DE69131289T2

DE69131289T2 - Polypeptide mit einer aktivität des menschlichen dopaminergischen rezeptors, deren kodierende nukleinsäuresequenzen und verwendung dieser polypeptide

Info

Publication number: DE69131289T2
Application number: DE69131289T
Authority: DE
Inventors: Bruno Giros; Marie-Pascale Martres; Jean-Charles Schwartz; Pierre Sokoloff
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1990-11-06
Filing date: 1991-10-16
Publication date: 1999-12-16
Anticipated expiration: 2011-10-17
Also published as: ATE180788T1; CA2072874A1; FR2668771B1; DE69131289D1; JPH05503219A; ES2134781T3; AU8857991A; EP0507908A1; EP0507908B1; CA2072874C; FR2668771A1; WO1992007937A1

Description

Die Erfindung hat Polypeptide mit einer Aktivität eines humanen dopaminergen Rezeptors und die diese Polypeptide kodierenden Gene zum Gegenstand.
Die Erfindung bezieht sich gleichfalls auf
- Vektoren, die die Polypeptide mit einer Aktivität eines dopaminergen Rezeptors kodierenden Gene enthalten,
- Zellen, die transformiert worden sind, um die vorstehend genannten Gene zu exprimieren, mit denen es möglich ist, die Aktivität von bezüglich dieser Rezeptoren agonistischen oder antagonistischen Mitteln auszuwerten,
- Nukleotidsonden, die in der Lage sind, mit den die genannten Polypeptide kodierenden Genen zu hybridisieren, wobei diese Sonden für die in vitro-Diagnose von Erkrankungen, insbesondere neurologischen, psychiatrischen, kardiovaskulären oder neuroendokrinen, verwendet werden können,
- polyklonale und monoklonale Antikörper, die gegen die genannten Polypeptide gerichtet sind und zu analytischen Zwecken, um die Polypeptide zu reinigen, für die in vitro- Diagnose oder zu therapeutischen Zwecken, insbesondere bei Erkrankungen, die die dopaminergen Systeme mit einbeziehen, verwendet werden können,
- Zusammenstellungen (oder Kits) zum Untersuchen des Ausmaßes der Affinität bestimmter Substanzen für die genannten Polypeptide,
- Arzneimittel, die insbesondere für die Behandlung psychiatrischer, neurologischer, kardiovaskulärer oder neuroendokriner Erkrankungen bestimmt sind und Substanzen enthalten, die eine Aktivität gegenüber den Polypeptiden mit einer Aktivität eines dopaminergen Rezeptors aufweisen, oder Substanzen enthalten, die eine Aktivität auf durch die Ge ne oder Fragmente von Genen, die die Polypeptide mit einer Aktivität eines dopaminergen Rezeptors kodieren, transfizierte Zellen aufweisen,
- Arzneimittel, die eine Aktivität gegenüber den bereits identifizierten dopaminergen Rezeptoren aufweisen, aber bei denen man bestimmte Nebenwirkungen, die ihrer Wechselwirkung mit den genannten Polypeptiden zuzuschreiben sind, verringern möchte.
Es ist bis heute angenommen worden, daß die verschiedenen Wirkungen von Dopamin aus seiner Wechselwirkung mit zwei Typen von Rezeptoren, die üblicherweise mit den Namen Rezeptor D-1 und Rezeptor D-2 bezeichnet werden, resultieren (Kebabian und Calne, (1979) (1)). Unter jenen war nur die Sequenz des Rezeptors D-2 bekannt (Bunzow et al., (1988) (2)) und es sind zwei Isoformen des D-2-Rezeptors (manchmal bezeichnet als D-2A und D-2B oder ferner D-2(415) und D-2(444), die aus dem alternativen Spleißen der mRNA des Gens dieses Rezeptors resultieren, beschrieben worden (Giros et al., (1989) (3); Dal Toso et al., (1989) (4)).
Der D2-Rezeptor stammt aus der Familie der G-Proteingekoppelten Rezeptoren, die sieben Transmembrandomänen umfassen und ein bestimmtes Ausmaß an Homologie zu den Rezeptoren der Familie der Rhodopsine, die durch die Photorezeptoren der Retina exprimiert werden, aufweisen.
Die Existenz von dopaminergen Rezeptoren, die sich von den Rezeptoren D-1 und D-2 unterscheiden, war von verschiedenen Autoren aufgrund indirekter Beobachtungen vermutet worden (siehe insbesondere Schwartz et al. (1984) (5)), ist aber niemals bewiesen worden, da diese Rezeptoren weder jemals isoliert worden sind, noch identifiziert worden sind, was ihre Struktur betrifft, noch durch ihre pharmakologischen Eigenschaften vollständig definiert worden sind. Insbesondere wurde die Existenz von Autorezeptoren, die die Synthese und/oder die Freisetzung von Dopamin und/oder ferner die Aktivität der dopaminergen Neuronen steuern, gezeigt, aber es ist üblicherwei se angenommen worden, daß sie mit den D-2-Rezeptoren identisch sind, was ihre Pharmakologie betrifft.
Die Existenz von Polypeptiden aus der Maus mit einer Aktivität eines dopaminergen Rezeptors, die weder zu der Aktivität dopaminerger D-1-Rezeptoren noch jener der dopaminergen D-2- Rezeptoren paßt, war Gegenstand einer Veröffentlichung in Nature gewesen (13). Diese Polypeptide werden als dopaminerger Rezeptor D-3 der Ratte bezeichnet.
Die Erfindung hat zum Gegenstand, Zugang zu neuen Polypeptiden mit einer Aktivität eines dopaminergen Rezeptors, die weder zu jener der humanen dopaminergen Rezeptoren D-1 noch jener der humanen dopaminergen Rezeptoren D-2 paßt, zu gewähren.
Die Erfindung hat gleichfalls zum Gegenstand, Zugang zu neuen Nukleinsäuresequenzen zu gewähren, die eine spezifische Diagnose bestimmter neurologischer oder psychiatrischer Pathologien beim Menschen erlauben.
Insbesondere enthält das neue Polypeptid der Erfindung mit einer Aktivität eines dopaminergen Rezeptors:
- die Sequenz von 400 Aminosäuren der Fig. 1 oder ein Fragment dieser Sequenz, wobei dieses Fragment dergestalt ist, daß
- es entweder gleichwohl die in dieser Sequenz enthaltenen Stellen enthält, deren Anwesenheit erforderlich ist, damit, wenn dieses Fragment in einer Membran anwesend ist, es in der Lage ist, Dopamin, seine Agonisten oder Antagonisten auf spezifische und meßbare Weise, beispielsweise mittels eines radioaktiven Liganden gemäß der in Sokoloff et al. (1980) (6) und in Martres et al. (1985) (7) beschriebenen Technik, zu binden, wobei diese Stellen sich von den in dem dopaminergen Rezeptor D-3 der Ratte enthaltenen Stellen unterscheiden;
- oder es durch Antikörper erkannt werden kann, die gleichfalls die genannte Sequenz von 400 Aminosäuren erkennen, aber weder den dopaminergen Rezeptor D1, noch den dopami nergen Rezeptor D-2 noch den dopaminergen Rezeptor D-3 der Ratte erkennen,
- oder es Antikörper erzeugen kann, die die genannte Sequenz von 400 Aminosäuren erkennen, aber weder den dopaminergen Rezeptor D1 noch den dopaminergen Rezeptor D-2 noch den dopaminergen Rezeptor D-3 der Ratte erkennen.
Wenn "dopaminerge Rezeptoren D-3 der Ratte" erwähnt werden, handelt es sich um jenen, dessen Aminosäuresequenz und entsprechende Nukleinsäuresequenz in dem vorstehend zitierten Nature-Artikel beschrieben worden sind.
Das Erkennen der Sequenz von 400 Aminosäuren durch die vorstehend angesprochenen Antikörper - oder des vorstehend erwähnten Fragments durch die vorstehend genannten Antikörper - bezeichnet, daß die genannte Sequenz einen Komplex mit einem der genannten Antikörper bildet.
Die Bildung des Antigen (d. h. Sequenz von 400 Aminosäuren oder das genannte Fragment)-Antikörper-Komplexes und der Nachweis der Existenz eines gebildeten Komplexes können durch klassische Techniken erfolgen (wie jene, die einen durch radioaktive Isotope oder ein Enzym markierten Tracer einsetzen).
Was die Definition der "die Stellen enthaltenden Fragmente", die der vorstehend gegebenen Definition entsprechen, angeht, bezieht man sich auf die folgende Beschreibung.
Unter den vorstehend definierten Fragmenten bevorzugt man das oder die Fragmente, die durch alternatives Spleißen der mRNA, die von dem die vorstehend definierte Sequenz von 400 Aminosäuren kodierenden Gen produziert wird, produziert werden.
Die Erfindung betrifft gleichfalls chimäre Proteine, in denen das Polypeptid, wie weiter oben definiert, oder Teile von jenem mit einer bezogen auf dieses Polypeptid heterologen Abfolge von Aminosäuren verbunden sind.
Die chimären Polypeptide und Proteine der Erfindung können glykosyliert sein und können gegebenenfalls Disulfidbrücken enthalten.
In der Folge der Beschreibung werden die Polypeptide der Erfindung zur Vereinfachung als "humane Rezeptoren D-3" bezeichnet.
Ein vorteilhafter humaner Rezeptor D-3 der Erfindung wird durch die Abfolge der Aminosäuren 1 bis 400, die in der Fig. 1 gezeigt sind, gebildet.
