JPH10507904A

JPH10507904A - ヒトのカッパオピオイド受容体、核酸と使用

Info

Publication number: JPH10507904A
Application number: JP8504160A
Authority: JP
Inventors: キーファー，ブリジット; シモナン，フレデリック
Original assignee: ユニヴェルシテルイパスツール
Priority date: 1994-07-11
Filing date: 1995-07-07
Publication date: 1998-08-04
Anticipated expiration: 2015-07-07
Also published as: WO1996001898A1; DE69535380T2; US6146835A; FR2722209A1; EP0804574B1; CA2194768A1; JP3643598B2; FR2722209B1; EP0804574A1; DE69535380D1; ES2281073T3; ATE353103T1

Abstract

(57)【要約】本発明はヒトのカッパオピオイド受容体の活性を有する新規なポリペプチド、その発現を可能にする遺伝子物質、これらのポリペプチドを発現するすべての組換え細胞、およびその使用に関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトのカッパオピオイド受容体、核酸と使用本発明は新規なポリペプチドとその発現を可能にする遺伝子物質に関するものである。もっと具体的には、ヒトのカッパオピオイド受容体の活性を有する新規なポリペプチドに関するものである。オピオイド受容体はモルヒネ型のアルカロイド薬剤の鎮痛剤および向精神剤の特性を媒介する神経系の膜受容体である（Brownstein，1993，Proc．Natl．Acad ．Sci．USA，vol 90，5391）。薬理学研究によって受容体の３つの亜種の存在が実証され、ミュー(μ)、デルタ(δ)、カッパ(κ)と命名された、これらは異なるオピオイドリガンドとの結合能力（Goldstein et al.，1989，Mol．Pharmacol. ，vol 36，265-272）と生体内の分布（Mansour et al.，1987，J．Neurosci.，v ol 7，2445）によって区別される。最近、３種のオピオイド受容体がネズミにおいてクローン化された。Ｃｏｓ細胞内に一時的に発現したクローン化したこれら３つの受容体の薬理学的プロフィールはそれがδ受容体、μ受容体とκ受容体であることを示している。それらの１次的構造を分析して、それらが７つの膜貫通領域に想定されたトポロジーを有する、Ｇタンパクに結合された受容体の群に属することが確認された（Bockaert，1991，Curr．Op．Neurobiol.，vol 1．32）。本発明はヒトのカッパオピオイド受容体の実証、単離と分子特性化に関するものである。それはとくに、官能受容体の発現を可能にする組換え株の構築における、またこれらの受容体に作用する化合物の単離を可能にし、有利な治療上の特性を有する試験の開発において、この受容体のための暗号化遺伝子の単離と配列決定に関するものである。本発明のＤＮＡ配列はさらに、生物標本内で、カッパオピオイド受容体の発現のいっさいの異常（非発現、突然変異、多形現象、など）を検出することのできるプローブの実現も可能にする。これらのプローブは各種の起源の、とくにヒト起源の組織から、オピオイド受容体のための他のいっさいの暗号化ｃＤＮＡのハイブリッド形成によるクローン化にも使用できる。したがって、本発明の第１の目的はヒトのカッパオピオイド受容体の活性を有するポリペプチドのための暗号化ヌクレオチド配列にある。好適には、本発明によるヌクレオチド配列は、（ａ）ヌクレオチド配列ＳＥＱＩＤＮｏ．