JP3681384B2 - Ｇｄｐ交換因子活性を有するペプチド，それらのペプチドをコードする核酸配列，調製法，およびに，使用 - Google Patents
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Description
本発明は、新しいペプチドおよびヌクレオチド配列、およびそれらの薬剤学的使用に関する。より特定的には、本発明は、ｐ２１−ＧＤＰ複合体によるＧＤＰの交換レベルを調節することができるペプチドに関する。
一般的にｐ２１と表示されるｒａｓ遺伝子の産物は、それらが調査されているすべての真核生物における細胞分裂の調節における要所となる役割を担っている。これらの蛋白質に幾つかの特異的改変を行うことにより、これらは正常な調節機能を失い、そして、それらを発癌性へと導く。従って、ヒトについての多数の癌が、改変を生じたｒａｓ遺伝子の存在に関連している。同様に、これらのｐ２１蛋白質の過剰発現の結果、細胞増殖の妨害を生じることがある。従って、細胞内におけるこれらｐ２１蛋白質の厳密な役割、それらの機能様式、および、それらの特性を理解することは、発癌に対する治療研究法を理解することと密接にかかわっている。
インビボにおいては、ｐ２１蛋白質の活性化の原因となることがらの厳密な性質は明らかにされていない。それらは、２つの確立した状態、つまり、ＧＤＰに結合している不活性形態と、ＧＴＰに結合している活性形態との間を彷徨することにより、それらの機能を働かせることが知られているが、これらの２つの形態の間のトランジションに影響を与える因子ははっきりとは同定されいない。最近の研究より、ＧＴＰに結合しているｒａｓ蛋白質の比率が細胞中で増大しているという生理学的状況が報告されている。これらのに状況は、ＥＧＦおよびＰＤＧＦを含む成長因子による、Ｔリンパ球の活性化、および、３Ｔ３繊維芽細胞の刺激化が含まれている（Ｄｏｗｎｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３４６（１９９０）７１９；Ｇｉｂｂｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５（１９９０）２０４３７）。ｐ２１−ＧＴＰの比率の増大は、少なくとも部分的には、形質導入のＧ蛋白質のレセプターのものに類似する役割を担っている蛋白質の作用により説明することができる。これに関連して、ｐ２１蛋白質によるＧＤＰの交換を促進することができる幾つかの蛋白質が、雄牛の脳［Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２５９（１９９０）２４５］、および、ラットの脳［Ｗｏｌｆｍａｎ ａｎｄ Ｍａｃａｒａ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８（１９９０）６７］より同定されている。これらの因子の細胞部位が異なっていること、およびそれらの取得された実験条件がひどく異なっていることより、それらは異なる蛋白質であることが示唆されている。それらは、正常なｒａｓ蛋白質についても、発癌性のｒａｓ蛋白質についてと同様に活性を示す。これらの活性は、用語ＧＥＰ、つまり、グアニジンヌクレオチド交換因子、もしくは、ＧＲＦの名の下に、同じ分類上のものとされる。
サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母においては、ＧＲＦ活性は、ＣＤＣ２５遺伝子の産生［Ｃａｍｏｎｉｓ ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊ． ５（１９８６）３７５］に起因するものであり、そして、一方では、ＣＤＣ２５、ＲＡＳ１、および、ＲＡＳ２遺伝子の産物に、そしてもう一方では、サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母におけるアデニルシクラーゼに関与するシグナル経路を理解する目的の研究が行われている。特に、多くの研究が、この関連の中でも最も情報が少ない成分である、ＣＤ２５遺伝子の産物の性質決定に焦点を注いでいる。ＣＤＣ２５遺伝子の産物は、酵母においてｐ２１の活性化を誘導するカスケード反応における最も上流に位置する成分を構成している。この分野において行われている研究は、この遺伝子が、ｒａｓ蛋白質を活性化するためのＧＤＰ→ＧＴＰ交換因子として作用するに違いないことを証明することに寄与している。Ｓ．セレビジアエ （Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母の２番目の遺伝子であるＳＤＣ２５は、構造上ＣＤＣ２５においてｐ２１非常に密接に関連しているが、この遺伝子が単離され、そして、その性質が決定されている。ＳＤＣ２５の活性ドメインは、ｒａｓ蛋白質に、インビトロで、および、インビボで作用することができる交換因子であるように思われる。このドメインは、記載されている最初の分子構成物を構成しており、それがこの活性を付与している。
つい最近、ＧＲＦタイプの蛋白質も、マウスにおいて証明された［Ｖａｎｏｎｉ ａｎｄ Ｍａｒｔｅｇａｎｉ、 Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈ． Ｓｕｐｐｌ． １６８（１９９２）２２０］。
しかしながら、今のところ、ヒトにおいて単離され、そして性質が決定されているＧＲＦ活性は存在しない。本発明は、具体的に、ヒトのＧＤＰ交換因子の存在についての、本出願者により証明された結果である。本発明は、より特定的には、ヒト起源のもので、ｈＧＲＦおよびｈＳＯＳと表示される、ｐ２１蛋白質の活性化の状態を変化させることができるペプチドおよびヌクレオチド配列の同定、単離、および性質決定の結果である。
従って、本発明の第一の態様は、薬剤学的に使用することができるペプチドからなる。より特定的には、本発明の目的は、ｐ２１−ＧＤＰ複合体によるＧＤＰの交換レベルを変化させることができるペプチドである。ｐ２１は、正常もしくは発癌性ｒａｓ遺伝子のいずれかの発現産物を表すことが了解されている。
より特定的には、本発明のペプチドは、配列番号２、３、４、６もしくは８の配列、あるいはこれらの配列の誘導体の配列の、すべてもしくは一部分から選択される。
本発明の目的について、誘導体という用語は、これらの配列の、遺伝子および／または化学的性質の改変により取得され、かつ、所期の活性を保持している任意の分子を表わす。遺伝子および／または化学的性質の改変は、一つもしくは複数の残基の、任意の突然変異、置換、欠損、付加、および／または改変を意味することを了解事項とする。このような誘導体は、特に、相互作用部位についてのペプチドの親和性を増大させる、産生のレベルを改良する、プロテアーゼに対する耐性を増加させる、治療的効果を増大させる、もしくは副作用を低下させるか、あるいは新しい薬物動態的および／または生物学的特性を付与することのようないろいろな目的のために作成することができる。
本発明のある特定な態様においては、本発明のペプチドは、ｐ２１−ＧＤＰ複合体によるＧＤＰの交換を刺激化することができるペプチドである。
本発明の別の特定の態様においては、本発明のペプチドは、ｐ２１−ＧＤＰ複合体によるＧＤＰの交換の速度を低減させるか、もしくは阻害することができるペプチドである。このようなペプチドは、ｐ２１−ＧＤＰ複合体によるＧＤＰ交換因子の相互作用に拮抗することができるペプチドであることが好ましい。従って、それらは先に記載した配列、あるいはそれらの誘導体の断片であることができる。このような断片は、いろいろな方法で作成することができる。特に、それらは本出願において与えられる配列に基づいて、当業者に知られているペプチドの合成法を用いて、化学的に合成することができる。それらは所期のペプチドをコードするヌクレオチド配列の細胞宿主内における発現により、遺伝子的に合成することもできる。この場合においては、ヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチド合成機を用い、本出願において与えられるペプチド配列、および遺伝子コードを基にして、化学的に調製することができる。このヌクレオチド配列は、本出願において与えられる配列（配列番号１、５、および７）から、酵素開裂、連結反応、およびクローニングなどにより、当業者に知られている技術に従って、あるいはこれらの配列を基にして作成したプローブでのＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより調製することもできる。しかしながら、ｐ２１−ＧＤＰ複合体に関するＧＤＰの交換の速度を緩めるもしくは阻害することができる本発明のペプチドは、ｐ２１−ＧＤＰ複合体に関する交換因子の相互作用の部位に相当する配列を有するペプチドであることもできる。
本発明の他の目的は、先に特定されたペプチドに対するポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、あるいは抗体断片である。このような抗体は、本出願において与えられる教示を考慮して、当業者に知られている方法により作成することができる。特に、これらの抗体は、本発明のペプチドに対する動物の免疫化、血液の回収、および抗体の単離により調製することができる。これらの抗体は、当業者に知られている技術に従うハイブリドーマの調製によっても作成することができる。
本発明の抗体もしくは抗体断片は、ｐ２１−ＧＤＰ複合体による交換因子の相互作用を少なくとも部分的に阻害する能力を所有することがより好ましい。従って、これらを使用して、ｒａｓ遺伝子産物の活性化の状態を調節することができる。
その上、これらの抗体を使用して、生物学的試料中に含まれるヒトのＧＤＰ交換因子を検出および／またはアッセイし、そしてその結果、ｒａｓ遺伝子の産物の活性化の状態についての情報を提供することもできる。
従って、本発明は、薬剤学的に使用するという観点において有利な生物学的特性を所有する、配列番号２−４、６、および８の配列に由来するペプチド、ならびにそれらのペプチドに対する抗体を作成することを可能にする。ＧＤＰ交換に関する本発明のいろいろなペプチドおよび抗体の生物学的活性は、実施例において説明されるような、いろいろな方法において評定することができる。
本発明は、非ペプチドであるか、あるいはペプチドのみに占められてはいない化合物であって、かつ薬剤学的に使用することができる化合物をも提供する。実際には、本出願において開示される活性な蛋白質様単位から出発すると、非ペプチドであるか、あるいはペプチドのみに占められてはいず、かつ薬剤学的使用に適合する、ｒａｓ蛋白質依存的シグナル経路を阻害する分子を作成することが可能である。これに関連して、本発明は、非ペプチドであるか、あるいはペプチドのみに占められてはいず、かつＧＤＰ交換のレベルに関して薬剤学的に活性である分子の、その活性のために重要である上述のポリペプチドの構成成分の決定、および非ペプチドであるか、あるいはペプチドのみに占められない構造によるこれらの成分の再構成による調製について、先に記載されているような本発明のポリペプチドの利用法に関する。本発明の主題は、このように調製した、ひとつもしくは複数の分子を含んでなる薬剤学的組成物でもある。
本発明の主題は、先に特定されているポリペプチドをコードする任意の核酸配列でもある。当配列は、
（ａ）配列番号１、５、もしくは７の配列、あるいはそれらの相補鎖の、全てもしくは一部分、
（ｂ）配列（ａ）とハイブリッド形成を行い、かつ本発明に従うポリペプチドをコードする任意の配列、および
（ｃ）遺伝子コードの縮重の結果として、（ａ）および（ｂ）の配列から取得される配列、
から選択されることがより好ましい。