Es wird angenommen, daß dieser humane Rezeptor D-3 sieben hydrophobe Transmembranbereiche aufweist, die durch hydrophile intra- und extrazelluläre Schleifen voneinander getrennt sind.
Diese Transmembranbereiche entsprechen den 7 unterstrichenen Bereichen, in Bezug auf welche MbI dem ersten Transmembranbereich entspricht und so fort bis zu MbVII (siebter Transmembranbereich).
Die Erfindung betrifft gleichfalls die Polypeptidvarianten, die den vorstehend definierten Polypeptiden entsprechen, die bestimmte lokalisierte Mutationen enthalten, ohne daß die Polypeptide die Eigenschaften eines humanen dopaminergen D-3- Rezeptors verlieren. Unter diesen Varianten können jene aufgeführt werden, die von Antikörpern, die die Transmembranbereiche erkennen, erkannt werden, wie auch jene, die von Antikörpern, die die anderen Bereiche außer den Transmembranbereichen erkennen, erkannt werden.
Unter den Polypeptidvarianten der Erfindung können jene aufgeführt werden, die mindestens eine der folgenden vier Mutationen aufweisen (wobei die Positionen der Aminosäuren, die mutiert werden können, bezogen auf die Fig. 1 angegeben sind):
Ser an Position 9 wird durch Gly ersetzt,
Ala an Position 79 wird durch Val ersetzt,
Val an Position 189 wird durch Ile ersetzt,
Ile an Position 397 wird durch Thr ersetzt.
Eine vorteilhafte Polypeptidvariante der Erfindung umfaßt die vier vorstehend angegebenen Mutationen.
Die Erfindung betrifft gleichfalls Nukleinsäuren, die umfassen oder gebildet sind aus einer Abfolge von Nukleotiden, die am Ende der Translation oder am Ende der Transkription und der Translation zu irgendeinem der vorstehend definierten humanen D3-Rezeptoren führt.
Mit "Nukleinsäuren, die umfassen oder gebildet sind aus einer Abfolge von Nukleotiden, die am Ende der Translation oder am Ende der Transkription und der Translation führt zu" bezeichnet man gleichzeitig:
- die Exons,
- die Introns 5' und/oder 3' flankierenden Exons,
- die zwischen Introns liegenden Exons,
- die Introns 5' und/oder 3' flankierenden und zwischen Introns liegenden Exons.
Die Erfindung betrifft gleichfalls Nukleinsäuren, wie sie nachfolgend definiert werden und die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie aus Fragmenten genomischer DNA gebildet werden.
Von der Erfindung ausgeschlossen sind die Nukleinsäuren, die der Gesamtheit des menschlichen Genoms entsprechen, wie auch jene, die der Gesamtheit des Chromosoms, das das den humanen Rezeptor D-3 kodierende Gen trägt, entsprechen.
Die vorteilhaften Nukleinsäuren der Erfindung enthalten:
- die in Fig. 3 gezeigte Nukleinsäureabfolge,
- die in Fig. 4 gezeigte Nukleinsäureabfolge oder werden aus einer der vorstehend erwähnten Abfolgen gebildet.
Die von den Nukleotiden an Position 1 und an Position 574 in der Fig. 3 begrenzte Nukleinsäuresequenz ist dergestalt, daß:
- die Sequenz, die sich in Fig. 3 von dem durch das Nukleotid an Position 1 gebildeten Ende bis zu jenem, das durch das Nukleotid an Position 227 gebildet wird, erstreckt, dem 5'-terminalen (nicht-kodierenden) Teil der Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid der Fig. 1 kodiert, entspricht,
- die Sequenz, die sich in Fig. 3 von dem durch das Nukleotid an Position 228 gebildeten Ende bis zu jenem, das durch das Nukleotid an Position 501 gebildet wird, erstreckt, der (kodierenden) Nukleinsäuresequenz, die sich von dem durch das Nukleotid an Position 1 gebildeten Ende bis zu jenem, das durch das Nukleotid an Position 274 gebildet wird, wie in Fig. 1 angegeben, erstreckt, entspricht,
- die Sequenz, die sich in Fig. 3 von dem durch das Nukleotid an Position 502 gebildeten Ende bis zu jenem, das durch das Nukleotid an Position 574 gebildet wird, erstreckt, einem Intron der das in Fig. 1 angegebene Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht.
Die Nukleinsäuresequenz, die durch die Nukleotide begrenzt wird, die sich von dem durch das Nukleotid an Position 1 gebildeten Ende bis zu jenem, das durch das Nukleotid an Position 306 gebildet wird, wie in Fig. 4 angegeben, erstrecken, ist dergestalt, daß:
- die Sequenz, die sich in Fig. 4 von dem durch das Nukleotid an Position 1 gebildeten Ende bis zu jenem, das durch das Nukleotid an Position 46 gebildet wird, erstreckt, einem Intron der das in Fig. 1 angegebene Polypeptid kodierenden Nukleinsäuresequenz entspricht,
- die Sequenz, die sich in Fig. 4 von dem durch das Nukleotid an Position 47 gebildeten Ende bis zu jenem, das durch das Nukleotid an Position 240 gebildet wird, erstreckt, der (kodierenden) Nukleinsäuresequenz, die sich von dem durch das Nukleotid an Position 1007 gebildeten Ende bis zu jenem, das durch das Nukleotid an Position 1200 gebildet wird, wie in Fig. 1 angegeben, erstreckt, entspricht,
- die Sequenz, die sich in Fig. 4 von dem durch das Nukleotid an Position 241 gebildeten Ende bis zu jenem, das durch das Nukleotid an Position 306 gebildet wird, erstreckt, dem 3'-terminalen (nicht-kodierenden) Ende der Nukleinsäuresequenz, die das Polypeptid der Fig. 1 kodiert, entspricht.
Vorteilhafte Nukleinsäuren der Erfindung sind jene, die enthalten oder gebildet sind aus der Abfolge von Nukleinsäuren der Fig. 3, welche mindestens eine der folgenden Mutationen umfaßt:
A an Position 252 ist durch G ersetzt,
A an Position 278 ist durch G ersetzt.
Vorteilhafte Nukleinsäuren der Erfindung werden durch jene gebildet, die in der in Fig. 3 gezeigten Nukleinsäuresequenz enthalten sind, oder jene, die die in Fig. 3 angegebene Nukleinsäuresequenz enthalten, mit der Maßgabe, daß sie mit der Nukleinsäuresequenz der Fig. 3 unter den in den Referenzen (3) und (13) angegebenen Bedingungen hybridisieren.
Vorteilhafte Nukleinsäuren der Erfindung werden durch jene gebildet, die in der in Fig. 4 gezeigten Nukleinsäuresequenz enthalten sind, oder jene, die die in Fig. 4 gezeigte Nukleinsäuresequenz enthalten, mit der Maßgabe, daß sie mit der Nukleinsäuresequenz der Fig. 4 unter den in den Referenzen (3) und (13) angegebenen Bedingungen hybridisieren.
Insbesondere betrifft die Erfindung die Nukleinsäure, die die in Fig. 1 gezeigte Abfolge von Nukleotiden, die sich von dem durch das Nukleotid an Position -6 bis zu jenem, das durch das Nukleotid an Position 1266 gebildet wird, erstreckt, umfaßt.
Die Erfindung betrifft insbesondere die in Fig. 1 gezeigte Nukleinsäure, die umfaßt oder gebildet wird aus der Abfolge, die sich von dem durch das Nukleotid an Position 1 gebildeten Ende bis zu jenem, das durch das Nukleotid an Position 1200 gebildet wird, erstreckt.
Die vorstehend definierte Nukleinsäure entspricht dem kodierenden Teil des Gens, das dem in Fig. 1 gezeigten Polypeptid entspricht.
Gleichfalls Teil der Erfindung sind die Nukleinsäurevarianten bezogen auf jene, die vorstehend definiert wurden, die bestimmte lokalisierte Mutationen umfassen mit der Maßgabe, daß diese Nukleinsäurevarianten mit den vorstehend definierten Nukleinsäuren oder mit den nachfolgend definierten Nukleinsäuresonden unter den nachfolgend in der Beschreibung definierten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren.
Unter den Nukleinsäurevarianten können jene aufgeführt werden, die mindestens eine der folgenden sechs Mutationen aufweisen (wobei die Nukleotidpositionen, die mutiert sein können, unter Bezugnahme auf die Fig. 1 angegeben sind):
A an Position 25 ist durch G ersetzt,
A an Position 51 ist durch G ersetzt,
C an Position 236 ist durch T ersetzt,
G an Position 565 ist durch A ersetzt,
T an Position 876 ist durch C ersetzt,
T an Position 1190 ist durch C ersetzt.
Unter den Nukleinsäurevarianten können jene aufgeführt werden, die an den Positionen 25, 51, 236, 565, 876 und 1190 die Gesamtheit der vorstehend definierten Mutationen aufweisen. Die Erfindung bezieht sich gleichfalls auf die Nukleinsäuresequenzen, die ausgehend von einer humanen genomischen Bibliothek durch Hybridisierung mit einer der nachfolgend definierten Hybridisierungssonden erhalten werden können, wobei diese Nukleinsäuresequenzen Introns umfassen oder daraus gebildet sein können.
Die Erfindung betrifft gleichfalls die Nukleinsäuren, die zu den vorstehend definierten komplementär sind, wie auch die Nukleinsäuren, die den vorstehend definierten entsprechen und in denen T durch U ersetzt ist.