１またはその相補的鎖の全体または一部；（ｂ）配列（ａ）とハイブリッド形成し、ヒトのカッパオピオイド受容体の活性を有するポリペプチドについて暗号化するいっさいの配列；および（ｃ）遺伝子コードの退化のために配列（ａ）と（ｂ）から派生した配列：の中から選択される。本発明の代表的な実施態様はヌクレオチド配列ＳＥＱＩＤＮｏ．１またはその相補的鎖の全体または一部によって表される。本発明の様々なヌクレオチド配列は人工的起源のものであるか否かを問わない。それはゲノム配列でも、ｃＤＮＡでも、ＲＮＡでも、ハイブリッド配列でも、合成または半合成配列でもよい。これらの配列は例えば、配列ＳＥＱＩＤＮｏ．１を元に作製したプローブを用いてＤＮＡバンク（ｃＤＮＡバンク、ゲノムＤＮＡバンク）のスクリーニングによって得ることができる。このようなバンクは当業者には周知の分子生物学の古典的技術によって様々な起源の細胞から調製することができる。本発明のヌクレオチド配列はリン酸アミド法（phosphoramidit es）をはじめとする化学的合成によって、あるいはまたバンクのスクリーニングで得られた配列の化学的または酵素による修飾を含む混合法によって調製できる。本発明によるヌクレオチド配列はカッパオピオイドポリペプチドの産生に使用できる。カッパオピオイドポリペプチドという用語はカッパオピオイド受容体の活性を有するいっさいのポリペプチド、ならびにかかるポリペプチドのいっさいの断片または誘導体を意味するものとする。カッパオピオイドポリペプチドの産生のために、前記ポリペプチドのための暗号化部分も一般的に、宿主細胞内にその発現を可能にする信号制御の下に置かれる。これらの信号（プロモーター、ターミネーター、など）の選択は使用する宿主細胞に応じて変化することがある。このため、本発明のヌクレオチド配列は自己複製型または組込型とするこのできるベクターの一部とすることができる。もっと具体的には、自己複製型のベクターは選択した宿主の自己複製配列を使用して調製することができる。組込型ベクターについては、例えば、相同組換えによってベクターの組込を可能にする、宿主のゲノムの特定の領域に相同の配列の使用によって調製できる。組換え法による本発明のオピオイドポリペプチドの産生に使用可能な宿主細胞は真核細胞でも原核細胞でもよい。適合する真核細胞の宿主としては、動物の細胞、酵母、または菌類が挙げられる。とくに、酵母に関しては、サッカロミケス、クルイベロミケス、ピシア、シュバンイオミケス、またはハンセヌラ種などが挙げられる。動物細胞としては、ＣＯＳ、ＣＨＯ、Ｃ１２７、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞などが挙げられる。菌類としては、とくにアスペルギルスｓｓｐ．またはトリコデルマｓｓｐ．を挙げることができる。原核細胞宿主としては、下記のバクテリアの使用が好適である、大腸菌、バシルス、ストレプトミケス。本発明のヌクレオチド配列は医薬品分野でも、遺伝子治療の枠内で使用可能なアンチセンス配列の実現や、ハイブリッド形成実験によって、生物標本内のオピオイド受容体の発現の検出や遺伝子異常（多形現象、突然変異）または変型発現の実証を可能にするプローブの実現に使用することもできる。アンチセンス配列による一部の遺伝子の発現阻害は遺伝子活性制御に有望な戦略であることがわかった。アンチセンス配列は転写産生物が所与の遺伝子の暗号化断片の補体であり、そのために、タンパク質への翻訳を阻害して（ＥＰ１４０３０８、転写ｍＲＮＡととくにハイブリッド形成が可能な配列である。したがって、本発明は先に定義したカッパオピオイドポリペプチドの産生を少なくとも部分的に阻害することのできるアンチセンス配列も対象とする。かかる配列は先に定義したヌクレオチド配列の全体または一部を使用して構成てきる。これは一般的に本発明のペプチドのための暗号化配列の相補的配列、または配列の断片である。かかる配列は断片化などによって、または化学的合成によって配列ＳＥＱＩＤＮｏ．