DE69334146T2

DE69334146T2 - Peptide mit gdp-austauschfaktorartiger wirkung, dafür kodierende nukleinsäuresequenzen, ihre herstellung und verwendung

Info

Publication number: DE69334146T2
Application number: DE69334146T
Authority: DE
Inventors: Fabien Schweighoffer; Bruno Tocque
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1992-04-21
Filing date: 1993-04-19
Publication date: 2008-01-31
Anticipated expiration: 2013-04-20
Also published as: WO1993021314A1; ES2287927T3; JP3681384B2; FR2690162A1; ATE364079T1; PT637334E; EP0637334B1; CA2131166A1; US5656595A; DE69334146D1; DK0637334T3; JPH07505774A; FR2690162B1; EP0637334A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Peptid- und Nukleotidsequenzen und deren pharmazeutische Verwendung. Die Erfindung betrifft insbesondere Peptide, die in der Lage sind, die Spiegel des Austausches von GDP an p21-GDP-Komplexen zu modulieren.
Die Produkte der ras-Gene, die im Allgemeinen als p21-Proteine bezeichnet werden, spielen eine Schlüsselrolle bei der Kontrolle der Zellteilung bei allen eukaryotischen Organismen, bei denen sie erforscht wurden. Bestimmte spezifische Modifikationen dieser Proteine lassen sie ihre normale Kontrolle verlieren und führen dazu, dass sie onkogen werden. Folglich wurde eine große Anzahl menschlicher Tumoren mit der Gegenwart von modifizierten ras-Genen assoziiert. Außerdem kann eine Überexpression dieser p21-Proteine zu einer Störung der Zellproliferation führen. Das Verständnis der genauen Rolle dieser p21-Proteine in den Zellen, ihrer Funktionsweise und ihrer Merkmale stellt daher ein wichtiges Thema für das Verständnis und den therapeutischen Ansatz der Karzinogenese dar.
In vivo ist die genaue Art der Ereignisse noch nicht bekannt, die für die Aktivierung der p21-Proteine verantwortlich sind. Man weiß, dass sie ihre Funktionen ausüben, indem sie zwischen zwei Konformationszuständen oszillieren: Eine inaktive Form, die an das GDP gebunden ist, und eine aktive Form, die an das GTP gebunden ist, aber die Faktoren, die den Übergang zwischen diesen beiden Formen auslösen, sind nicht eindeutig identifiziert. Aktuelle Arbeiten berichten über physiologische Situationen, in deren Verlauf sich der Anteil der ras-Proteine, die an GTP gebunden sind, in der Zelle erhöht. Es handelt sich um die Aktivierung der T-Lymphozyten und die Stimulation der 3T3-Fibroblasten durch Wachstumsfaktoren, darunter EGF und PDGF (Downward et al., Nature 346 (1990) 719; Gibbs et al., J. Biol. Chem. 265 (1990) 20437). Die Erhöhung des Anteils an p21-GTP lässt sich mindestens zum Teil durch das Wirken eines Proteins erklären, das eine ähnliche Rolle spielt, wie die eines Rezeptors für die G-Proteine zur Transduktion. In diesem Zusammenhang wurden bestimmte Proteine, die in der Lage sind, den Austausch von GDP an den p21-Proteinen zu fördern, aus Rinderhirn (West et coll., FEBS Lett. 259 (1990) 245) und Rattenhirn (Wolfman und Macara, Science 248 (1990) 67) identifiziert. Die unterschiedliche zelluläre Lage dieser Faktoren und die sehr verschiedenen Versuchsbedingungen, unter denen sie erhalten wurden, lassen vermuten, dass es sich um verschiedene Proteine handelt. Sie wirken gleichermaßen auf die normalen ras-Proteine wie auf diejenigen, die onkogen sind. Diese Aktivitäten werden unter dem Begriff GEF zusammengefasst: Guaninnukleotid-Austauschfaktor oder GRF.
Bei der Hefe Saccharomyces cerevisiae wurde die GRF-Aktivität auf das Produkt des CDC25-Gens (Camonis et al., EMBO J. 5 (1986) 375) zurückgeführt, und es wurden Untersuchungen realisiert, um den Signalweg zu verstehen, der einerseits das Produkt der Gene CDC25, RAS1 und RAS2, und andererseits die Adenylatcyclase bei der Hefe Saccharomyces cerevisiae eingreifen lässt. Insbesondere konzentrierten sich zahlreiche Arbeiten auf die Charakterisierung des Produkts des CDC25-Gens, das das am wenigsten bekannte Element dieser Kette war. Das Produkt des CDC25-Gens bildet das Element, das am weitesten stromaufwärts der Reaktionskaskade liegt, was zur Aktivierung von p21 bei der Hefe führt. Die auf diesem Gebiet realisierten Arbeiten haben dazu beigetragen, zu zeigen, dass das Produkt dieses Gens als GDP → GTP-Austauschfaktor wirken muss, um die ras-Proteine zu aktivieren. Ein zweites Gen der Hefe S. cerevisiae, SDC25, das eine sehr ähnliche Struktur wie CDC25 aufweist, wurde isoliert und charakterisiert. Die aktive Domäne von SDC25 scheint ein Austauschfaktor zu sein, der in der Lage ist, in vitro und in vivo auf die ras-Proteine zu wirken. Diese Domäne ist der erste molekulare Bestandteil mit dieser Aktivität, der beschrieben wurde.
Unlängst wurde ebenfalls ein Protein vom Typ GRF bei der Maus nachgewiesen (Vanoni und Martegani, J. Cell. Bioch. Suppl. 16B (1992) 220). Die Aufreinigung eines Proteins bovinen Ursprungs, das rho-GDI (GDP Dissociation Inhibitor) genannt wurde, das den GDP-GTP-Austausch des rho-Proteins reguliert, wurde beschrieben (Fukumoto et al. Oncogene (1990), 5, pp. 1321), sowie das Klonieren eines Proteins bovinen Ursprungs, das smg p25A-GDI (GDP Dissociation Inhibitor) genannt wurde, das den GDP-GTP-Austausch des Proteins smg p25A reguliert (Matsui et al. Molecular and Cellular Biology (Aug. 1990) p. 4116–4122).
Bis heute wurde jedoch keine GRF-Aktivität beim Menschen isoliert und charakterisiert. Die vorliegende Erfindung resultiert genau aus dem Nachweis der Existenz eines menschlichen GDP-Austauschfaktors durch die Anmelderin. Die vorliegende Erfindung resultiert insbesondere aus der Identifikation, der Isolierung und der Charakterisierung von Peptiden und Nukleotidsequenzen menschlichen Ursprungs, die mit hGRF und hSOS bezeichnet werden, die in der Lage sind, den Aktivierungszustand der p21-Proteine zu modulieren.
Ein erster Aspekt der Erfindung besteht daher aus Peptiden, die pharmazeutisch verwendbar sind. Eine Aufgabe der Erfindung besteht insbesondere in Peptiden, die in der Lage sind, die Spiegel des Austausches von GDP an p21-GDP-Komplexen zu modulieren. Es versteht sich, dass p21 jedes Expressionsprodukt eines normalen oder onkogenen ras-Gens bezeichnet.
