ES2281073T3 - Receptor opioide kappa humano, acidos nucleicos y usos. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A NUEVOS POLIPEPTIDOS QUE TIENEN UNA ACTIVIDAD DE RECEPTOR OPIOIDE KAPA HUMANO, PERMITIENDO EL MATERIAL GENETICO SU EXPRESION, EXPRESANDO CUALQUIER CELULA RECOMBINANTE ESTOS POLIPEPTIDOS, Y SU UTILIZACION.

Description

Receptor opioide kappa humano, ácidos nucleicos y usos.

La presente invención se refiere a polipéptidos novedosos y el material genético que permite su expresión. Más particularmente, se refiere a polipéptidos novedosos que tienen una actividad de receptor opioide kappa humano.

Los receptores opioides son receptores membranarios del sistema nervioso que median las propiedades analgésicas y psicotrópicas de los fármacos alcaloides del tipo morfínico (Brownstein, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol 90, 5391). Los estudios farmacológicos han demostrado la existencia de tres subtipos de receptores, denominados mu, delta y kappa, que se diferencian por su capacidad para unirse a los diferentes ligandos opioides (Goldstein et al, 1989, Mol. Pharmacol., vol 36, 265-272.) y por su distribución en el organismo (Mansour et al, 1987, J. Neurosci., vol 7, 2445). Recientemente, se han clonado tres receptores opioides en los roedores. El perfil farmacológico de estos tres receptores clonados expresados transitoriamente en células Cos indica que se trata de un receptor delta, un receptor mu y un receptor kappa. El análisis de sus estructuras primarias confirma que forman parte de la familia de los receptores acoplados a las proteínas G, que presentan una topología supuesta de siete dominios transmembrana (Bockaert, 1991, Curr. Op. Neurobiol., vol 1, 32).

La presente invención se refiere a la puesta en evidencia, el aislamiento y la caracterización molecular del receptor opioide kappa humano. Se refiere especialmente al aislamiento y secuenciación del gen que codifica para este receptor, en la construcción de cepas recombinantes que permiten la expresión de receptores funcionales, y en la puesta a punto de pruebas que permiten el aislamiento de principios activos sobre estos receptores y que presentan propiedades terapéuticas ventajosas. Las secuencias de ADN de la invención permiten igualmente la realización de sondas, que pueden detectar en muestras biológicas cualquier irregularidad en la expresión de un receptor opioide kappa (no expresión, mutación, polimorfismo, etc). Estas sondas pueden utilizarse igualmente para la clonación mediante hibridación de cualquier otro ADNc que codifica para un receptor opioide, a partir de tejidos de diversos orígenes y especialmente de origen humano.

Un primer objeto de la invención se refiere por tanto a una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido que tiene una actividad de receptor opioide kappa humano.

Más preferiblemente, la secuencia nucleotídica según la invención se selecciona de las secuencias que codifican para un polipéptido que tiene una actividad de receptor opioide kappa humano, comprendiendo dicho polipéptido

a. la secuencia peptídica SEQ ID nº 1, o

b. un derivado de la secuencia peptídica SEQ ID nº 1 obtenido mediante mutación, substitución, deleción, adición o modificación de un residuo.

Un modo de realización particular de la invención está representado por una secuencia nucleotídica que comprende la secuencia nucleotídica SEQ ID nº 1 o su cadena complementaria.

La invención se refiere igualmente a una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido que tiene una actividad de receptor opioide kappa humano caracterizada porque se selecciona de las secuencias derivadas de la SEQ ID nº 1 debido a la degeneración del código genético.

Las diferentes secuencias nucleotídicas de la invención pueden ser de origen artificial o no. Puede tratarse de secuencias genómicas, de ADNc, de ARN, de secuencias híbridas o de secuencias sintéticas o semisintéticas. Estas secuencias pueden obtenerse por ejemplo mediante cribado de bancos de ADN (banco de ADNc, banco de ADN genómico) por medio de sondas elaboradas basándose en la secuencia SEQ ID nº 1. Tales bancos pueden prepararse a partir de células de diferentes orígenes mediante técnicas clásicas de biología molecular conocidas por el experto en la técnica. Las secuencias nucleotídicas de la invención pueden prepararse igualmente mediante síntesis química, especialmente según el método de las fosforamiditas, o incluso mediante métodos mixtos que incluyen modificación química o enzimática de secuencias obtenidas mediante cribado de bancos.