本発明のいろいろなヌクレオチド配列は、人工的な起源のもの、もしくはそれとは別のものであることができる。それらはゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡの配列、ハイブリッド配列、あるいは合成的もしくは半合成的配列であることができる。これらの配列は、例えば、配列番号１、５、もしくは７の配列を基にして作製したプローブによる、ＤＮＡライブラリー（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー）のスクリーニングにより取得することができる。このようなライブラリーは、いろいろな起源の細胞から、当業者に知られている分子生物学の標準的な技術により調製することができる。本発明のヌクレオチド配列は、特に、ホスホルアミダイト法に従う化学合成により、あるいは別の方法として、ライブラリーのスクリーニングにより取得される配列の、化学的もしくは酵素的改変を初めとする混成方法により調製することもできる。
本発明に記載のこれらのヌクレオチド配列を薬剤学的分野において使用することができるが、それは、遺伝子治療という面における、本発明のペプチドのインビトロでの産生のため、もしくはアンチセンス配列の産生のため、もしくは本発明のペプチドの産生のため、あるいはそれとは別に、生物学的試料中に含まれる、増幅された、突然変異を生じた、もしくは再構成されたＧＤＰ交換因子の発現もしくは過剰発現の、ハイブリッド形成実験による検出および診断のため、もしくは他の細胞起源からの相同配列の単離のための使用法のようなものである。
本発明のペプチドの産生のために、先に特定される核酸配列配列は、一般的に、細胞宿主内においてそれらの発現を可能にするシグナルの調節下に置かれている。これらのシグナル（プロモーター、ターミネーター、および、分泌用リーダー配列など）の選択は、使用する細胞宿主に従って異なることがある。本発明のこれらのヌクレオチド配列が、自律的に複製することができるベクター、もしくは組み込みベクターの一部を形成することが好ましい。より特定的には、自律的に複製するベクターは、選択した宿主内において自律的な複製を示す配列を使用して調製することができる。組み込みベクターの方は、例えば、相同組換えによりベクターの組み込みを可能にする宿主ゲノムの特定領域に対して相同な配列を使用してこれを調製することができる。
本発明のペプチドの産生のために使用することができる細胞宿主は、真核細胞宿主もしくは原核細胞宿主のいずれでもかまわない。適切である真核細胞宿主では、動物細胞、酵母、もしくは新菌類を挙げることができる。特に、酵母に関しては、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シュワニオミセス（Ｓｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、もしくはハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属を挙げることができる。動物細胞に関しては、ＣＯＳ、ＣＨＯ、および、Ｃ１２７細胞などを挙げることができる。新菌類では、アスペルギルス エスエスピー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｓｐ．）、もしくはトリコデルマ エスエスピー（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｓｐ．）をより特別に挙げることができる。原核細胞宿主としては、以下に記載する細菌、つまり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、もしくはストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）を使用することが好ましい。
本発明に従う核酸配列を、薬剤学的試薬として使用することができる、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくは遺伝子のアンチセンス配列の産生のために使用することもできる。アンチセンス配列による特定の発癌遺伝子の発現の阻害は、これらの発癌遺伝子の役割を理解する上での有用な手法であり、かつ抗癌剤治療法の開発における特に有望な研究法であることが判っている。アンチセンス配列は、特定の遺伝子のコーディング鎖に対して相補的であり、かつその結果として、転写されたｍＲＮＡに特異的にハイブリッド形成して、そのｍＲＮＡが蛋白質へと翻訳されるのを阻害することができる小さなサイズのオリゴヌクレオチドである。従って、本発明の目的は、少なくとも部分的に、ｐ２１−ＧＤＰ複合体によるＧＤＰの交換を刺激化するペプチドの産生を阻害することができるアンチセンス配列である。このような配列は、先に特定される核酸配列のすべてもしくは一部分からなることができる。それらは一般的に、ＧＤＰ交換を刺激化するペプチドをコードする配列に対して相補的な配列、もしくは、そのような配列の断片である。このようなオリゴヌクレオチドは、フラグメント化などにより配列番号１、５、もしくは、７の配列から、あるいは、化学合成により取得することができる。このような配列を、遺伝子治療という面において、ｒａｓ蛋白質によるＧＤＰの交換のレベルを調節することができるアンチセンス配列もしくはペプチドの、転移もしくはインビボでの発現のために使用することができる。これに関連して、この配列を、ベクター、特に、ウイルス起源のベクター内に取り込ませることができる。
本発明は、ヌクレオチド配列として、本発明のペプチドをコードする、先に特定されるヌクレオチド配列と、もしくはそれに相関するｍＲＮＡと、ハイブリッド形成することができる、合成もしくはその他のヌクレオチドプローブにも関する。このようなプローブは、ＧＤＰ交換因子の発現の検出のため、もしくは別の方法として、遺伝子異常（スプライシングの誤り、多形性、および、点突然変異など）の証明のための、診断手段としてインビトロにおいて用いることができる。このようなプローブはあらかじめラベル化しておく必要があり、そしてこの目的のためのいろいろな技術が当業者に知られている。これらのプローブを使用することができるハイブリッド形成条件は、緊縮性の通常の条件である（特に、以下の一般的なクローニング技術、およびに、実施例を参照せよ）。これらのプローブを、実施例に説明してあるような他の細胞起源から、本発明のペプチドをコードする相同核酸配列を証明および単離するために使用することもできる。
本発明の主題は、先に特定される少なくとも一つのペプチドを活性素因として含んでなる任意の薬剤学的組成物でもある。
本発明の主題は、先に特定される少なくとも一つの抗体および／または抗体断片を活性成分として含んでなる任意の薬剤学的組成物、ならびに、先に特定される少なくとも一つのヌクレオチド配列を活性成分として含んでなる任意の薬剤学的組成物でもある。
その上、本発明の目的は、先に特定されるペプチド、抗体、および、ヌクレオチド配列が、もう一つの、あるいは、他の活性成分と組合わさっている、薬剤学的組成物でもある。
本発明に記載の薬剤学的組成物を使用して、ｐ２１蛋白質の活性化を調節することができ、そしてその結果、特定の細胞の種類の増殖を調節することができる。より特定的には、これらの薬剤学的組成物は、癌の治療を意図する。実際、多くの癌が、発癌性ｒａｓ蛋白質の存在に関連している。最も頻繁に突然変異を生じているｒａｓ遺伝子を含む癌の内でも、特に、９０％は第１２番目のコドン上で突然変異を生じたＫｉ−ｒａｓ発癌遺伝子を有している膵臓の腺癌「Ａｌｍｏｇｕｅｒａ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ ５３（１９８８）５４９］、大腸の腺癌および甲状腺の癌（５０％）、もしくは、肺の癌腫および骨髄性白血病［３０％、Ｂｏｓ、Ｊ．Ｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４９（１９８９）４６８２］を挙げることができる。
本発明の主題は、ｐ２１蛋白質の活性を調節するための、先に特定される分子の利用でもある。特に、本発明は、ｐ２１蛋白質の活性化を少なくとも部分的に阻害するこれらの分子の利用に関する。
本発明はまた、生物学的試料中に含まれるｒａｓ遺伝子の発現および／または過剰発現の検出のための方法を提供する。このような方法は、例えば、このような試料の本発明に記載の抗体もしくは抗体断片との接触、この抗原−抗体複合体の可視化、および標準試料を使用して得られる結果の比較を含んでなる。このような方法においては、抗体は、懸濁液中に含まれるか、或いは支持体上にあらかじめ固定化されていることができる。この方法はまた、試料の本発明に記載のヌクレオチドプローブとの接触、取得されるハイブリッドの証明、および標準試料の場合において取得されるものとの比較を含んでなることもできる。
本発明は、治療分野において使用することができるが、それは、本発明のペプチド、抗体、およびヌクレオチド配列がｒａｓ遺伝子の活性化を調節することができるために、実際、それらが、癌の発生過程に介在することを可能にするためである。実施例において説明されるように、本発明のヌクレオチド配列は、特に、ｃｄｃ２５突然変異を保持する酵母の温度感受性を補足することができるペプチドを発現することを可能にする。これらはまた、ＲＡＳ２ｔｓ優性突然変異を抑制することができるペプチドを発現することを可能にもし、このことにより、ｐ２１蛋白質に関する相互作用についての、ＣＤＣ２５遺伝子の正常発現産物との競合を証明している。本発明はまた、本発明の抗体およびヌクレオチドプローブが、実際、ｒａｓ遺伝子が関与している癌の同定を可能にするために、癌の診断および型別の分野において利用すること、ならびに、正常もしくは発癌性ｒａｓ遺伝子の過剰発現に関連する癌の診断の分野においても使用することができる。
本発明の他の利点は、以下に示す実施例を読むことにより明白になるものと思われるが、これらの実施例は説明として考慮されるべきであり、制限として考慮すべきものではない。
図面の説明
図１：転移活性化テスト：この図は、縦座標として、形質転換のために使用したｃＤＮＡ配列に関する、組換えＣＨＯ株のＣＡＴ活性のレベル（バックグラウンドに対する比較％）を示す。
図２：ＧＴＰ交換活性のテスト：この図は、縦座標として、形質転換のために使用したｃＤＮＡ配列に関する、組換えＣＨＯ株のｐ２１−ＧＤＰ／ｐ２１−ＧＴＰ形態の比率を示す。
図３：インビトロでのＧＤＰ交換活性のテスト：この図は、時間および本発明のペプチドの２つの濃度について、ｐ２１蛋白質に結合したままになっているＧＤＰの比率の減少を示す。
一般的なクローニング技術
プラスミドＤＮＡの予備抽出、塩化セシウム濃度勾配中におけるプラスミドＤＮＡの遠心処理、アガロースゲルもしくはアクリルアミドゲル電気泳動、エレクトロエリューションによるＤＮＡ断片の精製、フェノールもしくはフェノール／クロロホルムでの蛋白質抽出、食塩水培地中に含まれるＤＮＡのエタノールもしくはイソプロパノール沈殿、および、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における形質転換などのような分子生物学において因習的に使用される方法は当業者に良く知られており、そして刊行物中において詳細に説明されている［Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ． ｅｔ ａｌ．、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８２；Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）、”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８７］。
制限酵素は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｉｏｌａｂｓ）社、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＢＲＬ）社、もしくは、Ａｍｅｒｓｈａｍ社から供給され、そして、供給元の勧告に従って使用した。
ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ、λｇｔ１１、および、ｐＧＥＸ ２Ｔタイプのプラスミド、およびＭ１３シリーズのファージは、市販品の源のものを使用する。
