JPH05503219A

JPH05503219A - ヒトドーパミン作用性受容体活性を有するポリペプチド、これらのポリペプチドをコードする核酸、これらのポリペプチドに対して活性の物質をスクリーニングするためのかかるポリペプチドの使用

Info

Publication number: JPH05503219A
Application number: JP3517704A
Authority: JP
Inventors: ジロ，ブルーノ; ソコロフ，ピエール; シユワルツ，ジヤン―シヤルル; マルトル，マリー―パスカル
Original assignee: アンステイテユ・ナシオナル・ドウ・ラ・サンテ・エ・ドウ・ラ・ルシエルシユ・メデイカル
Priority date: 1990-11-06
Filing date: 1991-10-16
Publication date: 1993-06-03
Also published as: FR2668771B1; WO1992007937A1; AU8857991A; EP0507908B1; ES2134781T3; CA2072874C; ATE180788T1; FR2668771A1; EP0507908A1; CA2072874A1; DE69131289D1; DE69131289T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトドーパミン作用性受容体活性を有するポリペプチド、これらのポリペプチドをコードする核酸、これらのポリペプチドに対して活性の物質をスクリーニングするためのかかるポリペプチドの使用本発明は、ヒトドーパミン作用性受容体活性を有するポリペプチド、及び、かかるポリペプチドをコードする遺伝子に係る。

本発明はまた、 −ドーパミン作用性受容体活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むベクター、 −前記遺伝子を発現するように形質転換され、前記受容体の作動薬または拮抗薬の活性を評価するために使用され得る細胞、一前記ポリペプチドをコードする遺伝子とハイブリダイズでき、特に、神経系、精神医学系、心血管系、または神経内分泌系の疾患のｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断に使用され得るヌクレオチドプローブ、 −特にドーパミン作用系が関与する疾患において、分析目的で前記ポリペプチドを精製するため、ｉｎ　ｖｉｔｒ。

診断のためまたは治療のために使用される前記ポリペプチドに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体、−いくつかの物質の前記ポリペプチドに対する親和性の程度を検査するためのキット、一ドーパミン作用性受容体活性を有する前記ポリペプチドに対して活性の物質を含むかまたはドーパミン作用性受容体活性を有する前記ポリペプチドをコードする遺伝子もしくは遺伝子フラグメントがトランスフェクトされた細胞に対して活性の物質を含む特に神経系、精神医学系、心血管系、または神経内分泌系の疾患の治療に使用するための医薬、一前記ポリペプチドとの相互作用に起因するある種の副作用を抑制することが望まれる既知のドーパミン作用性受容体に活性の医薬に係る。

ドーパミンの種々の作用が、通称ではり、受容体及びＤ２受容体（Ｋｅｂａｂｉａｎ　ｅｔ　Ｃａ１ｎｅ、（１９７９’）（１））と呼ばれている２種類の受容体との相互作用から生じることは既に認められていた。これらの受容体のうちで、Ｄ２受容体の配列だけが既知であり（Ｂ　ｕ　ｎ　ｚ　ｏ　ｗ他、（１９８８）＜２））、この受容体の遺伝子のメツセンジャーＲＮＡの代替スプライシングによって、Ｄ２受容体の２つのイソタイプ（ｉｓｏｆｏｒｍｅ）（Ｄ−２Ａ及びＤ−２ＢまたはＤ−２（４１５）及びＤ−２＜４１４）などで示される）が生じることも文献に記載されている（Ｇｉｒ。

他、（１９８９）（３）；Ｄａｌ　Ｔｏｓｏ他、（１９８９）（４））。

Ｄ２受容体は、１つのＧタンパク質に結合した７つのトランスメンブランドメインを有し、且つ網膜の光受容体によって発現されるロドプシン（視紅）系の受容体とある程度の相同性を有する受容体系に属している。

Ｄ１受容体及びＤ２受容体以外の別のドーパミン作用性受容体が存在することは、間接的なＩｌｉ察に基づいて種々の研究者によって推測されていたく特にＳ　ｃ　ｈ　ｗ　ａ　ｒ　ｔ　Ｚ他、（１９８４）（５））。これらの受容体は、単離されたことがないので証明されたことはない、また、その構造が同定されたこともなく、薬理学的特性が完全に定義されたこともない、特に、ドーパミンの合成及び／または遊離、及び／またはドーパミン作用性ニューロンの活性を調節する自己受容体の存在は証明されたが、これらは、その薬理学的特性に基づいてＤ２受容体にほぼ等しいと認識されていた。

ドーパミン作用性Ｄ１受容体の活性及びドーパミン作用性Ｄ２受容体の活性のいずれにも所属しないドーパミン作用性受容体活性を有するネズミのポリペプチドの存在が、Ｎａｔｕｒｅの論文（１３）の対象となっている。該ポリペプチドはラットドーパミン作用性受容体り、と命名された。

本発明の目的は、ヒトドーパミン作用性り、受容体の活性及びヒトドーパミン作用性Ｄ２受容体の活性のいずれにも所属しないドーパミン作用性受容体活性を有する新規なポリペプチドを提供することである。

本発明の目的はまた、ヒトのある種の神経系または精神医学系病理を特異的に診断し得る新規な核酸配列を提供することである。

本発明の目的はまた、ドーパミン作用性受容体活性を有する新規なポリペプチドに作用するかまたは逆に新規なポリペプチドとの相互作用を防止するための新規な医薬、特に精神医学系、神経系、心血管系または神経内分泌系の障害の治療に使用するための新規な医薬のスクリーニング方法を提供することである。

特に、ドーパミン作用性受容体活性を有する本発明の新規なポリペプチドは、 −７１の４００個のアミノ酸の配列を含むかまたは該配列のフラグメントを含み、このフラグメントは、重鎖フラグメントが膜に存在するときにドーパミンを作動薬または拮抗薬に特異的に結合させるために必要な該配列に内在する部位を含んでおり、上記の結合を、例えば５ｏｋｏ１ｏｆｆ他、（１９８０）（６）及びＭａｒｔｒｅｓ他、（１９８５）（７）に記載された方法を用いて放射性リガンドによって測定することが可能であり、これらの部位は、ラットドーパミン作用性り、受容体に含まれている部位とは異なる部位である、束前記４００個のアミノ酸の配列を認識するがドーパミン作用性Ｄ１受容体、ドーパミン作用性Ｄ２受容体、ラットドーパミン作用性り、受容体のいずれをも認識しない抗体によって認識されることが可能である、京前記４００個のアミノ酸の配列を認識するがドーパミン作用性Ｄ１受容体、ドーパミン作用性Ｄ２受容体、ラットドーパミン作用性り、受容体のいずれをも認識しない抗体を産生し得る。

「ラットのドーパミン作用性り、受容体」なる用語は、前記に引用のＮａｔｕｒｅの論文に記載されたアミノ酸配列及び対応する核酸配列を有する受容体を指す。

前記抗体による４００個のアミノ酸配列の認識または前記抗体による前記フラグメントの認識という表現は、前記配列が前記抗体の１つと複合体を形成することを意味する。

抗原（即ち４００個のアミノ酸の配列または前記フラグメント）−抗体複合体の形成、及び形成された複合体の存在の検出は、（放射性同位体または酵素によって標識されたトレーサーを用いる方法のような）従来の方法によって行なうことができる。

前記定義に対応する「部位を含むフラグメント」の定義に関しては本文中で後述する。

前記に定義されたフラグメントのうちでも、前記に定義された４００個のアミノ酸の配列をコードする遺伝子によって産生されたメツセンジャーＲＮＡの代替スプライシングによって産生された１つまたは複数のフラグメントが好ましい。

本発明はまた、前記に定義したようなポリペプチドまたは該ポリペプチドの部分が、該ポリペプチドに非対応のアミノ酸連鎖に結合したキメラタンパク質に係る。

本発明のポリペプチド及びキメラタンパク質は、グリコジル化されることができ、かつ任意にジスルフィド結合を含み得る。

以下の記載においては判り易くするために、本発明のポリペプチドを「ヒトＤ、受容体」と呼ぶことにする。

本発明のヒトＤ、受容体は好ましくは、図１に示すアミノ酸１〜４００の連鎖から構成されている。

このヒトＤ、受容体は、細胞内及び細胞外の親水性ループによって隔てられた７つの疎水性トランスメンブラン領域を含んでいると考えられる。

これらのトランスメンブラン領域は下線を付けた７つの領域に対応し、第１のトランスメンブラン領域をＭｂＩに対応させ、Ｍｂ■（第７のトランスメンブラン領域）まで順次対応させている。

本発明はまた、ポリペプチドがヒトドーパミン作用性り。

受容体特性を喪失しないでいくつかの局在突然変異を含むような前記に定義のポリペプチドに対応する突然変異ポリペプチドに係る。これらの突然変異体の例として特に、トランスメンブラン領域を認識する抗体によって認識されるポリペプチド、及びトランスメンブラン領域以外の領域を認識する抗体によって認識されるポリペプチドがある。

本発明の突然変異ポリペプチドとして、以下の４つの突然変異の少なくとも１つを有するポリペプチドがある（突然変異を有し得るアミノ酸の位置は図１の符号に基づく）二９位のＳｅｒがＧｌｙによって置換された突然変異、７９位のＡｌａがＶａｌによって置換された突然変異、１８９位のＶａｌがＩｌｅによって置換され突然変異、３９７位のＩｌｅがＴｈｒによって置換された突然変異。

