WO1999021589A2 - Verwendung von vektoren wie adenoviren und/oder adeno-assoziierten viren und/oder retroviren und/oder herpes-simplex-viren und/oder liposomen und/oder plasmiden als vehikel für genetische information zur befähigung von säugetierzellen mittel, zur behandlung von knochenpathologien zu produzieren - Google Patents

Verwendung von vektoren wie adenoviren und/oder adeno-assoziierten viren und/oder retroviren und/oder herpes-simplex-viren und/oder liposomen und/oder plasmiden als vehikel für genetische information zur befähigung von säugetierzellen mittel, zur behandlung von knochenpathologien zu produzieren Download PDF

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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • vectors such as adenoviruses and / or adeno-associated viruses and / or retroviruses and / or herpes simplex viruses and / or liposomes and / or piasmids as vehicles for genetic information to enable mammalian cells to produce agents for the treatment of bone pathogens.
  • the invention relates to the use of adenoviruses and / or adeno-associated viruses and / or retroviruses and / or herpes simplex viruses and / or liposomes and / or piasmids as vectors, respective vehicles for genetic information to enable mammalian cells to be therapeutically enabled, to produce proteins, effective as medicinal products, for correcting bone pathologies at the cellular level.
  • Adenoviruses are simple DNA viruses made up of double-stranded DNA and proteins, some of which are human-like and cause infections of the eye and respiratory tract. Many species induce tumors in experimental animals that do not match the natural host or can transform cells in vitro. Adenoviral vectors are modified adenoviruses that have lost the ability to replicate in vivo and their typical pathogenicity.
  • the adeno-associated virus is also known as such and is used, for example, to label cells, as described in more detail in WO 95/14232.
  • retroviruses are understood to mean class 6 RNA viruses which contain single-stranded ribonucleic acid (RNA) and the enzyme reverse transcriptase. With the help of this enzyme, the RNA that has entered the host cell is translated into DNA and then, together with additional repetitive sequences to be integrated into the host genome and replicated with it as a so-called provirus.
  • Retroviruses which are used as vectors in genetic engineering, are replication-deficient and apathogenic with regard to their typical pathogenicity.
  • the present invention has for its object to provide a genetic treatment method for bone pathologies detailed below, which includes a special agent to enable mammalian cells to produce therapeutic proteins.
  • the transmission of the genetic information is made possible by special vectors.
  • the invention thus relates to the use of vectors such as adenoviruses and / or adeno-associated viruses and / or retroviruses and / or herpes simplex viruses and / or liposomes and / or piasmids as mammalian cell-stimulating agents for the production of therapeutic, drug-acting proteins on cellular Level, for the treatment of bone pathologies.
  • vectors such as adenoviruses and / or adeno-associated viruses and / or retroviruses and / or herpes simplex viruses and / or liposomes and / or piasmids
  • the adenoviruses are adenoviral vectors. These are of the currently more than 40 known human adenovirus types, such as Ad2 and Ad5, which, transformed into the vector, can be used according to the invention. These are modified to reduce your in vivo replication ability and pathogenicity by removing the essential E-1 sequence. Instead of the E1 sequence and the nonessential E3 sequence, the cDNA which codes for the therapeutic genes and marker genes is incorporated into adenoviral vectors. When the virus enters the cell, the cDNA is deposited episomally in the nucleus. The encoded substances are then produced and expressed via the common protein synthesis apparatus of the cells.
  • the adeno-associated viruses are an adeno-associated viral vectors.
  • examples of this are the adeno-associated virus of the wild type, which is described in the Journal of Virology February 1983, Vol. 45, pp. 555-564, in particular FIGS. 1 to 4 and the sections Materials and Methods and Results, to which express reference is made.
  • Recombinant retroviruses that are currently used as vectors in human gene therapy experiments all derive from the wild-type Moloney Murine Leukemia (MoMuLV) retrovirus.
  • the recombinant viruses are structurally identical to the wild type of the retrovirus, but carry a genetically modified genome that codes for the therapeutic genes or the marker genes.
  • Recombinant retroviruses can no longer replicate themselves in vivo, but are still infectious and integrate the genome into the DNA of the target cells. The pathogenic viral genes have been completely removed.
  • the vectors are herpes simplex virus vectors. These are neurotropic human viruses that also attack mature neurons and, as a wild-type virus, can cause latent-type infections.
  • the herpes simplex virus -1 is used as viral vectors in a replication-deficient, apathogenic form.
  • a particular advantage of the herpes simplex virus vector is the ability to integrate particularly large foreign cDNA fragments.
  • the liposomes are liposomal vectors which contain the genetic information for growth factors or cytokines, or their inhibitors, and which can be transferred to mammalian cells.
  • liposomal vectors reference is made to the publication by Gao and Huang in Biochem Biophys Res Commun 179: 280 to 285, 1991.
  • the piasmids are those which contain the genetic information for growth factors or cytokines, or their inhibitors, and which can be transferred to mammalian cells.
  • therapeutic proteins are generated at the cellular level, which are growth hormones, cytokines or cytokine inhibitors. Examples include: Transforming growth factor-ß (TGF-ß) e.g. TGF-ß 1-5, Bone morphogenetic proteins (BMP) e.g. BMP-2-7, or osteogenic protein-1 (OP-1) e.g.
  • IGF Insulin like growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • PDGF platelet derived growth factor
  • TNF tumor necrosis factor
  • interleukin-6 inhibitors macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) inhibitors, granulcyte / macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) inhibitors, interleukins such as interleukin-4, interleukin-10 and Interleukin-13.
  • M-CSF macrophage-colony stimulating factor
  • GM-CSF granulcyte / macrophage-colony stimulating factor
  • interleukins such as interleukin-4, interleukin-10 and Interleukin-13.
  • the mammalian cells are animal or human cells, in particular bone cells, bone marrow cells, connective tissue cells and / or muscle cells.
  • the vectors which lead to the production of the medicament by the transfected cells are applied parenterally.
  • the vectors which lead to the production of the medicament by the transfected cells are applied intraosseously.
  • the vectors which lead to the production of the medicament by the transfected cells are applied locally to the site of the bone pathology.
  • mammalian cells are removed from the body for further treatment, then transduced in vitro using the aforementioned vectors, cultured in a suitable medium and autologously reimplanted, after which these mammalian cells are located at the site of the bone pathology produce effective therapeutic proteins as medicinal products.
  • the bone pathologies are osteoporosis, local or systemic bone mass loss, bone substance loss or bone structure disorders, bone fractures with bone substance loss, defect fractures, or pseudathroses, bone defect states after operations, Sudek's disease, bone substance loss in endoprosthesis disorders, osteolyseal looseness, osteolyseal looseness, osteolyseal looseness, osteolyseal looseness rheumatic type, for example in rheumatoid arthritis and / or osteonecrosis.
  • the healing of transplants in particular ligamentous, bone or tendinous transplants, can also be used as bone pathology, e.g. in knee and shoulder surgery.
  • the genetic information (cDNA) of the therapeutically active proteins Bone Morphogenetic Proteins 2-7 (BMP 2-7), transforming growth factor-ß (TGF-ß), fibroplast growth factors ( FGFs), insulin-like growth factors (IGFs), platelet derived growth factors (PDGFs), and vascular endothelial growth factor (VEGF), or the cDNA of cytokines or cytokine inhibitors, e.g. Interleukin-I receptor antagonist protein (IL-1Ra) or tumor necrosis factor- ⁇ (TNF- ⁇ ) inhibitors.
  • BMP 2--7 Bone Morphogenetic Proteins 2-7
  • TGF-ß transforming growth factor-ß
  • FGFs fibroplast growth factors
  • IGFs insulin-like growth factors
  • PDGFs platelet derived growth factors
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • cytokines or cytokine inhibitors e.g. Interleukin-I receptor antagonist protein (IL-1Ra) or tumor necrosis factor
  • cytokine inhibitors e.g. B. Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1Ra) and sTNF ⁇ R (soluble tumor necrosis factor ⁇ receptor) and Interleukin-6 inhibitors or absorption-inhibiting cytokines such as Interleukin-10 used.
  • IL-1Ra Interleukin-1 receptor antagonist
  • sTNF ⁇ R soluble tumor necrosis factor ⁇ receptor
  • Interleukin-6 inhibitors or absorption-inhibiting cytokines such as Interleukin-10 used.
  • Example 1 shows a plot of the production of the therapeutic protein IL-1 Ra per 50,000 cells after 48 h [in pg] for osteoblastic cells transduced with MFG (samples 1-6, values of 9111.5 pg on average) compared to non-transduced osteoblastic cells ( Control 1a - 3a, values around 0 pg) and retroviral LacZ transduced osteoblastic cells (control 1b - 3b, values around 0 pg). The measurement was carried out by ELISA analysis.
  • Fig. 2 is a plot of the spontaneous production of alkaline phosphatase (ALP) by human osteoblastic cells (HOB) (9.5 units per 1,000,000 cells), as well as the positive controls with murine Osteogenensis imperfecta stem cells (OIM) after stimulation with BMP-2 (30 units per 1,000,000 cells).
  • HOB human osteoblastic cells
  • OFIM murine Osteogenensis imperfecta stem cells
  • the negative controls with immortalized synovial fibroblasts (HIG-82) do not produce alkaline phosphatase.
  • FIG. 3 shows a plot of the decrease in dry weight of the humeri, tibiae and fibulae in mg in white Balb / C mice by an ovariectomy (OVX) 12 days postoperatively, in comparison to simulated operated mice (sham).
  • OVX-IL-1Ra Ad-IL-1Ra
  • FIG. 4 shows a plot of the expression of the marker enzyme luciferase [units / g] in the white Balb / C mouse in the bone tissue, muscle tissue, lymph node tissue, and also easily and transiently in the liver, after intraosseous / intramuscular transduction of the femora with 10 9 pfu ad -Luc. Lungs and spleen are apparently not reached by the adenoviral vectors and show no enzyme expression. In bones and muscles, enzyme expression lasts for the whole Examination period of 21 days, expression in the liver can only be determined for a period of five days, in the draining inguinal nymph nodes for a period of 14 days. A small and time-limited transgene expression can thus be assumed outside the application area.
  • transgenic IRAP interleukin-1 receptor antagonist protein
  • ⁇ 10 9 pfu Ad-IL-IRa
  • positive systemic IRAP levels were found for the entire examination period of 12 days with maximum values of almost 100 pg / ml on the 3rd day.
  • intravenous administration of Ad-IL-1Ra leads to lower values of up to 32 pg / ml, with a maximum expression duration of 3 days.
  • Ad-LacZ A
  • FIG. 7 shows a 50-fold enlarged view of a paraffin section of the intrafemoral cavity of Balb / C mice after intraosseous transduction with 10 9 pfu adenoviral vectors which code for LacZ ( ⁇ -galactosidase). Morphologically, primarily resting osteoblasts (lining osteoblasts) but also bone marrow cells are transduced. These cells are marked with arrows. 8 shows a plot of the expression of the transgenic enzyme luciferase [units / ⁇ l] after injection of 10 10 pfu Ad-Luc into the femoral defect in the white New Zealand rabbit.
