JP3681384B2 - Gdp交換因子活性を有するペプチド,それらのペプチドをコードする核酸配列,調製法,およびに,使用 - Google Patents
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Description
一般的にp21と表示されるras遺伝子の産物は、それらが調査されているすべての真核生物における細胞分裂の調節における要所となる役割を担っている。これらの蛋白質に幾つかの特異的改変を行うことにより、これらは正常な調節機能を失い、そして、それらを発癌性へと導く。従って、ヒトについての多数の癌が、改変を生じたras遺伝子の存在に関連している。同様に、これらのp21蛋白質の過剰発現の結果、細胞増殖の妨害を生じることがある。従って、細胞内におけるこれらp21蛋白質の厳密な役割、それらの機能様式、および、それらの特性を理解することは、発癌に対する治療研究法を理解することと密接にかかわっている。
インビボにおいては、p21蛋白質の活性化の原因となることがらの厳密な性質は明らかにされていない。それらは、2つの確立した状態、つまり、GDPに結合している不活性形態と、GTPに結合している活性形態との間を彷徨することにより、それらの機能を働かせることが知られているが、これらの2つの形態の間のトランジションに影響を与える因子ははっきりとは同定されいない。最近の研究より、GTPに結合しているras蛋白質の比率が細胞中で増大しているという生理学的状況が報告されている。これらのに状況は、EGFおよびPDGFを含む成長因子による、Tリンパ球の活性化、および、3T3繊維芽細胞の刺激化が含まれている(Downward et al.、Nature 346(1990)719;Gibbs et al.、J. Biol. Chem. 265(1990)20437)。p21−GTPの比率の増大は、少なくとも部分的には、形質導入のG蛋白質のレセプターのものに類似する役割を担っている蛋白質の作用により説明することができる。これに関連して、p21蛋白質によるGDPの交換を促進することができる幾つかの蛋白質が、雄牛の脳[West et al.、FEBS Lett. 259(1990)245]、および、ラットの脳[Wolfman and Macara、Science 248(1990)67]より同定されている。これらの因子の細胞部位が異なっていること、およびそれらの取得された実験条件がひどく異なっていることより、それらは異なる蛋白質であることが示唆されている。それらは、正常なras蛋白質についても、発癌性のras蛋白質についてと同様に活性を示す。これらの活性は、用語GEP、つまり、グアニジンヌクレオチド交換因子、もしくは、GRFの名の下に、同じ分類上のものとされる。
サッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)酵母においては、GRF活性は、CDC25遺伝子の産生[Camonis et al.、EMBO J. 5(1986)375]に起因するものであり、そして、一方では、CDC25、RAS1、および、RAS2遺伝子の産物に、そしてもう一方では、サッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)酵母におけるアデニルシクラーゼに関与するシグナル経路を理解する目的の研究が行われている。特に、多くの研究が、この関連の中でも最も情報が少ない成分である、CD25遺伝子の産物の性質決定に焦点を注いでいる。CDC25遺伝子の産物は、酵母においてp21の活性化を誘導するカスケード反応における最も上流に位置する成分を構成している。この分野において行われている研究は、この遺伝子が、ras蛋白質を活性化するためのGDP→GTP交換因子として作用するに違いないことを証明することに寄与している。S.セレビジアエ (S.cerevisiae)酵母の2番目の遺伝子であるSDC25は、構造上CDC25においてp21非常に密接に関連しているが、この遺伝子が単離され、そして、その性質が決定されている。SDC25の活性ドメインは、ras蛋白質に、インビトロで、および、インビボで作用することができる交換因子であるように思われる。このドメインは、記載されている最初の分子構成物を構成しており、それがこの活性を付与している。
つい最近、GRFタイプの蛋白質も、マウスにおいて証明された[Vanoni and Martegani、 J. Cell. Bioch. Suppl. 168(1992)220]。
しかしながら、今のところ、ヒトにおいて単離され、そして性質が決定されているGRF活性は存在しない。本発明は、具体的に、ヒトのGDP交換因子の存在についての、本出願者により証明された結果である。本発明は、より特定的には、ヒト起源のもので、hGRFおよびhSOSと表示される、p21蛋白質の活性化の状態を変化させることができるペプチドおよびヌクレオチド配列の同定、単離、および性質決定の結果である。
従って、本発明の第一の態様は、薬剤学的に使用することができるペプチドからなる。より特定的には、本発明の目的は、p21−GDP複合体によるGDPの交換レベルを変化させることができるペプチドである。p21は、正常もしくは発癌性ras遺伝子のいずれかの発現産物を表すことが了解されている。