本発明の突然変異ポリペプチドは好ましくは、上記の４つの突然変異を含む。

本発明はまた、翻訳後にまたは転写及び翻訳後に前記に定義のヒトＤ、受容体のいずれか１つを与えるヌクレオチド連鎖を含むかまたは該連鎖から構成される核酸に係る。

「翻訳後にまたは転写及び翻訳後に１０．を与えるヌクレオチド連鎖を含むかまたは該連鎖から構成される核酸」という表現は、一エキソン、一イントロンの５′末端及び／または３′末端のエキソン、一イントロンで中断されたエキソン、 −イントロンの５′末端及び／または３′末端に接続し且つイントロンで中断されているエキソンなどを意味する。

本発明はまた、ゲノムＤＮＡフラグメントから成ることを特徴とする前記に定義されたような核酸に係る。

完全ヒトゲノムに対応する核酸及び前記ヒトＤ、受容体をコードする遺伝子を含む完全染色体に対応する核酸は本発明から除外される。

本発明の有利な核酸は、 −７３に示す核酸連鎖、 −１４に示す核酸連鎖、を含むか、または前記連鎖の１つから構成されている。

図３の１位及び５７４位のヌクレオチドによって規定された核酸配列の例を以下に挙げるニー図３の１位のヌクレオチドから成る末端から２２７位のヌクレオチドから成る末端までの配列は、図１のポリペプチドをコードする核酸配列のく非コード）５ ′末端に対応する、 −７３の２２８位のヌクレオチドから成る末端から５０１位のヌクレオチドから成る末端までの配列は、図１の１位のヌクレオチドから成る末端から２７４位のヌクレオチドまでの核酸（コード）配列に対応する、−図３の５０２位のヌクレオチドから成る末端から５７４位のヌクレオチドから成る末端までの配列は、図１のポリペプチドをコードする核酸配列のイントロンに対応する、図４の１位のヌクレオチドから成る末端から３０６位のヌクレオチドから成る末端までのヌクレオチドによって規定される核酸配列の例を以下に挙げるニー図４の１位のヌクレオチドから成る末端から４６位のヌクレオチドから成る末端までの配列は、図１のポリペプチドをコードする核酸配列のイントロンに対応する、 −図４の４７位のヌクレオチドから成る末端から２４０位のヌクレオチドから成る末端までの配列は、図１の１００７位のヌクレオチドから成る末端から１２００位のヌクレオチドから成る末端までの核酸（コード）配列に対応する、 −１４の２４１位のヌクレオチドから成る末端から３０６位のヌクレオチドから成る末端までの配列は、図１のポリペプチドをコードする核酸配列の３′　（非コード）末端に対応する。

本発明の有利な核酸は、図３の核酸連鎖を含むかまたは該連鎖から構成され、以下の突然変異の少なくとも１つを含む。

一２５２位のＡがＧによって置換された突然変異、＝２７８位のＡがＧによって置換された突然変異。

本発明の有利な核酸は、参考文献（３）及び（１３）に示されている条件下に図３の核酸配列とハイブリダイズすることができ、図３に示す核酸配列に含まれている核酸または図３に示す核酸配列を含む核酸から成る。

本発明の有利な核酸は、参考文献（３）及び（１３）に示されている条件下に図４の核酸配列とハイブリダイズすることができ、図４に示す核酸配列に含まれている核酸または図４に示す核酸配列を含む核酸から成る。

より詳細には本発明は、図１に示すヌクレオチド連鎖の一６位のヌクレオチドから成る末端から１２６６位のヌクレオチドから成る末端までを含む核酸に係る。

本発明は特に、図１の１位のヌクレオチドから成る末端から１２００位のヌクレオチドから成る末端までの連鎖を含むかまたは該連鎖から成る核酸に俤る。

前記に定義の核酸は、図１に示すポリペプチドに対応する遺伝子をコードする部分に対応する。

また、突然変異核酸が本文中のハイブリダイゼーション条件下に前記に定義の核酸または後述する核酸７０−プとハイブリダイズする限り、いくつかの局在突然変異を含む前記に定義の核酸の突然変異核酸も本発明に包含される。

これらの突然変異核酸の例として、以下の６つの突然変異の少なくとも１つを含む核酸を引用し得る（突然変異され得るヌクレオチドの位置の番号は図１に基づく）−２５位のＡがＧによって置換された突然変異、−５１位のＡがＧによって ′Ｉｌ換された突然変異、−２３６位のＣがＴによって置換された突然変異、− ５６５位のＧがＡによって置換された突然変異、＝８７６位のＴがＣによって１換された突然変異、−１１９０位のＴがＣによって置換された突然変異。

突然変異核酸の例として、前記に定義の突然変異を２５位、５１位、２３６位、５６５位、８７６位及び１１９０位にすべて有している核酸を引用し得る。

本発明の目的はまた、後述するハイブリダイゼーションプローブの１つと共にハイブリダイゼーションすることによってヒトゲノムバンクから得ることができ、イントロンを含むかまたはイントロンから成る核酸配列を提供することである。

本発明はまた、前記に定義の核酸に相補的な核酸、前記に定義の核酸に対応しＴがＵで置換されている核酸に係る。

本発明の核酸は、化学的方法で製造されてもよく、またはその他の方法で製造されてもよい。

２００個以下のヌクレオチドまたは塩基対く二本鎖核酸以下の段階を含むニーＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　４；２７４〜３２５．１９８６に記載のβ−シアンエチルホスホラミジット全自動化法を使用してＤＮＡを合成し、−得られたＤＮＡを適当なプラスミドベクター中でクローニングし、適当な７０−ブとのハイブリダイゼーションによってＤＮＡを回収する。

２００個以上のヌクレオチドまたは塩基対く二本鎖核酸の場合）を含む長い核酸を製造するための適当な化学的方法は、以下の段階を含む・一化学的に合成され、末端に種々の制限部位を備え、その配列が、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８０；７４６１〜７４６５．１９８３に記載された理論によれば天然ポリペプチドのアミノ酸連鎖と適合性のオリゴヌクレオチドを組立て、 −得られたＤＮＡを適当なプラスミドベクター中でクローニングし、適当なプローブとのハイブリダイゼーションによってＤＮＡを回収する。

ｍＲＮＡから本発明の核酸配列を製造する別の方法は、以下の段階を含むニーＭａｎ　ｉ　ａｔ　ｉ　ｓ他（１９８２Ｈ８）及びＡｕ５ｕ−ｂｅｌ　Ｆ、Ｍ　他（１９８９）（９）に記載の方法でドーパミン作用性り、受容体を発現する任意の組織から細胞性ＲＮＡを調製し、一オリゴｄＴを固定したクロマトグラフィーに全細胞性ＲＮＡを通してｍＲＮＡを回収及び精製し、−Ｇｅｎｅ　２５：２６３．１９８３に記載の方法に従って精製ｍＲＮＡから一本ｆｆ４　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを合成し、−得られた核酸を適当なプラスミドベクター中でクローニングし、適当なハイブリダイゼーションプローブを使用して所望のヌクレオチド配列を回収する。

本発明の核酸を製造するために使用される化学的に合成されたオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブの例を以下に示すニ −７１の一６位のヌクレオチドから成る末端から１２６６位のヌクレオチドから成る末端までの核酸配列によって規定される１０−ブ、 −１１の１位のヌクレオチドから成る末端から１２００位のヌクレオチドから成る末端までの核酸配列によって規定されるプローブ、 −１１の７２０位のヌクレオチドから成る末端から８３１位のヌクレオチドから成る末端までの核酸配列によって規定されるプローブ、一図３の１位のヌクレオチドから成る末端から５７４位のヌクレオチドから成る末端までの核酸配列によって規定されるプローブ、 −７４の１位のヌクレオチドから成る末端から３０６位のヌクレオチドから成る末端までの核酸配列によって規定されるプローブ、 −または夫々の相補的ヌクレオチド配列。

これらの配列は図１、図３及び図４の配列に由来し、Ｍａｎｉａｔｉｓ他（１９８２）（８）に記載されたハイブリダイゼーション条件で使用され得る。

また、−木調ｃＤＮＡの合成及びその後の１ｎｖｉ−ｔｒｏ増幅を行なうために、例えばＧｏｂｌｅｔ他（１９８９，）（１０）に記載されているように、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｎ）法を用い、図１の配列から定義された化学的に合成された２つのアンブリマー（ａｍｐ　ｌ　ｉｍｅｒｅ）を使用してもよい、適当なアンブリマーは例えば、図１のヌクレオチド− ６からヌクレオチド１８及び図１のヌクレオチド１２２６からヌクレオチド１２５１の配列である。

増幅された核酸フラグメントを次に、Ａｕ５ｕｂｅｌＦ、Ｍ、他（１９８９）（１１）に記載の方法によってクローニングし得る。

本発明はまた、複製に必須でない部位の１つに本発明の核酸を含む特にプラスミド、コスミド、ファージまたはウィルス型の特にクローニング及び／または発現用の組換えベクターに係る。