Las secuencias nucleotídicas de la invención pueden utilizarse para la producción de los polipéptidos opioides kappa. El término polipéptido opioide kappa representa cualquier polipéptido que tenga una actividad de receptor opioide kappa, y cualquier fragmento o derivado de un polipéptido de este tipo. Para la producción de polipéptido opioide kappa, la parte que codifica para dicho polipéptido se coloca generalmente bajo el control de señales que permiten su expresión en un huésped celular. La elección de estas señales (promotores, terminadores, etc) puede variar en función del huésped celular utilizado. Con este fin, las secuencias nucleotídicas de la invención pueden formar parte de un vector, que puede tener replicación autónoma o integrativos. Más particularmente, pueden prepararse vectores de replicación autónoma utilizando secuencias de replicación autónoma en el huésped seleccionado. Tratándose de vectores integrativos, pueden prepararse por ejemplo utilizando secuencias homologas a ciertas regiones del genoma del huésped, que permiten, mediante recombinación homóloga, la integración del vector. Los huéspedes celulares utilizables para la producción de los polipéptidos opioides de la invención mediante vía recombinante son tanto huéspedes eucariotas como procariotas. Entre los huéspedes eucariotas que convienen, pueden citarse las células animales, las levaduras, o los champiñones. En particular, tratándose de levaduras, pueden citarse las levaduras del género
Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces, o Hansenula. Tratándose de células animales, pueden citarse las células COS, CHO, Cl27, NIH-3T3, etc. Entre los champiñones, pueden citarse más particularmente Aspergillus ssp. o Trichoderma ssp. Como huéspedes procariotas, prefiere utilizarse las bacterias siguientes E. coli, Bacillus, o Streptomyces.

Las secuencias nucleotídicas de la presente invención pueden utilizarse igualmente en el dominio farmacéutico, o bien para la realización de secuencias antisentido utilizables en el marco de una terapia génica, o bien incluso para la realización de sondas que permiten la detección, mediante experimentos de hibridación, de la expresión de receptores opioides en muestras biológicas y la puesta en evidencia de anomalías genéticas (polimorfismo, mutaciones) o de expresiones aberrantes.

La inhibición de la expresión de ciertos genes mediante secuencias antisentido resulta ser una estrategia prometedora en el control de la actividad de un gen. Las secuencias antisentido son secuencias cuyo producto de transcripción es complementario a la cadena codificante de un gen dado, y por ello puede hibridarse específicamente con el ARNm transcrito, inhibiendo su traducción en proteína (documento EP 140 308). La invención tiene por tanto como objeto las secuencias antisentido que pueden inhibir al menos parcialmente la producción de polipéptidos opioides kappa tal como se definieron anteriormente. Tales secuencias pueden estar constituidas por las secuencias nucleotídicas definidas anteriormente en el presente documento. Se trata generalmente de secuencias complementarias de secuencias que codifican para péptidos de la invención. Tales secuencias pueden obtenerse a partir de la secuencia SEQ ID nº 1, mediante fragmentación, etc, o mediante síntesis química.