Die Nukleinsäuren der Erfindung können entweder durch ein chemisches Verfahren oder durch andere Verfahren hergestellt werden.
Eine geeignete Herstellungsweise der Nukleinsäuren (umfassend maximal 200 Nukleotide oder Basenpaare, wenn es sich um doppelsträngige Nukleinsäuren handelt) der Erfindung auf chemischem Wege umfaßt die folgenden Schritte:
- die Synthese von DNA, indem die automatisierte β-Cyanethylphosphoramidit-Methode, die in Bioorganic Chemistry 4: 274-325, 1986, beschrieben ist, eingesetzt wird,
- die Klonierung der so erhaltenen DNA in einen geeigneten Plasmidvektor und die Gewinnung der DNA durch Hybridisierung mit einer geeigneten Sonde.
Eine Weise zur Herstellung von Nukleinsäuren mit einer Länge von über 200 Nukleotiden oder Basenpaaren (wenn es sich um doppelsträngige Nukleinsäuren handelt) auf chemischem Wege umfaßt die folgenden Schritte:
- das Zusammenfügen chemisch synthetisierter Oligonukleotide, die an ihren Enden mit unterschiedlichen Restriktionsstellen versehen sind, deren Sequenzen mit der Abfolge von Aminosäuren des natürlichen Polypeptids kompatibel sind, gemäß dem in Proc. Nat. Acad. Sci, USA 80: 7461-7465, 1983, beschriebenen Prinzip,
- die Klonierung der so erhaltenen DNA in einen geeigneten Plasmidvektor und die Gewinnung der gesuchten Nukleinsäure durch Hybridisierung mit einer geeigneten Sonde.
Ein anderes Verfahren zur Herstellung der Nukleinsäuren der Erfindung ausgehend von mRNA umfaßt die folgenden Schritte:
- Herstellung von zellulärer RNA ausgehend von einem jeglichen Gewebe, das den dopaminergen Rezeptor D-3 exprimiert, gemäß den von Maniatis et al. (1982) (8) und Ausubel, F. M., et al. (1989) (9) beschriebenen Techniken,
- Gewinnung und Reinigung der mRNA durch Leiten der zellulären Gesamt-RNA durch Chromatographie über immobilisiertes oligo-dT,
- Synthese eines cDNA-Strangs ausgehend von den gereinigten mRNAs gemäß der in Gene 25: 263, 1983, beschriebenen Technik,
- Klonierung der so erhaltenen Nukleinsäuren in einen geeigneten Plasmidvektor und Gewinnung der gesuchten Nukleotid sequenz, indem eine geeignete Hybridisierungssonde verwendet wird.
Zur Herstellung der Nukleinsäuren der Erfindung sind die chemisch synthetisierten Oligonukleotid-Hybridisierungssonden die folgenden:
jene, die durch die in Fig. 1 angegebene Nukleinsäuresequenz definiert wird, die sich von dem durch das Nukleotid an Position -6 gebildeten Ende bis zu jenem, das durch das Nukleotid an Position 1266 gebildet wird, erstreckt,
- jene, die durch die in Fig. 1 angegebene Nukleinsäuresequenz definiert wird, die sich von dem durch das Nukleotid an Position 1 gebildeten Ende bis zu jenem, das durch das Nukleotid an Position 1200 gebildet wird, erstreckt,
- jene, die durch die in Fig. 1 angegebene Nukleinsäuresequenz definiert wird, die sich von dem durch das Nukleotid an Position 720 gebildeten Ende bis zu jenem, das durch das Nukleotid an Position 831 gebildet wird, erstreckt, jene, die durch die in Fig. 3 angegebene Nukleinsäuresequenz definiert wird, die sich von dem durch das Nukleotid an Position 1 gebildeten Ende bis zu jenem, das durch das Nukleotid an Position 574 gebildet wird, erstreckt,
- jene, die durch die in Fig. 4 angegebene Nukleinsäuresequenz definiert wird, die sich von dem durch das Nukleotid an Position 1 gebildeten Ende bis zu jenem, das durch das Nukleotid an Position 306 gebildet wird, erstreckt,
oder deren komplementäre Nukleotidsequenz, wobei sich diese Sequenzen von jenen der Fig. 1, 3 und 4 ableiten und unter den von Maniatis et al. (1982) (8) beschriebenen Hybridisierungsbedingungen verwendet werden können.
Die Synthese des cDNA-Strangs und seine nachfolgende in vitro-Amplifizierung können gleichfalls erfolgen, indem die PCR (Polymerase Chain Reaction; Polymerasekettenreaktion)- Methode, wie sie beispielsweise von Goblet et al. (1989) (10) beschrieben wurde, eingesetzt wird, indem zwei chemisch synthetisierte definierte Amplimere ausgehend von der Sequenz der Fig. 1 eingesetzt werden. Geeignete Amplimere sind beispielsweise: jenes, das in der Fig. 1 von Nukleotid -6 bis zum Nukleotid 18 definiert ist, und jenes, das in der Fig. 1 von Nukleotid 1226 bis zum Nukleotid 1251 definiert ist.
Das amplifizierte Nukleinsäurefragment kann dann gemäß den in Ausubel, F. M., et al. (1989) (11) beschriebenen Techniken kloniert werden.
Die Erfindung betrifft gleichfalls die rekombinanten oder rekombinierten Vektoren, insbesondere für die Klonierung und/oder die Expression, insbesondere vom Typ Plasmid, Cosmid, Phage oder Virus, die eine Nukleinsäuren der Erfindung in einer ihrer für ihre Replikation nicht essentiellen Stellen enthalten.
Ein geeigneter Vektor der Erfindung enthält in einer seiner für seine Replikation nicht essentiellen Stellen Elemente, die für die Förderung der Expression eines Polypeptids gemäß der Erfindung in einem zellulären Wirt erforderlich sind, und gegebenenfalls einen Promotor, der durch die Polymerasen des zellulären Wirts erkannt wird, insbesondere einen induzierbaren Promotor, und gegebenenfalls eine Signalsequenz und eine Ankersequenz.
Die Erfindung betrifft gleichfalls einen zellulären Wirt, der durch einen vorstehend definierten rekombinanten Vektor, der die Regulationselemente enthält, die die Expression der eines der Polypeptide gemäß der Erfindung kodierenden Nukleotidsequenz in diesem Wirt erlauben, transformiert ist.
Unter zellulärem Wirt versteht man jeden Organismus, der in der Lage ist, in Kultur gehalten zu werden.
Einer der verwendeten Mikroorganismen kann aus einem Bakterium, insbesondere Escherichia coli, gebildet werden.
Ein Organismus der Wahl wird aus einem eukaryotischen Organismus, wie beispielsweise CHO (Chinese Hamster Ovary)- Zellen (Ovarzellen des chinesischen Hamsters) oder COS-7 (durch das SV-40-Virus transformierte Nierenzellen der afrikanischen grünen Meerkatze), gebildet.
Andere Organismen können aber gleichfalls leicht verwendet werden, natürlich mit der Maßgabe, daß man für jeden von diesen über Vektoren, insbesondere Plasmidvektoren, die in der Lage sind, sich darin zu replizieren, und über Nukleotidsequenzen verfügt, die in diese Vektoren insertierbar sind und in der Lage sind, wenn ihnen in diesen Vektoren ein ein Polypeptid der Erfindung kodierendes Insert folgt, die Expression dieses Inserts in den gewählten Organismen und deren Transport in die Membranen dieser zellulären Wirte sicherzustellen.
Die Erfindung betrifft gleichfalls die Antikörper, die spezifisch gegen eines der Polypeptide der Erfindung gerichtet sind, wobei diese Antikörper so sind, daß sie weder den dopaminergen Rezeptor D-1 noch den dopaminergen Rezeptor D-2 erkennen. Insbesondere erkennen diese Antikörper die folgenden Aminosäuresequenzen:
- jene, die durch die in Fig. 1 angegebene Aminosäuresequenz, die sich von dem durch die Aminosäure an Position 243 gebildeten Ende bis zu jenem, das durch die Aminosäure an Position 277 gebildet wird, erstreckt, definiert wird.
Um die Antikörper zu erhalten, kann man eines der vorstehend genannten Polypeptide in ein Tier injizieren.
Monoklonale Antikörper stellt man durch Zellfusion zwischen Myelomzellen und Milzzellen immunisierter Mäuse gemäß den klassischen Verfahren her.
Die Antikörper der Erfindung können für die in vitro- Diagnose des Tumor- oder Nicht-Tumor-Charakters bestimmter Zellen wie auch des benignen oder malignen Charakters bestimmter Tumore verwendet werden mit der Maßgabe, daß diese Elemente mit der pathologischen Expression des humanen Rezeptors D-3 korreliert sind.
Man konnte tatsächlich feststellen, daß es bei bestimmten Tumoren, insbesondere Lungentumoren, möglich ist, die Expression dopaminerger Rezeptoren nachzuweisen, die normalerweise nicht anwesend sein dürften (Sokoloff et al., (1989) (12)).
Dieses in vitro-Diagnoseverfahren ausgehend von dem biologischen Untersuchungsmaterial, das möglicherweise den humanen dopaminergen Rezeptor D-3 enthält, umfaßt:
- das Inkontaktbringen eines Antikörpers der Erfindung mit dem genannten biologischen Untersuchungsmaterial unter Bedingungen, die gegebenenfalls die Bildung eines immunologischen Komplexes, der zwischen dem humanen dopaminergen Rezeptor D-3 oder einem Derivat von diesem, das eine oder mehrere lokalisierte Mutationen umfaßt und die Eigenschaften eines humanen dopaminergen Rezeptors D-3 bewahrt, einerseits und dem Antikörper der Erfindung andererseits ermöglichen, und
