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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues Protein und eine
DNA, die für
dasselbe codiert. Sie bezieht sich insbesondere auf ein neues Protein,
das inhibitorische Aktivität
auf die Proteaseaktivität
von Hepatocyten-Wachstumsfaktor-aktivierendem
Faktor (HGF-Aktivator) hat (im Nachfolgenden wird dieses Protein
manchmal als "HAI-I" bezeichnet), ein
Gen, das für
das Protein codiert, einen Expressionsvektor, der das Gen enthält, eine
Transformante, wie sie mit dem Expressionsvektor transformiert ist,
und auf ein Verfahren zur Produktion von HAI-I unter Verwendung
der Transformanten.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Es
wurde bereits beschrieben, dass Thrombin die Vorstufe des HGF-Aktivators
(JP-A-5-103670, JP-A-6-141859, JP-A-6-153946 und JP-A-6-153966 (der Ausdruck "JP-A", wie er hier verwendet
wird, meint eine "ungeprüfte veröffentlichte
japanische Patentanmeldung");
Faktor mit Aktivität
zur Umwandlung der Einzelkettenform des Hepatocyten-Wachstumsfaktors
(HGF) in seiner Doppelkettenform) in der Weise einer positiven Aktivitätskontrolle
aktiviert. Allerdings war ein von humanen Geweben stammender Proteaseinhibitor, der
fähig ist,
als negativer Kontrollfaktor die physiologische Aktivität von HGF-Aktivator
zu inhibieren, nicht bekannt. Daher bleibt es unbekannt, wie der
HGF-Aktivator in humanen Geweben kontrolliert wird. Ein derartiger negativer
Kontrollfaktor könnte
indirekt auch die Aktivität
von Hepatocyten-Wachstumsfaktor (HGF), auf den der HGF-Aktivator wirkt,
beeinflussen. So wurde für
die Analyse des Wirkmechanismus von HGF in vivo gefordert, dass
ein solcher aus humanen Geweben stammender. Proteaseinhibitor isoliert
und identifiziert würde.
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Durch
Verwendung eines solchen Proteaseinhibitors und eines Antikörpers zu
dem Proteaseinhibitor würde
es möglich
werden, die physiologische in vivo-Aktivität des HGF-Aktivators zu erkennen, den Wirkmechanismus
desselben zu analysieren oder den Kontrollmechanismus der HGF-Aktivierung zu analysieren,
und zwar von einem anderen Standpunkt aus als dem des Standes der
Technik.
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Zur
Untersuchung der detaillierten in vivo-Funktion von HAI-I oder der
Wirkung von HAI-I bei einer Leberkrankheit z. B. ist HAI-I in großen Mengen
erforderlich. Derzeit ist allerdings nur eine Methode zur Herstellung
von HAI-I verfügbar,
wobei diese Methode die Verwendung des Kulturüberstandes, der mit einer humanen Krebszelllinie,
z. B. MKN45- oder
A549-Zellen erhalten wird, als Ausgangsmaterial und Auf reinigen
daraus HAI-I, das darin in Spurenmengen vorkommt, umfasst. Diese
Methode ist unter dem Gesichtspunkt der Arbeit, der Zeit und der
Kosten nicht immer die beste. Sie trifft auf große Schwierigkeiten bei der
stabilen Isolierung der sehr geringen Menge an HAI-I alleine. Daher
entstand der Wunsch, ein Expressionssystem zu konstruieren, damit
HAI-I stabil und in großen
Mengen erhalten werden kann.
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J.
Biochem., Nov. 1994, Bd. 116, Nr. 5, Seiten 939 bis 942, beschreibt
die cDNA-Clonierung und die mRNA-Expression
eines Serinproteinaseinhibitors, der durch Krebszellen sezerniert
wird. Die cDNA gehört
zur Familie der Serin-Proteaseinhibitoren des Kunitz-Typs. Erfindungsgemäß wird allerdings
ein spezifisches Protein mit inhibitorischer Aktivität auf die
Proteaseaktivität
von Hepatocyten-Wachstumsaktivator isoliert.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung haben eine Durchmusterung verschiedener
kultivierter Zelllinien durchgeführt,
wobei sie als Indikator die inhibitorische Aktivität auf die
Proteaseaktivität
von Hepatocyt-Wachstumsfaktor-Aktivator verwendeten, und haben festgestellt,
dass eine Substanz mit der Aktivität im Kulturüberstand von bestimmten humanen
Krebszelllinien (MKN45-Zellen, A549-Zellen und ähnliche Epithelial-Tumorzell-linien)
auftritt. Um die Natur ihrer inhibitorischen Aktivität zu zeigen,
wurden weitere Anstrengungen unternommen um die Substanz aus dem
MKN45-Zellkulturüberstand
zu reinigen, wobei verschiedene Säulenchromatographietechniken
angewendet wurden. Als Resultat wurde ein neues Protein mit einem
Molekulargewicht von etwa 40.000 Dalton, wie es durch SDS (Natriumdodecylsulfat)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
(PAGE) bestimmt wird, gefunden und sie haben auch eine aminoterminale
Aminosäuresequenz
dieses Proteins erhalten, indem sie das Protein an einem Proteinsequencer
analysierten. Außerdem
bestimmten sie partielle Aminosäuresequenzen,
indem sie das Protein unter Verwendung proteolytischer Enzyme abbauten, die
resultierenden Peptide isolierten und jedes Peptid derselben Aminosäuresequenzanalyse,
wie sie oben erwähnt
wurde, unterzogen. Darüber
hinaus bestimmten sie auf der Basis der partiellen Aminosäuresequenzen DNA-Basensequenzen
und führten
eine Durchmusterung einer cDNA-Bibliothek unter Verwendung von Oligonukleotidsonden,
die auf der Basis dieser Sequenzen hergestellt worden waren, durch.
Das Ergebnis war, dass sie erfolgreich ein Gen clonierten, das für das Protein
codiert, und sie die vorliegende Erfindung vollendeten.
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Als
Resultat verschiedener Untersuchungen, das Protein in stabiler Weise
und in großen
Mengen unter Anwendung der rekombinanten DNA-Technik zu produzieren,
haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung außerdem einen neuen Ex pressionsvektor
konstruiert, der für
das Protein codiert, und haben so die Expression des Proteins ermöglicht.
Durch Konstruktion eines Plasmids zur Proteinexpression durch Einsetzen eines
DNA-Fragments, das für
einen Teil der Aminosäuresequenz
des Proteins oder die ganze codiert, in einen Plasmidvektor, z.
B. den Expressionsvektor pME18S zur Verwendung in Tierzellen oder
ein Expressionsvektor zur Verwendung in Hefen, Escherichia coli
und dergleichen, an eine Stelle stromabwärts des Promotors dafür und durch
Verwendung des so erhaltenen rekombinanten Plasmids zur Transformation
von Wirtszellen haben sie die vorliegende Erfindung in einem anderen
Aspekt vollendet.
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Demnach
bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Protein, das die
folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften hat:
- (1) ein Molekulargewicht von etwa 40.000 Dalton, wie es durch
SDS-Polyacrylamid-Gelelktrophorese bestimmt wird;
- (2) inhibierende Aktivität
auf die Proteaseaktivität
von Hepatocyten-Wachstumsfaktor-Aktivator; und
- (3) eine der Aminosäuresequenzen,
die im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO: 1 bis 7 dargestellt sind.