Die Peptide der Erfindung werden insbesondere aus allen oder einem Teil der Sequenzen SEQ ID NR 2, 3, 4, 6 oder 8 oder einem ihrer Derivate ausgewählt.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff Derivat jedes Molekül, das durch Modifikation, genetischer und/oder chemischer Art, dieser Sequenzen erhalten wird, und dabei die gesuchte Aktivität bewahrt. Unter Modifikation genetischer und/oder chemischer Art ist jede Mutation, Substitution, Deletion, Addition und/oder Modifikation eines oder mehrerer Reste zu verstehen. Solche Derivate können zu verschiedenen Zwecken erzeugt werden, wie vor allem dem, die Affinität des Peptids zu seiner Interaktionsstelle zu erhöhen, dem, seine Produktionsspiegel zu verbessern, dem, seine Resistenz gegenüber Proteasen zu erhöhen, dem, seine therapeutische Wirksamkeit zu erhöhen oder seine Nebenwirkungen zu reduzieren, oder dem, ihnen neuartige pharmakokinetische und/oder biologische Eigenschaften zu verleihen.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung sind die Peptide der Erfindung Peptide, die in der Lage sind, den Austausch von GDP am p21-GDP-Komplex zu stimulieren.
In einer anderen besonderen Ausführungsform der Erfindung sind die Peptide der Erfindung Peptide, die in der Lage sind, den Austausch von GDP am p21-GDP-Komplex zu verlangsamen oder zu hemmen. Solche Peptide sind vorzugsweise Peptide, die in der Lage sind, die Interaktion des Austauschfaktors von GDP mit dem p21-GDP-Komplex zu antagonisieren. Es kann sich daher um Fragmente der oben angegebenen Sequenzen oder deren Derivate handeln. Solche Fragmente können auf verschiedene Weise erzeugt werden. Sie können insbesondere auf chemischem Weg auf der Basis von Sequenzen synthetisiert werden, die in dieser Anmeldung genannt werden, unter Verwendung der Peptidsynthetisierer, die dem Fachmann bekannt sind.
Sie können auch auf genetischem Weg synthetisiert werden, durch Expression einer Nukleotidsequenz in einer Wirtszelle, die für das gesuchte Peptid codiert. In diesem Fall kann die Nukleotidsequenz unter Verwendung eines Oligonukleotidsynthetisierers auf der Basis der Peptidsequenz, die in der vorliegenden Anmeldung genannt wird, und des genetischen Codes chemisch hergestellt werden. Die Nukleotidsequenz kann auch aus den Sequenzen hergestellt werden, die in der vorliegenden Anmeldung genannt werden (SEQ ID NR. 1, 5 und 7), durch enzymatische Spaltungen, Ligatur, Klonieren usw., gemäß den Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, oder durch Screenen von DNA-Banken mit Sonden, die aus diesen Sequenzen entwickelt wurden. Ferner können die Peptide der Erfindung, die in der Lage sind, den Austausch von GDP am p21-GDP-Komplex zu verlangsamen oder zu hemmen, auch Peptide sein, die eine Sequenz aufweisen, die der Interaktionsstelle des Austauschfaktors am p21-GDP-Komplex entspricht.
Eine andere Aufgabe der Erfindung besteht in Antikörpern oder polyklonalen oder monoklonalen Antikörperfragmenten, die gegen ein Peptid, wie zuvor definiert, gerichtet sind. Solche Antikörper können durch Methoden erzeugt werden, die dem Fachmann bekannt sind, unter Berücksichtigung der Lehren, die in der vorliegenden Anmeldung dargelegt werden. Die Antikörper können insbesondere durch Immunisierung eines Tiers gegen ein Peptid der Erfindung, Blutentnahme und Isolierung der Antikörper hergestellt werden. Diese Antikörper können auch durch Herstellung von Hybridomen erzeugt werden, gemäß den Techniken, die dem Fachmann bekannt sind.
Stärker bevorzugt weisen die Antikörper oder Antikörperfragmente der Erfindung die Fähigkeit auf, die Interaktion des Austauschfaktors mit dem p21-GDP-Komplex mindestens teilweise zu hemmen. Sie können folglich verwendet werden, um den Aktivierungszustand des Produkts der ras-Gene zu regulieren.
Ferner können die Antikörper ebenfalls verwendet werden, um den Austauschfaktor der menschlichen GDP in biologischen Proben nachzuweisen und/oder zu dosieren, und daher, um über den Aktivierungszustand des Produkts des ras-Gens zu informieren.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es daher, Peptide, die von den Sequenzen SEQ ID NR. 2–4, 6 und 8 abgeleitet sind, sowie Antikörper zu erzeugen, die gegen diese Peptide gerichtet sind, die im Hinblick auf die pharmazeutische Verwendung interessante biologische Eigenschaften aufweisen. Die biologische Aktivität der verschiedenen Peptide und Antikörper der Erfindung zum Austausch von GDP kann auf unterschiedliche Weise bewertet werden, wie in den Beispielen illustriert.
Die Erfindung liefert ebenfalls nicht peptidische oder nicht ausschließlich peptidische Verbindungen, die pharmazeutisch verwendbar sind. Es ist nämlich möglich, ausgehend von den in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen aktiven Proteineinheiten Moleküle zu realisieren, die den ras-Protein-abhängigen Signalweg hemmen, die nicht ausschließlich peptidisch sind und mit einer pharmazeutischen Verwendung kompatibel sind. In diesem Zusammenhang betrifft die Erfindung die Verwendung eines Polypeptids der Erfindung, wie oben beschrieben, zur Herstellung von nicht peptidischen oder nicht ausschließlich peptidischen Molekülen, die auf die Spiegel des Austausches von GDP pharmakologisch wirken, durch Bestimmung der Strukturelemente dieses Polypeptids, die für dessen Aktivität wichtig sind, und die Reproduktion dieser Elemente durch nicht peptidische oder nicht ausschließlich peptidische Strukturen. Aufgabe der Erfindung sind ebenfalls pharmazeutische Verbindungen, die eine oder mehrere derart hergestellte Moleküle umfassen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls jede Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid, wie oben definiert, codiert. Stärker bevorzugt handelt es sich um eine Sequenz, ausgewählt aus:

(a) allen oder einem Teil der Sequenzen SEQ ID NR. 1, 5 oder 7 und deren komplementärem Strang,
(b) jeder Sequenz, die mit einer Sequenz (a) hybridisiert, und für ein Polypeptid gemäß der Erfindung codiert, und
(c) den von den Sequenzen (a) und (b) aufgrund der Degeneration des genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen.

Die verschiedenen Nukleotidsequenzen der Erfindung können künstlichen oder nicht künstlichen Ursprungs sein. Es kann sich um genomische Sequenzen, cDNA, RNA, hybride Sequenzen oder synthetische oder halbsynthetische Sequenzen handeln. Diese Sequenzen können zum Beispiel durch Screenen von DNA-Banken (cDNA-Bank, genomische DNA-Bank) mittels Sonden erhalten werden, die auf der Basis der Sequenzen SEQ ID NR. 1, 5 oder 7 entwickelt wurden. Solche Banken können ausgehend von Zellen verschiedenen Ursprungs durch herkömmliche molekularbiologische Techniken hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Die Nukleotidsequenzen der Erfindung können auch durch chemische Synthese hergestellt werden, vor allem gemäß der Phosphoramidit-Methode, oder auch durch gemischte Methoden, einschließlich der chemischen oder enzymatischen Modifikation der Sequenzen, die durch das Screenen der Banken erhalten wurden.
Die Nukleotidsequenzen gemäß der Erfindung sind auf pharmazeutischem Gebiet entweder zur In-vitro-Produktion von Peptiden der Erfindung oder zur Realisierung von Antisense-Sequenzen oder zur Produktion von Peptiden der Erfindung im Rahmen einer Gentherapie, oder auch zum Nachweis und zur Diagnose, durch Hybridisierungsversuche, der Expression oder einer Überexpression eines verstärkten, mutierten oder umgeordneten GDP-Austauschfaktors in biologischen Proben oder zur Isolierung von homologen Sequenzen aus anderen zellulären Quellen verwendbar.
Zur Produktion der Peptide der Erfindung werden die oben definierten Nukleotidsequenzen im Allgemeinen unter die Kontrolle von Signalen gestellt, die ihre Expression in einer Wirtszelle ermöglichen. Die Wahl dieser Signale (Promoter, Terminatoren, Sekretionsleadersequenzen usw.) kann in Abhängigkeit von der verwendeten Wirtszelle variieren. Vorzugsweise sind diese Nukleotidsequenzen der Erfindung Teil eines Vektors, der autonom replizierend oder integrativ sein kann. Autonom replizierende Vektoren können insbesondere unter Verwendung von Sequenzen hergestellt werden, die eine autonome Replikation in dem ausgewählten Wirt aufweisen. Wenn es sich um integrative Vektoren handelt, können diese zum Beispiel unter Verwendung von Sequenzen hergestellt werden, die mit bestimmten Regionen des Wirtsgenoms homolog sind, und durch homologe Rekombination, die Integration des Vektors ermöglichen.
Die zur Produktion der Peptide der Erfindung verwendbaren Wirtszellen sind sowohl eukaryotische als auch prokaryotische Wirte. Unter den eukaryotischen Wirten, die geeignet sind, können tierische Zellen, Hefen oder Pilze zitiert werden. Insbesondere wenn es sich um Hefen handelt, können die Hefen der Gattung Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces oder Hansenula zitiert werden. Wenn es sich um tierische Zellen handelt, können die Zellen COS, CHO, C127 usw. zitiert werden. Unter den Pilzen können insbesondere Aspergillus ssp. oder Trichoderma ssp. zitiert werden. Als prokaryotische Wirte werden bevorzugt die folgenden Bakterien verwendet: E. coli, Bacillus oder Streptomyces.
Die Nukleinsäuresequenzen gemäß der Erfindung können auch zur Realisierung von Antisense-Oligonukleotiden oder genetischen Antisense-Sequenzen dienen, die als pharmazeutische Mittel verwendbar sind. Die Hemmung der Expression bestimmter Onkogene durch Antisense-Nukleotide hat sich als eine nützliche Strategie für das Verständnis der Rolle dieser Onkogene und als ein besonders viel versprechender Weg bei der Realisierung einer Antikrebsbehandlung erwiesen. Die Antisense-Sequenzen sind kleine Oligonukleotide, die komplementär zu dem Strang sind, der für ein gegebenes Gen codiert, und sind daher in der Lage, spezifisch mit der transkribierten mRNA zu hybridisieren, wobei deren Traduktion in Protein gehemmt wird. Aufgabe der Erfindung sind ebenfalls Antisense-Sequenzen, die in der Lage sind, mindestens teilweise die Produktion von Peptiden zu hemmen, die den Austausch von GDP an p21-GDP-Komplexen stimulieren. Solche Sequenzen können aus allen oder einem Teil der oben definierten Nukleinsequenzen bestehen. Es handelt sich im Allgemeinen um Sequenzen oder um Sequenzfragmente, die zu Sequenzen komplementär sind, die für Peptide codieren, die den Austausch von GDP stimulieren. Solche Oligonukleotide können aus den Sequenzen SEQ ID NR. 1, 5 oder 7 durch Fragmentation usw. oder durch chemische Synthese erhalten werden. Solche Sequenzen können im Rahmen von Gentherapien zum Transfer und der In-vivo-Expression von Antisense-Sequenzen oder Peptiden verwendet werden, die in der Lage sind, die Spiegel des Austausches von GDP an den ras-Proteinen zu modulieren. In diesem Zusammenhang können die Sequenzen in Vektoren eingebaut werden, die vor allem viralen Ursprungs sind.