１から得ることができる。先に述べたごとく、本発明は本発明のオピオイドポリペプチドのために暗号化する先に定義したヌクレオチド配列と、または対応するｍＲＮＡとハイブリッド形成できる、合成であるか否かをとわず、ヌクレオチドプローブの実現も可能にする。かかるプローブは、カッパオピオイド受容体の発現検出のために、あるいは遺伝子異常（撚継ぎ不良、多形現象、一時的突然変異、など）の検出のために診断の道具として試験管内で使用することができる。オピオイド受容体に内在するリガンドの多数の活性を考慮して、本発明のプローブはこのようにして神経学的、心臓血管系または精神医学的疾患を識別することを可能にする。このプローブは、他の細胞源から、好適にはヒト起源の細胞から、先に定義したようなオピオイドポリペプチドについてコード化する相同核酸の配列を明らかにし、単離するのにも使用することができる。本発明のプローブは一般的に少なくとも１０の基から成り、最大限配列ＳＥＱＩＤＮｏ．１全体、またはその相補的鎖を含むことができる。好適には、これらのプローブは、その使用に先立って標識を付けられる。このために当業者には周知の各種の技術を用いることができる（放射線、酵素、などのマーキング）。これらのプローブが使用できるハイブリッド形成条件は後述のクローン化の一般的技術、ならびに実施例において示されている。本発明はさらに、先に定義したヌクレオチド配列の発現から生じるいっさいのポリペプチドも対象とする。好適には、ペプチド配列ＳＥＱＩＤＮｏ．１またはその誘導体の全体または一部を含むポリペプチドである。本発明において、誘導体という用語はペプチド配列ＳＥＱＩＤＮｏ．１の遺伝子的および／または化学的性質の修飾によって得られ、カッパオピオイド受容体の活性を保存しているいっさいの分子を意味するものとする。遺伝子的および／または化学的性質の修飾とは、１つまたは複数個の残基のいっさいの突然変異、置換、欠損、付加および／または修飾を意味するものとする。かかる誘導体は、特に、そのリガンドに対するペプチドの親和性を増加させる、産生レベルを向上させる、プロテアーゼに対する耐性の向上、その活性の増加および／または修飾、あるいは新規な薬反応学的および／または生物学的特性を付与するなどの多種多様な目的のために発生させることができる。付加から生じる誘導体としては、先端に結合した追加の異質部分を有するキメラポリペプチドなどが挙げられる。好適には、本発明のポリペプチドはダイノルフィンとプロダイノルフィンの遺伝子の誘導体を結合する能力を有するポリペプチドである。さらに好適には、Ｕ −５０，４８８、エチルセトシクラソンシンまたはブレモザシンなどのダイノルフィンの作用剤とノルビナルトルフィミンなどのダイノルフィンの拮抗剤を結合する能力を有する。やはり推奨実施態様において、本発明のポリペプチドは完全なペプチド配列ＳＥＱＩＤＮｏ．１を認識する抗体によっても認識される。かかる抗体は、本出願に記載のポリペプチドを抗原に用いる、当業者には周知のいっさいの技術によって発生させることができる。実施例に示したごとく、これらのポリペプチドは官能オピオイド受容体を形成するために各種の細胞内に発現することができる。本発明のポリペプチドは当業者には周知の技術を、あるいはこれらの技術の組み合わせを使用して配列ＳＥＱＩＤＮｏ．１を元にして、化学的合成によって、上述のようなヌクレオチド配列の宿主細胞内の発現によって得ることができる。本発明のもう１つの目的はヒトのカッパオピオイド受容体の活性を有するポリペプチドをその表面に発現することのできる組換え細胞に関するものである。これらの細胞は先に定義したヌクレオチド配列を導入し、ついで前記細胞を前記配列の発現条件で培養して得ることができる。本発明による組換え細胞は真核細胞でも原核細胞でもよい。適合する真核細胞としては動物の細胞、酵母、または菌類が挙げられる。とくに酵母については、サッカロミケス、クルイベロミケス、ピシア、シュバンイオミケス、またはハンセヌラ種などが挙げられる。