DE69333284T2

DE69333284T2 - Polypeptide mit serotioninerger (5ht5a) rezeptoraktivität, für sie codierende nucleinsäuren und ihre verwendung

Info

Publication number: DE69333284T2
Application number: DE69333284T
Authority: DE
Inventors: Nourdine Amlaiky; Ursula Boschert; Rene Hen; Jean-Luc Plassat
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1992-07-01
Filing date: 1993-06-29
Publication date: 2004-08-26
Anticipated expiration: 2013-06-30
Also published as: EP0651801B1; FR2693200A1; DE69333284D1; EP0651801A1; ES2208641T3; US5807691A; ATE253634T1; JPH07508654A; WO1994001555A1; CA2139430C; FR2693200B1; CA2139430A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Polypeptide und das genetische Material, das ihre Expression erlaubt. Genauer betrifft sie neue Polypeptide mit einer serotoninergen Rezeptor-Aktivität.
Serotonin ist ein Neuromodulator, der eine große Vielfalt von Verhalten, wie Schlaf, Appetit, Bewegung, sexuelle Aktivität oder außerdem die vaskuläre Kontraktion, auslösen und verändern kann. Es wird angenommen, dass die Aktivität von Serotonin durch seine Interaktion mit Rezeptoren, die als serotoninerge Rezeptoren oder 5-HT (für 5-Hydroxytryptamin)-Rezeptoren bezeichnet werden, vermittelt wird. Studien der Molekularbiologie sowie pharmakologische Studien haben gezeigt, dass eine große Zahl von Subtypen der 5-HT-Rezeptoren existiert. Die 5-HT-Rezeptoren, die bis heute beschrieben worden sind, gehören entweder zur Familie der Rezeptoren, die mit Ionenkanälen verbunden sind (5-HT3-Rezeptoren), oder zur Familie der Rezeptoren, die mit G-Proteinen interagieren und die sieben Transmembrandomänen besitzen. Außerdem hat die Analyse der Aminosäuresequenzen gezeigt, dass die 5-HT-Rezeptoren, die mit G-Proteinen interagieren, in zwei verschiedene Gruppen unterteilt werden können: Die 5HT1-Rezeptoren, umfassend die Subtypen 5HT1A, 5HT1B und 5HT1D der Säuger sowie die drei 5HT-Rezeptoren von Drosophila; und die 5HT2-Rezeptoren, umfassend die Subtypen 5HT2 und SHT1C.
Diese Rezeptoren sind ohne Zweifel nicht die einzigen existierenden 5HT-Rezeptoren, insoweit als pharmakologische Studien andere Subtypen aufgedeckt haben, wie die 5HT4-Rezeptoren, sowie bestimmte Rezeptoren, die mit dem Subtyp 5HT1 verwandt sind („5HT1-ähnliche" Rezeptoren). Darüber hinaus haben ergänzende Studien der Molekularbiologie ebenfalls die Heterogenitäten innerhalb der Subtypen 5HT1B/1D gezeigt.
Die vorliegende Erfindung resultiert aus der Entdeckung neuer Polypeptide mit einer serotoninergen Rezeptor-Aktivität. Obwohl sie zur Familie der Rezeptoren, die mit G-Proteinen interagieren, gehören, unterscheiden sich diese neuen Polypeptide von den schon beschriebenen serotoninergen Rezeptoren (5HT1, 5HT2, 5HT3 und 5HT4), sowohl aus struktureller als auch aus pharmakologischer Hinsicht. Genauer resultiert die Erfindung aus der Isolierung und der Charakterisierung dieser neuen Polypeptide, mit der Bezeichnung 5HT5a, sowie des genetischen Materials, das ihre Expression oder ihre Identifikation erlaubt.
Ein erster Gegenstand der Erfindung besteht also in den Polypeptiden 5HT5a, umfassend die Sequenz SEQ ID Nr. 1; die Erfindung betrifft ebenso die Peptide 5HT5a, umfassend die Sequenz SEQ ID Nr. 7, die dem menschlichen Rezeptor entspricht.
Bevorzugt sind die Polypeptide der Endung Polypeptide, die die Fähigkeit besitzen, Serotonin zu binden. Stärker bevorzugt handelt es sich um Polypeptide, die eine serotoninerge Rezeptor-Aktivität besitzen. Immer noch nach einer bevorzugten Ausführungsform können die Polypeptide der Erfindung von Antikörpern erkannt werden, die die vollständige Peptidsequenz SEQ ID Nr. 1 erkennen.
Wie in den Beispielen angedeutet, kann das Polypeptid 5HT5a in verschiedenen Zelltypen exprimiert werden, um einen funktionellen Serotonin-Rezeptor zu bilden.
Die Polypeptide der Erfindung können durch Expression einer Nucleotidsequenz in einem zellulären Wirt erhalten werden, wobei die Nucleotidsequenz wie nachstehend beschrieben durch chemische Synthese, auf der Grundlage der SEQ ID Nr. 1, mittels dem Fachmann bekannter Verfahren oder einer Kombination dieser Verfahren erhalten wird.
Im nachfolgenden werden die Polypeptide der Erfindung, wie vorstehend definiert, als Polypeptide 5HT5a bezeichnet.