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Die
Erfindung betrifft auch Proteine, die im Sequenzprotokoll unter
SEQ ID NO: 1 bis 7 dargestellt sind und inhibitorische Aktivität auf die
Proteaseaktivität
von Hepatocyten-Wachstumsfaktor-Aktivator haben; ein Protein mit
einer Aminosäuresequenz,
die im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO: 8/9 angegeben ist; und
ein
Protein mit einer Aminosäuresequenz,
die das Segment der Aminosäuresequenz
ist, die im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO: 8/9 dargestellt ist,
das mit dem 36. Aminosäure(Glycin)-Rest
beginnt und mit dem 513. Aminosäu re(Leucin)-Rest
endet; DNAs und Gene, die für
die oben definierten Proteine codieren; entsprechende Expressionsvektoren,
die die DNA oder Gene enthalten; Transformanten, die durch Transformation
von Wirtszellen mit den Expressionsvektoren erhalten wurden; wie
auch ein verfahren zur Herstellung von Proteinen mit inhibierender
Aktivität
auf die Proteaseaktivität
von Hepatocyten-Wachstumsfaktor-Aktivator,
das Kultivieren der Transformanten umfasst.
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Die
Basensequenz, die im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO: 8 dargestellt
ist, enthält
nur einen Strang, während
die andere komplementäre
Basensequenz weggelassen ist. Ausgehend von diesem Gen und unter
Verwendung der rekombinanten DNA-Technik ist es möglich, eine
Expression z. B. des Proteins, das die im Sequenzprotokoll unter
SEQ ID NO: 8/9 gezeigte Aminosäuresequenz
hat, zu verursachen. In diesem Fall enthält das Protein, das von der
mRNA, die für
das Protein codiert, translatiert wird, eine Signalsequenz. Nach extracellulärer Exkretion
wurde die Signalsequenz abgespalten und das erhaltene Protein hat
eine Aminosäuresequenz,
die den 36. Aminosäure(Glycin)-Rest
und die nachfolgenden Aminosäurereste
der Aminosäuresequenz,
die im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO: 8 dargestellt ist, umfasst.
Signalsequenzen von anderen Proteinen können auch als Signalsequenz
verwendet werden. Für
eine Signalsequenz-freie reife Proteinexpression in Wirtszellen
kann ein Gen, das den Teil der Basensequenz, die im Sequenzprotokoll
unter SEQ ID NO: 8 dargestellt ist, der den 106. Nukleotid(Guanin)-Rest
und die anschließenden
Nukleotidreste umfasst, als Gen verwendet werden, das für das relevante
Protein codiert, und an das ATG-Codon eines Vektors gebunden ist.
Die vorliegende Erfindung umfasst ferner innerhalb ihres Rahmens
Modifikationen der Proteine oder DNAs, die oben erwähnt wurden,
wobei dieser aus einer Deletion, Substitution und/oder Addition
einer Aminosäure oder
mehrerer Aminosäuren
oder Nukleotidreste innerhalb von Grenzen, die für die inhibierende Aktivität auf die Proteaseaktivität von HGF-Aktivator
nicht schädlich
sind, stammen.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt die Resultate einer
Untersuchung des erfindungsgemäßen Proteins
auf seine inhibierende Aktivität
auf die Proteaseaktivität
von HGF-Aktivator.
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2 zeigt die Struktur des
Plasmids pME185-HAI.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Im
Folgenden wird die vorliegende Erfindung detaillierter beschrieben.
Das neue Protein der vorliegenden Erfindung, das Proteaseinhibitoraktivität hat, kann
durch Durchführung
von Reinigungsschritten, wie sie nachfolgend beschrieben werden,
erhalten werden. Beispielsweise wird eine humane Krebszelllinie (MKN45-Zellen
oder A549-Zellen, hinterlegt bei der Japanese Cancer Research Resources
Bank unter der Hinterlegungsnummer JCRB0254 bzw. JCRB0076 oder eine ähnliche
Epithel-Tumorzelllinie) für
mehrere Tage in serumfreiem Medium kultiviert; der Kulturüberstand
wird gewonnen und nach Entfernung von Zellen daraus und Konzentrierung
wird er einer Heparin-Sepharose-Säule (erhältlich z. B. von Pharmacia)
unterworfen. Die nicht-adsorbierte
Fraktion wird einer ConA-Sepharose-Säule (erhältlich z. B. von Pharmacia)
unterworfen und in eine adsorbierte Fraktion und eine nicht-adsorbierte
Fraktion getrennt. Die adsorbierte Fraktion wird einer hydrophoben
Chromatographie unter Verwendung von Phenyl-5PW (erhältlich z.
B. von Tosoh Corp.) unterworfen. Die so erhaltene Fraktion, die
das gewünschte
Protein enthält,
wird an einer DEAE-Ionenaustauschsäule (erhältlich z. B. von Polymer Laboratory)
chromatographiert, danach einer Hydroxyapatitsäule (erhältlich z. B. von Mitsui Toatsu
Chemicals oder Seikagu Corp.) und ferner einer Gelfiltrationssäulenchro matographie (unter
Verwendung z. B. von Asahi Chemical Industry's GS520) unterworfen um das fragliche
Protein zu erhalten. Die Reinigungsschritte können ferner reversedphase-Säulenchromatograhie
und/oder andere geeignete Mittel, wenn notwendig, umfassen.
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Bei
der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wandert das auf diese weise
gereinigte Protein der vorliegenden Erfindung als verwaschene Bande
oder mehrere Fragmente, die vermutlich aus Unterschieden in der
Zuckerkette, Aminosäurerest-Modifikationen
und/oder Mutation an der C-terminalen
Seite resultieren und ein Molekulargewicht von etwa 40.000 Dalton
haben. Bei Umsetzung mit HGF-Aktivator zeigt das Protein inhibierende
Aktivität
auf die Proteaseaktivität
des HGF-Aktivators. Dieses Protein der vorliegenden Erfindung enthält die in
der folgenden Tabelle 1 angegebene Aminosäuresequenz.
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Ein
DNA-Fragment des Gens, das für
das neue Protein der vorliegenden Erfindung codiert, kann in folgender
Weise erhalten werden. Durch Analysieren des neuen Proteins, das
in der obigen Weise gereinigt wurde, kann seine aminoterminale Aminosäuresequenz
unter Verwendung eines Gasphasen-Proteinsequencers
(erhältlich
z. B. von Applied Biosystems) bestimmt werden. Ferner wird das Protein
unter Verwendung von Lysyl-Endopeptidase (z. B. Achromobacter-Protease
I) abgebaut, die resultierenden Peptidfragmente werden durch reversed-phase-Hochdruckflüssigkeitschromatographie
(z. B. unter Verwendung einer YMC-Säule) getrennt und jedes Fragment
wird in der gleichen Weise wie oben beschrieben einer Aminosäureanalyse
unterworfen, wodurch die Aminosäuresequenz
eines Zwischenteils des Proteins bestimmt werden kann.
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Aus
der so bestimmten Aminosäuresequenz
wird eine DNA-Basensequenz
abgeleitet und entsprechend werden geeignete Oligonukleotide synthetisiert
und als Sonden verwendet.