本発明の適当なベクターは、複製に必須でない部位の１つに、細胞性宿主中で本発明のポリペプチドの発現を促進するために必要なエレメントを含み、且つ任意に、細胞性宿主のポリメラーゼによって認識されるプロモーター、特に誘発性プロモーターと、任意にシグナル配列及びアンカー配列とを含む。

本発明はまた、前記に定穐の組換えベクターによって形質転換され本発明のポリペプチドの１つをコードするヌクレオチド配列をその内部で発現させ得る調節エレメントを含む細胞性宿主に係る。

細胞性宿主なる用語は、培養して維持され得るすべての生物を意味する。

使用される微生物の例は、細菌、特に大腸菌である。

好ましい生物は、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）またはＣＯ３ −７細胞（ＳＶ４０ウィルスによって形質転換されたアフリカミドリザルの腎臓線維芽細胞）のような真核生物から成る。

しかしながら、各生物毎に、該生物中で複製され得るベクター特にプラスミドベクターと、これらのベクターに挿入され得るヌクレオチド配列とを入手することができ、本発明のポリペプチドをコードするインサートが該ベクターの上記ヌクレオチド配列の下流に導入されたときに、該ベクターが選択された生物中で該インサートを発現させ、該細胞性宿主の膜に運搬できるという条件が満たされる限り、他の生物も全く同様に容易に使用できる。

本発明はまた、本発明のポリペプチドの１つに特異的な抗体に係る。これらの抗体は、ドーパミン作用性Ｄ１受容体及びドーパミン作用性Ｄ２受容体のいずれをも認識しない、特に、これらの抗体は、以下のアミノ酸配列を認識するニ −７１の２４３位のアミノ酸から成る末端から２７７位のアミノ酸から成る末端までのアミノ酸配列によって規定される配列。

抗体を得るために、前記ポリペプチドの１つを動物に注射し得る。

慣用の方法に従い、骨髄腫細胞と免疫マウスの胛臓細胞との細胞融合によってモノクローナル抗体を調製する。

ある細胞が腫瘍特性を有しているか否か、また、ある腫瘍が良性であるか悪性であるかを判定する場合、その要素がヒトＤ、受容体の異常発現と相関間係を有しているならば、本発明の抗体を使用してｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断を行なうことが可能である。

実際、ある種の腫瘍、特に肺の腫瘍においては、正常には存在しないはずのドーパミン作用性受容体の発現を検出し得ることが確認された（Ｓｏｋｏｌｏｆｆ他、（１９８９）（１２））。

ヒトドーパミン作用性り、受容体を含むと予想される生物サンプルを用いたこのようなｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断方法は以下の段階から成るニーヒトドーパミン作用性り、受容体または該受容体に由来の物質と本発明の抗体との免疫複合体が産生可能な条件下に本発明の抗体と前記生物サンプルとを接触させ、−形成された前記免疫複合体を検出する。

本発明はまた、前記に定義の核酸の１つまたはそれらの相補的配列丈たは対応するＲＮＡとハイブリダイズする合成または非合成のヌクレオチドプローブに係る。これらのプローブは、ドーパミン作用性Ｄ１受容体、Ｄ２受容体及びラットＤ、受容体の遺伝子及びメツセンジャーＲＮＡのいずれともハイブリダイズしない。

本発明のプローブは、最小では１０個、好ましくは１５個の核酸を含み、最大では図１．図３ｔたは図４に示すヌクレオチド配列全部を含み得る。

短いほうのプローブの場合、即ち約１０個から約１００個のヌクレオチドから成るプローブの場合、適当なバイブ）　リダイゼーション条件は以下の通りである：９００ｍＭのＮａＣ１，９０ｍＭのクエン酸三ナトリウムｐＨ７，０，１００ μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、０．０５％のどロリン酸ナトリウム、１０〜２５％の脱イオンホルムアミド、０．０２％のＦｉｃｏｌｌ（分子量４００，０００）０．０２％のウシ血清アルブミン、０．０２％のポリビニルピロリドン、４２ ℃で１４〜１６時間。

長いほうのプローブ、即ち約１００以上のヌクレオチドを含むプローブの場合、適当なハイブリダイゼーション条件は以下の通りである：６００ｍＭのＮａＣ１−６０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、２０μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、２０ｔｔｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡ、８ｍＭのトリス−ＨＣｌ　ＰＨ７，４，４０〜６０％の脱イオンホルムアミド、００２％のＦｉｃｏｌｌｉ、０．０２％のウシ血清アルブミン、０．０２％のポリビニルピロリドン、０，２％のドデシル硫酸ナトリウム、１０％の硫酸デキストラン。

本発明は特に前記に定義のヌクレオチドプローブに係る。

本発明のプローブは、神経系、精神医学系及び心血管系の疾患の特にｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断用ツールとして使用され得る。

本発明のプローブはまた、前記に定義の４００個のアミノ酸配列をコードする遺伝子によって産生されるメツセンジャーＲＮＡの代替スプライシングの詳細な分析に使用され得る。これらのスプライシングの有無を、神経系、精神医学系、心血管系または神経内分泌系の障害と関連付けることが可能である。

より詳細には、本発明のプローブは、遺伝的異常、特に多形現象または点突然変異を検出するために使用され得る。

個体のドーパミン作用性り、受容体をコードする遺伝子の多形現象を検出するためには、個体から採取された血液のような生物サンプルを以下の段階から成る方法で処理するニー制限酵素によって認識される制限部位の処で核酸を開裂して制限フラグメントが得られる条件下で、前記生物サンプルに由来の核酸を制限酵素によって処理し、−プローブと前記制限フラグメントとの間のハイブリダイゼーション複合体の産生が可能な条件下で、前記フラグメントとハイブリダイズし得る本発明のヌクレオチドプローブとを接触させ、一前記ハイブリダイゼーション複合体を検出し、。

−前記ハイブリダイゼーション複合体に多形制限フラグメントが含まれているときは、該フラグメントの大きさを測定する。

また、個体のドーパミン作用性り、受容体をコードする遺伝子の多形現象を検出するために、個体から採取された血液のような生物サンプルを以下の段階から成る方法で処理してもよいニー患者から採取された生物サンプルに含まれると予想される量のヌクレオチド配列を２つのＤＮＡプライマーによってできれば予め増幅させ、一制限酵素によって認識される制限部位の処で核酸を開裂することによって制限フラグメントが得られるような条件下に、前記生物サンプルまたは前記のごとく増幅された量のヌクレオチド配列に由来の核酸を制限酵素によって処理し、一該プローブと前記制限フラグメントとのハイブリダイゼーション複合体の産生が可能な場合には該産生が生じ得る条件下に、前記フラグメントとハイブリダイズし得る本発明のヌクレオチドプローブを接触させ、−前記ハイブリダイゼーション複合体を検出し、−前記ハイブリダイゼーション複合体中に多形制限フラグメントが含まれている場合には該フラグメントの大きさを測定する。

適当なりＮＡプライマーとしては、図３に示すヌクレオチド１からヌクレオチド２２７の配列に含まれる約２０塩基の配列、及び、図４に示すヌクレオチド５０２からヌクレオチド５７４に含まれる約２０塩基の別の配列を使用し得る。

好ましいプライマーの２つの例としては、−図３の４７位のヌクレオチドから６７位のヌクレオチドによって規定されるプライマー、及び、−図３の４８９位のヌクレオチドから５０９位のヌクレオチドによって規定されるプライマーがある。

個体のドーパミン作用性り、受容体をコードする核酸または核酸フラグメントの点突然変異を検出する１ｎｖｉｔｒｏ診断方法としては、以下の段階から成る方法を使用し得るニープローブと核酸または該核酸のフラグメントとの閏のハイブリダイゼーション複合体の産生が可能な場合には該産生が生じ得る条件下に、本発明のヌクレオチド１０−ブと生物サンプル例えば血液とを接触させ、−前記ハイブリダイゼーション複合体を検出し、・−前記ハイブリダイゼーション複合体に含まれる核酸または核酸フラグメントを配列決定し、 −前記ハイブリダイゼーション複合体に含まれる核酸または核酸フラグメントの配列を、ヒトドーパミン作用性り。

受容体の（突然変異を有していない）核酸または（突然変異を有していない）核酸フラグメントの配列に比較する。

ヒトＤ、受容体をコードする遺伝子によって産生されるメツセンジャーＲＮＡの代替スプライシングを検出するためには、組織サンプルに含まれるメツセンジャーＲＮＡを本発明のプローブの１つを用いて定量する方法を用いるとよい。

本発明のプローブはまた、ドーパミン作用性り、受容体の異常発現を検出するために使用される。この発現は、ドーパミン作用性Ｄｚ受容体のメツセンジャーＲＮＡが存在してはならない細胞中に存在することによって露見する。

このｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出方法を行なうためには、個体から採取された血液のような生物サンプルを以下の段階から成る方法で処理するニー患者から採取された生物サンプルに含まれると予想される量のヌクレオチド配列を２つのＤＮＡプライマーによってできれば予め増幅させ、一ヌクレオチドプローブと前記ヌクレオチド配列とから形成されたハイブリダイゼーション複合体が産生され得る条件下に、前記生物サンプルとヌクレオチドプローブとを接触させ、一形成された前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する。