より特定的には、本発明のペプチドは、配列番号2、3、4、6もしくは8の配列、あるいはこれらの配列の誘導体の配列の、すべてもしくは一部分から選択される。
本発明の目的について、誘導体という用語は、これらの配列の、遺伝子および/または化学的性質の改変により取得され、かつ、所期の活性を保持している任意の分子を表わす。遺伝子および/または化学的性質の改変は、一つもしくは複数の残基の、任意の突然変異、置換、欠損、付加、および/または改変を意味することを了解事項とする。このような誘導体は、特に、相互作用部位についてのペプチドの親和性を増大させる、産生のレベルを改良する、プロテアーゼに対する耐性を増加させる、治療的効果を増大させる、もしくは副作用を低下させるか、あるいは新しい薬物動態的および/または生物学的特性を付与することのようないろいろな目的のために作成することができる。
本発明のある特定な態様においては、本発明のペプチドは、p21−GDP複合体によるGDPの交換を刺激化することができるペプチドである。
本発明の別の特定の態様においては、本発明のペプチドは、p21−GDP複合体によるGDPの交換の速度を低減させるか、もしくは阻害することができるペプチドである。このようなペプチドは、p21−GDP複合体によるGDP交換因子の相互作用に拮抗することができるペプチドであることが好ましい。従って、それらは先に記載した配列、あるいはそれらの誘導体の断片であることができる。このような断片は、いろいろな方法で作成することができる。特に、それらは本出願において与えられる配列に基づいて、当業者に知られているペプチドの合成法を用いて、化学的に合成することができる。それらは所期のペプチドをコードするヌクレオチド配列の細胞宿主内における発現により、遺伝子的に合成することもできる。この場合においては、ヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチド合成機を用い、本出願において与えられるペプチド配列、および遺伝子コードを基にして、化学的に調製することができる。このヌクレオチド配列は、本出願において与えられる配列(配列番号1、5、および7)から、酵素開裂、連結反応、およびクローニングなどにより、当業者に知られている技術に従って、あるいはこれらの配列を基にして作成したプローブでのDNAライブラリーのスクリーニングにより調製することもできる。しかしながら、p21−GDP複合体に関するGDPの交換の速度を緩めるもしくは阻害することができる本発明のペプチドは、p21−GDP複合体に関する交換因子の相互作用の部位に相当する配列を有するペプチドであることもできる。
本発明の他の目的は、先に特定されたペプチドに対するポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、あるいは抗体断片である。このような抗体は、本出願において与えられる教示を考慮して、当業者に知られている方法により作成することができる。特に、これらの抗体は、本発明のペプチドに対する動物の免疫化、血液の回収、および抗体の単離により調製することができる。これらの抗体は、当業者に知られている技術に従うハイブリドーマの調製によっても作成することができる。
本発明の抗体もしくは抗体断片は、p21−GDP複合体による交換因子の相互作用を少なくとも部分的に阻害する能力を所有することがより好ましい。従って、これらを使用して、ras遺伝子産物の活性化の状態を調節することができる。
その上、これらの抗体を使用して、生物学的試料中に含まれるヒトのGDP交換因子を検出および/またはアッセイし、そしてその結果、ras遺伝子の産物の活性化の状態についての情報を提供することもできる。
従って、本発明は、薬剤学的に使用するという観点において有利な生物学的特性を所有する、配列番号2−4、6、および8の配列に由来するペプチド、ならびにそれらのペプチドに対する抗体を作成することを可能にする。GDP交換に関する本発明のいろいろなペプチドおよび抗体の生物学的活性は、実施例において説明されるような、いろいろな方法において評定することができる。
本発明は、非ペプチドであるか、あるいはペプチドのみに占められてはいない化合物であって、かつ薬剤学的に使用することができる化合物をも提供する。実際には、本出願において開示される活性な蛋白質様単位から出発すると、非ペプチドであるか、あるいはペプチドのみに占められてはいず、かつ薬剤学的使用に適合する、ras蛋白質依存的シグナル経路を阻害する分子を作成することが可能である。これに関連して、本発明は、非ペプチドであるか、あるいはペプチドのみに占められてはいず、かつGDP交換のレベルに関して薬剤学的に活性である分子の、その活性のために重要である上述のポリペプチドの構成成分の決定、および非ペプチドであるか、あるいはペプチドのみに占められない構造によるこれらの成分の再構成による調製について、先に記載されているような本発明のポリペプチドの利用法に関する。本発明の主題は、このように調製した、ひとつもしくは複数の分子を含んでなる薬剤学的組成物でもある。
本発明の主題は、先に特定されているポリペプチドをコードする任意の核酸配列でもある。当配列は、
(a)配列番号1、5、もしくは7の配列、あるいはそれらの相補鎖の、全てもしくは一部分、
(b)配列(a)とハイブリッド形成を行い、かつ本発明に従うポリペプチドをコードする任意の配列、および
(c)遺伝子コードの縮重の結果として、(a)および(b)の配列から取得される配列、
