DE69733204T2

DE69733204T2 - Neuartige vegf-ähnliche faktoren

Info

Publication number: DE69733204T2
Application number: DE69733204T
Authority: DE
Inventors: Yuichi Nihari-gun HIRATA; Junichi Niihari-gun NEZU
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1996-07-15
Filing date: 1997-07-15
Publication date: 2006-05-11
Anticipated expiration: 2017-07-16
Also published as: EP0935001B2; ATE294863T1; AU3461097A; DE69733204D1; AU733322B2; US6828426B1; US20050112665A1; DE69733204T3; ES2242227T3; JP3911028B2; EP0935001B1; WO1998002543A1; EP0935001B9; US7803576B2; EP0935001A4; US20060172343A1; US20110293602A1; ES2242227T5; EP0935001A1

Description

Fachliches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Proteinfaktor, der in die Angiogenese bei Menschen involviert ist, und fällt in das Gebiet der Gentechnik.
Hintergrund des Fachgebietes
Der Prozess der Angiogenese, innerhalb dessen Endothelzellen, die in der inneren Wand von Blutgefäßen von Tieren vorkommen, neue Blutgefäße erzeugen, wird durch die Transduktion eines spezifischen Signals ausgelöst. Wie berichtet, ist eine Vielzahl von Substanzen an dieser Signaltransduktion beteiligt. Die bemerkenswerteste Substanz unter ihnen ist der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF). VEGF ist ein Proteinfaktor, der isoliert und gereinigt wurde, und kann die Proliferation von Endothelzellen und die Durchlässigkeit von Blutgefäßen erhöhen (Senger, D. R. et al., Science 219: 983–985 (1983); Ferrara, N. und Henzel, W. J., Biochem. Biophys. Res. Commun. 161: 851–858 (1989)). Es wurde berichtet, dass das menschliche VEGF-Gen acht Exons enthält und in Abhängigkeit von Unterschieden beim Spleißen vier Unterarten, bestehend aus 121, 165, 189 oder 206 Aminosäureresten, produziert, was unterschiedliche Sekretionsmuster verursacht (Houck, K. A. et al., Mol. Endocrinol. 5: 1806–1814 (1991)). Es wurde ebenfalls berichtet, dass es einen VEGF-spezifischen Rezeptor flt-1 gibt und dass die Bindung von VEGF an flt-1 für die Signaltransduktion wichtig ist (Vries, C. D. et al., Science 255: 989–991 (1992)).
Die Expression von VEGF während der embryonalen Angiogenese und der Differenzierung der Endothelzellen wurde durch Breier, G. et al., Development (1992), S. 521–532 berichtet. WO 97/12972 (1996) beschreibt FIGF, ein Molekül, das mit dem Wachstumsfaktor VEGF verwandt ist.
Der Plazenta-Wachstumsfaktor (PIGF) und der von Plättchen stammende Wachstumsfaktor (PDGF) sind bislang isoliert worden und sind mit VEGF verwandte Faktoren. Es wurde gefunden, dass diese Faktoren die Proliferationsaktivität von vaskulären Endothelzellen fördern (Maglione, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9267–9271 (1991); Betsholtz, C. et al., Nature 320: 695–699 (1986)). Zusätzlich wurden vor kurzem VEGF-B (Olofsson, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 2576–2581 (1996)) und VEGF-C (Lee, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1988–1992 (1996); Joukov, V. et al., EMBO J. 15: 290–299 (1996)) isoliert.
Diese Faktoren scheinen eine Familie zu bilden und diese kann weitere unbekannte Faktoren enthalten.
Es wurde vorgeschlagen, dass VEGF nicht nur an der Gefäßbildung im Entwicklungsstadium, sondern auch an der mit Diabetes verbundenen pathologischen Neovaskularisation, rheumatoider Arthritis, Retinopathie und an dem Wachstum solider Tumore beteiligt ist. Weiterhin wurde vorgeschlagen, dass die Fähigkeit von VEGF, die vaskuläre Durchlässigkeit zu erhöhen, zusätzlich zu seinen vorstehend aufgelisteten, das Wachstum von vaskulären Endothelzellen fördernden Wirkungen an der Erzeugung von Ödemen, die aus unterschiedlichen Ursachen resultieren, beteiligt ist. Auch können diese Faktoren der VEGF-Familie nicht nur auf Blutgefäße, sondern auch auf Blutzellen und lymphatischen Gefäße wirken. Sie können also bei der Differenzierung und Proliferation von Blutzellen und bei der Erzeugung von lymphatischen Gefäßen eine Rolle spielen. Folglich lenken die Faktoren der VEGF-Familie gegenwärtig außergewöhnliche Aufmerksamkeit auf die Entwicklung nützlicher neuartiger Arzneistoffe.
Offenbarung der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein neuartiges, zu der VEGF-Familie gehörendes Protein und ein das Protein codierendes Gen zu isolieren. Wir haben nach Genen mit einer Homologie zu VEGF-C, welches ein kürzlich cloniertes Gen der VEGF-Familie ist, bei Exprimierten Sequenzmarkierten Stellen (EST) und Sequenzmarkierten Stellen (STS) in der GenBank-Datenbank gesucht. Als Ergebnis haben wir ein EST gefunden, von dem angenommen wurde, dass es eine Homologie zu dem C-terminalen Teil von VEGF-C aufweist. Wir haben dann basierend auf der Sequenz Primer entworfen und haben unter der Verwendung des 5'-RACE-Verfahrens und des 3'-RACE-Verfahrens die entsprechende cDNA amplifiziert und isoliert. Die Nucleotidsequenz der isolierten cDNA wurde bestimmt und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz ergab, dass die Aminosäuresequenz eine signifikante Homologie zu der von VEGF-C aufwies. Auf der Homologie beruhend haben wir angenommen, dass der isolierte menschliche Clon ein viertes Mitglied der VEGF-Familie (nachstehend als VEGF-D bezeichnet) darstellt. Wir waren auch bei der Expression des durch das isolierte menschliche VEGF-D-Gen codierten Proteins in E. coli-Zellen erfolgreich und haben es auch gereinigt und isoliert. Weiterhin waren wir unter der Verwendung des isolierten menschlichen VEGF-D-Gens bei der Isolierung der VEGF-D-Gene von Maus und Ratte erfolgreich.
