ES2208641T3 - Polipeptidos con actividad de receptor serotoninergico (5-ht5a), acidos nucleicos que codifican para estos polipeptidos y usos de los mismos. - Google Patents

Polipeptidos con actividad de receptor serotoninergico (5-ht5a), acidos nucleicos que codifican para estos polipeptidos y usos de los mismos.

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Nourdine Amlaiky
Ursula Boschert
Rene Hen
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Abstract

LA PRESENTE INVNCION SE REFIERE A NUEVOS POLIPEPTIDOS LLAMADOS 5HT5A QUE TIENEN UNA ACTIVIDAD DE RECEPTOR SEROTONINERGICO, EL MATERIAL GENETICO QUE PERMITE SU EXPRESION, CUALQUIER CELULA RECOMBINANTE QUE EXPRESE ESTOS POLIPEPTIDOS, Y SU UTILIZACION.

Description

Polipéptidos con actividad de receptor serotoninérgico (5-HT5a), ácidos nucleicos que codifican para estos polipéptidos y usos de los mismos.
La presente invención trata de nuevos polipéptidos y del material genético que permite su expresión. Más particularmente, trata de nuevos polipéptidos con una actividad de receptor serotoninérgico.
La serotonina es un neuromodulador capaz de inducir y modular una amplia variedad de comportamientos, tales como el sueño, el apetito, la locomoción, la actividad sexual o incluso la contracción vascular. Se admite que la actividad de la serotonina está mediada por su interacción con los receptores, denominados receptores serotoninérgicos o receptores 5-HT (para 5-hidroxitriptamina). Estudios de biología molecular, así como estudios farmacológicos, han revelado que existía un gran número de subtipos de receptores 5-HT. Los receptores 5-HT que se han descrito hasta hoy pertenecen bien a la familia de los receptores unidos a canales iónicos (receptores 5-HT3) o bien a la familia de los receptores que interactúan con proteínas G y que poseen siete dominios transmembrana. Además, el análisis de las secuencias de aminoácidos a mostrado que los receptores 5-HT que interactúan con proteínas G pueden subdividirse en dos grupos distintos: los receptores 5-HT1, que comprenden los subtipos mamíferos 5-HT1A, 5-HT1B y 5-HT1D, así como tres receptores 5-HT de drosofila; y los receptores 5-HT2, que comprenden los subtipos 5-HT2 y 5-HT1C.
Estos receptores no son, sin duda, los únicos receptores 5-HT existentes, en la medida en que estudios farmacológicos han revelado otros subtipos tales como los receptores 5-HT4, así como ciertos receptores similares al subtipo 5-HT1(receptores "5-HT1 like"). Además, estudios complementarios de biología molecular han revelado igualmente heterogeneidades en el seno de los subtipos 5-HT1B/1D.
La presente invención es el resultado de la puesta en evidencia de nuevos polipéptidos con una actividad de receptor serotoninérgico. A pesar de que pertenecen a la familia de los receptores que interactúan con proteínas G, estos nuevos polipéptidos difieren de los receptores serotoninérgicos ya descritos (5-HT1, 5-HT2, 5-HT3 y 5-HT4) tanto desde el punto de vista estructural como desde el punto de vista farmacológico. Más particularmente, la invención resulta del aislamiento y la caracterización de estos nuevos polipéptidos, denominados 5-HT5a, así como del material genético que permite su expresión o su identificación.
Un primer objeto de la invención reside por tanto en los polipéptidos 5-HT5a que comprenden la secuencia SEC ID nº1; la invención trata igualmente de los péptidos 5-HT5a que comprenden la secuencia SEC ID nº7, que corresponde al receptor humano.
Preferiblemente, los polipéptidos de la invención son polipéptidos que poseen la capacidad de unir la serotonina. Aún mas preferiblemente, se trata de polipéptidos con una actividad de receptor serotoninérgico. Siempre según un modo preferible, los polipéptidos de la invención son susceptibles de ser reconocidos por los anticuerpos que reconocen la secuencia peptídica SEC ID nº1 completa.
Como se indica en los ejemplos, el polipéptido 5-HT5a puede expresarse en diferentes tipos celulares para formar un receptor serotoninérgico funcional.
Los polipéptidos de la invención pueden obtenerse por expresión, en un hospedador celular, de una secuencia nucleotídica como la descrita a continuación, mediante síntesis química, sobre la base de la secuencia SEC ID nº1, usando técnicas conocidas por el experto en la materia o mediante una combinación de estas técnicas.
En lo sucesivo, los polipéptidos de la invención como los definidos anteriormente se designan como polipéptidos 5-HT5a.
La presente invención tiene igualmente por objeto cualquier secuencia nucleotídica que codifique para un polipéptido 5-HT5a. Más preferiblemente, se trata de una secuencia elegida entre:
(a)
la secuencia nucleotídica SEC ID nº1 o su hebra complementaria
(b)
cualquier secuencia que hibride con una secuencia (a) y que codifique para un polipéptido como el definido anteriormente, y
(c)
las secuencias derivadas de las secuencias (a) y (b) debidas a la degeneración del código genético.