Die Erfindung betrifft ebenfalls, als Nukleotidsequenzen, synthetische oder nicht synthetische Nukleotidsonden, die in der Lage sind, sich mit den oben definierten Nukleotidsequenzen, die für ein Peptid der Erfindung codieren, oder mit der entsprechenden mRNA zu hybridisieren. Solche Sonden können in vitro als Diagnosewerkzeug zum Nachweis der Expression des GDP-Austauschfaktors oder auch zum Nachweis genetischer Anomalien (schlechtes Spleißen, Polymorphismus, Punktmutationen usw.) verwendet werden. Solche Sonden müssen zuvor markiert werden, und hierfür sind dem Fachmann verschiedene Techniken bekannt. Die Hybridisierungsbedingungen unter denen diese Sonden verwendet werden können, sind Bedingungen normaler Stringenz (vergleiche vor allem die nachfolgenden allgemeinen Klonierungstechniken sowie die Beispiele). Diese Sonden können ebenfalls zum Nachweis und zur Isolierung homologer Nukleinsäuresequenzen verwendet werden, die für ein Peptid der Erfindung codieren, ausgehend von anderen zellulären Quellen, wie in den Beispielen illustriert.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist jede pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff mindestens ein Peptid, wie oben definiert, umfasst.
Ihre Aufgabe ist ebenfalls jede pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff mindestens einen Antikörper und/oder ein Antikörperfragment umfasst, wie oben definiert, sowie jede pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff mindestens ein Antisense-Nukleotid, wie oben definiert, umfasst.
Ihre Aufgabe sind ferner pharmazeutische Zusammensetzungen, in denen die Peptide, Antikörper und Nukleotidsequenzen, die oben definiert wurden, untereinander oder mit anderen Wirkstoffen assoziiert sind.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der Erfindung können verwendet werden, um die Aktivierung der p21-Proteine zu modulieren, und folglich, um die Proliferation bestimmter Zelltypen zu modulieren. Insbesondere sind die pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Behandlung von Krebserkrankungen bestimmt. Zahlreiche Krebserkrankungen wurden nämlich mit der Gegenwart onkogener ras-Proteine assoziiert. Unter den Krebserkrankungen, die am häufigsten mutierte ras-Gene einschließen, können vor allem Adenokarzinome der Bauchspeicheldrüse zitiert werden, bei denen 90% ein mutiertes Ki-ras-Onkogen auf dem zwölften Codon haben [Almoguera et coll., Cell 53 (1988) 549], Adenokarzinome des Dickdarms und Krebserkrankungen der Schilddrüse (50%), oder Lungenkarzinome und myeloische Leukämien [30%, Bos, J.L. Cancer Res. 49 (1989) 4682].
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Verwendung der oben beschriebenen Moleküle zum Modulieren der Aktivität der p21-Proteine. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Moleküle, um mindestens teilweise die Aktivierung der p21-Proteine zu hemmen.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zum Nachweis der Expression und/oder einer Überexpression eines ras-Gens in einer biologischen Probe bereit. Ein solches Verfahren umfasst zum Beispiel das Kontaktieren einer solchen Probe mit einem Antikörper oder Antikörperfragment gemäß der Erfindung, die Visualisierung der Antigen-Antikörper-Komplexe und den Vergleich der erhaltenen Ergebnisse mit einer Standardprobe. In einem solchen Verfahren kann der Antikörper in Suspension oder zuvor auf einem Träger immobilisiert sein. Dieses Verfahren kann auch das Kontaktieren der Probe mit einer Nukleotidsonde gemäß der Erfindung, den Nachweis der erhaltenen Hybride und den Vergleich mit jenen umfassen, die im Fall einer Standardprobe erhalten werden.
Die vorliegende Erfindung kann auf therapeutischem Gebiet verwendet werden: die Peptide, Antikörper und Nukleotidsequenzen der Erfindung sind in der Lage, die Aktivität der ras-Gene zu modulieren, sie ermöglichen es nämlich, in den Prozess der Krebsentstehung einzugreifen. Wie in den Beispielen illustriert, ermöglichen die Nukleotidsequenzen der Erfindung vor allem, Peptide zu exprimieren, die in der Lage sind, die Temperaturempfindlichkeit der Hefen zu komplementieren, die eine cdc25-Mutation tragen. Sie ermöglichen es auch, Peptide zu exprimieren, die in der Lage sind, eine dominante RAS2ts-Mutation zu unterdrücken, die eine Konkurrenz mit dem normalen Expressionsprodukt des CDC25-Gens für die Interaktion mit den p21-Proteinen aufweist. Die Erfindung kann ebenfalls auf dem Gebiet der Diagnose und der Typisierung von Krebserkrankungen verwendet werden: die Antikörper und Nukleotidsonden der Erfindung ermöglichen nämlich die Identifikation der Krebserkrankungen, an denen ein ras-Gen beteiligt ist, sowie die Diagnose der Krebserkrankungen, die mit einer Überexpression eines normalen oder onkogenen ras-Gens verbunden sind.
Andere Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus der Lektüre der folgenden Beispiele hervor, die als illustrierend und nicht beschränkend zu betrachten sind.
Legende der Figuren
1: Transaktivierungstest: Diese Figur zeigt in der x-Achse die Level der CAT-Aktivität (% im Verhältnis zum Hintergrundrauschen) der rekombinanten CHO-Stämme, in Abhängigkeit von der für die Transformation verwendeten cDNA-Sequenz.
