JPH10210993A - 新規7−トランスメンブラン受容体をコードしているcDNAクローンHE8CH90 - Google Patents
新規7−トランスメンブラン受容体をコードしているcDNAクローンHE8CH90Info
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-
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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-
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 HE8CH90ポリペプチドおよびポリヌク
レオチド、ならびに組み換え法によりかかるポリペプチ
ドを製造する方法、ならびにHE8CH90のバランス
不良関連症状の治療プロトコールの設計におけるHE8
CH90ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用を
提供する。 【解決手段】 配列番号:2のポリペプチドまたはその
対応フラグメントをコードしているヌクレオチド配列に
対して少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド
配列を含む単離ポリヌクレオチド;あるいは上記ヌクレ
オチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列。
レオチド、ならびに組み換え法によりかかるポリペプチ
ドを製造する方法、ならびにHE8CH90のバランス
不良関連症状の治療プロトコールの設計におけるHE8
CH90ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用を
提供する。 【解決手段】 配列番号:2のポリペプチドまたはその
対応フラグメントをコードしているヌクレオチド配列に
対して少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド
配列を含む単離ポリヌクレオチド;あるいは上記ヌクレ
オチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
ポリヌクレオチド、それによりコードされるポリペプチ
ド、ならびにかかるポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドの使用、ならびにそれらの製造に関する。より詳細に
は、本発明ポリヌクレオチドおよびポリペプチドはG蛋
白結合受容体(以下、HE8CH90という)に関連し
ている。また本発明は、かかるポリヌクレオチドおよび
ポリペプチドの阻害または活性化にも関する。
ポリヌクレオチド、それによりコードされるポリペプチ
ド、ならびにかかるポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドの使用、ならびにそれらの製造に関する。より詳細に
は、本発明ポリヌクレオチドおよびポリペプチドはG蛋
白結合受容体(以下、HE8CH90という)に関連し
ている。また本発明は、かかるポリヌクレオチドおよび
ポリペプチドの阻害または活性化にも関する。
【0002】
【従来の技術】医学的に重要な多くの方法が、G蛋白お
よび/または第2のメッセンジャー(例えば、cAM
P)を含むシグナル伝達経路に関与している蛋白により
行われているということは、十分にわかっている(Lefk
owitz,Nature,1991,351,353-354)。本明細書では、こ
れらの蛋白を、G蛋白またはPPG蛋白に関する経路に
関与する蛋白という。これらの蛋白のいくつかの例とし
ては、GPC蛋白(例えば、アドレナリン作用性因子お
よびドパミン(Kobilka,B.K.,et al.,Proc.Natl.Acad.S
ci.,USA,1987,84:46-50;Kobolka,B.K. et al.,Science,
1987,238:650-656;Bunzow,J.R.,et al.,Nature,1988,33
6:783-787))、G蛋白自体、エフェクター蛋白(effec
tor proteins)(例えば、ホスホリパーゼC、アデニル
シクラーゼおよびホスホジエステラーゼ)、ならびにア
クチュエーター蛋白(actuator proteins)(例えば、
蛋白キナーゼAおよび蛋白キナーゼC)(Simon,M.I.,e
t al.,Science,1991,252:802-808))が挙げられる。例
えば、シグナル伝達の1の形態において、ホルモン結合
の効果は細胞内酵素アデニレートシクラーゼの活性化で
ある。ホルモンによる酵素の活性化はヌクレオチドGT
Pの存在による。GTPはホルモン結合にも影響する。
G蛋白は、ホルモン受容体により活性化された場合に
は、GTPを結合GDPに交換することが示された。次