動物細胞としては、ＣＯＳ、ＣＨＯ、Ｃ１２７、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞などが挙げられる。菌類としては、とくにアスペルギルスｓｓｐ．またはトリコデルマｓｓｐ．を挙げることができる。原核細胞としては、下記のバクテリアの使用が好適である、大腸菌、バシルス、ストレプトミケス。このようにして得られた細胞は、リガンドとして、またはオピオイド受容体の活性モジュレーターとしてふるまう各種の分子の能力の測定に用いることができる。とくに、このようにして、リガンドまたはオピオイド受容体の活性モジュレーター、および、より好適には作用剤および拮抗剤の識別と単離法に使用できる。本発明の別の目的は、オピオイド受容体のリガンドの識別および／または単離法に関するものであって、この方法によれば下記の過程が実施される：・分子がポリペプチドとの親和性を有する場合にポリペプチドと分子の間の相互作用を可能にする条件で、１つの分子と、あるいは、場合によっては識別されていない、各種の分子の混合物と、オピオイド受容体の活性を有するポリペプチドをその表面に発現する上述の組換え細胞を接触させる過程と：・前記ポリペプチドに結合した分子を検出および／または単離する過程。特定の実施態様において、本発明のこの方法はカッパオピオイド受容体についてカッパ受容体のダイノルフィンまたはその他のリガンドの作用剤および拮抗剤の検出および／または単離に適合される。本発明の別の目的は、オピオイド受容体のモジュレーターの識別および／または単離法に関するものであって、この方法によれば下記の過程が実施される：・ポリペプチドとそのリガンドの間の相互作用を可能にする条件で、前記受容体に内在するリガンドの存在の下に、１つの分子と、あるいは、場合によっては識別されていない、各種の分子の混合物と、オピオイド受容体の活性を有するポリペプチドをその表面に発現する上述の組換え細胞を接触させる過程と：・前記ポリペプチド上のリガンドの活性を修飾することのできる分子を検出および／または単離する過程。特定の実施態様において、本発明のこの方法はカッパオピオイド受容体に対するカッパ受容体のダイノルフィンまたはその他のリガンドの活性のモジュレーターの検出および／または単離に適合される。本発明のもう１つの目的は上述の方法によって識別および／または得られたリガンドまたはモジュレーターの医薬品としての使用に関するものである。かかるリガンドまたはモジュレーターは実際にオピオイド受容体に結びつけられるいくつかの疾患の治療を可能にする。とくにカッパオピオイド受容体は鎮痛効果を媒介するので、これらの受容体の作用剤は疼痛の緩和に使用できる。本発明はさらに、本発明の受容体に作用する少なくとも１つの分子を作用成分として含むすべての医薬品にも関するものである。好適には、この分子は上述の方法によって識別および／または単離されたリガンドまたはモジュレーターである。本発明の他の利点は、非制限的な例として挙げられる、下記の実施例を読むことによって明らかになるだろう。図面の説明図１：ヒトのカッパオピオイド受容体（ｈＫＯＲ）遺伝子の部分的組織。エクソンは箱で、イントロンは線で示した。カッパ受容体の想定膜貫通領域の部分はローマ数字で表した。エクソンの既知の末端は、ｃＤＮＡ内のそれらの位置（図２）に対して、算用数字で番号を付けた。３’のエクソンはＴＧＡ末端コドンまで配列を決定した。図２：ヒトのカッパオピオイド受容体について暗号化するｃＤＮＡのクローン化戦略クローン化の一般的技術分子生物学に使用される古典的方法、例えば、プラズマＤＮＡの調製用抽出、塩化セシウムの勾配プラズマＤＮＡ遠心分離、アガロースまたはアクリルアミドのゲル上の電気泳動、電気溶出によるＤＮＡ断片の精製、フェノールまたはフェノールクロロフォルムによるタンパク質の抽出、エタノールまたはイソプロパノールによる塩水内のＤＮＡ沈降、大腸菌内の形質転換、などは当業者には周知であり、文献にも多数記載されている［Maniatis T．