連結反応については、ＤＮＡ断片を、アガースもしくはアクリルアミドゲル電気泳動によりサイズに従って分離し、フェノールもしくはフェノール／クロロホルム混合物で抽出し、エタノールで沈殿させ、そしてその後、供給元の勧告に従ってファージＴ４のＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下においてインキュベートする。
５’突出端の補充は、供給元の勧告に従って、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片（Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して行う。３’突出端の破壊は、供給元の勧告に従ってファージＴ４のＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下において行う。５’突出端の破壊は、Ｓ１ヌクレオアーゼでの管理条件下での処理により行う。
合成オリゴヌクレオチドによるインビトロでの突然変異誘発は、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．により開発された方法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３（１９８５）８７４９−８７６４］に従って、Ａｍｅｒｓｈａｍ社により配給されるキットを使用して実行する。
いわゆるＰＣＲ［ポリメラーゼにより触媒される連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０（１９８５）１３５０−１３５４；Ｍｕｌｌｉｓ Ｋ．Ｂ． ａｎｄ Ｆａｌｏｏｎａ Ｆ．Ａ．、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍ． １５５（１９８７）３３５−３５０］技術によるＤＮＡ断片の酵素的増幅は、供給元の勧告に従う「ＤＮＡサーマルサイクラー」（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社）を使用して行う。
ヌクレオチド配列の実証は、Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．により開発された方法［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、７４（１９７７）５４６３−５４６７］により、Ａｍｅｒｓｈａｍ社により配給されるキットを使用して実行する
ハイブリッド形成実験のためには、緊縮性の通常の条件は、一般的には、以下に示すものであり、それは、ハイブリッド形成：６５℃下、５×デンハート溶液の存在下における３×ＳＣＣ、洗浄：６５℃下、０．５×ＳＳＣ、である。
１．ヒトのＧＤＰ交換因子（ｈＧＲＦ）遺伝子の単離
ベクターλｇｔ１１［Ｓｋｏｌｎｉｋ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ ６５（１９９１）８３］中において作製したヒトの脳のライブラリーの５×１０5のファージを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、および、Ｍａｎｉａｔｉｓにより記載される技術（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；１９８９）に従ってスクリーニングした。
このライブラリーのスクリーニングのために使用したプローブは、32Ｐでラベル化してある１３７塩基対のヒトのｃＤＮＡ断片である。このプローブは、プライマーとして、以下に示す縮重オリゴヌクレオチドを使用する、前述のライブラリーの総ＤＮＡについてのＰＣＲにより調整し、それらの縮重オリゴヌクレオチドは、その断片の３’端のオリゴヌクレオチド（配列番号１１）については、
であり、そして、
その断片の５’端のオリゴヌクレオチド（配列番号１２）については、
である。
このプローブは、ＦｅｉｎｂｅｒｇおよびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３７（１９８４）２６６］の技術に従うランダムプライミングにより32Ｐでラベル化し、そして、ＰＣＲ反応は、一般的なクローニング技術において記載した条件下において、約４０℃下で実行した。
このプローブを使用するハイブリッド形成により取得されるいろいろな陽性クローンの内、あるものは、Ｈａ−Ｒａｓに関する交換活性を保持する読み取り枠全体を含んでいる。
このλｇｔ１１クローンは、Ｍ１３ｍｐ１８ベクターの相関する部位において、ＥｃｏＲＩ断片の形態において取り込まれている３−ｋｂのｃＤＮＡを保持している。その後、このｃＤＮＡを、市販の「リバース」および「−２０」プライマーを使用し、そしてさらに、Ｓａｎｇｅｒ技術（一般的なクローニング技術を参照せよ）に従う特異的オリゴヌクレオチドも使用して配列決定を行った。
そのようにして取得される断片により保持されるヒトのＧＤＰ交換因子遺伝子のヌクレオチド配列を、配列番号１の配列において、演繹されるペプチド配列（配列番号２、３、および、４）と一緒に示した。
２．サブフラグメントの調製
このようにして取得された遺伝子のいろいろな誘導体もしくは断片は、特に、本発明のペプチドの発現のために、調製および使用することができる。特に、以下に示す断片を、酵素開裂により調製し、そして電気溶出により分離するが、それらの断片は、
−交換因子をコードする領域の一部（ヌクレオチド９３６から停止コドンまで）、およびに、その断片の３’非コーディング領域を含んでなるＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片、
−交換因子をコードする領域の一部（ヌクレオチド９１０から停止コドンまで）、およびに、その断片の３’非コーディング領域を含んでなるＥｃｏＮＩ−ＥｃｏｒＩ断片、
−交換因子をコードする領域の一部（ヌクレオチド６３８から停止コドンまで）、およびに、その断片の３’非コーティング領域を含んでなるＥａｇＩ−ＥｃｏＲＩ断片、
−交換因子をコードする領域の一部（ヌクレオチド８８から停止コドンまで）、およびに、その断片の３’非コーティング領域を含んでなるＢａｌＩ−ＥｃｏＲＩ断片、ならびに、
−交換因子をコードする領域の一部（ヌクレオチド１９６から停止コドンまで）、およびに、その断片の３’非コーティング領域を含んでなるＮａｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片、
である。
これらの断片により保持される３’非コーディング領域は二次的に重要なものであり、そしてヌクレアーゼ、あるいはその停止コドンの約３０ｂｐ後に開裂部位が位置する、特に、ＳｍａＩのような、停止コドンに近い開裂部位を有する酵素での開裂、のいずれかにより除去することができる、ということを了解事項とする。
また、特に、Ｃ−末端部分全体をコードする領域を含んでいる訳ではない断片、ならびに突然変異、置換、添加、もしくは化学的および／または遺伝子的性質の改変により取得されるこれらの断片の誘導体のような、他の断片も調製することができることも了解事項とする。
３．生物学的特性決定
本発明に従うペプチドの機能性を、
−哺乳類細胞中、
−サッカロミセス セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中、そうでなければ、
−組換えＨａ−Ｒａｓ蛋白質についてインビトロで、
テストした。
３．１．哺乳類細胞中における機能の亢進については、例えば、実施例２において記載のもののような、本発明のペプチドをコードするＤＮＡ配列を、Ｃａｍｏｎｉｓ ｅｔ ａｌ．［Ｇｅｎｅ ８６（１９９０）２６３］により記載されている、ベクターｐＣｙｍ１中におけるＳＶ４０の初期プロモーターの調節下に配置させることができる。
この例においては、実施例２において記載のＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＮＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、このベクター内に挿入した。
このようにして取得されるベクターを、Ｒｅｙ ｅｔ ａｌ．［Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６（１９９１）３４７］により記載される計画に従うＣＨＯ細胞内へのトランジエントトランスフェクションによりテストした。
このような方法において、機能性の２つの基準を調査したが、それらの基準とは、
−この場合、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ遺伝子）をコードする細菌性遺伝子である、レポーター遺伝子の発現を調節しているプロモーターを転移活性化させるベクターの能力、
−トランスフェクトされたＣＨＯ細胞のＲａｓ蛋白質に、ＧＴＰを結合させることを促進するそれらの能力、
である。
ａ）転移活性化テストについては、５０％の濃度のＣＨＯ細胞を、一方では、マウスのチミジンキナーゼ遺伝子のプロモーター、および、ポリオーマウイルスのエンハンサーから得られる４つのＰＥＡ１反復成分よりなる合成プロモーターの調節下あるＣＡＴ遺伝子を保持する０．５μｇのベクターで［Ｗａｓｙｌｙｋ ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊ． ７（１９８８）２４７５］、そして、もう一方では、ＳＶ４０の初期プロモーターの調節下にある、非コーディングｃＤＮＡ（ライン１）、正常なＨａ−ＲａｓのｃＤＮＡ（ライン２）、位置１２（Ｖａｌ１２）に存在する活性化されたＨａ−ＲａｓのｃＤＮＡ（ライン３）、先に引用したＲｅｙ ｅｔ ａｌ．により記載される、ＳＤＣ２５のｃＤＮＡの３’端（ライン４）、および、先に記載の、本発明に従うペプチドをコードするｃＤＮＡ（ライン５）を保持する４．５μｇの発現ベクターで、トランスフェクトさせた（例えば、Ｓｃｈｗｅｉｇｈｏｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｉｎ ｐｒｅｓｓ、により記載の計画を参照せよ）。
結果を図１に示した。ライン１は基準値の活性化に相当し、ライン３（ＰＳｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片について取得された：ＣＤＣ ｈｕｍ．）は、本発明のペプチドの発現により、調査した合成プロモーターの転移活性化が可能になることを示している。
同じ定量的結果が、調査を行った他の断片について取得された。
ｂ）この転移活性化が、ＣＨＯ細胞のｒａｓ蛋白質へのヌクレオチドの結合を実際に伴うということを立証するために、32Ｐでラベル化したオルトリン酸を培養培地に添加して、同一のトランジエントトランスフェクションを行った。
このラベル化計画、ならびに、細胞性のｒａｓ蛋白質の免疫沈降のための計画は、先に引用したＲｅｙ ｅｔ ａｌ．により記載されている。取得された結果を図２に示した。それらは、本発明のペプチドは、ｒａｓ蛋白質によるＧＤＰの交換のレベルを調節することができることを示しているが、それは、それらの内の幾つかのもの（先に記載のＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片により発現されるペプチドＣＤＣ Ｈｕｍ．）が、Ｙ１３−２５９抗体で免疫沈降させたＣＨＯ細胞のｒａｓ蛋白質のＧＴＰとの結合を促進することができるためである。
３．２．本発明のペプチドは、Ｓ．セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｂｉｓｉａｅ）のｃｄｃ２５-イーストにおける機能性についてもテストを行った。この目的のために、シャトルベクターである、先に記載の（３．１．）ベクターを、イースト株ＯＬ９７−１−１１Ｂ内に取り込ませた［Ｃａｍｏｎｉｓ ａｎｄ Ｊａｃｑｕｅｔ、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８（１９８８）２９８０］。取得された結果により、本発明に記載のｃＤＮＡ断片は、３６℃におけるこの株の生育欠損を補うことができるペプチドをコードしていることが示されている。従って、これらの結果は、これらの断片が、Ｓ．セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｂｉｓｉａｅ）内においてインビボで機能を発揮するペプチドをコードしていることを示している。