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Von
humaner Leber, Milz und Plazenta abgeleitete cDNA-Bibliotheken (erhältlich z.
B. von Clonetec) können
unter anderem als cDNA-Bibliothek zur Durchmusterung nach dem Gen,
das für
das gewünschte
Protein codiert, verwendet werden. Zusätzlich kann eine cDNA-Bibliothek
in der herkömmlicher
Weise aus einer Zelllinie oder einem Gewebematerial, in dem das
Protein exprimiert wird, konstruiert werden.
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Escherichia
coli wird mit λ-Phage,
der eine solche cDNA eingebaut enthält (nach dem Verfahren von Maniatis
et al.: "Molecular
Cloning") transfiziert
und dann kultiviert. Die gebildeten Plaques werden einer Selektion
durch Plaquehybridisierung unterzogen, wobei Oligonukleotidsonden
verwendet werden, die auf der Basis der Basensequenz hergestellt
werden, welche von der Aminosäuresequenz
eines Teils des fraglichen Proteins abgeleitet ist; dadurch kann
eine gewisse Anzahl unterschiedlicher λ-Phagen-Clone in einfacher weise
erhalten werden, welche die Aminosäuresequenz des gewünschten
Proteins haben und zusätzlich
solche Segmentbasensequenzen des Proteins enthalten, die anderen
Regionen als den Sonden entsprechen.
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Dann
wird der Phage aus jedem positiven Plaque, der beim obigen Durchmustern
erhalten wurde, sich durch das Verfahren von Maniatis et al. replizieren
gelassen; dann wird die DNA daraus durch das Glycerin-Gradienten-Verfahren
gereinigt und nach geeigneter Restriktionsenzymspaltung einer cDNA-Sublconierung
in einen Plasmidvektor, z. B. pUC18 oder pUC19, oder einen Einzelketten-Phasenvektor,
z. B. M13mp18 oder M13mp19, unterworfen. Danach kann die Basensequenz
des gewünschten
cDNA-Fragments durch das Verfahren von Sanger et al. bestimmt werden.
Die Basensequenzen der erhaltenen Clone werden analysiert und synthetisiert
und als Resultat kann ein Gen, das vollständig der gesamten Aminosäuresequenz
des gewünschten
Proteins, wie es in Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO: 8/9 angegeben
ist, ent spricht, aus einer Gruppe von cDNAs, die für die entsprechenden
Bereiche des Proteins codieren, abgeleitet werden. Es ist auch möglich, ein
Gen, das die gesamte der interessierenden cDNA enthält, ein
Gen, das die cDNA mit Deletion einer partiellen Basensequenz davon
enthält,
ein Gen, das die cDNA mit Insertion einer anderen Basensequenz enthält, ein
Gen, das die cDNA mit Substitution einer partiellen Basensequenz
der cDNA durch eine andere Basensequenz enthält, oder ein ähnliches
Gen aus einer Vielzahl von cDNA-Bibliotheken
durch das PCR-Verfahren unter Verwendung von Teilen der fraglichen
cDNA als Sonden zu erhalten. Eine derartige ortsspezifische Mutation
einschließlich
Basensequenzdeletion, -addition oder -substitution kann in einfacher
Weise durch die in der Literatur beschriebenen Verfahren (z. B.
Methods in Enzymol., 217, 218 (1993; ebda., 217, 270 (1993)) verwirklicht
werden.
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Die
Gruppe der cDNAs, die in der oben beschriebenen Weise erhalten wird,
werden in der Reihenfolge der Basensequenzen, die der Aminosäuresequenz
des Proteins entspricht, zusammengefügt um so ein DNA-Fragment zu
erhalten, das den gesamten Bereich des Proteins abdeckt. Das DNA-Fragment
wird in ein Plasmid, z. B. pCDL-SRα296, an einer Stelle stromabwärts des
Promotors dafür
insertiert und in Phasenübereinstimmung
mit dem Translationsinitiationscodon ATG gebracht um dadurch einen
Proteinexpressionsvektor zu konstruieren. Dann kann das Protein
in einem Wirt, z. B. Tierzellen, die mit dem Plasmid transformiert
sind, exprimiert werden. Danach kann das exprimierte Protein durch
Reinigung nach einem herkömmlichen
Verfahren isoliert werden.
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Auf
diese Weise wird jede der so erhaltenen cDNAs in ein Plasmid, z.
B. pME18S, an einer Stelle stromabwärts des Promotors dafür insertiert
um dadurch ein Plasmid zur Proteinexpression zu konstruieren. Das
Protein oder ein Protein, das aus einer partiellen Aminosäuresequenzdeletion,
-insertion oder -substitution stammt, kann in einem Wirt, z. B.
in Tierzellen, die mit dem Expressionsplasmid transformiert sind,
exprimiert werden. Genauer ausgedrückt, als Tierzellen zur Proteinexpression
können
CHO-Zellen, COS-Zellen, Maus-L-Zellen,
Maus-C127-Zellen, Maus-FM3A-Zellen und dergleichen verwendet werden.
Wenn diese Tierzellen als Wirt verwendet werden, wird angenommen,
dass die Verwendung des Teils der DNA-Basensequenz, die im Sequenzprotokoll
unter SEQ ID NO: 8 dargestellt ist, nämlich das Gen für das Protein,
das mit dem ersten Nukleotid beginnt und mit dem 35. Nukleotid endet,
oder die Verwendung einer existierenden Signalsequenz als Signalsequenz
für eine
extracelluläre
sekretorische Produktion des Proteins oder die Produktion einer
Zellmembran förderlich
ist.
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Das
Expressionsplasmid zur Verwendung in Tierzellwirten wird in folgender
weise konstruiert. Als Promotor kann von einem der existierenden
Promotoren, z. B. dem SRα-Promotor,
SV40-Promotor oder Metallothioneingen-Promotor, Gebrauch gemacht
werden. Eine DNA, die das ganze Gen für das Protein, einschließlich der
oben genannten signalartigen Sequenz enthält, eine DNA, die das Gen mit
einer partiellen Basensequenzdeletion enthält, eine DNA, die das Gen mit
Insertion einer Basensequenz enthält, oder eine DNA, die das
Gen mit Substitution einer anderen Sequenz für eine partielle Basensequenz
enthält,
wird in eine Stelle, stromabwärts
zum Promotor in Transkriptionsrichtung insertiert. Bei der Konstruktion
des Expressionsplasmids für
das Protein können
zwei oder drei Stücke
des DNA-Fragments des Gens, das für das Protein codiert, zusammengefügt werden
und zur Insertion stromabwärts
vom Promotor verwendet werden. Es ist auch möglich, einen solchen Promotor,
wie den SV40-Promotor, an die 5'-Stromaufwärtsseite
des DNA-Fragments
des Gens, das für
das Protein codiert, anzufügen
um ein Einheitsinsert zu erhalten, und in einen Vektor zwei oder drei
solcher Einheiten, die in derselben Transkriptionsrichtung aneinander
gebunden sind, zu insertieren. An die stromabwärtige Seite des Gens, das für das Protein
codiert, wird eine Polyadenylierungsstelle angefügt. Z. B. kann die Polyadenylierungsstelle,
die aus der SV40-DNA, dem -Globingen oder dem Metallothioneingen stammt,
an die stromabwärts
gelegene Seite des Gens, das für
das Protein codiert, gebunden werden. Wenn ein DNA-Fragment, das einen
Promotor und das Gen, das für
das Protein codiert, aneinander gefügt umfasst, verdoppelt oder
verdreifacht wird, kann jede Einheit eine Polyadenylierungsstelle
an der 3'-Seite
des Gens, das für
das Protein codiert, enthalten. Beim Transformieren von Tierzellen,
z. B. CHO-Zellen, mit einem solchen Expressionsvektor kann ein Arzneimittelresistenzgen
zum Zwecke der Expressionszellselektion verwendet werden. Als Arzneimittelresistenzgen
können
genannt werden: das DHFR-Gen, das Resistenz gegen Methotrexat bereitstellt
(J. Mol. Biol., 159, 601 (1982)), das Neo-Gen, das Resistenz gegen
das Antibiotikum G-418 bereitstellt (J. Mol. Appl. Genet. 1, 327
(1982)), das von Escherichia coli stammende Ecogpt-Gen, das Resistenz
gegen Mycophenolsäure
bereitstellt (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 2072 (1981)) und das
hph-Gen, das Resistenz gegen das Antibiotikum Hygromycin (Mol. Cell.
