DE19730786C2 - Humanes zirkulierendes hNLP (humanes Neutrophilen-Lymphocyten-Peptid) - Google Patents

Humanes zirkulierendes hNLP (humanes Neutrophilen-Lymphocyten-Peptid)

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DE19730786C2 DE1997130786 DE19730786A DE19730786C2 DE 19730786 C2 DE19730786 C2 DE 19730786C2 DE 1997130786 DE1997130786 DE 1997130786 DE 19730786 A DE19730786 A DE 19730786A DE 19730786 C2 DE19730786 C2 DE 19730786C2
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Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Peptid mit der in Anspruch 1 angegebenen Formel, Polynucleotide kodierend für Peptide mit der in Anspruch 1 angegebenen Formel, Vektoren enthaltend eine DNA aus den erfindungsgemäßen Poly­ nucleotiden, gentechnisch manipulierte Wirtszellen enthaltend den erfindungsgemäßen Vektor, DNA hybridisierend mit einem erfindungsgemäßen Polynucleotid, Antikörper gerichtet gegen die erfindungsgemäßen Polypepitde, Antisense- Oligonucleotide zur Hemmung der Expression der erfindungs­ gemäßen Peptide, Arzneimittel enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder ein erfindungsgemäßes Polynucleotid, Verfahren zur Herstellung der erfindungs­ gemäßen Peptide, ein Diagnostikum zur Erfassung der er­ findungsgemäßen Polypeptide sowie Verwendungen der er­ findungsgemäßen Polypeptide.
Erfindungsgemäß wird ein humanes zirkulierendes Neutro­ philen-Lymphocyten-Peptid zur Verfügung gestellt. Es hat die folgende Struktur (Formel I)
Ra-C-Xn-C-Rd I
wobei
Ra NH2 oder ein Derivat einer primären Aminogruppe oder ein Oligo- oder Polypeptid ist, wobei das Oligo- oder Polypeptid aus natürlich vorkommenden Aminosäuren, deren in der Seitenkette modifi­ zierten Derivate und/oder deren stereoisomeren Aminosäuren aufgebaut ist,
n eine ganze Zahl zwischen 3 und 7 ist,
X eine natürlich vorkommende Aminosäure, deren in der Seitenkette modifiziertes Derivat und/oder deren stereoisomere Aminosäure ist,
Rd COOH, ein Carbonsäurederivat oder ein Oligo- oder Polypeptid ist, wobei das Oligo- oder Polypeptid aus natürlich vorkommenden Aminosäuren, deren in der Seitenkette modifizierten Derivate und/oder deren stereoisomeren Aminosäuren aufgebaut ist, ausgenommen ein Peptid, das von einer Nucleinsäure mit der Sequenz gemäß Seq. ID. Nr. 10 kodiert wird.
Vorzugsweise besitzt das erfindungsgemäße Peptid die folgende Struktur (Formel II):
wobei
Ra, Rd, n und X die oben genannten Bedeutungen haben und Rb und Rc jeweils ein Oligo- oder Polypeptid sind, wobei das Oligo- oder Polypeptid aus natürlich vorkommenden Amino­ säuren, deren in der Seitenkette modifizierten Derivaten und/oder deren stereoisomeren Aminosäuren aufgebaut ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist Xn RDDSE.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Peptid insbesondere vier Molekülformen auf, davon drei im menschlichem Blutfiltrat, eine im Urin, mit den nachstehend angegebenen Aminosäuresequenzen:
hNLP-17-55, MW 4451:
hNLP-22-55, MW 3762:
hNLP-26-55, MW 3406:
hNLP-22-39, MW 1877 als Urin-Peptid:
GVSLRPIGASCRDDSECI
Das erfindungsgemäße Peptid ist erhältlich durch ein Reinigungsverfahren ausgehend von humanem Hämofiltrat.
Das humane Hämofiltrat wird gegebenenfalls mit Wasser ver­ dünnt und angesäuert. Der pH-Wert beträgt vorzugsweise 1,5 bis 3,5, insbesondere 2,5 bis 3,0. Danach wird das Hämo­ filtrat über einen Kationenaustauscher geleitet, beispiels­ weise ein mit Sulfonsäuregruppen modifiziertes Trägermaterial (Fractogel SP-650 (M), Merck, Darmstadt). Die an den Kationenaustauscher gebundenen Peptide werden mit einer relativ hoch konzentrierten Salzlösung eluiert. Die Ionen­ stärke der Elutionslösung entspricht dabei ungefähr einer 0,5 bis 1 molaren Ammoniumacetatlösung.