から選択されることがより好ましい。
本発明のいろいろなヌクレオチド配列は、人工的な起源のもの、もしくはそれとは別のものであることができる。それらはゲノム、cDNA、RNAの配列、ハイブリッド配列、あるいは合成的もしくは半合成的配列であることができる。これらの配列は、例えば、配列番号1、5、もしくは7の配列を基にして作製したプローブによる、DNAライブラリー(cDNA、ゲノムDNAライブラリー)のスクリーニングにより取得することができる。このようなライブラリーは、いろいろな起源の細胞から、当業者に知られている分子生物学の標準的な技術により調製することができる。本発明のヌクレオチド配列は、特に、ホスホルアミダイト法に従う化学合成により、あるいは別の方法として、ライブラリーのスクリーニングにより取得される配列の、化学的もしくは酵素的改変を初めとする混成方法により調製することもできる。
本発明に記載のこれらのヌクレオチド配列を薬剤学的分野において使用することができるが、それは、遺伝子治療という面における、本発明のペプチドのインビトロでの産生のため、もしくはアンチセンス配列の産生のため、もしくは本発明のペプチドの産生のため、あるいはそれとは別に、生物学的試料中に含まれる、増幅された、突然変異を生じた、もしくは再構成されたGDP交換因子の発現もしくは過剰発現の、ハイブリッド形成実験による検出および診断のため、もしくは他の細胞起源からの相同配列の単離のための使用法のようなものである。
本発明のペプチドの産生のために、先に特定される核酸配列配列は、一般的に、細胞宿主内においてそれらの発現を可能にするシグナルの調節下に置かれている。これらのシグナル(プロモーター、ターミネーター、および、分泌用リーダー配列など)の選択は、使用する細胞宿主に従って異なることがある。本発明のこれらのヌクレオチド配列が、自律的に複製することができるベクター、もしくは組み込みベクターの一部を形成することが好ましい。より特定的には、自律的に複製するベクターは、選択した宿主内において自律的な複製を示す配列を使用して調製することができる。組み込みベクターの方は、例えば、相同組換えによりベクターの組み込みを可能にする宿主ゲノムの特定領域に対して相同な配列を使用してこれを調製することができる。
本発明のペプチドの産生のために使用することができる細胞宿主は、真核細胞宿主もしくは原核細胞宿主のいずれでもかまわない。適切である真核細胞宿主では、動物細胞、酵母、もしくは新菌類を挙げることができる。特に、酵母に関しては、サッカロミセス(Saccharomyces)属、クルイベロミセス(Kluyveromyces)属、ピキア(Pichia)属、シュワニオミセス(Shwanniomyces)属、もしくはハンセヌラ(Hansenula)属を挙げることができる。動物細胞に関しては、COS、CHO、および、C127細胞などを挙げることができる。新菌類では、アスペルギルス エスエスピー(Aspergillus ssp.)、もしくはトリコデルマ エスエスピー(Trichoderma ssp.)をより特別に挙げることができる。原核細胞宿主としては、以下に記載する細菌、つまり、大腸菌(E.coli)、バチルス(Bacillus)、もしくはストレプトミセス(Streptomyces)を使用することが好ましい。
本発明に従う核酸配列を、薬剤学的試薬として使用することができる、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくは遺伝子のアンチセンス配列の産生のために使用することもできる。アンチセンス配列による特定の発癌遺伝子の発現の阻害は、これらの発癌遺伝子の役割を理解する上での有用な手法であり、かつ抗癌剤治療法の開発における特に有望な研究法であることが判っている。アンチセンス配列は、特定の遺伝子のコーディング鎖に対して相補的であり、かつその結果として、転写されたmRNAに特異的にハイブリッド形成して、そのmRNAが蛋白質へと翻訳されるのを阻害することができる小さなサイズのオリゴヌクレオチドである。従って、本発明の目的は、少なくとも部分的に、p21−GDP複合体によるGDPの交換を刺激化するペプチドの産生を阻害することができるアンチセンス配列である。このような配列は、先に特定される核酸配列のすべてもしくは一部分からなることができる。それらは一般的に、GDP交換を刺激化するペプチドをコードする配列に対して相補的な配列、もしくは、そのような配列の断片である。このようなオリゴヌクレオチドは、フラグメント化などにより配列番号1、5、もしくは、7の配列から、あるいは、化学合成により取得することができる。このような配列を、遺伝子治療という面において、ras蛋白質によるGDPの交換のレベルを調節することができるアンチセンス配列もしくはペプチドの、転移もしくはインビボでの発現のために使用することができる。これに関連して、この配列を、ベクター、特に、ウイルス起源のベクター内に取り込ませることができる。