  • the distribution pattern of the enzyme activity shows that after local application of vectors in the bone defect, the expression of the transgenes apparently mainly takes place from local tissue structures. Bones, defect / scar tissue and muscles express the transgene with high expression values (up to 70,000 units / 100 ⁇ l in the muscle). There is no evidence of transgenic activity in the lungs, spleen and in contralateral, musculoskeletal tissue samples (not shown graphically). Only in the liver can transient, weak transgenic activity be demonstrated for 5 days. The gene expression was longest detectable in the bone for a total of 42 days, in the defect-filling tissue and in the muscles no gene expression was detectable after 15 or 26 days.
  • FIG. 9 shows a 50-fold magnification of a decalcified paraffin section from the area of the femoral defect on the white New Zealand rabbit.
  • adipocytes and possibly stem cells are also morphologically transduced. Here, too, these cells are marked by arrows.
  • FIG. 10 shows a 20-fold magnification of a decalcified paraffin section from the area of the defect edge in the femoral defect model on the white New Zealand rabbit. Histomorphologically, in addition to resting osteoblasts, which are indicated by arrows, connective tissue cells of the adjacent scar are also transduced.
  • FIG. 11 shows the healing process of the femoral defect in the white New Zealand rabbit as an example on the basis of three X-ray images, 5 weeks after intralesional transduction with 2 ⁇ 10 10 pfu adenoviral vectors which code for BMP-2. An almost complete filling of the defect chamber with mineralized bones can be clearly seen in all three cases.
  • FIG. 12 shows the healing process of the femoral defect in the white New Zealand rabbit as an example using three X-ray images, 5 weeks after intralesional transduction with 2 ⁇ 10 10 pfu adenoviral vectors which code for the non-therapeutic marker gene luciferase. Clear osseous substance defects can be seen in the defect chamber. The comparison with the course of healing after application of therapeutic vectors (FIG. 11) testifies to a good effectiveness of the transgenic BMP-2.
  • FIG. 13 shows a production of human IL-1 Ra osteoblast cells following an in vitro transduction with Ad-IRAP after a multiplicity of infection of 1000. The highest level of expression was found 3 weeks after the transduction. The gene expression was detectable in vitro for 72 days.
  • the remaining cancellous bone was cut up with pieces of approximately 1 mm 3 and subsequently put into culture. Fragments with remaining cortical components were treated overnight with 0.1% collagenase (Seromed, Berlin) in 25 cm 2 cell culture bottles (Nunc, Denmark). The collagenase solution was then removed and the cancellous fragments washed 3 times with PBS (Seromed, Berlin). The connective tissue cells released by the collagenase digestion were thereby removed quantitatively.
  • collagenase Seromed, Berlin
  • the bone fragments were then cultured in nutrient medium (RPMI Medium 1640 (CibcoBRL, Grand Island, NY, USA)) with 10% fetal calf serum (FBS) and 1% penicillin / streptomycin solution (CibcoBRL, Grand Island, NY, USA)).
  • RPMI Medium 1640 CibcoBRL, Grand Island, NY, USA
  • FBS fetal calf serum
  • penicillin / streptomycin solution CibcoBRL, Grand Island, NY, USA
  • trypsin trypsin, 0.25% (CibcoBRL, Grand Island, NY, USA)
  • the production cell lines for the retroviral particles are based on a derivative of the NIH3T3 cell line (CRIP).
  • CRIP NIH3T3 cell line
  • the cell line contains genetically integrated viral env and gag genes. These allow the production of retroviral viruses from the MFG-IRAP and BAG proviruses.
  • MFG-IRAP and CRIP-BAG are described in the publication by G. Bandara et al. Proc. Natl. Acad. Be. USA 90: 10764 to 10768 (1993) under the title Intraarticular expression of bioiogically active interleukin-1-receptor-antagonist protein by ex vivo gene transfer. Both cell lines produce amphotropic retroviral particles, so they have a broad host specificity.
  • MFG-IRAP carries the cDNA of the human interleukin-I receptor antagonist (hlL-1 Ra).
  • BAG carries the bacterial ß-galactosinase gene (LacZ) and a neomycin resistance gene (neoR), which enables selection of the transfected cell.
  • the viral long terminal repeat (LTR) serves as a promoter for the HLL-1 Ra cDNA and LacZ.
  • the CRIP cells are in (DMEM) medium (CibcoBRL, Grand Island, NY, USA), 10% FBS (CibcoBRL, Grand Island, NY, USA) and 1% HEPES (CibcoBRL, Grand Island, NY, USA) in Incubator cultivated at 37 ° C and 5% carbon dioxide fumigation.
  • MFG and BAG are both derived from the Moloney Murine Leukemia Virus (MoMuLV, as described by P. Wehling et al. In Spine 21: 931-935 (1996) and S. Wells et al. In Gene Therapy 2: 512-520 (1995)).
  • MoMuLV Moloney Murine Leukemia Virus
  • MFG has been used as a vector in several gene therapy trials, including a human Phase I trial in rheumatoid arthritis. Both retroviruses are no longer autonomously replication-competent, which means that an independent multiplication of the retrovirus in vivo is not possible.
  • the osteoblastic cells were removed from the cell culture bottles by means of trypsin digestion and placed in 12 well plates cell culture dishes with 30,000 cells per dish. After approximately 80% confluence was reached, the nutrient medium was removed and the cells were washed twice with 3 ml of physiological saline.
  • the transduction was carried out with 1 ml of viral supernatant at a virus concentration of 1 ⁇ 10 6 particles of retrovirus per ml of virus supernatant and with a cationic polymer, that is to say a copolymer of N, N, N ', N'-tetramethyl-1, 6-hexanediamine and 1, 3-dibromopropane modulated by the Abbott Corporation under the designation Polybrene ®, which is marketed, inter alia, from Aldrich as a promoter.
  • a cationic polymer that is to say a copolymer of N, N, N ', N'-tetramethyl-1, 6-hexanediamine and 1, 3-dibromopropane modulated by the Abbott Corporation under the designation Polybrene ®, which is marketed, inter alia, from Aldrich as a promoter.
  • the cells were fixed and LacZ expression was prepared using X-gal staining as follows.
  • the cells were first washed with 1 ml PBS solution (Seromed, Germany), then fixed with solution 1 (1 ml 0.5% gluturaldehyde in 49 ml PBS (Roth GmbH, Germany)) for 10 min at room temperature.
  • the cell culture dishes were then washed twice for 10 min each with solution 2 (1 ml of PBS solution in 1 mM magnesium chloride).
  • solution 2 was replaced by the substrate solution (solution 3) consisting of 1500 ⁇ l 5 mM K 3 Fe (CN) 6 and 5 mM K4Fe (CN) 6 , 30 ⁇ l 1 M MgCl 2 , 750 ⁇ l 1 mg / ml 5- Bromine-4.chlor-3-indolyl-ß-D-galactpyranoside (X-gal) and 27 ml PBS were exchanged and left in the cell culture dishes overnight. The next morning, solution 3 replaced by PBS and the typical blue staining of the cells quantified by light microscopy.
  • solution 3 replaced by PBS and the typical blue staining of the cells quantified by light microscopy.
  • IL-1Ra was determined by a commercial ELISA kit (Biosource, USA) according to the manufacturer's information.
  • the determination of the activity of the alkaline phosphatase (ALP) was carried out in the cell cultures in the first passage.
  • Immortalized synovial fibroblasts HOG-82 served as negative controls;
  • All cell cultures were subjected to a three-time freeze-thaw cycle at -80 ° C to destroy the cell membranes. The burst cells were then stored at a temperature of -80 ° C until further analysis.
  • the activity of the alkaline phosphatase was analyzed using a commercial analysis kit from Sigma Diagnostics (Dorset, United Kingdom) according to the manufacturer's instructions and determined photometrically at a wavelength of 405 nm after 1, 2 and 30 min on a UV-Max device from Molecular Devices, UNITED STATES.
  • the transduction of retro-LacZ was carried out simultaneously in three cell culture dishes. In all cell culture dishes, the blue staining of cells was achieved by the X-gal staining. The proportion of transduced cells in the total cell number was 60% according to light microscopic quantification. No selection of transduced cells was carried out.
  • a transduction of the cells with retro-IRAP was carried out in 6 cell culture dishes.
  • the supernatant from all 6 cells showed in the analysis by ELISA that the cell populations with the cDNA for hlL-1 Ra transduced and the transgene was expressed with an average of 9111.5 pg per 50,000 cells and 48 hours with a standard deviation of 522.4 pg.
  • Alkaline phosphatase is one of the first markers that is already synthesized by immature osteoblasts and during the osteoblastic maturation process.
  • the cell populations used in this experiment spontaneously expressed alkaline phosphatase with an average of 9.5 units per 1,000,000 units with a standard deviation of 0.7 units.
  • the immortalized synovial fibroblasts (HIG-82) serving as negative controls did not express ALP, in contrast to the BMP-2 stimulated immortalized OIM cells, which served as positive controls.
  • OIM and HIG-82 cells were chosen as control cell populations, since the potency of the OIM cells after stimulation with rhBMP-2 ALP is known. Because of their ability to synthesize ALP, the cells were classified as an osteoblastic cell population. The results of the ALP activity test are shown in FIG. 2.
  • adenoviral vectors to develop a therapy for estrogen deficiency-related osteoporosis in the model of the Balb / C mouse
  • Ad-LacZ adenoviral vectors which code for the marker gene LacZ
  • the vectors were applied intrafemorally, using a transcutaneous, intercondylar approach, which made it possible to apply 100 ⁇ l of a suspension with physiological saline and 10 9 pfu Ad-LacZ intraosseously. Controls were carried out with instillation of physiological saline without vectors.
  • the immunohistochemical staining method (LacZ staining is described several times in this application) enables the color of the successfully transduced cells to be shown by intensive blue staining of the cells expressing LacZ.
  • the intraosseous vector application commonly carried out in the experiments was compared with the parenteral vector application in order to investigate the duration and intensity of systemic transgene levels in both methods.
  • the intraosseous application of the vectors was carried out as described above, while the parenteral injection was carried out in the generously applied retroorbital sinus in mice.
  • the systemic IL-1Ra levels were determined in the serum of the mice after repeated blood withdrawals from the retroorbital sinus.
  • the blood samples were taken before the vector application and on days 1, 2, 3, 5, 9 and 12 after the vectors were injected.
  • the IL-1 Ra levels were analyzed using commercial ELISA kits according to the manufacturer's instructions.
  • adenovirally transferred, therapeutically effective IL-1Ra on ovariectomy-induced bone mass loss was examined.
  • four groups with at least 8 mice each were formed, an ovariectomy being carried out in two groups and the mice receiving either the therapeutic vector Ad-IL-1 Ra or the non-therapeutic marker gene vector Ad-LacZ.
  • the two remaining groups were treated in the same way, but instead of ovariectomy, only a simulated operation (sham) was performed.
  • the analysis was carried out by measuring the total dry weight of the non-manipulated humeri, tibiae and fibulae in order to be able to evaluate the systemic effect of the vector application. The dry weight was measured in mg after darticulation and complete fleshing of the bones and treatment of the bones in a 90% acetone-alcohol bath.
  • a number of different cell types are successfully transduced after the intraosseous application of adenoviral vectors (arrows).
  • adenoviral vectors arrows
  • the enzyme activity of the luciferase after intraosseous vector application of Ad-Luc is shown in FIG. 4. It demonstrates that transgene expression persists in the bones and muscles over the entire course of the examination interval of 21 days. Transgene expression from the liver (2 days) and draining lymph nodes (14 days) is transient and does not reach the level of enzyme activity in the area of the injection.