Según un modo de realización particular, la invención tiene por objeto una secuencia nucleotídica que comprende la secuencia SEC ID nº7.
Las diferentes secuencias nucleotídicas de la invención pueden ser o no de origen artificial. Puede tratarse de secuencias genómicas, de ADNc, de ARN, de secuencias híbridas o de secuencias sintéticas o semisintéticas. Estas secuencias pueden obtenerse, por ejemplo, mediante el cribado de bancos de ADN (banco de ADNc, banco de ADN genómico) por medio de sondas elaboradas sobre la base de la secuencia SEC ID nº1. Dichos bancos pueden prepararse a partir de células de diferentes orígenes, mediante las técnicas clásicas de biología molecular conocidas por el experto en la materia. Las secuencias nucleotídicas de la invención pueden prepararse igualmente mediante síntesis química, particularmente según el procedimiento del fosforamidito, o incluso mediante procedimientos mixtos que incluyen la modificación química o enzimática de secuencias obtenidas mediante el cribado de bancos.
Las secuencias nucleotídicas de la invención pueden usarse para la producción de polipéptidos 5-HT5a como los definidos anteriormente. En este caso, la parte que codifica para dicho polipéptido se sitúa generalmente bajo el control de señales que permiten su expresión en un hospedador celular. La elección de estas señales (promotores, terminadores, etc.) puede variar en función del hospedador celular usado. A este efecto, las secuencias nucleotídicas de la invención pueden formar parte de un vector, que puede ser de replicación autónoma o integrativa. Más particularmente, los vectores de replicación autónoma pueden prepararse usando secuencias de replicación autónoma en el hospedador elegido. Si se trata de vectores integrativos, pueden prepararse, por ejemplo, usando secuencias homólogas en ciertas regiones del genoma del hospedador, permitiendo, mediante recombinación homóloga, la integración del vector. Los hospedadores celulares usables para la producción de los polipéptidos 5-HT5a de la invención por vía recombinante son tanto los hospedadores eucariotas como los procariotas. Entre los hospedadores eucariotas adecuados pueden citarse las células animales, las levaduras o los hongos. En particular, si se trata de levaduras, pueden citarse las levaduras del género Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces o Hansenula. Si se trata de células animales, pueden citarse las células COS, CHO, C127, NIH-3T3, etc.. Entre los hongos pueden citarse más particularmente Aspergillus sps. o Trichoderma sps.. Como hospedadores procariotas se prefiere usar las siguientes bacterias: E. coli, Bacillus o Streptomyces.
Las secuencias nucleotídicas de la presente invención son igualmente usables en el ámbito farmacéutico, bien para la elaboración de secuencias antisentido usables en el marco de una terapia génica, o bien para la elaboración de sondas que permitan la detección, mediante experimentos de hibridación, de la expresión de receptores serotoninérgicos en muestras biológicas, y para poner en evidencia anomalías genéticas (polimorfismo, mutaciones) o expresiones aberrantes.
La inhibición de la expresión de ciertos genes por los oligonucleótidos antisentido han demostrado ser una estrategia prometedora en el control de la actividad de un gen. Los oligonucleótidos antisentido son oligonucleótidos de pequeño tamaño, complementarios de la hebra que codifica para un gen dado, y por tanto capaces de hibridar específicamente con el ARNm transcrito, inhibiendo su traducción en proteína. La invención tiene así por objeto los oligonucleótidos antisentido capaces de inhibir al menos parcialmente la producción de polipéptidos 5-HT5a como los definidos anteriormente. Dichos oligonucleótidos pueden estar constituidos por las secuencias nucleotídicas definidas previamente.
Como se indica anteriormente, la invención permite igualmente la elaboración de sondas nucleotídicas, sintéticas o no sintéticas, capaces de hibridar con las secuencias nucleotídicas definidas previamente que codifican para los polipéptidos 5-HT5a de la invención, o con los ARNm correspondientes. Dichas sondas pueden usarse in vitro como herramienta de diagnóstico, para la detección de la expresión de un receptor serotoninérgico 5-HT5a, e incluso para poner en evidencia anomalías genéticas (mal corte y empalme, polimorfismo, mutaciones puntuales, etc.). Teniendo en cuenta las múltiples actividades de la serotonina, las sondas de la invención pueden permitir también identificar afecciones neurológicas, cardiovasculares o psiquiátricas que estén relacionadas con los receptores 5-HT5a. Estas sondas pueden usarse igualmente para poner en evidencia y aislar secuencias de ácidos nucleicos homólogas que codifican para los polipéptidos 5-HT5a, como las definidas anteriormente, a partir de otras fuentes celulares, y preferiblemente de células de origen humano, tal y como se ilustra en los ejemplos. Las sondas de la invención comprenden generalmente al menos 10 bases, y pueden comprender hasta la totalidad de la secuencia SEC ID nº1 o SEC ID nº7, o de su hebra complementaria. Preferiblemente, estas sondas se marcan antes de su usación. Para ello pueden emplearse diferentes técnicas conocidas por el experto en la materia (marcaje radioactivo, enzimático, etc.). Las condiciones de hibridación en las que pueden usarse estas sondas se indican en las técnicas generales de clonaje, a continuación, así como en los ejemplos, a continuación.