et al.，"Molecular Cloning ，a Laboratory Manual"，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbo r，N.Y.，1982; Ausubel F.M．et al．(eds)，"Current Protocols in Molecula r Biology"，John Wiley & Sons，New York，1987］。結紮（リガンド）に関しては、ＤＮＡの断片はアガロースまたはアクリルアミドのゲル内の電気泳動によってサイズ別に分離され、フェノールまたはフェノール／クロロフォルム混合物によって抽出され、エタノールで沈降させてから、供給者の勧めに従ってＴ４ファージのリガーゼＤＮＡの存在の下に保温した。突出した５’末端の充填は供給者の仕様に従って大腸菌のＩポリメラーゼＤＮＡの Klenow 断片によって実施した。突出した３’末端の破壊は製造者の勧めによって使用されたＴ４ファージのポリメラーゼＤＮＡの存在の下に実施した。突出した５’末端の破壊はＳ１ヌクレアーゼによって手配された処置によって実施した。合成オリゴデオキシヌクレオチドによって試験管内に誘導した突然変異誘発は Taylor et al.が開発した方法によって実施した［Nucleic Acids Res．13（198 5）8749-8764］。ＤＮＡ断片の酵素的増幅は、ＰＣＲ技術によって実施した［Polymerase-catal yzed Chain Reaction，Saiki R.K．et al.，Science 230（1985）1350-1354; Mu llis K.B．et Faloona F.A.，Meth．Enzym．155（1987）335-350］。ヌクレオチド配列の確認は Sanger et al.が開発した方法で実施した［Proc． Natl．Acad．Sci．USA，74（1977）5463-5467］。ハイブリッド形成実験について、緊縮条件は先に述べた Maniatis T．et al. に準拠した。１．ゲノムクローン化と遺伝子の部分的組織ヒトゲノムバンクのスクリーニングにはマウスのデルタ受容体について暗号化するｃＤＮＡに由来するプローブを用いた（Kieffer et al.，PNAS 1992，vol 8 9，12048）。プローブはｃＤＮＡの暗号化部分の大半に対応するｃＤＮＡのＰｓｔＩ−ＮｏｔＩ（９７６ｂｐ）の断片である。バンクは並べて、ニトロセルローズのフィルタに移した。フィルタは比較的緊縮性の条件で（５ＸＳＳＣ、５ＸＤenhardt's，ＳＤＳ０．１％、ホルムアミド４０％、ＮａＰＰｉ０．０５％と鮭の精子のＤＮＡ１００μｇ／ｍｌ）、³²Ｐでマーキングしたプローブにハイブリッド形成した。洗浄は０．１％ＳＳＣで５０℃まで実施し、フィルタは一晩Ｘ線フィルムに露出した。プローブと弱くハイブリッド形成する２つのゲノムクローンが単離された。部分配列決定によるインサートの分析によって、マウスのカッパ受容体にきわめて相同の領域が含まれていることがわかった。クローンのそれぞれに１つのエクソンが識別された：１つはトポロジー的に細胞間の第１のループから第４の膜貫通領域の終わりまでに対応する領域のコードであり、もう１つは受容体のＣ−末端の端の残りについてのコードである。遺伝子のこの部分のトポロジーは図１に示した、イントロン−エクソン結合の正確な位置はそこに示されている。２．ヒトのカッパ受容体について暗号化する完全なｃＤＮＡのクーロン化特記事項なき限り使用した方法の大半（「標準」）は Sambrook，J．et al.， 1989 Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Lab.，Col d Spring Harbor，NY)，2nd Ed.によるものである。