  • FIG. 1 The comparison of the intrafemoral vector application, which is preferably used in these test series, with an intravenous vector application is presented in FIG.
  • the figure shows that the intrafemoral application form is superior to the intravenous application form both in the intensity of the expression of transgenes and in the duration of the expression.
  • FIG. 3 demonstrates on the basis of the dry weights [mg] of the humeri, tibiae and fibulae that the ovariectomy-induced loss of bone mass, expressed here as the weight of mineralized bone, by genetic therapy with adenoviral vectors which code for IL-1 Ra by about 50 % can be reduced.
  • Recombinant first generation adenoviruses (E1 ⁇ E3 ') were used deliberately for the transduction of the cells, one of which carried the LacZ gene (Ad-LacZ) and the other the luciferase gene (Ad-Luc).
  • gene expression was stimulated by a human early promoter.
  • the contralateral femoral defects received either 0.5 ml of a physiological saline solution or 0.5 ml of collagen gel without virus particles.
  • 293 cells were propagated to produce the vectors Ad-LacZ and Ad-Luc. This method is described by Graham et al. in J. Gen Virol 36: 59-72 (1977).
  • the 293 cells are each transfected with adenoviruses for 2 hours with a multiplicity of infection (moi) of 10.
  • the cells are harvested after being scraped 36 to 48 hours after infection and resuspended in 5 ml of 50 mM Tris-Cl (pH 7.5) and 200 mM sodium chloride. After 5 freeze-thaw cycles, the viruses were purified using 2 cesium chloride step gradients (4 ° C., 30,000 rpm, 1 hour).
  • Ad-LacZ was dialyzed against 10% glycerol dialysis buffer (100mM sodium chloride, 10mM Tris-Cl, pH 7.5; 1mM magnesium chloride, 10% v / v glycerin) as described by Mittereder et al. in J. Virol 70: 7498-7509 (1996) and Ad-Luc was dialyzed against 3% sucrose dialysis buffer (150 mM sodium chloride, 10 mM Tris-Cl, pH 7.5; 10 mM magnesium chloride, 3% v / v sucrose). Each of the vectors was titrated by its optical density at 260 nm, and both viruses were stored until use at a concentration of 7 x 10 12 particles per ml at -80 ° C.
  • Group 1 The femoral defect was created in 4 rabbits treated with 0.5% physiological saline containing 1 x 10 10 particles of Ad-LacZ. Two rabbits were killed after two days, two more rabbits were killed 12 days after the operation. Group 2: Four rabbits were treated with a 0.5 ml mixture of collagen gel (Vitrogen) with 1 x 10 10 particles of Ad-LacZ. The rabbits were killed on the schedule of Group 1.
  • tissues were removed from the spleen, liver and lungs, as were bones, bone marrow and muscle from the contralateral untreated segmental defects. All tissue parts were fixed in 10% formaldehyde solution for 24 hours, then decalcified in 20% EDTA, within 2 to 3 weeks with a weekly exchange of the EDTA. After embedding the demineralized tissue in paraffin, blocks were cut and the tissue sections were stained with X-gal and eosin. The transduced cells were assessed histomorphologically by an independent pathologist.
  • Group 3 Eight rabbits from Group 3 were treated with 0.5 ml of a mixture of physiological saline with 1 x 10 10 particles from Ad-Luc. The rabbits were put to sleep 2, 5, 10 and 14 days after the operation. Tissue samples were taken from the trabecular and cortical bone that surrounded the defect chamber, from the connective tissue that filled the defect chamber, and from the muscle that surrounded the femoral defect. In order to check a systemic distribution of the vectors, samples from the lungs, liver and spleen were analyzed as well as musculoskeletal samples from the non-transduced contralateral defect.
  • luciferase activity was found in the bone and bone marrow, as well as in the defect-filling connective tissue and in the surrounding muscle tissue at the injection site. 5 days after the transduction there was a slight luciferase activity in the liver which disappeared completely after 10 days. No luciferase activity could be found in the contralateral femur, the lungs and the spleen (Fig. 8).
  • Ad-BMP-2 had a stimulating effect on ossification in the femoral defect
  • Ad-TGF-b presumably more promotes non-specific mineralization of the tissue without leading to a final maturation of the bone.
  • a combination of both vectors could possibly lead to a further acceleration of bone fracture healing in defect situations.
  • the biomechanical analysis was carried out using the three-point bending method to determine the bending stiffness and the maximum bending force of the femora.
  • the femora was stored frozen up to 24 hours before the tests and then slowly thawed in the refrigerator.
  • Each femur was placed in the three-point bending system, which ensured a free bending distance of 4.5 cm.
  • the load was taken in the posterior-anterior direction, with the load being transmitted at the center of the free bending path, which in each case represents approximately the center of the diaphyses.
  • the tests were performed with the Instron 8500 servo-hydralic testing system (Instron Corp., Canton, MA), an Instron 2500 Ibf load cell was used. The deformation of the femora was measured using the internal LVDT system. The data was collected using Instron's MAX software and analyzed using the MS-Excel software program.
  • a maximum deflection of 1 cm was used, with a bed rate of 0.5 cm / min. or 0.0833 mm / sec. The test was completed in the event of a fracture of the femora.
  • Ad-BMP-2 control Ad-BMP-2 control
  • the biomechanical analysis according to the three-point bending method suggests that the use of the adenoviral vectors which code for BMP-2 and thus at the cellular level leads to the production of the active pharmaceutical ingredient Proteins cause an acceleration of bone defect healing can be achieved.
  • the femoral defect model on the white New Zealand rabbit was used. 16 weeks after the operation of the animals and after injection 10 7 pfu adenoviral vectors, the cDNA of which codes for the potentially therapeutic TGF-beta (Ad-TGF-beta), the four animals were sacrificed and prepared. Four white New Zealand rabbits, which received only 10 7 pfu of a marker gene (Ad-Luc), served as a control group.
  • the image analysis was carried out as follows on the digitized histological section.
  • the images were sharpened with a double band filter to define the blue-colored, bony areas (trichrome staining). Bony areas were defined using the color cube technique (3 x 3 pixels) after standardization against the normal cortical bone outside the defect had been carried out.
  • the previous defect boundaries were digitally marked and the former area of interest (AOI) was analyzed for the intensity of the blue color. Four different measurements were made:
  • IOD integrated optical density
  • the total mass of mineralization in the defect area was more than twice that in the verum group treated with Ad-TGF-beta Control group (19.5 +/- 10.7 mm 2 versus 9.04 +/- 4.3 mm 2 ), but not significantly different. The differences were even clearer taking into account the area and the light intensity (IOP) (1754.0 +/- 906.0 mm 2 versus 557.7 +/- 138.0 mm 2 ). Here, too, the difference in the t-test was not significant for unconnected samples, which can be explained by the large scatter with small numbers of cases.
  • TGF-beta produced and expressed at the cellular level, has a positive influence on mineralization and ossification after defect fractures.
  • the technique of gene transfer with subsequent expression of the growth factor which, as described in the preliminary experiments, is a predominantly local method, the known side effects of a systemic TGF-beta application could possibly be avoided.

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Abstract

Offenbart wird die Verwendung von Vektoren wie Adenoviren und/oder Adeno-assoziierten Viren und/oder Retroviren und/oder Herpes-Simplex-Viren und/oder Liposomen und/oder Plasmiden als säugerzellenstimulierendes Mittel zur Herstellung von therapeutischen, als Arzneimittel wirkenden Proteinen auf zellulärem Niveau zur genetischen Behandlung von Knochenpathologien.

Description

Verwendung von Vektoren wie Adenoviren und/oder Adeno-assoziierten Viren und/oder Retroviren und/oder Herpes Simplex Viren und/oder Liposomen und/oder Piasmiden als Vehikel für genetische Information zur Befähigung von Säugetierzellen Mittel zur Behandlung von Knochenpathoiogien zu produzieren.
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Adenoviren und/oder Adeno-assoziierten Viren und/oder Retroviren und/oder Herpes Simplex Viren und/oder Liposomen und/oder Piasmiden als Vektoren, respective Vehikel für genetische Information, um Säugetierzellen auf genetischem Wege zu befähigen therapeutische, als Arzneimittel wirksame Proteine zur Korrektur von Knochenpathologien, auf zellulärer Ebene, herzustellen.
Bei Adenoviren handelt es sich um einfache, aus Doppelstrang DNA und Proteinen aufgebaute DNA-Viren, von den einige humanpatogen sind, Infektionen des Auges und des Respirationstraktes verursachen. Viele Arten induzieren Tumore in Versuchstieren, die nicht dem natürlichen Wirt entsprechen oder können Zellen in vitro transformieren. Adenovirale Vektoren sind veränderte Adenoviren, die die Fähigkeit zur Replikation in vivo und ihre typische Pathogenität eingebüßt haben.
Auch das Adeno-assoziierte Virus ist als solches bekannt und wird beispielsweise zur Markierung von Zellen eingesetzt, wie in der WO 95/14232 näher beschrieben.
Unter Retroviren im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man RNA Viren der Klasse 6, die einsträngige Ribonukleinsäure (RNA) und das Enzym reverse Transkriptase enthalten. Mit Hilfe dieses Enzyms wird die in die Wirtszelle gelangene RNA in DNA übersetzt, um mitsamt zusätzlicher repetitiver Sequenzen anschließend in das Wirtsgenom integriert und als sogenanntes Provirus mit ihm repliziert zu werden. Retroviren, die als Vektoren in der Gentechnologie eingesetzt werden, sind replikationsdefizient und apathogen bezüglich ihrer typischen Pathogenität.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein genetisches Behandlungsverfahren für im einzelnen weiter unten aufgeführte Knochenpathologien bereitzustellen, welches ein spezielles Mittel beinhaltet, um Säugetierzellen zur Herstellung von therapeutischen Proteinen zu befähigen. Die Übertragung der genetischen Information wird durch spezielle Vektoren ermöglicht.
Die Erfindung betrifft somit die Verwendung von Vektoren wie Adenoviren und/oder Adeno-assoziierten Viren und/oder Retroviren und/oder Herpes-Simplex Viren und/oder Liposomen und/oder Piasmiden als säugerzellenstimulierendes Mittel zur Herstellung von therapeutischen, als Arzneimittel wirkenden Proteinen auf zellulärem Niveau, zur Behandlung von Knochenpathologien.
Nach einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den Adenoviren um adenovirale Vektoren. Dies sind von den derzeit über 40 bekannten humanen Adenovirentypen, wie beispielsweise Ad2 und Ad5, die, zum Vektor transformiert, erfindungsgemäß eingesetzt werden können. Diese werden dahingehend verändert, daß sie Ihre Fähigkeit zur Replikation in vivo und ihre Pathogenität dadurch einbüßen, daß die essentielle E-1 -Sequenz entfernt worden ist. Anstelle der E1 -Sequenz und der nicht essentiellen E3-Sequenz wird bei adenoviralen Vektoren die cDNA eingebaut, die für die therapeutischen Gene und Markergene kodiert. Die cDNA wird bei Eindringen des Virus in die Zelle im Nucleus episomal abgelagert. Über den gängigen Protein-Synthese-Apparat der Zellen werden dann die kodierten Substanzen produziert und exprimiert.
