減少しているということを示している。プラークの発達の減退は、バルーンによる損傷直前のCBP-I単独注入の４週間後の追跡検査で観察された。目に見える損傷は、主に、ラット動脈損傷モデルに特有の平滑筋細胞増殖性変化からなる（図10）。
ウサギモデルでも、生理食塩水で処理した対照との比較において、プラークの面積及び厚さが有意に減少していた。４週間後の追跡検査では、CBP-I注入後のプラークの平均厚さは30±21.6μm であり、生理食塩水注入後は 600±200 μm であった（ｐ＜0.02）。この場合、観察されたプラークはコレステロール補給ウサギモデルで通常見られた線維及び脂肪泡沫細胞プラークであった（図11）。
損傷誘発性アテローム硬化症の２モデルにおけるウイルス抗炎症タンパク質の使用の検査（ウサギ及びラット）。両モデルで、組織学的分析においてその後のプラーク形成における有意な減少が検出可能であった。各場合において、タンパク質の単独注入がバルーン損傷直後に行われた。
実施例５
シュワルツマン反応
壊死性炎症の典型的な例の一つはシュワルツマン反応であり、この反応は、まずリポ多糖(LPS)をウサギの皮膚に導入し、次いで24時間後同じLPSを静脈内投与するものである。第二のLPS注射後短時間のうちに、浸潤マクロファージが第一の注射部位に再現性のある壊死性応答（これは高度に再現性があり、容易に定量化される）を誘発する。マクロファージ流入及び第一の注入部位での活性化を阻害するCBP-Iの能力が検査された。
LPSを精製T7タンパク質の存在下又は不存在下でウサギの背に皮内注射し、24時間後、LPSを静脈注射により投与した。皮内注射部位に炎症がすぐに現れ、その動物は安楽死した。そのデータを集めた。
Figure 2007332145
 損傷は以下のように等級付けられる：直径１〜10mm、わずかに赤色、膨らみ無し（＋）；直径１〜10mm、赤色、膨らみ１〜２mm（＋＋）；直径10〜15mm、強烈な赤色、膨らみ２〜３mm（＋＋＋）；直径15mmより大、暗出血性中心を有する強烈な赤色、膨らみ２〜３mm（＋＋＋＋）。
LPS（100μg）損傷は出血性で膨らみがあるが、LPS(100μg)＋CBP-I(T7)タンパク質(１μg)を注射した皮膚はわずかに赤色で膨らみがあった。LPS50μgを用いた場合、CBP-I１μg によりシュワルツマン反応の全ての目に見える徴候が抑制された。CBP-Iを単独で皮内注射し、その後LPSを静脈注射した場合、炎症は誘発されなかった。ウシ血清アルブミン(1.0μg)をLPS100 μg とともに注射し、その後LPSを静脈注射した場合、炎症を抑制することはできなかった。これらの実験（ｎ＝２）は、精製CBP-Iタンパク質が局在化したシュワルツマン反応からウサギを保護することができるということを示している。
T7が IFNγ及びIL-8及びRANTES等のケモカインを結合することが示されたので、シュワルツマン反応におけるこれらのサイトカインのかかわり合いは興味深い。
サイトカインIL-12、IFNγ、TNFα(Ozmenら，J．Exp．Med.，180:907-915，1994)及びIL-8(Harada ら，Int．Immunol.，5:681-690，1993)が関与するシュワルツマン反応は複雑である。例えば、IFNγ(Billiauら，Euro．J．Immunol.，17:1851-1854，1987; Heremans，J．Immunol.，138:4175-4179，1987)又はIL-8（上記のHaradaら）のいずれかに対する中和抗体はシュワルツマン反応を遮断し又は抑制することは示されている。したがって、ウサギでのシュワルツマン反応におけるCBP-Iの抑制効果は、CBP-Iの IFNγもしくはケモカイン又はその両方に結合する能力によるものであり得る。CBP-Iは IFNγに対する化学種特異性を示すが、ケモカインには結合しないので、これらの実験はこの炎症モデルにおけるT7の IFNγとケモカインとの結合活性を識別するための試みにおいてラットで繰り返されるであろう。
概要：
クローニングされ配列決定された粘液腫CBP-I遺伝子は、公知のケモカイン受容体の分泌相同体ではなく、全てが７つの膜伸縮進行性(membrane-spanning)ドメイン（「ヘビ状物(serpentine)」と呼ばれる）を保有し、非常に多くの最近のレビューに記載されている(kelvin,D.J.ら，J．Leukocyte Biol.，54:604-612，1993; Murphy,P.M.，Ann．Rev．Imm.，12:593-633，1994; Horuk，R.，Imm．Today.，15:169-174，1994;及びHoruk,R.，Trends inPharm．Sci.，15:159-165，1994)。いくつかのＤＮＡウイルスは、ポックスウイルスにおける少なくとも１つの遺伝子候補(Massung,R.F．ら，Virology，197:511-528，1994)を含む、そのようなヘビ状物受容体の相同体をコードする(Ahuja,S.K．ら，Imm．Today，15:281-287，1994)が、本発明のCBP-Iはかかる特定の受容体ファミリーのメンバーではない。したがって、CBP-Iは、恐らく処理された組織におけるケモカインのスペクトルをモジュレートすることによって作用する新しいクラスの抗炎症タンパク質を示すものである。
本発明は目下好ましい態様に関して記載したが、本発明の精神から逸脱することなく種々の修飾がなされ得ることは理解されるであろう。したがって、本発明は以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