本発明は、ヌクレオチド配列として、本発明のペプチドをコードする、先に特定されるヌクレオチド配列と、もしくはそれに相関するmRNAと、ハイブリッド形成することができる、合成もしくはその他のヌクレオチドプローブにも関する。このようなプローブは、GDP交換因子の発現の検出のため、もしくは別の方法として、遺伝子異常(スプライシングの誤り、多形性、および、点突然変異など)の証明のための、診断手段としてインビトロにおいて用いることができる。このようなプローブはあらかじめラベル化しておく必要があり、そしてこの目的のためのいろいろな技術が当業者に知られている。これらのプローブを使用することができるハイブリッド形成条件は、緊縮性の通常の条件である(特に、以下の一般的なクローニング技術、およびに、実施例を参照せよ)。これらのプローブを、実施例に説明してあるような他の細胞起源から、本発明のペプチドをコードする相同核酸配列を証明および単離するために使用することもできる。
本発明の主題は、先に特定される少なくとも一つのペプチドを活性素因として含んでなる任意の薬剤学的組成物でもある。
本発明の主題は、先に特定される少なくとも一つの抗体および/または抗体断片を活性成分として含んでなる任意の薬剤学的組成物、ならびに、先に特定される少なくとも一つのヌクレオチド配列を活性成分として含んでなる任意の薬剤学的組成物でもある。
その上、本発明の目的は、先に特定されるペプチド、抗体、および、ヌクレオチド配列が、もう一つの、あるいは、他の活性成分と組合わさっている、薬剤学的組成物でもある。
本発明に記載の薬剤学的組成物を使用して、p21蛋白質の活性化を調節することができ、そしてその結果、特定の細胞の種類の増殖を調節することができる。より特定的には、これらの薬剤学的組成物は、癌の治療を意図する。実際、多くの癌が、発癌性ras蛋白質の存在に関連している。最も頻繁に突然変異を生じているras遺伝子を含む癌の内でも、特に、90%は第12番目のコドン上で突然変異を生じたKi−ras発癌遺伝子を有している膵臓の腺癌「Almoguera et al.、Cell 53(1988)549]、大腸の腺癌および甲状腺の癌(50%)、もしくは、肺の癌腫および骨髄性白血病[30%、Bos、J.L. Cancer Res. 49(1989)4682]を挙げることができる。
本発明の主題は、p21蛋白質の活性を調節するための、先に特定される分子の利用でもある。特に、本発明は、p21蛋白質の活性化を少なくとも部分的に阻害するこれらの分子の利用に関する。
本発明はまた、生物学的試料中に含まれるras遺伝子の発現および/または過剰発現の検出のための方法を提供する。このような方法は、例えば、このような試料の本発明に記載の抗体もしくは抗体断片との接触、この抗原−抗体複合体の可視化、および標準試料を使用して得られる結果の比較を含んでなる。このような方法においては、抗体は、懸濁液中に含まれるか、或いは支持体上にあらかじめ固定化されていることができる。この方法はまた、試料の本発明に記載のヌクレオチドプローブとの接触、取得されるハイブリッドの証明、および標準試料の場合において取得されるものとの比較を含んでなることもできる。
本発明は、治療分野において使用することができるが、それは、本発明のペプチド、抗体、およびヌクレオチド配列がras遺伝子の活性化を調節することができるために、実際、それらが、癌の発生過程に介在することを可能にするためである。実施例において説明されるように、本発明のヌクレオチド配列は、特に、cdc25突然変異を保持する酵母の温度感受性を補足することができるペプチドを発現することを可能にする。これらはまた、RAS2ts優性突然変異を抑制することができるペプチドを発現することを可能にもし、このことにより、p21蛋白質に関する相互作用についての、CDC25遺伝子の正常発現産物との競合を証明している。本発明はまた、本発明の抗体およびヌクレオチドプローブが、実際、ras遺伝子が関与している癌の同定を可能にするために、癌の診断および型別の分野において利用すること、ならびに、正常もしくは発癌性ras遺伝子の過剰発現に関連する癌の診断の分野においても使用することができる。
本発明の他の利点は、以下に示す実施例を読むことにより明白になるものと思われるが、これらの実施例は説明として考慮されるべきであり、制限として考慮すべきものではない。
図面の説明
図1:転移活性化テスト:この図は、縦座標として、形質転換のために使用したcDNA配列に関する、組換えCHO株のCAT活性のレベル(バックグラウンドに対する比較%)を示す。
図2:GTP交換活性のテスト:この図は、縦座標として、形質転換のために使用したcDNA配列に関する、組換えCHO株のp21−GDP/p21−GTP形態の比率を示す。
図3:インビトロでのGDP交換活性のテスト:この図は、時間および本発明のペプチドの2つの濃度について、p21蛋白質に結合したままになっているGDPの比率の減少を示す。
一般的なクローニング技術
プラスミドDNAの予備抽出、塩化セシウム濃度勾配中におけるプラスミドDNAの遠心処理、アガロースゲルもしくはアクリルアミドゲル電気泳動、エレクトロエリューションによるDNA断片の精製、フェノールもしくはフェノール/クロロホルムでの蛋白質抽出、食塩水培地中に含まれるDNAのエタノールもしくはイソプロパノール沈殿、および、大腸菌(Escherichia coli)における形質転換などのような分子生物学において因習的に使用される方法は当業者に良く知られており、そして刊行物中において詳細に説明されている[Maniatis T. et al.、”Molecular Cloning、a Laboratory Manual”、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、N.Y.、1982;Ausubel F.M. et al.(eds)、”Current Protocols in Molecular Biology”、John Wiley and Sons、New York 1987]。