′ヒトドーパミン作用性り、受容体のこの異常発現は、いくつかの腫瘍において観察され、またある腫瘍が良性であるか悪性であるかに関して腫瘍特性との相関を示し得る。

本発明のポリペプチドは、前記に定義の核酸の１つを含む組換えベクターによって予め形質転換された細胞性宿主を適当な培地中で培養し、前記形質転換細胞性宿主によって産生されたポリペプチドを前記培養物から回収することによって調製され得る。

本発明のポリペプチドの別の調製方法の特徴は、ペプチド合成で公知の方法を用い、好ましくはＣ末端アミノ酸から出発し、連続するアミノアシルを２つずつ所望の順序で順次縮合させるか、またはアミノアシルと複数のアミノアシル残基を適当な順序で既に含む予め形成されたフラグメントとを縮合させるか、または上記のごとき予め調製された複数のフラグメントを互いに縮合させ、この際、特にカルボキシル官能基の活性化後にペプチド結合の形成に正常に関与すべき一方のアミン官能基と他方のカルボキシル官能基またはその逆に一方のカルボキシル官能基と他方のアミン官能基とを除いてアミノアシルまたはフラグメントに含まれる反応性官能基全部を予め保護すべく配慮し、以後同様にしてＮ末端アミノ酸に達するまで鎖を順次延長することである。

大腸菌のような細菌またはＣＨ○細胞のような真核細胞中でヒトドーパミン作用性り、受容体を発現させるためには以下の段階から成る方法で処理する：〜調節エレメント、特に細胞性宿主のポリメラーゼによって認識されヌクレオチド配列を使用細胞性宿主中で発現させ得るプロモーターのコントロール下に、ヒトＤ、受容体をコードするヌクレオチド配列（インサート）が予め挿入されたベクター、特にプラスミドまたはファージによってコンピテント細胞性宿主を形質転換させ、−前記インサートを発現させ得る条件下に形質転換細胞性宿主を培養し、ヒトＤ、受容体のトランスメンブラン配列が形質転換された細胞性宿主の表面に露出するように、発現されたヒトＤ、受容体を膜に向かって運搬させる。

真核細胞中で発現させる場合には、調節エレメントは、ドーパミン作用性レセプターの内因性プロモーターを含んでもよく、またはＳＶ４０ウィルスのプロモーターもしくはＲ３Ｖ　（ラウス肉腫ウィルス）のプロモーターのようなウィルス性プロモーターを含んでもよい。

大腸菌中で発現させる場合には、調節エレメントはラクトースオペロンのプロモーターまたはトリプトファンオペロンのプロモーターを含み得る。

本発明はまた、本発明のポリペプチドに対してリガンドとして作用し得るドーパミン作用性分子の能力の検出方法に係る。この方法は、一前記ポリベブチドをコードするインサートで修飾されたベクターによって予め形質転換され該ポリペプチドに特異的な１つまたは複数の部位を表面に含む細胞性宿主とドーパミン作用性分子とを、場合によっては該インサートの発現を誘発した後で、前記分子が前記ポリペプチドに対する親和性を実際に有していることが判明すると前記特異的部位の少なくとも１つと前記分子との結合が形成されるような条件下に接触させ、一リガンドーポリペプチド型の複合体の形成の有無を検出する段階から成る。

本発明はまた、１つまたは複数の所定のリガンドに対する本発明のポリペプチドの親和性の試験方法に係る。この方法は、一調節エレメント、特に細胞性宿主のポリメラーゼによって認識されヌクレオチド配列を使用細胞性宿主中で発現させ得るプロモーターのコントロール下に、Ｄ、受容体をコードするヌクレオチド配列（インサート）が予め挿入されたベクター、特にプラスミドまたはファージでコンピテント細胞性宿主を形質転換させ、一前記インサートを発現させ得る条件下に形質転換細胞性宿主を培養し、ヒトＤ、受容体のトランスメンブラン配列が形質転換された細胞性宿主の表面に露出するように、発現されたヒトＤ、受容体を膜に向かって運搬させ、−前記細胞性宿主を前記所定のリガンドと接触させ、−前記形質転換細胞性宿主と前記所定のリガンドとの闇の特異的結合を検出する段階を含む。

また、上記方法によって、図１の４００個のアミノ酸配列の一部分だけを含む上記で問題にした「部位保有フラグメント」を同定し得る。

この同定方法では、前記配列をコードする核酸よりも短い寸法のインサートを使用し、上記のごとき発現、発現産物の運搬及び露出に関する段階を行なう０発現、発現産物の運搬、及び膜における露出、並びに前記に定義のようなリガンドとの反応が得られると、必須部位保有フラグメントを決定し得る。従って、完全配列よりも短い寸法のフラグメントを使用した試験において前記に定義のようなリガンドとの反応が生じない結果が得られた場合には、幾つかの必須部位が削除されたことを示している。

本発明はまた、本発明のポリペプチドに対するリガンドの親和性の有無を検出する検出用キットに係る０本発明のキットは、一前記に定義のような修飾されたベクターによって形質転換された細胞性宿主の培養物または前記に定義の細胞性宿主の培養物または前記宿主の原調製物と、− 前記配列の上流に配置されたプロモーターが物理的手段または化学的手段によって誘発され得る１０モーターであるときに、修飾ベクターに含まれているヌクレオチド配列の発現を誘発しタンパク質を産生させる物理的または化学的手段と、一前記ポリペプチドに対して所定の親和性を有する１つまたは複数の対照リガンドと、一発現されたタンパク質の生物学的活性のキャリクタリゼーションを行なう物理的または化学的手段とから成る。

本発明はまた、神経性疾患（例えばパーキンソン病）、精神医学性疾患（例えば精神病性状！ｇ）、心血管性疾患（例えば動脈高血圧症）または神経内分泌性疾患（例えば視床下部−下垂体軸の機能不全）を治療するための医薬のスクリーニング方法に係る。

本発明はまた、ドーパミン作用性受容体活性を有する本発明のポリペプチドの少なくとも１つに活性の物質、またはドーパミン作用性受容体活性を有する本発明のポリペプチドの少なくとも１つをコードする遺伝子もしくは遺伝子フラグメントによって形質転換された細胞に対して活性の物質を活性物質として、医薬的に許容されるビヒクルと共に含有する医薬に係る。

本発明はまた、ドーパミン作用性Ｄ１受容体またはＤ２受容体に活性であるが本発明のドーパミン作用性受容体活性を有するポリペプチドに不活性の物質を活性物質として含む医薬に係る。

本発明の別の特徴及び利点は、特に添付の図面及び表に関する以下の説明及び実施例の記載からより明らかであろう。

−７１はヒトドーパミン作用性Ｄ３受容体の核酸配列及び対応するアミノ酸配列を示す。

−７２はヒトドーパミン作用性り、受容体のアミノ酸配列（第１列）に位置合わせしたラットのドーパミン作用性り、受容体のアミノ酸配列（第２列）を示す。

ラットのドーパミン作用性り、受容体の配列中でヒトドーパミン作用性り、受容体と同様の位置に存在する等しいアミノ酸残基を二重線（＝）で示す。

相同性を証明するために、２つの配列に欠失を与え、これらの欠失をラットのり、受容体の配列中に点線間＃（−）で示す６２つの列間の一本線は、ヒトＤ３受容体及び対応するラットＤり受容体の相同でないアミノ酸を夫々示す。

Ｄ、受容体のｍ胎外Ｎ末端領域では、アスパラギン（ＮＸＳ／Ｔ）に結合したグリコジル化部位のコンセンサス配列が１２位及び１９位に存在する（図２）。

ラットＤ３受容体とヒトＤ、受容体との闇に存在する相同の割合は７８．７％である。

一図３は、コード部の５′末端便のヒトＤ、受容体の遺伝子の一部に対応する０図３の２２８位のヌクレオチドから成る末端から５０１位のヌクレオチドから成る末端ｔでの配列は、図１の１位のヌクレオチドから成る末端から２７４位のヌクレオチドから成る末端までの核酸（コード）配列に対応する。

−７４は、コード部の３′末端のヒトＤ３受容体の遺伝子の一部に対応する９図４の４７位のヌクレオチドがら成る末端から２４０位のヌクレオチドがら成る末端までの配列は、図１の１００７位のヌクレオチドがら成る末端から１２００位のヌクレオチドがら成る末端までの核酸のコード配列に対応する。

実施例１：ヒトＤ−３ドーパミン作用性受容体のヌクレオチド配列の決定及びアミノ酸への翻訳：ＬラットＤ３受容体をコードするｃＤＮＡの切断によって得られたｆｆ２ｐ放射性標識した２つのｃＤＮＡを用い、ＥＭＢＬ　３（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ）中で、５ａｕ３Ａ−ｐａｒｔｉｅｌｌｅヒトゲノムバンクをスクリーニングした。一方のｃＤＮＡは、Ｃ１ａｌ−ＰｓｔＩによって切断されたラットＤ、受容体から得られたｃＤＮＡであってプローブ１（Ｎ末端部子トランスメンブラン領域ＭｂＩ＋） −ランスメンプラン領域Ｍｂ　Ｉりを与え、他方のｃＤＮＡは、ＢｓｔＸＩ−ＥｃｏＲＩによって切断されたラットのり。

受容体から得られたｃＤＮＡであってプローブ２（Ｃ末端部子トランスメンブラン領域ＭｂＶＩ＋トランスメンブラン領域Ｍｂ■）を与える（Ｓｏｋｏｌｏｆｆ他、１９９０”Ｉ。