いで、GTP担持形態は活性化アデニレートシクラーゼ
に結合する。G蛋白自体により触媒されるGTPからG
DPへの加水分解によりG蛋白はその基底不活性形態に
戻る。かくして、G蛋白は2重の役割、すなわち、受容
体からエフェクターへのシグナルを遅延させる中間体お
よびシグナル間隔を制御する時計としての作用を行う。
よび/または第2のメッセンジャー(例えば、cAM
P)を含むシグナル伝達経路に関与している蛋白により
行われているということは、十分にわかっている(Lefk
owitz,Nature,1991,351,353-354)。本明細書では、こ
れらの蛋白を、G蛋白またはPPG蛋白に関する経路に
関与する蛋白という。これらの蛋白のいくつかの例とし
ては、GPC蛋白(例えば、アドレナリン作用性因子お
よびドパミン(Kobilka,B.K.,et al.,Proc.Natl.Acad.S
ci.,USA,1987,84:46-50;Kobolka,B.K. et al.,Science,
1987,238:650-656;Bunzow,J.R.,et al.,Nature,1988,33
6:783-787))、G蛋白自体、エフェクター蛋白(effec
tor proteins)(例えば、ホスホリパーゼC、アデニル
シクラーゼおよびホスホジエステラーゼ)、ならびにア
クチュエーター蛋白(actuator proteins)(例えば、
蛋白キナーゼAおよび蛋白キナーゼC)(Simon,M.I.,e
t al.,Science,1991,252:802-808))が挙げられる。例
えば、シグナル伝達の1の形態において、ホルモン結合
の効果は細胞内酵素アデニレートシクラーゼの活性化で
ある。ホルモンによる酵素の活性化はヌクレオチドGT
Pの存在による。GTPはホルモン結合にも影響する。
G蛋白は、ホルモン受容体により活性化された場合に
は、GTPを結合GDPに交換することが示された。次
いで、GTP担持形態は活性化アデニレートシクラーゼ
に結合する。G蛋白自体により触媒されるGTPからG
DPへの加水分解によりG蛋白はその基底不活性形態に
戻る。かくして、G蛋白は2重の役割、すなわち、受容
体からエフェクターへのシグナルを遅延させる中間体お
よびシグナル間隔を制御する時計としての作用を行う。
【0003】G蛋白結合受容体(7TM受容体としても
知られる)の膜蛋白遺伝子スーパーファミリーは、7つ
の推定上のトランスメンブランドメインを有するものと
特徴づけられている。ドメインは、細胞外または細胞質
ループにより結合されたトランスメンブランα−ヘリッ
クスを示すと考えられている。G蛋白結合受容体は、広
範な生物学的活性受容体を包含し、例えば、ホルモン、
ウイルス、成長因子および神経受容体を包含する。G蛋
白結合受容体は、少なくとも8個の種々異なる親水性ル
ープに結合した約20ないし30個のアミノ酸からなる
これら7個の保存された疎水的な配列を含むものとして
特徴づけられている。結合受容体のG蛋白ファミリーは
ドパミン受容体を包含し、それは精神病および神経学的
疾病の治療に使用される神経弛緩薬に結合する。このフ
ァミリーのメンバーの他の例は、カルシトニン、アドレ
ナリン作動性物質、エンドセリン、cAMP、アデノシ
ン、ムスカリン作動性物質、アセチルコリン、セロトニ
ン、ヒスタミン、スロンビン、キニン、卵胞刺激ホルモ
ン、オプシン、内皮分化遺伝子−1、ロドプシン、オド
ラント、およびサイトメガロウイルス受容体が挙げられ
るが、これらに限らない。たいていのG蛋白結合受容体
は、最初の2個の細胞外ループ中にそれぞれ1個の保存
されたシステイン残基を有し、ジスルフィド結合を形成
して機能的蛋白構造を安定化していると考えられてい
る。7個のトランスメンブラン領域はTM1、TM2、
TM3、TM4、TM5、TM6、およびTM7と命名
されている。TM3がシグナル伝達に関与している。
知られる)の膜蛋白遺伝子スーパーファミリーは、7つ
の推定上のトランスメンブランドメインを有するものと
特徴づけられている。ドメインは、細胞外または細胞質
ループにより結合されたトランスメンブランα−ヘリッ
クスを示すと考えられている。G蛋白結合受容体は、広
範な生物学的活性受容体を包含し、例えば、ホルモン、
ウイルス、成長因子および神経受容体を包含する。G蛋
白結合受容体は、少なくとも8個の種々異なる親水性ル
ープに結合した約20ないし30個のアミノ酸からなる
これら7個の保存された疎水的な配列を含むものとして
特徴づけられている。結合受容体のG蛋白ファミリーは
ドパミン受容体を包含し、それは精神病および神経学的
疾病の治療に使用される神経弛緩薬に結合する。このフ
ァミリーのメンバーの他の例は、カルシトニン、アドレ
ナリン作動性物質、エンドセリン、cAMP、アデノシ
ン、ムスカリン作動性物質、アセチルコリン、セロトニ
ン、ヒスタミン、スロンビン、キニン、卵胞刺激ホルモ
ン、オプシン、内皮分化遺伝子−1、ロドプシン、オド
ラント、およびサイトメガロウイルス受容体が挙げられ