Das aufgefangene Eluat wird einer weiteren Kationenaus­ tauscher-Chromatographie unterzogen. Diese Chromatographie ist vorzugsweise eine Stufenelution mit Puffern von an­ steigenden pH-Werten.
Die das erfindungsgemäße Peptid enthaltenden Fraktionen werden z. B. mittels präparativer Umkehrphasen-Chromato­ graphie und nachfolgender semipräparativer Umkehrphasen- Chromatographie beispielsweise an mit C4 modifizierten Trägermaterialien weitergereinigt. Der Aufreinigungsgrad wird vorzugsweise mittels analytischer Umkehrphasen-Chromato­ graphie beispielsweise an mit C18 modifizierten Träger­ materialien und der Kapillarzonenelektrophorese überprüft.
Die durch die chromatographische Reinigung erhaltenen Substanzen wurden der Strukturaufklärung zugeführt. Die Bestimmung der Molekülmassen der nativen Peptide sowie der proteolytischen Fragmente und chemisch modifizierten Derivate erfolgte mittels eines Sciex API III Massenspektrometer. Die Aminosäureanalyse wurde nach einer sauren Totalhydrolyse durchgeführt. Die Sequenzanalyse erfolgte über einen Edman- Abbau der Peptide, ihrer proteolytischen Spaltprodukte sowie von chemisch modifizierten Derivaten mit einem ABI 473 A Sequenzer.
Die erfindungsgemäßen Polynucleotide kodieren für die er­ findungsgemäßen Peptide. Aus den Polynucleotiden lassen sich nach dem Fachmann bekannten Methoden Primer ableiten zur Analyse und Sequenzierung der zugehörigen mRNA und des Gens.
Das Polynucleotid ist insbesondere eine cDNA, die sowohl als Ausgangspunkt einer gentechnischen Herstellung des hNLP dienen kann, wie auch als analytisches Werkzeug zu Nachweis des Auftretens von für das Peptid kodierender DNA oder mRNA.
Dabei können entsprechende Derivate als Hybridisierungssonden eingesetzt werden. Beispielsweise weist die cDNA des er­ findungsgemäßen Peptids die neuartige, nachstehende Sequenz auf (Seq. ID No. 6):
Das Gen des erfindungsgemäßen Peptids wurde aus humaner ge­ nomischer Leukozyten-DNA kloniert und weist die nachstehende Sequenz auf:
Die Darstellung der cDNA von Maus (Mus musculus) und Her­ stellung von Knock-out-Mäusen wurden nach den üblichen Verfahren möglich.
Die Maus-cDNA-Sequenz (Seq. ID No. 10) sowie die daraus abgeleitete Peptidsequenz (Seq. ID No. 14) lauten:
Das Maus-Gen wurde über eine genomische PCR aus einer murinen Cosmid-Bank isoliert und sequenziert. Die Sequenz ist im Folgenden dargestellt (Seq. ID No. 15):
Neben der gentechnischen Herstellung ist auch die aufbauende Totalsynthese an üblichen Festphasen im Sinne der Merrifield- Synthese oder einer Flüssigphasensynthese möglich. Die Synthesestrategie und der Aufbau des Peptids und von ihm abgeleiteten Derivaten z. B. mit den entsprechend geschützten Aminosäuren sind dem Fachmann bekannt.