Die vorliegende Erfindung hat auch die ganze Nucleotidsequenz zum Gegenstand, die ein Polypeptid 5HT5a codiert. Stärker bevorzugt handelt es sich um eine Sequenz, ausgewählt aus:

(a) der Nucleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 oder ihrem Komplementärstrang,
(b) der ganzen mit einer Sequenz (a) hybridisierenden und ein Polypeptid, wie vorstehend definiert, codierenden Sequenz, und,
(c) den von den Sequenzen (a) und (b) abgeleiteten Sequenzen zur Degeneration des genetischen Codes.

Nach einer besonderen Ausführungsform hat die Erfindung eine Nucleotidsequenz, umfassend die Sequenz SEQ ID Nr. 7, zum Gegenstand.
Die verschiedenen Nucleotidsequenzen der Erfindung können künstlichen Ursprungs sein oder nicht. Es kann sich um genomische Sequenzen, cDNA, RNA, Hybridsequenzen oder synthetische oder halbsynthetische Sequenzen handeln. Diese Sequenzen können zum Beispiel durch Absuchen von DNA-Banken (cDNA-Bank, genomische DNA-Bank) mittels auf der Grundlage der Sequenz SEQ ID Nr. 1 entwickelter Sonden erhalten werden. Solche Banken können ausgehend von Zellen unterschiedlichen Ursprungs mittels dem Fachmann bekannter klassischer Techniken der Molekularbiologie hergestellt werden. Die Nucleotidsequenzen der Erfindung können auch durch chemische Synthese, vor allem nach dem Phosphoramiditverfahren, oder auch mittels verschiedener Verfahren, einschließlich der chemischen oder enzymatischen Modifikation der durch Absuchen der Banken erhaltenen Sequenzen, hergestellt werden.
Die Nucleotidsequenzen der Erfindung können zur Herstellung der Polypeptide 5HT5a, wie vorstehend definiert, verwendet werden. In diesem Fall wird der Teil, der das Polypeptid codiert, im allgemeinen unter die Kontrolle von Signalen gestellt, die seine Expression in einer Wirtszelle erlauben. Die Wahl dieser Signale (Promotoren, Terminatoren, etc.) kann in der Funktion je nach dem verwendeten zellulären Wirt verschieden sein. Zu diesem Zweck können die Nucleotidsequenzen der Erfindung Teil eines Vektors sein, der sich autonom oder integrativ repliziert. Genauer können die Vektoren der autonomen Replikation durch Verwendung von autonomen Replikationssequenzen im gewählten Wirt hergestellt werden. Wenn- es sich um integrative Vektoren handelt, können diese zum Beispiel durch Verwendung von zu bestimmten Bereichen des Genoms des Wirts homologen Sequenzen, die durch homologe Rekombination die Integration des Vektors erlauben, hergestellt werden. Die zur rekombinanten Herstellung der Polypeptide 5HT5a der Erfindung verwendbaren zellulären Wirte sind genausogut eukaryontische wie prokaryontische Wirte. Unter den passenden eukaryontischen Wirten kann man tierische, Hefe- oder Pilz-Zellen anführen. Besonders wenn es sich um Hefen handelt, kann man die Hefen der Gattung Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces oder Hanseaula anführen. Wenn es sich um tierische Zellen handelt, kann man die Zellen COS, CHO, C127, NIH-3T3, etc. anführen. Unter den Pilzen kann man vor allem Aspergillus ssp. oder Trichoderma ssp. anführen. Als prokaryontische Wirte bevorzugt man die Verwendung der folgenden Bakterien E. coli, Bacillus oder Streptomyces.
Die Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung können auch im pharmazeutischen Bereich verwendet werden, entweder als Antisense-Sequenzen, die im Rahmen einer Gentherapie verwendet werden können, oder auch als Sonden, die den Nachweis der Expression serotoninerger Rezeptoren in biologischen Proben durch Hybridisierungsexperimente und den Nachweis genetischer Anomalien (Polymorphismus, Mutationen) oder falscher Expressionen erlauben.
Die Hemmung der Expression bestimmter Gene durch Antisense-Oligonucleotide hat sich als eine vielversprechende Strategie zur Kontrolle der Aktivität eines Gens erwiesen. Die Antisense-Oligonucleotide sind kleine Oligonucleotide, komplementär zum codierenden Strang eines gegebenen Gens und daher in der Lage, spezifisch mit der transkribierten mRNA zu hybridisieren, wobei ihre Übersetzung in Protein gehemmt wird. Die Erfindung hat also die Antisense-Oligonucleotide zum Gegenstand, die mindestens teilweise die Herstellung der Polypeptide 5HT5a, wie vorstehend definiert, hemmen können. Diese Oligonucleotide können aus den vorstehend definierten Nucleotidsequenzen bestehen.