制限酵素は、New England Biolabs(Biolabs)社、Bethesda Research Laboratories(BRL)社、もしくは、Amersham社から供給され、そして、供給元の勧告に従って使用した。
pBR322、pUC、λgt11、および、pGEX 2Tタイプのプラスミド、およびM13シリーズのファージは、市販品の源のものを使用する。
連結反応については、DNA断片を、アガースもしくはアクリルアミドゲル電気泳動によりサイズに従って分離し、フェノールもしくはフェノール/クロロホルム混合物で抽出し、エタノールで沈殿させ、そしてその後、供給元の勧告に従ってファージT4のDNAリガーゼ(Biolabs)の存在下においてインキュベートする。
5’突出端の補充は、供給元の勧告に従って、大腸菌のDNAポリメラーゼIのクレノウ断片(Biolabs)を使用して行う。3’突出端の破壊は、供給元の勧告に従ってファージT4のDNAポリメラーゼ(Biolabs)の存在下において行う。5’突出端の破壊は、S1ヌクレオアーゼでの管理条件下での処理により行う。
合成オリゴヌクレオチドによるインビトロでの突然変異誘発は、Taylor et al.により開発された方法[Nucleic Acids Res. 13(1985)8749−8764]に従って、Amersham社により配給されるキットを使用して実行する。
いわゆるPCR[ポリメラーゼにより触媒される連鎖反応(Polymerase−catalyzed Chain Reaction)、Saiki R.K. et al.、Science 230(1985)1350−1354;Mullis K.B. and Faloona F.A.、Meth. Enzym. 155(1987)335−350]技術によるDNA断片の酵素的増幅は、供給元の勧告に従う「DNAサーマルサイクラー」(Perkin Elmer Cetus社)を使用して行う。
ヌクレオチド配列の実証は、Sanger et al.により開発された方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA、74(1977)5463−5467]により、Amersham社により配給されるキットを使用して実行する
ハイブリッド形成実験のためには、緊縮性の通常の条件は、一般的には、以下に示すものであり、それは、ハイブリッド形成:65℃下、5×デンハート溶液の存在下における3×SCC、洗浄:65℃下、0.5×SSC、である。
1.ヒトのGDP交換因子(hGRF)遺伝子の単離
ベクターλgt11[Skolnik et al.、Cell 65(1991)83]中において作製したヒトの脳のライブラリーの5×105のファージを、Sambrook、Fritsch、および、Maniatisにより記載される技術(Molecular cloning;Cold Spring Harbor Laboratory Press;1989)に従ってスクリーニングした。
このライブラリーのスクリーニングのために使用したプローブは、32Pでラベル化してある137塩基対のヒトのcDNA断片である。このプローブは、プライマーとして、以下に示す縮重オリゴヌクレオチドを使用する、前述のライブラリーの総DNAについてのPCRにより調整し、それらの縮重オリゴヌクレオチドは、その断片の3’端のオリゴヌクレオチド(配列番号11)については、
であり、そして、
その断片の5’端のオリゴヌクレオチド(配列番号12)については、
である。
このプローブは、FeinbergおよびVogelstein[Anal.Biochem.137(1984)266]の技術に従うランダムプライミングにより32Pでラベル化し、そして、PCR反応は、一般的なクローニング技術において記載した条件下において、約40℃下で実行した。
このプローブを使用するハイブリッド形成により取得されるいろいろな陽性クローンの内、あるものは、Ha−Rasに関する交換活性を保持する読み取り枠全体を含んでいる。
このλgt11クローンは、M13mp18ベクターの相関する部位において、EcoRI断片の形態において取り込まれている3−kbのcDNAを保持している。その後、このcDNAを、市販の「リバース」および「−20」プライマーを使用し、そしてさらに、Sanger技術(一般的なクローニング技術を参照せよ)に従う特異的オリゴヌクレオチドも使用して配列決定を行った。
そのようにして取得される断片により保持されるヒトのGDP交換因子遺伝子のヌクレオチド配列を、配列番号1の配列において、演繹されるペプチド配列(配列番号2、3、および、4)と一緒に示した。
2.サブフラグメントの調製
このようにして取得された遺伝子のいろいろな誘導体もしくは断片は、特に、本発明のペプチドの発現のために、調製および使用することができる。特に、以下に示す断片を、酵素開裂により調製し、そして電気溶出により分離するが、それらの断片は、
−交換因子をコードする領域の一部(ヌクレオチド936から停止コドンまで)、およびに、その断片の3’非コーディング領域を含んでなるPstI−EcoRI断片、
−交換因子をコードする領域の一部(ヌクレオチド910から停止コドンまで)、およびに、その断片の3’非コーディング領域を含んでなるEcoNI−EcorI断片、