Das erfindungsgemäße Peptid sowie seine cDNA, sein Gen und Analoga, Fragmente und Derivate zu dem Peptid, der cDNA und dem Gen sowie seine Antagonisten oder Inhibitoren können als Arzneimittel Verwendung finden. Seine biologische Aktivität entspricht der einer antizellproliferativen Substanz ähnlich der bekannten Interleukine. Es ist daher geeignet, als Arzneimittel zur Behandlung von Störungen bei entzündlichen Prozessen, gestörten Entzündungsreaktionen, Tumorer­ krankungen, Proliferations- und Reifungsstörungen des blutbildenden Systems, Infektionserkrankungen, entzündlichen und neoplastischen Erkrankungen und Proliferationsstörungen z. B. der Atemwege, des Magendarmtraktes und des Urogenitalapparates, insbesondere des Blutes und der blutbildenden System, eingesetzt zu werden. Das erfindungs­ gemäße Peptid oder seine Antagonisten/Inhibitoren können dabei in für Peptide üblicher Weise parenteral, intravenös, intramuskulär, intranasal, lokal-topisch oder bukal ver­ abreicht werden. Die Menge an zu verabreichenden Peptid beträgt 1 µg bis 1 g pro Darreichungseinheit pro Tag. Die Wirkung des erfindungsgemäßen Peptids kann durch Gabe ge­ eigneter Inhibitoren und Antagonisten gehemmt werden.
Das erfindungsgemäße Diagnostikmittel enthält poly- oder monoklonale Antikörper gegen das erfindungsgemäße Peptid gegebenenfalls in fluoreszenz- oder radioaktiv-markierter Form, um z. B. in an sich bekannten ELISA oder RIA eingesetzt zu werden. Das erfindungsgemäße Diagnostikmittel enthält DNA, RNA und/oder PNA gegebenenfalls in modifizierter und/oder markierter Form zum Einsatz in dem Fachmann bekannten Test­ systemen wie PCR oder Fingerprinting.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher beschrieben.
Beispiel 1 Hämofiltrat-Batch-Extraktion
800 bis 1.000 L Hämofiltrat werden mit HCl auf einen pH-Wert von 2,7 eingestellt und mit Wasser auf eine Leitfähigkeit von 5,5 mS/cm verdünnt und mit einer Flußrate von 3 L/min auf einen starken Kationenaustauscher aufgetragen.
Chromatographiebedingungen:
Säule: Vantage VA 250 (Amicon, Witten)
Säulenmaterial: Fractogel TSK SP 650 (M), 25 cm Durchmesser × 5 cm Länge
Fluß: 3 L/min
Detektion: 280 nm, pH, Leitfähigkeit
Puffer A: Hämofiltrat pH 2,7, Leitfähigkeit 5,5 mS/cm
Puffer B: 0,5 M Ammoniumacetat
Anlage: Autopilot Chromatographiesystem, (PerSeptive Biosystems, Wiesbaden)
Nach Auftrag der insgesamt 4.000 L Flüssigkeit über Nacht wird mit mehreren Säulenvolumina 5 mM HCl gespült. Die Elution der gebundenen Peptide erfolgt als Batch-Elution mit 0,5 M Ammoniumacetat. Hierbei wird eine komplette Elution der Peptide über steigenden pH-Wert (2,7-7,2) und steigende Leitfähigkeit (56 mS/cm) in etwa 5 L Eluat erreicht.
Erste präparative Auftrennung
Die Ammoniumacetat-Eluate der Batch-Extraktion werden in Mengen von 5.000 bis 10.000 L Hämofiltrat-Peptid vereinigt. Nach pH-Einstellung auf 2,7 wird das Peptidextrakt unter Zumischung von VE-Wasser mit einer Leitfähigkeit von 5,5 mS/cm auf den präparativen Kationenaustauscher aufgetragen.
Chromatographiebedingungen:
Säule: Vantage 250 VA
Säulenmaterial: Fractogel TSK SP 650 (M), 25 cm Durchmesser × 5 cm Länge
Fluß: bis zu 3 L/min während des Auf­ trages
0,5 bis 1 L während der Elution
Detektion: 280 nm, pH, Leitfähigkeit
Probe: Hämofiltrat pH 2,7, Leitfähigkeit 5,5 mS/cm
Anlage: Autopilot Chromatographiesystem, (PerSeptive Biosystems, Wiesbaden)
Nach Auftrag des Rohextraktes über 240 min wird die Säule mit 0,01 M HCl gespült, bis die Leitfähigkeit unter 1 mS/cm ist. Die Elution erfolgt dabei in mehreren Stufen mit den im folgenden angegebenen Puffern
Die Eluate 1-7 werden als pH-Pool I-VII bezeichnet. Sie werden separat gesammelt. Die Elution erfolgt bis zum Er­ reichen einer neuen Basislinie, wobei für die einzelnen pH- Pools I bis VII Elutionsvolumina von 10 bis 25 L erreicht werden.