Im Besonderen betrifft die vorliegende Erfindung ein neuartiges, zu der VEGF-Familie gehörendes Protein und ein das Protein codierendes Gen. Noch genauer betrifft sie

(1) ein durch SEQ ID NR. 1 dargestelltes Protein;
(2) ein durch eine DNA, die mit der in SEQ ID NR. 2 dargestellten DNA hybridisiert, codiertes Protein;
(3) eine das Protein von (1) codierende DNA;
(4) eine mit der in SEQ ID NR. 2 dargestellten DNA hybridisierende DNA;
(5) einen die DNA von (3) oder (4) enthaltenden Vektor;
(6) eine den Vektor von (5) tragende Transformante;
(7) ein Verfahren zur Herstellung der Proteine von (1) oder (2), was die Züchtung der Transformante von (6) umfasst;
(8) einen an die Proteine von (1) oder (2) bindenden Antikörper; und
(9) ein Screening-Verfahren für eine Verbindung, die an das Protein von (1) oder (2) bindet, was einen Schritt des Nachweises der Aktivität des Proteins von (1) oder (2), an eine Testprobe zu binden, umfasst.

Das Protein der vorliegenden Erfindung (VEGF-D) besitzt eine signifikante Homologie zu VEGF-C und kann als vierter Faktor der VEGF-Familie betrachtet werden. Da die hauptsächliche Funktion von VEGF die Gefäßbildung im Entwicklungsstadium ist und in Betracht gezogen wird, dass VEGF an der mit Diabetes verbundenen pathologischen Neovaskularisierung, rheumatoider Arthritis, Retinopathie und dem Wachstum von soliden Tumoren beteiligt ist, wird angenommen, dass das Protein der vorliegenden Erfindung ähnliche Funktionen aufweist.
Ein Fachmann könnte durch die Modifikation des VEGF-D der vorliegenden Erfindung durch Anfügen, Entfernen oder Austauschen von einer oder mehreren Aminosäuren des durch SEQ ID NR. 1 dargestellten VEGF-D unter der Verwendung bekannter Verfahren funktionell entsprechende Proteine herstellen. Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen artifiziellen Modifikationen können Modifikationen des Proteins auch natürlicherweise vorkommen. Bekannte Verfahren für das Anfügen, das Entfernen oder das Austauschen von Aminosäuren schließen das Polymerasekettenreaktions-Verfahren zur Verlängerung von Überlappungen (OE-PCR) ein (Gene, 1989, 77 (1): 51).
Die durch SEQ ID NR. 2 dargestellte, das VEGF-D der vorliegenden Erfindung codierende DNA ist bei der Isolierung von DNAs, die Proteine mit ähnlichen Funktionen wie VEGF-D in anderen Organismen codieren, von Nutzen. Zum Beispiel könnte ein Fachmann routinemäßig Homologe des menschlichen VEGF-D der vorliegenden Erfindung von anderen Organismen isolieren, indem er/sie die durch SEQ ID NR. 2 dargestellte DNA oder einen Teil davon als Sonde mit einer von anderen Organismen stammenden DNA hybridisieren lässt. Die DNA, die mit der durch SEQ ID NR. 2 dargestellten DNA hybridisiert, ist ebenfalls in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Die anderen Organismen schließen Mäuse, Ratten und Kaninchen ein.
Die DNA, die ein Protein codiert, das VEGF-D funktionell entspricht, weist üblicherweise eine hohe Homologie zu der durch SEQ ID NR. 2 dargestellten DNA auf. Die hier verwendete hohe Homologie bedeutet mindestens 70% oder mehr, mehr bevorzugt 80% oder mehr und noch mehr bevorzugt 90% oder mehr an Sequenzhomologie.
Ein Beispiel für die Hybridisierungsbedingungen zur Isolierung von DNA mit einer hohen Homologie wird nachstehend gegeben. Die Vorhybridisierung wird für 30 Minuten bei 68°C in ExpressHyb-Lösung durchgeführt. Die mit einem Radioisotop markierte Sonde wird für 2 bis 5 Minuten bei 95°C bis 100°C denaturiert und schnell auf Eis gekühlt. Die Sonde wird in eine frische ExpressHyb-Lösung gegeben. Der Blot wird in die die Sonde enthaltende Lösung transferiert und man lässt ihn für 2 Stunden unter Anlegung eines Temperaturgradienten von 68°C bis 55°C hybridisieren. Der Blot wird für jeweils 10 Minuten vier Mal mit einer 0,05% SDS enthaltenden 2 × SSC-Lösung bei Raumtemperatur gewaschen. Der Blot wird anschließend bei 45°C für 3 Minuten mit einer 0,1% SDS enthaltenden 0,1 × SSC-Lösung gewaschen. Der Blot wird einer Autoradiographie unterzogen.
Ein Beispiel für die Hybridisierungsbedingungen zur Isolierung von DNA mit einer sehr hohen Homologie wird nachstehend gegeben. Die Vorhybridisierung wird für 30 Minuten bei 68°C in ExpressHyb-Lösung durchgeführt. Die mit einem Radioisotop markierte Sonde wird für 2 bis 5 Minuten bei 95°C bis 100°C denaturiert und schnell auf Eis gekühlt. Die Sonde wird in eine frische ExpressHyb-Lösung gegeben. Der Blot wird in die die Sonde enthaltende Lösung transferiert und man lässt ihn für 1 Stunde bei 68°C hybridisieren. Der Blot wurde für jeweils 10 Minuten viermal mit einer 0,05% SDS enthaltenden 2 × SSC-Lösung bei Raumtemperatur gewaschen. Der Blot wurde anschließend mit einer 0,1% SDS enthaltenden 0,1 × SSC-Lösung für 40 Minuten bei 50°C gewaschen, währenddessen die Lösung einmal ausgetauscht wurde. Der Blot wurde dann einer Autoradiographie unterzogen.