−交換因子をコードする領域の一部(ヌクレオチド638から停止コドンまで)、およびに、その断片の3’非コーティング領域を含んでなるEagI−EcoRI断片、
−交換因子をコードする領域の一部(ヌクレオチド88から停止コドンまで)、およびに、その断片の3’非コーティング領域を含んでなるBalI−EcoRI断片、ならびに、
−交換因子をコードする領域の一部(ヌクレオチド196から停止コドンまで)、およびに、その断片の3’非コーティング領域を含んでなるNaeI−EcoRI断片、
である。
これらの断片により保持される3’非コーディング領域は二次的に重要なものであり、そしてヌクレアーゼ、あるいはその停止コドンの約30bp後に開裂部位が位置する、特に、SmaIのような、停止コドンに近い開裂部位を有する酵素での開裂、のいずれかにより除去することができる、ということを了解事項とする。
また、特に、C−末端部分全体をコードする領域を含んでいる訳ではない断片、ならびに突然変異、置換、添加、もしくは化学的および/または遺伝子的性質の改変により取得されるこれらの断片の誘導体のような、他の断片も調製することができることも了解事項とする。
3.生物学的特性決定
本発明に従うペプチドの機能性を、
−哺乳類細胞中、
−サッカロミセス セルビシエ(Saccharomyces cerevisiae)中、そうでなければ、
−組換えHa−Ras蛋白質についてインビトロで、
テストした。
3.1.哺乳類細胞中における機能の亢進については、例えば、実施例2において記載のもののような、本発明のペプチドをコードするDNA配列を、Camonis et al.[Gene 86(1990)263]により記載されている、ベクターpCym1中におけるSV40の初期プロモーターの調節下に配置させることができる。
この例においては、実施例2において記載のPstI−EcoRIおよびEcoNI−EcoRI断片を、このベクター内に挿入した。
このようにして取得されるベクターを、Rey et al.[Oncogene 6(1991)347]により記載される計画に従うCHO細胞内へのトランジエントトランスフェクションによりテストした。
このような方法において、機能性の2つの基準を調査したが、それらの基準とは、
−この場合、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT遺伝子)をコードする細菌性遺伝子である、レポーター遺伝子の発現を調節しているプロモーターを転移活性化させるベクターの能力、
−トランスフェクトされたCHO細胞のRas蛋白質に、GTPを結合させることを促進するそれらの能力、
である。
a)転移活性化テストについては、50%の濃度のCHO細胞を、一方では、マウスのチミジンキナーゼ遺伝子のプロモーター、および、ポリオーマウイルスのエンハンサーから得られる4つのPEA1反復成分よりなる合成プロモーターの調節下あるCAT遺伝子を保持する0.5μgのベクターで[Wasylyk et al.、EMBO J. 7(1988)2475]、そして、もう一方では、SV40の初期プロモーターの調節下にある、非コーディングcDNA(ライン1)、正常なHa−RasのcDNA(ライン2)、位置12(Val12)に存在する活性化されたHa−RasのcDNA(ライン3)、先に引用したRey et al.により記載される、SDC25のcDNAの3’端(ライン4)、および、先に記載の、本発明に従うペプチドをコードするcDNA(ライン5)を保持する4.5μgの発現ベクターで、トランスフェクトさせた(例えば、Schweighoffer et al.、Science、in press、により記載の計画を参照せよ)。
結果を図1に示した。ライン1は基準値の活性化に相当し、ライン3(PStI−EcoRI断片について取得された:CDC hum.)は、本発明のペプチドの発現により、調査した合成プロモーターの転移活性化が可能になることを示している。
同じ定量的結果が、調査を行った他の断片について取得された。
b)この転移活性化が、CHO細胞のras蛋白質へのヌクレオチドの結合を実際に伴うということを立証するために、32Pでラベル化したオルトリン酸を培養培地に添加して、同一のトランジエントトランスフェクションを行った。
このラベル化計画、ならびに、細胞性のras蛋白質の免疫沈降のための計画は、先に引用したRey et al.により記載されている。取得された結果を図2に示した。それらは、本発明のペプチドは、ras蛋白質によるGDPの交換のレベルを調節することができることを示しているが、それは、それらの内の幾つかのもの(先に記載のPstI−EcoRI断片により発現されるペプチドCDC Hum.)が、Y13−259抗体で免疫沈降させたCHO細胞のras蛋白質のGTPとの結合を促進することができるためである。
3.2.本発明のペプチドは、S.セレビシエ(S. cerebisiae)のcdc25-イーストにおける機能性についてもテストを行った。この目的のために、シャトルベクターである、先に記載の(3.1.)ベクターを、イースト株OL97−1−11B内に取り込ませた[Camonis and Jacquet、Mol. Cell. Biol. 8(1988)2980]。取得された結果により、本発明に記載のcDNA断片は、36℃におけるこの株の生育欠損を補うことができるペプチドをコードしていることが示されている。従って、これらの結果は、これらの断片が、S.セレビシエ(S. cerebisiae)内においてインビボで機能を発揮するペプチドをコードしていることを示している。