Biol., 5, 410 (1985)) bereitstellt, und andere. Jedes Resistenzgen
enthält
einen Promotor, z. B. den oben genannten von SV40-abgeleiteten Promotor,
insertiert an der 5'-stromaufwärts gelegenen
Seite, und eine Polyadenylierungsstelle, wie sie oben beschrieben wurde,
an der 3'-stromabwärts gelegenen
Seite jedes Resistenzgens. Beim Insertieren eines solchen Resistenzgens
in den Expressionsvektor für
das Protein kann das Gen an einer Stelle stromabwärts von
der Polyadenylierungsstelle des Gens, das für das Protein codiert, in derselben
oder der entgegengesetzten Richtung insertiert sein. Diese Expressionsvektoren
machen es unnötig,
eine zweifache Transformation mit einem anderen Plasmid, das ein
selektives Markergen zum Zweck der Transformantenisolierung enthält, durchzuführen. Wenn
der Expressionsvektor für
das Protein kein derartiges selektives Markergeninsert enthält, kann
ein Vektor, der einen für
die Transforman tenselektion geeigneten Marken hat, z. B. pSV2neo
(J. Mol. Appl. Genet., 1, 327 (1982)), pMBG (Nature, 294, 228 (1981)),
pSV2gpt (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 2072 (1981)) oder pAd·D26·1 (J.
Mol. Biol., 159, 601 (1982)) in Kombination mit dem Expressionsvektor
für das
Gen, das für
das Protein codiert, zur Transformation verwendet werden, um es
dadurch einfach zu machen, eine Transformantenselektion auf der
Basis der Phänotypexpression
des Arzneimittel-Resistenzgens durchzuführen.
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Der
Expressionsvektor kann z. B. durch das Calciumphosphatverfahren
(Virology, 52, 456 (1973)) oder das Elektroporationsverfahren (J.
Membr. Biol., 10, 279 (1972)) in Tierzellen eingeführt werden.
Die transformierten Tier-zellen können in herkömmlicher
Weise als Suspensionskultur oder Adhäsionskultur kultiviert werden.
Sie werden in einem Medium, z. B. MEM oder RPMI 1640 in Gegenwart
von 5 bis 10% Serum oder in Gegenwart einer geeigneten Mengen an
Insulin, Transferrin oder dergleichen oder unter serum-freien Bedingungen
kultiviert. Ferner ist es auch möglich,
das Protein unter Verwendung von Mikroorganismen, wie Hefen oder
Escherichia coli, z. B. Stämmen
von Saccharomyces cerevisiae oder dem Stamm Escherichia coli YA-21,
zu produzieren. Da die Zellen das Protein im Kulturüberstand
oder an der Zelloberfläche
exprimieren, ist es möglich,
das Protein zu gewinnen und zu reinigen, indem der Zellüberstand
oder Zellen dieser Transformante verwendet werden. Spezifischer
ausgedrückt,
das Protein kann isoliert und gereinigt werden, indem der Kulturüberstand
oder der Zell-extrakt,
der das produzierte Protein enthält,
einem geeigneten Chromatographiever-fah-ren, z. B. einer chromatographischen
Behandlung unter Ver-wendung von Heparin-Sepharose, ConA-Sepharose, Hydroxyapatit
und dergleichen in Kombination, unterworfen wird.
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Das
Proteaseinhibitoraktivität-besitzende
Protein der vorliegenden Erfindung hat eine inhibierende Aktivität auf die
Proteaseaktivität
von HGF-Aktivator und ist daher in vitro oder in vivo als regulatorischer
Faktor für
den HGF-Aktivator
oder indirekt als HGF-Aktivität-regulierender
Faktor einsetzbar. Das Protein wie auch ein Antikörper gegen
das Protein oder ein Gen, das für
das Protein codiert, ist außerdem
als Werkzeug oder Mittel zur Funktionsanalyse der Faktoren nützlich.
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Durch
Einführung
eines Expressionsvektors, der ein Gen trägt, das für das Protein codiert, in Tierzellen
wird es außerdem
möglich,
einen Teil des Proteins oder das gesamte Protein oder eines Proteinäquivalents dazu,
das biologisch aktiv ist, in stabiler weise und in großen Mengen
zu produzieren. Dies war bisher schwierig zu erreichen.
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Die
vorliegende Erfindung wird nun detaillierter anhand der folgenden
Beispiele erläutert.
Allerdings ist es nicht beabsichtigt, sie auf diese Beispiele zu
beschränken.
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BEISPIEL 1
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Reinigung des Proteins
unter Verwendung eines MKN45-Zellkulturüberstands
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MKN45-Zellen
(Naito et al., Gan to Kagaku-ryoho (Cancer and Chemotherapy), 5,
89 (1978)) (erhalten von Meneki Seibutsu Kenkyusho) wurden in eRDF-Medium,
das 5% FBS (fötales
Rinderserum) enthielt, das in einer Schüttelflasche 850 enthalten war,
gesät und
sich vermehren gelassen, bis ein Konfluenzzustand erreicht war.
Dann wurden die FBSenthaltenden Kulturüberstände entfernt und die Zellen
wurden mit zwei Portionen serumfreiem eRDF-Medium gewaschen. Nach
Entfernung des Waschmediums wurden 500 ml serumfreies eRDF-Medium
zugesetzt und die Inkubation wurde 3 bis 6 Tage bei 37°C durchgeführt. Nach
Inkubation wurden die Zellüberstande
gewonnen, es wurden 500 ml frisches serumfreies eRDF-Medium zugesetzt
und es wurde erneut eine Inkubation durchgeführt. Dieses Verfahren wurde
mehrmals wiederholt. Die so gewonnenen Kulturüberstände wurden kombiniert und etwa
20-fach konzentriert, wobei eine YM30-Ultrafiltrationsmembran (Amicon)
verwendet wurde.