Wie vorstehend angedeutet, erlaubt die Erfindung auch die Verwendung von Nucleotidsonden, synthetisch oder nicht, die mit den vorstehend definierten Nucleotidsequenzen, die die Polypeptide 5HT5a der Erfindung codieren, oder mit den entsprechenden mRNAs hybridisieren können. Die Sonden können in vitro als Diagnostikwerkzeug zum Nachweis der Expression eines serotoninergen Rezeptors 5HT5a oder auch zum Nachweis genetischer Anomalien (falsches Spleissen, Polymorphismus, Punktmutationen, etc.) verwendet werden. Unter Berücksichtigung der vielfältigen Aktivitäten von Serotonin können die Sonden der Erfindung auch die Identifikation neurologischer, kardiovaskulärer oder psychiatrischer Erkrankungen, wie jene, die mit den 5HT5a-Rezeptoren in Verbindung stehen, erlauben. Diese Sonden können auch zum Nachweis und der Isolierung homologer Nucleinsäuresequenzen, die 5HT5a-Polypeptide, wie vorstehend definiert, codieren, aus anderen zellulären Quellen und bevorzugt Zellen menschlichen Ursprungs verwendet werden, wie in den Beispielen dargestellt. Die Sonden der Erfindung bestehen im allgemeinen aus mindestens 10 Basen und sie können aus der gesamten Sequenz SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 7 oder ihren komplementären Strängen bestehen. Bevorzugt werden diese Sonden vor ihrer Verwendung markiert. Dazu können verschiedene, dem Fachmann bekannte Techniken verwendet werden (radioaktive, enzymatische Markierung, etc.). Die Hybridisierungsbedingungen, unter denen diese Sonden verwendet werden können, werden in den allgemeinen Techniken der Clonierung nachstehend sowie in den Beispielen angegeben.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung betrifft die rekombinanten Zellen, die an ihrer Oberfläche ein Polypeptid 5HT5a, wie vorstehend definiert, exprimieren können. Diese Zellen können durch Einführung einer Nucleotidsequenz, wie nachstehend definiert, die ein Polypeptid der Erfindung codiert, und anschließende Kultur der Zellen unter Bedingungen zur Expression der Sequenz erhalten werden.
Die rekombinanten Zellen gemäß der Endung können sowohl eukaryontische als auch prokaryontische Zellen sein. Unter den eukaryontischen Zellen, die geeignet sind, kann man tierische Zellen, die Hefen oder die Pilze anführen. Besonders wenn es sich um Hefen handelt, kann man die Hefen der Gattung Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces oder Hanseaula anführen. Wenn es sich um tierische Zellen handelt, kann man die Zellen COS, CHO, C127, NIH-3T3, etc. anführen. Unter den Pilzen kann man vor allem Aspergillus ssp. oder Trichoderma ssp. anführen. Als prokaryontische Zellen bevorzugt man die Verwendung der folgenden Bakterien E. coli, Bacillus oder Streptomyces. Die so erhaltenen Zellen können zur Messung der Fähigkeit verschiedener Moleküle, als Ligand oder als Modulator der Aktivität der Polypeptide der Endung zu funktionieren, verwendet werden. Genauer können sie so in einem Verfahren zum Nachweis und zur Isolierung von Liganden oder Modulatoren der Aktivität der Polypeptide der Erfindung und stärker bevorzugt als Agonisten und Antagonisten von Serotonin verwendet werden.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung betrifft also ein Verfahren zum Nachweis und/oder der Isolierung von Liganden der Polypeptide 5HT5a der Erfindung, nach dem man die folgenden Schritte durchführt:

– Inkontaktbringen eines Moleküls oder eines Gemisches, das verschiedene Moleküle enthält, die gegebenenfalls nicht identifiziert sind, mit einer rekombinanten Zelle, wie vorstehend beschrieben, die auf ihrer Oberfläche ein Polypeptid der Erfindung exprimiert, unter Bedingungen, die die Wechselwirkung zwischen dem Polypeptid der Erfindung und dem Molekül erlauben, im Falle, dass es eine Affinität für das Polypeptid besitzt, und
– Nachweis und/oder Isolierung der mit dem Polypeptid der Erfindung verbundenen Moleküle.

In einer speziellen Ausführungsform wird dieses Verfahren der Erfindung zum Nachweis und/oder der Isolierung von Agonisten und Antagonisten von Serotonin für die Polypeptide 5HT5a angepasst.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis und/oder der Isolierung von Modulatoren der Polypeptide 5HT5a der Erfindung, nach dem man die folgenden Schritte durchführt:

– Inkontaktbringen eines Moleküls oder eines Gemisches, das verschiedene Moleküle enthält, die gegebenenfalls nicht identifiziert sind, mit einer rekombinanten Zelle, wie vorstehend beschrieben, die auf ihrer Oberfläche ein Polypeptid der Erfindung exprimiert, in Anwesenheit von 5HT, unter Bedingungen, die die Wechselwirkung zwischen dem Polypeptid der Erfindung und 5HT erlauben, und
– Nachweis und/oder Isolierung der Moleküle, die die Aktivität von 5HT auf das Polypeptid der Erfindung modulieren können.

Andere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden beim Lesen der Beispiele, die folgen und die als veranschaulichend, nicht als einschränkend betrachtet werden müssen, klar werden.
Legende der Figuren
SEQ ID Nr. 1: Nucleotid- und Peptidsequenz des Rezeptors 5HT5a. Die cDNA von 4 kb wurde auf den 2 Strängen von der EcoRI-Schnittstelle an bis zur Position 1685 sequenziert. Die verbleibenden 2300 Nucleotide mit Ausnahme des 3'-Endes, das den polyA-Schwanz enthält, wurden nicht sequenziert.