Otro objeto de la invención trata de las células recombinadas capaces de expresar en su superficie un polipéptido 5-HT5a como el definido anteriormente. Estas células pueden obtenerse mediante la introducción de una secuencia nucleotídica como la definida anteriormente que codifique para un polipéptido de la invención, y después, cultivar dichas células en las condiciones de expresión de dicha secuencia.
Las células recombinadas según la invención pueden ser tanto células eucariotas como procariotas. Entre las células eucariotas adecuadas pueden citarse las células animales, las levaduras o los hongos. En particular, si se trata de levaduras, pueden citarse las levaduras del género Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces o Hansenula. Si se trata de células animales, pueden citarse las células COS, CHO, C127, NIH-3T3, etc.. Entre los hongos pueden citarse más particularmente Aspergillus sps. o Trichoderma sps.. Como células procariotas se prefiere usar las siguientes bacterias: E. coli, Bacillus o Streptomyces. Las células así obtenidas pueden usarse para medir la capacidad de diferentes moléculas de comportarse como ligando o como modulador de la actividad de los polipéptidos de la invención. Más particularmente, también pueden usarse en un procedimiento para poner en evidencia y aislar ligandos o moduladores de la actividad de los polipéptidos de la invención, y más preferiblemente, de agonistas y antagonistas de la serotonina.
Otro objeto de la invención trata por tanto de un procedimiento para poner en evidencia y/o aislar ligandos de polipéptidos 5-HT5a de la invención, según el cual se realizan las siguientes etapas:
-
se pone en contacto una molécula o una mezcla que contiene diferentes moléculas, eventualmente no identificadas, con una célula recombinada como la descrita anteriormente, que exprese en su superficie un polipéptido de la invención en unas condiciones que permitan la interacción entre dicho polipéptido de la invención y dicha molécula, en el caso de que ésta poseyera una afinidad por dicho polipéptido, y,
-
se detectan y/o aíslan las moléculas unidas a dicho polipéptido de la invención.
En un modo particular, este procedimiento de la invención se adapta para poner en evidencia y/o aislar agonistas y antagonistas de la serotonina para los polipéptidos 5-HT5a.
Otro objeto de la invención trata de un procedimiento para poner en evidencia y/o aislar moduladores de los polipéptidos 5-HT5a de la invención, según el cual se realizan las siguientes etapas:
-
se pone en contacto una molécula o una mezcla que contiene diferentes moléculas, eventualmente no identificadas, con un célula recombinada como la descrita anteriormente, que exprese en su superficie un polipéptido de la invención, en presencia de 5-HT, en unas condiciones que permitan la interacción entre dicho polipéptido de la invención y dicha 5-HT, y,
-
se detectan y/o aíslan las moléculas capaces de modular la actividad de la 5- HT sobre dicho polipéptido de la invención.
Otras ventajas de la presente invención aparecerán con la lectura de los ejemplos que siguen, que deben ser considerados como ilustrativos y no limitativos.
Leyenda de las figuras
SEC ID nº1: secuencias nucleotídica y peptídica del receptor 5-HT5a. El ADNc de 4 kb se ha secuenciado sobre las dos hebras desde el sitio EcoRi hasta la posición 1685. Los 2300 nucleótidos restantes no han sido secuenciados, con excepción del extremo 3' que contiene la cola poliA.
Figura 2: porcentajes de homología de la secuencia peptídica entre el receptor 5-HT5a SEC ID nº1 y otros receptores de la familia de los receptores acoplados a proteínas G. las homologías se han calculado sobre las secuencias conservadas: el dominio transmembrana y sus bucles de conexión.
Figura 3: curva de saturación de [^{125}I]-LSD en las membranas de células Cos-7 que expresan el receptor 5-HT5a. Las membranas se han incubado con concentraciones de ligando que varían desde 50 pM hasta 1,25 nM, con o sin 10 \muM de 5-HT. Se representa la unión específica. La inserción representa el análisis de Scatchard de los resultados.
Figura 4: puesta en evidencia de la secuencias homólogas: (a) mediante transferencia Northern sobre los ARNm poliA (5 \mug) de diferentes tejidos; (b) mediante PCR sobre los ARN totales (1 \mug) de diferentes tejidos.
Tabla 1: perfil farmacológico del receptor 5-HT5a. Los resultados corresponden a experimentos de competición por la unión de [^{125}I]-LSD, bien en membranas de células Cos-7 que expresan el receptor 5-HT5a de forma transitoria, o bien en membranas de células NS4 que expresan el receptor 5-HT5a de forma estable. Los valores de IC_{50} (correspondientes a la concentración de ligando necesaria para desplazar el 50% del [^{125}I]-LSD unido) se han calculado experimentalmente y se han convertido en K_{i} según la siguiente ecuación: K_{i} = IC_{50} / (1 + C/K_{d}), en la que C es la concentración de [^{125}I]-LSD y K_{d} es la constante de disociación del [^{125}I]-LSD (308 pM). Los números entre paréntesis corresponden al número de experimentos independientes realizados, estando cada punto realizado por
triplicado.
