DE19747719A1

DE19747719A1 - Verfahren zur Verbesserung der Knochenheilung mit der molekularbiologischen Methode der Genübertragung

Info

Publication number: DE19747719A1
Application number: DE1997147719
Authority: DE
Inventors: Axel W A Dr Med Baltzer; Christian Dr Med Lattermann; Christopher Prof Evans; Paul Prof Robbins
Original assignee: BALTZER AXEL WILHELM AUGUST DR
Current assignee: BALTZER, AXEL WILHELM AUGUST, PRIV.-DOZ. DR.MED.,
Priority date: 1997-10-29
Filing date: 1997-10-29
Publication date: 1999-05-12

Description

Es ist bekannt, daß eine Reihe von Wachstumsfaktoren zu einer Beschleunigung der Knochenheilung beitragen. Zu diesen Wachstumsfaktoren gehören unter anderem Bone Morphogenetic Proteins (BMPs), Fibroblast Growth Factors (FGFs), Insulin-Like Growth Factors (IGFs), Platelet-Derived Growth Factors (PDGFs) sowie potentiell auch die cDNA des Vascular Endothelian Growth Factor (VEGF). Auf Grund der kurzen Halbwertzeit der aufgeführten therapeutischen Proteine konnten diese bislang nicht adäquat genutzt werden, da sie innerhalb von Stunden, längstens Tagen metabolisiert und abgebaut werden.

Das Problem, daß die aufgeführten therapeutischen Proteine wegen kurzer Halbwertzeiten nicht ausreichend lange therapeutisch zur Verfügung stehen, wird durch die in Patentanspruch 1-9 aufgelisteten Merkmale umgangen.

Prinzipiell sind zwei Methoden des Gentransfers zu schützen, 1.) die Technik des in vivo Transfers, bei dem die oben genannten Vektoren direkt in den Körper eingebracht werden und lokal Zellen transduzieren (DNA oder RNA in die Zellen einschleusen), um sie zur Produktion von therapeutischen Substanzen zu befähigen, 2.) das ex vivo Verfahren, bei dem zunächst körpereigene oder immunologisch geschützte Zellen in vitro transduziert und vermehrt werden. Diese gentherapeutisch manipulierten Zellen werden in den Körper reimplantiert und exprimieren dort die therapeutischen Substanzen.

Sowohl für das in vivo als auch für das ex vivo Verfahren kommen grundsätzlich sämtliche Gewebetypen des Körpers in Frage. Von vorrangiger Bedeutung sind jedoch Knochenmarkszellen, Bindegewebszellen wie beispielsweise Fibroblasten und Muskelgewebe.

Die Vorteile der neuen beschriebenen Technik bestehen insbesondere darin, daß Substanzen, die normalerweise schnell vom Körper abgebaut werden, nach Transduktion ihrer cDNA durch die kontinuierliche Produktion körpereigener Zellen therapeutisch nutzbar gemacht werden. Ein weiterer Vorteil besteht in der prinzipiell minimalinvasiven Technik des beschriebenen Verfahrens. Die genannten therapeutischen Proteine werden in geringer Menge auch vom Körper selbst produziert. Gravierende Nebenwirkungen der aufgeführten therapeutischen Proteine sind bislang nicht bekannt.

Wir haben ein Verfahren entwickelt, mit dem wir segmentale Knochendefekte und Pseudarthrosen mit der Methode der Gentherapie behandeln können. Mit der Methode der Gentherapie werden die transduzierten Zellen dazu befähigt, auf zellulärem Niveau therapeutische Substanzen zu produzieren, die lokal eine Knochenheilung initiieren. Die erwähnten Substanzen kommen natürlich im menschlichen Körper vor, so daß mit dem Verfahren der Gentherapie die Nebenwirkungen der herkömmlichen Therapeutika in geringerem Maße zu erwarten sind.

Knochenheilungsstörungen, insbesondere die Pseudarthrose stellen für den Mediziner immer noch erhebliche therapeutische Probleme dar, daher ist die Methode von großer klinischer Relevanz.

Einleitung

Die Antragsteller haben ein Verfahren entwickelt, welches mit der Methode des Gentransfers eine neuartige Therapie von Knochenheilungsstörungen wie der Pseudarthrose, verzögerter Knochenbruchheilung und Behandlung von ausgedehnten Defektfrakturen auf zellularer Ebene ermöglicht. Da Wachstumsfaktoren, die prinzipiell natürlich im Körper vorkommen, und für die bislang kaum ernsthafte Nebenwirkungen bekannt sind, genutzt werden, ist mit einer niedrigen Nebenwirkungsrate zu rechnen.