2: Prozentsätze der Homologie der Peptidsequenz zwischen dem Rezeptor 5HT5a SEQ ID Nr. 1 und anderen Rezeptoren der Familie der Rezeptoren, die mit G-Proteinen gekoppelt sind. Die Homologien wurden für die konservierten Sequenzen berechnet: die Transmembrandomäne und ihre Verbindungsschleifen.
3: Sättigungskurve von [¹²⁵I]-LSD an Membranen von Cos-7-Zellen, die den Rezeptor 5HT5a exprimieren. Die Membranen wurden mit Konzentrationen des Liganden von 50 pM bis 1,25 nM mit oder ohne 10 μM 5HT inkubiert. Die spezifische Bindung wird dargestellt. Die Einlage stellt die Scatchard-Analyse der Ergebnisse dar.
4: Nachweis homologer Sequenzen: (a) durch Northern Blot auf polyA-mRNA (5 μg) verschiedener Gewebe; (b) durch PCR auf Gesamt-RNA (1 μg) verschiedener Gewebe. Tabelle 1: Pharmakologisches Profil des Rezeptors 5HT5a. Die Ergebnisse entsprechen den Erfahrungen der Kompetition für die Bindung von [¹²⁵I]-LSD entweder an Membranen von Cos-7-Zellen, die den Rezeptor 5HT5a transient exprimieren, oder an Membranen von NS4-Zellen, die den Rezeptor 5HT5a stabil exprimieren. Die IC50-Werte (die der Konzentration an Ligand entsprechen, die notwendig ist, um 50% gebundenes [¹²⁵I]-LSD zu verdrängen) wurden experimentell berechnet und in Ki gemäß der folgenden Gleichung umgewandelt: Ki = IC₅₀/(1 + C/Kd), in der C die Konzentration an [¹²⁵I] ist, und Kd die Dissoziationskonstante von [¹²⁵I]-LSD (308 pM) ist. Die Zahlen in Klammern entsprechen der Zahl unabhängig durchgeführter Experimente, wobei jeder Punkt eine Dreifachbestimmung ist.
Allgemeine Techniken der Clonierun
Die klassischen, in der Molekularbiologie verwendeten Verfahren, wie präparative Extraktionen von Plasmid-DNA, die Zentrifugation von Plasmid-DNA in einem Cäsiumchloridgradienten, die Gelelektrophorese in Agarose- oder Acrylamidgelen, die Reinigung von DNA-Fragmenten durch Elektroelution, die Proteinextraktionen mit Phenol oder Phenol-Chloroform, die Präzipitation von DNA im Salzmilieu durch Ethanol oder Isopropanol, die Transformation von Escherichia coli, etc., sind dem Fachmann gut bekannt und wurden ausführlich in der Literatur beschrieben [Maniatis T. et al., „Molecular Cloning, a. Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F. M. et al. (Hrsg.), „Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Die Restriktionsenzyme wurden von New England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) oder Amersham geliefert und gemäß den Empfehlungen der Lieferanten verwendet.
Für die Ligationen wurden die DNA-Fragmente mittels Elektrophorese in Agarose oder Acrylamidgelen nach ihrer Größe aufgetrennt, mit Phenol oder einem Phenol/Choroform-Gemisch extrahiert, mit Ethanol präzipitiert, anschließend in Anwesenheit von DNA-Ligase des T4-Phagen (Biolabs) gemäß den Empfehlungen des Lieferanten inkubiert.
Das Auffüllen der überhängenden 5'-Enden wurde mittels des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I von E. coli (Biolabs) gemäß den Anweisungen des Lieferanten durchgeführt. Der Abbau der überhängenden 3'-Enden wird in Anwesenheit der DNA-Polymerase des T4-Phagen (Biolabs), die gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet wird, durchgeführt. Der Abbau der überhängenden 5'-Enden wird mittels einer vorsichtigen Behandlung mit der S1-Nuclease durchgeführt.
Die gerichtete in vitro-Mutagenese durch synthetische Oligodesoxynucleotide wird nach dem von Taylor et al. entwickelten Verfahren [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749–8764] unter Verwendung des von Amersham vertriebenen Kits durchgeführt.
Die enzymatische Amplifikation der DNA-Fragmente wird mittels des PCR- Verfahrens [Polymerase-catalysed Chain Reaction, Saiki R. K. et al., Science 230 (1985) 1350–1354; Mullis K. B. et Faloona F. A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335–350] unter Verwendung eines „DNA-Thermocyclers" (Perkin Elmer Cetus) nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
Die Überprüfung der Nucleotidsequenzen wird mit dem von Sanger et al. entwickelten Verfahren [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463–5467] unter Verwendung des von Amersham vertriebenen Kits durchgeführt.
Für die Hybridisierungs-Experimente sind die normalen Bedingungen der Stringenz im allgemeinen die folgenden: Hybridisierung: 3 × SSC in Anwesenheit von 5 × Denhardt's bei 65°C; Waschen: 0,5 × SSC bei 65°C.