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Dieses
Konzentrat wurde einer Heparin-Sepharose-Säule (äquilibriert mit PBS) unterworfen
und die nicht-adsorbierte
Fraktion wurde gewonnen. Diese Fraktion wurde einer ConA-Sepharose-Säule (äquilibriert mit
PBS) unterworfen und in die nicht-adsorbierte Fraktion und eine
adsorbierte Fraktion, welche mit einer PBS-Lösung, die 20 mM α-Methyl-D-mannosid
enthielt, eluiert wurde, getrennt. Die an ConA adsorbierte Fraktion
wurde unter Verwendung von YM30 konzentriert, darauf folgte ein
Pufferwechsel zu 10 mM Phosphatpuffer (pH 6,8), der 1 M Ammoniumsulfat
enthielt. Die neue Lösung
wurde einer HPLC unter Verwendung von Phenyl-5PW (Tosoh Corp.; äquilibriert
mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 6,8), der 1 M Ammoniumsulfat enthielt), gefolgt
von einer linearen Konzentrationsgradientenelution mit 1 M Ammoniumsulfat
bis 0 M Ammoniumsulfat. Eine Fraktion, die die gewünschte Proteaseinhibitoraktivität enthielt,
wurde auf diese Weise gewonnen.
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Die
Fraktion wurde gegen 20 mM Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 8), der
0,05% CHAPS enthielt, dialysiert und danach einer HPLC unterworfen,
bei der DEAE (äquilibriert
mit 20 mM Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 8), enthaltend 0,05% CHAPS),
gefolgt von einer linearen Konzentrationsgradientenelution mit 0
M bis 500 mM NaCl, verwendet wurde, wodurch eine Fraktion mit der
gewünschten
Proteaseinhibitoraktivität
isoliert wurde. Die Fraktion wurde gegen 5 mM Phosphatpuffer (pH
6,8), der 0,05% CHAPS enthielt, dialysiert und dann einer HPLC unter
Verwendung einer HCA A-4007-Säule (Produkt
von Mitsui Toatsu Chemicals) (äquilibriert
mit 5 mM Phosphatpuffer (pH 6,8), der 0,05 CHAPS enthielt) unterzogen
und die nicht-adsorbierte Fraktion wurde gewonnen. Die Fraktion
wurde GS-520 (äquilibriert mit
PBS, der 0,05% CHAPS enthielt) unterworfen und es wurde eine aktive
Fraktion (Fraktion mit etwa 50 bis 30 kDA) isoliert. Zur Eliminierung
kleinerer Banden wurde die Fraktion auf eine YMC-Pack-C4-Säule (erhalten
von YMC) aufgebracht, es wurde eine lineare Konzentrationsgradientenelution über 30 Minuten
durchgeführt,
wobei Acetonitril-Isopropylalkohol (3/7), enthaltend 0,1% TFA und
mit variierender Konzentration von 10% bis 50% verwendet wurde;
die aktive Fraktion wurde mit 1 M Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 8) neutralisiert
und dann unter reduziertem Druck getrocknet. Nach dem Trocknen wurde
der erhaltene Feststoff in PBS, der 0,05% CHAPS enthielt, gelöst, wobei
eine gereinigte Proteinlösung erhalten
wurde.
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BEISPIEL 2
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Bestimmung der amino-terminalen
Aminosäuresequenz
und einer partiellen Aminosäuresequenz
des Proteins
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Das
Protein, das Proteaseinhibitoraktivität hat, das in Beispiel 1 gereinigt
wurde und durch reverse-phase-HPLC eluiert wurde, wurde unter verringertem
Druck ohne Neutralisation getrocknet. Dann wurde es in 60 μl 50% TFA
(Trifluoressigsäure)
gelöst,
auf einen mit Polybren behandelten Glasfilter gegeben und an einem
Applied Biosystems Modell 470A-Sequencer einem Edman-Abbau unterworfen;
die Aminosäuresequenz
einer N-terminnalen Region wurde bestimmt. Phenylhydantoin (PTH)-Aminosäuren wurden
unter Verwendung einer Mitsubishi Chemical s MCI-Gel-ODS-IHU-Säule (0,46 × 15 cm) identifiziert und
es wurde eine Ein-Lösungsmittelelution
mit Acetatpuffer (10 mM Acetatpuffer (pH 4,7), 0,01% SDS, 38% Acetonitril)
mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 1,2 ml/Minute und bei einer
Temperatur von 43°C
durchgeführt.
PTH-Aminosäuren
wurden auf der Basis der Extinktion bei 269 nm detektiert.
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Als
Resultat wurde die N-terminale Aminosäuresequenz, die unten in Tabelle
1 dargestellt ist, identifiziert.
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Dann
wurde dasselbe Protein mit Proteaseinhibitoraktivität, wie es
in Beispiel 1 gereinigt worden war und durch reversed-phase-HPLC
eluiert worden war, in 100 μl
50 mM Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 9,0), enthaltend 4 M Harnstoff,
gelöst;
Lysylendopeptidase (Achromobacter-Protease-I) wurde der Lösung zugesetzt und die Reaktion
wurde für
8 Stunden bei 37°C
durchgeführt.
Das resultierende Peptidgemisch wurde durch reversed-phase-HPLC
unter Verwendung einer YMC-Pack-C8-Säule (YMC) getrennt, wodurch
die jeweiligen Peptidfragmente erhalten wurden. Sechs Peptide wurde
einer Aminosäureanalyse
unter Verwendung eines Gasphasen-Sequencers
(Applied Biosystems, Modell 1470A) unterworfen. Es wurden die in
Tabelle 1 dargestellten Sequenzen gefunden.
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Tabelle
1
Aminosäuresequenzen
von Peptiden
-
Partielle
Aminosäuresequenzen
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BEISPIEL 3
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Reinigung des Proteins
unter Verwendung eines A549-Zellkulturüberstands
und Aminosäuresequenzanalyse
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Es
wurde ein Kulturüberstand
hergestellt, indem A549-Zellen
(erhalten von der Japanese Cancer Research Resources Bank) in der
gleichen weise wie in Beispiel 1 kultiviert wurde.
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Unter
Verwendung des Kulturüberstandes
und indem in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 vorgegangen wurde,
wurde ein Protein mit inhibierender Aktivität auf die Proteaseaktivität von HGF-Aktivator
erhalten. Nach SDS-PAGE zeigte dieses Protein dasselbe Molekulargewicht
wie das, das von MKN45-Zellen stammte. wenn es derselben Bestimmung
der N-terminalen Aminosäuresequenz
wie in Beispiel 1 unterzogen wurde, lieferte dieses Protein dieselbe
Sequenz wie das aus MKN45-Zellen abgeleitete Protein. Dies legt
die Möglichkeit
nahe, dass das Protein mit dem von MKN45-abgeleiteten Protein identisch ist.
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BEISPIEL 4
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Verfahren zur Untersuchung
der Aktivität
des Proteins, das die Proteaseaktivität von HGF-Aktivator hemmt, wie
auch die Aktivität
-
Ein
bis zehn μl
der zu untersuchenden Probe wurden zu 30 bis 40 μl PBS-0,05% CHAPS-Lösung, die 2
bis 5 ng von Serum abgeleitetem HGF-Aktivator enthielt, gegeben.
