DE4344397A1 - Humanes zirkulierendes Cytokin CC-1 - Google Patents

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid aus der Klasse der Cytokine, Cytokin CC-1 sowie dessen biologisch aktive Fragmente und/oder Derivate, ein für das Cytokin CC-1 oder für seine biologisch aktiven Fragmente kodierendes Poly­ nukleotid, insbesondere eine cDNA, ein Arzneimittel enthaltend das erfindungsgemäße Peptid, ein Diagnostikmittel, Verwendung von Cytokin CC-1 für zweite medizinische Indikationen sowie eine Nucleinsäuresonde hybridisierend für ein Polynukleotid kodierend für Cytokin CC-1 oder eines seiner Fragmente.

Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß sich aus humanem Hämofiltrat ein Cytokin CC-1 isolieren läßt. Das Cytokin hat die nachstehend angegebene Aminosäuresequenz

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Auch Fragmente des Cytokins CC-1 weisen biologische Aktivität auf. Die Fragmente sind erhältlich durch dem Fachmann bekannte Methoden, beispielsweise durch Abdauung mit Peptidasen, insbe­ sondere Endoproteasen. Auch Fragmentierung des erfindungsge­ mäßen Peptids mittels peptidbindungspaltender chemischer Rea­ genzien, insbesondere Cyanogenbromid liefert auch biologisch aktive Fragmente.

Das erfindungsgemäße Peptid ist erhältlich durch ein Isola­ tionsverfahren ausgehend von humanem Hämofiltrat.

Das humane Hämofiltrat wird gegebenenfalls mit Wasser verdünnt und angesäuert. Der pH-Wert beträgt vorzugsweise 1,5 bis 3,5, insbesondere 2,5 bis 3,0. Danach wird das Hämofiltrat mit einem Kationenaustauscher behandelt, beispielsweise einem mit Sulfonsäuregruppen modifizierten Trägermaterial (Fractogel medium SO₃⁻ der Firma Merck). Die an den Kationenaustauscher gebundenen Peptide werden mit relativ hoch konzentrierter Salzlösung in einem sauren pH-Bereich, der dem obigen ent­ spricht, eluiert. Die Ionenstärke der Elutionslösung ent­ spricht dabei ungefähr einer 0,7 bis 1,3 molaren Natriumchlo­ ridlösung.

Das aufgefangene Eluat wird mit einem peptidfällenden Reagenz, beispielsweise Ammoniumsulfat versetzt. Die Ausfällung der Peptide erfolgt vorzugsweise bei niedrigeren Temperaturen, insbesondere im Bereich von 4 bis 10°C. Das so gewonnene Prä­ zipitat wird von der überstehenden Lösung befreit, in Wasser aufgenommen und danach mit einem niederen peptidfällenden Alkohol, wie Isopropanol versetzt. Darin schließt sich eine weitere Kationenaustauscher-Chromatographie an. Diese Chroma­ tographie ist vorzugsweise eine Gradientenelutions-Chromato­ graphie mit einem Puffer geringer Ionenstärke bis zu einem Puffer mit höherer Ionenstärke entsprechend ungefähr einer Ionenstärke von 0,7 bis 1,3 M NaCl.

Die biologisch aktiven Fraktionen werden gepoolt und mittels präparativer Umkehrphasen-Chromatographie an mit C4 modifi­ zierten Trägermaterialien weitergereinigt. Gegebenenfalls erfolgen weitere chromatographische Reinigungsschritte.

Die durch die chromatographische Reinigung erhaltene Substanz wurde der Strukturbestimmung zugeführt. Die Sequenzanalyse erfolgte über einen Edman-Abbau des Peptids sowie der Spalt­ produkte und wurden über einen ABI 473 A Sequenzer durchge­ führt.

Aus der erfindungsgemäßen Peptidsequenz läßt sich ein Polynu­ kleotid ableiten, kodierend für das Cytokin CC-1 (Fig. 1).

Das Polynukleotid ist insbesondere eine cDNA, die sowohl als Ausgangspunkt einer gentechnischen Herstellung des Cytokins CC-l dienen kann, wie auch als analytisches Werkzeug zum Nach­ weis des Auftretens von für das Protein kodierender DNA oder mRNA.