Beachten Sie, dass die Hybridisierungsbedingungen in Abhängigkeit von der Länge der Sonde (je nachdem, ob es sich um ein Oligomer oder eine Sonde mit mehr als mehreren hundert Basen handelt), dem Markierungsverfahren (je nachdem, ob die Sonde radioisotopisch oder nicht radioisotopisch markiert ist) und der Art des zu clonierenden Zielgens variieren können. Ein Fachmann würde die geeigneten Hybridisierungsbedingungen in richtiger Weise wählen. In der vorliegenden Erfindung ist es besonders wünschenswert, dass die Bedingungen es nicht zulassen, dass die Sonde mit der VEGF-C codierenden DNA hybridisiert.
Die DNA der vorliegenden Erfindung wird auch verwendet, um VEGF-D der vorliegenden Erfindung als rekombinantes Protein herzustellen. Im Besonderen kann das rekombinante Protein in großer Menge hergestellt werden, indem die VEGF-D codierende DNA (zum Beispiel die durch SEQ ID NR. 2 dargestellte DNA) in einen geeigneten Expressionsvektor integriert, der resultierende Vektor in einen Wirt eingebracht und die Transformante gezüchtet wird, um die Expression des rekombinanten Proteins zu erlauben.
Der für die Produktion des rekombinanten Proteins zu verwendende Vektor ist nicht besonders eingeschränkt. Jedoch sind Vektoren wie pGEMEX-1 (Promega) oder pEF-BOS (Nucleic Acids Res. 1990, 18 (17): S. 5322) bevorzugt. Geeignete Beispiele von Wirtszellen, in welche der Vektor eingebracht wird, schließen E. coli-Zellen, CHO-Zellen und COS-Zellen ein.
Das durch die Transformante exprimierte VEGF-D-Protein kann gereinigt werden, indem in geeigneter Weise Reinigungsbehandlungen wie Solubilisierung mit einem Homogenisator oder einem Ultraschallgerät, Extraktion durch verschiedene Puffer, Solubilisierung oder Fällung durch Säure oder Base, Extraktion oder Fällung mit organischen Lösungsmitteln, Aussalzen durch Ammoniumsulfat und andere Mittel, Dialyse, Ultrafiltration unter der Verwendung von Membranfiltern, Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie, Umkehrphasenchromatographie, Gegenstrom-Verteilungschromatographie, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, isolelektrische Fokussierung, Gelelektrophorese oder Affinitätschromatographie, bei der Antikörper oder Rezeptoren immobilisiert werden, kombiniert werden.
Wenn das rekombinante Protein einmal erhalten wurde, können Antikörper gegen dieses unter der Verwendung bekannter Verfahren hergestellt werden. Die bekannten Verfahren schließen die Herstellung polyclonaler Antikörper durch die Immunisierung von Kaninchen, Schafen oder anderen Tieren mit dem gereinigten Protein und die Herstellung monoclonaler Antikörper aus den Antikörper produzierenden Zellen von immunisierten Mäusen oder Ratten ein. Diese Antikörper werden es möglich machen, VEGF zu quantifizieren. Obwohl die so erhaltenen Antikörper so, wie sie sind, verwendet werden können, wird es wirksamer sein, humanisierte Antikörper zu verwenden, um die Immunogenität zu reduzieren. Die Verfahren der Humanisierung von Antikörpern schließen das CDR-Graft-Verfahren und das Verfahren der direkten Produktion eines menschlichen Antikörpers ein. Bei dem CDR-Transplantat-Verfahren wird das Antikörpergen aus den monoclonale Antikörper produzierenden Zellen cloniert und dessen antigener Determinantenanteil wird in einen bestehenden menschlichen Antikörper eingebaut. Bei dem Verfahren der direkten Produktion eines menschlichen Antikörpers wird eine Maus, deren Immunsystem gegen das menschliche Immunsystem ausgetauscht wurde, immunisiert, ähnlich wie bei herkömmlichen monoclonalen Antikörpern. Das VEGF-D-Protein oder sein auf diese Weise erhaltener Antikörper können dem Körper durch subkutane Injektion oder ein ähnliches Verfahren verabreicht werden.
Ein Fachmann könnte durch bekannte Verfahren nach Verbindungen suchen, die an das Protein der vorliegenden Erfindung binden.