- den Nachweis des gebildeten immunologischen Komplexes.
Die Erfindung betrifft gleichfalls die synthetischen oder nicht-synthetischen Nukleotidsonden, die mit einer der vorstehend definierten Nukleinsäuren oder deren komplementären Sequenzen oder deren korrespondierender RNA hybridisieren, wobei diese Sonden dergestalt sind, daß sie weder mit dem Gen noch den mRNAs der dopaminergen Rezeptoren D-1 und D-2 und des Rezeptors D-3 der Ratte hybridisieren.
Die Sonden der Erfindung umfassen minimal 10, vorteilhafterweise 15 Nukleinsäuren und können maximal die Gesamtheit der in Fig. 1, in Fig. 3 oder in Fig. 4 gezeigten Nukleotidsequenz enthalten.
Für die kürzesten Sonden, d. h. von ungefähr 10 bis ungefähr 100 Nukleotide, sind geeignete Hybridisierungsbedingungen die folgenden:
900 mM NaCl, 90 mM Trinatriumcitrat, pH 7,0, 100 ug/ml Lachssperma-DNA, 0,05% Natriumpyrophosphat, 10 bis 25% entionisiertes Formamid, 0,02% Ficoll (MG: 400000), 0,02% Rinderserumalbumin, 0,02% Polyvinylpyrrolidon während 14 bis 16 h bei 42ºC.
Für die längsten Sonden, d. h. die mehr als ungefähr 100 Nukleotide aufweisen, sind geeignete Hybridisierungsbedingungen die folgenden:
600 mN NaCl, 60 mM Trinatriumcitrat, 20 ug/ml Lachssperma-DNA, 20 ug/ml Hefe-tRNA, 8 mM Tris-HCl, pH 7,4, 40 bis 60% entionisiertes Formamid, 0,02% Ficoll, 0,02% Rinderserumalbumin, 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,2% Natriumdodecylsulfat, 10% Dextransulfat.
Die Erfindung betrifft insbesondere die vorstehend definierten Nukleotidsonden.
Die Sonden der Erfindung können als Werkzeug (Tool) insbesondere der in vitro-Diagnose von neurologischen, psychiatrischen und kardiovaskulären Erkrankungen eingesetzt werden.
Die Sonden der Erfindung können gleichfalls dazu dienen, das alternative Spleißen der mRNA, die von dem die vorstehend definierte Sequenz von 400 Aminosäuren kodierenden Gen erzeugt wird, zu präzisieren, wobei die gegebenenfalls vorliegende Existenz dieses Spleißens mit neurologischen, psychiatrischen, kardiovaskulären oder neuroendokrinen Erkrankungen verbunden sein könnte.
Insbesondere können die Sonden der Erfindung dazu verwendet werden, die genetischen Anomalien, insbesondere Polymorphismen oder Punktmutationen, nachzuweisen.
Was den Nachweis der Polymorphismen des den dopaminergen Rezeptor D-3 kodierenden Gens bei einem Individuum betrifft, kann dieser ausgehend von einer biologischen Probe, wie Blut, die dem Individuum abgenommen wird, gemäß einem Verfahren, das die folgenden Schritte umfaßt, erfolgen:
- die Behandlung der aus der vorstehend erwähnten biologischen Probe stammenden Nukleinsäure, die mittels eines Restriktionsenzyms unter Bedingungen ausgeführt wird, die die Gewinnung von Restriktionsfragmenten ermöglichen, die aus der Spaltung der Nukleinsäure auf der Ebene dieser von dem Enzym erkannten Restriktionsstellen stammen,
- das Inkontaktbringen einer Nukleotidsonde der Erfindung, die zu einer Hybridisierung in der Lage ist, mit den Fragmenten unter Bedingungen, die die gegebenenfalls erfolgen de Bildung von Hybridisierungskomplexen zwischen der Sonde und den Restriktionsfragmenten ermöglichen,
- den Nachweis der Hybridisierungskomplexe,
- das Messen der Größe der gegebenenfalls vorliegenden polymorphen Restriktionsfragmente, die an den Hybridisierungskomplexen beteiligt sind.
Der Nachweis der Polymorphismen des den dopaminergen Rezeptor D-3 kodierenden Gens bei einem Individuum kann gleichfalls ausgeführt werden ausgehend von einer biologischen Probe, wie Blut, die dem Individuum abgenommen wird, gemäß einem Verfahren, das die folgenden Schritte umfaßt:
- die mögliche, vorab erfolgende Amplifizierung der Mengen an Nukleotidsequenzen, die in einer biologischen Probe, die einem Patienten abgenommen worden ist, enthalten sein könnte, mittels zweier DNA-Primer,
- die Behandlung der aus der biologischen Probe stammenden Nukleinsäure oder der Mengen an wie vorstehend angegeben amplifizierten Nukleotidsequenzen, die mittels eines Restriktionsenzyms unter Bedingungen ausgeführt wird, die die Gewinnung von Restriktionsfragmenten ermöglichen, die aus der Spaltung der Nukleinsäure auf der Ebene dieser von dem Enzym erkannten Restriktionsstellen stammen,
- das Inkontaktbringen einer Nukleotidsonde der Erfindung, die zu einer Hybridisierung in der Lage ist, mit den Fragmenten unter Bedingungen, die die gegebenenfalls erfolgende Bildung von Hybridisierungskomplexen zwischen der Sonde und den Restriktionsfragmenten ermöglichen,
- den Nachweis der Hybridisierungskomplexe,
- das Messen der Größe der gegebenenfalls vorliegenden polymorphen Restriktionsfragmente, die an den Hybridisierungskomplexen beteiligt sind.
Als geeignete DNA-Primer können eine Sequenz von ungefähr 20 Basen, die in der sich von Nukleotid 1 bis Nukleotid 227 erstreckenden Sequenz, wie in Fig. 3 angegeben, enthalten sind, und eine andere Sequenz von ungefähr 20 Basen, die in der sich von Nukleotid 502 bis Nukleotid 574 erstreckenden Sequenz, wie in Fig. 4 angegeben, enthalten sind, eingesetzt werden.
Zwei bevorzugte Primer sind beispielsweise:
- jener, der durch das Nukleotid an Position 47 bis zum Nukleotid an Position 67 der Fig. 3 definiert ist,
- jener, der durch das Nukleotid an Position 489 bis zum Nukleotid an Position 509 der Fig. 3 definiert ist.
Was die in vitro-Diagnosemethode zum Nachweis von Punktmutationen der Nukleinsäure oder eines Fragments der Nukleinsäure, die den dopaminergen Rezeptor D-3 kodiert, bei einem Individuum betrifft, kann diese gemäß dem die folgenden Schritte umfassenden Verfahren ausgeführt werden:
- das Inkontaktbringen einer Nukleotidsonde der Erfindung mit einem biologischen Untersuchungsmaterial, beispielsweise Blut, unter Bedingungen, die die gegebenenfalls erfolgende Bildung eines Hybridisierungskomplexes, der zwischen der Sonde und der Nukleinsäure oder einem Fragment dieser Nukleinsäure gebildet wird, ermöglichen,
- den Nachweis des Hybridisierungskomplexes,
- die Sequenzierung der Nukleinsäure oder des Nukleinsäurefragments, die an dem Hybridisierungskomplex beteiligt sind,
- den Vergleich der Sequenz der Nukleinsäure oder des Nukleinsäurefragments, die an dem Hybridisierungskomplex beteiligt sind, mit der Sequenz der Nukleinsäure (die keine Mutation aufweist) oder des Nukleinsäurefragments (das keine Mutation aufweist) des humanen dopaminergen Rezeptors D-3.
Was den Nachweis des alternativen Spleißens der von dem den humanen Rezeptor D-3 kodierenden Gen produzierten mRNA betrifft, kann dieser durch Quantifizierung der mRNA, die in einer Gewebeprobe enthalten ist, erfolgen, indem eine der Sonden der Erfindung verwendet wird.
Die Sonden der Erfindung können gleichfalls eingesetzt werden, um die pathologische Expression des dopaminergen Rezeptors D-3 nachzuweisen, wobei diese Expression durch die Anwesenheit von mRNA des dopaminergen Rezeptors D-3 in Zellen, wo sie nicht anwesend sein dürfte, enthüllt wird.
Dieser in vitro-Nachweis kann ausgehend von einer biologischen Probe, die einem Individuum abgenommen worden ist, wie Blut, gemäß einem Verfahren erfolgen, das die folgenden Schritte umfaßt:
- die mögliche, vorab erfolgende Amplifizierung der Mengen an Nukleotidsequenz, die in einer biologischen Probe, die einem Patienten abgenommen worden ist, enthalten sein könnte, mittels eines DNA-Primers,
- das Inkontaktbringen der vorstehend angegebenen biologischen Probe mit einer Nukleotidsonde unter Bedingungen, die die Bildung eines Hybridisierungskomplexes, der aus der Sonde und der Nukleotidsequenz gebildet wird, ermöglichen,
- den Nachweis des Hybridisierungskomplexes, der sich möglicherweise gebildet hat.
Diese pathologische Expression des humanen dopaminergen Rezeptors D-3 kann sich im Falle bestimmter Tumore manifestieren und kann auch mit dem malignen oder benignen Charakter bestimmter Tumore korreliert sein.