Técnicas generales de clonaje
Los procedimientos clásicos usados en biología molecular, como las extracciones preparativas de ADN plasmídico, la centrifugación de ADN plasmídico en gradiente de cloruro de cesio, la electroforesis sobre gel de agarosa o de acrilamida, la purificación de fragmentos de ADN mediante electroelución, las extracciones de proteínas con fenol o fenol-cloroformo, la precipitación de ADN en medio salino con etanol o isopropanol, la transformación en Escherichia coli, etc., son bien conocidos por el experto en la materia, y están abundantemente descritas en la bibliogrfía [Maniatis, T. y col., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1982; Ausubel, F. M. Y col., (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, Nueva York, 1987].
Las enzimas de restricción han sido proporcionadas por New England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) o Amersham, y se usan según las recomendaciones del proveedor.
Para las uniones se separan los fragmentos de ADN según su tamaño mediante electroforesis en gel de agarosa o acrilamida, se extraen con fenol o con una mezcla fenol/cloroformo, se precipitan con etanol y después se incuban en presencia de ADN ligasa del pliegue T4 (Biolabs) según las recomendaciones del proveedor.
El relleno de los extremos 5' prominentes se realiza mediante el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli (Biolabs), según las especificaciones del proveedor. La destrucción de los extremos 3' prominentes se realiza en presencia de la ADN polimerasa del fago T4 (Biolabs) usado según las recomendaciones del fabricante. La destrucción de los extremos 5' prominentes se realiza mediante un tratamiento facilitado por la nucleasa S1.
La mutagénesis dirigida in vitro por oligodesoxinucleótidos sintéticos se realiza según el procedimiento desarrollado por Taylor y col. [Nucleic Acids Res. 13 (1985), 8749-8764] usando el equipo distribuido por Amersham.
La amplificación enzimática de los fragmentos de ADN mediante la técnica denominada de PCR [Polimerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki, R. K. Y col., Science 230 (1985), 1350-1354; Mullis, K. B. y Faloona, F. A., Meth. Enzym. 155 (1987), 335-350] se realiza usando un "DNA thermal cycler" (ciclador térmico de ADN) (Parkin Elmer Cetus) según las especificaciones del fabricante.
La verificación de las secuencias nucleotídicas se realiza por el procedimiento desarrollado por Sanger y col. [Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 74 (1977), 5463-5467] usando el equipo distribuido por Amersham.
Para los experimentos de hibridación, las condiciones de astringencia normales son generalmente las siguientes: hibridación: 3 x SCC en presencia de 5 x Denhart's a 65ºC; lavado: 0,5 x SSC a 65ºC.
1. Aislamiento del receptor 5-HT5a
Las comparaciones de las secuencias entre los diferentes receptores serotoninérgicos conocidos hacen aparecer una cierta conservación, particularmente en ciertas regiones transmembrana potenciales como los dominios III y IV. Con el objeto de poner en evidencia y de aislar un nuevo receptor, se han preparado tres oligonucleótidos degenerados correspondientes a estas regiones, y después se han usado en una serie de reacciones de PCR sobre una preparación de ARN de cerebro de rata. La secuencia de los oligonucleótidos degenerados (i)-(iii) se da en las secuencias SEC ID nº2-4.
Las reacciones de PCR se han realizado de la forma siguiente: se han sometido 5 \mug de ARN de cerebro de rata adulta a una reacción de transcripción inversa en presencia de 500 ng de oligonucleótido (i) y de 200 unidades de transcriptasa inversa MMLV (BRL). La mitad del producto de esta reacción se ha sometido a continuación a 30 ciclos de amplificación en presencia de 5 unidades de polimerasa Taq (Cetus) y de 1 \mug de oligonucleótido (i) y de oligonucleótido (ii). Un veinteavo del producto de esta reacción se ha sometido a continuación a 30 ciclos de amplificación suplementarios en presencia de los oligonucleótidos (i) y (iii). Los productos así obtenidos han sido digeridos con las enzimas BamHI e HindIII, insertados en los sitios correspondientes del plásmido Bluescript (Estratagema) y secuenciados. Uno de los fragmentos así obtenidos, que presenta una cierta homología con los receptores serotoninérgicos, se ha marcado mediante "random priming" (cebado aleatorio) (Feinberg y Vogelstein, Analytical Biochemistry 132 (1984), 6) y se ha usado como sonda para cribar una banco de ADNc de cerebro de rata construido en el fago UniZap (Estratagema). Entre los fagos positivos obtenidos, uno de ellos, denominado \lambdaNS y portado por el plásmido pNS, contenía un inserto de 4 kb. Este fago se ha aislado, y su inserto se ha introducido a continuación en el plásmido Bluescript. La secuencia de este fragmento se ha determinado sobre aproximadamente 1,6 kb sobre las 2 hebras usando la técnica de los didesoxinucleótidos por medio de los oligonucleótidos sintéticos.