るが、これらに限らない。たいていのG蛋白結合受容体
は、最初の2個の細胞外ループ中にそれぞれ1個の保存
されたシステイン残基を有し、ジスルフィド結合を形成
して機能的蛋白構造を安定化していると考えられてい
る。7個のトランスメンブラン領域はTM1、TM2、
TM3、TM4、TM5、TM6、およびTM7と命名
されている。TM3がシグナル伝達に関与している。
【0004】システイン残基のホスホリレーションおよ
びリピデーション(パリミチレーションまたはファルネ
シレーション)により、いくつかのG蛋白結合受容体の
シグナル伝達が影響を受ける可能性がある。たいていの
G蛋白結合受容体は、3番目の細胞質ループおよび/ま
たはカルボキシ末端に潜在的なホスホリレーション部位
を有する。いくつかのG蛋白結合受容体、例えばβ−ア
ドレナリン受容体については、蛋白キナーゼAおよび/
または特異的受容体キナーゼによるホスホリレーション
により受容体脱感作がなされる。いくつかの受容体につ
いては、G蛋白結合受容体のリガンド結合部位は、いく
つかのG蛋白結合受容体トランスメンブランドメインに
より形成された親水性ソケットを含むと考えられてお
り、該ソケットはG蛋白結合受容体の疎水性残基により
囲まれていると考えられている。各G蛋白結合受容体ト
ランスメンブランヘリックスの親水性部位は内側を向
き、極性リガンド結合部位を形成すると考えられる。T
M3は、リガンド結合部位(例えば、TM3のアスパラ
ギン酸残基)を有するようないくつかのG蛋白結合受容
体中に含まれている。TM5のセリン、TM6のアスパ
ラギンおよびTM6もしくはTM7のフェニルアラニン
もしくはチロシンもリガンド結合に関与している。ヘテ
ロ3量体G蛋白により、G蛋白結合受容体は種々の細胞
内酵素、イオンチャンネルおよびトランスポーターに細
胞内で結合されうる(Johnson et al.,Endoc.Rev.,198
9,10:317-331参照)。別のG蛋白α−サブユニットは特
定のエフェクターを優先的に刺激して、細胞中の種々の
生物学的機能を転調させる。G蛋白結合受容体の細胞質
残基のホスホリレーションは、いくつかのG蛋白結合受
容体のG蛋白結合の調節のための重要な機構であると同
定されている。G蛋白結合受容体は哺乳動物宿主中の多
くの部位に見いだされている。
びリピデーション(パリミチレーションまたはファルネ
シレーション)により、いくつかのG蛋白結合受容体の
シグナル伝達が影響を受ける可能性がある。たいていの
G蛋白結合受容体は、3番目の細胞質ループおよび/ま
たはカルボキシ末端に潜在的なホスホリレーション部位
を有する。いくつかのG蛋白結合受容体、例えばβ−ア
ドレナリン受容体については、蛋白キナーゼAおよび/
または特異的受容体キナーゼによるホスホリレーション
により受容体脱感作がなされる。いくつかの受容体につ
いては、G蛋白結合受容体のリガンド結合部位は、いく
つかのG蛋白結合受容体トランスメンブランドメインに
より形成された親水性ソケットを含むと考えられてお
り、該ソケットはG蛋白結合受容体の疎水性残基により
囲まれていると考えられている。各G蛋白結合受容体ト
ランスメンブランヘリックスの親水性部位は内側を向
き、極性リガンド結合部位を形成すると考えられる。T
M3は、リガンド結合部位(例えば、TM3のアスパラ
ギン酸残基)を有するようないくつかのG蛋白結合受容
体中に含まれている。TM5のセリン、TM6のアスパ
ラギンおよびTM6もしくはTM7のフェニルアラニン
もしくはチロシンもリガンド結合に関与している。ヘテ
ロ3量体G蛋白により、G蛋白結合受容体は種々の細胞
内酵素、イオンチャンネルおよびトランスポーターに細
胞内で結合されうる(Johnson et al.,Endoc.Rev.,198
9,10:317-331参照)。別のG蛋白α−サブユニットは特
定のエフェクターを優先的に刺激して、細胞中の種々の
生物学的機能を転調させる。G蛋白結合受容体の細胞質
残基のホスホリレーションは、いくつかのG蛋白結合受
容体のG蛋白結合の調節のための重要な機構であると同
定されている。G蛋白結合受容体は哺乳動物宿主中の多
くの部位に見いだされている。
【0005】過去15年間にわたり、7トランスメンブ
ラン(7TM)受容体を標的とする約350種の治療薬
の市場導入が成功している。このことは、これらの受容
体が、治療標的として確立され証明された歴史を有する
こよを示すものである。細菌、真菌、原生動物およびウ
イルス感染のごとき感染症、詳細にはHIV−1または
HIV−2による感染;痛み;癌;拒食症;大食症;喘
息;パーキンソン病;急性心臓疾患;低血圧;高血圧;
尿閉;骨粗鬆症;狭心症;心筋梗塞;潰瘍;アレルギ
ー;良性前立腺肥大;ならびに不安症、分裂病、躁鬱
病、せん妄、痴呆、重度の精神遅滞および運動障害(例
えば、Huntington病またはGilles dela Toutrett症候
群)を包含する精神病および神経学的疾病を包含(これ