ゲノムバンク（９４０，０００クローン）のファージをニトロセルロース膜（ＲＡＳ−８５，５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒｅｔ　５ｃｈｕｅｌｌ）に移し、４２℃で４時間プレハイブリダイズしく４０％ホルムアミド、４ＸＳＳＣ１１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’　ｓ、８ｍＭトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７，４，２０μｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡ、２０μｇ／ｍｌのサケ精子、０．１％の５ＤＳ）−７００，０００ｃｐｍ／ｍｌの上記に定義のプローブ１またはプローブ２（ＤＮＡＩμｇあたりの比活性１０１０９ｃｐの存在下に４２℃で１４時間ハイブリダイズする（同じ溶液＋１０％硫酸デキストラン）。

次いで、膜に対して４２℃で１５分間の洗浄を２回（２ｘＳＳＣ；　０．１％５ＤＳ）並びに夫々４２℃及び５０℃で１５分間の洗浄を２回（０，２ｘｓＳＣ；　０．１％５ＤＳ）行なう。次に、増幅スクリーンの存在下に一７０℃で膜をＸ線撮影フィルム（ＸＡＲ５、Ｋｏｄａｋ）に密着させる。５時間露光後にＸ線撮影フィルムを現像する。

プローブ２（３′末端）によって１つの陽性クローンが得られた。このクローンは４．８　ｋ　ｂの反応性ＥｃｏＲＩフラグメントを含む。これをＭ１３中でサブクローニングして配列決定する。

プローブ１（５′末端）によって５つの陽性クローンが得られた。これらのクローンは、１．２ｋｂのＳａｃ　Ｉ及び２．５　ｋ　ｂのＥｃｏＲＩとの反応性フラグメントを含む。

これをＭ１３中でサブクローニングして配列決定する。

ゲノムＤＮＡの配列によって、ラットＤ、受容体の配列と高度な相同性を有するオープン読取フェーズの存在が確認できる。

ＰＣＲ増幅に使用できるプライマーを合成する＝３′に：Ａ：ＴＴＧ　ＡＡＴ　ＴＣＣＴＧＧ　ＣＡＧ　ＣＴＡＧＡＡ　ＡＴＧ　ＧＧＴ　ＴＣＡ　Ａ５′に：Ｂ：ＣＧＡ　ＡＴＴ　ＣＡＴ　ＧＧＣＡＴＣＴＣＴＧＡＧ　ＣＣＡ　ＧＣＴ　ＧＡＧ　ＴＡ３′に：Ｃ：ＡＡＧ　ＡＡＴ　ＴＣＡ　ＧＡＴ　ＣＴＴ　ＣＴＧＣＴＣＣＣＴ　ＣＡＧ　ＣＡＡ　Ｇ。

プライマーＢ（３７５ｍＭ）を使用し、ヒト脳下垂体乳頭のｍＲＮＡと逆転写酵素（２０Ｕ、Ｂｏｅｈｒ　ｉ　ｎｇｅ　ｒ）とから一本＠　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを合成する。

プライマーＢ及びＡ（各々７５ｍＭ）を用いＴｈｅｒ−ｍｏｐｈｙｌｕｓ　Ａｑｕａｔｉｃｕｓポリメラーゼ（Ｃｅｔ、ｕｓ、２．５Ｕ）によってこのマトリックスを３０サイクル（９２℃、５６℃、７２℃、各１分間）で増幅する。

反応生成物を１％アガロースゲル電気泳動で分離し、（１〜１．４ｋｂの）ゲルバンドを切り出し、ＤＮＡを抽出しくｇｅｎｅ−ｃｌｅａｎ、ＢＩＯ１０１）、プライマーＢとＣとの間に再度増幅する。アガロースゲル上でエチジウムプロミドで着色して可視化したＤＮＡ（１，２ｋｂ）を再度抽出し、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＩＯＵ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）でリン酸化し、Ｓｍａ　（によって切断したｐＧＥＭ　４Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中でサブクローニングする。

完全フラグメントをＫｐｎ（及びＢｇｌｌｉによって１ラスミドから抽出し、配列決定のためにＭ１３中でサブクローニングする。

配列は、ラットＤコ受容体に対して総合的に７９％の相同性を有し細胞質内の第３ループを考慮しないときは９３％の相同性を有する４００個のアミノ酸がら成るオーブン読取フェーズを与えた。

実施例■：トランスフェクトされたＣＨＯ細胞中のり、受容体の発現：ドーパミンの作用素及び拮抗薬によるヨードスルブリド１２５１結合の阻害を測定した。

たえ発現ベクターはプラスミドｐｓｖ　Ｄ−２に由来する。

該プラスミドの構築は前記に引用のＮａｔｕｒｅの論文に記載されている。

ヒトＤ、受容体を発現させるベクターは、オリゴヌクレオチドＨｉ　ｎｄＩ［ｒ −Ｋｐｎ　［アダプター（ＡＧＣＴＧＴＡＣ）を用い、ＰＳＶ　Ｄ−２のＨｉ　ｎｄＩ［［−Ｂｇ　ｌ　ＩＩ制限フラグメントをプラスミドｐＧＥＭ　４ＺのＢｇ　Ｉ　ＩＪ−Ｋｐｎｌ制限フラグメントで置換することによってヒトｐｓｖ　Ｄ−３プラスミドを導くことによって得られる。

これらの構築物を培養し、塩化セシウム勾配で精製しくＳａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ、他、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏ−ｎｉｎｇ−ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、ｃ。

Ｎｏｌａｎ編、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、１９８９）、Ｌｉｐ。

ｆｅｃｔｉｎｅ　（登録商標）−（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ−５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇｈ−ＵＳＡ）を使用してジヒドロ葉酸レダクターゼの欠失したチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋｌ）にトランスフェクトする。ヒボキサンチン及びチミジンを含まない培地（ダルベツコの改質イーグル培地）中で安定なトランスフェクトントを選択する。

Ｍａｒｔｒｅｓ他、ｌ９８５　（７）の方法を用い、トランスフェクトされた細胞腫にヨードスルプリド−１２５Ｉを結合させることによってり、受容体の発現を証明する。結合実験は、１２０ｍＭのＮａＣｌと５ｍＭのＫＣＩと２ｍＭのＣａＣｌ２と２ｍＭのＭｇＣ＋２と０．１％のアスコルビン酸と、１０μＭの８− ヒドロキシキノリンと、０．１％のウシ血清アルブミンと０１〜０．２ｎＭのヨードスルプリド−１２５１とを含む５０ｍＭのトリス−ＭＣＩバッファ（総量４００μｍ）中で行なう（１１）。

ヒトＤ受容体が、正常にはヨードスルプリドー＋２Ｊ結合部位を有していないＣＨＯ細胞中で発現された。

ＣＨ○細胞の永久トランスフェクトクローン中でＫＤの値は１．１ｎＭであり、Ｂｍａｘ　（ＢｍａｘはＤ３受容体の最大濃度を示す）の値は膜タンパク質Ｉｍｇあたり約０．６ｐｍｏ＋である。

ＣＨＯ細胞中で発現されたヒトＤ、受容体の薬理学的特性に関する結果を以下に示す：物質　Ｋｌ値（ｎＭ）作Ｊｌヌードーパミン　３９．６±４．２ドーパミン＋Ｇｐｐ＜ＮＨ）ｐ　４３．５±３．９キンビロール　１０．３±１，０擢肌ＪＬＬトンベリトン　４．３３±０．４０ハロペリドール　４．２５±０．６１アミスルブリド　２．２０±０２０ビモジド　０，６７±０．０６（＋）ＯＨ２３２２２，０５±１．７０ヨードスルブリド　１１０土０．１０実施例■：ヒトＤ、受容体の機能試験モデル：ヒトＤ、受容体をトランスフェクトしたＣＨ○細胞では、該レセプターの刺激に対するｆｉ能性応答を測定できない。

この細胞中では、既知の形質導入経路（アセニレートシクラーゼ、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＡ２）の活性化及び阻害をいずれも証明できなかった。その理由は、ＣＨＯ細胞がり、受容体との結合に特異的な形質導入タンパク質Ｇを発現しないがらであろう。

例えば、ＣＨＯＪｆｌｌ胞はタンパクｉｌｉ　Ｇ　ｏを発現しないが、同じタンパク質Ｇの系列に属する別のタンパク質を発現する。

ヒトＤ、受容体及びタンパク質Ｇｏのサブユニットα０（タンパク質α０）の双方をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞で機能性応答を測定できたので、この仮説が正しいことが証明された。

Ｌえラットのタンパク質α０をコードする核酸は、サブユニットα０の既知の配列に由来のプライマーとのＰＣＲ１ｌｌ＠によって得られた。サブユニットα０の配列はＪｏｎｅｓｅｔ　Ｒｅｅｄ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　ｌ９８７．２６２：１４２４１〜１４２４９）によって発表されている。