Nach 30minütiger
Inkubation bei 37°C wurden
5 bis 10 μg
Einzelketten-HGF zugesetzt und die Inkubation wurde für weitere
2 Stunden fortgesetzt. Dieses Inkubationsgemisch wurde einer SDS-Folyacrylamidgelelektrophorese
unter reduzierenden Bedingungen unterworfen. Nach der Elektrophorese
wurde eine Färbung
mit Coomassie-Brilliantblau-R250 (CBB) durchgeführt und zur Aktivitätsdetektion
wurden die Verhältnismengen
von Einzelketten-HGF und Doppelketten-HGF verglichen.
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Das
gereinigte Protein (10 ng) und 5 ng aus Serum stammendem HGF-Aktivator
wurden in 30 bis 40 μl
PBS-0,05% CHAPS-Lösung bei
37°C für 30 Minuten
inkubiert, dann wurden 10 μg
Einzelketten-HGF zugesetzt und die Inkubation wurde für weitere
2 Stunden fortgesetzt. Das Inkubationsgemisch wurde einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
unter reduzierenden Bedingungen, gefolgt von einem Färben mit
CBB unterworfen. Die Resultate sind in 1 dargestellt. In der Figur gibt die
Nummer 1 den Fall an, in dem weder der HGF-Aktivator noch das Protein
zugesetzt wurden, gibt 2 den Fall an, bei dem der HGF-Aktivator
zugesetzt wurde, aber das Protein nicht zugesetzt wurde, und gibt
3 den Fall an, in dem der HGF-Aktivator und das Protein zugesetzt
wurden. Ein Zusatz des Proteins führt zu einer Unterdrückung der
Aktivität
des HGF-Aktivators, der Einzelketten-HGF in Doppelketten-HGF umwandelt.
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BEISPIEL 5
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SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
-
Zur
Bestimmung des scheinbaren Molekulargewichts des Proteins, das Proteaseinhibitor-Aktivität hat, wie
es aus dem MKN45-Zellkulturüberstand
oder A549-Zellkulturüberstand
in Beispiel 1 oder Beispiel 2 gereinigt worden war, wurde das Protein
einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Das endgültig gereinigte
Protein wurde der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
unter Verwendung von 12,5% Polyacrylamid-Plattengelen unterzogen,
die unter nicht-reduzierenden
Bedingungen durchgeführt
wurde. Die verwendeten Molekulargewichtsmarker waren die Molekulargewichtsmarker "Daiichi" III für das Laemmli-verfahren (Daiichi
Pure Chemicals). Nach der Elektrophorese wurde eine Farbentwicklung
unter Verwendung eines Silberfärbungsreagenses
(Kanto Chemical) durchgeführt.
Nach einem relativen Vergleich der Wanderungsentfernung zwischen
dem Protein und den Molekulargewichtsmarkern zeigte das Protein,
das aus dem MKN45-Zellkulturüberstand
oder dem A549-Zellkulturüberstand
erhalten worden war, verschiedene Fragmente oder eine Schmierbande,
vermutlich infolge der Unterschiede in der Zuckerkette, einer Aminosäurerestmodifikation
oder am terminalen Bereich, in Positionen bei etwa einem scheinbaren
Molekulargewicht von etwa 40.000 Dalton, wie es durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
bestimmt worden war.
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BEISPIEL 6
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Clonierung eines Gens,
das für
das Protein codiert, und Basensequenzbestimmung
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Zwei
Oligonukleotidprimer (Primer 1 und Primer 2) wurden hergestellt,
die aus den Sequenzen Gly-Ala-Asp-Cys-Leu-Asn und Gly-Phe-Val-Leu-Asp-Thr,
die in der N-terminalen Aminosäuresequenz
(SEQ ID NO: 1 im Sequenzprotokoll) des in Beispiel 2 erhaltenen
Proteins enthalten sind, bestimmbar waren. zwei weitere Oligonukleotidprimer
(Primer 3 und Primer 4) wurden synthetisiert, die aus den Sequenzen Ser-Phe-Val-Tyr-Gly-Gly
(SEQ ID NO: 5) und Gln-Val-Glu-Leu-Trp-Gly (SEQ ID NO: 6) in der partiellen
Aminosäuresequenz
(Sequenzprotokoll 1) des Proteins bestimmbar waren.
-
Die
Sequenzen dieser Primer sind nachfolgend angegeben:
Primer
1: Gemisch aus 5'-GGNGCNGAYTGYTTRAA-3' (SEQ ID NO: 10 im
Sequenzprotokoll) und 5'-GGNGCNGAYTGYCTNAA-3' (SEQ ID NO: 1 im
Sequenzprotokoll);
Primer 2: Gemisch aus 5'-GTRTCYAANACRAANCC-3' (SEQ ID NO: 2 im Sequenzprotokoll)
und 5'-GTRTCNAGNACRAANCC-3' (SEQ ID NO: 3 im
Sequenzprotokoll);
Primer 3: Gemisch aus 5'-CCNCCRTANACRAANGA-3' (SEQ ID NO: 4 im Sequenzprotokoll)
und 5'-CCNCCRTANACRAARCT-3' (SEQ ID NO: 5 im
Sequenzprotokoll);
Primer 4: Gemisch aus 5'-CCCCANAGYTCNACYTG-3' (SEQ ID NO: 6 im Sequenzprotokoll)
und 5'-CCCCAYAAYTCNACYTG-3' (SEQ ID NO: 8 im
Sequenzprotokoll).
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(In
den obigen Sequenzen steht N für
A, G, C oder T, steht Y für
C oder T und steht R für
A oder G).
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Getrennt
davon wurde Gesamt-RNA aus MKN45-Zellen (einer Magen-Krebszelllinie)
nach dem Verfahren, das in Anal. Biochem., 162, 156 (1987) beschrieben
ist, hergestellt und auf eine oligo(dT)-Säule aufgebracht, wodurch poly(A)+RNA
hergestellt wurde.
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Dann
wurde ein Versuch unternommen um ein cDNA-Fragment zu erhalten,
das der N-terminalen Aminosäuresequenz
des Proteins entspricht. Unter Verwendung der poly(A)+RNA, hergestellt
aus MKN45-Zellen, als Matrize und unter Verwendung der zwei Oligonukleotidprimer
(Primer 1 und Primer 2), hergestellt wie oben beschrieben, wurde
eine RT-PCR (Umkehrtranskriptions-Polymerasekettenreaktion; siehe
K. Hayashi (Herausg.): "PCR
Ho no Saishin Gijutsu (State-of-art Techniques of PCR)", Seite 44 und Seite
52, veröffentlicht am
5. Februar 1995 von Yohdosha) durchgeführt. Das Reaktionsgemisch,
das durch die RT-PCR erhalten worden war, wurde durch eine Polyacrylamid-Gelelektrophorese
analysiert, wonach ein DNA-Fragment mit etwa 56 bp detehtiert wurde.
Dieses DNA-Fragment wurde aus dem Polyacrylamidgel extrahiert, gefolgt
von einer Phenol-Chloroform-Extraktion und einer Ethanol-Präzipitation,
wodurch das DNA-Fragment gewonnen wurde. Die Basensequenz des DNA-Fragments
wurde durch das Didesoxyverfahren bestimmt.