３．３．精製したＨａ−Ｒａｓ蛋白質に関するＧＤＰの交換を促進させることができるペプチドをコードする、本発明のＤＮＡ配列の能力を、Ｒｅｙ ｅｔ ａｌ． ［Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． ＢＩｏｌ． ９（１９８９）３９０４］により記載されている計画に従って、インビトロにおいても証明した。
この目的のために、本発明の配列を、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ［Ｇｅｎｅ ６７（１９８８）３１］により記載されている技術に従って、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白質の形態において、大腸菌株ＴＧ１内において発現させる。この目的のために、先の３．１．において記載されているいろいろなＤＮＡ断片を、ＧＳＴをコードするｃＤＮＡの３’端、および、その読み取り枠内に存在するベクターｐＧＥＸ ２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）内に、ＳｍａＩ−ＥｃｏＲＩ断片の形態でクローン化させた。このＳｍａＩ−ＥｃｏＲＩ断片は、リガーゼによるアダプターの添加により取得される。その後、このようにして取得されたベクターを使用して、大腸菌株ＴＧ１を形質転換させる。このように形質転換させた細胞を、３７℃において一晩予備培養を行い、ＬＢ培地内で１／１０に希釈し、発現を誘導させるためにＩＰＴＧを添加し（２時間、２５℃）、そしてその後、２５℃において約２１時間培養する。その後、細胞を溶菌させ、そして、産生された融合蛋白質を、アガロース−ＧＳＨカラムにおける親和性により精製する。この目的のために、細菌の溶菌液を、４℃において１５分間、ゲル（溶菌緩衝液を用いて調製および平衡化させてある）の存在下においてインキュベートする。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４で３度洗浄した後、この蛋白質を、過剰量のＧＳＨを含む、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．７の存在下において溶出させる。上清を回収し、そして、遠心処理にかける。
その後、精製したＨａ−Ｒａｓ蛋白質に関する、本発明のペプチドのＧＤＰ交換活性を、Ｒｅｙ ｅｔ ａｌ．（先に引用したＭｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）により記載されている計画に従ってインビトロにおいて証明した。得られた結果を図３に示す。それらは、特に、先に記載のＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩにより発現されるＣＤＣ ｈｕｍ配列に相当する本発明のペプチドは、ＧＤＰ交換を刺激化することを示している。
４．相同配列の証明
図１に示す核酸配列に対して相同な核酸配列を、以下に示す２つの異なる手法により証明した。
−一般的なクローニング技術において記載の条件下における、胎盤のｍＲＮＡから新しく合成したｃＤＮＡについて、配列番号１の配列と、ＳＯＳ蛋白質の配列［Ｂｏｎｆｉｎｉ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５（１９９２）６０３］との間に保存されている配列を覆うために選択した縮重オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用するＰＣＲによる手法。
−32Ｐでラベル化した配列番号１の配列の全体からなるプローブを使用する胎盤のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによる手法。５０℃下、５×ＳＳＣ、５×デンハート培地中におけるハイブリッド形成、その後に続く、５０℃下、２×ＳＳＣ培地中における洗浄を含んでなるこのスクリーニングは、低緊縮性の条件下において実行した。
これらの２つの手法により、配列番号１の配列に対して相同である配列が明らかにされた。これらの配列は、簡単に、単離および特性を決定を行うことができる。これらは、ｐ２１−ＧＤＰ複合体に関するＧＤＰの交換のレベルを調節することができるペプチド（あるいは、それらの断片もしくは誘導体）をコードする場合、本発明の目的のための核酸配列を構成している。
特に、この手法により、胎盤のｍＲＮＡから、そして、オリゴヌクレオチドであるｏｌｉｇｏ ２４４９（配列番号９）、および、ｏｌｉｇｏ ２４５１（配列番号１０）、ｈＳＯＳ１およびｈＳＯＳ２と表示される因子をコードする２つのｃＤＮＡを使用して、各々、配列番号５および配列番号７に示される部分的配列を同定することが可能となった。これらの因子に相関するｍＲＮＡは探索を行ったすべての組織内に存在するが、それとは対照的に、実施例１において記載される因子は、脳にのみ存在することが明らかになっている。これらの遺伝子の染色体上における位置決定を行い、そして、以下に示す結果を取得した。
−ｈ−ＧＲＦ：１５ｑ２．４．
−ｈ−ＳＯＳ１：４ｑ２．１．
−ｈ−ＳＯＳ２：１４ｑ２．２．
５．他の組織内に存在するｈ−ＧＲＦタイプの交換因子のためのテスト
抗−ｈ−ＧＲＦ抗体は、配列番号４に示したｈ−ＧＲＦ因子の、残基２１１と４８９との間に位置する２８０アミノ酸の断片に相当する抗原で免疫化することにより、ウサギにおいて調製した。
これらの抗体により、明白な分子量３０、５５、７５、９５、および、１４０ｋＤａの蛋白質を、ＥＬＩＳＡにより、ヒトの皮質および脳前駆体細胞内において検出することができた。分子量の多様性により、多重性ｃＤＮＡの存在が示唆されている。ｈ−ＧＲＦ抗体をｈ−ＧＲＦとあらかじめインキュベーションさせておくと、同定された蛋白質の検出が消失し、これにより、シグナルの特異性が証明された。
配 列 表
（１）一般的な情報
（ｉ）出願者
（Ａ）氏名：ＲＨＯＮＥ−ＰＯＵＬＥＮＣ ＲＯＲＥＲ Ｓ．Ａ．
（Ｂ）街路名：２０、ａｖｅｎｕｅ Ｒａｙｍｏｎｄ ＡＲＯＮ
（Ｃ）市：ＡＮＴＯＮＹ
（Ｅ）国：ＦＲＡＮＣＥ
（Ｆ）郵便番号：９２１６５
（ii）発明の名称：ｒａｓ蛋白質の活性を阻害するペプチド、調製法、および、使用法
（iii）配列数：１２
（iv）コンピューター解読形態：
（Ａ）メディウムの種類：テープ
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ
（Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェアー：ＰａｔｅｎｔＩｎ Ｒｅｌｅａｓｅ ＃１．０、Ｖｅｒｓｉｏｎ ＃１．２５（ＥＰＯ）
（２）配列番号１についての情報
（ｉ）配列の性質
（Ａ）配列の長さ：２６５２
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：ＮＯ
（iii）アンチセンス：ＮＯ
（ix）配列の特徴
（Ａ）名称／略称：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１．．．２４４５
（ix）配列の特徴
（Ａ）名称／略称：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：４４５．．．２４４５（配列番号３）
（ix）配列の特徴
（Ａ）名称／略称：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：９７６．．．２４４５（配列番号４）
（xi）配列：配列番号１：
（２）配列番号２についての情報
（ｉ）配列の性質
（Ａ）配列の長さ：８１４
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（xi）配列：配列番号２：
（２）配列番号３についての情報
（ｉ）配列の性質
（Ａ）配列の長さ：６６６
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（xi）配列：配列番号３：
（２）配列番号４についての情報
（ｉ）配列の性質
（Ａ）配列の長さ：４８９
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（xi）配列：配列番号４：
（２）配列番号５についての情報
（ｉ）配列の性質
（Ａ）配列の長さ１０９２
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：ＮＯ
（iii）アンチセンス：ＮＯ
（ix）配列の特徴
（Ａ）名称／略称：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１．．．１０９２
（xi）配列：配列番号５：
（２）配列番号６についての情報
（ｉ）配列の性質
（Ａ）配列の長さ：３６４
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（xi）配列：配列番号６：
（２）配列番号７についての情報
（ｉ）配列の性質
（Ａ）配列の長さ：１９５６
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：ＮＯ
（iii）アンチセンス：ＮＯ
（ix）配列の特徴
（Ａ）名称／略称：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１．．．１９５６
（xi）配列：配列番号７：
（２）配列番号８についての情報
（ｉ）配列の性質
（Ａ）配列の長さ：６５２
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（xi）配列：配列番号８：
（２）配列番号９についての情報
（ｉ）配列の性質
（Ａ）配列の長さ：４１
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：ＮＯ
（iii）アンチセンス：ＮＯ
（xi）配列：配列番号９：
（２）配列番号１０についての情報
（ｉ）配列の性質
（Ａ）配列の長さ：３４
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：ＮＯ
（iii）アンチセンス：ＮＯ
（xi）配列：配列番号１０：
（２）配列番号１１についての情報
（ｉ）配列の性質
（Ａ）配列の長さ：３３
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：ＮＯ
（iii）アンチセンス：ＮＯ
（xi）配列：配列番号１１：
（２）配列番号１２についての情報
（ｉ）配列の性質
（Ａ）配列の長さ：２７
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：ＮＯ
（iii）アンチセンス：ＮＯ
（xi）配列：配列番号１２：
一般的にｐ２１と表示されるｒａｓ遺伝子の産物は、それらが調査されているすべての真核生物における細胞分裂の調節における要所となる役割を担っている。これらの蛋白質に幾つかの特異的改変を行うことにより、これらは正常な調節機能を失い、そして、それらを発癌性へと導く。従って、ヒトについての多数の癌が、改変を生じたｒａｓ遺伝子の存在に関連している。同様に、これらのｐ２１蛋白質の過剰発現の結果、細胞増殖の妨害を生じることがある。従って、細胞内におけるこれらｐ２１蛋白質の厳密な役割、それらの機能様式、および、それらの特性を理解することは、発癌に対する治療研究法を理解することと密接にかかわっている。