La secuencia así obtenida se presenta sobre la secuencia SEC ID nº1. Ésta muestra que el ADNc aislado porta una fase de lectura abierta de 357 aminoácidos. Además, el análisis de hidrofobicidad muestra que esta proteína porta siete dominios hidrófobos, una particularidad reencontrada entre los miembros de la familia de los receptores acoplados a proteínas G. El extremo N-terminal contiene además 2 sitios de N-glucosilación, y el presunto dominio citoplásmico contiene los sitios consenso de fosforilación por las proteíncinasas C y A.
2. Estudio de homologías de secuencia
La secuencia del receptor 5-HT5a aislado anteriormente se ha comparado con las secuencias de los siguientes receptores acoplados a proteínas G: 5-HT1B, 5-HT1D, 5-HT1A, 5-HT-dro2A, 5-Ht-dro1, \alpha2, D2, \beta1, D1, H2, 5-HT1C y 5-HT2. Estos experimentos han revelado una cierta homología en el dominio transmembrana potencial y en ciertos bucles, pero no en las regiones terminales ni en el tercer bucle citoplásmico. La figura 2 da los % de homología a nivel de las regiones conservadas.
Como se desprende de esta figura, la homología con los receptores conocidos es débil, habiendo obtenido el mejor resultado con el receptor serotoninérgico de drosofila HT-dro2A (37% de homología).
3. Expresión del receptor 5-HT5a en las células Cos-7 y caracterización farmacológica
El fragmento de ADNc aislado en el ejemplo 1 se ha insertado en un vector de expresión eucariota, que se ha usado para transfectar las células Cos-7. Las membranas de las células transfectadas obtenidas se preparan y se ensayan a continuación para comprobar su capacidad de unir ciertos ligandos serotoninérgicos marcados.
\newpage
El ADNc de 4 kb que codifica para el receptor 5-HT5a se ha aislado a partir del plásmido pNS en forma de un fragmento EcoRI-Xhoi, y después se ha insertado en los sitios correspondientes del vector p513. El vector p513 deriva del vector pSG5 [Green y col., Nucl. Acids Res. 16 (1988), 369] mediante la adición de un multisitio de clonaje. El vector recombinante así obtenido, denominado p513NS, se ha usado a continuación (20 \mug por placa de 10 cm) para transfectar las células Cos-7 en presencia de fosfato cálcico.
48 horas después de la transfección, las células recombinantes se recogen, y las membranas se preparan según la técnica descrita por Amlaiky y Caron [J. Biol. Chem. 260 (1985), 1983]. A continuación se han realizado experiencias de unión a saturación y de competición sobre estas membranas en presencia de los siguientes ligandos radiomarcados: [^{125}I]-LSD; [^{125}I]-cianopindolol; [^{3}H]-8-OH-DPAT y [^{3}H]-espiperona. Para ello se han incubado las muestras de membrana (10-20 \mug de proteínas) 10 minutos a 37ºC en presencia del ligando, en un volumen final de 250 \mul de tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,4). Después se ha parado la reacción mediante filtración a vacío sobre filtros de fibra de vidrio Whatman GF/C, y se ha enjuagado 4 veces con 4 ml de tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,4). La unión no específica se ha determinado en presencia de 5-HT 10 \muM. La radioactividad se ha medido con un contador \gamma.
Los resultados obtenidos muestran que aunque el [^{125}I]-cianopindolol, el [^{3}H]-8-OH-DPAT y la [^{3}H]-espiperona no unen las membranas preparadas, el [^{125}I]-LSD presenta un sitio de unión saturable con una K_{d} = 340 pM y una B_{máx} = 1,6 pmol/mg de proteínas membranales (figura 3). En un experimento controlado, se ha mostrado además que el [^{125}I]-LSD no une las células Cos-7 transfectadas por el plásmido p513.
Para determinar el perfil farmacológico de este receptor, el [^{125}I]-LSD unido a las membranas se ha desplazado en presencia de diferentes fármacos serotoninérgicos (tabla 1). Estos diferentes fármacos muestran el siguiente orden de eficacia de desplazamiento: 2-bromo-LSD > ergotamina > 5-CT > metisergida > 5-HT = RU24969 > bufotenina > yohimbina = 8-OH-DPAT (tabla 1). La ketanserina, el (\pm) pindolol, el sumatriptán, la dopamina y la norepinefrina son inactivas.
4. Expresión del receptor 5-HT5a en las células NIH-3T3 y estudio farmacológico
El ADNc clonado en el ejemplo 1 ha sido igualmente expresado por las células NIH-3T3, que no expresan ningún receptor serotoninérgico de forma endógena. Para ello, se ha usado el vector de expresión recombinante descrito en 3, anteriormente. Se ha introducido (20 \mug por placa de 10 cm) en las células NIH-3T3 mediante transfección en presencia de fosfato cálcico, al mismo tiempo que el vector pRSVneo [Goman y col., Science 221 (1983), 551], que porta el gen de resistencia G418 (1 \mug por placa de 10 cm). Los clones transformantes se han seleccionado en presencia de 0,5 mg de G418. A continuación se han amplificado los clones aislados, y los ARN totales de estos clones se han preparado y analizado mediante transferencia Northern para comprobar la expresión del ARNm del 5-HT5a. Así, se han seleccionado 2 clones, NS1 y NS4, que expresan respectivamente niveles elevados y débiles de ARNm del 5-HT5a.