2: Test der GTP-Austauschaktivität: Diese Figur zeigt in der x-Achse das Verhältnis der p21-GDP/p21-GTP-Formen der rekombinanten CHO-Stämme, in Abhängigkeit von der für die Transformation verwendeten cDNA-Sequenz.
3: In-vitro-Test der GDP-Austauschaktivität: Diese Figur zeigt in Abhängigkeit von der Zeit und für 2 Konzentrationen eines Peptids der Erfindung die Verringerung des verbleibenden GDP-Anteils, der an das p21-Protein gebunden ist.
Allgemeine Klonierungstechniken
Die herkömmlich in der Molekularbiologie verwendeten Methoden, wie etwa präparative Extraktionen von Plasmid-DNA, Zentrifugation von Plasmid-DNA in einem Cäsiumchloridgradienten, Elektrophorese auf Agarose- oder Acrylamidgelen, Aufreinigung von DNA-Fragmenten durch Elektroelution, Extraktionen von Proteinen mit Phenol oder mit Phenol/Chloroform, Ethanol- oder Isopropanol-Präzipitation von DNA in salinem Medium, Transformation in Escherichia coli usw., sind dem Fachmann gut bekannt, und sind in der Literatur ausführlich beschrieben (Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987).
Die Restriktionsenzyme wurden von New England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) oder Amersham bereitgestellt, und werden gemäß den Empfehlungen des Lieferanten verwendet.
Die Plasmide vom Typ pBR322, pUC, λgt11, pGEX 2T und die Phagen der Serie M13 stammen aus dem Handel.
Für die Ligaturen werden die DNA-Fragmente gemäß ihrer Größe durch Elektrophorese auf Agarose- oder Acrylamidgelen getrennt, mit Phenol oder einer Phenol/Chloroform-Mischung extrahiert, mit Ethanol präzipitiert, dann in Gegenwart von Phage-T4-DNA-Ligase (Biolabs) gemäß den Empfehlungen des Lieferanten inkubiert.
Das Auffüllen der überstehenden 5'-Enden erfolgt durch das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli (Biolabs) gemäß den Spezifikationen des Lieferanten. Die Zerstörung der überstehenden 3'-Enden erfolgt in Gegenwart der DNA-Polymerase des Phagen T4 (Biolabs), die gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet wird. Die Zerstörung der überstehenden 5'-Enden erfolgt durch eine S1-Nuklease-Behandlung.
Die in vitro durch synthetische Oligodesoxynukleotide gelenkte Mutagenese erfolgt gemäß der von Taylor et al. (Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749–8764) entwickelten Methode unter Verwendung des von Amersham vertriebenen Kits.
Die enzymatische Verstärkung der DNA-Fragmente durch die so genannte PCR-Technik [Polymerase-katalysierte Kettenreaktion, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350–1354; Mullis K.B. und Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335–350] erfolgt unter Verwendung eines "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) gemäß den Spezifikationen des Herstellers.
Die Verifikation der Nukleotidsequenzen erfolgt durch die von Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463–5467) entwickelte Methode unter Verwendung des von Amersham vertriebenen Kits.
Für die Hybridisierungsversuche sind die Bedingungen normaler Stringenz im Allgemeinen folgende: Hybridisierung: 3 × SCC in Gegenwart von 5 × Denhart's bei 65°C; Waschen: 0,5 × SSC bei 65°C.
1. Isolierung des humanen GDP-Austauschfaktorgens (hGRF)
5·10⁵ Phagen einer menschlichen Hirnbank, die in dem Vektor λgt11 konstruiert wurde (Skolnik et al., Cell 65 (1991) 83) wurden gemäß den von Sambrook, Fritsch und Maniatis (Molecular cloning; Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989) beschriebenen Techniken gescreent.
Die zum Screenen dieser Bank verwendete Sonde ist ein ³²P-markiertes menschliches cDNA-Fragment mit 137 Basenpaaren. Diese Sonde wurde durch PCR auf der Voll-DNA der vorher zitierten Bank hergestellt, unter Verwendung der folgenden degenerierten Oligonukleotide als Primer:
für das Oligonukleotid des 3'-Endes des Fragments (SEQ ID NR. 11), und
für das Oligonukleotid des 5'-Endes des Fragments (SEQ ID NR. 12).
Die Sonde wurde mit ³²P durch "random priming" gemäß der Technik von Feinberg und Vogelstein (Anal. Biochem. 137 (1984) 266) markiert, und die PCR-Reaktion wurde bei etwa 40°C unter den Bedingungen ausgeführt, die in den allgemeinen Klonierungstechniken beschrieben sind.
Unter den verschiedenen positiven Klonen, die durch die Hybridisierung mit dieser Sonde erhalten wurden, umfasst eine die Gesamtheit eines offenen Leserahmens, der die Austauschaktivität gegenüber Ha-Ras trägt.
Dieser λgt11-Klon enthält eine cDNA mit 3 kb, die in Form eines EcoRI-Fragments an die entsprechende Stelle eines M13mp18-Vektors eingeführt wurde. Diese cDNA wurde anschließend mit Hilfe kommerzieller "Reverse-" und "–20"-Primer sowie mit Hilfe von spezifischen Oligonukleotiden gemäß der Technik von Sanger sequenziert (vgl. Allgemeine Klonierungstechniken).
Die Nukleotidsequenz des humanen GDP-Austauschfaktorgens, das von dem so erhaltenen Fragment getragen wird, wird in der Sequenz SEQ ID NR. 1 dargestellt, sowie die davon abgeleiteten Peptidsequenzen (SEQ ID NR. 2, 3 und 4).
2. Herstellung von Subfragmenten
Verschiedene Derivate oder Fragmente des so erhaltenen Gens können vor allem für die Expression von Peptiden der Erfindung hergestellt und verwendet werden. Insbesondere wurden die folgenden Fragmente durch enzymatische Spaltung hergestellt und durch Elektroelution getrennt:

– ein PstI-EcoRI-Fragment, das einen Teil der codierenden Region des Austauschfaktors (vom Nukleotid 936 bis zum Stopp-Codon) sowie die nicht codierende 3'-Region des Fragments umfasst,
– ein EcoNI-EcoRI-Fragment, das einen Teil der codierenden Region des Austauschfaktors (vom Nukleotid 910 bis zum Stopp-Codon) sowie die nicht codierende 3'-Region des Fragments umfasst,
– ein EagI-EcoRI-Fragment, das einen Teil der codierenden Region des Austauschfaktors (vom Nukleotid 638 bis zum Stopp-Codon) sowie die nicht codierende 3'-Region des Fragments umfasst,
– ein BalI-EcoRI-Fragment, das einen Teil der codierenden Region des Austauschfaktors (vom Nukleotid 88 bis zum Stopp-Codon) sowie die nicht codierende 3'-Region des Fragments umfasst, und,
– ein NaeI-EcoRI-Fragment, das einen Teil der codierenden Region des Austauschfaktors (vom Nukleotid 196 bis zum Stopp-Codon) sowie die nicht codierende 3'-Region des Fragments umfasst.

Es versteht sich, dass die nicht codierende 3'-Region, die von diesen Fragmenten getragen wird, nebensächlich ist, und dass sie entweder durch Digestion mittels einer Nuklease, oder durch Spalten mit einem Enzym entfernt werden kann, das eine Stelle nahe dem Stopp-Codon aufweist, wie vor allem etwa SmaI, dessen Stelle etwa 30 Bp nach dem Stopp-Codon liegt.
Es versteht sich ebenfalls, dass andere Fragmente hergestellt werden können, wie vor allem etwa Fragmente, die die codierende Region für den gesamten C-terminalen Teil nicht enthalten, sowie Derivate dieser Fragmente, die durch Mutation, Substitution, Addition oder Modifikation chemischer und/oder genetischer Art erhalten werden.
3. Biologische Charakterisierung
Die Funktionalitäten der Peptide gemäß der Erfindung wurden getestet:

– in Säugetierzellen,
– in der Hefe Saccharomyces cerevisiae, oder auch
– in vitro auf dem rekombinanten Ha-Ras-Protein.
3.1. Zur funktionellen Bewertung in den Säugetierzellen können die cDNA-Sequenzen, die für Peptide der Erfindung codieren, wie zum Beispiel die in Beispiel 2 beschriebenen, unter die Kontrolle des frühen Promoters von SV40 in dem pCym1-Vektor gestellt werden, der von Camonis et al. (Gene 86 (1990) 263) beschrieben wurde.

In diesem Beispiel wurden die Fragmente PstI-EcoRI und EcoNI-EcoRI, die in Beispiel 2 beschrieben wurden, in diesen Vektor eingebaut.
Die so erhaltenen Vektoren wurden durch vorübergehende Transfektion in den CHO-Zellen gemäß dem von Rey et al. (Oncogene 6 (1991) 347) beschriebenen Protokoll getestet.
Es wurden daher zwei Funktionalitätskriterien untersucht:

– Die Fähigkeit der Vektoren, einen Promoter zu transaktivieren, der die Expression eines Reportergens regiert, das hier das bakterielle Gen ist, das für Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT-Gen) codiert,
– ihre Fähigkeit, die GTP-Beladung der Ras-Proteine der transfizierten CHO-Zellen zu fördern.
a) Für die Transaktivierungstests wurden CHO-Zellen mit 50%-iger Konfluenz (vergleiche zum Beispiel das Protokoll, das von Schweighoffer et al. Science, In Press beschrieben wurde) einerseits mit 0,5 μg eines Vektors transfiziert, der das CAT-Gen unter der Kontrolle eines synthetischen Promoters trägt, bestehend aus dem murinen Promoter des Thymidinkinasegens und 4 Wiederholungselementen PEA1, die vom Polyoma-Enhancer abgeleitet sind (Wasylyk et al., EMBO J. 7 (1988) 2475), und andererseits mit 4,5 μg eines Expressionsvektors, der unter der Kontrolle des frühen SV40-Promoters keine codierende cDNA (Spur 1), die cDNA des normalen Ha-Ras (Spur 2), die cDNA des aktivierten Ha-Ras an Position 12 (Val 12) (Spur 3), das 3'-Ende der SDC25-cDNA, beschrieben von Rey et al. supra (Spur 4), und die cDNA, die für ein Peptid gemäß der Erfindung, wie oben beschrieben, codiert, (Spur 5) trägt.