1. Isolierung des 5HT5a-Rezeptors
Die Sequenzvergleiche der verschiedenen bekannten serotoninergen Rezeptoren zeigen eine gewisse Konserviertheit, besonders in bestimmten möglichen Transmembranbereichen, wie den Domänen III und IV. Mit dem Ziel, einen neuen Rezeptor nachzuweisen und zu isolieren, wurden drei degenerierte Oligonucleotide, die diesen zwei Bereichen entsprechen, hergestellt und anschließend in einer Reihe von PCR-Reaktionen mit einer RNA-Präparation von Gehirn der Ratte verwendet. Die Sequenz der degenerierten Oligonucleotide (i)–(iii) ist in den Sequenzen SEQ ID Nr. 2–4 gegeben.
Die PCR-Reaktionen wurden folgendermaßen durchgeführt: 5 μg RNA des Gehirns der adulten Ratte wurden einer reversen Transkriptionsreaktion in Anwesenheit von 500 ng Oligonucleotid (i) und 200 Einheiten Reverser Transkriptase MMLV (BRL) unterzogen. Die Hälfte des Produkts dieser Reaktion wurde anschließend 30 Amplifikationszyklen in Anwesenheit von 5 Einheiten Taq-Polymerase (Cetus) und 1 μg Oligonucleotid (i) und Oligonucleotid (ii) unterzogen. 1/20 des Produkts dieser Reaktion wurde anschließend 30 weiteren Amplifikationszyklen in Anwesenheit der Oligonucleotide (i) und (iii) unterzogen. Die so erhaltenen Produkte wurden mit den Enzymen BamHI und HindIII gespalten, in entsprechende Stellen des Plasmids Bluescript (Stratagene) eingefügt und sequenziert. Eines der so erhaltenen Fragmente, das eine gewisse Homologie mit den serotoninergen Rezeptoren aufweist, wurde durch „Random Priming" (Feinberg et Vogelstein, Analytical Biochemistry 132 (1984) 6) markiert und als Sonde verwendet, um eine cDNA-Bank von Gehirn der Ratte, die im Phagen UniZap (Stratagene) hergestellt wurde, abzusuchen. Unter den erhaltenen positiven Phagen enthielt einer von ihnen, genannt λNS und im Plasmid pNS enthalten, ein Insert von 4 kb. Dieser Phage wurde isoliert, und sein Insert wurde anschließend in das Plasmid pBluescript eingeführt. Die Sequenz dieses Fragments wurde auf etwa 1,6 kb auf den beiden Strängen unter Verwendung des Didesoxynucleotidverfahrens mittels synthetischer Oligonucleotide bestimmt.
Die so erhaltene Sequenz ist in der Sequenz SEQ ID Nr. 1 dargestellt. Sie zeigt, dass die isolierte cDNA einen offenen Leserahmen von 357 Aminosäuren trägt. Außerdem zeigt die Analyse der Hydrophobizität, dass dieses Protein sieben hydrophobe Domänen besitzt, eine Eigenschaft der Mitglieder der Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Das Nterminale Ende enthält außerdem 2 N-Glycosylierungsstellen, und die angenommene cytoplasmatische Domäne enthält die Consensus-Phosphorylierungsstellen der Proteinkinasen C und A.
2. Sequenzhomologieuntersuchungen
Die Sequenz des vorstehend isolierten 5HT5a-Rezeptors wurde mit den Sequenzen der folgenden G-Protein-gekoppelten Rezeptoren verglichen: 5HT1B, SHT1D, 5HT1A, 5HTdro2A, 5HT-dro1, α2, D2, β1, D1, H2, SHT1C und 5HT2. Diese Untersuchungen haben eine gewisse Homologie in der möglichen Transmembrandomäne und in bestimmten Schleifen, aber nicht in den terminalen Bereichen noch in der dritten cytoplasmatischen Schleife gezeigt. Die 2 zeigt die % Homologie auf der Ebene der konservierten Bereiche.
Wie aus dieser Figur hervorgeht, ist die Homologie mit den bekannten Rezeptoren schwach, wobei das beste Ergebnis mit dem serotoninergen Rezeptor von Drosophila HTdro2A (37% Homologie) erhalten wird.
3. Expression des 5HT5a-Rezeptors in Cos-7-Zellen und pharmakologische Charakterisierung
Das in Beispiel 1 isolierte cDNA-Fragment wurde in einen eukaryontischen Expressionsvektor eingefügt, der verwendet wurde, um Cos-7-Zellen zu transfizieren. Die Membranen der erhaltenen transfizierten Zellen wurden anschließend präpariert und auf ihre Fähigkeit getestet, bestimmte markierte serotoninerge Liganden zu binden.
Die den 5HT5a-Rezeptor codierende cDNA von 4 kb wurde ausgehend vom Plasmid pNS in Form eines Fragments EcoRI-XhoI isoliert, anschließend in die entsprechenden Stellen des Vektors p513 eingefügt. Der Vektor p513 leitet sich vom Vektor pSGS [Green et al., Nucl. Acids Res. 16 (1988) 369] durch Hinzufügen einer multiplen Clonierungsstelle ab. Der so erhaltene rekombinante Vektor mit der Bezeichnung p513NS wurde anschließend verwendet (20 μg pro 10 cm-Platte), um die Cos-7-Zellen in Anwesenheit von Calciumphosphat zu transfizieren.