Zweite präparative Auftrennung:
Die einzelnen pH-Pools werden zur Fraktionierung und gleich­ zeitigen Entsalzung über eine Reversed Phase Chromatographie getrennt.
Chromatographiebedingungen:
Säule: FineLine 100 (Pharmacia, Freiburg)
Säulenmaterial: Source RPC, 15 µm 10 cm Durchmesser × 12,5 cm Länge (FineLine 100)
Fluß: 150 mL/min
Detektion: 280 nm, Leitfähigkeit, pH
Puffer A: 10 mM HCl
Puffer B: 80% Acetonitril in 10 mM HCl
Gradient: 0-60% Puffer B in 5 Säulenvolumen
Nach Auftrag der pH-Pools wird die Säule mit Puffer A ge­ spült. Während der Elution werden Fraktionen zu 200 ml gesammelt. Die Fraktionen werden gefriergetrocknet und bei -20°C gelagert.
Semipräparative Reverse-Phase C18-Chromatographie
Die Fraktion 15 aus pH-Pool VI wurde sukzessive in mehreren identischen Chromatographien über eine semipräparative Reversed-Phase Säule aufgetrennt.
Chromatographiebedingungen:
Säule: 1 cm × 25 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Vydac RP-C18 5 µm, 300 Å
Puffer A: 0,1% TFA
Puffer B: 0,1% TFA, 80% Acetonitril
Gradient: 5-50% B in 45 min, 50-100% B in 10 min
Fluß: 2 ml/min
Detektion: 220 nm
Chromatographieanlage: Kontron
Fraktionen: á 1 min ab Start des Gradienten
Analytische Reversed-Phase C18-Chromatographie
Die Fraktion 37 enthielt die erfindungsgemäße Substanz. Sie wurde auf einer analytischen Säule weiter aufgereinigt (Chromatogramm siehe Abb. 4).
Chromatographiebedingungen:
Säule: 0,46 cm × 25 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Vydac RP-C18, 5 µm, 300 Å
Puffer A: 0,1% TFA
Puffer B: 0,1% TFA, 80% Acetonitril
Gradient: 5-50% B in 45 min,
50-100% B in 10 min
Fluß: 0,7 ml/min
Detektion: 214 nm
Chromatographieanlage: Kontron
In dieser Rechromatographie wird die Reinheit des isolierten Peptides, wie es zur weiteren Analytik verwandt wird, deut­ lich. Analog zu diesem Vorgehen wurden auch die Peptide HF 4451 (hNLP-17-55) und HF 3406 (hNLP-26-55) aufgereinigt.
Beispiel 2 Kapillarzonen-Elektrophorese
Zur Überprüfung der Reinheit wurde eine Kapillarzonen- Elektrophorese für die verschiedenen hNLPs angefertigt. Die Fraktion, enthaltend hNLPs, zeigen die zu über 95% aufge­ reinigten Substanzen.
Bedingungen:
Kapillare: fused silica
Effektive Länge: 50 cm
Gesamtlänge: 57 cm
Puffer: 100 mM NaH2
PO4
pH 2,5, 0,2% Hydroypropylmethylcellulose
Strom: 120 µA const.
Detektion: 200 nm
Temperatur: 25°C
Beispiel 3 Massenbestimmungen
Alle Massenbestimmungen der unmodifizierten, modifizierten und/oder durch Endoproteinasespaltung fragmentierten Peptide wurden auf einem Elektrospray-Massenspektrometer (Sciex API III, Fa. Perkin Elmer) durchgeführt. Die Molekülmassen der Peptide wurden im positive ion mode entsprechend der oben gezeigten Massenzahlen (MW) bestimmt.
Aminosäureanalyse
Nach Gasphasen-Hydrolyse mit 6 N HCl für 1 Stunde bei 160°C werden die Aminosäuren mit einem automatischen Aminosäure­ analysator (AminoQuant, Hewlett-Packard) nach Doppel­ markierung mit OPA/Fmoc mit dem Standardprogramm analysiert.