インビボにおいては、ｐ２１蛋白質の活性化の原因となることがらの厳密な性質は明らかにされていない。それらは、２つの確立した状態、つまり、ＧＤＰに結合している不活性形態と、ＧＴＰに結合している活性形態との間を彷徨することにより、それらの機能を働かせることが知られているが、これらの２つの形態の間のトランジションに影響を与える因子ははっきりとは同定されいない。最近の研究より、ＧＴＰに結合しているｒａｓ蛋白質の比率が細胞中で増大しているという生理学的状況が報告されている。これらのに状況は、ＥＧＦおよびＰＤＧＦを含む成長因子による、Ｔリンパ球の活性化、および、３Ｔ３繊維芽細胞の刺激化が含まれている（Ｄｏｗｎｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３４６（１９９０）７１９；Ｇｉｂｂｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５（１９９０）２０４３７）。ｐ２１−ＧＴＰの比率の増大は、少なくとも部分的には、形質導入のＧ蛋白質のレセプターのものに類似する役割を担っている蛋白質の作用により説明することができる。これに関連して、ｐ２１蛋白質によるＧＤＰの交換を促進することができる幾つかの蛋白質が、雄牛の脳［Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２５９（１９９０）２４５］、および、ラットの脳［Ｗｏｌｆｍａｎ ａｎｄ Ｍａｃａｒａ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８（１９９０）６７］より同定されている。これらの因子の細胞部位が異なっていること、およびそれらの取得された実験条件がひどく異なっていることより、それらは異なる蛋白質であることが示唆されている。それらは、正常なｒａｓ蛋白質についても、発癌性のｒａｓ蛋白質についてと同様に活性を示す。これらの活性は、用語ＧＥＰ、つまり、グアニジンヌクレオチド交換因子、もしくは、ＧＲＦの名の下に、同じ分類上のものとされる。
サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母においては、ＧＲＦ活性は、ＣＤＣ２５遺伝子の産生［Ｃａｍｏｎｉｓ ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊ． ５（１９８６）３７５］に起因するものであり、そして、一方では、ＣＤＣ２５、ＲＡＳ１、および、ＲＡＳ２遺伝子の産物に、そしてもう一方では、サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母におけるアデニルシクラーゼに関与するシグナル経路を理解する目的の研究が行われている。特に、多くの研究が、この関連の中でも最も情報が少ない成分である、ＣＤ２５遺伝子の産物の性質決定に焦点を注いでいる。ＣＤＣ２５遺伝子の産物は、酵母においてｐ２１の活性化を誘導するカスケード反応における最も上流に位置する成分を構成している。この分野において行われている研究は、この遺伝子が、ｒａｓ蛋白質を活性化するためのＧＤＰ→ＧＴＰ交換因子として作用するに違いないことを証明することに寄与している。Ｓ．セレビジアエ （Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母の２番目の遺伝子であるＳＤＣ２５は、構造上ＣＤＣ２５においてｐ２１非常に密接に関連しているが、この遺伝子が単離され、そして、その性質が決定されている。ＳＤＣ２５の活性ドメインは、ｒａｓ蛋白質に、インビトロで、および、インビボで作用することができる交換因子であるように思われる。このドメインは、記載されている最初の分子構成物を構成しており、それがこの活性を付与している。
つい最近、ＧＲＦタイプの蛋白質も、マウスにおいて証明された［Ｖａｎｏｎｉ ａｎｄ Ｍａｒｔｅｇａｎｉ、 Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈ． Ｓｕｐｐｌ． １６８（１９９２）２２０］。
しかしながら、今のところ、ヒトにおいて単離され、そして性質が決定されているＧＲＦ活性は存在しない。本発明は、具体的に、ヒトのＧＤＰ交換因子の存在についての、本出願者により証明された結果である。本発明は、より特定的には、ヒト起源のもので、ｈＧＲＦおよびｈＳＯＳと表示される、ｐ２１蛋白質の活性化の状態を変化させることができるペプチドおよびヌクレオチド配列の同定、単離、および性質決定の結果である。
従って、本発明の第一の態様は、薬剤学的に使用することができるペプチドからなる。より特定的には、本発明の目的は、ｐ２１−ＧＤＰ複合体によるＧＤＰの交換レベルを変化させることができるペプチドである。ｐ２１は、正常もしくは発癌性ｒａｓ遺伝子のいずれかの発現産物を表すことが了解されている。
より特定的には、本発明のペプチドは、配列番号２、３、４、６もしくは８の配列、あるいはこれらの配列の誘導体の配列の、すべてもしくは一部分から選択される。
本発明の目的について、誘導体という用語は、これらの配列の、遺伝子および／または化学的性質の改変により取得され、かつ、所期の活性を保持している任意の分子を表わす。遺伝子および／または化学的性質の改変は、一つもしくは複数の残基の、任意の突然変異、置換、欠損、付加、および／または改変を意味することを了解事項とする。このような誘導体は、特に、相互作用部位についてのペプチドの親和性を増大させる、産生のレベルを改良する、プロテアーゼに対する耐性を増加させる、治療的効果を増大させる、もしくは副作用を低下させるか、あるいは新しい薬物動態的および／または生物学的特性を付与することのようないろいろな目的のために作成することができる。
本発明のある特定な態様においては、本発明のペプチドは、ｐ２１−ＧＤＰ複合体によるＧＤＰの交換を刺激化することができるペプチドである。
本発明の別の特定の態様においては、本発明のペプチドは、ｐ２１−ＧＤＰ複合体によるＧＤＰの交換の速度を低減させるか、もしくは阻害することができるペプチドである。このようなペプチドは、ｐ２１−ＧＤＰ複合体によるＧＤＰ交換因子の相互作用に拮抗することができるペプチドであることが好ましい。従って、それらは先に記載した配列、あるいはそれらの誘導体の断片であることができる。このような断片は、いろいろな方法で作成することができる。特に、それらは本出願において与えられる配列に基づいて、当業者に知られているペプチドの合成法を用いて、化学的に合成することができる。それらは所期のペプチドをコードするヌクレオチド配列の細胞宿主内における発現により、遺伝子的に合成することもできる。この場合においては、ヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチド合成機を用い、本出願において与えられるペプチド配列、および遺伝子コードを基にして、化学的に調製することができる。このヌクレオチド配列は、本出願において与えられる配列（配列番号１、５、および７）から、酵素開裂、連結反応、およびクローニングなどにより、当業者に知られている技術に従って、あるいはこれらの配列を基にして作成したプローブでのＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより調製することもできる。しかしながら、ｐ２１−ＧＤＰ複合体に関するＧＤＰの交換の速度を緩めるもしくは阻害することができる本発明のペプチドは、ｐ２１−ＧＤＰ複合体に関する交換因子の相互作用の部位に相当する配列を有するペプチドであることもできる。
本発明の他の目的は、先に特定されたペプチドに対するポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、あるいは抗体断片である。このような抗体は、本出願において与えられる教示を考慮して、当業者に知られている方法により作成することができる。特に、これらの抗体は、本発明のペプチドに対する動物の免疫化、血液の回収、および抗体の単離により調製することができる。これらの抗体は、当業者に知られている技術に従うハイブリドーマの調製によっても作成することができる。
本発明の抗体もしくは抗体断片は、ｐ２１−ＧＤＰ複合体による交換因子の相互作用を少なくとも部分的に阻害する能力を所有することがより好ましい。従って、これらを使用して、ｒａｓ遺伝子産物の活性化の状態を調節することができる。
その上、これらの抗体を使用して、生物学的試料中に含まれるヒトのＧＤＰ交換因子を検出および／またはアッセイし、そしてその結果、ｒａｓ遺伝子の産物の活性化の状態についての情報を提供することもできる。
従って、本発明は、薬剤学的に使用するという観点において有利な生物学的特性を所有する、配列番号２−４、６、および８の配列に由来するペプチド、ならびにそれらのペプチドに対する抗体を作成することを可能にする。ＧＤＰ交換に関する本発明のいろいろなペプチドおよび抗体の生物学的活性は、実施例において説明されるような、いろいろな方法において評定することができる。
本発明は、非ペプチドであるか、あるいはペプチドのみに占められてはいない化合物であって、かつ薬剤学的に使用することができる化合物をも提供する。実際には、本出願において開示される活性な蛋白質様単位から出発すると、非ペプチドであるか、あるいはペプチドのみに占められてはいず、かつ薬剤学的使用に適合する、ｒａｓ蛋白質依存的シグナル経路を阻害する分子を作成することが可能である。これに関連して、本発明は、非ペプチドであるか、あるいはペプチドのみに占められてはいず、かつＧＤＰ交換のレベルに関して薬剤学的に活性である分子の、その活性のために重要である上述のポリペプチドの構成成分の決定、および非ペプチドであるか、あるいはペプチドのみに占められない構造によるこれらの成分の再構成による調製について、先に記載されているような本発明のポリペプチドの利用法に関する。本発明の主題は、このように調製した、ひとつもしくは複数の分子を含んでなる薬剤学的組成物でもある。
本発明の主題は、先に特定されているポリペプチドをコードする任意の核酸配列でもある。当配列は、
（ａ）配列番号１、５、もしくは７の配列、あるいはそれらの相補鎖の、全てもしくは一部分、
（ｂ）配列（ａ）とハイブリッド形成を行い、かつ本発明に従うポリペプチドをコードする任意の配列、および
（ｃ）遺伝子コードの縮重の結果として、（ａ）および（ｂ）の配列から取得される配列、
から選択されることがより好ましい。
本発明のいろいろなヌクレオチド配列は、人工的な起源のもの、もしくはそれとは別のものであることができる。それらはゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡの配列、ハイブリッド配列、あるいは合成的もしくは半合成的配列であることができる。これらの配列は、例えば、配列番号１、５、もしくは７の配列を基にして作製したプローブによる、ＤＮＡライブラリー（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー）のスクリーニングにより取得することができる。このようなライブラリーは、いろいろな起源の細胞から、当業者に知られている分子生物学の標準的な技術により調製することができる。本発明のヌクレオチド配列は、特に、ホスホルアミダイト法に従う化学合成により、あるいは別の方法として、ライブラリーのスクリーニングにより取得される配列の、化学的もしくは酵素的改変を初めとする混成方法により調製することもできる。
本発明に記載のこれらのヌクレオチド配列を薬剤学的分野において使用することができるが、それは、遺伝子治療という面における、本発明のペプチドのインビトロでの産生のため、もしくはアンチセンス配列の産生のため、もしくは本発明のペプチドの産生のため、あるいはそれとは別に、生物学的試料中に含まれる、増幅された、突然変異を生じた、もしくは再構成されたＧＤＰ交換因子の発現もしくは過剰発現の、ハイブリッド形成実験による検出および診断のため、もしくは他の細胞起源からの相同配列の単離のための使用法のようなものである。
本発明のペプチドの産生のために、先に特定される核酸配列配列は、一般的に、細胞宿主内においてそれらの発現を可能にするシグナルの調節下に置かれている。これらのシグナル（プロモーター、ターミネーター、および、分泌用リーダー配列など）の選択は、使用する細胞宿主に従って異なることがある。本発明のこれらのヌクレオチド配列が、自律的に複製することができるベクター、もしくは組み込みベクターの一部を形成することが好ましい。より特定的には、自律的に複製するベクターは、選択した宿主内において自律的な複製を示す配列を使用して調製することができる。組み込みベクターの方は、例えば、相同組換えによりベクターの組み込みを可能にする宿主ゲノムの特定領域に対して相同な配列を使用してこれを調製することができる。