使用されるプライマーは、５′のＴＴＡ、ＴＣＴ、ＡＧＡ、ＡＧＧ、ＧＧＣ，ＣＡＣ。

ＣＡＴ、ＧＧＧ、ＡＴＧ、ＴＡ３′のＴＡＣ，ＧＡＣ，ＣＴＣ，ＡＡＧ、ＡＡＧ、ＴＣＡＧＴＡ、ＣＡＡ、ＧＣＣ，ＡＣである。

得られた核酸を制限酵素Ｓａｃ　（及びＸｂａｌ（プライマーに含まれる部位）によって消化し、発現ベクターｐＥＴＪＫ−Ｃ（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、Ｅｔａｔｓ−Ｕｎｉｓ）中でサブクローニングした。このプラスミドを調製し、フレオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドｐＵＴ　５２３（Ｃａｙｌａ、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ＋Ｆｒａｎｃｅ）と同時に実施例Ｈに記載のごとくトランスフェクトした。フレオマイシンを含む実施例■と同じ培地中でトランスフェクトントを選択した。

これらの＃胞に対して、Ｍａ１ｇａｒｏｌｊ他（Ｊ。

Ｃｅｌ　１．Ｂｉｏｌ、１９８７．１０５：２１４５〜２１５５）及びＶａｌｌａｒ他（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

１９８８．２６３　：１０１２７〜１０１３４）に記載の方法で細胞内カルシウム濃度の変化を記録した。

ヒトＤ、受容体とタンパク質α０との双方を発現するＣＨ○細胞に関して、１ｎＭのオーダのドーパミンを含む有効濃度５０ｒＭ胞内カルシウム濃度が増加することを確認した。有効濃度５０は、細胞内カルシウム濃度の最大増加の半分が得られるドーパミン濃度の値である。１１００ｎのドーパミンに対する応答は、１ μＭの濃度の（＋）　ＵＨ２３２のようなヒトドーパミン作用性り、受容体に対する拮抗物質によって完全に阻害される。

この機能モデルに基づいて、ヒトドーパミン作用性受容体に対する作用力価または拮抗力価を検出し、丈な、作動物質の有効濃度５０を評価し得る。

Ｄｆｆ受容体に対する分子の作用力価または拮抗力価を決定するために、ヒトドーパミン作用性り、受容体及びタンパク質ＧＯのサブユニットα０の双方をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、作用力価または拮抗力価を測定すべき分子と共に存在させる。

一前記分子が存在しないときの細胞内カルシウム濃度に比べて細胞内カルシウム濃度が増加しているときは、分子がり、受容体に対する作動物質であると判定し、−細胞内カルシウム濃度の変化がないときは、前記宿主細胞をドーパミン及び前記分子と共に存在せさ、ドーパミンの存在下に得られた濃度に比べて細胞内カルシウム濃度が減少したときは、分子がり、受容体に対する拮抗物質であると判定する。

作動物質であると判定された分子の有効濃度５０を決定するために、細胞内カルシウム濃度の最大増加の半分を生じる該分子の濃度を決定する。

千１乙の矢紋１工明革田害中【；引ｐ＠ｚれ１；もので゛ある：１、　Ｋａｋａｂｉａｎ　Ｊ、Ｗ、ａｔ　Ｃａ１ｎｅ　Ｄ、Ｅ、、’Ｍｕｌセ１ｐｌａ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓｆｏｒ　ｄｏｐａｍｉｎｅ”、　Ｎａｔｕｒａ、１９７９．　２７７＝　９３−９６゜２、　Ｂｕｎｚｏｗ　Ｊ、Ｒ−、Ｖａｎ　Ｔｏｌ　Ｈ，Ｈ− Ｍ、、Ｇｒａｎｄｙ　Ｄ、ｌＣ，、ＡｌｂａｒｔＰ、、５ａｌｏｎ　Ｊ、、Ｃｈｒｉｓｔｉｅ　Ｍｃ　Ｄ、、Ｍａｃｈｉｄａ　Ｃ，Ａ、、ＮａｖｅＫ、Ａ、ｅｔ　Ｃ１ｖｅｌ工ｉ　０．　”Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ａｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａＤ−２ｄｏｐａｍｉｎａ　ｒｅｃａｐｔｏｒ　ｃＤＮＡ”、Ｎａｔｕｒｅ、　１９８Ｂ、　コ３６＝７８３−７８７゜３、　Ｇｉｒｏｓ　Ｂ、、５ｃｋｏｌｏｆｆ　Ｐ、、Ｍａｒ′ｔｒｅｓ　Ｍ、Ｐ、、Ｒｉｏｕ　Ｊ、Ｆ、。

Ｅｍｏｒｉｎｅ　Ｉ、−Ｊ、　ｅｔ　Ｓｃｈｗａｒｔｚ　、７−Ｃ，”入１ｔａｒｎａｔｉｖｅｓｐｌｉｃｉｎｇ　ｄｉｒｅｃｔｓ　ｔｈｅ　ａｘｐｒａｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｏｏ　ｏ−２ｄｏｐａｍｉｎｅ　ｒｅｃａｐｔｏｒ　ｉｓｏｆｏｒｍｓ”、Ｎａｔｕｒｅ、１９８９．　３４２：９２３−９２６゜４、　Ｄａｌ　Ｔｏｓｏ　Ｒ，、Ｓｏｍｍｅｒ　Ｂ、、Ｅｗｅｒｔ　Ｍ−、Ｈｅｒｂ　入、。

Ｐｒ１ｔｃｈｅｔｔ　［）、Ｅｌ、、Ｂａｃｈ　Ａ、、５ｈｉｖｅｒｓ　Ｅｌ、Ｉ）、ａｔ　ｓｅｅｂｕｒｇＰ、Ｈ，”Ｔｈｅ　ｄｏｐａｍｉｎｅ　Ｄ−２ｒｅｃｅｐｔｏｒ　：　ｔｗｏ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｏｒｍｓ　ｇｅｎａｒａｔｅｄ　ｂｙ　ａｌｔａｒｎａｔｉｖｅ　ｓｐｌｉｃｉｎｇ”、　Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、１９８９，８：　４０２５−４０３４゜５、　Ｓｃｈｗａｒｔｚ　Ｊ、Ｃ，、Ｄｅｌａｎｄｒｅ　Ｍ、、　Ｍａｒｈｒｅｓ　Ｍ、Ｐ、、　５ｏｋｏｌｏｆｆＰ、、Ｐｒｏ亡ａｉｓ　Ｐ、、Ｖａｓｓｅ　Ｍ、、Ｃｏ５ｔａｎｔｉｎ　Ｊ、、Ｌａ１ｂｅ　Ｐ、。

Ｗａｒｍｕｔｈ　Ｃ，Ｇ、、Ｇｕｌａｔ　ｃ、ｅｔ　Ｌａｆｉｔｔａ　Ａ、”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄ　ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ　１ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔｂｅｎｚａｍｉｄｅ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ　：　ｎｅｗ　ｔｏｏｌｓ　ｔｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ　ｏｆ　ｄｏｐａｍｉｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ”、　Ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｓ：ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｃａｎｔｒａｌ　ｎｅｒｖｏｕｓ　ｓｙｓｔｅｍ。

Ｔｂｅｏｒａｔｉｃａｌ　ａｓｐａｃｔｓ、　Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、工ｎｃ、　Ｎ、Ｙ、１９８４゜ｐｐ、５９−７２゜５、　Ｓｏｋ口１ｏｆｆ　ｐ、、Ｍａｒｔｒｅｓ　Ｍ、Ｐ、ｌ！ｔ　Ｓｃｈｗａｒｔｚ　、ｙ、ｃ、　”Ｔｈｒｅｅｃｌａｓｓｅｓ　ｏｆ　ｄｏｐａｍｉｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　（Ｄ−２，Ｄ−：ｌ、Ｄ−４）ｉｄａｎｔｉｆ工ｅｄ　ｂｙ　ｂｉｎｄｉｎｇ　５ｔｕｄｉｅｓ　ｗｉｔｈ　３Ｈ−ａｐｏｍｏｒｐｈｉｎｅａｎｄ　３Ｈ−ｄｏｍｐｅｒｉｄｏｎｅ”、Ｎａｕｎｙｎ−５ｃｈｍｉｅｄａｂａｒｇ’ｓ　Ａｒｃｈ。

Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、１９８０．　コ１５：　８９（０２，７、Ｍａｒｔｒａｓ　Ｍ、Ｐ、、　Ｂｏｕｔｈｅｎａｔ　Ｍ、Ｌ、、５ａｌｅｓ　Ｎ、、５ｏｋｏｌｏｆｆＰ、ｅｔ　Ｓｃｈｗａｒｔｚ　Ｊ、Ｃ，”Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ロｆｂｒａｉｎ　ｄｏｐａｍｉｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｅｖｉｄａｎｃｅｄ　ｗｉｔｈ　１２ＳＸ　−１ｏｄｏｓｕｌｐｒｉｄｅ、　ａ　ｈｉｇｈｌｙ　５ｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｌｉｇａｎｄＩｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ。

１９８５．２２８：　７５２−７５５゜８、　Ｍａｎｉａｔｉｓ　ａｔ　ａｌ、、”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ”、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８２゜９、　Ａｕ５ｕｂａｌ　Ｆ、Ｍ、、　Ｂｒｅｎｔ　Ｒ，、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ　Ｒ，Ｅ、、　Ｍｏｏｒｅ　Ｄ、Ｄ、。