Die Polypeptide der Erfindung können durch Kultur eines zellulären Wirts, der vorab durch einen rekombinanten Vektor, der eine der vorstehend definierten Nukleinsäuren enthält, transformiert worden ist, in einem geeigneten Medium und durch Gewinnung des durch den transformierten zellulären Wirt produzierten Polypeptids ausgehend von der Kultur hergestellt werden.
Ein anderes Verfahren zur Herstellung der Polypeptide der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß man vorzugsweise ausgehend von der C-terminalen Aminosäure nacheinander jeweils zwei aufeinanderfolgende Aminoacylverbindungen in der benötig ten Reihenfolge oder Aminoacylverbindungen und vorab hergestellte Fragmente, die bereits mehrere Aminoacylreste in der geeigneten Reihenfolge enthalten, oder ferner mehrere so vorab hergestellte Fragmente kondensiert, wobei es sich versteht, daß man vorab alle reaktiven Funktionen, die diese Aminoacylverbindungen oder Fragmente tragen, zu schützen hat außer den Aminfunktionen der/des einen und den Carboxylfunktionen der/des anderen oder umgekehrt, die normalerweise an der Bildung der Peptidbindungen teilnehmen müssen, insbesondere nach Aktivierung der Carboxylfunktion, gemäß den in der Peptidsynthese bekannten Methoden und so nach und nach fort bis zu der N-terminalen Aminosäure.
Handelt es sich um die Realisierung der Expression der humanen dopaminergen Rezeptoren D-3 in einem Bakterium, wie E. coli, oder in einer eukaryotischen Zelle, wie einer CHO-Zelle, führt man die folgenden Schritte aus:
- die Transformation eines kompetenten zellulären Wirts mit einem Vektor, insbesondere einem Plasmid oder einem Phagen, in den man vorab eine Nukleotidsequenz, die den humanen Rezeptor D-3 kodiert, (Insert) unter der Kontrolle von Regulationselementen, insbesondere eines Promotors, der von den Polymerasen des zellulären Wirts erkannt wird und die Expression der Nukleotidsequenz in dem verwendeten zellulären Wirt ermöglicht, insertiert hat,
- die Züchtung oder Kultur des transformierten zellulären Wirts unter Bedingungen, die die Expression des Inserts und den Transport des exprimierten humanen Rezeptors D-3 zu der Membran dergestalt ermöglichen, daß die Transmembransequenzen des humanen Rezeptors D-3 auf der Oberfläche des transformierten zellulären Wirts exponiert werden.
Handelt es sich um die Expression in eukaryotischen Zellen, können die Regulationselemente den endogenen Promotor der dopaminergen Rezeptoren oder virale Promotoren, wie jene des SV-40-Virus oder des Rous-Sarkom-Virus (RSV), umfassen.
Handelt es sich um die Expression in E. coli, können die Regulationselemente den Promotor des Lactose-Operons oder des Tryptophan-Operons umfassen.
Die Erfindung betrifft gleichfalls ein Verfahren zum Nachweis der Fähigkeit eines dopaminergen Moleküls, sich als Ligand gegenüber einem Polypeptid der Erfindung zu verhalten, wobei das Verfahren umfaßt:
- das Inkontaktbringen des dopaminergen Moleküls mit einem zellulären Wirt, der vorab transformiert worden ist durch einen Vektor, der seinerseits durch ein Insert, das das Polypeptid kodiert, modifiziert worden ist, wobei dieser Wirt auf seiner Oberfläche eine oder mehrere für dieses Polypeptid spezifische Stellen trägt, gegebenenfalls nach Induktion der Expression dieses Inserts, wobei dieses Inkontaktbringen unter Bedingungen ausgeführt wird, die die Bildung einer Bindung zwischen mindestens einer dieser spezifischen Stellen und dem Molekül ermöglichen, sobald es sich herausstellt, daß es tatsächlich eine Affinität für dieses Polypeptid aufweist,
- den Nachweis der gegebenenfalls erfolgten Bildung eines Komplexes des Typs Ligand-Polypeptid.
Die Erfindung betrifft gleichfalls ein Verfahren zum Untersuchen der Affinität eines Polypeptids der Erfindung für einen oder mehrere bestimmte Liganden, wobei das Verfahren umfaßt:
- die Transformation eines kompetenten zellulären Wirts mit einem Vektor, insbesondere einem Plasmid oder einem Phagen, in den man vorab eine Nukleotidsequenz, die den humanen Rezeptor D-3 kodiert, (Insert) unter der Kontrolle von Regulationselementen, insbesondere eines Promotors, der von den Polymerasen des zellulären Wirts erkannt wird und die Expression der Nukleotidsequenz in dem verwendeten zellulären Wirt ermöglicht, insertiert hat,
- die Züchtung oder Kultur des transformierten zellulären Wirts unter Bedingungen, die die Expression des Inserts und den Transport des exprimierten humanen Rezeptors D-3 zu der Membran dergestalt ermöglichen, daß die Transmembransequenzen des humanen Rezeptors D-3 auf der Oberfläche des transformierten zellulären Wirts exponiert werden,
- das Inkontaktbringen dieses zellulären Wirts mit diesen bestimmten Liganden,
- den Nachweis einer spezifischen Bindung zwischen dem transformierten zellulären Wirt und den bestimmten Liganden.
Das vorstehend beschriebene Verfahren erlaubt gleichfalls die Identifizierung der "Fragmente, die die Stellen enthalten", die vorstehend angesprochen wurden und die lediglich einen Teil der Sequenz von 400 Aminosäuren der Fig. 1 enthalten.
Diese Identifizierung besteht darin, Inserts mit einer stärker verringerten Größe als die Nukleinsäure, die die vorstehend angesprochene Sequenz kodiert, zu verwenden, die Schritte für eine Expression, einen Transport des Expressionsprodukts und die Exposition, wie sie vorstehend wiederholt worden sind, auszuführen. Wenn man die Expression, den Transport des Expressionsprodukts und seine Exposition auf der Membran erhält wie auch die Reaktion mit den Liganden, wie sie vorstehend definiert wurde, kann man so die Fragmente bestimmen, die die essentiellen Stellen enthalten. Folglich könnte das Fehlen einer Reaktion mit den Liganden, wie sie vorstehend definiert wurde, unter Verwendung von Fragmenten mit einer stärker verringerten Größe als der vollständigen Sequenz zeigen, daß man bestimmte essentielle Stellen beseitigt hat.
Andere Eigenschaften und Vorteile der Erfindung ergeben sich in der Folge der Beschreibung und der Beispiele, insbesondere unter Bezugnahme auf die Zeichnungen und Tabellen, in denen:
- die Fig. 1 die Nukleinsäuresequenz des humanen dopaminergen Rezeptors D-3 und die entsprechende Aminosäuresequenz zeigt,
- die Fig. 2 die Aminosäuresequenzen des dopaminergen Rezeptors D-3 (zweite Zeile) der Ratte, dargestellt in einem Alignment (einer Zuordnung beruhend auf Homologie) mit jener des humanen dopaminergen Rezeptors D-3 (erste Zeile), zeigt. In den Sequenzen des dopaminergen Rezeptors D-3 der Ratte sind die identischen Aminosäurereste und die Aminosäurereste an analoger Position zu jenen des humanen dopaminergen Rezeptors D-3 durch Doppelstriche (=) markiert.
Um die Homologie nachzuweisen, wurden Deletionen in den zwei Sequenzen vorgenommen und diese Deletionen sind durch die gepunkteten Bereiche (-) in der Sequenz des Rezeptors D-3 der Ratte angegeben.
Die einfachen Linien zwischen den Zeilen, die dem humanen Rezeptor D-3 bzw. dem Rezeptor D-3 der Ratte entsprechen, entsprechen der Tatsache, daß es keine Homologie gibt.
In dem N-terminalen extrazellulären Bereich des Rezeptors D-3 befinden sich die Consensus-Sequenzen für die Asparaginverknüpften Glykosylierungsstellen (NXS/T) an den Positionen 12 und 19 (Fig. 2).
Der Prozentsatz an Homologie, der zwischen dem Rezeptor D- 3 der Ratte und dem humanen Rezeptor D-3 existiert, beträgt 78,7%.
- Die Fig. 3 entspricht einem Teil des Gens des humanen Rezeptors D-3 nahe dem 5'-Terminus des kodierenden Bereichs; die Sequenz, die sich in Fig. 3 von dem durch das Nukleotid an Position 228 gebildeten Ende bis zu jenem, das durch das Nukleotid an Position 501 gebildet wird, erstreckt, entspricht der (kodierenden) Nukleinsäuresequenz, die sich von dem durch das Nukleotid an Position 1 gebildeten Ende bis zu jenem, das durch das Nukleotid an Position 274 gebildet wird, wie in Fig. 1 angegeben, erstreckt.
- Die Fig. 4 entspricht einem Teil des Gens des humanen Rezeptors D-3 nahe dem 3'-Terminus des kodierenden Bereichs; die Sequenz, die sich in Fig. 4 von dem durch das Nukleo tid an Position 47 gebildeten Ende bis zu jenem, das durch das Nukleotid an Position 240 gebildet wird, erstreckt, entspricht der (kodierenden) Nukleinsäuresequenz, die sich von dem durch das Nukleotid an Position 1007 gebildeten Ende bis zu jenem, das durch das Nukleotid an Position 1200 gebildet wird, wie in Fig. 1 angegeben, erstreckt.