らに限らない)する機能不全を予防、改善または修正す
ることにおいて役割りを果たすことのできるさらなる受
容体の同定および特徴づけが明らかに必要である。
ラン(7TM)受容体を標的とする約350種の治療薬
の市場導入が成功している。このことは、これらの受容
体が、治療標的として確立され証明された歴史を有する
こよを示すものである。細菌、真菌、原生動物およびウ
イルス感染のごとき感染症、詳細にはHIV−1または
HIV−2による感染;痛み;癌;拒食症;大食症;喘
息;パーキンソン病;急性心臓疾患;低血圧;高血圧;
尿閉;骨粗鬆症;狭心症;心筋梗塞;潰瘍;アレルギ
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病、せん妄、痴呆、重度の精神遅滞および運動障害(例
えば、Huntington病またはGilles dela Toutrett症候
群)を包含する精神病および神経学的疾病を包含(これ
らに限らない)する機能不全を予防、改善または修正す
ることにおいて役割りを果たすことのできるさらなる受
容体の同定および特徴づけが明らかに必要である。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】1の態様において、本
発明は、HE8CH90ポリペプチドならびにその製造
のための組み換え物質および方法に関する。本発明のも
う1つの態様は、HE8CH90ポリペプチドおよびポ
リヌクレオチドの使用方法に関する。かかる方法は、細
菌、真菌、原生動物およびウイルス感染のごとき感染
症;詳細にはHIV−1またはHIV−2による感染;
痛み;癌;拒食症;大食症;喘息;パーキンソン病;急
性心臓疾患;低血圧;高血圧;尿閉;骨粗鬆症;狭心
症;心筋梗塞;潰瘍;アレルギー;良性前立腺肥大;な
らびに不安症、分裂病、躁鬱病、せん妄、痴呆、重度の
精神遅滞および運動障害(例えば、Huntington病または
Gilles dela Toutrett症候群)を包含する精神病および
神経学的疾病の治療を包含する。さらにもう1つの態様
において、本発明は、本発明により提供される材料を用
いるアンタゴニストおよびアゴニストの同定方法、なら
びに同定された化合物を用いるHE8CH90のバラン
ス不良関連症状の治療方法に関する。さらにもう1つの
態様は、不適当なHE8CH90活性またはレベルに関
連した疾病の検出のための診断アッセイに関する。
発明は、HE8CH90ポリペプチドならびにその製造
のための組み換え物質および方法に関する。本発明のも
う1つの態様は、HE8CH90ポリペプチドおよびポ
リヌクレオチドの使用方法に関する。かかる方法は、細
菌、真菌、原生動物およびウイルス感染のごとき感染
症;詳細にはHIV−1またはHIV−2による感染;
痛み;癌;拒食症;大食症;喘息;パーキンソン病;急
性心臓疾患;低血圧;高血圧;尿閉;骨粗鬆症;狭心
症;心筋梗塞;潰瘍;アレルギー;良性前立腺肥大;な
らびに不安症、分裂病、躁鬱病、せん妄、痴呆、重度の
精神遅滞および運動障害(例えば、Huntington病または
Gilles dela Toutrett症候群)を包含する精神病および
神経学的疾病の治療を包含する。さらにもう1つの態様
において、本発明は、本発明により提供される材料を用
いるアンタゴニストおよびアゴニストの同定方法、なら
びに同定された化合物を用いるHE8CH90のバラン
ス不良関連症状の治療方法に関する。さらにもう1つの
態様は、不適当なHE8CH90活性またはレベルに関
連した疾病の検出のための診断アッセイに関する。
【0007】
【課題を解決するための手段および発明の実施の形態】定義 下記定義は、本明細書で頻繁に使用される特定の用語の
理解を容易にするためのものである。「HE8CH9
0」は、一般的には、配列番号:2に示すアミノ酸配列
を有するポリペプチド、またはその対立遺伝子変種をい
う。「受容体活性」または「受容体の生物学的活性」
は、該HE8CH90の代謝的または生理学的機能をい
い、類似の活性または改善された活性または望ましくな
い副作用を減じられたこれらの活性を包含する。該HE
8CH90の抗原性および免疫原性の活性も含まれる。
「HE8CH90遺伝子」は、配列番号:1に示すヌク
レオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはその対立
遺伝子変種および/またはその相補物をいう。
理解を容易にするためのものである。「HE8CH9
0」は、一般的には、配列番号:2に示すアミノ酸配列
を有するポリペプチド、またはその対立遺伝子変種をい
う。「受容体活性」または「受容体の生物学的活性」
は、該HE8CH90の代謝的または生理学的機能をい
い、類似の活性または改善された活性または望ましくな
い副作用を減じられたこれらの活性を包含する。該HE
8CH90の抗原性および免疫原性の活性も含まれる。
「HE8CH90遺伝子」は、配列番号:1に示すヌク
レオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはその対立
遺伝子変種および/またはその相補物をいう。
【0008】本明細書の用語「抗体」は、ポリクローナ
ルおよびモノクローナル抗体、キメラ、1本鎖、ならび
にヒト化抗体、さらにはFabフラグメントを包含し、
Fabまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの生
成物も包含する。「単離」とは、「人間の手により」天
然の状態から変化させられた、すなわち、それが天然に
存在する場合、元来の環境から変化させるもしくは取り
除く、またはその両方を行ったことを意味する。例えば
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、天然の状態で
生存動物に存在する場合は、「単離」されていないが、
同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、天然に
共存する物質から分離されている場合は、本明細書に用
いる用語である、「単離」がなされている。
ルおよびモノクローナル抗体、キメラ、1本鎖、ならび
にヒト化抗体、さらにはFabフラグメントを包含し、
Fabまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの生
成物も包含する。「単離」とは、「人間の手により」天
然の状態から変化させられた、すなわち、それが天然に
存在する場合、元来の環境から変化させるもしくは取り
除く、またはその両方を行ったことを意味する。例えば
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、天然の状態で
生存動物に存在する場合は、「単離」されていないが、
同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、天然に
共存する物質から分離されている場合は、本明細書に用
いる用語である、「単離」がなされている。
【0009】「HE8CH90ポリヌクレオチド」は、
HE8CH90ポリペプチドまたはそのフラグメントを
コードしているヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチ
ド、あるいは配列番号:2のポリペプチドまたはその対
応フラグメントをコードしているヌクレオチドに対して
少なくとも100%の同一性を有するヌクレオチド配
列、あるいは配列番号:1に含まれるヌクレオチド配列
に対して十分な同一性を有していて、増幅に使用可能な
条件下でハイブリダイゼーションし、またプローブもし
くはマーカーとして使用されるヌクレオチド配列をい
う。
HE8CH90ポリペプチドまたはそのフラグメントを
コードしているヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチ
ド、あるいは配列番号:2のポリペプチドまたはその対
応フラグメントをコードしているヌクレオチドに対して
少なくとも100%の同一性を有するヌクレオチド配
列、あるいは配列番号:1に含まれるヌクレオチド配列
に対して十分な同一性を有していて、増幅に使用可能な
条件下でハイブリダイゼーションし、またプローブもし
くはマーカーとして使用されるヌクレオチド配列をい
う。
【0010】「ポリヌクレオチド」とは、修飾されてい
ないRNAもしくはDNA、または修飾されたRNAも
しくはDNAであってよい、任意のポリリボヌクレオチ
ドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを意味する。
「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖DNA、
一本鎖および二本鎖領域の混合物または一本鎖、二本鎖
および三本鎖領域の混合物であるDNA、一本鎖および
二本鎖RNA、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合
物であるRNA、一本鎖もしくはより通常的には二本鎖
もしくは三本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合
物でよいDNAおよびRNAを含むハイブリッド分子を
意味するが、これに限定するものではない。さらに、本
明細書で用いるポリヌクレオチドは、RNAもしくはD
NAまたはRNAとDNAの両方を含む三本鎖領域を意
味する。安定性またはその他の理由で修飾した骨格を有
するDNAまたはRNAは、本明細書の用語「ポリヌク
レオチド」に含まれる。イノシン等の通常的でない塩
基、またはトリチル化塩基等の修飾塩基は「修飾」され
た塩基に含まれる。種々の修飾がDNAおよびRNAに
ついて行われているので、「ポリヌクレオチド」は、ポ
リヌクレオチドのかかる化学的、酵素的または代謝的に
修飾された形態、ならびにウイルスおよび、例えば単細