Ｓｍ１ｔｈ　Ｊ−Ａ、、Ｓｅｉｄｍａｎ　Ｊ、ｃ、ａｔ　５ｔｒｕｈｌ　Ｌ　（１９８９）Ｃｕｒｒａｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｃｈａｐｉｔｒｅ４、Ｇｒｅｅｎ　Ｆ’ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓ５ｏｃｉａｔａｓ　ｅｔ　Ｗｉｌｅｙ−工ｎｔｅｒｓｅｉａｎｃａ、Ｎａｗ　Ｙｏｒｋ。

１０、　Ｇｏｂｌａｔ　ｅｔ　ａｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ工ｄ　Ｒａ５ｅａｒｃｈ、　１７．　２１４４゜１９８９　”Ｏｎｅ　５ｔｅｐ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ　工ｎｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｕｓｌｎ（Ｊ　Ｐｏｌｙｍａｒａｓｅ　Ｃｈａｌｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ”。

１１、Ａｕ５ｕｂｅｌ　Ｆ、Ｍ、　、　５ｒｅｎｔ　Ｒ，、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ　Ｒ，Ｅ、、　Ｍｏｏｒｅ　Ｄ、Ｄ、。

Ｓｍ工ｔｈ　Ｊ、Ａ、、Ｓａｉｄｍａｎ　Ｊ、Ｇ、ａｔ　５ｔｒｕｈｌ　Ｋ、（１９８９）ｃｕｒｒａｎ亡　ＰｒｏｔＯｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｃｈａｐｉｔｒａコ、　Ｇｒｅｅｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ　ａｔ　Ｗｉｌｅｙ−工ｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

１２、　５ｏｋｏｌｏｆｆ　Ｐ、、Ｒ工Ｏｕ　、７．Ｆ、、Ｍａｒｔｒａｓ　Ｍ、Ｐ、ａｔ　ｓｃｈｗａｒｔｚＪ、Ｃ，”Ｐｒｅｓｅｎｃｅ　ｏｆ　ｄｏｐａｍｉｎｅ　Ｄ−２ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎｔｕｍｏｒａｌ　ｃａｌｌ　Ｌｉｎａｓｌｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ。

１．９Ｂ９，１６２：　５７５−５８２゜１コ−５Ｏｋ０１０ｆｆ　Ｐ−ｒ　Ｂ　、　ＧｌｒＯ５ｒ　Ｍ　、Ｐ−ｍａｒ　ｔｒｌｉ！Ｓ＋　Ｍ−Ｌ−Ｂｏｕｔｈａｎａｔ　ｅｔ　＋ｙ、ｃ、ｓｃｈｗａｒｔｚ、”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ０ｎｌｎｑ　ａｎｄＣｈａｒａＣｔｅｒｌＺａｔＬＯｎ　ｏｆ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ａｏｐａｍｉｎｅ　ｒｅｃａｐｔｏｒ　（Ｃ３）ａｓ　ａ　ｔａｒｇｅセ　ｆｏｒ　ｎｅｕｒｏｌａｐｔｉｃｓ”、Ｎａｔｕｒｅ、１９９０．　：＋４７゜ｐ、１４６．１１１５１゜じトドーパミン作用ｄ生Ｄ３欠＃′ｌ不のヌ７レイナド配ケｊ及びアミノ会Ｌ　ｍ　ｔｊ−ｔｇｇｇｃｔ　−１ＧＣＡ　ＧＴＧ　ＧＴＣＡＴＧ　ＣＣＣＧＴｒ　ＣＡＣＴＡＣＣＡＧ　ＣＡＴ　ＧＧＣＡＣＧ　ＧＧＡ　４２９Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｍａｔ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｔｙｒ　Ｇ工ｎ　Ｈｚｓ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　１４コＡＧＧ　ＡＴＣＣＴＣＡＣＴ　ＣＧＡ　ＣＡＧ　入ＡＣＡＧＴ　ＣＡＧ　ＴＧＣＡＡＣＡＧＴ　ＧＴＣ７０２Ａｒｑ　工１ｅ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｒｑ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｓａｒ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　２］４Ｆｉｇｕｒｅ　１ＧＣＡ　ＣＡＴ　ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＣＴＧ　ＡＡＧ　ＣにＴ　ＴＡＣＴＡＣＡＧＣｋＴＣＴＧＣＣＡＧ　７８０人１ａ　Ｈｉｓ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　ｘｒｇ　’ｒｙｒ　’ｒｙｒ　５ｅｒ　工１ａ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　２６０ＡＧＴ　ＣＣＣＡｃｅ　ＡＴＡ　ＧＣＧ　ＣＣＴ　ＡＡＧ　ＣＴＣｋＧＣＴＴＡ　ＧＡＡ　ＧＴＴ　ＣＧＡ　８９７Ｓｉｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　工ＩＣ入ｌａ　ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｓｉｒ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　ｋｒｑ　２９９ａ　ａ　ｑ　ａ　ｑｑｑａａｃａ　Ｃｔｃ　ｔ　ｔｔｇｔ−ａ　ｅｃｃａ　ｔ　ｔｔｃｔａｇｃｔｑ　ｃｃａｇｇｃｔｇｔｔｇｑＣＣＣａ　bｔ　１２６３ｃａｇ　Ｌ！６６Ｆｉｇｕｒｅ　ｌ　（犠５　）とトＤ３（上ｌ”Ｊ）／ラットＤ３（下チ（」）の仁し奉火ｊ　トＤ３’ｌ：ｇイネの↓イ叔子のフラクンントのフルオナドａυ“Ｊ響」ｒ本発明は、図１の４００個のアミノ酸配列を含むかまたは該配列のフラグメントを含むドーパミン作用性受容体活性を有する新規なポリペプチドを提供する。前記フラグメントは、該フラグメントが細胞の表面に至上しているときに、ドーパミンがその作動物質または拮抗物質に特異的に且つ例えば放射性リガンドによる定量可能に結合するために前記配列中で存在することが必要な部位を含むフラグメントであるか、または、前記４００個のアミノ酸配列を認識するがドーパミン作用性Ｄ１受容体及びＤ２受容体並びにラットドーパミン作用性Ｄ３受容体のいずれもを認識しない抗体によって認識され得るフラグメントか、または、前記４４６個のアミノ酸配列を認識するがドーパミン作用性Ｄｌ受容体、Ｄ２受容体、ラットドーパミン作用性り、受容体をいずれも認識しない抗体を産生じ得るようなフラグメントである。