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Dann
wurde ein Primer, der einen Teil dieser Basensequenz umfasste, 5'-AACAGCTTTACCG-3' (Primer 5) (SEQ
ID NO: 7 im Sequenzprotokoll) synthetisiert und zum Erhalt der cDNA
wie folgt verwendet.
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Eine
PCR wurde unter Verwendung der poly(A)+RNA (als Matrize), die vorher
aus MKN45-Zellen hergestellt worden war, und des Primers 3 und des
Primers 5 durchgeführt.
Ferner wurde unter Verwendung der so erhaltenen PCR-amplifizierten DNA,
des Primer 4 und des Primers 5 eine PCR durchgeführt. Als Resultat wurde ein
480 bp-DNA-Fragment,
das für
das Protein spezifisch ist, erhalten. Das so erhaltene 480 bp-DNA-Fragment
wurde nach dem Verfahren, das in "Molecular Cloning" (Cold Spring Harbor Laboratory, 1982)
beschrieben wurde, mit 32P markiert und
als Durchmusterungssonde verwendet.
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Eine
humane Plazenta-cDNA-Bibliothek (Clonetec) wurde als Bibliothek
zum Erhalt der Volllängen-cDNA
für das
Protein verwendet. Zuerst wurde Escherichia coli Y-1090 mit einem
Phagen, hergestellt in Form einer humanen Plazenta-cDNA-Bibliothek (λgt11, Clonetec),
infiziert um etwa 4 × 105 Plaques zu erhalten; dann wurde eine Inkubation
in NZY-Medium über Nacht
bei 42°C
durchgeführt.
Danach wurden die Plaques auf eine Gene Screening Plus-Membran (du
Pont) transferriert. Die Membran wurde auf ein Filterpapier gelegt, das
mit 0,1 M Natriumhydroxid-0,5 M Tris- Hydrochlorid-Puffer (pH 7,5) imprägniert war
und für
2 Minuten stehengelassen und danach auf ein Filterpapier gelegt,
das mit 1,5 M Natriumchlorid-0,5 M Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 7,5) imprägniert war
und 5 Minuten stehengelassen. Nach zwei oder mehr Wiederholungen
dieser Behandlungsreihen wurde die Membran mit 2 × SSC (zweifach
konzentriertes SSC) gewaschen und auf einem trockenen Filterpapier
luftgetrocknet. Diese Membran wurde mit UV-Licht mit einer Dosis
von 20 mJ/cm2 zur Fixierung der DNA, die
auf die Membran übertragen
worden war, bestrahlt. Die so behandelte Membran wurde in 50 ml
einer Lösung,
umfassend 50 mM Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 7,5), 1 M Natriumchlorid
und 1% SDS, eingetaucht und für
2 Stunden bei 65°C
in diesem Zustand gehalten.
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Dann
wurde die Membran in 40 ml einer Lösung, umfassend 5 ng/ml der
oben genannten 32P-markierten Sonde, 100 μg/ml Lachssperma,
50 mM Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 7,5), 1 M Natriumchlorid und
1% SDS, eingetaucht und für
16 Stunden bei 65°C
in diesem Zustand gehalten. Danach wurde diese Membran mit 2 × SSC bei
Raumtemperatur für
5 Minuten gewaschen und dann mit zwei Portionen 0,1 × SSC bei
Raumtemperatur für
30 Minuten gewaschen und einer Autoradiographie unterzogen, welche
84 positive Clone ergab, die vermutlich cDNA für das Protein enthielten.
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Der
Phage wurde aus jedem Clon mit 500 μl SM-Puffer (50 mM Tris-Hydrochlorid-Puffer
(pH 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumsulfat und 0,01%
Gelatine) und 20 μl
Chloroform extrahiert. Eine 100-μl-Portion
des Phagenextraktes und Escherichia coli Y-1090-Zellen, suspendiert
in 100 μl
10 mM Magnesiumsulfat, wurden miteinander vermischt und das Gemisch
wurde zusammen mit 3 ml Deckschicht-Agarmedium auf LB-Agarmedium
(9 cm) gesät
und über
Nacht bei 37°C
inkubiert. Nach Bestätigung
einer Plaquebildung wurden 3 ml SM-Puffer und mehrere Tropfen Chloroform
zugesetzt und das Ganze wurde für
1 Stunde bei Raumtemperatur stehengelas sen. Dieser Phage-enthaltende
SM-Puffer wurde isoliert und mit 8000 Upm für 10 Minuten zentrifugiert
und der Überstand
wurde isoliert. Eine 10-μl-Portion
der so erhaltenen Phagenlösung
und 300 μl
einer Escherichia coli-Y-1090-Zellsuspension
wurden miteinander vermischt, 10 ml LB-Medium, das 10 mM Magnesiumsulfat enthielt,
wurden zugesetzt und es wurde eine Schüttelkultur bei 37°C durchgeführt. Nach
Bakteriolyse wurden mehrere Tropfen Chloroform zugesetzt und das
Gemisch wurde für
10 Minuten weiter geschüttelt
und für
5 Minuten bei 10.000 Upm zentrifugiert. Der Überstand wurde gewonnen, DNase
I (Endkonzentration, 5 μg/ml)
und RNase (Endkonzentration 2 μg/ml)
wurden zugesetzt und das Gemisch wurde bei 37°C 30 Minuten stehengelassen.
Dann wurden 5 g Natriumchlorid und 1,1 g PEG 6000 zugesetzt, das
Gemisch wurde bei 4°C
1 Stunde stehengelassen und dann für 15 Minuten bei 10.000 Upm
zentrifugiert und der Niederschlag wurde gewonnen. Dieses Präzipitat
wurde in 400 μl
SM-Puffer suspendiert. Die Suspension wurde außerdem einer Phenol-Chloroform-Behandlung
und einer Ethanol-Präzipitation
unterworfen und es wurde eine Phagen-DNA, die cDNA für das Protein
enthielt, gewonnen. Diese DNA wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI
gespalten und die cDNA-Fragmente wurden durch Agarosegelelektrophorese
analysiert. Die längste
cDNA-Fragmentbande in dieser Agarosegelelektrophorese wurde getrennt
und extrahiert und das cDNA-Fragment wurde an der EcoRI-Stelle in
den Plasmidvektor pUC19 insertiert. Auf diese Weise wurde ein Plasmidvektor,
pHAI, der cDNA für
das Protein enthielt, aufgebaut. Die Basensequenz des cDNA-Inserts
in dem so erhaltenen Plasmidvektor pHAI wurde analysiert und die
Basensequenz des gesamten Gens, das für das Protein codiert, wurde
bestimmt (SEQ ID NO: 8 im Sequenzprotokoll).
-
BEISPIEL 7
-
Herstellung eines Expressionsplasmids
für das
Protein
-
Durch
Behandlung des Plasmids (pHAI), das cDNA für das Protein enthält, wie
es in Beispiel 6 erhalten worden war, mit dem Restriktionsenzym
EcoRI ist es möglich,
das volllängen-cDNA-Fragment,
das für
das Protein codiert (volllängen
cDNA-Fragment für
das Protein, einschließlich
der Translationsinitiationscodon-Basensequenz ATG und des Terminationscodons
TGA), aus dem Plasmidvektor pUC19 zu trennen. So wurde eine Agarosegelelektrophorese
durch das Verfahren von Maniatis et al. ("Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, Seite
164 (1982)) durchgeführt
und es wurde ein etwa 2,4 kb-EcoRI-EcoRI-DNA-Fragment, das die cDNA
für das
Protein enthält,
getrennt und extrahiert. Das so erhaltene DNA-Fragment wurde durch das
herkömmliche
Verfahren unter Verwendung von T4-DNA-Polymerase an den Enden geglättet und
dann wurde das DNA-Fragment durch Phenol-Chloroform-Extralotion
und Ethanol-Präzipitation
gereinigt und in 10 μl
Wasser gelöst.