本発明のペプチドの産生のために使用することができる細胞宿主は、真核細胞宿主もしくは原核細胞宿主のいずれでもかまわない。適切である真核細胞宿主では、動物細胞、酵母、もしくは新菌類を挙げることができる。特に、酵母に関しては、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シュワニオミセス（Ｓｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、もしくはハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属を挙げることができる。動物細胞に関しては、ＣＯＳ、ＣＨＯ、および、Ｃ１２７細胞などを挙げることができる。新菌類では、アスペルギルス エスエスピー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｓｐ．）、もしくはトリコデルマ エスエスピー（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｓｐ．）をより特別に挙げることができる。原核細胞宿主としては、以下に記載する細菌、つまり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、もしくはストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）を使用することが好ましい。
本発明に従う核酸配列を、薬剤学的試薬として使用することができる、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくは遺伝子のアンチセンス配列の産生のために使用することもできる。アンチセンス配列による特定の発癌遺伝子の発現の阻害は、これらの発癌遺伝子の役割を理解する上での有用な手法であり、かつ抗癌剤治療法の開発における特に有望な研究法であることが判っている。アンチセンス配列は、特定の遺伝子のコーディング鎖に対して相補的であり、かつその結果として、転写されたｍＲＮＡに特異的にハイブリッド形成して、そのｍＲＮＡが蛋白質へと翻訳されるのを阻害することができる小さなサイズのオリゴヌクレオチドである。従って、本発明の目的は、少なくとも部分的に、ｐ２１−ＧＤＰ複合体によるＧＤＰの交換を刺激化するペプチドの産生を阻害することができるアンチセンス配列である。このような配列は、先に特定される核酸配列のすべてもしくは一部分からなることができる。それらは一般的に、ＧＤＰ交換を刺激化するペプチドをコードする配列に対して相補的な配列、もしくは、そのような配列の断片である。このようなオリゴヌクレオチドは、フラグメント化などにより配列番号１、５、もしくは、７の配列から、あるいは、化学合成により取得することができる。このような配列を、遺伝子治療という面において、ｒａｓ蛋白質によるＧＤＰの交換のレベルを調節することができるアンチセンス配列もしくはペプチドの、転移もしくはインビボでの発現のために使用することができる。これに関連して、この配列を、ベクター、特に、ウイルス起源のベクター内に取り込ませることができる。
本発明は、ヌクレオチド配列として、本発明のペプチドをコードする、先に特定されるヌクレオチド配列と、もしくはそれに相関するｍＲＮＡと、ハイブリッド形成することができる、合成もしくはその他のヌクレオチドプローブにも関する。このようなプローブは、ＧＤＰ交換因子の発現の検出のため、もしくは別の方法として、遺伝子異常（スプライシングの誤り、多形性、および、点突然変異など）の証明のための、診断手段としてインビトロにおいて用いることができる。このようなプローブはあらかじめラベル化しておく必要があり、そしてこの目的のためのいろいろな技術が当業者に知られている。これらのプローブを使用することができるハイブリッド形成条件は、緊縮性の通常の条件である（特に、以下の一般的なクローニング技術、およびに、実施例を参照せよ）。これらのプローブを、実施例に説明してあるような他の細胞起源から、本発明のペプチドをコードする相同核酸配列を証明および単離するために使用することもできる。
本発明の主題は、先に特定される少なくとも一つのペプチドを活性素因として含んでなる任意の薬剤学的組成物でもある。
本発明の主題は、先に特定される少なくとも一つの抗体および／または抗体断片を活性成分として含んでなる任意の薬剤学的組成物、ならびに、先に特定される少なくとも一つのヌクレオチド配列を活性成分として含んでなる任意の薬剤学的組成物でもある。
その上、本発明の目的は、先に特定されるペプチド、抗体、および、ヌクレオチド配列が、もう一つの、あるいは、他の活性成分と組合わさっている、薬剤学的組成物でもある。
本発明に記載の薬剤学的組成物を使用して、ｐ２１蛋白質の活性化を調節することができ、そしてその結果、特定の細胞の種類の増殖を調節することができる。より特定的には、これらの薬剤学的組成物は、癌の治療を意図する。実際、多くの癌が、発癌性ｒａｓ蛋白質の存在に関連している。最も頻繁に突然変異を生じているｒａｓ遺伝子を含む癌の内でも、特に、９０％は第１２番目のコドン上で突然変異を生じたＫｉ−ｒａｓ発癌遺伝子を有している膵臓の腺癌「Ａｌｍｏｇｕｅｒａ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ ５３（１９８８）５４９］、大腸の腺癌および甲状腺の癌（５０％）、もしくは、肺の癌腫および骨髄性白血病［３０％、Ｂｏｓ、Ｊ．Ｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４９（１９８９）４６８２］を挙げることができる。
本発明の主題は、ｐ２１蛋白質の活性を調節するための、先に特定される分子の利用でもある。特に、本発明は、ｐ２１蛋白質の活性化を少なくとも部分的に阻害するこれらの分子の利用に関する。
本発明はまた、生物学的試料中に含まれるｒａｓ遺伝子の発現および／または過剰発現の検出のための方法を提供する。このような方法は、例えば、このような試料の本発明に記載の抗体もしくは抗体断片との接触、この抗原−抗体複合体の可視化、および標準試料を使用して得られる結果の比較を含んでなる。このような方法においては、抗体は、懸濁液中に含まれるか、或いは支持体上にあらかじめ固定化されていることができる。この方法はまた、試料の本発明に記載のヌクレオチドプローブとの接触、取得されるハイブリッドの証明、および標準試料の場合において取得されるものとの比較を含んでなることもできる。
本発明は、治療分野において使用することができるが、それは、本発明のペプチド、抗体、およびヌクレオチド配列がｒａｓ遺伝子の活性化を調節することができるために、実際、それらが、癌の発生過程に介在することを可能にするためである。実施例において説明されるように、本発明のヌクレオチド配列は、特に、ｃｄｃ２５突然変異を保持する酵母の温度感受性を補足することができるペプチドを発現することを可能にする。これらはまた、ＲＡＳ２ｔｓ優性突然変異を抑制することができるペプチドを発現することを可能にもし、このことにより、ｐ２１蛋白質に関する相互作用についての、ＣＤＣ２５遺伝子の正常発現産物との競合を証明している。本発明はまた、本発明の抗体およびヌクレオチドプローブが、実際、ｒａｓ遺伝子が関与している癌の同定を可能にするために、癌の診断および型別の分野において利用すること、ならびに、正常もしくは発癌性ｒａｓ遺伝子の過剰発現に関連する癌の診断の分野においても使用することができる。
本発明の他の利点は、以下に示す実施例を読むことにより明白になるものと思われるが、これらの実施例は説明として考慮されるべきであり、制限として考慮すべきものではない。
図面の説明
図１：転移活性化テスト：この図は、縦座標として、形質転換のために使用したｃＤＮＡ配列に関する、組換えＣＨＯ株のＣＡＴ活性のレベル（バックグラウンドに対する比較％）を示す。
図２：ＧＴＰ交換活性のテスト：この図は、縦座標として、形質転換のために使用したｃＤＮＡ配列に関する、組換えＣＨＯ株のｐ２１−ＧＤＰ／ｐ２１−ＧＴＰ形態の比率を示す。
図３：インビトロでのＧＤＰ交換活性のテスト：この図は、時間および本発明のペプチドの２つの濃度について、ｐ２１蛋白質に結合したままになっているＧＤＰの比率の減少を示す。
一般的なクローニング技術
プラスミドＤＮＡの予備抽出、塩化セシウム濃度勾配中におけるプラスミドＤＮＡの遠心処理、アガロースゲルもしくはアクリルアミドゲル電気泳動、エレクトロエリューションによるＤＮＡ断片の精製、フェノールもしくはフェノール／クロロホルムでの蛋白質抽出、食塩水培地中に含まれるＤＮＡのエタノールもしくはイソプロパノール沈殿、および、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における形質転換などのような分子生物学において因習的に使用される方法は当業者に良く知られており、そして刊行物中において詳細に説明されている［Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ． ｅｔ ａｌ．、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８２；Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）、”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８７］。
制限酵素は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｉｏｌａｂｓ）社、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＢＲＬ）社、もしくは、Ａｍｅｒｓｈａｍ社から供給され、そして、供給元の勧告に従って使用した。
ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ、λｇｔ１１、および、ｐＧＥＸ ２Ｔタイプのプラスミド、およびＭ１３シリーズのファージは、市販品の源のものを使用する。
連結反応については、ＤＮＡ断片を、アガースもしくはアクリルアミドゲル電気泳動によりサイズに従って分離し、フェノールもしくはフェノール／クロロホルム混合物で抽出し、エタノールで沈殿させ、そしてその後、供給元の勧告に従ってファージＴ４のＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下においてインキュベートする。
５’突出端の補充は、供給元の勧告に従って、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片（Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して行う。３’突出端の破壊は、供給元の勧告に従ってファージＴ４のＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下において行う。５’突出端の破壊は、Ｓ１ヌクレオアーゼでの管理条件下での処理により行う。
合成オリゴヌクレオチドによるインビトロでの突然変異誘発は、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．により開発された方法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３（１９８５）８７４９−８７６４］に従って、Ａｍｅｒｓｈａｍ社により配給されるキットを使用して実行する。