ヒトの胎盤はカッパ受容体を発現する（Meunier et al.，1988 Life Sci.，vo l 43，559）。出願人は人の胎盤から完全なＲＮＡを調製し（Chomczynski，P.et al.，1987，Anal．Biochem.，vol 162，156）、ランダムヌクレオチドプライマー（"random hexamer”Pharmacia）とトランスクリプターゼ逆モロネー・マウス・白血病ウィルス（ＢＲＬ）を用いて、標準条件で、このＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。つぎに、特定プライマーの理解のためにゲノムクローンの分析から得たヒトの配列の部分を用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によってヒトのカッパ受容体について暗号化するｃＤＮＡを増幅した。遺伝子の暗号化部分の５’末端が入手できないので、５’先端からの増幅のためにマウスのカッパ配列から誘導したオリゴヌクレオチドを用いた。暗号化領域の５’（マウス）および３’（ヒト）末端に位置する２つのプライマーの使用は完全なｃＤＮＡの産生にはほとんど有効性がないことかわかったので、３段階で実施し、使用した戦略は図２に示した（数字は配列ＳＥＱＩＤＮｏ．１に示したｃＤＮＡの完全な配列内のヌクレオチドの正確な位置を示している）。使用したオリゴヌクレオチドの配列は下記の通りである：ｃＤＮＡのハイブリッド形成配列は太文字で示し、他のヌクレオチドはＰＣＲの反応によって産生される断片のクローン化の後の過程を容易にするために存在している。オリゴヌクレオチドＲＰ７０、ＲＨ８４とＲＮ６はヒトのカッパ配列から誘導される。オリゴヌクレオチドＲＰ６９は、ヒトのｃＤＮＡ内にマウスの配列を導入しないために（３’末端にイニシエーターＡＴＧを含む）マウスの非暗号化５ ’配列に対応している。４つのプライマーとハイブリッド形成するｃＤＮＡの領域の正確な位置は図２に示した。下記の条件で各種の増幅反応を実施した：反応１：ＲＮ６とＲＰ７０プライマー。反応は保温媒体内にＤＭＳＯ５％を添加したほかは、ＰＣＲ標準条件でＴａｑポリメラーゼ（Cetus）の存在の下で実施した。増幅は４０サイクル実施する（９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で１分）。伸長の最後の過程は７２℃で１０分間実施する。所望の大きさ（７６０ｂｐ）のＤＮＡ断片が得られる＝断片１．反応２：増幅条件は反応１と同じである。継続する２つの増幅が必要であった：最初の増幅はＲＰ６９とＲＰ７０プライマーを使用し、完全なｃＤＮＡを含む、１と１．３ｋｂの間に含まれる大きさのＤＮＡ断片の混合物が得られた。この混合物を精製する前に、GeneClean法による１％のアガロースのゲルから電気泳動し、オリゴヌクレオチドＲＰ６９とＲＨ８４によって再増幅した。このとき、所望の大きさ（５０８ｂｐ）のＤＮＡ断片が得られる＝断片２。完全なｃＤＮＡのクローン化：ＰＣＲ断片はＥｃｏＲＶによって線形化したpBluescript（ストラタゲン）ベクターの新しい末端内で修復しクローン化した。インサートは自動ＤＮＡシーケンサ（３７３ＡＤＮＡ、Applied Bioystems Inc.）上で両方向に配列を決定した。ついで、２つのインサートはＥｃｏＲＩ（断片２の３’側と断片１の５ ’側切断）とポリリンカーの制限酵素の存在の下でプラスミドから切除された。断片は geneClean法による１％のアガロースのゲルから精製し、ベクターｐｃＤＮＡ／Ａｍｐ（イントロゲン）内で共−結合して、Ｃｏｓ細胞内で受容体を一時的に発現させた。２回の増幅反応によって所望の断片１と２が産生された。断片２の場合、５’ 末端でマウスの配列から誘導したオリゴヌクレオチドの使用によってヒトｃＤＮＡの増幅が可能になった。２つの断片は１４０ｂｐ上で重なり合っている。被覆の配列は２つの断片において、同一である。