Dabei können entsprechende Derivate als Hybridisierungssonden eingesetzt werden. Beispielsweise weist die cDNA, die für ein Fragment des erfindungsgemäßen Peptids kodiert, die nachste­ hende Sequenz auf

TAT GAG ACC AGC AGC CAG TGC TCC AAG CCC GGA ATT GTC TTC ATC ACC AAA AGG GGC CAT TCC GTC TGT ACC AAC CCC AGT GAC AAG TGG GTC CAG GAC TAT ATC AAG GAC ATG AAG GAG AAC

Neben der gentechnischen Herstellung ist auch die aufbauende Totalsynthese an üblichen Festphasen im Sinne der Merrifield- Synthese möglich. Die Synthesenstrategie und der Aufbau des Peptids mit den entsprechend geschützten Aminosäuren sind dem Fachmann bekannt.

Das erfindungsgemäße Peptid kann als Arzneimittel Verwendung finden. Seine biologische Aktivität entspricht der eines Cyto­ kins. Es ist daher geeignet, als Arzneimittel bei den in An­ spruch 7 genannten Indikationen eingesetzt zu werden. Das erfindungsgemäße Peptid kann dabei in für Peptide üblicher Weise parenteral, intravenös oder intramuskulär oder intrana­ sal, bukal verabreicht werden. Die Menge an zu verabreichenden Peptid beträgt zwischen 10 und 3000 µg pro Darreichungsein­ heit.

Das erfindungsgemäße Diagnostikmittel enthält poly- oder mono­ klonale Antikörper gegen das erfindungsgemäße Peptid gegebe­ nenfalls in fluoreszenz- oder radioaktivmarkierter Form um in an sich bekannten ELISA oder RIA Assays eingesetzt zu werden.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher be­ schrieben.

Beispiel 1

500 l humanes Hämofiltrat wurden mit Wasser auf 2000 l ver­ dünnt und mit konzentrierter HCl der pH auf 2,7 eingestellt. Nach Auftrag auf eine Amicon-Vantage Säule (Füllmaterial Merck Fractogel medium SO₃⁻) wurden die gebundenen Peptide mit 1 M NaCl pH 3,0 eluiert.

Das Eluat (7 l) wurde mit Ammoniumsulfat versetzt und über Nacht die Peptide bei 4°C ausgefällt. Das Peptidpräzipitat wurde über einen Büchner-Filter filtriert.

Das gewonnene Präzipitat wurde in 2 l Wasser gelöst und mit 4,5 Teilen Isopropanol versetzt. Die ausgefällten Peptide wurden erneut über einen Büchner-Filter abfiltriert.

Das Präzipitat nach Isopropanol-Fällung wurde in 4 l Wasser gelöst und ein pH von 3,0 mit HCl eingestellt. Nach Auftrag auf einen Kationenaustauscher (Säule: Amicon Vantage) wurde die Säule eluiert und die Fraktionen gesammelt (Chromatogramm siehe Fig. 2).

Chromatographie-Bedingungen

Puffer A: 10 mmol Natriumdihydrogenphosphat pH 3,0
Puffer B: Puffer A mit 1 M NaCl
Gradient: 0-100% B in 60 min.
Fluß: 40 ml/min
Detektion: 280 nm
Chromatographieanlage: Biopilot (Pharmacia)
Fraktionen: à 2 min ab Start des Gradienten

Die Fraktionen 31 bis 34 wurden zur weiteren Behandlung ver­ einigt.

Die gepoolten Fraktionen 31 bis 34 wurden sukzessive in zwei Chromatographie-Läufen über eine präparative Reverse-Phase Säule aufgetrennt (Chromatogram siehe Fig. 3a und b).

Chromatographie -Bedingungen

Säule: 3 cm×12,5 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Parcosil RP-C4 25-45, 300 A
Puffer A: 0,01 N HCl
Puffer B: Puffer A mit 30% Methanol und 50% Isopropanol
Gradient: 0-100% B in 60 min.
Fluß: 15 ml/min
Detektion: 280/254 nm
Chromatographieanlage: BioCAD (Perseptive)
Fraktionen: à 1 min ab Start des Gradienten

Die Fraktionen 22 und 23 aus dem ersten präparativen Lauf sowie die Fraktion 24 des zweiten Laufes wurden gepoolt und das Lösungsmittel über einen Rotationsverdampfer abgezogen. Danach wurden die Fraktionen über eine semipräparative RP-C4 Säule aufgetrennt (Chromatogram siehe Fig. 4).