いわゆるＰＣＲ［ポリメラーゼにより触媒される連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０（１９８５）１３５０−１３５４；Ｍｕｌｌｉｓ Ｋ．Ｂ． ａｎｄ Ｆａｌｏｏｎａ Ｆ．Ａ．、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍ． １５５（１９８７）３３５−３５０］技術によるＤＮＡ断片の酵素的増幅は、供給元の勧告に従う「ＤＮＡサーマルサイクラー」（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社）を使用して行う。
ヌクレオチド配列の実証は、Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．により開発された方法［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、７４（１９７７）５４６３−５４６７］により、Ａｍｅｒｓｈａｍ社により配給されるキットを使用して実行する
ハイブリッド形成実験のためには、緊縮性の通常の条件は、一般的には、以下に示すものであり、それは、ハイブリッド形成：６５℃下、５×デンハート溶液の存在下における３×ＳＣＣ、洗浄：６５℃下、０．５×ＳＳＣ、である。
１．ヒトのＧＤＰ交換因子（ｈＧＲＦ）遺伝子の単離
ベクターλｇｔ１１［Ｓｋｏｌｎｉｋ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ ６５（１９９１）８３］中において作製したヒトの脳のライブラリーの５×１０5のファージを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、および、Ｍａｎｉａｔｉｓにより記載される技術（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；１９８９）に従ってスクリーニングした。
このライブラリーのスクリーニングのために使用したプローブは、32Ｐでラベル化してある１３７塩基対のヒトのｃＤＮＡ断片である。このプローブは、プライマーとして、以下に示す縮重オリゴヌクレオチドを使用する、前述のライブラリーの総ＤＮＡについてのＰＣＲにより調整し、それらの縮重オリゴヌクレオチドは、その断片の３’端のオリゴヌクレオチド（配列番号１１）については、
その断片の５’端のオリゴヌクレオチド（配列番号１２）については、
このプローブは、ＦｅｉｎｂｅｒｇおよびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３７（１９８４）２６６］の技術に従うランダムプライミングにより32Ｐでラベル化し、そして、ＰＣＲ反応は、一般的なクローニング技術において記載した条件下において、約４０℃下で実行した。
このプローブを使用するハイブリッド形成により取得されるいろいろな陽性クローンの内、あるものは、Ｈａ−Ｒａｓに関する交換活性を保持する読み取り枠全体を含んでいる。
このλｇｔ１１クローンは、Ｍ１３ｍｐ１８ベクターの相関する部位において、ＥｃｏＲＩ断片の形態において取り込まれている３−ｋｂのｃＤＮＡを保持している。その後、このｃＤＮＡを、市販の「リバース」および「−２０」プライマーを使用し、そしてさらに、Ｓａｎｇｅｒ技術（一般的なクローニング技術を参照せよ）に従う特異的オリゴヌクレオチドも使用して配列決定を行った。
そのようにして取得される断片により保持されるヒトのＧＤＰ交換因子遺伝子のヌクレオチド配列を、配列番号１の配列において、演繹されるペプチド配列（配列番号２、３、および、４）と一緒に示した。
２．サブフラグメントの調製
このようにして取得された遺伝子のいろいろな誘導体もしくは断片は、特に、本発明のペプチドの発現のために、調製および使用することができる。特に、以下に示す断片を、酵素開裂により調製し、そして電気溶出により分離するが、それらの断片は、
−交換因子をコードする領域の一部（ヌクレオチド９３６から停止コドンまで）、およびに、その断片の３’非コーディング領域を含んでなるＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片、
−交換因子をコードする領域の一部（ヌクレオチド９１０から停止コドンまで）、およびに、その断片の３’非コーディング領域を含んでなるＥｃｏＮＩ−ＥｃｏｒＩ断片、
−交換因子をコードする領域の一部（ヌクレオチド６３８から停止コドンまで）、およびに、その断片の３’非コーティング領域を含んでなるＥａｇＩ−ＥｃｏＲＩ断片、
−交換因子をコードする領域の一部（ヌクレオチド８８から停止コドンまで）、およびに、その断片の３’非コーティング領域を含んでなるＢａｌＩ−ＥｃｏＲＩ断片、ならびに、
−交換因子をコードする領域の一部（ヌクレオチド１９６から停止コドンまで）、およびに、その断片の３’非コーティング領域を含んでなるＮａｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片、
である。
これらの断片により保持される３’非コーディング領域は二次的に重要なものであり、そしてヌクレアーゼ、あるいはその停止コドンの約３０ｂｐ後に開裂部位が位置する、特に、ＳｍａＩのような、停止コドンに近い開裂部位を有する酵素での開裂、のいずれかにより除去することができる、ということを了解事項とする。
また、特に、Ｃ−末端部分全体をコードする領域を含んでいる訳ではない断片、ならびに突然変異、置換、添加、もしくは化学的および／または遺伝子的性質の改変により取得されるこれらの断片の誘導体のような、他の断片も調製することができることも了解事項とする。
３．生物学的特性決定
本発明に従うペプチドの機能性を、
−哺乳類細胞中、
−サッカロミセス セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中、そうでなければ、
−組換えＨａ−Ｒａｓ蛋白質についてインビトロで、
テストした。
３．１．哺乳類細胞中における機能の亢進については、例えば、実施例２において記載のもののような、本発明のペプチドをコードするＤＮＡ配列を、Ｃａｍｏｎｉｓ ｅｔ ａｌ．［Ｇｅｎｅ ８６（１９９０）２６３］により記載されている、ベクターｐＣｙｍ１中におけるＳＶ４０の初期プロモーターの調節下に配置させることができる。
この例においては、実施例２において記載のＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＮＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、このベクター内に挿入した。
このようにして取得されるベクターを、Ｒｅｙ ｅｔ ａｌ．［Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６（１９９１）３４７］により記載される計画に従うＣＨＯ細胞内へのトランジエントトランスフェクションによりテストした。
このような方法において、機能性の２つの基準を調査したが、それらの基準とは、
−この場合、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ遺伝子）をコードする細菌性遺伝子である、レポーター遺伝子の発現を調節しているプロモーターを転移活性化させるベクターの能力、
−トランスフェクトされたＣＨＯ細胞のＲａｓ蛋白質に、ＧＴＰを結合させることを促進するそれらの能力、
である。
ａ）転移活性化テストについては、５０％の濃度のＣＨＯ細胞を、一方では、マウスのチミジンキナーゼ遺伝子のプロモーター、および、ポリオーマウイルスのエンハンサーから得られる４つのＰＥＡ１反復成分よりなる合成プロモーターの調節下あるＣＡＴ遺伝子を保持する０．５μｇのベクターで［Ｗａｓｙｌｙｋ ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊ． ７（１９８８）２４７５］、そして、もう一方では、ＳＶ４０の初期プロモーターの調節下にある、非コーディングｃＤＮＡ（ライン１）、正常なＨａ−ＲａｓのｃＤＮＡ（ライン２）、位置１２（Ｖａｌ１２）に存在する活性化されたＨａ−ＲａｓのｃＤＮＡ（ライン３）、先に引用したＲｅｙ ｅｔ ａｌ．により記載される、ＳＤＣ２５のｃＤＮＡの３’端（ライン４）、および、先に記載の、本発明に従うペプチドをコードするｃＤＮＡ（ライン５）を保持する４．５μｇの発現ベクターで、トランスフェクトさせた（例えば、Ｓｃｈｗｅｉｇｈｏｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、ｉｎ ｐｒｅｓｓ、により記載の計画を参照せよ）。
結果を図１に示した。ライン１は基準値の活性化に相当し、ライン３（ＰＳｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片について取得された：ＣＤＣ ｈｕｍ．）は、本発明のペプチドの発現により、調査した合成プロモーターの転移活性化が可能になることを示している。
同じ定量的結果が、調査を行った他の断片について取得された。
ｂ）この転移活性化が、ＣＨＯ細胞のｒａｓ蛋白質へのヌクレオチドの結合を実際に伴うということを立証するために、32Ｐでラベル化したオルトリン酸を培養培地に添加して、同一のトランジエントトランスフェクションを行った。
このラベル化計画、ならびに、細胞性のｒａｓ蛋白質の免疫沈降のための計画は、先に引用したＲｅｙ ｅｔ ａｌ．により記載されている。取得された結果を図２に示した。それらは、本発明のペプチドは、ｒａｓ蛋白質によるＧＤＰの交換のレベルを調節することができることを示しているが、それは、それらの内の幾つかのもの（先に記載のＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片により発現されるペプチドＣＤＣ Ｈｕｍ．）が、Ｙ１３−２５９抗体で免疫沈降させたＣＨＯ細胞のｒａｓ蛋白質のＧＴＰとの結合を促進することができるためである。
３．２．本発明のペプチドは、Ｓ．セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｂｉｓｉａｅ）のｃｄｃ２５-イーストにおける機能性についてもテストを行った。この目的のために、シャトルベクターである、先に記載の（３．１．）ベクターを、イースト株ＯＬ９７−１−１１Ｂ内に取り込ませた［Ｃａｍｏｎｉｓ ａｎｄ Ｊａｃｑｕｅｔ、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８（１９８８）２９８０］。取得された結果により、本発明に記載のｃＤＮＡ断片は、３６℃におけるこの株の生育欠損を補うことができるペプチドをコードしていることが示されている。従って、これらの結果は、これらの断片が、Ｓ．セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｂｉｓｉａｅ）内においてインビボで機能を発揮するペプチドをコードしていることを示している。
３．３．精製したＨａ−Ｒａｓ蛋白質に関するＧＤＰの交換を促進させることができるペプチドをコードする、本発明のＤＮＡ配列の能力を、Ｒｅｙ ｅｔ ａｌ． ［Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． ＢＩｏｌ． ９（１９８９）３９０４］により記載されている計画に従って、インビトロにおいても証明した。