Tal como se indicó anteriormente en el presente documento, la invención permite igualmente la realización de sondas nucleotídicas, sintéticas o no, que pueden hibridarse con las secuencias nucleotídicas definidas anteriormente en el presente documento que codifican para polipéptidos opioides de la invención, o con los ARNm correspondientes. Tales sondas pueden utilizarse in vitro como herramienta de diagnóstico, para la detección de la expresión de un receptor opioide kappa, o incluso para la puesta en evidencia de anomalías genéticas (corte y empalme erróneo, polimorfismo, mutaciones puntuales, etc). Teniendo en cuenta las actividades múltiples de los ligandos endógenos de los receptores opioides, las sondas de la invención pueden así permitir identificar afecciones neurológicas, cardiovasculares o psiquiátricas. Estas sondas pueden igualmente utilizarse para la puesta en evidencia y el aislamiento de secuencias de ácidos nucleicos homólogos que codifican para polipéptidos opioides tal como se definieron anteriormente, a partir de otras fuentes celulares y preferiblemente de células de origines humanos. Las sondas de la invención comprenden la totalidad de la secuencia SEQ ID nº 1 o de su cadena complementaria. Preferiblemente, estas sondas se marcan previamente a su utilización. Para ello, pueden emplearse diferentes técnicas conocidas por el experto en la técnica (marcaje radiactivo, enzimático, etc). Las condiciones de hibridación en las que pueden utilizarse esas sondas se indican en las técnicas generales de clonación a continuación en el presente documento así como en los ejemplos.

La invención tiene igualmente por objeto cualquier polipéptido resultante de la expresión de una secuencia nucleotídica tal como se definió anteriormente. Se trata de un polipéptido que comprende la secuencia peptídica SEQ ID nº 1 o de un derivado del mismo.

En el sentido de la presente invención, el término derivado designa cualquier molécula obtenida mediante una modificación de naturaleza genética y/o química de la secuencia peptídica SEQ ID nº 1 y que conserva una actividad de receptor opioide kappa, por modificación de naturaleza genética y/o química, puede entenderse cualquier mutación, substitución, deleción, adición o modificación de un residuo. Tales derivados pueden generarse con finalidades diferentes, tales como especialmente la de aumentar la afinidad del péptido por su(s) ligando(s), la de mejorar sus niveles de producción, la de aumentar su resistencia a proteasas, la de aumentar y/o de modificar su actividad, o la de conferir nuevas propiedades farmacocinéticas y/o biológicas.

Preferiblemente, los polipéptidos de la invención son polipéptidos que presentan la capacidad de unirse a la dinorfina y a los derivados del gen de la prodinorfina. Incluso más preferiblemente, presentan la capacidad de unirse a los agonistas de la dinorfina tales como U-50,488, etilcetociclasoncina y la bremozacina, y los antagonistas de la dinorfina tales como la norbinaltorfimina. Todavía según un modo preferido, los polipéptidos de la invención son susceptibles de reconocerse por anticuerpos que reconocen la secuencia peptídica SEQ ID nº 1 completa. Tales anticuerpos pueden generarse mediante cualquier técnica conocida por el experto en la técnica, utilizando como antígenos los polipéptidos descritos en la presente solicitud.

Tal como se indica en los ejemplos, estos polipéptidos pueden expresarse en diferentes tipos celulares para formar receptores opioides funcionales.

Los polipéptidos de la invención pueden obtenerse mediante expresión en un huésped celular de una secuencia nucleotídica tal como se describió anteriormente en el presente documento, mediante síntesis química, basándose en la secuencia SEQ ID nº 1 utilizando las técnicas conocidas por el experto en la técnica, o mediante combinación de estas técnicas.

Otro objeto de la invención se refiere a las células recombinadas que pueden expresar en su superficie un polipéptido que tiene una actividad de receptor opioide kappa humano. Estas células pueden obtenerse mediante introducción de una secuencia nucleotídica tal como se definió anteriormente en el presente documento, luego cultivo de dichas células en condiciones de expresión de dicha secuencia.

Las células recombinadas según la invención pueden ser tanto células eucariotas como procariotas. Entre las células eucariotas que convienen, pueden citarse las células animales, las levaduras, o los champiñones. En particular, tratándose de levaduras, pueden citarse las levaduras del género Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces, o Hansenula. Tratándose de células animales, pueden citarse las células COS, CHO, Cl27, NIH-3T3, etc. Entre los champiñones, pueden citarse más particularmente Aspergillus ssp. o Trichoderma ssp. Como células procariotas, prefiere utilizarse las siguientes E. coli, Bacillus, o Streptomyces. Las células así obtenidas pueden utilizarse para medir la capacidad de diferentes moléculas para comportarse como ligando o como modulador de la actividad de los receptores opioides. Más particularmente, pueden utilizarse así en un procedimiento de puesta en evidencia y de aislamiento de ligandos o de modulador de la actividad de los receptores opioides, y, más preferiblemente, de agonistas y de antagonistas.