48 Stunden nach der Transfektion wurden die rekombinanten Zellen geerntet, und die Membranen wurden nach der von Amlaiky et Caron beschriebenen Technik hergestellt [J. Biol. Chem. 260 (1985) 1983]. Sättigungsbindungs- und Kompetitionsexperimente wurden auf diesen Membranen in Anwesenheit der folgenden radiomarkierten Liganden durchgeführt: [¹²⁵I]-LSD; [¹²⁵I]-Cyanopindolol; [³H]-8-OH-DPAT und [³H]-Spiperon. Dazu wurden die Membranproben (10–20 μg Proteine) 10 Minuten bei 37°C in Anwesenheit des Liganden in einem Endvolumen von 250 μl 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) inkubiert. Die Reaktion wird anschließend durch Vakuumfiltration über Glasfaserfilter Whatman GF/C und 4maliges Waschen mit 4 ml 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) gestoppt. Die unspezifische Bindung wurde in Anwesenheit von 10 μM 5HT bestimmt. Die Radioaktivität wurde mit einem γ-Zähler gemessen.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass obwohl [¹²⁵I]-Cyanopindolol; [³H]-8-OH-DPAT und [³H]-Spiperon die hergestellten Membranen nicht binden, das [¹²⁵I]-LSD eine sättigbare Bindungsstelle mit einem Kd = 340 pM und einem Bmax = 1,6 pmol/mg von Membranproteinen darstellt (3). In einem Kontrollexperiment wurde außerdem gezeigt, dass das [¹²⁵I]-LSD nicht die mit dem Plasmid p513 transfizierten Cos-7-Zellen bindet.
Um das pharmakologische Profil dieses Rezeptors zu bestimmen, wurde das an die Membranen gebundene [¹²⁵I]-LSD in Gegenwart verschiedener serontoninerger Substanzen verdrängt (Tabelle 1). Diese verschiedenen Substanzen zeigen die folgende Reihenfolge des Wirkungsgrades der Verdrängung: 2-Bromo-LSD > Ergotamin > 5-CT > Methysergid > 5HT = RU24969 > Bufotenin > Yohimbin = 8-OH-DPAT (Tabelle 1). Ketanserin, (+)Pindolol, Sumatriptan, Dopamin und Norepinephrin sind inaktiv.
4. Expression des 5HT5a-Rezeptors in NIH-3T3-Zellen und pharmakologische Untersuchung
Die in Beispiel 1 clonierte cDNA wurde auch in NIH-3T3-Zellen exprimiert, die keinen endogenen serotoninergen Rezeptor exprimieren. Deshalb wurde der vorstehend in 3. beschriebene rekombinante exprimierte Vektor verwendet. Er wurde in NIH-3T3-Zellen durch Transfektion in Gegenwart von Calciumphosphat eingeführt (20 μg pro 10 cm-Platte), gleichzeitig mit dem Vektor pRSVneo [Gorman et al., Science 221 (1983) 551], der das Resistenzgen G418 trägt (1 μg pro 10 cm-Platte). Die transformanten Clone wurde mit 0,5 mg G418 selektiert. Die isolierten Clone wurden anschließend amplifiziert, und die Gesamt-RNA dieser Clone wurde hergestellt und im Northern Blot auf die Expression der mRNA von 5HT5a analysiert. 2 Clone wurden so selektioniert, NS1 und NS4, die jeweils erhöhte und geringe Mengen der mRNA von 5HT5a exprimierten.
Die Membranen der Zellen dieser Clone wurden anschließend präpariert und unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen auf ihre Fähigkeit getestet, bestimmte markierte serotoninerge Liganden zu binden, und um die Affinität der Rezeptoren für diese Liganden zu bestimmen.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die Membranen dieser 2 Clone Bindungsstellen hoher Affinität für [¹²⁵I]-LSD besitzen, was anzeigt, dass diese 2 Clone 5HT5a-Rezeptoren exprimieren. Ein Kontrollexperiment hat in der Tat gezeigt, dass die nicht-transfizierten NIH-3T3-Zellen [¹²⁵I]-LSD nicht binden konnten. Verschiedene Verdrängungsexperimente wurden anschließend durchgeführt (Tabelle 1). Im Fall von 5HT, SCT, Sumatriptan und 8-OH-DPAT waren die erhaltenen Verdrängungskurven biphasisch, und eine Analyse der Ergebnisse ergab 2 Bindungsbestandteile, einen mit einer erhöhten Affinität und einen anderen mit einer geringeren Affinität.
5. Suche der homologen Sequenzen in anderen Geweben
Die Nucleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 wurde anschließend zum Nachweis homologer Sequenzen ausgehend von anderen Geweben verwendet. Dazu wurden drei Verfahren verwendet:

– Hybridisierung im Northern Blot,
– PCR,
– in situ-Hybridisierung.

Die zur Suche homologer Sequenzen verwendeten Gewebe sind die folgenden aus Maus: Großhirn, Kleinhirn, Niere, Leber, Rückenmark, Milz, Lunge und Herz.