Las membranas de las células de estos clones se han preparado y ensayado a continuación en las condiciones descritas anteriormente para comprobar su capacidad de unir ciertos ligandos serotoninérgicos marcados, y para determinar la afinidad de los receptores por dichos ligandos.
Los resultados obtenidos muestran que las membranas de estos 2 clones poseen unos sitios de unión de alta afinidad para el [^{125}I]-LSD, lo que indica que estos 2 clones expresan los receptores 5-HT5a. Un experimento control ha mostrado, en efecto, que las células NIH-3T3 no transfectadas eran incapaces de unir el [^{125}I]-LSD. A continuación se han realizado diferentes experimentos de desplazamiento (tabla 1). En el caso del 5-HT, del 5-CT, del sumatriptán y del 8-OH-DPAT, las curvas de competición obtenidas eran bifásicas, y un análisis de los resultados ha revelado 2 componentes de unión, uno con una afinidad elevada y otro con una afinidad más débil.
5. Búsqueda de secuencias homólogas en otros tejidos
La secuencia nucleotídica SEC ID nº1 se ha usado a continuación para poner en evidencia secuencias homólogas a partir de otros tejidos. Para ello se han usado tres técnicas:
- la hibridación mediante transferencia Northern
- la PCR
- la hibridación in situ
Los tejidos usados para la búsqueda de secuencias homólogas son los siguientes, de origen marino: cerebro, cerebelo, riñón, hígado, médula espinal, bazo, pulmón y corazón.
5.1 Búsqueda mediante hibridación por transferencia Northern
A partir de los tejidos indicados anteriormente se han preparado los ARNm-poliA según la técnica descrita por Cathala y col.(DNA 2(4) (1983)), seguida del paso sobre una columna de oligo(dT)-celulosa. Estos ARNm se han fraccionado a continuación sobre gel de agarosa-formaldehído al 1%, y después se han transferido sobre un filtro de nitrocelulosa. La sonda usada para la hibridación corresponde al fragmento EcoRI-Xhoi de 4 kb completo, descrito en el ejemplo 1 (SEC ID nº1), previamente marcado con ^{32}P mediante "random priming" (cebado aleatorio). La hibridación se ha realizado en condiciones de astringencia elevadas: 42ºC, en un tampón de fosfato sódico 20 mM (pH 6,5) que contiene un 50% de formamida, 5 x SSC, 1 x Denhardt's, 0,1% de SDS y 100 \mug/ml de ARNt. los lavados se han realizado a 60ºC en un tampón 0,1 x SSC, 0,1% x SDS.
Este estudio ha permitido poner en evidencia tres transcritos homólogos en el cerebro y el cerebelo, de 5,8 kb, 5 kb y 4,5 kb (figura 4a).
5.2 Búsqueda mediante PCR
Para la búsqueda mediante PCR se han usado las sondas (iv) SEC ID nº5 y (v) SEC ID nº6.
La sonda (iv) corresponde a la posición 1351 sobre la secuencia SEC ID nº1, y la sonda (v) a la posición 947.
Los ARN totales se han preparado a partir de diferentes tejidos estudiados usando la técnica descrita por Cathala y col. citada anteriormente. Se ha sometido 1 \mug de estos ARN a una transcripción inversa en presencia de 200 unidades de transcriptasa inversa MMLV y de 300 ng de la sonda (iv), durante 1 hora a 37ºC. A continuación se ha amplificado la mitad del producto de esta reacción (30 ciclos) en presencia de 5 unidades de polimerasa Taq (Cetus) y de 500 ng de las sondas (iv) y (v). También se ha tomado una alícuota de esta reacción tras 20 ciclos de amplificación. Los productos así obtenidos se han transferido a continuación sobre filtros de nitrocelulosa y se han hibridado en las condiciones descritas anteriormente en 5.1.
Este estudio ha permitido poner en evidencia fragmentos de ADN específicos homólogos en la médula espinal y el cerebro (figura 4b).
5.3 Búsqueda mediante hibridación in situ
Los experimentos de hibridación in situ se han realizado sobre secciones criostatizadas de cerebro de rata adulta (de alrededor de 8 semanas) según la técnica descrita por Hafen y col. [EMBO J. 2 (1983), 617]. La sonda usada para estos experimentos es una hebra de ARN simple obtenida por transcripción en presencia de polimerasa T7, de [^{35}S]-CTP, usando el plásmido pNS como matriz.
Este estudio ha permitido poner en evidencia las secuencias homólogas según la invención en la corteza cerebral, el hipocampo y la capa granular del cerebelo y en el bulbo olfatorio.