Die Peptide enthalten die mit dieser Methode nachweisbaren Aminosäuren entsprechend der vier genannten Molekülformen.
Bestimmung von Cysteinen
Cysteine lassen sich nach vorheriger chemischer Derivati­ sierung, zum Beispiel nach Reduktion mit β-Mercaptoethanol und Carboxamidomethylierung mit Iodacetamid, in der Peptid- Sequenzierung nachweisen. Nach der Derivatisierung schließt sich eine Entsalzung vorzugsweise über eine analytische Reverse-Phase Chromatographie mit einer Vydac RP-C18 Säule (4,6 mm × 25 cm) an. Ein Teil der so modifizierten Peptide werden der Sequenzanalyse zugeführt, mit dem anderen Teil ergeben die Massenbestimmungen ein pro Cystein um 57 Da erhöhtes Molekulargewicht. Aus der Massendifferenz zum nativen Peptid wird geschlossen, daß die Peptide aus Hämo­ filtrat vier Cysteine enthalten, welche zudem mit zwei Disulfidbrücken untereinander verbunden sind.
Sequenzbestimmung
Sowohl die nativen als auch die carboxamidomethylierten Peptide sowie die Fragmente nach Spaltung mit den Endo­ proteinasen Glu-C und Arg-C werden mittels Edman-Abbau auf einem ABI 473 A Sequenzer unter Verwendung des Standard- Programms analysiert. Die Proben werden auf eine Polybrene- Membran in Mengen zwischen 100 und 400 pmol aufgetragen. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen aus den Aminosäure­ analysen und den Massenbestimmungen ergeben sich folgende Sequenzen:
hNLP-17-55, MW 4451 (Seq. ID No. 1):
hNLP-22-55, MW 3762 (Seq. ID No. 2):
hNLP-26-55, MW 3406 (Seq. ID No. 3):
hNLP-22-39 (Seq. ID No. 4), MW 1877 als Urin-Peptid:
GVSLRPIGASCRDDSECI
Die Verknüpfung der Cysteine untereinander in einer 1-3 sowie 2-4-Anordnung wird durch Analyse der Fragmente der Endoproteinasespaltungen ermittelt und ist durch die Klammern angegeben.
Datenbankvergleich
Ein Datenbankvergleich wurde mit Hilfe des HUSAR-Programm­ pakets an den SwissProt-, PIR-, EMBL-Nucleinsäure- und GenBank-Datenbanken durchgeführt. Die Peptidsequenz ist überraschenderweise neu. Es wurde keine Sequenzhomologie zu Mitgliedern von bekannten Peptidfamilien gefunden, so daß den hNLPs eine überraschend neuartige Sequenz zukommt.
Beispiel 4 Synthese von Oligonucleotiden
Primer wurden auf einem Nucleinsäure-Synthesizer (Fa. Applied Biosystems) nach der Phosphoamidit-Methode nach den Angaben des Herstellers synthetisiert, auf OPC-Säulen gereinigt und in bidest. H2O gelöst. NLP-N und NLP-C bilden Paare soge­ nannter 'degenerierter' PCR-Primer, welche sämtliche Codierungsmöglichkeiten für die in Beispiel 2 bestimmten amino- und carboxyterminalen Aminosäuresequenzen des hNLP und eine zusätzliche Linkersequenz mit Restriktionsschnitt­ stellen für die spätere Klonierung enthalten. Mit UNIP wird die Erststrangsynthese der cDNA durchgeführt.
Präparation von cDNA
Aus humanem Darmgewebe wurde mit Hilfe eines automatischen Nucleinsäurenextraktors (ABI, 340) Gesamt-RNA nach den Angaben des Herstellers präpariert. Aus 5 µg dieser RNA wurde die mRNA unter Verwendung der Primer und von MMLV-RTase (Gibco-BRL) in cDNA-Erststrang umgeschrieben.
Amplifikation der für hNLP codierenden cDNA
Die spezifische Amplifikation der codierenden cDNA wurde durch eine PCR an einem Thermocycler (Perkin-Elmer-Cetus, 7000) durchgeführt. Mit etwa 1 µg cDNA-Erststrängen aus verschieden humanen Geweben, insbesondere des Intestinal­ traktes, werden mit den oben aufgeführten Primern nach Standardmethoden die codierenden cDNAs erhalten.