胞および複合細胞等の細胞に特徴的なDNAおよびRN
Aの化学的形態を包含する。また、「ポリヌクレオチ
ド」は、しばしばオリゴヌクレオチドと称される短いポ
リヌクレオチドを包含する。
ないRNAもしくはDNA、または修飾されたRNAも
しくはDNAであってよい、任意のポリリボヌクレオチ
ドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを意味する。
「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖DNA、
一本鎖および二本鎖領域の混合物または一本鎖、二本鎖
および三本鎖領域の混合物であるDNA、一本鎖および
二本鎖RNA、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合
物であるRNA、一本鎖もしくはより通常的には二本鎖
もしくは三本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合
物でよいDNAおよびRNAを含むハイブリッド分子を
意味するが、これに限定するものではない。さらに、本
明細書で用いるポリヌクレオチドは、RNAもしくはD
NAまたはRNAとDNAの両方を含む三本鎖領域を意
味する。安定性またはその他の理由で修飾した骨格を有
するDNAまたはRNAは、本明細書の用語「ポリヌク
レオチド」に含まれる。イノシン等の通常的でない塩
基、またはトリチル化塩基等の修飾塩基は「修飾」され
た塩基に含まれる。種々の修飾がDNAおよびRNAに
ついて行われているので、「ポリヌクレオチド」は、ポ
リヌクレオチドのかかる化学的、酵素的または代謝的に
修飾された形態、ならびにウイルスおよび、例えば単細
胞および複合細胞等の細胞に特徴的なDNAおよびRN
Aの化学的形態を包含する。また、「ポリヌクレオチ
ド」は、しばしばオリゴヌクレオチドと称される短いポ
リヌクレオチドを包含する。
【0011】「ポリペプチド」は、ペプチド結合または
修飾したペプチド結合により互いに結合している2個ま
たはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたは蛋
白を意味する。「ポリペプチド」は、通常、例えばペプ
チド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称する短
鎖、および一般的に蛋白と称する長鎖の両方を意味す
る。ポリペプチドは20種の遺伝子によりコードされた
アミノ酸とは異なるアミノ酸を含有できる。「ポリペプ
チド」には、プロセッシングおよびその他の翻訳後修飾
のような天然の工程により修飾されたものが含まれる
が、当業者に周知の化学修飾技術によっても修飾され
る。このような修飾は基礎的な参考書およびさらに詳細
な論文ならびに多数の研究文献にも詳しく記載されてお
り、これらは当業者に周知である。同一の型の修飾は該
ポリペプチドの幾つかの部位で、同一または異なる程度
で存在し得ることは理解されよう。また、該ポリペプチ
ドは多くの型の修飾をも含み得る。修飾は、ペプチド骨
格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端
等のポリペプチドの任意の部位で起こりうる。修飾に
は、アセチル化、アシル化、ADP−リボシル化、アミ
ド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌク
レオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質ま
たは脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトール
の共有結合、交差架橋、環化、ジスルフィド結合形成、
脱メチル化、交差架橋共有結合形成、システイン形成、
ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキ
シル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、水酸化、
ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白加水
分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ
化、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残
基のガンマ−カルボキシル化、水酸化およびADPリボ
シル化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のような
トランスファーRNA媒介の蛋白へのアミノ酸の添加、
ならびにユビキチネーションなどがある。例えばProtei
ns-Structure and Molecular Properties、第2版、T.