Zum Beispiel können solche Verbindungen erhalten werden, indem aus den Zellen, von denen erwartet wird, dass sie das an das Protein der vorliegenden Erfindung bindende Protein exprimieren (wie Lunge, Dünndarm und Herzzellen von Säugern), eine cDNA-Genbank in einem Phagenvektor (wie λgt11 und ZAP) hergestellt wird, die cDNAs auf LB-Agarose exprimiert werden, die exprimierten Proteine auf einem Filter fixiert werden, das gereinigte Protein der vorliegenden Erfindung als Biotin markiertes oder Fusionsprotein mit dem GST-Protein hergestellt wird und dieses Protein mit dem vorher genannten Filter umgesetzt wird. Die gewünschten Verbindungen können dann durch Western-Blot-Verfahren unter der Verwendung von Streptavidin oder von einem anti-GST-Antikörper nachgewiesen werden (Skolnik, E. Y., Margolis, B., Mohammadi, M., Lowenstein, E., Fischer, R., Drepps, A., Ullrich, A. und Schlessinger, J. (1991) Cloning of P13 kinase-associated p85 utilizing a novel method for expression/cloning of target proteins for receptor tyrosine kinases, Cell 65: 83–90). Ein anderes Verfahren umfasst die folgenden Schritte. Exprimiere zuerst das Protein der vorliegenden Erfindung fusioniert mit der SRF-Bindedomäne oder der GAL4-Bindedomäne in Hefezellen. Stelle zweitens eine cDNA-Genbank, die cDNAs fusioniert mit der Transkriptionsaktivierungsdomäne von VP16 oder GAL4 exprimiert, aus den Zellen her, von denen erwartet wird, dass sie ein Protein exprimieren, das an das Protein der vorliegenden Erfindung bindet. Bringe drittens die cDNA in die vorstehend genannten Hefezellen ein. Isoliere viertens die aus der Genbank stammende cDNA aus den positiven Clonen. Bringe letztens die isolierte cDNA in E. coli ein, um sie exprimieren zu lassen. (Wenn ein Protein, das an das Protein der vorliegenden Erfindung bindet, in Hefezellen exprimiert wird, wird das Reportergen aktiviert und der positive Clon kann nachgewiesen werden.) Dieses Verfahren kann unter der Verwendung des Zwei-Hybrid-Systems durchgeführt werden (MATCHMAKER Two-Hybrid System, Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit oder MATCHMAKER One-Hybrid System (alle von Clontech) oder das HybriZAP Two-Hybrid Vector System (Stratagene)) (Dalton, S. und Treisman, R. (1992) Characterisation of SAP-1, a protein recruited by serum response factor to the c-fos serum response element, Cell 68: 597–612). In einer anderen Ausführungsform kann nach Bindeproteinen gesucht werden, indem aus den Zellen, von denen erwartet wird, dass sie eine Substanz wie einen Rezeptor, die an das Protein der vorliegenden Erfindung bindet, exprimieren (zum Beispiel vaskuläre Endothelzellen, Knochenmarkszellen oder Lymphgefäßzellen), eine cDNA-Genbank hergestellt wird, diese in solche Zellen wie COS-Zellen eingebracht wird, die Bindung des Proteins der vorliegenden Erfindung an sich oder markiert mit einem Radioisotop oder einer Fluoreszenz nachgewiesen wird und die Proteine, die an das Protein der vorliegenden Erfindung binden, cloniert werden (Yamasaki, K., Taga, T., Hirata, Y. Yawata, H., Kawanishi, Y., Seed, B., Taniguchi, T., Hirano, T. und Kishimoto, T. (1988) Cloning and expression of human interleukin-6 (BSF-2/IFN beta2) receptor, Science 241: 825–828, Fukunaga, R., Ishizaka-Ikeda, E., Seto, Y. und Nagata, S. (1990) Expression cloning of a receptor for murine granulocyte colony-stimulating factor, Cell 61: 341–350). Noch ein anderes Verfahren umfasst das Aufbringen des Kulturüberstandes oder des zellulären Extraktes der Zellen, von denen erwartet wird, dass sie ein Protein exprimieren, das an das Protein der vorliegenden Erfindung bindet, auf eine Affinitätssäule, an der das Protein der vorliegenden Erfindung immobilisiert worden ist, und das Reinigen der spezifisch an die Säule gebundenen Proteine. Darüber hinaus kann eine DNA, die das Protein codiert, das an das Protein der vorliegenden Erfindung bindet, erhalten werden, indem die Aminosäuresequenz des Bindeproteins bestimmt wird, auf der Sequenz beruhende Oligonucleotide synthetisiert werden und eine cDNA-Genbank mit den Oligonucleotiden als Sonden durchsucht wird.
Weiterhin kann nach Verbindungen, die an das Protein der vorliegenden Erfindung binden, gesucht werden, indem Verbindungen, eine natürliche Substanzbank oder eine zufällige Phagenpeptid-Display-Genbank mit dem immobilisierten Protein der vorliegenden Erfindung in Kontakt gebracht und die an das Protein gebundenen Moleküle nachgewiesen werden. Nach diese Verbindungen kann auch durch eine Hochdurchsatz-Durchmusterung unter der Verwendung von Technologien der kombinatorischen Chemie gesucht werden (Wrighton, N. C., Farrell, F. X., Chang, R., Kashyap, A. K., Barbone, F. P., Mulcahy, L. S., Johnson, D. L., Barrett, R. W., Jolliffe, L. K. und Dower, W. J., Small peptides as potent mimetics of the protein hormone erythropoietin, Science (Vereinigte Staaten) 26. Jul. 1996, 273: 458–464, Verdine, G. L., The combinatorial chemistry of nature, Nature (England) 7. Nov. 1996, 384: 11–13, Hogan, J. C. Jr., Directed combinatorial chemistry, Nature (England) 7. Nov. 1996, 384: 17–19).
VEGF-D der vorliegenden Erfindung kann für Gentherapie verwendet werden, indem das VEGF-D-Gen in den Körper eines Patienten mit einer VEGF-D-Defizienz eingebracht oder das Gen in dem Körper exprimiert wird. Eine Antisense-DNA des VEGF-D-Gens kann auch verwendet werden, um die Expression des Gens selbst zu hemmen, wodurch die pathologische Neovaskularisation unterdrückt wird.
Unter den vielen zugänglichen Verfahren, das VEGF-D-Gen oder dessen Antisense-DNA in den Körper einzubringen, sind das Retrovirus-Verfahren, das Liposomen-Verfahren, das kationische Liposomen-Verfahren und das Adenovirus-Verfahren bevorzugt.
Um diese Gene im Körper zu exprimieren, können die Gene in einen geeigneten Vektor integriert und mittels des Retrovirus-Verfahrens, des Liposomen-Verfahrens, des kationischen Liposomen-Verfahrens oder des Adenovirus-Verfahrens in den Körper eingebracht werden. Obwohl die zu verwendenden Vektoren nicht besonders eingeschränkt sind, werden solche Vektoren wie pAdex1cw und pZIPneo bevorzugt.
Die vorliegende Erfindung kann auch zur Diagnose von Krankheiten, die durch Abnormalitäten des VEGF-D-Gens hervorgerufen werden, eingesetzt werden, um zum Beispiel mittels PCR eine Abnormalität der Nucleotidsequenz des VEGF-D-Gens nachzuweisen.