Nucleinsäure-Seguenzierung
Die Nucleinsäurensequenz nach routinegemäß ausgeführter Fluoreszenzsequenzierung ergab folgende Sequenz mit abge­ leiteter Aminosäuresequenz (Seq. ID No. 6):
Das Polyadenylierungssignal ist unterstrichen.
Die humane Gensequenz wurde durch genomische PCR aus humaner DNA von Leukozyten nach dem Fachmann bekannten Methoden verstärkt, kloniert und sequenziert. Die Gen-Sequenz lautet:
Length of gen NLP: 1255 bp, +1 at: 1; Listed from: 1 to: 1255; Thu, Feb 20, 1997 12:51 PM
Die Prozessierung des Peptidhormons hNLP ist aus Fig. 1 ersichtlich.
Die Darstellung der cDNA von Maus (Mus musculus) und Her­ stellung von Knock-out-Mäusen wurden nach den üblichen Verfahren möglich:
Die Maus-cDNA-Sequenz (Seq. ID No. 10) sowie die daraus abgeleitete Peptidsequenz lautet:
Length of Maus cDNA: 429 bp, +1 at: 1; Listed from: 3 to: 429; Translated from: 69 to: 296 (ORFs); Genetic Code used: Universal; Thu, Feb 20, 1997 4:32 PM
Frame 3
Das Knock-out-Konstrukt besitzt folgenden Aufbau:
Beispiel 5
Synthetische Peptidformen von hNLP wurden mit üblichen chemischen Syntheseverfahren sowie mittels rekombinanter Expression in E. coli sowie durch Expression in Pichia pastoris erhalten. Folgende Produkte wurden durch multiple Synthese erreicht:
hNLP-17-55, MW 4451 (Seq. ID No. 1):
hNLP-22-55, MW 3762 (Seq. ID No. 2):
hNLP-26-55, MW 3406 (Seq. ID No. 3):
hNLP-1-55, (Seq. ID No. 5)
SEQUENZPROTOKOLL

Claims (24)

1. Humanes zirkulierendes Neutrophilen-Lymphocyten-Peptid mit der Formel I
Ra-C-Xn-C-Rd I
wobei
Ra NH2 oder ein Derivat einer primären Aminogruppe oder ein Oligo- oder Polypeptid ist, wobei das Oligo- oder Polypeptid aus natürlich vorkommenden Aminosäuren, deren in der Seitenkette modifizier­ ten Derivaten und/oder deren stereoisomeren Ami­ nosäuren aufgebaut ist,
n eine ganze Zahl zwischen 3 und 7 ist,
X eine natürlich vorkommende Aminosäure, deren in der Seitenkette modifiziertes Derivat und/oder deren stereoisomere Aminosäure ist,
Rd COOH, ein Carbonsäurederivat oder ein Oligo- oder Polypeptid ist, wobei das Oligo- oder Polypeptid aus natürlich vorkommenden Aminosäuren, deren in der Seitenkette modifizierten Derivaten und/oder deren stereoisomeren Aminosäuren aufgebaut ist,
ausgenommen ein Peptid, das von einer Nucleinsäure mit der Sequenz gemäß Seq. ID. Nr. 10 kodiert wird, wobei Seq. ID. Nr. 10 Bestandteil dieses Anspruchs ist.
2. Peptid nach Anspruch 1 mit der Formel II
wobei
Ra, Rd, n und X die oben genannten Bedeutungen haben und Rb und Rc jeweils ein Oligo- oder Polypeptid sind, wobei das Oligo- oder Polypeptid aus natürlich vorkommenden Aminosäuren, deren in der Seitenkette modifizierten Derivaten und/oder deren stereoisomeren Aminosäuren aufgebaut ist.
3. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 mit der Bezeichnung natives hNLP (humanes Neutrophilen-Lymphocyten-Peptid) mit nachfolgenden Aminosäuresequenzen:
hNLP-17-55, MW 4451 (Seq. ID No. 1):
hNLP-22-55, MW 3762 (Seq. ID No. 2):
hNLP-26-55, MW 3406 (Seq. ID No. 3):
hNLP-22-39, MW 1877 (Seq. ID No. 4):
GVSLRPIGASCRDDSECI
hNLP-1-55, (Seq. ID No. 5)
sowie deren biologisch aktive Fragmente und/oder Deri­ vate, insbesondere amidierte, acetylierte, sulfatierte, phosphorylierte und/oder glykosylierte Derivate.