3.3.精製したHa−Ras蛋白質に関するGDPの交換を促進させることができるペプチドをコードする、本発明のDNA配列の能力を、Rey et al. [Mol. Cell. BIol. 9(1989)3904]により記載されている計画に従って、インビトロにおいても証明した。
この目的のために、本発明の配列を、Smith and Johnson[Gene 67(1988)31]により記載されている技術に従って、グルタチオン S−トランスフェラーゼ(GST)との融合蛋白質の形態において、大腸菌株TG1内において発現させる。この目的のために、先の3.1.において記載されているいろいろなDNA断片を、GSTをコードするcDNAの3’端、および、その読み取り枠内に存在するベクターpGEX 2T(Pharmacia社)内に、SmaI−EcoRI断片の形態でクローン化させた。このSmaI−EcoRI断片は、リガーゼによるアダプターの添加により取得される。その後、このようにして取得されたベクターを使用して、大腸菌株TG1を形質転換させる。このように形質転換させた細胞を、37℃において一晩予備培養を行い、LB培地内で1/10に希釈し、発現を誘導させるためにIPTGを添加し(2時間、25℃)、そしてその後、25℃において約21時間培養する。その後、細胞を溶菌させ、そして、産生された融合蛋白質を、アガロース−GSHカラムにおける親和性により精製する。この目的のために、細菌の溶菌液を、4℃において15分間、ゲル(溶菌緩衝液を用いて調製および平衡化させてある)の存在下においてインキュベートする。Tris−HCl緩衝液、pH7.4で3度洗浄した後、この蛋白質を、過剰量のGSHを含む、Tris−HCl緩衝液、pH7.7の存在下において溶出させる。上清を回収し、そして、遠心処理にかける。
その後、精製したHa−Ras蛋白質に関する、本発明のペプチドのGDP交換活性を、Rey et al.(先に引用したMol.Cell.Biol.)により記載されている計画に従ってインビトロにおいて証明した。得られた結果を図3に示す。それらは、特に、先に記載のPstI−EcoRIにより発現されるCDC hum配列に相当する本発明のペプチドは、GDP交換を刺激化することを示している。
4.相同配列の証明
図1に示す核酸配列に対して相同な核酸配列を、以下に示す2つの異なる手法により証明した。
−一般的なクローニング技術において記載の条件下における、胎盤のmRNAから新しく合成したcDNAについて、配列番号1の配列と、SOS蛋白質の配列[Bonfini et al.、Science 255(1992)603]との間に保存されている配列を覆うために選択した縮重オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用するPCRによる手法。
−32Pでラベル化した配列番号1の配列の全体からなるプローブを使用する胎盤のcDNAライブラリーのスクリーニングによる手法。50℃下、5×SSC、5×デンハート培地中におけるハイブリッド形成、その後に続く、50℃下、2×SSC培地中における洗浄を含んでなるこのスクリーニングは、低緊縮性の条件下において実行した。
これらの2つの手法により、配列番号1の配列に対して相同である配列が明らかにされた。これらの配列は、簡単に、単離および特性を決定を行うことができる。これらは、p21−GDP複合体に関するGDPの交換のレベルを調節することができるペプチド(あるいは、それらの断片もしくは誘導体)をコードする場合、本発明の目的のための核酸配列を構成している。
特に、この手法により、胎盤のmRNAから、そして、オリゴヌクレオチドであるoligo 2449(配列番号9)、および、oligo 2451(配列番号10)、hSOS1およびhSOS2と表示される因子をコードする2つのcDNAを使用して、各々、配列番号5および配列番号7に示される部分的配列を同定することが可能となった。これらの因子に相関するmRNAは探索を行ったすべての組織内に存在するが、それとは対照的に、実施例1において記載される因子は、脳にのみ存在することが明らかになっている。これらの遺伝子の染色体上における位置決定を行い、そして、以下に示す結果を取得した。
−h−GRF:15q2.4.
−h−SOS1:4q2.1.
−h−SOS2:14q2.2.
5.他の組織内に存在するh−GRFタイプの交換因子のためのテスト
抗−h−GRF抗体は、配列番号4に示したh−GRF因子の、残基211と489との間に位置する280アミノ酸の断片に相当する抗原で免疫化することにより、ウサギにおいて調製した。
これらの抗体により、明白な分子量30、55、75、95、および、140kDaの蛋白質を、ELISAにより、ヒトの皮質および脳前駆体細胞内において検出することができた。分子量の多様性により、多重性cDNAの存在が示唆されている。h−GRF抗体をh−GRFとあらかじめインキュベーションさせておくと、同定された蛋白質の検出が消失し、これにより、シグナルの特異性が証明された。
配 列 表
(1)一般的な情報
(i)出願者
(A)氏名:RHONE−POULENC RORER S.A.