Weiterhin können das VEGF-D-Protein oder seine Agonisten entsprechend der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um Wunden zu heilen, kollaterale Gefäßbildung zu fördern und die Hematopoese durch die hämatopoetischen Stammzellen zu unterstützen, indem der Vorteil der angiogenen Wirkung des VEGF-D-Proteins genutzt wird. Die Antikörper gegen das VEGF-D-Protein oder seine Antagonisten können als therapeutische Mittel für die pathologische Neovaskularisierung, lymphatische Dysplasie, Dyshematopoese oder Ödeme, die aus verschiedenen Ursachen entstanden sind, verwendet werden. Die anti-VEGF-D-Antikörper können für die Diagnose von Krankheiten, die aus einer abnormalen Produktion von VEGF-D resultieren, verwendet werden, indem VEGF-D quantifiziert wird.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 zeigt das Verhältnis zwischen dem VEGF-D-Gen, den EST-Sequenzen und den für die Clonierung verwendeten Primern.
2 vergleicht die Aminosäuresequenzen eines EST (H24828) und VEGF-C.
3 vergleicht die von dem VEGF-D-Gen und von den bekannten Genen der VEGF-Proteinfamilie abgeleiteten Aminosäuresequenzen.
4a zeigt den Hydrophobizitätsplot von VEGF-D. 4b zeigt die Vorhersage der Spaltungsstelle des VEGF-D-Signalpeptids.
Beste Art und Weise der Durchführung der Erfindung
Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung im Detail, sollen aber nicht als Einschränkung des Umfanges der Erfindung aufgefasst werden.
Beispiel 1. Homologiesuche nach dem TFASTA-Verfahren
Die Sequenz CGPNKELDENTCQCVC (SEQ ID NR. 3) wurde auf der Basis der Konsensus-Sequenz, die in der BR3P (Balbiani-Ring 3-Protein)-Wiederholung am C-Terminus von VEGF-C gefunden wurde, entworfen. Die gesamten EST- und STS-Sequenzen in der Genbank-Datenbank (wie am 29. Februar 1996) wurden dann mittels des TFASTA-Verfahrens durchsucht (Person und Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444–2448 (1988)). Die verwendeten Suchbedingungen sind nachstehend gezeigt (Tabelle 1).
Tabelle 1
Als Ergebnis wurde ein EST (Zugangs-Nr. H24828) gefunden, der die Konsensus-Sequenz codieren könnte. Die Sequenz ist einer der ESTs, die durch das WashU-Merck-EST-Projekt erfasst wurden, und neun von 16 Aminosäureresten waren identisch. Eine weitere Suche nach UniGene mittels NCBI basierend auf dieser Sequenz ergab, dass von fünf erfassten Sequenzen (T64149, H24780, H24633, H24828 und T64277 (wie am 1. März 1996)), einschließlich des vorstehenden EST, angenommen wurde, dass sie von dem gleichen Gen stammen. T64277 und T64149 ebenso wie H24828 und H24780 sind die Kombination der 5'-Sequenz und der 3'-Sequenz der gleichen Clone und die Länge der Insertion in beiden dieser Clone betrug 0,9 kb (1).
Die Übersetzung der H24828-Sequenz in eine Proteinsequenz in dem Rahmen, in dem die Homologie gefunden wurde, legte nahe, dass diese Sequenz 104 C-terminale Aminosäurereste codiert. Beim Vergleich dieser Aminosäuresequenz mit dem C-Terminus von VEGF-C waren 28 von 104 Aminosäuren (27%) identisch. Darüber hinaus waren die für die Erhaltung der Proteinstruktur wichtigen Aminosäuren wie Cystein und Prolin gut konserviert ( 2). Konservierte Sequenzen sind in einem schwarzen Kasten gezeigt.
Beispiel 2. cDNA-Clonierung aus einer Genbank
Primer für 5'-RACE und 3'-RACE (5'-RACE-Primer: 5'-AGGGATGGGGAACTTGGAACGCTGAAT-3' (SEQ ID NR. 4), 3'-RACE-Primer: 5'-GATCTAATCCAGCACCCCAAAAACTGC-3' (SEQ ID NR. 5)) wurden entworfen ( 1). Eine doppelsträngige cDNA wurde unter der Verwendung von reverser Transkriptase aus menschlicher aus der Lunge stammender polyA-RNA synthetisiert. Unter der Verwendung von Marathon-Ready-cDNA aus der Lunge (Clontech) wurde dann eine PCR durchgeführt, wobei eine Adaptor-cDNA an beide Enden als Matrizen-cDNA ligiert wurde und die vorstehend genannten Primer und ein Adaptor-Primer (AP-1-Primer: 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (SEQ ID NR. 6), 1) als Primer verwendet wurden. Die vorher genannte Adaptor-cDNA enthält die Bereiche, mit denen die Adaptor-Primer AP-1 und AP-2 hybridisieren. Die PCR wurde in einer solchen Art und Weise durchgeführt, dass das System einer Behandlung bei 94°C für 1 min ausgesetzt wurde; fünf Zyklen Behandlung bei 94°C für 30 sec und bei 72°C für 4 min; fünf Zyklen Behandlung bei 94°C für 30 sec und bei 70°C für 4 min; dann 25 Zyklen Behandlung bei 94°C für 20 sec und bei 68°C für 4 min. (TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) und der beigelegte Puffer wurden als Taq-Polymerase anstelle des Advantage KIenTaq Polymerase Mix verwendet). Als Ergebnis wurden 1,5 kb-Fragmente an der 5'-Region und 0,9 kb-Fragmente an der 3'-Region amplifiziert. Diese Fragmente wurden mit dem pCR-Direct Cloning System (Clontech), CR-TRAP Cloning System (GenHunter) und dem pT7Blue-T-Vektor (Novagen) cloniert. Als das 5'-RACE-Fragment in den pCR-Direct-Vektor cloniert wurde, wurde das Fragment wiederum unter der Verwendung von 5'-CTGGTTCGGCCCAGAACTTGGAACGCTGAATCA-3' (SEQ ID NR. 7) und 5'-CTCGCTCGCCCACTAATACGACTCACTATAGG-3' (SEQ ID NR. 8) als Primer amplifiziert.