5.1. Suche durch Hybridisierung im Northern Blot
Die polyA-mRNAs wurde ausgehend von den vorstehenden angegebenen Geweben nach dem von Cathala et al. beschriebenen Verfahren (DNA (1983)) hergestellt, gefolgt von einem Fluss über eine OligodT-Cellulose-Säule. Diese mRNAs wurden anschließend auf einem 1%igen Agarose-Formaldehyd-Gel fraktioniert, dann auf Nitrocellulose-Filter transferiert. Die zur Hybridisierung verwendete Sonde entspricht dem ganzen in Beispiel 1 beschriebenen (SEQ ID Nr. 1) Fragment EcoRI-XhoI von 4 kb, das zuvor mittels „random priming" mit ³²P markiert wurde. Die Hybridisierung wurde unter Bedingungen erhöhter Stringenz durchgeführt: 42°C, in einem 20 mM Phosphatpuffer (pH 6,5), enthaltend 50% Formamid, 5 × SSC, 1 × Denhardfs, 0,1% SDS und 100 μg/ml tRNA. Die Waschschritte wurden bei 60°C in einem 0,1 × SSC, 0,1% SDS-Puffer durchgeführt.
Diese Untersuchung erlaubte den Nachweis von drei homologen Transkripten im Großhirn und Kleinhirn, von 5,8 kb, 5 kb und 4,5 kb (4a).
5.2 Suche durch PCR
Zur Suche mittels PCR wurden die Sonden (iv) SEQ ID Nr. 5 und (v) SEQ ID Nr. 6 verwendet.
Die Sonde (iv) entspricht der Position 1351 in der Sequenz SEQ ID Nr. 1 und die Sonde (v) der Position 947.
Die Gesamt-RNA wurde ausgehend von verschiedenen untersuchten Geweben mittels des bereits erwähnten von Cathala et al. beschriebenen Verfahrens hergestellt. 1 μg dieser RNA wurde einer Reversen Transkription in Gegenwart von 200 Einheiten Reverser Transkriptase MMLV und 300 ng Sonde (iv) für 1 Stunde bei 37°C unterzogen. Die Hälfte des Produkts dieser Reaktion wurde anschließend in Gegenwart von 5 Einheiten Taq-Polymerase (Cetus) und 500 ng Sonde (iv) und (v) amplifiziert (30 Zyklen). Ein Aliquot dieser Reaktion wurde auch nach 20 Zyklen Amplifikation entnommen. Die so erhaltenen Produkte wurden anschließend auf Nitrocellulose-Filter transferiert und unter den vorstehend in 5.1. beschriebenen Bedingungen hybridisiert.
Diese Untersuchung erlaubte den Nachweis von spezifischen homologen DNA-Fragmenten im Rückenmark und Großhirn (4b).
5.3. Suche durch in situ-Hybridisierung
Die in situ-Hybridisierungsexperimente wurden auf Kryostatschnitten des Gehirns der adulten Ratte (etwa 8 Wochen alt) nach dem von Hafen et al. beschriebenen Verfahren durchgeführt [EMBO J. 2 (1983) 617]. Die für diese Experimente verwendete Sonde ist eine einzelsträngige RNA, die durch Transkription mit T7-Polymerase und [³⁵S]-CTP erhalten wurde, wobei das Plasmid pNS als Matrize verwendet wurde.
Diese Untersuchung erlaubte den Nachweis homologer Sequenzen gemäß der Erfindung im cerebralen Cortex, im Hippocampus und der Körnerzellschicht des Kleinhirns und im olfaktorischen Bulbus.
6. Isolierung des menschlichen Rezeptors
Gemäß dem in 5. vorstehend beschriebenen Verfahrens wurde der menschliche 5HT5a-Rezeptor cloniert.
Dazu wurde eine menschliche genomische DNA-Bank ausgehend von der Placenta durch partielle Spaltung mittels des Enzyms Mbo1, Trennung auf Salzgradienten und Subclonierung in den Vektor Lamda GEM 12, linearisiert mit BamHI (bakterieller Wirt: TAP90), hergestellt.
Die so erhaltene Bank wurde anschließend mittels der in Beispiel 5.1 beschriebenen Sonde durchsucht. Die DNA-Fragmente, die mit dieser Sonde hybridisieren, wurden isoliert, in ein Bluescript-Plasmid subcloniert, anschließend in beiden Richtungen nach dem Didesoxynucleotidverfahren sequenziert. Die Amplifikation wurde mittels der PCR-Technik durchgeführt: 20 Zyklen mit Thermus aquaticus-Polymerase (2,5 Einheiten; Cetus) und den Oligonucleotiden 1 (SEQ ID Nr. 8), 2 (SEQ ID Nr. 9) für den Teil A des Rezeptors stromaufwärts des Introns, dem Oligonucleotid 3 (SEQ ID Nr. 10), 4 (SEQ ID Nr. 11) für den Teil B des Rezeptors stromabwärts des Introns. Das Fragment A wurde mit den Enzymen NotI und XhoI und das Fragment B mit den Enzymen EcoRI und XhoI gespalten. Diese Fragmente wurden in einen Expressionsvektor P514 subcloniert.
Die erhaltene Sequenz wird in der Sequenz SEQ ID Nr. 7 dargestellt.