BEISPIEL 1: Bestimmung der Nukleotidsequenz des humanen dopaminergen Rezeptors D-3 und Übersetzung derselben in Aminosäuren

Methode

Eine humane genomische partielle Sau3A-Bibliothek in EMBL 3 (Clontech) wurde mittels zweier mittels ³²P radioaktiv markierter cDNAs, erhalten durch Schneiden von den Rezeptor D-3 der Ratte kodierender cDNA, gescreent; eine der cDNAs wird ausgehend von dem Rezeptor D-3 der Ratte, geschnitten durch ClaI-PstI, erhalten, was die Sonde 1 liefert (N-terminaler Teil + Transmembranbereich MbI + Transmembranbereich MbII), und die andere cDNA wird ausgehend von dem Rezeptor D-3 der Ratte, geschnitten durch BstXI-EcoRI, erhalten, was die Sonde 2 liefert (C-terminaler Teil + Transmembranbereich MbVI + Transmembranbereich MbVII) (Sokoloff et al., 1990).
Die Phagen der genomischen Bibliothek (940000 Klone) werden auf Nitrocellulosemembranen (BAS-85; Schleicher und Schüll) transferiert, die 4 h bei 42ºC vorhybridisiert (40% Formamid, 4xSSC, 1 · Denhardt's, 8 mM Tris-HCl, pH 7,4, 20 ug/ml Hefe-tRNA, 20 ug/ml Lachssperma, 0,1% SDS) und 14 h bei 42ºC hybridisiert (gleiche Lösung + 10% Dextransulfat) werden in Anwesenheit von 700000 cpm/ml Sonde 1 oder Sonde 2, die vorstehend definiert wurden, (spezifische Aktivität 10&sup9; cpm/ug DNA).
Dann werden die Membranen zweimal 15 min bei 42ºC (2 · SSC, 0,1% SDS) und zweimal 15 min bei 42ºC bzw. 50ºC (0,2 · SSC, 0,1% SDS) gewaschen. Dann werden die Membranen auf Radio graphiefilme (XAR 5, Kodak) bei -70ºC in Anwesenheit von Verstärkerschirmen aufgelegt. Die Radiographiefilme werden nach 5 h Exposition entwickelt.
Mit der Sonde 2 (3'-Ende) wird ein positiver Klon erhalten, der ein reaktives EcoRI-Fragment von 4,8 kb enthält, das in M13 subkloniert und sequenziert wird.
Mit der Sonde 1 (5'-Ende) werden fünf positive Klone erhalten, die ein reaktives SacI-Fragment von 1,2 kb und ein reaktives EcoRI-Fragment von 2,5 kb enthalten, die in M13 subkloniert und sequenziert werden.
Die genomische DNA-Sequenz erlaubt es, die Anwesenheit offener Leseraster, die eine hohe Homologie zu der Sequenz des Rezeptors D-3 der Ratte aufweisen, festzustellen.
Es werden für die PCR-Amplifizierung einsetzbare Primer synthetisiert:
in 3':
A: TTG AAT TCC TGG CAG CTA GAA ATG GGT ACA A
in 5':
B: CGA ATT C AT G GC ATC TCT GAG CCA GCT GAG TA
in 3':
C: AAG AAT TCA GAT CTT CTG CTC CCT CAG CAA G
Ein cDNA-Einzelstrang wird ausgehend von mRNA aus humanem Corpus mamillare und reverser Transkriptase (20 U, Boehringer) mit dem Primer B (375 mM) synthetisiert.
Diese Matrize wird durch die Thermophylus Aquaticus- Polymerase (Cetus, 2,5 U) mittels der Primer B und A (jeweils 75 mM) während 30 Zyklen (92ºC, 56ºC, 72ºC, jeweils 1 min) amplifiziert.
Die Produkte der Reaktion werden durch Elektrophorese auf einem 1% Agarosegel getrennt und eine Bande des Gels (zwischen 1 und 1,4 kb) wird ausgeschnitten, die DNA extrahiert (geneclean, BIO 101) und erneut zwischen den Primern B und C ampli fiziert. Die dann durch Färbung mit Ethidiumbromid auf einem Agarosegel sichtbare DNA (1,2 kb) wird erneut extrahiert, durch Polynukleotidkinase (10 U, Boehringer) phosphoryliert und in pGEM 42 (Promega), der durch SmaI geschnitten worden ist, subkloniert.
Ein vollständiges Fragment wird aus dem Plasmid durch KpnI und BglII ausgeschnitten und in M13 für eine Sequenzierung subkloniert.
Die Sequenz liefert ein offenes Leseraster von 400 Aminosäuren mit 79% Gesamthomologie zu dem Rezeptor D-3 der Ratte und 93%, wenn man die dritte intrazytoplasmatische Schleife nicht berücksichtigt.

BEISPIEL II: Expression des Rezeptors D-3 in transfizierten CHO-Zellen:

Es wurde die Inhibition der ¹²&sup5;I-Iodsulprid-Bindung durch Agonisten und Antagonisten von Dopamin gemessen.

METHODE:

Die Expressionsvektoren leiten sich von dem Plasmid pSV D- 2 ab, dessen Konstruktion in dem Nature-Artikel, der vorstehend erwähnt wurde, angegeben ist.
Um den humanen Rezeptor D-3 zu exprimieren, wird der Vektor erhalten, indem das Fragment aus der Restriktion von PSV D-2 durch HindIII-BglII durch ein Fragment aus der BglII-KpnI- Restriktion des Plasmids pGEM4Z ersetzt wurde, indem ein HindIII-KpnI-Oligonukleotidadaptor (AGCTGTAC) verwendet wurde, was zu dem Plasmid pSV D-3 human führt.
Diese Konstruktionen werden kultiviert und auf einem Caesiumchloridgradienten gereinigt (Sambrook, J., et al., Molecular cloning - a laboratory manual. C. Nolan, Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) und damit chinesische Hamster-Ovarzellen (CHO-K1), die Dihydrofolatreduktasedefizient waren, transfiziert, indem Lipofectin® (Bethesda Re search Laboratory, Gaithersburgh, USA) verwendet wurde. Die stabilen Transfektanten werden in einem Kulturmedium (Dulbecco's Modified Eagle-Medium) ohne Hypoxanthin und ohne Thymidin selektioniert.
Die Expression des Rezeptors D-3 wird durch die Bindung von ¹²&sup5;I-Iodsulprid an Membranen transfizierter Zellen gemäß der Technik von Martres und Kollegen, 1985 (7), nachgewiesen. Die Bindungsexperimente werden ausgeführt (11) in einem Puffer aus Tris-HCl, 50 mM (Gesamtvolumen 400 ul), der NaCl, 120 mM, KCl, 5 mM, CaCl&sub2;, 2 mM, MgCl&sub2;, 2 mM, 0,1% Ascorbinsäure, 8- Hydroxychinolein, 10 uM, 0,1% Rinderserumalbumin und ¹²&sup5;I- Iodsulprid, 0,1 bis 0,2 nM, enthält.

ERGEBNISSE

Der humane Rezeptor D-3 wird in CHO-Zellen exprimiert, die normalerweise keine Bindungsstellen für ¹²&sup5;I-Iodsulprid haben.
In den permanent transfizierten CHO-Zellklonen beträgt der KD-Wert 1,1 nM und der Wert Bmax (Bmax steht für die maximale Konzentration an Rezeptor D-3) liegt bei ungefähr 0,6 umol/mg Membranprotein.
Die Ergebnisse hinsichtlich der Pharmakologie des in CHO- Zellen exprimierten humanen Rezeptors D-3 sind nachfolgend angegeben:

Mittel KI-Wert (nM)

- Agonisten:

* Dopamin 39,6 ± 4,2
* Dopamin + Gpp(NH)p 43,5 ± 3,9
* Chinpirol 10,3 ± 1,0

- Antagonisten:

* Domperidon 4,33 ± 0,40
* Haloperidol 4,25 ± 0,61
* Amisulprid 2,20 ± 0,20
* Pimozid 0,67 ± 0,06
* (+)UH 232 22,05 ± 1,70
* Iodsulprid 1,10 ± 0,10

BEISPIEL III - Modell zur Untersuchung der Funktion des humanen Rezeptors D-3:

Die mit dem humanen Rezeptor D-3 transfizierte CHO-Zelle erlaubt nicht, eine funktionelle Antwort der Stimulation dieses Rezeptors zu messen. In dieser Zelle konnte weder eine Aktivierung noch eine Inhibition der bekannten Transduktionswege (Adenylatcyclase, Phospholipase C und Phospholipase A2) nachgewiesen werden. Dies wurde der Tatsache zugeschrieben, daß die CHO-Zelle kein für die Kopplung mit dem Rezeptor D-3 spezifisches transduzierendes G-Protein exprimiert.
Beispielsweise weiß man, daß die CHO-Zelle kein Go-Protein exprimiert, während sie andere aus der gleichen Familie von G- Proteinen stammende Proteine exprimiert.
Diese Hypothese wird genau bestätigt, da eine CHO-Zelle, die zugleich mit dem humanen Rezeptor D-3 und der Untereinheit α&sub0; des Proteins G&sub0; (Protein α&sub0;) transfiziert worden ist, es erlaubte, eine funktionelle Antwort zu messen.

METHODEN

Eine das Protein α&sub0; der Ratte kodierende Nukleinsäure wurde durch PCR-Amplifizierung mit von der von der Untereinheit α&sub0; veröffentlichen Sequenz abgeleiteten Primern erhalten. Die Sequenz der Untereinheit α&sub0; wurde von Jones und Reed veröffentlicht (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987, 262, 14241-14249).
Die verwendeten Primer sind die folgenden:
5': TTA. TCT. AGA. AGG. GGC. CAC. CAT. GGG. ATG. TA
3': TAC. GAG. CTC. AAG. AAG. TCA. GTA. CAA. GCC. AC
Die erhaltene Nukleinsäure wurde durch die Restriktionsenzyme SacI und XbaI (Stellen in den Primern enthalten) verdaut und in einen Expressionsvektor pEUK-C (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, Vereinigte Staaten) subkloniert. Dieses Plasmid wird hergestellt und, wie in Beispiel II beschrieben, damit und gleichzeitig mit einem Plasmid pUT 523 (Cayla, Toulouse, Frankreich), das ein Phleomycinresistenzgen enthält, eine Transfektion durchgeführt. Die Transfektanten werden in dem gleichen Kulturmedium wie jenes des vorangegangenen Beispiels, das Phleomycin enthält, selektioniert.
In diesen Zellen wurde die Variation der Konzentration intrazellulären Calciums gemäß der von Malgaroli und Kollegen (J. Cell. Biol. 1987, 105: 2145-2155) und Vallar und Kollegen (J. Biol. Chem. 1988, 263: 10127-10134) beschriebenen Technik registriert.