Por tanto, otro objeto de la invención se refiere a un procedimiento de puesta en evidencia y/o de aislamiento de ligandos de los receptores opioides, según el cual se realizan las etapas siguientes:

- se pone en contacto una molécula o una mezcla que contiene diferentes moléculas, eventualmente no identificadas, con una célula recombinada tal como se describió anteriormente en el presente documento que expresa en su superficie un polipéptido que tiene una actividad de receptor opioide en condiciones que permiten la interacción entre dicho polipéptido y dicha molécula en el caso en el que ésta presente una afinidad por dicho polipéptido, y,

- se detectan y/o aíslan las moléculas unidas a dicho polipéptido.

En un modo particular, este procedimiento de la invención está adaptado para la puesta en evidencia y/o el aislamiento de agonistas y de antagonistas de la dinorfina u otros ligandos de los receptores kappa para los receptores opioides kappa.

Otro objeto de la invención se refiere a un procedimiento de puesta en evidencia y/o de aislamiento de moduladores de los receptores opioides, según el cual se realizan las etapas siguientes:

- se pone en contacto una molécula o una mezcla que contiene diferentes moléculas, eventualmente no identificadas, con una célula recombinada tal como se describió anteriormente en el presente documento que expresa en su superficie un polipéptido que tiene una actividad de receptor opioide, en presencia del ligando endógeno de dicho receptor, en condiciones que permiten la interacción entre dicho polipéptido y su ligando, y,

- se detectan y/o aíslan las moléculas que pueden modular la actividad del ligando sobre dicho polipéptido.

En un modo particular, este procedimiento de la invención está adaptado para la puesta en evidencia y/o el aislamiento de moduladores de la actividad de la dinorfina u otros ligandos de los receptores kappa sobre los receptores opioides kappa.

Otro objeto de la invención se refiere al uso de un ligando o de un modulador identificado y/u obtenido según el procedimiento descrito anteriormente en el presente documento como medicamento. Tales ligandos o moduladores pueden de hecho permitir tratar ciertas afecciones relacionadas con los receptores opioides. En particular, al ser los receptores opioides kappa los mediadores de un efecto analgésico, los agonistas de estos receptores pueden utilizarse para disminuir las sensaciones de dolor.

La invención se refiere igualmente a cualquier medicamento que comprende como principio activo al menos una molécula que actúa sobre un receptor de la invención. Preferiblemente la molécula es un ligando o un modulador identificado y/o aislado según el procedimiento descrito anteriormente.

Otras ventajas de la presente invención aparecerán tras la lectura de los ejemplos que siguen, que deben considerarse como ilustrativos y no limitativos.

Leyenda de las figuras

Figura 1: Organización parcial del gen del receptor opioide kappa humano (KORh). Los exones se indican mediante cajas y los intrones mediante líneas. La posición de los dominios transmembrana supuesta del receptor kappa se indican mediante números romanos. Los extremos conocidos de los exones están numerados con números árabes, con respecto a su posición en el ADNc (figura 2). El exón en 3' se ha secuenciado hasta el codón terminador TGA.

Figura 2: Estrategia de clonación del ADNc que codifica para el receptor opioide kappa humano.

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Técnicas generales de clonación

Los métodos clásicamente utilizados en biología molecular tales como las extracciones preparativas de ADN de plásmido, la centrifugación de ADN de plásmido en gradiente de cloruro de cesio, la electroforesis sobre geles de agarosa o de acrilamida, la purificación de fragmentos de ADN mediante electroelución, las extracciones de proteínas con fenol o con fenol-cloroformo, la precipitación de ADN en medio salino mediante etanol o isopropanol, la transformación en Escherichia coli, etc, se conocen bien por el experto en la técnica y se describen abundantemente en la bibliografía [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1982; Ausubel F. M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, Nueva York, 1987].