Die Ergebnisse werden in 1 dargestellt. Spur 1 entspricht der basalen Aktivierung; Spur 3 (erhalten für das PstI-EcoRI-Fragment: CDC hum.) zeigt, dass die Expression eines Peptids der Erfindung die Transaktivierung des verwendeten synthetischen Promoters ermöglicht.
Das gleiche qualitative Ergebnis wurde für die anderen untersuchten Fragmente erhalten.

b) Um zu verifizieren, dass diese Transaktivierung wirklich eine Nukleotidbeladung der ras-Proteine der CHO-Zellen impliziert, wurden die gleichen vorübergehenden Transfektionen realisiert, wobei das Kulturmedium mit ³²P markiertem Orthophosphat angereichert wurde.

Dieses Markierungsprotokoll sowie das der Immunopräzipitation der zellulären ras-Proteine wurde von Rey et al. supra, beschrieben. Die erhaltenen Ergebnisse werden in 2 dargestellt. Sie zeigen, dass die Peptide der Erfindung in der Lage sind, die Spiegel des Austausches von GDP an den ras-Proteinen zu modulieren, da bestimmte unter ihnen (das oben beschriebene Peptid CDC Hum., exprimiert durch das PstI-EcoRI-Fragment) in der Lage sind, die GTP-Beladung der ras-Proteine der CHO-Zellen, die mit dem Antikörper Y 13-259 immunopräzipitiert wurden, zu fördern.

3.2. Die Peptide der Erfindung wurden funktionell auch in der Hefe S. cerevisiae cdc25-getestet. Hierfür wurden die zuvor zitierten (3.1) Vektoren, die Shuttle-Vektoren sind, in den Stamm der Hefe OL97-1-11B eingeführt (Camonis und Jacquet, Mol. Cell. Biol. 8 (1988) 2980). Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die DNA-Fragmente gemäß der Erfindung für Peptide codieren, die in der Lage sind, den Wachstumsmangel dieses Stamms bei 36°C zu komplementieren. Diese Ergebnisse zeigen daher, dass diese Fragmente in vivo in S. cerevisiae für funktionelle Peptide codieren.
3.3. Die Kapazität der DNA-Sequenzen der Erfindung, für Peptide zu codieren, die in der Lage sind, den Austausch von GDP an den aufgereinigten Ha-Ras-Proteinen zu fördern, wurde ebenfalls in vitro nachgewiesen, gemäß dem Protokoll, das von Rey et al. (Mol. Cell. Biol. 9 (1989) 3904) beschrieben wurde.

Hierfür werden die Sequenzen der Erfindung in dem E.-coli-Stamm TG1 in Form von Fusionsproteinen mit Glutathion-S-Transferase (GST) gemäß der Technik, die von Smith und Johnson [Gene 67 (1988) 31] beschrieben wurde, exprimiert. Hierfür wurden die verschiedenen DNA-Fragmente, die in 3.1 oben beschrieben wurden, in Form von SmaI-EcoRI-Fragmenten in den Vektor pGEX 2T (Pharmacia) am 3'-Ende und in den Rahmen einer cDNA, die für GST codiert, kloniert. Die SmaI-EcoRI-Fragmente werden durch Zugabe eines Adapters mittels einer Ligase erhalten. Die so erhaltenen Vektoren werden anschließend verwendet, um den E.-coli-Stamm TG1 zu transformieren. Die so transformierten Zellen werden eine Nacht lang bei 37°C vorkultiviert, auf 1/10e in LB-Medium verdünnt, es wird IPTG zugegeben, um die Expression zu induzieren (2 Stunden, 25°C), dann werden sie 21 Stunden lang bei etwa 25°C kultiviert. Die Zellen werden anschließend lysiert, und die produzierten Fusionsproteine werden durch Affinität auf einer Agarose-GSH-Kolonne aufgereinigt. Hierfür wird das bakterielle Lysat in Gegenwart des Gels (mit dem Lysepuffer hergestellt und äquilibriert) 15 Minuten lang bei 4°C inkubiert. Nach 3 Wäschen mit einem Tris-HCl-Puffer, pH-Wert 7,4, werden die Proteine in Gegenwart eines Tris-HCl-Puffers, pH-Wert 7,7, der einen Überschuss an GSH enthält, eluiert. Der Überstand wird entnommen und zentrifugiert.
Die GDP-Austauschaktivität der Peptide der Erfindung an den aufgereinigten Ha-Ras-Proteinen wurde anschließend in vitro gemäß dem von Rey et al. (Mol. Cell. Biol. supra) beschriebenen Protokoll nachgewiesen. Die erhaltenen Ergebnisse werden in 3 dargestellt. Sie zeigen vor allem, dass das Peptid der Erfindung, das der Sequenz CDC hum entspricht, die von dem oben beschriebenen PstI-EcoRI-Fragement exprimiert wurde, den GDP-Austausch stimuliert.
4. Nachweis homologer Sequenzen
Nukleinsäuresequenzen, die homolog mit den in 1 dargestellten sind, wurden über verschiedene Strategien nachgewiesen:

– Durch PCR, unter den Bedingungen, die in den allgemeinen Klonierungstechniken beschrieben wurden, auf neosynthetisierter cDNA aus Placenta-mRNA, unter Verwendung von degenerierten Oligonukleotiden als Primer, die ausgewählt wurden, um die Sequenzen abzudecken, die zwischen der Sequenz SEQ ID NR. 1 und der Sequenz des SOS-Proteins konserviert wurden (Bonfini et al., Science 255 (1992) 603).
– Durch Screenen einer Placenta-cDNA-Bank mit Hilfe einer Sonde, die aus der Gesamtheit der Sequenz SEQ ID NR. 1, markiert mit ³²P), gebildet wurde. Dieses Screening wurde unter Bedingungen geringer Stringenz realisiert: Hybridisierung bei 50°C in Medium 5 × SSC, 5 × Denhart's; dann Waschen bei 50°C in Medium 2 × SSC.