Beispiel 3. Nucleotidsequenzanalyse
Der ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit mit der Amplitaq DNA-Polymerase FS und der 377 A DNA Sequencer (ABI) wurden für die DNA-Sequenzierung verwendet. Die verwendeten Primer sind die Primer in den Vektoren (5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3' (SEQ ID NR. 9), 5'-CCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3' (SEQ ID NR. 10)), der AP-2-Primer (5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3' (SEQ ID NR. 11)) und 10 Primer in der nachstehend gezeigten Sequenz (Tabelle 2).
Tabelle 2
Die Bestimmung der Nucleotidsequenz des 1,5 kb-Fragmentes an der 5'-Seite und des 0,9 kb-Fragmentes an der 3'-Seite ergab, dass die Sequenz des überlappenden Bereiches identisch war, was bestätigte, dass die 5'-seitigen und 3'-seitigen cDNAs des gewünschten Gens erhalten wurden. Die Bestimmung der gesamten Nucleotidsequenz der cDNA ergab, dass dieses neue Gen eine volle Länge von 2 kb aufweist und ein aus 354 Aminosäurenresten bestehendes Protein codieren kann (SEQ ID NR. 1 und SEQ ID NR. 2). 1 zeigt die Verwandtschaft zwischen diesem Gen und den in der Genbank-Datenbank erfassten EST-Sequenzen. Der Vergleich der Aminosäuresequenz mit anderen Proteinen der VEGF-Familie ergab, dass die Aminosäuren, die zwischen den Proteinen der Familie gut konserviert sind, auch in diesem neuen Gen konserviert sind und dass dieses Gen daher offensichtlich ein neues Mitglied der VEGF-Familie darstellt (3). In 3 bezeichnet HSVEGF menschlichen VEGF; HSVEGF-D, HSVEGF-C und HSVEGF-B bezeichnen menschliche VEGF-Homologe (menschlicher VEGF-D, menschlicher VEGF-C bzw. menschlicher VEGF-B); HSPDGF-A bezeichnet menschlichen PDGF-A; HSPDGF-B bezeichnet menschlichen PDGF-B; und HSP1GF2 bezeichnet menschlichen P1GF2. Die konservierten Sequenzen sind in einem schwarzen Kasten gezeigt. Da VEGF-D zu VEGF-C, das als Flt4-Ligand cloniert wurde, in hohem Maße homolog ist, wurde angenommen, dass es ein Ligand von einem Flt-4-ähnlichen Rezeptor ist.
Nach der Herleitung der Signalpeptid-Spaltstelle (4b) durch den Hydrophobizitätsplot (4a) und durch das Verfahren von von Heijne (von Heijne, G., Nucleic Acids Res. 14: 4683–4690 (1986)) können 21 N-terminale Aminosäurereste als Signalpeptid abgespalten werden und sie können auch eine zusätzliche Prozessierung wie VEGF-C durchmachen.
Beispiel 4. Northern-Blot-Analyse
Ein 1 kb-Fragment, welches durch Spaltung mit EcoRI aus dem in den pCR-Direct-Vektor subclonierten 5'-Fragment herausgeschnitten worden war, wurde mit [α-³²P]dCTP markiert und als Sonde verwendet. Die Markierung wurde durch zufälliges Priming unter der Verwendung von Ready-to go-DNA-Markierungskügelchen (Pharmacia) durchgeführt. Die Hybridisierung wurde in ExpressHyb-Hybridization Solution (Clontech) mittels des üblichen Verfahrens unter der Verwendung von Multipe Tissue Northern (MTN) Blot-Human, Human II, fötalen Human Fetal und Human Cell lines (Clontech) durchgeführt. Eine eindeutige Expression wurde in der Lunge, dem Herzen und dem Darm beobachtet. Eine schwache Expression wurde in Skelettmuskeln, in der Gebärmutter, im Colon und in der Bauchspeicheldrüse beobachtet. Das offenbare Molekulargewicht der mRNA betrug 2,2 kb und das clonierte Fragment schien fast die gesamte Länge des Gens auszumachen.
Beispiel 5. VEGF-D-Protein-Expression in E. coli
Die zwei Primer 5'-TCCAGATCTTTTGCGGCAACTTTCTATGACAT-3' (SEQ ID NR. 22) und 5'-CAGGTCGACTCAAACAGGCACTAATTCAGGTAC-3' (SEQ ID NR. 23) wurden synthetisiert, um den Bereich, der dem 89. bis 181. Aminosäurerest der menschlichen VEGF-cDNA entspricht, zu amplifizieren. Das auf diese Weise erhaltene DNA-Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen BglII und SalI gespalten und unter Verwendung des Ligierungskits II (Takara Shuzo Co., Ltd) mit dem Plasmid pQE42 (QIAGEN), das mit den Restriktionsenzymen BamHI und SalI gespalten worden war, ligiert. Das resultierende Plasmid wurde in E. coli SG19003[pREP4] (QIAGEN) eingebracht und ein Plasmid, welches, wie konstruiert, ohne jegliche Mutation erhalten wurde, wurde ausgewählt (pQE42-BS3). Das Plasmid pQE42-BS3 wurde in E. coli BL21 (Invitrogen) eingebracht und in 10 ml L Broth, die 100 mg/l Bicucillin (Ampicillin-Natrium für Injektionen, Meiji Seika Kaisha, Ltd.) enthielt, gezüchtet. Anschließend wurden 200 ml frische L Broth mit der Kultur beimpft. Nach einer Inkubation für 1,5 Stunden bei 37°C wurde IPTG bis zu 3 mM zugegeben und die Kultur weitere fünf Stunden bei 37°C inkubiert. Nach der Ernte der Zellen wurde ein Protein mittels einer Ni-NTA-Säule nach dem Protokoll des QIAexpress TypII-Kits gereinigt.