Nach einer anderen besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den Adeno-assoziierten Viren um ein Adeno-assozierte virale Vektoren. Beispiele hierfür sind das adenoassoziierte Virus vom Wildtyp, welches im Journal of Virology Februar 1983, Vol. 45, S. 555-564, insbesondere Fig. 1 bis 4 und den Abschnitten Materials and Methods und Results, worauf ausdrücklich Bezug genommen wird, beschrieben ist.
Rekombinante Retroviren, die zur Zeit als Vektoren in humanen Gentherapie- Versuchen benutzt werden stammen sämtlich vom Wild-Typ des Moloney Murinen Leukämie (MoMuLV) Retrovirus ab. Die rekombinanten Viren sind strukturell mit dem Wild-Typ des Retrovirus identisch, tragen aber ein genetisch verändertes Genom, das für die therapeutischen Gene, bzw. die Markergene kodiert. Rekombinante Retroviren können sich in vivo nicht mehr selbst replizieren, sind jedoch noch infektiös und integrieren das Genom in die DNA der Zielzellen. Die pathogenen viralen Gene sind komplett entfernt.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Vektoren um Herpes-Simplex Virus Vektoren. Dies sind neurotrope humane Viren, die auch reife Neuronen befallen, und als Wildtyp-Virus eine Infektion vom latenten Typ verursachen können. Als virale Vektoren werden beispielsweise das Herpes Simplex Virus -1 in einer replikationsdefizienten, apathogen Form genutzt. Ein besonderer Vorteil des Herpes Simplex Virus Vektors ist es, auch besonders große fremde cDNA-Fragmente zu integrieren.
Nach einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den Liposomen um liposomale Vektoren, die die genetische Information für Wachstumsfaktoren oder Zytokine, bzw. deren Inhibitoren enthalten und auf Säugetierzellen übertragen können. Es wird bezüglich der liposomalen Vektoren auf die Veröffentlichung von Gao und Huang in Biochem Biophys Res Commun 179:280 bis 285, 1991 verwiesen.
Nach einer anderen besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den Piasmiden um solche, die die genetische Information für Wachstumsfaktoren oder Zytokine, bzw. deren Inhibitoren enthalten und auf Säugetierzellen übertragen können. Es wird bezüglich als Vektoren benutzten Plasmide auf die Veröffentlichung von Smith, Shepherd, et al. in Gene Therapy 3:190 bis 200, 1996 verwiesen. Bei dem erfindungsgemäß beschriebenen Verfahren werden auf zellulärem Niveau therapeutische Proteine erzeugt, bei denen es sich um Wachstumshormone, Zytokine oder Zytokininhibitoren handelt. Hier sind beispielhaft genannt: Transforming growth factor-ß (TGF-ß) z.B. TGF-ß 1-5, Bone morphogenetic proteins (BMP) z.B. BMP-2-7, respektive osteogenic protein-1 (OP-1) z.B. OP- 1 , Insulin like growth factor (IGF) z.B. IGF-1 und -2, fibroblast growth factor (FGF) z.B. FGF-1 und -2, Platelet derived growth factor (PDGF), Tumor-Nekrosis-Faktor (TNF) zum Beispiel TNF-ß oder TNF-α, lnterleukin-6-inhibitoren, Macrophage-colony stimulating factor (M-CSF)-Inhibitoren, Granulcyte/Macrophage-colony stimulating factor (GM- CSF)-lnhibitoren, Interleukine wie lnterleukin-4, lnterleukin-10 und lnterleukin-13.
Nach einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den Säugetierzellen um tierische oder menschliche Zellen, insbesondere Knochenzellen, Knochenmarkszellen, Bindegewebszellen und/oder Muskelzellen.
Nach einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Vektoren, die zur Produktion der Arzneimittel durch die transfizierten Zellen führen, parenterai appliziert.
Nach einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Vektoren, die zur Produktion der Arzneimittel durch die transfizierten Zellen führen, intraossär appliziert.
Nach einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Vektoren, die zur Produktion der Arzneimittel durch die transfizierten Zellen führen, lokal an den Ort der Knochenpathologie appliziert.
Nach einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, im nachfolgenden ex vivo Verfahren genannt, werden zur weiteren Behandlung Säugetierzellen dem Körper entnommen, dann in vitro mittels der vorgenannten Vektoren transduziert, in einem geeigneten Medium kultiviert und autolog reimplantiert, wonach am Ort der Knochenpathologie diese Säugetierzellen die als Arzneimittel wirksamen, therapeutischen Proteine produzieren. Nach einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den Knochenpathologien um Osteoporose, lokalen oder systemischen Knochenmasseverlust, Knochensubstanzverlust oder Knochenstrukturstörungen, Knochenbrüche mit Knochensubstanzverlust, Defektfrakturen, oder Pseudathrosen, Knochendefektzustände nach Operationen, Morbus Sudek, Knochensubstanzverlust bei Endoprothesenlockerungen, periartikuläre Osteolysen bei Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises z.B. bei der rheumatoiden Arthritis und/oder Osteonekrosen.
Nach einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann als Knochenpathologie auch das Einheilen von Transplantaten, insbesondere ligamentärer, knöchenen oder tendinösen Transplantaten eingesetzt, z.B. in der Knie- und Schulterchirurgie, beschleunigt werden.
Nach einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird zur Verbesserung des Knochenaufbaus die genetische Information (cDNA) der therapeutisch wirksamen Proteine Bone Morphogenetic Proteins 2 - 7 (BMP 2 - 7), Transforming growth factor-ß (TGF-ß), Fibroplast growth factors (FGFs), Insulin-like growth factors (IGFs), Platelet derived growth factors (PDGFs), sowie Vascular Endothelial growth factor (VEGF) verwandt, oder die cDNA von Zytokinen oder Zytokininhibitoren, z.B. Interleukin-I Rezeptor Antagonist Protein (IL-1Ra) oder Tumor Nekrosis Faktor-α (TNF-α)-lnhibitoren.
Nach einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird zur Reduktion des Knochenabbaus die genetische Information (cDNA) zur Bildung von Zytokininhibitoren, z. B. lnterleukin-1 Rezeptor Antagonist (IL-1Ra) und sTNFαR (löslichem Tumor Nekrose Faktor α Rezeptor) und lnterleukin-6-lnhibitoren oder resorptionshemmende Zytokine wie lnterleukin-10, eingesetzt.
Die vorliegende Erfindung wird nun durch Figuren näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 eine Auftragung der Produktion des therapeutischen Proteins IL-1 Ra pro 50.000 Zellen nach 48 h [in pg] für mit MFG transduzierten osteoblastäre Zellen (Proben 1 - 6, Werte von durchschnittlich 9111 ,5 pg) gegenüber nicht transduzierten osteoblastären Zellen (Kontrolle 1a - 3a, Werte um 0 pg) und retroviralen LacZ transduzierten osteoblastären Zellen (Kontrolle 1b - 3b, Werte um 0 pg). Die Messung erfolgte durch ELISA Analyse.
Fig. 2 eine Auftragung der spontanen Produktion von Alkalischer Phosphatase (ALP) durch humane osteoblastäre Zellen (HOB) (9,5 Units pro 1.000.000 Zellen), ebenso wie die positiven Kontrollen, die mit murinen Osteogenensis imperfecta Stammzellen (OIM) nach Stimulation mit BMP-2 (30 Units pro 1.000.000 Zellen) durchgeführt wurden. Die Negativ-Kontrollen mit immortalisierten synovialen Fibroblasten (HIG-82) produzieren keine Alkalische Phosphatase. Auch im azellulären Nährmedium (keine Zellen = no cells) ist keine ALP vorhanden.
Fig. 3 eine Auftragung der Abnahme des Trockengewichtes der Humeri, Tibiae und Fibulae in mg bei weißen Balb/C Mäusen durch eine Ovarektomie (OVX) 12 Tage postoperativ, im Vergleich zu simuliert operierten Mäusen (sham). Durch intraossäre Applikation von 109 pfu Ad-IL-1Ra (OVX-IL-1Ra) ließ sich der Knochenmasseverlust im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe (OVX-LacZ) um etwa 50% reduzieren.
Fig. 4 eine Auftragung der Expression des Markerenzyms Luciferase [Units/g] in der weißen Balb/C Maus im Knochengewebe, Muskelgewebe, Lymphknotengewebe, sowie leicht und transient auch in der Leber, nach intraossär/intramuskulärer Transduktion der Femora mit 109 pfu Ad-Luc. Lunge und Milz werden von den adenoviralen Vektoren offenbar nicht erreicht und zeigen keine Enzym-Expression. In Knochen und Muskulatur dauert die Enzymexpression für den gesamten Untersuchungszeitraum von 21 Tagen an, in der Leber ist eine Expression nur für die Dauer von fünf Tagen feststellbar, in den drainierenden Leisteniymphknoten für die Dauer von 14 Tagen. Es kann somit außerhalb des Applikationsbereiches eine geringe und zeitlich stark limitierte Transgen-Expression angenommen werden.
Fig. 5 den systemischen Nachweis von transgenem IRAP (lnterleukin-1 Rezeptor Antagonist Protein) über einen Verlauf von 12 Tagen in weißen Balb/C Mäusen, um die Güte verschiedener Applikationsformen von Ad-IL-1Ra, bei systemischen Knochenerkrankungen zu testen. Nach intrafemoraler Applikation (♦) von 109 pfu Ad- IL-IRa finden sich positive systemische IRAP-Spiegel für die gesamte Untersuchungsdauer von 12 Tagen mit maximalen Werten am 3. Tag von nahezu 100 pg/ml. Im Gegensatz dazu werden durch intravenöse Gabe von Ad-IL-1Ra (•) geringere Werte bis zu 32 pg/ml, bei einer maximalen Expressionsdauer von 3 Tagen erreicht. In der Negativ-Kontrolle, die mit 109 pfu des nicht therapeutischen Markergens Ad-LacZ (A) durchgeführt wurde konnte systemisch kein Nachweis für transgene IL-1Ra Spiegel geführt werden.
Fig. 6 die im Urin ausgeschiedene Menge an Desoxypyridinoline-Crosslinks [nM], nach Ovarektomie (OVX) bzw. simulierter Ovarektomie (sham) bei weißen Balb/C Mäusen. Es wird deutlich, daß nach Ovarektomie mehr Desoxypyridinoline- Crosslinks im Urin ausgeschieden werden, die als direkter osteoklastärer Aktivitätsparameter gelten.
Fig. 7 eine 50-fach vergrößerte Ansicht eines Paraffinschnittes der intrafemoralen Cavität von Balb/C Mäusen nach intraossärer Transduktion mit 109 pfu adenoviraler Vektoren, die für LacZ (ß-Galaktosidase) kodieren. Morphologisch sind vor vor allem ruhende Osteoblasten (lining osteoblasts) aber auch Knochenmarkzellen transduziert. Diese Zellen sind mittels Pfeilen markiert. Fig. 8 eine Auftragung der Expression des transgenen Enzyms Luciferase [Units/μl] nach Injektion von 1010 pfu Ad-Luc in den femoralen Defekt beim weißen Neuseeland Hasen. Das Verteilungsmuster der Enzymaktivität verdeutlicht, daß nach lokaler Vektoren-Applikation in den Knochendefekt die Expression der Transgene offenbar hauptsächlich aus lokalen Gewebestrukturen erfolgt. Knochen, Defekt- /Narbengewebe und Muskulatur exprimieren das Transgen mit hohen Expressionswerten (bis zu 70.000 Units/100 μl im Muskel). Kein Nachweis einer Transgenaktivität findet sich in der Lunge, der Milz und in contralateralen, muskuloskelettären Gewebeproben (nicht graphisch dargestellt). Lediglich in der Leber läßt sich eine transiente, schwache Transgenaktivität für 5 Tage nachweisen. Die Genexpression war im Knochen für insgesamt 42 Tage am längsten nachweisbar, im Defekt-füllenden Gewebe und in der Muskulatur war nach 15, bzw, 26 Tagen keine Genexpression mehr nachweisbar.