Es ist klar, dass dieselben Experimente mit anderen Geweben und vor allem Geweben menschlichen Ursprungs und anderen Sonden wiederholt werden können. Außerdem können die in diesen Untersuchungen nachgewiesenen homologen Sequenzen natürlich anschließend isoliert und/oder mittels klassischer Techniken der Molekularbiologie amplifiziert werden.
SEQUENZPROTOKOLL
TABELLE 1

Claims

Polypeptid, umfassend die Peptidsequenz SEQ ID Nr. 1.
Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es die Fahigkeit besitzt, Serotonin zu binden.
Polypeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Serotoninrezeptoraktivität aufweist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es von Antikörpern, die die Peptidsequenz SEQ ID Nr. 1 erkennen, erkannt werden kann.
Polypeptid, umfassend die Peptidsequenz SEQ ID Nr. 7,
Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 codiert.
Sequenz nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie ausgwählt ist aus: (a) der Nucleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 oder ihrem komplementären Strang, (b) der ganzen Sequenz, die mit einer Sequenz (a) hybridisiert und ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 codiert, und (c) den von Sequenzen (a) und (b) abgeleiteten Sequenzen zur Degeneration des genetischen Codes.
Sequenz nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Nucleotidsequenz SEQ ID Nr. 7 umfasst.
Sequenz nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie ausgewählt ist aus den genomischen Sequenzen, cDNA, RNA, den Hybridsequenzen oder den synthetischen oder halbsynthetischen Sequenzen.
Sequenz nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der das Polypeptid codierende Teil unter die Kontrolle von Signalen gestellt ist, die seine Expression in einer Wirtszelle erlauben.
Antisense-Oligonucleotid, das fähig ist, die Herstellung des Polypeptilds nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zumindest teilweise zu hemmen, dadurch gekennzeichnet, dass es aus einer Nucleotidsequenz nach Anspruch 7 besteht.
Nucleotidsonde, die fähig ist, mit einer Sequenz nach Anspruch 7 oder entsprechender mRNA zu hybridisieren, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Nucleotidsequenz SEQ ID Nr. 1, die Nucleotidsequenz SEQ ID Nr. 7 oder ihre komplementären Stränge umfasst.
Nucleotidsonde, die fähig ist, mit einer Sequenz nach Anspruch 7 oder entsprechender mRNA zu hybridisieren, dadurch gekennzeichnet, dass sie ausgewählt ist aus den Sequenzen SEQ ID Nr. 5, 6, 8–11,
In-vitro-Verwendung einer Sonde nach Anspruch 12 oder 13 als Mittel zur Erkennung der Expression eines Polypeptids mit serotoninerger 5HT5a-Rezeptaraktivität; oder zum Nachweis genetischer Anarmalitäten (schlechtes Spleissen, Polymorphismus, Punktmutationen, etc); oder zur Identifizierung von neurologischen, kardiovaskulären oder psychiatrischen Erkrankungen, wie jene, die mit den 5HT5a-Rezeptaren in Verbindung stehen; oder weiterhin zum Nachweis und zur Isolierung von homologen Nucleinsäuresequenzen, die das 5HT5a-Polypeptid codieren.
Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Nucleotidsequenz nach einem der Ansprüche 6 bis 10 enthält.
Rekombinante Zelle, die fähig ist, auf ihrer Oberfläche ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zu exprimieren, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Expressionsvektor nach Anspruch 15 enthält.
Zelle nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass sie ausgewählk ist aus den eukaryontischen oder prokaryontischen Zellen.
Verfahren zum Nachweis und/oder zur Isolierung van Liganden von wie in den Ansprüchen 1 bis 5 definierten Polypeptiden, dadurch gekennzeichnet, dass die folgenden Schritte durchgeführt werden: – Inkontaktbringen eines Moleküls oder eines Gemischs, das verschiedene Moleküle enthält, die gegebenenfalls nicht identifiziert sind mit einer rekombinanten Zelle nach Anspruch 16, die auf ihrer Oberfläche ein wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 definiertes Polypeptid exprimiert, unter Bedingungen, die die Wechselwirkung zwischen dem Polypeptid und dem Molekül erlauben, im Falle, dass es eine Affinität für das Polypeptids besitzt, und, – Nachweis und/oder Isalierung der mit dem Polypeptid verbundenen Moleküle.
Verfahren nach Anspruch 18 zum Nachweis und/oder zur Isolierung von Agonisten oder Antagonisten von Serotinin.
Verfahren zum Nachweis und/oder zur Isolierung von Modulatoren der wie in den Ansprüchen 1 bis 5 definierten Polypeptide, dadurch gekennzeichnet, dass die folgenden Schritte durchgeführt werden: – Inkontaktbringen eines Moleküls oder eines Gemischs, das verschiedene Moleküle enthält, die gegebenenfalls nicht identifiziert sind, mit einer rekombinanten Zelle nach Anspruch 16, die auf ihrer Oberfläche ein wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 definiertes Polypeptid exprimiert, in, Anwesenheit von 5HT, unter Bedingungen, die die Wechselwirkung zwichen dem Polypeptid und 5HT erlauben, und – Nachweis und/oder Isolierung der Moleküle; die fähig sind, die Aktivität des 5HT auf dem Palypeptid zu modulieren.