4. Polynucleotide kodierend für Peptide nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3.
5. Polynucleotide nach Anspruch 4 mit der Seq. ID # 6 bis 9 und 11 bis 14, wobei die Seq. ID # 6 bis 9 und 11 bis 14 Bestandteil dieses Anspruchs sind.
6. Polynucleotide nach Anspruch 4 und/oder 5, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das Polynucleotid aus DNA, RNA oder PNA aufgebaut ist.
7. Vektor enthaltend eine DNA gemäß Anspruch 4.
8. Gentechnisch manipulierte Wirtszelle enthaltend den Vektor nach Anspruch 7.
9. DNA hybridisierend mit einem Polynucleotid gemäß An­ spruch 4, die für ein Polypeptid mit hNLP-Aktivität kodiert.
10. Antikörper gerichtet gegen die Polypeptide gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3.
11. Antisense Oligonucleotide zur Hemmung der hNLP Ex­ pression.
12. Arzneimittel enthaltend mindestens ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder mindestens ein Poly­ nucleotid nach einem der Ansprüche 4 bis 6.
13. Arzneimittel nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß verträgliche Träger- und Hilfsstoffe enthalten sind.
14. Arzneimittel enthaltend mindestens einen der in den An­ sprüchen 10 bis 11 genannten Stoffe.
15. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 12 bis 14 zur oralen, parenteralen, intravenösen, intramuskulären, intracutanen, intrathekalen, intranasalen und lokal­ topischen Anwendung sowie als Aerosol zur trans­ pulmonalen Applikation.
16. Verfahren zur Herstellung eines Peptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 durch Extraktion von Hämofiltrat durch Kationenaustauscher-Extraktion mit nachfolgender Elution der adsorbierten Substanzen, eine erneute Kationenaus­ tauscher-Chromatographie des die Peptide enthaltenden Extraktes sowie mehrstufige Umkehrphasen-Chromatographie.
17. Verfahren zur Herstellung eines Peptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 durch Merrifield-Festphasensynthese oder Flüssigphasensynthese nach dem Fachmann bekannten Methoden mit geschützten Aminosäuren.
18. Verfahren zur Herstellung eines Peptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 durch dem Fachmann bekannte Verfahren der heterologen Expression mittels gängiger biotechno­ logischer Vektoren.
19. Diagnostikum zur Erfassung der Polypeptide nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder der Polynucleotide nach einem der Ansprüche 4 bis 6, enthaltend poly- oder monoklonale Antikörper gegen hNLP oder mit der für das hNLP kodie­ renden Nucleinsäure oder mRNA hybridisierenden DNA, RNA oder PNA.
20. Verwendung des Diagnostikums nach Anspruch 19 für Test­ systeme zur Kontrolle von Gewebe-, Plasma-, Urin- und Liquor cerebrospinalis-Spiegeln dieser Polypeptide.
21. Verwendung des Diagnostikums nach Anspruch 19 zur Erfas­ sung von Funktionsstörungen des Knochenmarkes, der Lymphorgane, des Magen-Darmtraktes, des Immunsystems und von inflammatorischen sowie neoplastischen Prozessen.
22. Verwendung der Polypeptide oder Oligonucleotide nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Behandlung von Störungen bei entzündlichen Prozessen, gestörten Entzündungsreaktionen, Tumorerkrankungen, Prolifera­ tions- und Reifungsstörungen des blutbildenden Systems.
23. Verwendung eines Peptids gemäß Anspruch 6 zur Behandlung von Infektionserkrankungen, entzündlichen und neoplasti­ schen Erkrankungen und Proliferationsstörungen insbesondere der Atemwege, des Magendarmtraktes und des Urogenitalappara­ tes, insbesondere des Blutes und der blutbildenden Systeme.
24. Vektoren zur Erzeugung von Knock-out-Mutanten in Mäusen zur Etablierung von chronischen Tiermodellen mit Reifungsstörungen der blutbildenden Systeme.
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