図1Aは、ポックスウイルス分泌タンパク質と接触させた後のI125標識されたIL-8、RANTES、およびMIP-1βのSDS-PAGEを示している。 図1Bは、粘液腫またはエクトロメリアウイルス感染細胞中のI125-MIP-1 βのSDS-PAGEを示している。 図2は、粘液腫分泌タンパク質に対するリガンドとしてのI125標識されたRANTESのSDS-PAGEを示すとともに、標識されていないRANTES、MIP-1β、MIP-1α、IL-8、およびMCP-1との拮抗を示している。 図3Aは、ポックスウイルス分泌タンパク質に対するリガンドとしてのI125標識されたMIP-1βのSDS-PAGEを示すとともに、標識されていないMIP-1β、IFN-γ、MCAF、MIP-1α、RANTES、およびIL-8との拮抗を示している。図3Aは、粘液腫、ワクシニア、およびSFVを示している。 図3Bは、ポックスウイルス分泌タンパク質に対するリガンドとしてのI125標識されたMIP-1βのSDS-PAGEを示すとともに、標識されていないMIP-1β、IFN-γ、MCAF、MIP-1α、RANTES、およびIL-8との拮抗を示している。図3Bは、粘液腫、牛痘、ウサギ痘、エクトロメリア、およびSFVを示している。 図4は、粘液腫分泌タンパク質に対するリガンドとしてのI125標識されたIL-8のSDS-PAGEを示すとともに、標識されていないMIP-1β、IFN-γ、MCAF、およびMIP-1αとの拮抗を示している。 図5は、T7タンパク質を表すウェスタンブロットを示すとともに、種々のサイトカイン（IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IFNα、およびIFN-γ）との相互作用を示している。 図6は、T7タンパク質を表すウェスタンブロットを示すとともに、種々のケモカイン（RANTES、MCP-1、MCP-3、IL-8、PF4、IP-10、NAP-2、MGSA、およびリンホタクチン）との相互作用を示している。 図7は、粘液腫感染BGMK細胞由来の全タンパク質、モノQ分画後の半精製タンパク質、およびsuperdex75ゲル濾過後の精製CBP-I(T7)タンパク質のSDS-PAGEを示している。 図8は、ヒトRANTESケモカインの精製CBP-I／部分精製CBP-Iへの結合を示している。銀染色分析により、精製CBP-Iまたは部分精製CBP-IのいずれかをRANTESと共にインキュベートした場合に得られる約47kDの架橋された複合体（CBP-I＋Rantes）が示され(第2レーンおよび第4レーン)、RANTESが存在しないときはゲル移動度シフト複合体は観測されなかった(第1レーンおよび第3レーン)。 図9は、ヒトRANTESケモカインの部分精製CBP-Iへの結合を示している。銀染色分析により、CBP-Iをビオチニル化Rantesと共にインキュベートした場合に得られる約47kDの架橋された結合複合体（CBP-I＋Rantes）が明らかにされ(第2レーン〜第6レーン)、この結合は、標識化されていないケモカインリガンドの量を減少させることによって滴定することができる。 図10Aは、CBP-I(T7)処理の1ヶ月後における動脈損傷ラットモデル中のアテローム性動脈硬化プラークのプラーク厚／深さ(mm)を示している。 図10Bは、CBP-I(T7)処理の1ヶ月後における動脈損傷ラットモデル中のアテローム性動脈硬化プラークのプラーク面積(mm2)を示している。 図10Cは、CBP-I(T7)処理の1ヶ月後における動脈損傷ラットモデル中のアテローム性動脈硬化プラークのプラーク面積(mm2)を示している。 図11は、CBP-I(T7)処理の1ヶ月後における動脈損傷ラットモデル中のアテローム性動脈硬化プラークのプラーク厚(mm2)を示している。

Claims (8)

  1. 約30〜40kDの分子量を有し、
    粘液腫T7インターフェロン−γ受容体相同体と相同のアミノ酸配列を有し、かつ、
    粘液腫T7インターフェロン−γ受容体相同体の生物学的機能を有することを特徴とする抗炎症性ケモカイン結合性タンパク質の治療学的に有効な量を被験者に投与することにより被験者の再狭窄を治療するための医薬の製造における、前記抗炎症性ケモカイン結合性タンパク質の使用。
  2. ケモカインがクラスα又はクラスβのケモカインである、請求項１に記載の使用。
  3. ケモカインが、ＣＴＡＰ−ＩＩＩ、gro／ＭＧＳＡ、ＥＮＡ−78、ＭＣＰ−１、インターロイキン−８、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＰＦ−４、ＩＰ−１０、およびＮＡＰ−２からなる群から選ばれる、請求項２に記載の使用。
  4. 被験者にさらに抗生物質又は抗ウイルス薬を投与する、請求項１に記載の使用。
  5. ケモカイン結合性タンパク質の投与が１投与当たり約10pg〜100μgの用量である、請求項１に記載の使用。
  6. ケモカイン結合性タンパク質の投与方法が皮下投与、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、直腸内投与及び経皮投与からなる群から選ばれる、請求項１に記載の使用。
  7. ケモカイン結合性タンパク質が、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の使用。
  8. ケモカイン結合性タンパク質が、配列番号２と９５％のアミノ酸配列相同性を有する、請求項１に記載の使用。
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