Diese beiden Strategien haben es ermöglicht, die Sequenzen zu offenbaren, die homolog zur Sequenz SEQ ID NR. 1 sind. Diese Sequenzen können leicht isoliert und charakterisiert werden. Sie bilden die Nukleinsequenzen im Sinne der vorliegenden Erfindung, denn sie (oder ihre Fragmente oder Derivate) codieren für Peptide, die in der Lage sind, die Spiegel der Austausche von GDP an p21-GDP-Komplexen zu modulieren.
Insbesondere hat diese Strategie die Identifikation, ausgehend von Placenta-mRNA und unter Verwendung der Oligonukleotide oligo 2449 (SEQ ID NR. 9) und oligo 2451 (SEQ ID NR. 10) von 2 cDNAs ermöglicht, die für Faktoren codieren, die mit hSOS1 und hSOS2 bezeichnet werden, deren Teilsequenzen in SEQ ID NR. 5 bzw. SEQ ID NR. 7 dargestellt sind. Die diesen Faktoren entsprechenden mRNAs sind in allen Geweben vorhanden, in denen nach ihnen gesucht wurde, im Gegensatz zu dem in Beispiel 1 beschriebenen Faktor, der einzig im Gehirn zu liegen scheint. Es wurde eine chromosomale Lokalisierung dieser Gene durchgeführt und ergab die folgenden Ergebnisse:

– h-GRF: 15q2.4
– h-SOS1: 4q2.1
– h-SOS2: 14q2.2.

5. Suche nach Austauschfaktoren vom Typ h-GRF in anderen Geweben
Ein Antikörper anti h-GRF wurde im Kaninchen durch Immunisierung mit einem Antigen hergestellt, das dem Fragment mit 280 Aminosäuren entspricht, das zwischen den Resten 211 und 489 des Faktors h-GRF liegt, der in SEQ ID NR. 4 dargestellt ist.
Dieser Antikörper ermöglichte den Nachweis, durch ELISA, von Proteinen mit apparentem Molekulargewicht von 30, 55, 75, 95 und 140 kDa in menschlichem Cortex und Gehirnvorläuferzellen. Die Verschiedenheit der Molekulargewichte lässt auf die Gegenwart von multiplen cDNAs schließen. Die Vorinkubation des Antikörpers anti h-GRF mit h-GRF unterdrückt den Nachweis der identifizierten Proteine, was die Spezifität des Signals nachweist.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Peptid, das in der Lage ist, die Spiegel des Austausches von GDP an p21-GDP-Komplexen zu modulieren, umfassend die Sequenzen SEQ ID NR. 2, 3, 4, 6 oder 8.
Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es den Austausch von GDP an dem p21-GDP-Komplex verlangsamt oder hemmt.
Peptid der Sequenz SEQ ID NR. 2, 3, 4, 6 oder 8.
Antikörper oder Antikörperfragment, der/das gegen ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 gerichtet ist.
Antikörper oder Antikörperfragment nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass er/es gegen die Peptidsequenz SEQ ID NR. 1 gerichtet ist.
Antikörper oder Antikörperfragment nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass er/es die Fähigkeit besitzt, den Austausch von GDP am p21-GDP-Komplex zumindest teilweise zu hemmen.
Nukleotidsequenz, die für ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert.
Nukleotidsequenz nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus Folgenden ausgewählt ist: (a) den Sequenzen SEQ ID NR. 1, 5 oder 7 und für ein Peptid codiert, das in der Lage ist, die Spiegel des Austausches von GDP an p21-GDP-Komplexen zu modulieren, (b) dem komplementären Strang der Sequenzen (a), (c) den von den Sequenzen (a) und (b) aufgrund der Degeneration des genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen.
Antisense-Sequenz, die in der Lage ist, die Produktion von Peptiden nach Anspruch 3 zu hemmen, die von den Sequenzen SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. 7 oder ihrem komplementären Strang stammen.
Verwendung einer Sequenz nach Anspruch 8(b) zum In-vitro-Nachweis der Expression des GDP-Austauschfaktors oder zum Nachweis genetischer Anomalien (schlechtes Spleißen, Polymorphismus, Punktmutationen).
Pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff mindestens ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einen Antikörper oder ein Antikörperfragment nach einem der Ansprüche 4 bis 6 oder eine Nukleotidsequenz nach Anspruch 8 enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 11, die zur Modulation der Aktivierung von p21-Proteinen bestimmt ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12, die dazu bestimmt ist, die Aktivierung von p21-Proteinen zumindest teilweise zu hemmen.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 11, die zur Behandlung von Krebserkrankungen bestimmt ist.
Verwendung eines Antikörpers oder Antikörperfragments nach einem der Ansprüche 4 bis 6 und/oder einer Nukleotidsequenz nach Anspruch 8(b) zum Nachweis der Expression und/oder einer Überexpression eines verstärkten, mutierten oder umgeordneten GDP-Austauschfaktors in einer biologischen Probe.
Verwendung eines Antikörpers oder Antikörperfragments nach einem der Ansprüche 4 bis 6 und/oder einer Nukleotidsequenz nach Anspruch 8(b) zur In-vitro-Typisierung von Krebserkrankungen.
Verfahren zur Herstellung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1–3, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Zelle, die eine Nukleotidsequenz nach Anspruch 7 enthält, unter Bedingungen der Expression dieser Sequenz kultiviert und das produzierte Peptid gewinnt.