(B)街路名:20、avenue Raymond ARON
(C)市:ANTONY
(E)国:FRANCE
(F)郵便番号:92165
(ii)発明の名称:ras蛋白質の活性を阻害するペプチド、調製法、および、使用法
(iii)配列数:12
(iv)コンピューター解読形態:
(A)メディウムの種類:テープ
(B)コンピューター:IBM PC compatible
(C)操作システム:PC−DOS/MS−DOS
(D)ソフトウェアー:PatentIn Release #1.0、Version #1.25(EPO)
(2)配列番号1についての情報
(i)配列の性質
(A)配列の長さ:2652
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(iii)ハイポセティカル配列:NO
(iii)アンチセンス:NO
(ix)配列の特徴
(A)名称/略称:CDS
(B)位置:1...2445
(ix)配列の特徴
(A)名称/略称:CDS
(B)位置:445...2445(配列番号3)
(ix)配列の特徴
(A)名称/略称:CDS
(B)位置:976...2445(配列番号4)
(xi)配列:配列番号1:
(2)配列番号2についての情報
(i)配列の性質
(A)配列の長さ:814
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:蛋白質
(xi)配列:配列番号2:
(2)配列番号3についての情報
(i)配列の性質
(A)配列の長さ:666
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:蛋白質
(xi)配列:配列番号3:
(2)配列番号4についての情報
(i)配列の性質
(A)配列の長さ:489
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:蛋白質
(xi)配列:配列番号4:
(2)配列番号5についての情報
(i)配列の性質
(A)配列の長さ1092
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(iii)ハイポセティカル配列:NO
(iii)アンチセンス:NO
(ix)配列の特徴
(A)名称/略称:CDS
(B)位置:1...1092
(xi)配列:配列番号5:
(2)配列番号6についての情報
(i)配列の性質
(A)配列の長さ:364
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:蛋白質
(xi)配列:配列番号6:
(2)配列番号7についての情報
(i)配列の性質
(A)配列の長さ:1956
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(iii)ハイポセティカル配列:NO
(iii)アンチセンス:NO
(ix)配列の特徴
(A)名称/略称:CDS
(B)位置:1...1956
(xi)配列:配列番号7:
(2)配列番号8についての情報
(i)配列の性質
(A)配列の長さ:652
(B)配列の型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:蛋白質
(xi)配列:配列番号8:
(2)配列番号9についての情報
(i)配列の性質
(A)配列の長さ:41
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(iii)ハイポセティカル配列:NO
(iii)アンチセンス:NO
(xi)配列:配列番号9:
(2)配列番号10についての情報
(i)配列の性質
(A)配列の長さ:34
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(iii)ハイポセティカル配列:NO
(iii)アンチセンス:NO
(xi)配列:配列番号10:
(2)配列番号11についての情報
(i)配列の性質
(A)配列の長さ:33
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(iii)ハイポセティカル配列:NO
(iii)アンチセンス:NO
(xi)配列:配列番号11:
(2)配列番号12についての情報
(i)配列の性質
(A)配列の長さ:27
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(iii)ハイポセティカル配列:NO
(iii)アンチセンス:NO
(xi)配列:配列番号12:
Claims (14)
- p21−GDP複合体によるGDPの交換レベルを調節することができ、配列番号2、3もしくは4の配列の、すべてもしくは一部分からなるペプチド。
- p21−GDP複合体に関するGDPの交換の速度を低減もしくは阻害するという特徴を有する、請求項1に記載のペプチド。
- 配列番号2、3もしくは4の配列のペプチド。
- 請求項1〜3の内のいずれかに記載のペプチドに対する抗体もしくは抗体断片。
- 配列番号1のペプチド配列に対するものであることを特徴とする、請求項4に記載の抗体もしくは抗体断片。
- p21−GDP複合体によるGDPの交換を少なくとも部分的に阻害する能力を保持することを特徴とする、請求項5に記載の抗体もしくは抗体断片。
- 請求項1〜3の内のいずれかにおいて特定されるペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- (a)配列番号1の配列、あるいはそれらの相補鎖の、すべてもしくは一部分、
(b)配列(a)とハイブリッド形成し、かつ、p21−GDP複合体によるGDPの交換レベルを調節することができるポリペプチドをコードする、任意の配列、ならびに
(c)遺伝子コードの縮重の結果、配列(a)および(b)から得られる配列、
から選択される配列を持つことを特徴とする、請求項7に記載のポリヌクレオチド。 - 配列番号1の塩基配列のポリヌクレオチド、あるいはそれに相関するmRNAと、ハイブリッド形成することができるポリヌクレオチド。
- GDP交換因子の検出のための、あるいは遺伝子異常(スプライシングの違り、多形性、点突然変異)の証明のための、請求項9に記載のポリヌクレオチドの使用方法。
- 非ペプチドであるか、あるいはペプチドのみに占められてはおらず、かつ、p21−GDP複合体によるGDPの交換のレベルを調節することができる化合物の、その活性のために重要であるこのペプチドの構成要素の決定、および非ペプチドであるか、あるいはペプチドのみに占められてはいない構造によるこの要素の再構成による産生のための、請求項1〜3の内のいずれかに記載のペプチドの使用方法。
- 生物学的試料中に含まれる、増幅された、突然変異を生じた、もしくは再構成したGDP交換因子の、発現および/または過剰発現の検出のための、請求項4〜6までの内の一つに記載の抗体もしくは抗体断片、および/または請求項9に記載のポリヌクレオチドの使用方法。
- 癌の型別のための、請求項4〜6の内の一つに記載の抗体もしくは抗体断片、および/または請求項9に記載のポリヌクレオチドの使用方法。
- 請求項7に記載のポリヌクレオチドを含む細胞を、当該配列の発現のための条件下において培養し、そして産生されたペプチドを回収することを特徴とする、請求項1〜3の内のいずれかに記載のペプチドを調製するための方法。
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