２つの断片の配列はゲノムＤＮＡから決定した配列（位置２５７から位置１１４３）と比較し、完全に同一であることがわかった。ゲノム配列が我々には不明の１から２５６の配列の部分に関して、ＰＣＲによる増幅がエラーを導入しなかったことを確認した；３つの異なる増幅反応から得た断片２の配列を比較し、３つの場合とも同一であることを確認した。本発明によるヒトのカッパ受容体について暗号化するｃＤＮＡの配列、ならびに演繹されたタンパク質の配列は、配列ＳＥＱＩＤＮｏ．１に示した。３．結論：ヒトのカッパ受容体の１次構造中程度の緊縮性のヒトゲノムバンクをスクリーニングし、相同ゲノムＤＮＡ断片を単離するためにマウスのデルタオピオイド受容体のための暗号化プローブを使用した。２つのエクソンを識別し、配列を比較すると、これらはおそらくヒトのカッパオピオイド受容体のために暗号化している。人の組織（胎盤）からこの遺伝子から誘導したｃＤＮＡ（暗号化部分）を単離し、その１次構造を分析した（ＳＥＱＩＤＮｏ．１）。ｃＤＮＡのサイズは１１０１対の塩基で、３８０のアミノ酸のタンパク質について暗号化している。ヌクレオチド配列は８６．７％がカッパオピオイド受容体について暗号化するマウスのｃＤＮＡに相同である。一番大きな拡散区域はＮ− およびＣ−末端領域に位置づけられる。この同じ領域が３つの亜種μ、δ、κの間で一番保存されない領域でもある。４．Ｋ５６受容体の薬反応学研究実施例２で単離された本発明のオピオイド受容体について暗号化するｃＤＮＡを含むｐｃＤＮＡ／ＡｍｐベクターをＣｏｓ−１細胞のトランスフェクションに使用した。得られたトランスフェクション細胞の膜をつぎに調製し、標識を付けた一部のオピオイドリガンドを結合する能力を試験した。塩化セシウム上で精製したｐｃＤＮＡ／Ａｍｐプラスミドベクターを使用して、ＤＥＡＥ−デクストラン技術を用いてＣｏｓ−１細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションから７２時間後に、組換え細胞を収穫し、次の方法で膜を調製した：細胞の沈滓を、４℃で、６０ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ５０ｍＭｐＨ７．４；ＥＤＴＡ１０ｍＭ緩衝液内に取り、均質化し、１１００ｇで１０分間遠心分離した。つぎに沈滓をもう一度３０ｍｌの同じ緩衝液内に取り、均質化し、遠心分離した。２つの上澄み液を一緒にして１１００００ｇで１５分間遠心分離した。つぎに膜沈滓を５ｍｌの同じ緩衝液内に取り、等しく分割し、−８０ ℃で保存した。ついで飽和結合および拮抗実験を異なるリガンドの存在の下にこれらの膜の上で実施した。このため、膜の標本（タンパク質１５−３０μｇ）を最終体積１ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ５０ｍＭ（ｐＨ７．４）；ＥＤＴＡ１０ｍＭ緩衝液内で、拮抗剤とともに／なしに、³Ｈ−ジプレノルフィンまたは³Ｈ−Ｕ −６９，５９３の存在の下に２５℃で２時間保温した。ついで反応を Whatman ＧＦ／Ｂフィルタ上で真空濾過によって停止させ、３ｍｌの低温緩衝液で３回洗浄した。Cheng et Prussof の式によってＫｉの値が得られた：Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋Ｌ／Ｋｄ）。放射能はβカウンターで測定した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 48/00 ＡＡＨＣ１２Ｎ 5/00 Ａ