Fig. 9 eine 50-fache Vergrößerung eines entkalkten Paraffinschnittes aus dem Bereich des femoralen Defektes am weißen Neuseeland-Hasen. Morphologisch sind neben Bindegewebszellen auch Adipozyten und möglicherweise Stammzellen transduziert. Auch hier sind diese Zellen durch Pfeile markiert.
Fig.10 eine 20-fache Vergrößerung eines entkalkten Paraffinschnittes aus dem Bereich des Defektrandes beim femoralen Defektmodell am weißen Neuseeland- Hasen. Histomorphologisch sind neben ruhenden Osteoblasten, die durch Pfeile angedeutet sind, auch Bindegewebszellen der angrenzenden Narbe transduziert.
Fig. 11 exemplarisch anhand von drei Röntgenaufnahmen den Heilungsverlauf des femoralen Defektes beim weißen Neuseelandhasen, 5 Wochen nach intraläsionaler Transduktion mit 2 x 1010 pfu adenoviraler Vektoren, welche für BMP-2 kodieren. Deutlich ist in allen drei Fällen ein nahezu vollständige Füllung der Defektkammer mit mineralisierten Knochen zu erkennen. Fig. 12 exemplarisch anhand von drei Röntgenaufnahmen den Heilungsverlauf des femoralen Defektes beim weißen Neuseelandhasen, 5 Wochen nach intraläsionaler Transduktion mit 2 x 1010 pfu adenoviraler Vektoren, welche für das nicht therapeutische Markergen Luciferase kodieren. Es sind deutliche ossäre Substanzdefekte in der Defektkammer zu sehen. Der Vergleich mit dem Heilungsverlauf nach Applikation therapeutischer Vektoren (Fig. 11) zeugt von einer guten Wirksamkeit des transgenen BMP-2.
Fig. 13 eine Produktion von humanen IL-1 Ra Osteoblastzellen im Anschluß an eine in vitro Transduktion mit Ad-IRAP nach einer multiplicity of infection von 1000. Der höchste Grad an Expression wurde 3 Wochen nach der Transduktion gefunden. Die Genexpression war in vitro für 72 Tage nachweisbar.
Die vorliegende Erfindung wird nun weiterhin durch Ausführungsbeispiele näher erläutert, wobei Prozentangaben jeweils sich auf Gewichtsprozentangaben beziehen.
Anwendunqsbeispiel 1 :
In vitro Evaluation einer Osteoporose Therapie mit retroviraien Vektoren anhand humaner osteoblastärer Zellpopulationen.
Material und Methodik
Als Grundlage der Zellxkulturen diente humaner spongiöser Knochen, der von informierten Patienten mit therapeutischer radialer oder ulnarer Resektionsosteotomie gewonnen wurde. Zellen mit arth rotischen, oft mit nekrotischen Veränderungen versehenen Hüftköpfen waren nur schwer zu kultivieren und hatten lediglich eine kurze Überlebenszeit in vitro.
Isolierung der Zellen
Nach Entfernung der cortikalen Anteile wurde der verbleibende spongiöse Knochen mit Stücken von etwa 1mm3 zerteilt und nachfolgend in Kultur genommen. Fragmente mit verbliebenen cortikalen Anteilen wurden über Nacht mit 0,1% Collagenase (Seromed, Berlin) in 25 cm2 Zellkulturflaschen (Nunc, Dänemark) behandelt. Anschließend wurde die Collagenaselösung entfernt und die Spongiosafragmente 3 mal mit PBS (Seromed, Berlin) gewaschen. Die durch den Collagenaseverdau freigesetzten Bindegewebszellen wurden dadurch quantitativ entfernt. Die Knochenfragmente wurde anschließend in Nährmedium (RPMI Medium 1640 (CibcoBRL, Grand Island, NY, USA)) mit 10 % fetalem Kälber Serum (FBS) und 1 %iger Penicillin/Streptomycinlösung (CibcoBRL, Grand Island, NY, USA)) kultiviert. Die Kultivierung der Zellen erfolgte im Inkubator bei 37 °C unter 5 %iger Kohlendioxidbegasung. Nach etwa 16 bis 20 Tagen begannen die Zellen die Oberfläche der Spongiosa sowie den Boden der Kulturflaschen zu besiedeln. Die Zellen erreichten nach weiteren 3 Wochen Konfiuenz und wurden nach Trypsinierung mit 2 ml Trypsin (Trypsin, 0,25 % (CibcoBRL, Grand Island, NY, USA)) mit den entsprechenden Analysen auf Zellkulturflaschen und Zellkulturschalen aufgeteilt.
Produktion der Virus-Partikel
Die Produktions-Zellinien für die retroviralen Partikel basieren auf einem Derivat der NIH3T3 Zellinie (CRIP). Die Zellinie enthält gentechnisch integrierte virale env und gag Gene. Diese erlauben die Produktion von retroviralen Viren aus den Proviren MFG-IRAP und BAG. MFG-IRAP und CRIP-BAG sind in der Publikation von G. Bandara et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:10764 bis 10768 (1993) unter dem Titel Intraarticular expression of bioiogically active interleukin-1-receptor-antagonist protein by ex vivo gene transfer beschrieben. Beide Zellinien produzieren amphotropische retrovirale Partikel, weisen also ein breite Wirtsspezifität auf. MFG- IRAP trägt die cDNA des humanen Interleukin-I Rezeptor Antagonist (hlL-1 Ra).
BAG trägt das bakterielle ß-Galaktosinase Gen (LacZ) und ein Neomycin Resistenz Gen {neoR), welches eine Selektion der transfizierten Zelle ermöglicht. Als Promotor für die hlL-1 Ra-cDNA und LacZ dient der virale long terminal repeat (LTR). Die CRIP-Zellen werden in (DMEM)-Medium (CibcoBRL, Grand Island, NY, USA), 10 % FBS (CibcoBRL, Grand Island, NY, USA) und 1 % HEPES (CibcoBRL, Grand Island, NY, USA) im Inkubator bei 37 °C und 5 % Kohlendioxidbegasung kultiviert.
Der Virus enthaltende Überstand wurde täglich aus konfluenten Kulturen gesammelt. Nach Filtration durch einen 0,45 μm feinen Spritzenfilter (Sartorius AG, Deutschland) wurde die Vektorensuspension bei -80 °C bis zur Benutzung aufbewahrt. MFG und BAG stammen beide vom Moloney Murinen Leukämie Virus (MoMuLV, wie von P. Wehling et al. in Spine 21 : 931-935 (1996) sowie S. Wells et al. in Gene Therapy 2: 512-520 (1995) beschrieben). MFG wurde als Vektor bereits in verschiedenen gentherapeutischen Versuchen eingesetzt, einschließlich einem humanen Phase-I Versuch bei der Rheumatoiden Arthritis. Beide Retroviren sind nicht mehr autonom replikationskompetent, das heißt, daß eine selbständige Vermehrung des Retrovirus in vivo nicht möglich ist.
Transduktion
Die osteoblastären Zellen wurden mittels Trypsin-Verdau aus den Zellkulturflaschen gelöst und in 12 well plates Zellkulturschalen mit 30.000 Zellen pro Schale ausgebracht. Nach Erreichen von etwa 80 % Konfluenz wurde das Nährmedium entfernt und die Zellen zweimal mit 3 ml physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die Transduktion wurde mit 1 ml viralem Überstand bei einer Viruskonzentration von 1 x 106 Partikeln Retrovirus pro ml Virusüberstand durchgeführt und mit einem kationischen Polymer, das heißt einem Copolymeren aus N,N,N',N'-Tetramethyl-1 ,6- hexandiamin und 1 ,3-Dibrompropan von der Abbott-Corporation unter der Bezeichnung Polybrene®, welches unter anderem von Aldrich vertrieben wird als Promotor moduliert. Während der ersten Stunde der Transduktion wurden die Zellkulturschalen bei Raumtemperatur langsam zentrifugiert und bei etwa 500 RPM und dann über Nacht unter Zellkulturbedingungen inkubiert. Nach 48 Stunden wurde das Nährmedium ausgetauscht. Der Überstand der MFG-IRAP transduzierten Zellen wurde gesammelt und für spätere IL-1Ra-Quantifizierung bei -80 °C eingefroren.
Nachweis der LacZ-Transfektion
48 Stunden nach Transduktion wurden die Zellen fixiert und die LacZ-Expression mittels X-gal Färbung wie folgt präpariert. Die Zellen wurden zunächst mit 1 ml PBS- Lösung (Seromed, Deutschland) gewaschen, anschließend mit Lösung 1 (1 ml 0,5 %ige Gluturaldehyd in 49 ml PBS (Roth GmbH, Deutschland)) über 10 min bei Raumtemperatur fixiert. Nachfolgend wurden die Zellkulturschalen zweimal für je 10 min mit Lösung 2 (1 ml PBS-Lösung in 1mM Magnesiumchlorid) gewaschen. Danach wurde Lösung 2 durch die Substrat-Lösung (Lösung 3) bestehend aus 1500 μl 5 mM K3Fe(CN)6 und 5 mM K4Fe(CN)6, 30 μl 1 M MgCI2, 750 μl 1 mg/ml 5- Brom-4.chlor-3-indolyl-ß-D-galactpyranosid (X-gal) und 27 ml PBS ausgetauscht und über Nacht in den Zellkulturschalen belassen. Am nächsten Morgen wurde Lösung 3 durch PBS ersetzt und die typischen Blaufärbungen der Zellen lichtmikroskopisch quantifiziert.
Quantifizierung der IL-1Ra Expression
IL-1Ra wurde durch einen kommerziellen ELISA-Kit (Biosource, USA) gemäß Herstellerinformationen bestimmt.
Bestimmung der Alkalischen Phosphatase
Die Bestimmung der Aktivität der Alkalischen Phosphatase (ALP) wurde bei den Zellkulturen in der ersten Passage durchgeführt. Immortalisierte synoviale Fibroblasten (HIG-82) dienten als negative Kontrollen; immortalisierte Knochmarksstammzellen von Osteogenesis inperfecta Mäusen (OIM), welche zuvor mit rekombinanten BMP-2 stimuliert wurden, dienten als positive Kontrollen. Alle Zellkulturen wurden einem dreimaligem Gefrier-Tau-Zyklus bei -80 °C unterworfen, um die Zellmembranen zu zerstören. Die geplatzten Zellen wurden dann bis zur weiteren Analyse bei einer Temperatur von -80 °C gelagert. Die Aktivität der Alkalischen Phosphatase wurde mit einem kommerziellen Analyse Kit der Sigma Diagnostics (Dorset, United Kingdom) nach Herstellerangaben analysiert und photometrisch bei einer Wellenlänge von 405 nm nach 1 , 2 und 30 min bestimmt an einem UV-Max Gerät der Firma Molecular Devices, USA.