ERGEBNISSE:

In der CHO-Zelle, die zugleich den humanen Rezeptor D-3 und das Protein α&sub0; exprimiert, stellt man fest, daß Dopamin die Konzentration von intrazellulärem Calcium mit einer wirksamen Konzentration 50 in einer Größenordnung von 1 nM erhöht. Zur Erinnerung entspricht die wirksame Konzentration 50 dem Wert der Konzentration an Dopamin, mit der man die Hälfte der maxi malen Erhöhung der Konzentration von intrazellulärem Calcium erhält. Die Reaktion auf 100 nM Dopamin wird vollständig durch einen Antagonisten gegenüber dem humanen dopaminergen Rezeptor D-3, wie beispielsweise (+)UH 232 in einer Konzentration von 1 uM, antagonisiert.
Dieses funktionelle Modell erlaubt es, die Agonisten- oder Antagonistenfähigkeit von Molekülen gegenüber dem humanen dopaminergen Rezeptor D-3 nachzuweisen und die wirksamen Konzentrationen 50 der Agonisten auszuwerten.
Um die Agonisten- oder Antagonistenfähigkeit eines Moleküls gegenüber dem Rezeptor D-3 zu bestimmen, kann man eine Wirtszelle, wie beispielsweise eine CHO-Zelle, die gleichzeitig mit dem humanen dopaminergen Rezeptor D-3 und der Untereinheit α&sub0; des Proteins G&sub0; transfiziert ist, mit einem Molekül, bezüglich welchem man die Agonisten- oder Antagonistenfähigkeit zu bestimmen wünscht, zusammenbringen,
- wenn eine Erhöhung der Konzentration an intrazellulärem Calcium bezogen auf die Konzentration von intrazellulärem Calcium in Abwesenheit dieses Moleküls auftritt, schließt man daraus, daß das Molekül ein Agonist gegenüber D-3 ist,
- wenn es keine Modifizierung der Konzentration an intrazelulärem Calcium gibt, bringt man die Wirtszelle in Gegenwart von Dopamin und dem genannten Molekül, und wenn eine Verringerung der Konzentration an intrazellulärem Calcium bezogen auf jene, die in Gegenwart von Dopamin erhalten wird, auftritt, schließt man daraus, daß das Molekül ein Antagonist gegenüber D-3 ist.
Um die wirksame Konzentration 50 eines Moleküls zu bestimmen, bei dem man eine Agonistennatur definiert hat, bestimmt man die Konzentration dieses Moleküls, die die Hälfte der maximalen Erhöhung der Konzentration von intrazellulärem Calcium erzeugt.

BIBLIOGRAPHIE

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13. Sokoloff, P., B. Giros, M. P. Martres, M. L. Bouthenet und J. C. Schwartz, "Molecular cloning and Characterization of a novel dopamine receptor (D3) as a target for neuroleptics", Nature, 1990, 347, S. 146-151.

Claims

1. Polypeptid mit einer Aktivität eines dopaminergen Rezeptors, umfassend:

- die Sequenz von 400 Aminosäuren der Fig. 1,

- oder ein Fragment dieser Sequenz, wobei dieses Fragment dergestalt ist, daß

- es entweder gleichwohl die in dieser Sequenz enthaltenen Stellen enthält, deren Anwesenheit erforderlich ist, damit, wenn dieses Fragment auf der Oberfläche einer Zelle exponiert wird, es in der Lage ist, Dopamin, seine Agonisten oder Antagonisten auf spezifische und meßbare Weise, beispielsweise mittels eines radioaktiven Liganden gemäß der in Sokoloff et al. (1980)(6) und Martres et al. (1985)(7) beschriebenen Technik, zu binden, wobei diese Stellen sich von den in dem Rezeptor D-3 der Ratte enthaltenen Stellen unterscheiden,

- oder es durch Antikörper erkannt werden kann, die gleichfalls die Sequenz von 400 Aminosäuren erkennen, aber weder den dopaminergen Rezeptor D-1, noch den dopaminergen Rezeptor D-2, noch den dopaminergen Rezeptor D-3 der Ratte erkennen,

- oder es Antikörper erzeugen kann, die die Sequenz von 400 Aminosäuren erkennen, aber weder den dopaminergen Rezeptor D-1, noch den dopaminergen Rezeptor D-2, noch den dopaminergen Rezeptor D-3 der Ratte erkennen, oder Polypeptidvarianten, die den vorstehend definierten Polypeptiden entsprechen und bestimmte lokalisierte Mutationen tragen, ohne daß die Polypeptide die Eigenschaften eines dopaminergen Rezeptors verlieren, und insbesondere die Polypeptide, die mindestens eine der vier folgenden Mutationen aufweisen (wobei die Positionen der Aminosäuren, die mutiert werden können, bezogen auf die Fig. 1 gekennzeichnet sind):

Ser an Position 9 wird durch Gly ersetzt,

Ala an Position 79 wird durch Val ersetzt,

Val an Position 189 wird durch Ile ersetzt,

Ile an Position 397 wird durch Thr ersetzt,

und insbesondere die Polypeptide, die die vier vorstehend angegebenen Mutationen aufweisen.

2. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es durch die in der Fig. 1 angegebene Sequenz gebildet wird, die sich von dem durch die Aminosäure an Position 1 gebildeten Ende bis zu jenem, das durch das Ende an Position 400 gebildet wird, erstreckt.

3. Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß sie umfaßt oder gebildet wird durch eine Aneinanderreihung von Nukleotiden, die am Ende der Translation oder am Ende der Transkription und der Translation zu einem der Polypeptide nach einem der Ansprüche 1 oder 2 führt.

4. Nukleinsäure nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie umfaßt oder gebildet wird durch

- die Aneinanderreihung von Nukleotiden, die in Fig. 3 angegeben ist und sich von dem durch das Nukleotid 1 gebildeten Ende bis zu jenem, das durch das Nukleotid 574 gebildet wird, erstreckt, oder durch

- die Aneinanderreihung von Nukleotiden, die in Fig. 4 angegeben ist und sich von dem durch das Nukleotid 1 gebildeten Ende bis zu jenem, das durch das Nukleotid 306 gebildet wird, erstreckt,

- die Aneinanderreihung von Nukleotiden, die in Fig. 1 angegeben ist und sich von dem durch das Nukleotid -6 gebildeten Ende bis zu jenem, das durch das Nukleotid 1266 gebildet wird, erstreckt, oder

- durch die Aneinanderreihung von Nukleotiden, die in Fig. 1 angegeben ist und sich von dem durch das Nukleotid 1 gebildeten Ende bis zu jenem, das durch das Nukleotid 1200 gebildet wird, erstreckt,

oder die Nukleinsäuren, die mindestens eine der folgenden sechs Mutationen aufweisen (wobei die Positionen der Nukleotide, die mutiert sein können, bezogen auf die Fig. 1 gekennzeichnet sind):

A an Position 25 wird durch G ersetzt,

A an Position 51 wird durch G ersetzt,

C an Position 236 wird durch T ersetzt,

G an Position 565 wird durch A ersetzt,

T an Position 876 wird durch C ersetzt,

T an Position 1190 wird durch C ersetzt,

und insbesondere die Nukleinsäuren, die die Gesamtheit der sechs Mutationen umfassen.

5. Rekombinanter Vektor, insbesondere für die Klonierung und/oder die Expression, insbesondere vom Typ Plasmid, Cosmid, Phage oder Virus, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 3 und 4 in einer seiner für seine Replikation nicht essenziellen Stellen enthält.

6. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß er in einer seiner für seine Replikation nicht essenziellen Stellen Elemente, die zur Förderung der Expression einer Aminosäuresequenz nach den Ansprüchen 1 oder 2 in einem zellulären Wirt erforderlich sind, und gegebenenfalls einen von den Polymerasen des zellulären Wirts erkannten Promotor, insbesondere eine induzierbaren Promotor, und gegebenenfalls eine Signalsequenz und eine Ankersequenz enthält.

7. Durch einen rekombinanten Vektor nach einem der Ansprüche 5 oder 6 transformierter zellulärer Wirt, der die Regulationselemente umfaßt, die die Expression der Nukleotidsequenz, die das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 oder 2 kodiert, in diesem Wirt ermöglichen.

8. Transformierter zellulärer Wirt nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß er unter den Bakterien, insbesondere E. coli, ausgewählt wird.

9. Transformierter zellulärer Wirt nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß er unter den eukaryotischen Organismen, wie den CHO- oder COS-7-Zellen ausgewählt wird.

10. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er (sie) auf spezifische Weise gegen ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 oder 2 gerichtet ist (oder sind) und daß er (sie) weder den dopaminergen Rezeptor D-1, noch den dopaminergen Rezeptor D-2 erkennt (oder erkennen), und insbesondere jener oder jene, der bzw. die die folgenden Aminosäuresequenzen erkennt bzw. erkennen:

- jene, die durch die in Fig. 1 angegebene Aminosäuresequenz, die sich von dem durch die Aminosäure an Position 243 gebildeten Ende bis zu jenem, das durch die Aminosäure an Position 277 gebildet wird, erstreckt, definiert wird.