Chromatographie-Bedingungen

Säule: 1 cm×12,5 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Parcosil RP-C4 5 µ, 300 A
Puffer A: 0,1% TFA
Puffer B: Puffer A mit 80% Acetonitril
Gradient: 0-30% B in 60 min.
Fluß: 2 ml/min
Detektion: 214 nm
Chromatographieanlage: Kontron 322
Fraktionen: à 1 min ab Start des Gradienten

Die Fraktion 33 und 34 enthält die zu über 95% aufgereinigte Substanz, die im folgenden in ihrer Struktur aufgeklärt wurde:

Beispiel 2 Sequenz-Bestimmung

Edman-Abbau des Peptids sowie der Spaltprodukte erfolgte über einen ABI 473 A Sequenzer nach Auftragen auf eine Polybrene- Membran in Mengen zwischen 100 und 400 pmol unter Verwendung des Standard-Programmes.

Bestimmung von Cysteinen

¹⁴C-Carboxymethylierung und nachfolgende Aufreinigung über analytische Vydac C18 RP-Säule (4,6 mm×25 cm). Detektion der carboxymethylierten Fraktion im Radioaktivitätsmonitor.

Nachfolgend Lys-C-Spaltung von 50% des carboxymethylierten Peaks mit der Endopeptidase Lys-C. Die Spaltung erfolgte bei 37°C über 3 Stunden in den vom Hersteller (Boehringer, Mann­ heim) angegebenen Puffern bei einem Verhältnis von Enzym zu Peptid von 1 : 25. Die Spaltprodukte wurden über RP-Chromatogra­ phie mit einer analytischen Vydac-C18-Säule getrennt. Sammeln der einzelnen Peaks und Sequenzierung zur Komplettbestimmung der Sequenz.

Bestimmung des c-Terminus

Die Spaltung der restlichen 50% des carboxymethylierten Pep­ tids erfolgt mit Chymostrypsin in den vom Hersteller (Boehrin­ ger, Mannheim) angegebenen Puffern bei einem Verhältnis von Enzym zu Peptid von 1 : 25, die nachfolgende Aufreinigung über analytische Vydac C18 RP-Säule (4,6 mm×25 cm). Die einzelnen Peaks werden gesammelt und zur Komplettbestimmung der Sequenz analysiert.

Massenbestimmung

Massenbestimmung des Gesamtpeptids erfolgt mit Sciex API III sowie der Fragmente nach Lys-C- und Chymotrypsinspaltung.

Sequenzierung und Massenbestimmung ergeben die oben angegebene Sequenz mit einer Masse von 8689 Dalton.

Ein Datenbankvergleich wurde durchgeführt an Swiss-Prot und EMBL-Peptid und Nukleinsäuredatenbank. Sequenzhomologie zu verschiedenen Mitgliedern der Superfamilie der Intercrine wurden festgestellt, dabei höchste Homologie zu Macrophage Inflammatory Protein MIP I alpha und MIP I beta.

Beispiel 3 Bestimmung der cDNA Klonierung und Charakterisierung eines partiellen humanen Cytokin CC-1 cDNA-Fragmentes

Aus humanen Nebennierengewebe wurde mit Hilfe eines automati­ schen Nukleinsäureextraktors (ABI,340) Gesamt-RNA präpariert.

Aus 5 µg dieser RNA wurde die mRNA unter Verwendung von MMLV- RTase (Gibco-BRL) und eines synthetischen Oligo(dT)-Primers (UNIP-2, CCTGAATTCTAGAGCTCA(T)₁₇) in cDNA-Erststrang umge­ schrieben. Parallel dazu wurden ausgehend von der bekannten Peptid-Sequenz zwei "degenerierte PCR-Primerpaare syntheti­ siert, welche sämtliche Codierungsmöglichkeiten für die ent­ sprechenden Aminosäuresequenzen enthielten (siehe separates Blatt "CC-1-Aminosäuresequenz und abgeleitete PCR-Primer"). Das erste Primerpaar (CC-1-2/1, CC-1-2/2) war dabei in bezug auf die Aminosäuresequenz eher N-terminal lokalisiert, während das zweite Primerpaar (CC-1-2/3, CC-1-2/4) nach C-terminal verschoben positioniert war. Dies sollte eine Verstärkung in zwei Stufen (Vorverstärkung, Nachverstärkung) ermöglichen, um die Spezifität der Reaktion zu erhöhen. Folgende Reaktionen wurden durchgeführt:

• 1. In zwei verschiedenen Ansätzen wurden je 1/15 des cDNA- Ansatzes 40 PCR-Zyklen mit den Primerkombinationen CC-1- 2/1/UNIP-2 bzw. CC-1-2/2/UNIP-2 unterzogen (Vorver­ stärkung, 2 Ansätze). Ein Zyklus bestand aus:
• 2. Je 1/30 der beiden Ansätze wurde danach mit den Primer­ kombinationen CC-1-2/3/UNIP-2 bzw. CC-1-2/4/UNIP-2 in 20 Zyklen nachamplifiziert (Nachverstärkung, 4 Ansätze): Nachverstärkung mit CC-1-2/4/UNIP-2 konnte ein homogenes PCR-Produkt erhalten werden (siehe "Agarosegelelektrophorese der PCR-Fragmente"). Der PCR-Ansatz wurde durch Centrikon C- 100 (Amicon) - Zentrifugation von nicht umgesetzten Primern be­ freit, zusammen mit 50 ng pBluescript Eco-RI-restringiert (die PCR-Primer enthalten zur leichteren Klonierung Eco-RI-Schnitt­ stellen) und anschließend ligiert. Die Ligationsprodukte wur­ den in E.coli XL-1 Blue propagiert, die Plasmid-DNA weißer Kolonien mit Qiagen-Säulen (Diagen) präpariert und mit Hilfe eines Fluoreszenzsequenzers sequenziert. Die klonierte cDNA kann nun als hochspezifische Hybridisierprobe zum Screening einer cDNA- oder Genbank eingesetzt werden. Ausgehend von der Sequenz können zudem spezifische Primer für eine direkte Am­ plifikation der restlichen cDNA aus Gesamt-DNA einer humanen cDNA-Bank abgeleitet werden.

GAP-2-Aminosäuresequenz und abgeleitete PCR-Primer

Claims (8)

1. Cytokin CC-1 mit nachfolgender Aminosäuresequenz TKTESSSRGP
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MKENsowie dessen biologisch aktive Fragmente und/oder Deri­ vate, insbesondere amidierte, acetylierte, phosphory­ lierte und/oder glycosylierte Derivate.

2. Polynukleotid kodierend für Cytokin CC-1 nach Anspruch 1 und/oder dessen Fragmente.

3. Polynukleotid nach Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet, daß dieses ein cDNA-Fragment der nachstehenden Formel ist TAT GAG ACC AGC AGC CAG TGC TCC AAG CCC GGA ATT GTC TTC ATC ACC AAA AGG GGC CAT TCC GTC TGT ACC AAC CCC AGT GAC AAG TGG GTC CAG GAC TAT ATC AAG GAC ATG AAG GAG AAC

4. Verfahren zur Herstellung eines Cytokins-CC-1 gemäß An­ spruch 1 durch Extraktion von Hämofiltrat, Kationenau­ stauscher-Extraktion, gefolgt von Elution der adsorbier­ ten Substanzen,
Ammoniumsulfat-Fällung der im Eluat vorhandenen Peptide und Proteine,
Aufnahme des Präziptitats in wäßriger Lösung und erneute Fällung mit einem niederen Alkohol sowie Kationenaustau­ scher-Chromatographie, sowie Umkehrphasen-Chromatogra­ phie.

5. Arzneimittel enthaltend Cytokin CC-1 gemäß Anspruch 1 als wirksamen Bestandteil.

6. Diagnostikmittel enthaltend poly- oder monoklonale An­ tikörper gegen Cytokin CC-1 oder mit der für das Cytokin kodierenden Nukleinsäure oder mRNA.

7. Verwendung von Cytokin CC-1 zur Herstellung eines Arz­ neimittels zur Behandlung von Störungen der Migration von Zellen, Erkrankungen des Immunsystems, Tumoren sowie Dis­ funktion regulatorischer Wachstumsfunktionen.

8. Nukleinsäuresonden hybridisierend mit einem Polynukleotid nach Anspruch 2.