Ergebnisse
X-gal Färbung
Die Transduktion von retro-LacZ wurde simultan in drei Zellkulturschalen durchgeführt. In allen Zellkulturschalen wurde durch die X-gal Färbung eine Blaufärbung von Zellen erreicht. Der Anteil transduzierter Zellen an der Gesamtzellzahl betrug gemäß lichtmikroskopischer Quantifizierung 60 %. Es wurde keine Selektion transduzierter Zellen durchgeführt.
Gen-Expression
In 6 Zellkulturschalen wurde eine Transduktion der Zellen mit retro-IRAP durchgeführt. Der Überstand aus allen 6 Zellen ergab in der Analyse mittel ELISA, daß die Zellpopulationen mit der cDNA für hlL-1 Ra transduziert und das Transgen mit durchschnittlich 9111 ,5 pg pro 50.000 Zellen und 48 Stunden bei einer Standardabweichung von 522,4 pg exprimiert wurde. Die ELISA-Analyse des Überstandes der drei Kulturschalen mit nicht transduzierten Zellkulturen, soweit die Analyse des Überstandes der mit retroviralem LacZ transduzierten Zellen, ergaben negative Werte, wie Fig. 1 zeigt.
ASSAY für Alkalische Phosphatase
Alkalische Phosphatase (ALP) ist einer der ersten Marker, der bereits durch unreife Osteoblasten und während des osteoblastären Reifungsprozesses synthetisiert wird. Die in diesem Versuch benutzten Zellpopulationen exprimierten spontan alkalische Phosphatase mit einem Mittelwert von 9,5 Units pro 1.000.000 Units bei einer Standardabweichung von 0,7 Units. Die als negative Kontrolle dienenden immortalisierten synovialen Fibroblasten (HIG-82) exprimierten keine ALP, im Gegensatz zu den BMP-2 stimulierten immortalisierten OIM-Zellen, die als positive Kontrollen dienten. Als Kontroll-Zellpopulationen wählte man OIM- und HIG-82- Zellen, da die Potenz der OIM-Zellen nach Stimulation mit rhBMP-2 ALP zu synthetisieren bekannt ist. Aufgrund ihrer Fähigkeit, ALP zu synthetisieren wurden die Zellen als osteoblastäre Zellpopulation eingestuft. Die Ergebnisse des ALP- Aktivitäts Tests werden in Fig. 2 dargestellt.
Anwendungsbeispiel 2:
Einsatz von adenoviralen Vektoren zur Entwicklung einer Therapie der Östrogenmangel-bedingten Osteoporose im Modell der Balb/C Maus
Die Grundlage dieser Versuche ist das bekannte Wissen, daß ein Östrogenmangel über eine systemische Erhöhung der Zytokine lnterleukin-1 und TNFa zu einer Aktivierung von Osteoklasten führt, die durch eine gesteigerte ossäre Resorption einen generalisierten Knochenmasseverlust verursachen. Die Theorie hinter den Versuchen zur Evaluation einer Osteoporose-Therapie am Modell der Balb/C Maus ist, daß bekanntermaßen nach Ovarektomie ein generalisierter Knochenmasseverlust auftritt, der nach etwa zwei Wochen sein Maximum erreicht. Es soll versucht werden mittels Einsatz adenoviraler Vektoren, die für IL-1 Ra kodieren den Knochenmasseverlust partiell zu verhindern. Ein solches genetisches Verfahren zur Therapie des Östrogenmangel-bedingten Knochenmasseverlustes ist bislang weder beschrieben, noch experimentell evaluiert.
Alle Versuchstiere waren zum Zeitpunkt der Experimente einheitlich 6 Wochen alt. Es wurden insgesamt fünf verschiedene Versuchsreihen durchgeführt.
Erstens wurde die Ausscheidung von Desoxy-Pyridinoline Crosslinks im Urin nach Ovarektomie (OVX) und nach simulierter Ovarektomie (sham) nach 2 Tagen gemessen. Die Analyse der Crosslinks erfolgte mittels kommerziellem Kit der Firma Metra Biosystems, Inc. (CA, USA) gemäß den Herstellerangaben. Diese Versuchsreihe diente zur Evaluation der Ovarektomie-Wirkung auf die Knochenresorption und zur Testung der Eignung dieser Analyse zur Differenzierung des Knochenmasseverlustes nach Behandlung mit therapeutischen Vektoren.
Zweitens wurde mit adenoviralen Vektoren, die für das Markergen LacZ kodieren (Ad-LacZ) getestet, ob eine Transduktion von Knochen und Knochenmark durch adenovirale Vektoren überhaupt möglich ist. Die Applikation der Vektoren erfolgte intrafemoral, duch einen transcutanen, intercondylären Zugang, der es ermöglichte 100μl eine Suspension mit physiologischer Kochsalzlösung und 109 pfu Ad-LacZ intraossär zu applizieren. Kontrollen wurden mit Instillation physiologischen Kochsalzlösung ohne Vektoren durchgeführt. Die immunhistochemische Färbemethode (LacZ Färbung ist in diesen Antrag mehrfach beschrieben) ermöglicht die farbliche Darstellung der erfolgreich transduzierten Zellen durch intensive Blaufärbung der LacZ exprimierenden Zellen.
In einer dritten Versuchsreihe wurde am Modell der Balb/C Maus durch die Administration von adenoviralen Markern, die für das Marker-Enzym Luciferase kodieren die Dauer der Genexpression und die intracorporale Distribution der Vektoren nach intraossärer Vektoren-Applikation untersucht. Je drei Mäuse wurden am Tag 2, 14 und 21 nach der Vektoren-Applikation getötet und verschiedene Gewebetypen im Bereich der Injektion, sowie verschiedene innere Organe zur Analyse auf Expression des Transgens. Diese wurde photometrisch mit dem Autolumat® LB953 der Firma Berthold, Deutschland, wie im Anwendungsbeispiel 3 beschrieben, auf Enzymaktivität der transgenen Luciferase durchgeführt.
Viertens wurde die in den Experimenten gängigerweise durchgeführte intraossäre Vektoren-Applikation mit der parenteralen Vektoren-Applikation verglichen, um die Dauer und Intensität systemischer Transgen-Level in beiden Verfahren zu untersuchen. Die intaossäre Applikation der Vektoren wurde wie vorbeschrieben intafemoral durchgeführt, während die parenterale Injektion in den bei Mäusen großzüglig angelegten Sinus retroorbitalis erfolgte. Die systemischen IL-1Ra Spiegel wurden im Serum der Mäuse nach wiederholten Blutabnahmen aus dem Sinus retroorbitalis bestimmt. Die Blutabnahmen erfolgten vor der Vektoren-Applikation, sowie an den Tagen 1 , 2, 3, 5 ,9 und 12 nach Injektion der Vektoren. Die Analyse der IL-1 Ra Spiegel erfolgte mittels kommerzieller ELISA-Kits nach den Angaben des Herstellers.
In einem fünften Schritt wurde der Effekt des adenoviral transferierten, therapeutisch wirksamen IL-1Ra auf den Ovarektomie-induzierten Knochenmasseverlust untersucht. Dazu wurden vier Gruppen mit je mindestens 8 Mäusen gebildet, wobei in zwei Gruppen eine Ovarektomie durchgeführt wurde und die Mäuse entweder den therapeutischen Vektor Ad-IL-1 Ra oder den nicht-therapeutischen Markergen-Vektor Ad-LacZ erhielten. Auf gleiche Weise wurden die beiden verbleibenden Gruppen behandelt, jedoch wurde anstelle der Ovarektomie lediglich eine simulierte Operation (sham) durchgeführt. Die Analyse erfolgte durch Messung des Gesamt- Trockengewichtes der nicht manipulierten Humeri, Tibiae und Fibulae um die systemische Wirkung der Vektoren-Applikation evaluieren zu können. Das Trockengewicht wurde nach Exartikulation und vollständigem Entfleischen der Knochen, sowie einer Behandlung der Knochen in einem 90%igen Aceton-Alkohol- Bad in mg gemessen.
Ergebnisse
Die Analyse der Ausscheidung der Desoxy-Pyridinoline-Crosslinks im Urin bestätigt, wie in Figur 6 demonstriert, daß es nach Ovarektomie zu einer Erhöhung der osteoblastären Aktivität mit zunehmender Knochenresorption kommt. Das Ovarektomie-Modell an der Balb/C Maus ist offenbar für die Bestimmung des Knochenmasseverlustes und geeignet für die Evaluation einer genetischen Therapie der Östrogenmangel-bedingten Osteoporose.
Wie in der Figur 7 demonstriert, werden nach intraossärer Applikation von adenoviralen Vektoren eine Reihe unterschiedlicher Zelltypen erfolgreich transduziert (Pfeile). Nach immunhistochemischer X-gal Färbung, die eine Darstellung der Zellen ermöglicht, welche das Transgen exprimieren, werden überwiegend Osteoblasten transduziert, aber auch Zellen des Knochenmarkes. Da Osteoblasten unter der Einwirkung von geeigneten Wachstumsfaktoren eine Ausreifung zum Osteocyten durchlaufen, ist wegen der großen Stabilität und dem immunologisch priviligierten Sitz dieser Zellen mit einer verlängerten Expression von Transgenen zu rechnen.
Die Enzym-Aktivität der Luciferase nach intraossärer Vektoren-Applikation von Ad- Luc wird in Figur 4 dargestellt. Sie demonstrier, daß über den gesamten Verlauf des Untersuchungsintervalles von 21 Tagen die Transgen-Expression in Knochen und Muskulatur persistiert. Die Transgen-Expression aus Leber (2 Tage) und drainierenden Leistelymphknoten (14 Tage) ist transient und erreicht nicht die Höhe der Enzymaktivität im Bereich der Injektion.
Der Vergleich der, in diesen Versuchsreihen bevorzugt angewandten intrafemoralen Vektor-Applikation, mit einer intravenösen Vektor-Applikation wird in Figur 5 präsentiert. Die Figur zeigt, daß die intrafemorale Applikationsform der intravenösen Applikationsform sowohl in der Intensität der Expression von Transgenen, als auch in der Dauer der Expression überlegen ist.
Die Figur 3 demonstriert anhand der Trockengewichte [mg] der Humeri, Tibiae und Fibulae, daß sich der Ovarektomie-induzierte Knochenmasseverlust, hier als Gewicht mineralisierten Knochens ausgedrückt, durch eine genetische Therapie mit adenoviralen Vektoren, die für IL-1 Ra kodieren um etwa 50% reduzieren läßt. Anwendunqsbeispiel 3:
Beschleunigung des Knochenwachstums durch Einsatz von adenoviralen Vektoren, welche für Wachstumsfaktoren kodieren, am Modell des weißen Neuseeland-Hasen.
Material und Methodik
Tiere:
Weibliche weiße Neuseelandhasen mit einem Alter von mehr als 6 Monaten und einem Gewicht von 4,3 bis 5 kg wurden in der Studie eingesetzt. Bei allen Tieren wurden chirurgische Defekte in Oberschenkelknochen derart erstellt, daß diese ohne eine Behandlung nach 9 Wochen noch nicht heilten.