Beispiel 6. Expression des DHFR-VEGF-D-Fusionsproteins in E. coli
Der Bereich, der dem 89. bis 181. Aminosäurerest der menschlichen VEGF-cDNA entspricht, wurde mit den gleichen Primern wie den in Beispiel 5 verwendeten amplifiziert. Das auf diese Weise erhaltene DNA-Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen BglII und SalI gespalten. Das Fragment wurde dann unter Verwendung des Ligierungskits II (Takara Shuzo Co., Ltd) mit dem Plasmid pQE40 (QIAGEN), das mit den Restriktionsenzymen BamHI und SalI gespalten worden war, ligiert. Das resultierende Plasmid wurde in E. coli SG19003[pREP4] (QIAGEN) eingebracht und ein Plasmid, welches, wie konstruiert, ohne jegliche Mutation erhalten wurde, wurde ausgewählt (pQE40-BS3). Das Plasmid pQE40-BS3 wurde in E. coli BL21 (Invitrogen) eingebracht und in 10 ml L Broth, die 100 mg/l Bicucillin (Ampicillin-Natrium für Injektionen, Meiji Seika Kaisha, Ltd.) enthielt, gezüchtet. Anschließend wurden 200 ml frische L Broth mit der Kultur beimpft. Nach einer Inkubation für 1,5 Stunden bei 37°C wurde IPTG bis zu 3 mM zugegeben und die Kultur weitere fünf Stunden bei 37°C inkubiert. Nach der Ernte der Zellen wurde ein DHFR-VEGF-D-Fusionsprotein mittels einer Ni-NTA-Säule nach dem Protokoll des QIAexpress TypII-Kits gereinigt.
Beispiel 7. Clonierung der Maus-VEGF-D-cDNA
Zwei Hybond N⁺-(Amersham) Filter (20 × 22 cm), auf die 1,5 × 10⁵ PBE einer Genbank aus 5'-Bereich-cDNA der Lunge von Maus aufgebracht worden waren, wurden hergestellt. Eine Gradientenhybridisierung von 68°C bis 55°C wurde für 2 Stunden in ExpressHyb-Hybridization Solution (Clontech) durchgeführt, wobei als Sonde ungefähr 50 ng eines PvuII-Fragmentes von menschlichem VEGF-D verwendet wurden, das unter der Verwendung von Ready-to go-DNA Labeling Beads (-dCTP) (Pharmacia) mit α³²P-dCTP (Amersham) markiert wurde. Die Filter wurden viermal für 10 min bei Raumtemperatur in 2 × SSC, 0,05% SDS gewaschen und dann für 3 min bei 45°C in 0,1 × SSC, 0,1% SDS. Die gewaschenen Filter wurden über Nacht bei –80°C unter der Verwendung von HyperFilm MP (Amersham) und Verstärkerfolien exponiert. Positive Clone wurden auf die gleiche Art und Weise wie vorstehend einer zweiten Durchmusterung unterzogen, um einen einzelnen Clon zu isolieren. Isolierte Lambda-DNAs wurden unter der Verwendung eines QIAGEN-Lambda MAX I Kit (Qiagen) aus den Plattenlysaten gereinigt. Insertions-DNAs wurden mit EcoRI herausgeschnitten und in pUC118 EcoRI/BAP (Takara Shuzo Co., Ltd.) subcloniert. Die Nucleotidsequenz wurde dann mit einem ABI377-Sequenziergerät bestimmt (Perkin Elmer). Die die volle Länge des Maus-VEGF-D codierende cDNA wurde mit zwei der erhaltenen Clone, die sich gegenseitig überlappten, rekonstruiert. SEQ ID NR. 24 zeigt die Nucleotidsequenz der Maus-VEGF-D-cDNA und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz.
Beispiel 8. Clonierung der Ratten-VEGF-D-cDNA
Zwei Hybond N⁺-(Amersham) Filter (20 × 22 cm), auf die 1,5 × 10⁵ PBE einer Genbank aus 5'-Bereich-cDNA der Lunge von Ratte aufgebracht worden war, wurden hergestellt. Eine Gradientenhybridisierung von 68°C bis 55°C wurde für 2 Stunden in ExpressH.Fyb-Hybridization Solution (Clontech) durchgeführt, wobei als Sonde ungefähr 1 μg eines Fragmentes verwendet wurde, das 1–782 bp der VEGF-D-cDNA von Maus enthielt, das unter der Verwendung von Ready-to go-DNA Labeling Beads (-dCTP) (Pharmacia) mit α³²P-dCTP (Amersham) markiert wurde. Die Filter wurden viermal für 10 min bei Raumtemperatur in 2 × SSC, 0,05% SDS gewaschen und dann für 3 min bei 45°C in 0,1 × SSC, 0,1% SDS. Die gewaschenen Filter wurden über Nacht bei –80°C unter der Verwendung von HyperFilm MP (Amersham) und Verstärkerfolien exponiert. Positive Clone wurden auf die gleiche Art und Weise wie vorstehend einer zweiten Durchmusterung unterzogen, um einen einzelnen Clon zu isolieren. Der isolierte positive Clon wurde unter der Verwendung von E. coli SOLAR (Stratagene) und dem Helferphagen ExAssist (Stratagene) ausgeschnitten und in pBluescript transferiert, dann wurde die Sequenz mit einem AB1377-Sequenziergerät bestimmt (Perkin Elmer). Bei der Sequenz schien es sich um die VEGF-D-cDNA von Ratte zu handeln, aber sie enthielt kein Terminationscodon.