Para los ligamientos, se separan los fragmentos de ADN según su tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa o de acrilamida, se extraen con fenol o mediante una mezcla fenol/cloroformo, se precipitan con etanol y después se incuban en presencia de la ADN ligasa del fago T4 según las recomendaciones del proveedor.

El llenado de los extremos 5' prominentes se realiza mediante el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli según las especificaciones del proveedor. La destrucción de los extremos 3' prominentes se realiza en presencia de la ADN polimerasa del fago T4 utilizada según las recomendaciones del fabricante. La destrucción de los extremos 5' prominentes se realiza mediante un tratamiento realizado mediante la nucleasa S1.

La mutagénesis dirigida in vitro mediante oligodesoxinucleótidos sintéticos se realiza según el método desarrollado por Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764].

La amplificación enzimática de fragmentos de ADN mediante la técnica denominada de PCR [reacción en cadena catalizada por la polimerasa, Saiki R. K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K. B. y Faloona F. A., Meth. Enzym. 155 (1987)335-350].

La verificación de las secuencias nucleotídicas se realiza mediante el método desarrollado por Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467].

Para los experimentos de hibridación, las condiciones de rigurosidad se basan en Maniatis T. et al., mencionado anteriormente.

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1. Clonación genómica y organización parcial del gen

Se cribó un banco genómico humano con ayuda de una sonda procedente de un ADNc que codifica para un receptor delta de ratón (Kieffer et al., PNAS 1992, vol 89, 12048). La sonda es un fragmento Pst I-Not I (976 pb) del ADNc que corresponde a la mayoría de la parte codificante del ADNc. Se extendió el banco y se transfirió sobre filtros de nitrocelulosa. Estos se hibridaron con la sonda marcada con ^{32}P, en condiciones relativamente rigurosas (5 X SSC, 5 X disolución de Denhardt, SDS al 0,1%, formamida al 40%, NaPPi al 0,05% y ADN de esperma de salmón 100 \mug/ml). Se realizaron los lavados en SSC al 0,1% hasta 50ºC y se expusieron los filtros a una película de rayos X durante la noche.

Se aislaron dos clones genómicos que se hibridaban débilmente con la sonda. El análisis de los insertos mediante secuenciación parcial indica que contienen regiones muy homólogas al receptor kappa de ratón. Se identificó un exón en cada uno de los clones: uno codifica para una región correspondiente topológicamente al inicio del primer bucle intracelular hasta el fin del cuarto dominio transmembrana y el otro codifica para el resto del extremo C-terminal del receptor. La topología de esta parte del gen está representada en la figura 1 y en ella se indica la posición exacta de las uniones intrón-exón.

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2. Clonación de un ADNc completo que codifica para el receptor kappa humano

La mayoría de los métodos utilizados ("habituales"), salvo los precisados en el texto, derivan de Sambrook, J. et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY), 2ª Ed.

La placenta humana expresa el receptor kappa (Meunier et al., 1988 Life Sci., vol 43, 559). Se ha preparado ARN total de placenta humana (Chomczynski, P. et al., 1987, Anal. Biochem., vol 162, 156) y se ha sintetizado ADNc a partir de este ARN, con ayuda de un cebador nucleotídico al azar ("hexámero al azar", Pharmacia) y de la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (BRL), en condiciones habituales.

A continuación, se amplificó el ADNc que codifica para el receptor kappa humano mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa) utilizando partes de la secuencia humana obtenida a partir del análisis de los clones genómicos para la concepción de cebadores específicos. Ya que carecíamos del extremo en 5' de la parte codificante del gen, se ha utilizado un oligonucleótido derivado a partir de una secuencia kappa de ratón para la amplificación a partir del extremo 5'.