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトのカッパオピオイド受容体の活性を有するポリペプチドについて暗号化するヌクレオチド配列。２．請求項１に記載のヌクレオチド配列において、（ａ）ヌクレオチド配列ＳＥＱＩＤＮｏ．１またはその相補的鎖の全体または一部；（ｂ）配列（ａ）とハイブリッド形成し、カッパオピオイド受容体の活性を有するポリペプチドについて暗号化するいっさいの配列；および（ｃ）遺伝子コードの退化のために配列（ａ）と（ｂ）から派生した配列：の中から選択されることを特徴とする配列。３．ヌクレオチド配列ＳＥＱＩＤＮｏ．１またはその相補的鎖の全体または一部を含むことを特徴とするヌクレオチド配列。４．請求項１から３に記載のヌクレオチド配列において、ヌクレオチド配列が、ゲノムＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、ハイブリッド配列、合成または半合成配列から選択されることを特徴とする配列。５．請求項１から４に記載のヌクレオチド配列において、前記ポリペプチドのための暗号化部分が宿主細胞内にその発現を可能にする信号制御の下に置かれることを特徴とする配列。６．前記請求項のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列の発現から生じたポリペプチド。７．ペプチド配列ＳＥＱＩＤＮｏ．１またはその誘導体の全体または一部を含むポリペプチド。８．請求項６または７のいずれか一つによるポリペプチドの産生を少なくとも部分的に阻害することができるアンチセンス配列。９．請求項２に記載の配列、または対応するｍＲＮＡとハイブリッド形成できるヌクレオチドプローブ。１０．オピオイド受容体の発現検出のため；あるいは遺伝子異常（撚継ぎ不良、多形現象、一時的突然変異、など）の検出のため；あるいはオピオイド受容体に結びつけられる神経学的、心臓血管系または精神医学的疾患を識別するため；またさらにオピオイドポリペプチドについてコード化する相同核酸の配列を明らかにし、単離するための請求項９に記載のプローブの使用。１１．カッパオピオイド受容体の活性を有することを特徴とする請求項６または７に記載のポリペプチド。１２．請求項６，７または１１のいずれか一つに記載のポリペプチドをその表面に発現することのできる組換え細胞。１３．真核細胞または原核細胞から選択されることを特徴とする請求項１２に記載の細胞。１４．オピオイド受容体のリガンドの識別および／または単離法において、下記の過程が実施されることを特徴とする方法：・分子がポリペプチドとの親和性を有する場合にポリペプチドと分子の間の相互作用を可能にする条件で、１つの分子と、あるいは、場合によっては識別されていない、各種の分子の混合物と、オピオイドポリペプチドをその表面に発現する請求項１２に記載の組換え細胞を接触させる過程と：・前記ポリペプチドに結合した分子を検出および／または単離する過程。１５．カッパオピオイド受容体のリガンドの検出および／または単離のための請求項１４に記載の方法。１６．オピオイド受容体のモジュレーターの識別および／または単離法において、下記の過程が実施されることを特徴とする方法：・ポリペプチドとそのリガンドの間の相互作用を可能にする条件で、前記受容体に内在するリガンドの存在の下に、１つの分子と、あるいは、場合によっては識別されていない、各種の分子の混合物と、オピオイド受容体の活性を有するポリペプチドをその表面に発現する請求項１２に記載の組換え細胞を接触させる過程と：・前記ポリペプチド上のリガンドの活性を修飾することのできる分子を検出および／または単離する過程。１７．請求項１４から１６に記載の方法によって得ることのできる、請求項６，７および１１に記載のポリペプチドのリガンドまたはモジュレーター。１８．請求項１４から１６に記載の方法によって識別および／または得られたリガンドまたはモジュレーターの医薬品としての使用。１９．請求項１１に記載のポリペプチドに作用する少なくとも１つの分子を作用成分として含む医薬品。２０．請求項１９に記載の医薬品において、分子が請求項１４から１６に記載の方法によって識別および／または単離されたリガンドまたはモジュレーターであることを特徴とする医薬品。