6. Aislamiento del receptor humano
Según la metodología descrita anteriormente en 5, se ha clonado el receptor 5-HT5a humano.
Para ello se ha preparado un banco de ADN genómico humano a partir de placenta mediante digestión parcial por la enzima Mbol, separación en gradiente de sales y subclonaje en el vector Lamda GEM 12 linealizado para BamHi (hospedador bacteriano: TAP 90).
El banco así obtenido se ha cribado a continuación por medio de la sonda descrita en el ejemplo 5.1. Los fragmentos de ADN que hibridan con esta sonda se han aislado, se han subclonado en un plásmido Bluescript, se han amplificado y después secuenciado en los dos sentidos según la técnica del didesoxinucleótido. La amplificación se ha realizado mediante la técnica de PCR: 20 ciclos en presencia de polimerasa Thermus acuaticus (2,5 unidades; Cetus) y de oligonucleótidos 1 (SEC ID nº8), 2 (SEC ID nº9) por la parte A del receptor más arriba del intrón, de oligonucleótidos 3 (SEC ID nº10), 4 (SEC ID nº11) por la parte B del receptor más abajo del intrón. El fragmento A ha sido digerido por las enzimas Notl y Xhol, y el fragmento B por las enzimas EcoRI y Xhol. Estos fragmentos se han subclonado en un vector de expresión P514.
La secuencia obtenida se presenta sobre la secuencia SEC ID nº7.
Se entiende que pueden repetirse los mismos experimentos usando otros tejidos, y especialmente tejidos de origen humano, y otras sondas. Además, las secuencias homólogas puestas en evidencia durante estos experimento pueden, evidentemente, ser aisladas a continuación y/o amplificadas mediante las técnicas clásicas de biología molecular.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
DEPOSITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: RHONE-POULENC RORER, S.A.
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CALLE: 20, avenue Raymond ARON
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CIUDAD: ANTONY
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
PAÍS: FRANCIA
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
CÓDIGO POSTAL: 92165
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevos polipéptidos con actividad de receptor serotoninérgico, ácidos nucleicos que codifican para estos polipéptidos y uso de los mismos.
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 11
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
TIPO DE SOPORTE: Cinta
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: Patentin Release #1.0 Versión #1.25 (OEB)
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº1:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1686 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: ratón
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 509..1582
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
OTRAS CARACTERÍSTICAS: /producto= "Gen receptor 5-HT5a de ratón"
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº1
\vskip1.000000\baselineskip
1
2
3 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº2:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: oligonucleótido (i)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGAACTAGTG GATCCAARAA NGGNARCCAR CA 
\hfill
32 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº3:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: oligonucleótido (ii)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTTGATATCG AATTCGAYRT NCTNTGYTGY AC 
\hfill
32 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº4:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: oligonucleótido (iii)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCTATCGATA AGCTTATHGC YCTNGAYMGN TA 
\hfill
32 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº5:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: oligonucleótido (iv)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTTCTGCTCC CTCCACGTAT C 
\hfill
21 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº6:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: oligonucleótido (v)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGCCACCTGG AGTACACACT C 
\hfill
21 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº7:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1074 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1..1074
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
OTRAS CARACTERÍSTICAS: /producto= "Gen del receptor 5-HT5A humano"
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº7
\vskip1.000000\baselineskip
4
5
50 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº8:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 43 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: oligonucleótido 1
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCATGCGCGC GGCCGCGGCA CCATGGATTT ACCTGTGAAC CTA 
\hfill
43 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº9:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: oligonucleótido 2
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTCGGATATC GGTGAGCGC 
\hfill
20 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº10:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
ORGANISMO: oligonucleótido 3
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCGATATCCG AAGCTGTGGA GGTGAAGGAC TCTGCCAACC A 
\hfill
41 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº11:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
ORIGEN:
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
ORGANISMO: oligonucleótido 4
\vskip0.666000\baselineskip
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AACCCGGGCT TAAGTCATG TTGCCTAGAA AAGAAGT 
\hfill
37 
\vskip1.000000\baselineskip
6

Claims (20)

1. Polipéptido que comprende la secuencia peptídica SEC ID nº1.
2. Polipéptido según la reivindicación 1, caracterizado porque posee la capacidad de unir la serotonina.
3. Polipéptido según la reivindicación 2, caracterizado porque posee una actividad de receptor serotoninérgico.
4. Polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque puede ser reconocido por anticuerpos que reconocen la secuencia peptídica SEC ID nº1.
5. Polipéptido que comprende la secuencia peptídica SEC ID nº7.
6. Secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Secuencia según la reivindicación 6, caracterizada porque se selecciona entre:
(a) la secuencia nucleotídica SEC ID nº1 o su hebra complementaria,
(b) cualquier secuencia que hibride con una secuencia (a) y que codifique para un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 5, y
(c) las secuencias derivadas de las secuencias (a) y (b) debidas a la degeneración del código genético.