Ya que el uso de dos cebadores situados en los extremos 5' (ratón) y 3' (humano) de la región codificante demostró ser poco eficaz para la producción de un ADNc completo, trabajamos en tres etapas y la estrategia utilizada se presenta en la figura 2 (las cifras indican la posición precisa de los nucleótidos en la secuencia completa del ADNc representado en la secuencia SEQ ID nº 1).

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La secuencia de los oligonucleótidos utilizados es la siguiente:

RP69: 5' GAGAGCTCGCGGCCGCGAGCTGCAGCGCTCACCATG

(SEQ ID nº 2)

RH84: 5' CACGGGGTGGCACACGGCAA

(SEQ ID nº 3)

RN6: 5' GTCTACTTGATGAATTCCTGG

(SEQ ID nº 4)

RP70: 5' AGACCCAAGCTTGCCCGGGTCCACGACTAGTCATACTGG

(SEQ ID nº 5)

Las secuencias que se hibridan con el ADNc se indican en negrita, estando presentes los otros nucleótidos para facilitar la etapa posterior de clonación de los fragmentos producidos mediante la reacción de PCR. Los oligonucleótidos RP70, RH84 y RN6 son derivados de la secuencia kappa humana. El oligonucleótido RP69 corresponde a una secuencia en 5' no codificante de ratón (incluyendo el ATG iniciador en el extremo 3') con el fin de no introducir secuencia murina en el ADNc humano. La posición precisa de las regiones del ADNc que se hibridan con los 4 cebadores está indicada en la figura 2.

Las diferentes reacciones de amplificación se realizaron en las condiciones siguientes:

Reacción 1: cebadores RN6 y RP70. La reacción se realiza en presencia de polimerasa Taq (Cetus) en condiciones de PCR habituales, excepto por la adición de DMSO al 5% en el medio de incubación. La amplificación se realiza durante 40 ciclos (1 min a 94ºC, 1 min a 55ºC, 1 min a 72ºC). La última etapa de alargamiento se realiza durante 10 min a 72ºC. Se obtiene un fragmento de ADN del tamaño esperado (760 pb) = fragmento 1.

Reacción 2: las condiciones de amplificación son las mismas que para la reacción 1. Dos amplificaciones sucesivas fueron necesarias: la primera utiliza los cebadores RP69 y RP70 y da lugar a la obtención de una mezcla de fragmentos de ADN de tamaño comprendido entre 1 y 1,3 kb, que contienen el ADNc completo. Esta mezcla se purifica tras la electroforesis a partir de un gel de agarosa al 1% mediante el procedimiento GeneClean y vuelve a amplificarse con ayuda de los oligonucleótidos RP69 y RH84. Se obtiene entonces un fragmento de ADN del tamaño esperado (508 pb) = fragmento 2.

Clonación del ADNc completo

Los fragmentos de PCR se reparan y clonan en los extremos libres del vector pBluescript (Stratagene) linealizado mediante EcoR V. Se secuencian los insertos en los dos sentidos sobre un secuenciador de ADN automático (ADN 373A, Applied Bioystems Inc.). A continuación, se escinden los dos insertos del plásmido en presencia de EcoR I (corte del lado 3' del fragmento 2 y del lado 5' del fragmento 1) y de una enzima de restricción del poliligador. Se purifican los fragmentos a partir de un gel de agarosa al 1% mediante el procedimiento GeneClean y se ligan conjuntamente en el vector pcDNA/Amp (Invitrogen) para la expresión transitoria del receptor en células Cos.

Las dos reacciones de amplificación produjeron los fragmentos 1 y 2 esperados. En el caso del fragmento 2, el uso de un oligonucleótido derivado de una secuencia de ratón en el extremo 5' permitió la amplificación del ADNc humano.

Se recubren los dos fragmentos sobre 140 pb. La secuencia de recubrimiento es idéntica en los dos fragmentos. Se comparan las secuencias de los dos fragmentos con la secuencia determinada a partir del ADN genómico (de la posición 257 a la posición 1143) y se encuentra que son perfectamente idénticas. Con respecto a la parte de secuencia 1 a 256, cuya secuencia genómica se desconoce, se verificó que la amplificación mediante PCR no introdujo errores: se comparó la secuencia del fragmento 2 obtenido a partir de tres reacciones de amplificación diferentes y se encontró idéntica en los 3 casos.