１□。、、　ＰＣＴ／ＦＲ９１１００８１Ｇ

Claims

【特許請求の範囲】

１．図１の４００個のアミノ酸配列または該配列のフラグメントを含み、前記フラグメントが、 −該フラグメントが細胞の表面に露出しているときにドーパミンが作動物質または拮抗物質に特異的に且つ、例えばＳｏｋｏｌｏｆｆ他、（１９８０）（６）及びＭａｒ−ｔｒｅｓ他、（１９８５）（７）に記載された方法で放射性リガンドにより定量可能に結合するために前記配列中に存在することが必要な部位を含み、これらの部位が、ラットドーパミン作用性Ｄ３受容体に含まれている部位とは異なる部位であるようなフラグメント、または、−前記４００個のアミノ酸の配列を認識するがドーパミン作用性Ｄ１受容体、ドーパミン作用性Ｄ２受容体、ラットドーパミン作用性Ｄ３受容体のいずれをも認識しない抗体によって認識され得るフラグメント、または、−前記４００個のアミノ酸の配列を認識するがドーパミン作用性Ｄ１受容体、ドーパミン作用性Ｄ２受容体、ラットドーパミン作用性Ｄ３受容体のいずれをも認識しない抗体を産生し得るようなフラグメントから成るドーパミン作用性受容体活性を有するポリペプチド、あるいは、ポリペプチドのドーパミン作用性受容体特性を喪失させないいくつかの局在性突然変異を含む前記に定義のポリペプチドに対応するポリペプチド変異体、特に以下の４つの突然変異（突然変異を有し得るアミノ酸の位置は図１の符号に基づく）：９位のＳｅｒがＧｌｙによって置換された突然変異、７９位のＡｌａがＶａｌによって置換された突然変異、１８９位のＶａｌがＩｌｅによって置換され突然変異、３９７位のＩｌｅがＴｈｒによって置換された突然変異：の少なくとも１つを有するポリペプチド、特に、上記の４つの突然変異全部を含むポリペプチドから成るドーパミン作用性受容体活性を有するポリペプチド。
２．図１の１位のアミノ酸から成る末端から４００位のアミノ酸から成る末端までの配列から成ることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
３．翻訳後にまたは転写及び翻訳後に請求項１または２に記載のポリペプチドのいずれか１つを与えるヌクレオチド連鎖から成ることを特徴とする核酸。
４．−図３の１位のヌクレオチドから成る末端から５７４位のヌクレオチドから成る末端までのヌクレオチド連鎖、−図４の１位のヌクレオチドから成る末端から３０６位のヌクレオチドから成る末端までのヌクレオチド連鎖、−図１の−６位のヌクレオチドから成る末端から１２６６位のヌクレオチドから成る末端までのヌクレオチド連鎖、−図１の１位のヌクレオチドから成る末端から１２００位のヌクレオチドから成る末端までのヌクレオチド連鎖を含むかまたは該連鎖から構成されるか、あるいは、以下の６つの突然変異（突然変異し得るヌクレオチドの位置は図１に基づく）：２５位のＡがＧで置換された突然変異、５１位のＡがＧで置換された突然変異、２３６位のＣがＴで置換された突然変異、５６５位のＧがＡで置換された突然変異、８７６位のＴがＣで置換された突然変異、１１９０位のＴがＣで置換された突然変異：の少なくとも１つを有しており、特に６つの突然変異の全部を含むことを特徴とする請求項３に記載の核酸。
５．複製に必須でない部位の１つに請求項３または４に記載の核酸を含むことを特徴とする特にプラスミド、コスミド、ファージまたはウイルス型の特にクローニング及び／または発現用の組換えベクター。
６．複製に必須でない部位の１つに、細胞性宿主中で請求項１または２に記載のアミノ酸配列の発現を促進するために必要なエレメントを含み、且つ任意に、細胞性宿主のポリメラーゼによって認識されるプロモーター、特に誘発性プロモーターと、任意にシグナル配列及びアンカー配列とを含むことを特徴とする請求項５に記載のベクター。
７．請求項５または６に記載の組換えベクターによって形質転換され請求項１または２に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をその内部で発現させ得る調節エレメントを含む細胞性宿主。
８．細菌、特に大腸菌から選択されることを特徴とする請求項７に記載の形質転換された細胞性宿主。
９．ＣＨＯ細胞またはＣＯＳ−７細胞のような真核生物から選択されることを特徴とする請求項７に記載の形質転換された細胞性宿主。
１０．請求項１または２に記載のポリペプチドに特異的であり、ドーパミン作用性Ｄ１受容体及びドーパミン作用性Ｄ２受容体のいずれをも認識せず、特に、以下のアミノ酸配列： −図１の２４３位のアミノ酸から成る末端から２７７位のアミノ酸から成る末端までのアミノ酸配列によって規定される配列：を認識することを特徴とする抗体。
１１．ドーパミン作用性Ｄ１受容体、Ｄ２受容体及びラットドーパミン作用性Ｄ３受容体の遺伝子及びメッセンジャーＲＮＡのいずれともハイブリダイズしないようなハイブリダイゼーション条件下に、請求項３または４に記載の核酸またはそれらの相補的配列の１つとハイブリダイズすることを特徴とするヌクレオチドプローブであって、特に、以下のヌクレオチドプローブ： −図１の−６位のヌクレオチドから成る末端から１２６６位のヌクレオチドから成る末端までの核酸配列によって規定されるプローブ、 −図１の１位のヌクレオチドから成る末端から１２００位のヌクレオチドから成る末端までの核酸配列によって規定されるプローブ、 −図１の７２０位のヌクレオチドから成る末端から８３１位のヌクレオチドから成る末端までの核酸配列によって規定されるプローブ、 −図３の１位のヌクレオチドから成る末端から５７４位のヌクレオチドから成る末端までの核酸配列によって規定されるプローブ、 −図４の１位のヌクレオチドから成る末端から３０６位のヌクレオチドから成る末端までの核酸配列によって規定されるプローブ、 −または夫々の相補的ヌクレオチド配列、から選択されることを特徴とするヌクレオチドプローブ。
１２．請求項１または２に記載のポリペプチドに対してリガンドとして作用し得る分子の能力の検出方法であって、−前記ポリペプチドをコードするインサートによって修飾されたベクターを用いて予め形質転換され且つ表面に前記ポリペプチドに特異的な１つまたは複数の部位を有している細胞性宿主と分子とを、場合によっては該インサートの発現の誘発後に接触させ、この接触は、前記分子が前記ポリペプチドに対する親和性を実際に有していることが判明すると直ちに、前記特異的部位の少なくとも１つと前記分子との間の結合が形成され得る条件下にで行なわれ、−リガンドーポリペプチド型の複合体の形成の有無を検出する段階から成ることを特徴とする方法。
１３．所定の１つまたは複数のリガンドに対する請求項１または２に記載のポリペプチドの親和性の試験方法であって、 −調節エレメントのコントロール下、特に使用される細胞性宿主のポリメラーゼによって認識され且つ該細胞性宿主中で前記ヌクレオチド配列を発現させ得るプロモーターのコントロール下に、Ｄ３受容体をコードするヌクレオチド配列（インサート）が予め挿入されたベクター、特にプラスミドまたはファージでコンピテント細胞性宿主を形質転換させ、 −前記インサートが発現し得る条件下に形質転換された細胞性宿主を培養し、Ｄ３受容体のトランスメンブラン配列が形質転換された細胞性宿主の表面に露出するように、発現されたヒトＤ３受容体を膜に向かって運搬させ、−前記細胞性宿主と所定のリガンドとを接触させ、−前記形質転換された細胞性宿主と前記所定のリガンドとの間の親和性反応を検出する段階から成ることを特徴とする方法。
１４．ヒトドーパミン作用性Ｄ３受容体の異常発現のｉｎｖｉｔｒｏ診断方法であって、請求項１１に記載の１つまたは複数のプローブを使用し、 −患者から採取された生物サンプルに含まれると予想される量の請求項３または４に記載のヌクレオチド配列を２つのＤＮＡプライマーによってできれば予め増幅させ、−前記プローブと前記ヌクレオチド配列とから形成されるハイブリダイゼーション複合体が産生され得る条件下に前記の生物サンプルと請求項１１に記載のヌクレオチドプローブとを接触させ、 −形成された前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する段階から成ることを特徴とする方法。
１５．個体から採取された血液のような生物サンプルを用い、神経性、精神医学性、心血管性または神経内分泌性疾患との相関が存在する遺伝的異常、特にヒトドーパミン作用性Ｄ３受容体をコードする遺伝子の多形現象のｉｎｖｉｔｒｏ診断方法であって、 −制限酵素によって認識され得る制限部位の処で前記核酸を開裂して制限フラグメントが得られる条件下に、前記生物サンプルに由来の核酸を制限酵素によって処理し、−プローブと前記制限フラグメントとの間のハイブリダイゼーション複合体の産生が可能な場合に該産生を生じさせる条件下に、前記フラグメントとハイブリダイズすると予想される請求項１１に記載のヌクレオチドプローブを接触させ、 −前記ハイブリダイゼーション複合体を検出し、−前記ハイブリダイゼーション複合体中に多形制限フラグメントが含まれている場合に該フラグメントの大きさを測定する段階から成ることを特徴とする方法。
１６．個体の請求項３または４に記載のヒトドーパミン作用性Ｄ３受容体をコードする核酸または核酸フラグメントの点突然変異を検出するｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断方法であって、 −プローブと核酸または該核酸フラグメントとの間に形成されるハイブリダイゼーション複合体の産生が可能な場合に該産生を生じさせる条件下に、請求項１１に記載のヌクレオチドプローブと血液のような生物サンプルとを接触させ、 −前記ハイブリダイゼーション複合体を検出し、−前記ハイブリダイゼーション複合体に含まれる核酸または核酸フラグメントを配列決定し、 −前記ハイブリダイゼーション複合体に含まれる核酸または核酸フラグメントの配列を、ヒトドーパミン作用性Ｄ３受容体の（突然変異を有していない）核酸または（突然変異を有していない）核酸フラグメントの配列に比較する段階から成ることを特徴とする方法。
１７．ヒトドーパミン作用性Ｄ３受容体の異常発現の１ｎｖｉｔｒｏ診断方法であって、請求項１０に記載の１つまたは複数の抗体を使用し、 −ヒトドーパミン作用性Ｄ３受容体または該受容体に由来する物質と本発明の抗体との間に形成される免疫複合体の産生が可能な場合に該産生を生じさせる条件下に、請求項１０に際の抗体と前記生物サンプルとを接触させ、−形成された前記免疫複合体を検出する段階から成る方法。
１８．医薬として許容されるビヒクルと共に、ドーパミン作用性受容体活性を有する請求項１または２に記載のポリペプチドの少なくとも１つに活性の物質を活性物質として含むか、または、請求項１または２に記載のドーパミン作用性受容体活性を有するポリペプチドの少なくとも１つをコードする遺伝子または遺伝子フラグメントがトランスフェクトされた細胞に対して活性の物質を活性物質として医薬的に許容されるビヒクルと共に含むことを特徴とする医薬。
１９．ドーパミン作用性Ｄ１受容体またはＤ２受容体に対して活性であるが、請求項１または２に記載のドーパミン作用性受容体活性を有するポリペプチドには不活性な物質を活性物質として含むことを特徴とする医薬。
２０．ヒトドーパミン作用性Ｄ３受容体に対する分子または請求項１８に記載の医薬の作動力価または拮抗力価を評価する方法であって、形質導入タンパク質Ｇｏのサブユニットαｏの遺伝子を含むベクターによって形質転換した請求項７から９のいずれかに記載の細胞性宿主を使用し、−前記分子が存在しないときの細胞内カルシウム濃度に比べて細胞内カルシウム濃度が増加しているときは、分子がＤ３受容体に対する作動物質であると判定し、−細胞内カルシウム濃度の変化がないときまたは前記分子が存在しないときの細胞内カルシウム濃度に比べて細胞内カルシウム濃度が減少しているときは、前記細胞性宿主をドーパミン及び前記分子の存在下に維持し、ドーパミンの存在下に得られた濃度に比べて細胞内カルシウム濃度が減少したときは、分子がＤ３受容体に対する拮抗物質であると判定することを特徴とする方法。