E.Creighton、W.H.Freeman and Company、ニューヨーク
(1993)およびPosttranslational Covalent Modificat
ion of Proteins、B.C.Johnson編、アカデミックプレ
ス、ニューヨーク(1983)のWold,F.,Posttranslationa
l Protein Modifications :Perspective and Prospect
s、1〜12頁;Seifterら、Meth.Enzymol.182:626-646(1
990)およびRattanら、Protein Synthesis:Posttransl
ational Modifications and Aging,Ann.N.Y.Acad.Sci.
663:48-62(1992)を参照されたい。
修飾したペプチド結合により互いに結合している2個ま
たはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたは蛋
白を意味する。「ポリペプチド」は、通常、例えばペプ
チド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称する短
鎖、および一般的に蛋白と称する長鎖の両方を意味す
る。ポリペプチドは20種の遺伝子によりコードされた
アミノ酸とは異なるアミノ酸を含有できる。「ポリペプ
チド」には、プロセッシングおよびその他の翻訳後修飾
のような天然の工程により修飾されたものが含まれる
が、当業者に周知の化学修飾技術によっても修飾され
る。このような修飾は基礎的な参考書およびさらに詳細
な論文ならびに多数の研究文献にも詳しく記載されてお
り、これらは当業者に周知である。同一の型の修飾は該
ポリペプチドの幾つかの部位で、同一または異なる程度
で存在し得ることは理解されよう。また、該ポリペプチ
ドは多くの型の修飾をも含み得る。修飾は、ペプチド骨
格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端
等のポリペプチドの任意の部位で起こりうる。修飾に
は、アセチル化、アシル化、ADP−リボシル化、アミ
ド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌク
レオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質ま
たは脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトール
の共有結合、交差架橋、環化、ジスルフィド結合形成、
脱メチル化、交差架橋共有結合形成、システイン形成、
ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキ
シル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、水酸化、
ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白加水
分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ
化、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残
基のガンマ−カルボキシル化、水酸化およびADPリボ
シル化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のような
トランスファーRNA媒介の蛋白へのアミノ酸の添加、
ならびにユビキチネーションなどがある。例えばProtei
ns-Structure and Molecular Properties、第2版、T.
E.Creighton、W.H.Freeman and Company、ニューヨーク
(1993)およびPosttranslational Covalent Modificat
ion of Proteins、B.C.Johnson編、アカデミックプレ
ス、ニューヨーク(1983)のWold,F.,Posttranslationa
l Protein Modifications :Perspective and Prospect
s、1〜12頁;Seifterら、Meth.Enzymol.182:626-646(1
990)およびRattanら、Protein Synthesis:Posttransl
ational Modifications and Aging,Ann.N.Y.Acad.Sci.