8. Secuencia según la reivindicación 7, caracterizada porque comprende la secuencia nucleotídica SEC ID nº7.
9. Secuencia según la reivindicación 7, caracterizada porque se selecciona entre las secuencias genómicas, de ADNc, de ARN, las secuencias híbridas o las secuencias sintéticas o semisintéticas.
10. Secuencia según una de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizada porque la parte que codifica para dicho polipéptido se sitúa bajo el control de señales que permiten su expresión en un hospedador celular.
11. Oligonucleótido antisentido capaz de inhibir al menos parcialmente la producción de polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque está constituido por una secuencia nucleotídica según la reivindicación 7.
12. Sonda nucleotídica capaz de hibridar con una secuencia según la reivindicación 7 o con el ARNm correspondiente, caracterizada porque comprende la secuencia nucleotídica SEC ID nº1, la secuencia nucleotídica SEC ID nº7 o sus hebras complementarias.
13. Sonda nucleotídica capaz de hibridar con una secuencia según la reivindicación 7 o con el ARNm correspondiente, caracterizada porque se selecciona entre las secuencias SEC ID nº5, 6, 8-11.
14. Utilización in vitro de una sonda según la reivindicación 12 ó 13 como agente para la detección de la expresión de un receptor serotoninérgico 5-HT5a; o para poner en evidencia anomalías genéricas (mal corte y empalme, polimorfismo, mutaciones puntuales, etc.); o para identificar afecciones neurológicas, cardiovasculares o psiquiátricas que estén relacionadas con los receptores 5-HT5a; o incluso para poner en evidencia y aislar secuencias de ácidos nucleicos homólogos que codifican para los polipéptidos 5-HT5a.
15. Vector de expresión, caracterizado porque contiene una secuencia nucleotídica según una de las reivindicaciones 6 a 10.
16. Célula recombinada capaz de expresar en su superficie un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque contiene un vector de expresión según la reivindicación 15.
17. Célula según la reivindicación 16, caracterizada porque se selecciona entre las células eucariotas o procariotas.
18. Procedimiento de puesta en evidencia y/o aislamiento de ligandos de polipéptidos como los definidos en las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se realiza en las siguientes etapas:
-
se pone en contacto una molécula o una mezcla que contiene diferentes moléculas, eventualmente no identificadas, con un célula recombinada según la reivindicación 16, que exprese en su superficie un polipéptido como el definido en las reivindicaciones 1 a 5 en unas condiciones que permitan la interacción entre dicho polipéptido y dicha molécula, en el caso de que ésta poseyera una afinidad por dicho polipéptido, y,
-
se detectan y/o aíslan las moléculas unidas a dicho polipéptido.
19. Procedimiento según la reivindicación 18 para la puesta en evidencia y/o aislamiento de agonistas o de antagonistas de la serotonina.
20. Procedimiento de puesta en evidencia y/o aislamiento de moduladores de polipéptidos como los definidos en las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se realiza en las siguientes etapas:
-
se pone en contacto una molécula o una mezcla que contiene diferentes moléculas, eventualmente no identificadas, con un célula recombinada según la reivindicación 16, que exprese en su superficie un polipéptido como el definido en las reivindicaciones 1 a 5, en presencia de 5-HT, en unas condiciones que permitan la interacción entre dicho polipéptido y la 5-HT, y,
-
se detectan y/o aíslan las moléculas capaces de modular la actividad de la 5-HT sobre dicho polipéptido.
ES93913199T 1992-07-01 1993-06-29 Polipeptidos con actividad de receptor serotoninergico (5-ht5a), acidos nucleicos que codifican para estos polipeptidos y usos de los mismos. Expired - Lifetime ES2208641T3 (es)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU686580B2 (en) * 1992-11-03 1998-02-12 Lundbeck Research Usa, Inc. DNA encoding a human serotonin receptor (5-HT-4B) and uses thereof
US6300087B1 (en) 1992-11-03 2001-10-09 Synaptic Pharmaceutical Corporation DNA encoding a human serotonin receptor (5-HT4B) and uses thereof
US5968817A (en) * 1993-03-15 1999-10-19 The Scripps Research Institute DNA encoding serotonin receptors
DE19900673A1 (de) * 1999-01-11 2000-07-13 Basf Ag Verwendung von Bindungspartnern für 5-HT5-Rezeptoren zur Behandlung neurodegenerativer und neuropsychiatrischer Störungen
DE19900674A1 (de) * 1999-01-11 2000-07-13 Basf Ag Bindungspartner für 5-HT5-Rezeptoren zur Migränebehandlung
US20040101860A1 (en) * 2002-11-27 2004-05-27 Jones Alison M. Predicting animal performance
WO2005114206A2 (en) * 2004-05-13 2005-12-01 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with serotonin 5-ht5a receptor (5ht5a)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5155218A (en) * 1990-05-08 1992-10-13 Neurogenetic Corporation Dna encoding human 5-ht1d receptors
DE4041464A1 (de) * 1990-12-22 1992-06-25 Basf Ag 5-ht(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)-rezeptor
DE69233785D1 (de) * 1991-04-19 2010-07-08 Univ Washington diert

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