Material und Methoden

Grundlage des Modells zur Testung des beschriebenen Verfahrens waren New Zealand White Rabbits, in deren Oberschenkelknochen ein knöcherner Defekt ausgeschnitten wurde, der dann mit einer herkömmlichen Osteosynthese fixiert wurde. Die Größe des Defektes wurde so gewählt, daß eine vollständige knöcherne Heilung ohne Behandlung nicht möglich ist. In den Defekt wurden nach Verschluß der Operationswunde Vektoren injiziert, die cDNA von Wachstumsfaktoren und von Markergenen in die Zellen der Gewebe transduzieren, die den Defekt unmittelbar umgeben. Diese Zellen exprimieren daraufhin die kodierten Wachstumsfaktoren oder Markergene in den Defekt.

Die Streuung der injizierten Vektoren im Körper wurde durch Analyse der Markergene in verschiedenen Körperteilen untersucht. Mit Hilfe der X-gal Färbung wurde die lokale Zell-Tranduktion und der Anteil transduzierter Zellen in der Umgebung der Injektion untersucht. Mittels Röntgenreihenuntersuchungen und mit der Methode der Histomorphometrie wurde die Verknöcherung des Defektes in den einzelnen Gruppen verglichen.

Ergebnisse

Es zeigte sich, daß es nach Injektion der Vektoren nur zu einer geringen Streuung im Körper kommt. Die Aktivität der Markergene war hauptsächlich im Bereich der Injektion nachweisbar, lediglich in der Leber war für wenige Tage eine Markergenaktivität nachweisbar. Die Expression von Markergenen bei Nutzung von Adenoviren als Vektoren war bis zu 6 Wochen nach Injektion nachweisbar. Die Expression von Wachstumsfaktoren im Defekt führte zu einer Defektheilung. Die Ergebnisse der Histomorphometrie bestätigten diese Befunde.

Diskussion

Durch diese neue Verfahren lassen sich Substanzen, die bislang wegen kurzer Halbwertzeiten nur ungenügend zur Behandlung von Knochenheilungsstörungen wie der Pseudarthrose und verzögerter Knochenbruchheilung oder auch Defektfrakturen nutzbar waren, therapeutisch nutzen. Die Injektion von Vektoren wie dem Adenovirus führt zu einer hohen lokalen Transfektionsrate mit einer starken und ausreichend langen Expression von Proteinen, um therapeutisch wirken zu können.

Claims

1. Verwendung der Methode der Gentherapie zur Behandlung von Knochenheilungsstörungen und zur Beschleunigung der Knochenbruchheilung.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Methode die Verwendung von Adeno-assoziierten Viren nutzt, um menschliche oder tierische Zellen diesbezüglich zu verändern, daß die Zellen therapeutische Proteine produzieren.

3. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Methode die Verwendung von Retroviren nutzt, um menschliche oder tierische Zellen diesbezüglich zu verändern, daß die Zellen therapeutische Proteine produzieren.

4. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Methode die Verwendung von Adenoviren nutzt, um menschliche oder tierische Zellen diesbezüglich zu verändern, daß die Zellen therapeutische Proteine produzieren.

5. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Methode die Verwendung von Liposomen nutzt, um menschliche oder tierische Zellen diesbezüglich zu verändern, daß die Zellen therapeutische Proteine produzieren.

6. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Methode die Verwendung von Plasmiden nutzt, um menschliche oder tierische Zellen diesbezüglich zu verändern, daß die Zellen therapeutische Proteine produzieren.

7. Verwendung nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß Gene genutzt werden, die für die Produktion von Mediatoren (auch im Sinne von Hormonen), Zytokinen, Zytokininhibitoren, Wachstumsfaktoren, Rezeptoren oder/und Zelloberflächendeterminanten kodieren.

8. Verwendung nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß in der Methode ein minimalinvasives chirurgisches Verfahren zur Applikation der Vektoren per injectionem durchgeführt wird.

9. Verwendung nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß in der Methode unter anderem knöchernes Gewebe, Narbengewebe und Muskelzellen als Zielgewebe für die Gentransduktion verwandt werden.

10. Verwendung nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß in der unten aufgeführten Methode der ex vivo Transfektion vorwiegend Knochenmarkszellen, Bindegewebszellen oder Muskelzellen zur ex vivo Transfektion genutzt und replantiert werden.

11. Verwendung nach Methode nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß zur Therapie von Knochenheilungsstörungen und zur Beschleunigung der Knochenbruchheilung cDNA von Bone Morphogenetic Proteins (BMPs), Fibroblast Growth Factors (FGFs), Insulin-Like Growth Factor (IGFs), Platelet- Derived Growth Factors (PDGFs) sowie die cDNA des Vascular Endothelian Growth Factor (VEGF) verwandt wird, oder die cDNA von Zytokinen und Zytokininhibitoren, wie zum Beispiel humanes Interleukin-I Rezeptor Antagonist Pretin (hIL-1Ra) oder Tumor Nekrosis Factor-α (TNF-α), beziehungsweise Interleukin-10.

12. Verwendung der Methode nach Anspruch 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß die beschriebene Methode bei Pseudarthrosen, komplizierten Knochenbrüchen, bei Knochensubstanzverlust, bei Morbus Sudeck, bei segmentalen Knochendefekten und bei der lokalen transienten Osteoporose Anwendung findet.