Um die C-terminate cDNA, die nicht erhalten worden war, zu erhalten, wurde eine PCR unter der Verwendung der Marathon-Ready-Ratten-Nieren-cDNA (Clontech) als Matrize und des 5'-Primers GCTGCGAGTGTGTCTGTAAA (SEQ ID NR. 26) und des 3'-Primers GGGTAGTGGGCAACAGTGACAGCAA (SEQ ID NR. 27) mit 40 Zyklen von 94°C für 15 sec, 55°C für 30 sec und 72°C für 2 min durchgeführt. Nachdem das auf diese Weise erhaltene Fragment in den pGEM-T-Vektor (Promega) subcloniert worden war, wurde die Nucleotidsequenz mit einem ABI377-Sequenziergerät bestimmt (Perkin Elmer). Der resultierende Clon enthielt den C-Terminus des VEGF-D von Ratte. Basierend auf den Ergebnissen der Sequenzierungen des durch Plaquehybridisierung erhaltenen Clons und des durch PCR erhaltenen Clons wurde die volle Länge der VEGF-D-Sequenz von Ratte bestimmt. SEQ ID NR. 25 zeigt die bestimmte Nucleotidsequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz.
Industrielle Anwendbarkeit
In der vorliegenden Erfindung wurden ein neuartiges Protein (VEGF-D) mit signifikanter Homologie zu VEGF-C und sein Gen isoliert. VEGF-D scheint in die mit Diabetes verbundene pathologische Neovaskularisation, rheumatoider Arthritis, das Wachstum solider Tumore, die Differenzierung und Proliferation von Blutzellen, die Bildung von lymphatischen Gefäßen und die Bildung von Ödemen, die von verschiedenen Ursachen herrühren, ebenso wie in die normale Neovaskularisation im Entwicklungsstadium involviert zu sein. Das Gen der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um Krankheiten zu diagnostizieren, die durch Abnormalitäten des VEGF-D-Gens verursacht werden, und für Gentherapie bei VEGF-D-Defizienz. Das VEGF-D-Protein, das durch die Expression des Gens der vorliegenden Erfindung erhalten wird, kann für die Heilung von Wunden, die Förderung der kollateralen Gefäßbildung und die Unterstützung der hematopoetischen Stammzellen-Proliferation verwendet werden. Die Antikörper oder Inhibitoren gegen das VEGF-D-Protein können zur Behandlung von Angiodysplasie und Lymphangiodysplasie in Verbindung mit Entzündungen, von Ödemen, die aus verschiedenen Ursachen entstehen, von Dyshematopoese und als neues Antikrebsmittel zur Behandlung von pathologischer Neovaskularisation verwendet werden. Das VEGF-D-Protein und seine Antikörper können bei der Diagnose von Krankheiten, die aus einer abnormalen Produktion von VEGF-D resultieren, von Nutzen sein.
Sequenzprotokoll

Claims

DNA-Molekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) einem DNA-Molekül, das ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NR: 1 dargestellt codiert; (b) einem DNA-Molekül mit der codierenden Sequenz wie dargestellt in SEQ ID NR: 2; (c) einem DNA-Molekül, dessen komplementärer Strang mit einem DNA-Molekül wie in (a) oder (b) definiert hybridisiert und welches ein Polypeptid mit VEGF-D-Aktivität codiert; oder (d) einem DNA-Molekül, dessen komplementärer Strang mit einem DNA-Molekül wie in (a) oder (b) definiert hybridisiert und zu mindestens 70% identisch dazu ist und welches ein Polypeptid mit VEGF-D-Aktivität codiert; oder der komplementäre Strang solch eines DNA-Moleküls.
Vektor, enthaltend ein DNA-Molekül nach Anspruch 1.
Vektor nach Anspruch 2, welcher ein Expressionsvektor ist, der die Expression des DNA-Moleküls in prokaryontischen und eukaryontischen Wirtszellen erlaubt.
Transformante Zelle, welche den Vektor nach Anspruch 2 oder 3 trägt.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das von dem DNA-Molekül nach Anspruch 1 codiert wird, umfassend das Züchten der transformanten Zelle nach Anspruch 4.
Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die von einem DNA-Molekül nach Anspruch 1 codiert wird oder durch das Verfahren nach Anspruch 5 erhältlich ist, wobei das Polypeptid, welches durch das Verfahren nach Anspruch 5 erhältlich ist, von dem DNA-Molekül nach Anspruch 1 codiert wird, welches in der transformanten Zelle nach Anspruch 4 enthalten ist.
Antikörper gegen das Polypeptid nach Anspruch 6.
Inhibitor der Expression eines DNA-Moleküls nach Anspruch 1, welcher ein Antisense-DNA-Molekül ist, welches spezifisch an ein DNA-Molekül nach Anspruch 1 hybridisiert.
Zusammensetzung, umfassend ein DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder einen Vektor nach Anspruch 2 oder 3.
Zusammensetzung, umfassend ein Polypeptid nach Anspruch 6.
Zusammensetzung, umfassend einen Antikörper nach Anspruch 7.
Zusammensetzung, umfassend ein Antisense-DNA-Molekül nach Anspruch 8.
Zusammensetzung nach Anspruch 9 zur Verwendung in der Gentherapie.
Zusammensetzung nach Anspruch 10 zur Heilung von Wunden, zur Förderung der kollateralen Gefäßbildung oder zur Unterstützung der Hematopoese oder hematopoetischer Stammzellen.
Zusammensetzung nach Anspruch 11 für die Behandlung von pathologischer Neovaskularisation, lymphatischer Dysplasie, Dyshematopoese oder Ödemen.
Zusammensetzung nach Anspruch 12 zur Hemmung der Expression des VEGF-D-Gens, wobei pathologische Neovaskularisation unterdrückt wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 11 zur Diagnose abnormaler Produktion von VEGF-D.
Screen-Verfahren für eine Verbindung, welche an ein Polypeptid nach Anspruch 6 bindet, umfassend den Schritt des Bindens eines Polypeptids nach Anspruch 6 an eine Testprobe.