Chirurgisches Verfahren
Nach Einleiten einer allgemeinen Narkose mit Ketaminhydrochlorid (Ketaject®) (40 mg/kg/M) und Xylasin (Xyla-ject®) (3 mg/kg/M) i.m., wurden beide Oberschenkel des Hasens rasiert, mit Isopropyl-Alkohol desinfiziert und in einer sterilen Weise vorbereitet. Eine allgemeine Anästhesie wurde eingeleitet, unter Verwendung von Isofluran 0,8 bis 1 ,5 % (AErrane®) ergänzt, mit 50 bis 100 % Sauerstoff und 50 % Distickstoffoxid. Eine zusätzliche Lokalanästhesie mit 2 % Lidocain wurde eingesetzt, während das Periost von den Femora abgelöst wurde, da dieses Verfahren Bewegungen der Hasen selbst unter allgemeiner Anästhesie bewirkte. Es erfolgte eine longitudinale Präparation der Weichteile. Die gesamte Diaphyse der Femora wurde freipräpariert und die Periostschicht vollständig entfernt. Eine 7 Loch DCP- Platte (Firma Synthes, Colorado, USA) wurde dann über den lateralen Femora plaziert und mit selbstschneidenden 2,7 mm Schrauben fixiert. Ein exakter Defekt von 1,3 cm wurde mittels einer Kugelfräse erzeugt. Um die Osteosynthese von den enormen Biegekräften beim „Kicken" der Hasen postoperativ zu schützen, wurden 3 Cerclage-Drähte benutzt, um eine zusätzliche Fixierung über der Platte an den distalen und proximalen Enden der Femora zu bewirken. Um Knochenfragmente und Knochenmarksanteile vollständig zu entfernen, wurde mehrfach mit physiologischer Kochsalzlösung gespült. Durch Refixation der Muskulatur um den femoralen Defekt wurde eine Defekt-Kammer geschaffen. Alle Weichteilschichten wurden peinlich genau geschlossen und die Haut intrakutan vernäht. Kein weiteres Schienen oder Gipsen war notwendig. Vektoren
Für die Transduktion der Zellen wurden rekombinante Adenoviren der ersten Generation (E1\ E3') deletär benutzt, von denen einer das LacZ-Gen (Ad-LacZ) und der andere das Luciferase-Gen trug (Ad-Luc). In jedem Fall wurde die Genexpression durch einen humanen early promoter angeregt. Bei jedem Defekt wurden 0,5 ml einer Suspension von 1 x 1010 particels von adenoviralen Vektoren, entweder in Suspension mit einer physiologischer Kochsalzlösung oder mit gereinigtem Kollagengel (Vitrogen Collagen Corporation, Palo Alto, Californien, USA) injiziert. Die kontralateralen femoralen Defekte erhielten entweder 0,5 ml einer physiologischen Kochsalzlösung oder 0,5 ml Kollagengel ohne Viruspartikel.
Zur Herstellung der Vektoren Ad-LacZ und Ad-Luc wurden 293-Zellen propagiert. Dieses Verfahren wird von Graham et al. in J. Gen Virol 36:59-72 (1977) beschrieben. Die 293-Zellen werden jeweils für 2 Stunden mit einer multiplicy of infection (m.o.i.) von 10 mit Adenoviren transfiziert. Die Zellen werden geerntet, nachdem sie 36 bis 48 Stunden nach der Infektion abgekratzt und in 5 ml einer 50 mM Tris-Cl (pH 7,5) und 200 mM Natriumchlorid resuspendiert werden. Nach 5 Frier- Tau-Zyklen wurden die Viren mittels 2 Cäsiumchlorid-Schritt-Gradienten (4 °C, 30.000 rpm, 1 Stunde) gereinigt. Ad-LacZ wurde gegen 10 % Glyzerindialysepuffer (100 mM Natriumchlorid, 10 mM Tris-Cl, pH 7,5; 1 mM Magnesiumchlorid, 10 % v/v Glyzerin) dialysiert, wie von Mittereder et al. im J. Virol 70:7498-7509 (1996) beschrieben und Ad-Luc wurde gegen 3 % Saccarosedialysepuffer (150 mM Natriumchlorid, 10 mM Tris-Cl, pH 7,5; 10 mM Magnesiumchlorid, 3 % v/v Saccarose dialysiert. Jeder der Vektoren wurde durch seine optische Dichte bei 260 nm titriert. Beide Viren wurden aufbewahrt bis zum Einsatz bei einer Konzentration von 7 x 1012 Partikeln pro ml bei -80 °C.
Gruppen, Datensammlung und Analyse
Gruppe 1: Der femorale Defekt wurde bei 4 Hasen erzeugt, die mit 0,5 %iger physiologischer Kochsalzlösung behandelt wurden, die 1 x 1010 Partikel Ad-LacZ enthielt. Zwei Hasen wurden nach zwei Tagen getötet, zwei weitere Hasen wurden 12 Tage nach der Operation getötet. Gruppe 2: Vier Hasen wurden mit einem 0,5 ml einer Mischung von Kollagengel (Vitrogen ) mit 1 x 1010 Partikeln von Ad-LacZ behandelt. Die Hasen wurden gemäß dem Zeitplan von Gruppe 1 getötet.
Knochenmark, kortikaler und trabakulärer Knochen, Narbengewebe, welches den Defekt ausfüllt und Muskel, wurden auf Genexpression mittels der X-gal Färbung bei allen Hasen der Gruppe 1 und 2 analysiert. Um zu bestimmen, ob eine systemische Streuung der Vektoren stattgefunden hat, wurden Gewebe von der Milz, der Leber und Lunge entnommen, ebenso wie Knochen, Knochenmark und Muskel von den kontralateralen unbehandelten segmentalen Defekten. Alle Gewebeteile wurden in 10 % Formaldehydlösung für 24 Stunden fixiert, dann in 20 % EDTA dekalzifiziert, innerhalb von 2 bis 3 Wochen bei einem wöchentlichen Austausch des EDTA. Nach Einbetten des demineralisierten Gewebes in Paraffin wurden Blöcke geschnitten und die Gewebeabschnitte mit X-gal und Eosin angefärbt. Die transduzierten Zellen wurden histomorphologisch durch einen unabhängigen Pathologen beurteilt.
Gruppe 3: Acht Hasen der Gruppe 3 wurden mit 0,5 ml einer Mischung von physiologischer Kochsalzlösung mit 1 x 1010 Partikeln von Ad-Luc behandelt. Die Hasen wurden 2, 5, 10 und 14 Tage nach der Operation eingeschläfert. Es wurden Gewebeproben vom trabekulären und kortikalen Knochen, der die Defekt-Kammer umgab, vom Bindegewebe, das die Defekt-Kammer ausfüllte und vom Muskel, der den femoralen Defekt umgab, entnommen. Um eine systemische Distribution der Vektoren zu überprüfen, wurden Proben von Lunge, Leber und Milz ebenso analysiert wie muskulo-skelettäre Proben des nicht-transduzierten contralateralen Defekts. Alle Gewebeproben wurden homogenisiert und nach Zugabe von 0,1 ml physiologischer Kochsalzlösung dreimal einem Frier-Tau-Zyklus unterzogen, um die Zellen zu zerstören. Die Zellen wurden dann bei -80 °C aufbewahrt bis die Messung der Luciferaseaktivität erfolgte. Nach dem letzten Auftauen wurden die Proben bei 10.000 rpm (5600 x g) für 5 Minuten zentrifugiert und die überstehende Lösung für die Messung der Luciferaseaktivität zurückgehalten. Die Luciferaseaktivität wurde bei Raumtemperatur mittels eines AutoLumat® LB953 der Firma Berthold, Deutschland gemäß den Hinweisen des Herstellers gemessen. Ergebnisse
X-gal Färbung
Die histomorphologische Analyse zeigte, daß die Produktion von Ad-LacZ, welches entweder in physiologischer Kochsalzlösung oder in Kollagengel suspendiert war, zu einer lokalen Transduktion von Knochen, Knochenmark, Narbengewebe und Kallusgewebe führte sowie zu einer Transduktion des Muskels, welcher die Injektionsstelle umgab (Fig. 9 bis 10 ). Demgegenüber wurden keine LacZ+ Zellen in der Lunge, der Leber oder Milz oder in dem kontralateralen femoralen Defekt gefunden. Bei Verwendung von Kollagengel als Träger für den Adeno Virus zeigte die histologische Untersuchung des Defektes und des Narbengewebes, weiches die Öffnung ausfüllte, selbst 12 Tage nach der Operation eine nicht-resorbierte feste Kollagenstruktur. Hieraus kann man nur schließen, daß das Adeno Virus durch das Gel verkapselt worden ist und deshalb keine Möglichkeit hatte zu transduzieren. Die histologische Analyse zeigte keinen Nachweis für eine lokale Entzündung.
Luciferase Assay
Ein verschieden hoher Gehalt an Luciferaseaktivität wurde im Knochen und im Knochenmark gefunden, ebenso wie im defekt-füllenden Bindegewebe, im umliegenden Muskelgewebe an der Injektionsstelle. 5 Tage nach der Transduktion war eine leichte Luciferaseaktivität in der Leber festzustellen, welche vollständig nach 10 Tagen verschwand. Keine Luciferaseaktivität konnte im kontralateralen Femur, der Lunge und der Milz gefunden werden (Fig. 8 ).
Radiologischer Heilungsverlauf nach Gabe therapeutischer Gene
Nachdem die Vorversuche, mit denen der Nachweis der Transduzierbarkeit der verschiedenen muskulo-skelettären Gewebestrukturen geführt und die Dauer der Expression von Transgenen bestimmt wurde, gezeigt hatten, daß das femorale Defektmodell am weißen Neuseelandhasen geeignet ist die Wirkung therapeutischer Gene auf die Defektheilung zu evaluieren, wurden nach dem gleichen Modell je vier und sechs Hasen mit 1x107 pfu Ad-TGF-ß, bzw. 2x1010 pfu Ad-BMP-2 transduziert, simultan mit je vier bzw. fünf gleichaltrigen Kontrollhasen, die mit dem nichttherapeutischen Markergen Ad-Luc transduziert wurden. Röntgenkontrollen erfolgten nach der ersten Kontrolluntersuchung eine Woche postoperativ in zweiwöchentlichen Abständen. Wie in Figur 11 und 12 dargestellt war bereits nach 5 Wochen in der Ad- BMP-2 behandelten Gruppe ein deutlicher Mineralisationsvorsprung im Vergleich zur Kontrollgruppe sichtbar. Die radiologische Abschlußuntersuchung in der 12. Woche ergab bei allen 6 Verum-Hasen eine gute knöcherne Durchbauung der femoralen Defektkammer, bei mangelhafte Durchbauung bis hin zur Pseudarthrose in der nicht- therapierten Kontrollgruppe. Ein ähnlicher Trend war auch in der mit Ad-TGF-ß therapierten Gruppe zu sehen. Der radiologiche Heilungsverlauf zeigte im Vergleich zur Kontrollgruppe deutlich mehr mineralisierte Substanz in der femoralen Defektkammer, jedoch ohne die Ausildung einer radiologisch sichtbaren Ossifikation im Sinne einer cortico-trabekulären Ausreifung. Dieses Ergebnis blib bis zur 16 postoperativen Woche unverändert.
Zusammenfassend ist zu schließen, daß Ad-BMP-2 eine stimulierende Wirkung auf die Ossifikation im femoralen Defekt hatte, Ad-TGF-b fördert vermutlich mehr eine unspezifische Mineralisation des Gewebes ohne zu einer letztendlichen Ausreifung des Knochens zu führen. Eine Kombination beider Vektoren könnte ggf. zu einer weiteren Beschleunigung der Knochenbruchheilung in Defektsituationen führen.