11. Nukleotidsonde, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einer der Nukleinsäuren nach den Ansprüchen 3 und 4 oder deren komplementären Sequenzen unter solchen Hybridisierungsbedingungen, unter denen sie mit den Genen oder der mRNA der dopaminergen Rezeptoren D-1 oder D-2 und des dopaminergen Rezeptors D-3 der Ratte nicht hybridisiert, hybridisiert, und insbesondere die Sonden, die aus den folgenden Nukleotidsonden ausgewählt werden:

- jene, die durch die in Fig. 1 angegebene Nukleinsäuresequenz, die sich von dem durch das Nukleotid an Position -6 gebildeten Ende bis zu jenem, das durch das Nukleotid an Position 1266 gebildet wird, erstreckt, definiert wird,

- jene, die durch die in Fig. 1 angegebene Nukleinsäuresequenz, die sich von dem durch das Nukleotid an Position 1 gebildeten Ende bis zu jenem, das durch das Nukleotid an Position 1200 gebildet wird, erstreckt, definiert wird,

- jene, die durch die in Fig. 1 angegebene Nukleinsäuresequenz, die sich von dem durch das Nukleotid an Position 720 gebildeten Ende bis zu jenem, das durch das Nukleotid an Position 831 gebildet wird, erstreckt, definiert wird,

- jene, die durch die in Fig. 3 angegebene Nukleinsäuresequenz, die sich von dem durch das Nukleotid an Position 1 gebildeten Ende bis zu jenem, das durch das Nukleotid an Position 574 gebildet wird, erstreckt, definiert wird,

- jene, die durch die in Fig. 4 angegebene Nukleinsäuresequenz, die sich von dem durch das Nukleotid an Position 1 gebildeten Ende bis zu jenem, das durch das Nukleotid an Position 306 gebildet wird, erstreckt, definiert wird,

oder deren komplementäre Nukleotidsequenz.

12. Verfahren zum Nachweis der Fähigkeit eines Moleküls, sich als Ligand gegenüber einem Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 zu verhalten, gekennzeichnet durch:

- das Inkontaktbringen des Moleküls mit einem zelluären Wirt, der vorab transformiert worden ist durch einen Vektor, der seinerseits durch ein Insert, das das Polypeptid kodiert, modifiziert worden ist, wobei dieser Wirt auf seiner Oberfläche eine oder mehrere spezifische Stellen dieses Polypeptids trägt, gegebenenfalls nach Induktion der Expression dieses Inserts, wobei dieses Inkontaktbringen unter Bedingungen ausgeführt wird, die die Bildung einer Bindung zwischen mindestens einer dieser spezifischen Stellen und dem Molekül ermöglichen, sobald es sich herausstellt, daß es tatsächlich eine Affinität für dieses Polypeptid aufweist,

- den Nachweis der gegebenenfalls erfolgten Bildung eines Komplexes des Typs Ligand-Polypeptid.

13. Verfahren zur Untersuchung der Affinität eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 oder 2 für einen oder mehrere bestimmte Liganden, gekennzeichnet durch:

- die Transformation eines kompetenten zellulären Wirts mit einem Vektor, insbesondere einem Plasmid oder einem Phagen, in den man vorab eine Nukleotidsequenz, die den humanen Rezeptor D- 3 kodiert, (Insert) unter der Kontrolle von Regulationselementen, insbesondere eines Promotors, der von den Polymerasen des zellulären Wirts erkannt wird und die Expression der Nukleo tidsequenz in dem verwendeten zellulären Wirt ermöglicht, insertiert hat,

- die Züchtung des transformierten zellulären Wirts unter Bedingungen, die die Expression des Inserts und den Transport des exprimierten humanen Rezeptors D-3 zu der Membran dergestalt ermöglichen, daß die Transmembransequenzen des Rezeptors D-3 auf der Oberfläche des transformierten zellulären Wirts exponiert werden,

- das Inkontaktbringen dieses zellulären Wirts mit diesen bestimmten Liganden,

- den Nachweis einer Affinitätsreaktion zwischen dem transformierten zellulären Wirt und den bestimmten Liganden.

14. in vitro-Diagnoseverfahren für die pathologische Expression des humanen dopaminergen Rezeptors D-3, in welchem man eine oder beliebige mehrere der gemäß Anspruch 11 definierten Sonden verwendet, welches die folgenden Schritte umfaßt:

- die mögliche, vorab erfolgende Amplifizierung der Mengen an Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 3 oder 4, die in einer biologischen Probe, die einem Patienten abgenommen worden ist, enthalten sein könnte, mittels DNA-Primer,

- das Inkontaktbringen der vorstehend angegebenen biologischen Probe mit einer Nukleotidsonde nach Anspruch 11 unter Bedingungen, die die Bildung eines Hybridisierungskomplexes, der aus der Sonde und der Nukleotidsequenz gebildet wird, ermöglichen,

- den Nachweis des Hybridisierungskomplexes, der sich möglicherweise gebildet hat.

15. in vitro-Diagnoseverfahren für genetische Anomalien, insbesondere Polymorphismen des den humanen dopaminergen Rezeptor D-3 kodierenden Gens, die mit psychiatrischen, neurologischen, kardiovaskulären oder neuroendokrinen Erkrankungen korreliert werden können, ausgehend von einer biologischen Probe, wie Blut, das einem Patienten abgenommen worden ist, gemäß einem Verfahren, das die folgenden Schritte umfaßt:

- die Behandlung der aus der biologischen Probe stammenden Nukleinsäure, die mittels eines Restriktionsenzyms unter Bedingun gen ausgeführt wird, die die Gewinnung von Restriktionsfragmenten ermöglichen, die aus der Spaltung der Nukleinsäure auf der Ebene dieser von dem Enzym erkannten Restriktionsstellen stammen,

- das Inkontaktbringen einer Nukleotidsonde nach Anspruch 11, die zu einer Hybridisierung in der Lage ist, mit den Fragmenten unter Bedingungen, die die gegebenenfalls erfolgende Bildung von Hybridisierungskomplexen zwischen der Sonde und den Restriktionsfragmenten ermöglichen,

- den Nachweis der Hybridisierungskomplexe,

- das Messen der Größe der gegebenenfalls vorliegenden polymorphen Restriktionsfragmente, die an den Hybridisierungskomplexen beteiligt sind.

16. in vitro-Diagnoseverfahren zum Nachweis von Punktmutationen der Nukleinsäure oder eines Fragments der Nukleinsäure, die den humanen dopaminergen Rezeptor D-3 kodiert, gemäß den Ansprüchen 3 oder 4 bei einem Patienten, welches die folgenden Schritte umfaßt:

- das Inkontaktbringen einer Nukleotidsonde nach Anspruch 11 mit einem biologischen Untersuchungsmaterial, beispielsweise Blut, unter Bedingungen, die die gegebenenfalls erfolgende Bildung eines Hybridisierungskomplexes, der zwischen der Sonde und der Nukleinsäure oder dem Nukleinsäurefragment gebildet wird, ermöglichen,

- den Nachweis des Hybridisierungskomplexes,

- die Sequenzierung der Nukleinsäure oder des Nukleinsäurefragments, die an dem Hybridisierungskomplex beteiligt sind,

- den Vergleich der Sequenz der Nukleinsäure oder des Nukleinsäurefragments, die an dem Hybridisierungskomplex beteiligt sind, mit der Sequenz der Nukleinsäure (die keine Mutation aufweist) oder des Nukleinsäurefragments (das keine Mutation aufweist) des humanen dopaminergen Rezeptors D-3.

17. in vitro-Diagnoseverfahren für die pathologische Expression des humanen dopaminergen Rezeptors D-3 ausgehend von einem biologischen Untersuchungsmaterial, in welchem man einen oder meh rere Antikörper nach Anspruch 10 einsetzt, umfassend die folgenden Schritte:

- das Inkontaktbringen eines Antikörpers nach Anspruch 10 mit dem biologischen Untersuchungsmaterial unter Bedingungen, die die gegebenenfalls erfolgende Bildung eines immunologischen Komplexes ermöglichen, der zwischen dem humanen dopaminergen Rezeptor D-3 oder einem Derivat davon, das eine oder mehrere lokalisierte Mutationen umfaßt und die Eigenschaften des humanen dopaminergen Rezeptors D-3 bewahrt, einerseits und dem Antikörper der Erfindung andererseits gebildet wird, und

- den Nachweis des gebildeten immunologischen Komplexes.

18. Verfahren zur Auswertung der Agonisten- oder Antagonistenfähigkeit eines Moleküls oder Arzneimittels gegenüber dem humanen dopaminergen Rezeptor D-3, bei dem man eine gemäß den Ansprüchen 7 und 9 definierte Wirtszelle einsetzt, die mit einem Vektor, der das Gen der α-Untereinheit des G&sub0;-Transduktionsproteins enthält, transformiert worden ist,

- wenn eine Erhöhung der Konzentration an intrazellulärem Calcium bezogen auf die Konzentration an intrazellulärem Calcium in Abwesenheit des Moleküls auftritt, man daraus schließt, daß das Molekül ein Agonist gegenüber D-3 ist,

- wenn es keine Modifizierung der Konzentration an intrazellulärem Calcium gibt oder wenn eine Verringerung der Konzentration an intrazellulärem Calcium bezogen auf die Konzentration an intrazellulärem Calcium in Abwesenheit des Moleküls auftritt, man die Wirtszelle in Gegenwart von Dopamin und dem genannten Molekül bringt, und wenn eine Verringerung der Konzentration an intrazellulärem Calcium gegenüber jener, die in Gegenwart von Dopamin erhalten wird, auftritt, man daraus schließt, daß das Molekül ein Antagonist gegenüber D-3 ist.