Se presenta la secuencia del ADNc que codifica para el receptor kappa humano según la invención, así como la secuencia proteica deducida, sobre la secuencia SEQ ID nº 1.

3. Conclusión: estructura primaria del receptor kappa humano

Se utilizó una sonda que codifica para un receptor opioide delta de ratón con el fin de cribar un banco genómico humano con rigurosidad media y de aislar fragmentos de ADN genómico homólogos.

Se identificaron dos exones, que según una comparación de secuencia, codifican aparentemente para el receptor opioide kappa humano. Se aisló un ADNc derivado de este gen (parte codificante) a partir de un tejido humano (placenta) y se analizó la estructura primaria (SEQ ID nº 1).

El ADNc tiene un tamaño de 1101 pares de bases y codifica para una proteína de 380 ácidos aminados. La secuencia nucleotídica es homóloga en un 86,7% al ADNc de ratón que codifica para un receptor opioide kappa. Las zonas de divergencia más importantes se sitúan en las regiones N- y C-terminales. Estas mismas zonas son igualmente las regiones menos conservadas entre los tres subtipos mu, delta y kappa.

4. Estudio farmacológico del receptor K56

Se utiliza el vector pcDNA/Amp que contiene el ADNc que codifica para el receptor opioide según la invención aislado en el ejemplo 2 para transfectar células Cos-1. A continuación se prepararon las membranas de las células transfectadas obtenidas y se sometieron a prueba para determinar su capacidad para unirse a ciertos ligandos opioides marcados.

Se utiliza el plásmido de vector pcDNA/Amp purificado sobre cloruro de cesio para transfectar las células Cos-1 utilizando la técnica con DEAE-dextrano.

72 horas tras la transfección, se recogen las células recombinantes y se preparan las membranas de la manera siguiente: vuelven a tomarse los sedimentos celulares, a 4ºC, en 60 ml de tampón Tris-HCl 50 mM pH 7,4; EDTA 10 mM, se homogeneizan y se centrifugan a 1.100 g durante 10 minutos. A continuación vuelve a tomarse el sedimento una segunda vez en 30 ml del mismo tampón, se homogeneiza y se centrifuga. Se combinan los 2 sobrenadantes y se centrifugan a 110.000 g durante 15 minutos. Entonces vuelve a tomarse el sedimento de membrana en 5 ml del mismo tampón, se preparan alícuotas y se conserva a -80ºC. A continuación se realizan experimentos de unión en saturación y de competición sobre estas membranas en presencia de diferentes ligandos. Para ello, se incuban las muestras de membrana (15-30 mg de proteínas) durante 2 horas a 25ºC en presencia de ^{3}H-diprenorfina o ^{3}H-U-69,593, con o sin competidor, en un volumen final de 1 ml de tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,4); EDTA 10 mM. A continuación se detiene la reacción mediante filtración a vacío sobre filtros Whatman GF/B, y se aclara 3 veces con 3 ml del tampón frío. Se obtienen los valores de Ki siguiendo la ecuación de Cheng y Prussof: Ki = CI50/ (1 + L/Kd). Se midió la radiactividad con un contador \beta.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE:

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(A)

NOMBRE: Universidad Louis Pasteur

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(B)

CALLE: 11 rue Humann

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(C)

CIUDAD: ESTRASBURGO

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(E)

PAÍS: FRANCIA

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 67085

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: RECEPTOR OPIOIDE KAPPA HUMANO, ÁCIDOS NUCLEICOS Y USOS

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 5

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(iv)

FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: Cinta

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(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C)

SISTEMA DE EXPLOTACIÓN: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.25 (OEB)

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 1143 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

NÚMERO DE CADENAS: doble

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(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(iii)

HIPOTÉTICA: NO

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(iii)

ANTISENTIDO: NO

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(ix)

CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B)

UBICACIÓN: 1..1143

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

\newpage

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 36 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

NÚMERO DE CADENAS: simple

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(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(iii)

HIPOTÉTICA: NO

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(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGAGCTCGC GGCCGCGAGC TGCAGCGCTC ACCATG

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACGGGGTGG CACACGGCAA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCTACTTGA TGAATTCCTG G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGACCCAAGC TTGCCCGGGT CCACGACTAG TCATACTGG

\hfill

39

Claims (12)

1. Secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido que tiene una actividad de receptor opioide kappa humano, comprendiendo dicho polipéptido

a.

la secuencia peptídica SEQ ID nº 1, o

b.

un derivado de la secuencia peptídica SEQ ID nº 1 obtenido mediante mutación, substitución, deleción, adición o modificación de un residuo.

2. Secuencia nucleotídica que comprende

a.

la secuencia SEQ ID nº 1, o

b.

la secuencia complementaria de la secuencia (a).

3. Secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido que tiene una actividad de receptor opioide kappa humano caracterizada porque se selecciona de las secuencias derivadas de la SEQ ID nº 1 debido a la degeneración del código genético.

4. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 1, 2 ó 3 caracterizada porque se selecciona de las secuencias de ADN genómico, de ADNc, de ARN, las secuencias híbridas o las secuencias sintéticas o semisintéticas.

5. Secuencia según una de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizada porque la parte que codifica para dicho polipéptido se coloca bajo el control de señales que permiten su expresión en un huésped celular.

6. Polipéptido que comprende la secuencia peptídica SEQ ID nº 1 o un derivado de esta secuencia obtenido mediante mutación, substitución, deleción, adición o modificación de un residuo, teniendo dicho polipéptido una actividad de receptor opioide kappa.

7. Secuencia antisentido que puede inhibir al menos parcialmente la producción de un polipéptido según la reivindicación 6.

8. Uso de una sonda que tiene una secuencia según la reivindicación 1, 2 ó 3 para la detección de la expresión de un receptor opioide; o para la puesta en evidencia de anomalías genéticas (corte y empalme erróneo, polimorfismo, mutaciones puntuales, etc); o para identificar afecciones neurológicas, cardiovasculares o psiquiátricas como relacionadas a los receptores opioides; o incluso para la puesta en evidencia y el aislamiento de secuencias de ácidos nucleicos homólogas que codifican para polipéptidos opioides.

9. Célula recombinada que puede expresar en su superficie un polipéptido según la reivindicación 6, seleccionándose dicha célula entre las células procariotas, las levaduras, los champiñones y las células COS, CHO, Cl27 y NIH-3T3.

10. Procedimiento de puesta en evidencia y/o de aislamiento de ligandos des receptores opioides, caracterizado porque se realizan las etapas siguientes:

-

se pone en contacto una molécula o un mezcla que contiene diferentes moléculas, eventualmente no identificadas, con una célula recombinada según la reivindicación 9, que expresa en su superficie un polipéptido opioide, en condiciones que permiten la interacción entre dicho polipéptido y dicha molécula en el caso en el que ésta presente una afinidad por dicho polipéptido, y,

-

se detectan y/o aíslan las moléculas unidas a dicho polipéptido.

11. Procedimiento según la reivindicación 10 para la puesta en evidencia y/o el aislamiento de ligandos de los receptores opioides kappa.

12. Procedimiento de puesta en evidencia y/o de aislamiento de moduladores de los receptores opioides, caracterizado porque se realizan las etapas siguientes:

-

se pone en contacto una molécula o un mezcla que contiene diferentes moléculas, eventualmente no identificadas, con una célula recombinada según la reivindicación 9 que expresa en su superficie un polipéptido que tiene una actividad de receptor opioide, en presencia de un ligando de dicho receptor, en condiciones que permiten la interacción entre dicho polipéptido y el ligando, y,

-

se detectan y/o aíslan las moléculas que pueden modular la actividad del ligando sobre dicho polipéptido.