Biomechanik
12 Wochen nach Operation und Injektion der viralen Vektoren in den Defekt wurden die sechs mit Ad-BMP-2 behandelten Hasen (2 x 1010 pfu), sowie 5 Kontroll-Hasen, die lediglich 2 x 1010 pfu des Markergens Ad-Luc erhalten hatten getötet. Die operierten Femora wurden weitgehend entfleischt, unter Schonung aller auch ektoper Knochenbrücken. Dann erfolgte die vorsichtige Metallentfernung. Dabei zeigte sich, daß ein Femur der Kontrollgruppe in bindegewebiger Pseudoarthrose geheilt war, ein zweiter Femur der Kontrollgruppe wis lediglich eine so dünne Knochenbrücke auf, daß diese auch bei sehr vorsichtiger Präparation brach. Dieser Femur wurde daher aus der Auswertung ausgeschlossen. Nach Entfernung sämtlichen Metalls wurden die Präparate bis zur weiteren Analyse bei -80 °C eingefroren.
Die biomechanische Analyse erfolgte im Drei-Punkte-Biege-Verfahren um die Biegungssteifigkeit und die maximale Biegungskraft der Femora zu bestimmen. Die Femora wurden bis 24 Stunden vor den Tests gefroren gelagert und dann im Kühlschrank langsam aufgetaut. Jeder Femur wurde im Drei-Punkte-Biegungs- System plaziert, das eine freie Biegestrecke von 4,5 cm gewährleistete. Die Lastaufnahme erfolgte in posterior-anteriorer Richtung, wobei die Last am Mittelpunkt der freien Biegestrecke übertragen wurde, die jeweils etwa den Mittelpunkt der Diaphysen darstellt.
Die Tests wurden mit dem Instron 8500 servo-hydralic testing System (Instron Corp., Canton, MA) durchgeführt, es wurde ein Instron 2500 Ibf Lastaufnahme Zelle verwandt. Die Deformation der Femora wurde mit dem internen LVDT-System gemessen. Die Daten wurden mittels Instron's MAX Software erhoben und mit Hilfe des Software-Programms MS-Excel analysiert.
Es wurde eine maximale Verbiegung von 1 cm angewandt, bei einer Beigerate von 0,5 cm/min. oder 0,0833 mm/sec. Bei Fraktur der Femora war der Test beendet.
Die mit Ad-BMP-2 behandelte Verumgruppe unterschied sich von der Kontrollgruppe signifikant (p=0,036) bezüglich der Steifigkeit und auch bezüglich der aufgewandten Kraft (p=0,0055).
Einzelmessungen:
Steifigkeit Kraft
Ad-BMP-2 Kontrolle Ad-BMP-2 Kontrolle
75.6000 80.8000 195.0000 102.0000
118.0000 64.0000 131.6000 103.2000
99.6000 53.2000 171.2000 82.0000
79.6000 0.0000 227.6000 0.0000
97.6000 206.4000
45.6000 92.4000
Die biomechanische Analyse nach dem Drei-Punkte-Biegungsverfahren läßt darauf schließen, daß durch den Einsatz der adenoviralen Vektoren, die für BMP-2 kodieren und so auf zellulärem Niveau zu einer Produktion des als Arzneimittel wirksamen Proteins führen, eine Beschleunigung der Knochen-Defektheilung erreicht werden kann.
Histomorphometrie
Wie in den vorbeschriebenen Versuchen wurde auch hier das femorale Defektmodell am weißen Neuseeland-Hasen genutzt. 16 Wochen nach der Operation der Tiere und nach Injektion 107 pfu adenoviraler Vektoren, deren cDNA für das potentiell therapeutische TGF-beta kodiert (Ad-TGF-beta) wurden die vier Tiere getötet und präpariert. Als Kontrollgruppe dienten 4 weiße Neuseelandhasen, die lediglich 107 pfu eines Markergens erhielten (Ad-Luc).
Die Bildanalyse wurde wie folgt am digitalisierten histologischen Schnitt vorgenommen. Die Bilder wurden mit einem 2-fachen Bandenfilter geschärft, um die blau gefärbten, knöchernen Areale zu definieren (Trichrome-Färbung). Knöcherne Areale wurden mittels Farbwürfel-Technik (3 x 3 Pixel) definiert, nachdem eine Standardisierung gegen den normalen corticalen Knochen außerhalb des Defektes vorgenommen worden war. Die vormaligen Defektgrenzen wurden digital markiert und das ehemalige Defektareal (area of interest = AOI) auf Intensität der Blaufärbung analysiert. Es wurden vier unterschiedliche Messungen vorgenommen:
1. Absolute Knochenmasse in der AOI
2. Mittlere Lichtintensität - die Messung der Intensität der Färbung ermöglicht dabei Rückschlüsse auf die Qualität des neugebildeten Knochens.
3. Masse mineralisierten Gewebes im Verhältnis zur Defektgröße in Prozent
4. IOD (integrated optical density), entspricht der mittleren optischen Lichtintensität pro gemessener Fläche
Als AOIs wurden folgende analysierte Zonen bestimmt:
1. Das gesamte Areal vom distalen bis zum proximalen Schraubenloch
2. Knochenneubildung entlang der entfernten DCP-Platte
3. Knochenneubildung der der entfernten DCP-Platte gegenüberliegenden Corticalis
4. Summe der Defektränder
Die Gesamtmasse der Mineralisation im Defektbereich war in der Verumgruppe, die mit Ad-TGF-beta behandelt worden war mehr als doppelt so hoch als in der Kontrollgruppe (19,5 +/- 10,7 mm2 versus 9,04 +/- 4,3 mm2), jedoch nicht signifikant unterschiedlich. Noch deutlicher waren die Unterschiede unter Berücksichtigung der Fläche und der Lichtintensität (IOD) (1754,0 +/- 906,0 mm2 versus 557,7 +/- 138,0 mm2). Auch hierbei war der Unterschied im t-Test für unverbundene Stichproben jedoch nicht signifikant, was sich durch die große Streuung bei geringen Fallzahlen erklärt.
Die Ergebnisse deuten jedoch dennoch darauf hin, daß TGF-beta, auf zellulärer Ebene produziert und exprimiert, einen positiven Einfluß auf die Mineralisation und Ossifikation nach Defektfrakturen hat. Durch die Nutzung der Technik des Gentransfers mit nachfolgender Expression des Wachstumsfaktors, die, wie in den Vorversuchen beschrieben ein überwiegend lokales Verfahren darstellt, könnten möglicherweise insbesondere die bekannten Nebenwirkungen einer systemischen TGF-beta Applikation vermieden werden.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von Vektoren wie Adenoviren und/oder Adeno-assoziierten Viren und/oder Retroviren und oder Herpes-Simplex-Viren und/oder Liposomen und/oder Piasmiden als säugerzellenstimulierendes Mittel zur Herstellung von therapeutischen, als Arzneimittel wirkenden Proteinen auf zellulärem Niveau zur genetischen Behandlung von Knochenpathologien.
2. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Adenoviren um adenovirale Vektoren handelt.
3. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Adeno-assoziierten Viren um ein Adeno-assozierte virale Vektoren handelt.
4. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Retroviren um retrovirale Vektoren handelt.
5. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Liposomen um liposomale Vektoren handelt, die die genetische Information für Wachstumsfaktoren oder Zytokine, bzw. deren Inhibitoren enthalten.
6. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Piasmiden um solche handelt, die die genetische Information für Wachstumsfaktoren oder Zytokine, bzw. deren Inhibitoren enthalten
7. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den therapeutischen Proteinen um Wachstumshormone, Zytokine oder Zytokininhibitoren handelt.
8. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den zu stimulierenden Säugerzellen um tierische oder menschliche Zellen handelt, insbesondere Knochenzellen, Knochenmarkszellen, Bindegewebszellen und/oder Muskelzellen.
9. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Vektoren, die zur Produktion der Arzneimittel durch die transfizierten Zellen führen, parenteral appliziert werden.
10. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Vektoren, die zur Produktion der Arzneimittel durch die transfizierten Zellen führen, intraossär appliziert werden.
11. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Vektoren, die zur Produktion der Arzneimittel durch die transfizierten Zellen führen, lokal an den Ort der Knochenpathologie appliziert werden.
12. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß zur Behandlung Säugerzellen dem Körper entnommen, dann in-vitro mittels der vorgenannten Vektoren transfiziert, in einem geeigneten Medium kultiviert und reimplantiert werden, um dann am Ort der Knochenpathologie, die als Arzneimittel wirksamen therapeutischen Proteine nach genetischer Manipulation der Zielzellen zu produzieren.
13. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüchen 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Knochenpathologien um Osteoporose, lokalen oder systemischen Knochenmasseverlust, Knochensubstanzverlust oder Knochenstrukturstörungen, Knochenbrüche mit Knochensubstanzverlust, Defektfrakturen, oder Pseudarthrosen, Knochendefektzustände nach Operationen, Morbus Sudek, Knochensubstanzverlust bei Endoprothesenlockerungen, periartikuläre Osteolysen bei Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises und/oder Osteonekrosen handelt.
14. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Knochenpathologie auch das Einheilen von Transplantaten, insbesondere ligamentärer, knöchener oder tendinöser Transplantate, z.B. in der Knie- und Schulterchirurgie, einschließt.
15. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 - 14, dadurch gekennzeichnet, daß zur Verbesserung des Knochenaufbaus die genetische Information (cDNA) der therapeutischen Proteine BMP 2 - 7 und/oder FGFs und/oder IGFs und/oder PDGFs und/oder VEGF und/oder TGF-ß verwandt wird oder die cDNA von Zytokinen oder Zytokininhibitoren, z.B. hlL-1 Ra oder TNF-α-lnhibitoren.
16. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 - 14, dadurch gekennzeichnet, daß zur Reduktion des Knochenabbaus die genetische Information (cDNA) zur Bildung von Zytokininhibitoren, z. B. hlL-1Ra und sTNFαR und lnterleukin-6 Inhibitoren oder resorptionshemmende Zytokine wie lnterieukin-10, eingesetzt werden.
17. Verfahren zur Behandlung von Knochenpathologien unter Verwendung von Vektoren wie Adenoviren und/oder Adeno-assoziierten Viren und/oder Retroviren und/oder Herpes-Simplex-Viren und/oder Liposomen und/oder Piasmiden als säugerzellenstimulierendes Mittel zur Herstellung von therapeutischen Proteinen auf zellulärem Niveau gemäß irgendeinem der vorstehenden Ansprüche 1 bis 16.
PCT/EP1998/006849 1997-10-29 1998-10-29 Verwendung von vektoren wie adenoviren und/oder adeno-assoziierten viren und/oder retroviren und/oder herpes-simplex-viren und/oder liposomen und/oder plasmiden als vehikel für genetische information zur befähigung von säugetierzellen mittel, zur behandlung von knochenpathologien zu produzieren WO1999021589A2 (de)

Priority Applications (7)

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EP98959810A EP1027076A2 (de) 1997-10-29 1998-10-29 Verwendung von vektoren wie adenoviren und/oder adeno-assoziierten viren und/oder retroviren und/oder herpes-simplex-viren und/oder liposomen und/oder plasmiden als vehikel für genetische information zur befähigung von säugetierzellen mittel, zur behandlung von knochenpathologien zu produzieren
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