この目的のために、本発明の配列を、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ［Ｇｅｎｅ ６７（１９８８）３１］により記載されている技術に従って、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白質の形態において、大腸菌株ＴＧ１内において発現させる。この目的のために、先の３．１．において記載されているいろいろなＤＮＡ断片を、ＧＳＴをコードするｃＤＮＡの３’端、および、その読み取り枠内に存在するベクターｐＧＥＸ ２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）内に、ＳｍａＩ−ＥｃｏＲＩ断片の形態でクローン化させた。このＳｍａＩ−ＥｃｏＲＩ断片は、リガーゼによるアダプターの添加により取得される。その後、このようにして取得されたベクターを使用して、大腸菌株ＴＧ１を形質転換させる。このように形質転換させた細胞を、３７℃において一晩予備培養を行い、ＬＢ培地内で１／１０に希釈し、発現を誘導させるためにＩＰＴＧを添加し（２時間、２５℃）、そしてその後、２５℃において約２１時間培養する。その後、細胞を溶菌させ、そして、産生された融合蛋白質を、アガロース−ＧＳＨカラムにおける親和性により精製する。この目的のために、細菌の溶菌液を、４℃において１５分間、ゲル（溶菌緩衝液を用いて調製および平衡化させてある）の存在下においてインキュベートする。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４で３度洗浄した後、この蛋白質を、過剰量のＧＳＨを含む、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．７の存在下において溶出させる。上清を回収し、そして、遠心処理にかける。
その後、精製したＨａ−Ｒａｓ蛋白質に関する、本発明のペプチドのＧＤＰ交換活性を、Ｒｅｙ ｅｔ ａｌ．（先に引用したＭｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）により記載されている計画に従ってインビトロにおいて証明した。得られた結果を図３に示す。それらは、特に、先に記載のＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩにより発現されるＣＤＣ ｈｕｍ配列に相当する本発明のペプチドは、ＧＤＰ交換を刺激化することを示している。
４．相同配列の証明
図１に示す核酸配列に対して相同な核酸配列を、以下に示す２つの異なる手法により証明した。
−一般的なクローニング技術において記載の条件下における、胎盤のｍＲＮＡから新しく合成したｃＤＮＡについて、配列番号１の配列と、ＳＯＳ蛋白質の配列［Ｂｏｎｆｉｎｉ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５（１９９２）６０３］との間に保存されている配列を覆うために選択した縮重オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用するＰＣＲによる手法。
−32Ｐでラベル化した配列番号１の配列の全体からなるプローブを使用する胎盤のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによる手法。５０℃下、５×ＳＳＣ、５×デンハート培地中におけるハイブリッド形成、その後に続く、５０℃下、２×ＳＳＣ培地中における洗浄を含んでなるこのスクリーニングは、低緊縮性の条件下において実行した。
これらの２つの手法により、配列番号１の配列に対して相同である配列が明らかにされた。これらの配列は、簡単に、単離および特性を決定を行うことができる。これらは、ｐ２１−ＧＤＰ複合体に関するＧＤＰの交換のレベルを調節することができるペプチド（あるいは、それらの断片もしくは誘導体）をコードする場合、本発明の目的のための核酸配列を構成している。
特に、この手法により、胎盤のｍＲＮＡから、そして、オリゴヌクレオチドであるｏｌｉｇｏ ２４４９（配列番号９）、および、ｏｌｉｇｏ ２４５１（配列番号１０）、ｈＳＯＳ１およびｈＳＯＳ２と表示される因子をコードする２つのｃＤＮＡを使用して、各々、配列番号５および配列番号７に示される部分的配列を同定することが可能となった。これらの因子に相関するｍＲＮＡは探索を行ったすべての組織内に存在するが、それとは対照的に、実施例１において記載される因子は、脳にのみ存在することが明らかになっている。これらの遺伝子の染色体上における位置決定を行い、そして、以下に示す結果を取得した。
−ｈ−ＧＲＦ：１５ｑ２．４．
−ｈ−ＳＯＳ１：４ｑ２．１．
−ｈ−ＳＯＳ２：１４ｑ２．２．
５．他の組織内に存在するｈ−ＧＲＦタイプの交換因子のためのテスト
抗−ｈ−ＧＲＦ抗体は、配列番号４に示したｈ−ＧＲＦ因子の、残基２１１と４８９との間に位置する２８０アミノ酸の断片に相当する抗原で免疫化することにより、ウサギにおいて調製した。
これらの抗体により、明白な分子量３０、５５、７５、９５、および、１４０ｋＤａの蛋白質を、ＥＬＩＳＡにより、ヒトの皮質および脳前駆体細胞内において検出することができた。分子量の多様性により、多重性ｃＤＮＡの存在が示唆されている。ｈ−ＧＲＦ抗体をｈ−ＧＲＦとあらかじめインキュベーションさせておくと、同定された蛋白質の検出が消失し、これにより、シグナルの特異性が証明された。
配 列 表
（１）一般的な情報
（ｉ）出願者
（Ａ）氏名：ＲＨＯＮＥ−ＰＯＵＬＥＮＣ ＲＯＲＥＲ Ｓ．Ａ．
（Ｂ）街路名：２０、ａｖｅｎｕｅ Ｒａｙｍｏｎｄ ＡＲＯＮ
（Ｃ）市：ＡＮＴＯＮＹ
（Ｅ）国：ＦＲＡＮＣＥ
（Ｆ）郵便番号：９２１６５
（ii）発明の名称：ｒａｓ蛋白質の活性を阻害するペプチド、調製法、および、使用法
（iii）配列数：１２
（iv）コンピューター解読形態：
（Ａ）メディウムの種類：テープ
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ
（Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェアー：ＰａｔｅｎｔＩｎ Ｒｅｌｅａｓｅ ＃１．０、Ｖｅｒｓｉｏｎ ＃１．２５（ＥＰＯ）
（２）配列番号１についての情報
（ｉ）配列の性質
（Ａ）配列の長さ：２６５２
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：ＮＯ
（iii）アンチセンス：ＮＯ
（ix）配列の特徴
（Ａ）名称／略称：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１．．．２４４５
（ix）配列の特徴
（Ａ）名称／略称：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：４４５．．．２４４５（配列番号３）
（ix）配列の特徴
（Ａ）名称／略称：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：９７６．．．２４４５（配列番号４）
（xi）配列：配列番号１：
（ｉ）配列の性質
（Ａ）配列の長さ：８１４
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（xi）配列：配列番号２：
（ｉ）配列の性質
（Ａ）配列の長さ：６６６
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（xi）配列：配列番号３：
（ｉ）配列の性質
（Ａ）配列の長さ：４８９
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（xi）配列：配列番号４：
（ｉ）配列の性質
（Ａ）配列の長さ１０９２
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：ＮＯ
（iii）アンチセンス：ＮＯ
（ix）配列の特徴
（Ａ）名称／略称：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１．．．１０９２
（xi）配列：配列番号５：
（ｉ）配列の性質
（Ａ）配列の長さ：３６４
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（xi）配列：配列番号６：
（ｉ）配列の性質
（Ａ）配列の長さ：１９５６
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：ＮＯ
（iii）アンチセンス：ＮＯ
（ix）配列の特徴
（Ａ）名称／略称：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１．．．１９５６
（xi）配列：配列番号７：
（ｉ）配列の性質
（Ａ）配列の長さ：６５２
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：蛋白質
（xi）配列：配列番号８：
（ｉ）配列の性質
（Ａ）配列の長さ：４１
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：ＮＯ
（iii）アンチセンス：ＮＯ
（xi）配列：配列番号９：
（ｉ）配列の性質
（Ａ）配列の長さ：３４
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：ＮＯ
（iii）アンチセンス：ＮＯ
（xi）配列：配列番号１０：
（ｉ）配列の性質
（Ａ）配列の長さ：３３
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：ＮＯ
（iii）アンチセンス：ＮＯ
（xi）配列：配列番号１１：
（ｉ）配列の性質
（Ａ）配列の長さ：２７
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル配列：ＮＯ
（iii）アンチセンス：ＮＯ
（xi）配列：配列番号１２：
Claims (14)
- ｐ２１−ＧＤＰ複合体によるＧＤＰの交換レベルを調節することができ、配列番号２、３もしくは４の配列の、すべてもしくは一部分からなるペプチド。
- ｐ２１−ＧＤＰ複合体に関するＧＤＰの交換の速度を低減もしくは阻害するという特徴を有する、請求項１に記載のペプチド。
- 配列番号２、３もしくは４の配列のペプチド。
- 請求項１〜３の内のいずれかに記載のペプチドに対する抗体もしくは抗体断片。
- 配列番号１のペプチド配列に対するものであることを特徴とする、請求項４に記載の抗体もしくは抗体断片。
- ｐ２１−ＧＤＰ複合体によるＧＤＰの交換を少なくとも部分的に阻害する能力を保持することを特徴とする、請求項５に記載の抗体もしくは抗体断片。
- 請求項１〜３の内のいずれかにおいて特定されるペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- （ａ）配列番号１の配列、あるいはそれらの相補鎖の、すべてもしくは一部分、
（ｂ）配列（ａ）とハイブリッド形成し、かつ、ｐ２１−ＧＤＰ複合体によるＧＤＰの交換レベルを調節することができるポリペプチドをコードする、任意の配列、ならびに
（ｃ）遺伝子コードの縮重の結果、配列（ａ）および（ｂ）から得られる配列、
から選択される配列を持つことを特徴とする、請求項７に記載のポリヌクレオチド。 - 配列番号１の塩基配列のポリヌクレオチド、あるいはそれに相関するｍＲＮＡと、ハイブリッド形成することができるポリヌクレオチド。
- ＧＤＰ交換因子の検出のための、あるいは遺伝子異常（スプライシングの違り、多形性、点突然変異）の証明のための、請求項９に記載のポリヌクレオチドの使用方法。
- 非ペプチドであるか、あるいはペプチドのみに占められてはおらず、かつ、ｐ２１−ＧＤＰ複合体によるＧＤＰの交換のレベルを調節することができる化合物の、その活性のために重要であるこのペプチドの構成要素の決定、および非ペプチドであるか、あるいはペプチドのみに占められてはいない構造によるこの要素の再構成による産生のための、請求項１〜３の内のいずれかに記載のペプチドの使用方法。
- 生物学的試料中に含まれる、増幅された、突然変異を生じた、もしくは再構成したＧＤＰ交換因子の、発現および／または過剰発現の検出のための、請求項４〜６までの内の一つに記載の抗体もしくは抗体断片、および／または請求項９に記載のポリヌクレオチドの使用方法。
- 癌の型別のための、請求項４〜６の内の一つに記載の抗体もしくは抗体断片、および／または請求項９に記載のポリヌクレオチドの使用方法。
- 請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む細胞を、当該配列の発現のための条件下において培養し、そして産生されたペプチドを回収することを特徴とする、請求項１〜３の内のいずれかに記載のペプチドを調製するための方法。
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