Getrennt davon wurde 0,05 μg
des Expressionsvektors pME18S (Medical Immunology, 20, 27 (1990))
vorab mit dem Restriktionsenzym Xhol gespalten und das erhaltene
DNA-Fragment wurde durch das herkömmliche Verfahren unter Verwendung
von T4-DNA-Polymerase an den Enden geglättet und dann durch Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation
gereinigt. Es wurde in 400 μl
einer 1 mM MgCl2-Lösung in 50 mM Tris-HCl (pH
8) gelöst,
eine Einheit alkalischer Bakterienphosphatase (Toyobo, BAP-101)
wurde zugesetzt und es wurde für
30 Minuten eine Dephosphorylierungsbehandlung bei 65°C durchgeführt. Dann
wurde das DNA-Fragment aus diesem Reaktionsgemisch durch Phenol-Chloroform-Extralotion
und Ethanol-Präzipitation
gereinigt und in 10 μl
Wasser gelöst.
Es wurde eine Ligationsrealotion in 20 μl eines Reaktionsgemisches (66
mM Tris-HCl, pH 7,6, 6,6 mM MgCl2, 10 mM
Dithiothreitol, 66 μM
ATP), das 0,01 μg
des von pME18S-Vektor abgeleiteten DNA-Fragments, hergestellt wie
oben beschrieben, und 0,1 μg des
oben beschriebenen EcoRI-Fragments der cDNA mit glatten Enden für das Protein
enthielt, in Gegenwart von T4-DNA-Ligase (Toyobo LGA-101) bei 14°C für 12 Stunden
durchgeführt.
Eine 10 μl-Portion
dieses T4-DNA-Ligase-Reaktionsgemisches
wurde verwendet um Escherichia coli HB101 (Takara Shuzo) nach dem damit
Gelieferten manuell zu transformieren. Der Mikroorganismus wurde
in einem Medium, enthaltend 50 μg/ml
Ampicillin, kultiviert und es wurden Scores Ampicillin-resistenter
Stämme
erhalten. Diese Transformanten wurden durch das Verfahren von Maniatis
("Molecular Cloning", Cold Spring Harbor
Laboratory, Seiten 86–96
(1982)) analysiert und als Resultat konnte ein Plasmid, pME18S-HAI,
das das Gen, das für
das Protein codiert, wie es an der XhoI-Restriktionsenzym-Spaltungsstelle
insertiert ist, welche zwischen dem Promotor und der Polyadenylierungsstelle
des Expressionsvektors pME18S auftritt, enthält, erhalten werden. Seine Struktur
ist in 2 dargestellt.
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BEISPIEL 8
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Erhalt einer Zelllinie,
die das Protein exprimiert
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Das
Plasmid pME18S-HAI, das in Beispiel 7 konstruiert wurde, und die
cDNA für
das Protein, wie sie an der Xhol-Restriktionsenzym-Spaltungsstelle
des Expressionsvektors pME18S insertiert war, enthält, wurde gewonnen
und nach dem Verfahren von Maniatis aus dem rekombinanten Escherichia
coli gereinigt ("Molecular
Cloning", Cold Spring
Harbor Laboratory, Seiten 86–96
(1982)). Auf diese Weise wurde eine große Menge der Expressionsplasmid-DNA
für das
Protein erhalten. COS-Zellen wurden durch Transfektion mit der Expressionsplasmid-DNA
transformiert. COS-Zellen wurden somit zuerst in eRDF-Medium, das
10% FBS (fötales Rinderserum)
enthielt, in Gewebekulturschalen, 9 cm im Durchmesser, bis zum halbkonfluenten
Zustand kultiviert. Dann wurde das Medium aus den Schalen entfernt
und eine DNA-Lösung, die
wie unten beschrieben hergestellt worden war, wurde tropfenweise
zugesetzt, wie es unten beschrieben wird. Zuerst wurde für jede Schale
mit einem Durchmesser von 9 cm eine Lösung in einem Eppendorf-Zentrifugenröhrchen hergestellt, indem
300 μl 2 × HEBS-Lösung (2 × HEBS-Lösung: 1,6%
Natriumchlorid, 0,074% Kaliumchlorid, 0,05% Dinatriumhydrogenphosphatdodecahydrat,
0,2% Dextrose, 1% HEPES (pH 7,05)) und 10 μg Plasmid-DNA eingefüllt wurden
und das Volumen mit sterilisiertem Wasser auf 570 μl ergänzt wurde.
Während
30 μl 2,5
M Calciumchloridlösung
zu der DNA-Lösung
gegeben wurden, wurde der Röhrcheninhalt
kräftig
unter Verwendung eines Vortex-Mischers für mehrere Sekunden gerührt. Das
resultierende Gemisch wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen,
wobei gelegentlich in Intervallen von etwa 10 Minuten unter Verwendung
eines Vortex-Mischers gemischt wurde. Die so hergestellte DNA-Lösung wurde auf die oben beschriebenen
Zellen geschichtet und das Ganze wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur
stehengelassen. Dann wurden 9 ml eRDF-Medium (Kyokuto Pharmaceutical),
ergänzt
mit 10% FBS, in jede Schale gegeben und die Inkubation wurde für 4 bis
5 Stunden in Gegenwart von 5% CO2 bei 37°C durchgeführt. Dann
wurde das Medium aus jeder Schale entfernt und die Zellen wurden
mit 5 ml 1 × TBS++-Lösung (1 × TBS++-Lösung: 25
mM Tris-Hydrochlorid
(pH 7,5), 140 mM Natriumchlorid, 5 mM Kaliumchlorid, 0,6 mM Dinatriumhydrogenphosphat,
0,08 mM Calciumchlorid, 0,08 mM Magnesiumchlorid) gewaschen. Nach
Entfernen der 1 × TBS++-Lösung wurden
die Zellen mit 5 ml 1 × HEBS-Lösung, die
10% DMSO (Dimethylsulfoxid) enthielt, pro Schale bedeckt und bei
Raumtemperatur für
i bis 2 Minuten stehengelassen. Dann wurde der Überstand entfernt. Die Zellen
wurden erneut mit 5 ml 1 × TBS++-Lösung gewaschen,
10 ml eRDF-Medium, ergänzt
mit 10% FBS, wurden in jede Schale gegeben und es wurde eine Inkubation
bei 37°C
in Gegenwart von 5% CO, durchgeführt.
Nach Ablauf von 48 Stunden wurde das Medium gewonnen. Der gewonnene Überstand wurde
20fach konzentriert und auf inhibierende Aktivität gegen HGF-Aktivator in der
gleichen Weise wie in Beispiel 4 untersucht. Die inhibierende Aktivität wurde
bestätigt.
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