663:48-62(1992)を参照されたい。
【0012】本明細書で用いる「変種」なる用語は、対
照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは各々異なる
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであるが、本質的
な特性は保持している。典型的なポリヌクレオチドの変
種は、別の対照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列
が異なる。変種のヌクレオチド配列の差異は、対照ポリ
ヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ
酸配列を変化させるものであってもよく、変化させない
ものであってもよい。ヌクレオチドの変化は結果的に、
以下に論じるように、対照配列によりコードされるポリ
ペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠損、融合およ
び末端切断を招く。典型的なポリペプチドの変種は、別
の対照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的
に差異は、対照ポリペプチドおよび変種の配列が、全体
的に非常に類似しており、多くの領域で同一であるよう
に限定される。変種および対照ポリペプチドは、1また
はそれ以上の置換、付加、欠損が任意の組み合わせで起
こることにより、アミノ酸配列が変化し得る。置換また
は挿入したアミノ酸残基は、遺伝的コードによりコード
されたものであってもなくてもよい。ポリヌクレオチド
またはポリペプチドの変種は例えば対立遺伝子変種のよ
うな天然発生のものでよいか、または天然に発生するこ
とが知られていない変種でよい。ポリヌクレオチドおよ
びポリペプチドの非天然発生変種は、突然変異技術また
は直接的合成により製造できる。
照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは各々異なる
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであるが、本質的
な特性は保持している。典型的なポリヌクレオチドの変
種は、別の対照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列
が異なる。変種のヌクレオチド配列の差異は、対照ポリ
ヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ
酸配列を変化させるものであってもよく、変化させない
ものであってもよい。ヌクレオチドの変化は結果的に、
以下に論じるように、対照配列によりコードされるポリ
ペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠損、融合およ
び末端切断を招く。典型的なポリペプチドの変種は、別
の対照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的
に差異は、対照ポリペプチドおよび変種の配列が、全体
的に非常に類似しており、多くの領域で同一であるよう
に限定される。変種および対照ポリペプチドは、1また
はそれ以上の置換、付加、欠損が任意の組み合わせで起
こることにより、アミノ酸配列が変化し得る。置換また
は挿入したアミノ酸残基は、遺伝的コードによりコード
されたものであってもなくてもよい。ポリヌクレオチド
またはポリペプチドの変種は例えば対立遺伝子変種のよ
うな天然発生のものでよいか、または天然に発生するこ
とが知られていない変種でよい。ポリヌクレオチドおよ
びポリペプチドの非天然発生変種は、突然変異技術また
は直接的合成により製造できる。
【0013】「同一性」とは、当該分野に周知であるよ
うに、二つもしくはそれ以上のポリペプチド配列また二
つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係で
あり、配列を比較して決定する。当該分野において、
「同一性」とは、場合によってはこのような配列の鎖の
適合性により決定できる、ポリペプチドまたはポリヌク
レオチド配列の配列関連性の程度をも意味する。「同一
性」および「類似性」は共に既知の方法により容易に算
出できる(Computational Molecular Biology,Lesk,A.
M.編、オックスフォード・ユニバーシティー・プレス、
ニューヨーク、1988年;Biocomputing:Informatics an
d Genome Projects,Smith,D.W.編、アカデミック・プ
レス、ニューヨーク、1993年;Computer Analysis of S
equence Data,パートI,Griffin,A.M.およびGriffin,
H.G.編、ヒューマン・プレス、ニュージャージー、1994
年;Sequence Analysis in Molecular Biology,von He
inje,G.、アカデミック・プレス、1987年;およびSeque
nce Analysis Primer,Gribskov,M.およびDevereux,J.
編、Mストックトン・プレス、ニューヨーク、1991
年)。二つの配列の同一性および類似性を測定する方法
は多くあるが、両用語共当業者に周知である(Sequence
Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.、ア
カデミック・プレス、1987年;Sequence Analysis Prim
er,Gribskov,M.およびDevereux,J.編、Mストックトン
・プレス、ニューヨーク、1991年;ならびにCarillo,H.
およびLipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(19
88))。配列間の同一性または類似性を測定するために
通常用いられる方法はCarillo,H.およびLipman,D.,SIA
M J.Applied Math.,48:1073(1988)等に開示されてい
るが、これらに限定するものではない。同一性を決定す
るための好ましい方法は、試験する配列間で最も良く適
合するように設計される。同一性および類似性を決定す
る方法は、公に入手できるコンピュータープログラムに
集成されている。二つの配列間の同一性および類似性を
測定する好ましいコンピュータープログラム法には、G
CGプログラムパッケージ(Devereux,J.ら、Nucleic A
cids Research12(1):387(1984)、BLASTP、BLASTN、お
よびFASTA(Atschul,S.F.ら、J.Molec.Biol.215:403-41
0(1990)))等があるが、これらに限定するものでは
ない。
うに、二つもしくはそれ以上のポリペプチド配列また二
つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係で
あり、配列を比較して決定する。当該分野において、
「同一性」とは、場合によってはこのような配列の鎖の
適合性により決定できる、ポリペプチドまたはポリヌク
レオチド配列の配列関連性の程度をも意味する。「同一
性」および「類似性」は共に既知の方法により容易に算
出できる(Computational Molecular Biology,Lesk,A.
M.編、オックスフォード・ユニバーシティー・プレス、
ニューヨーク、1988年;Biocomputing:Informatics an
d Genome Projects,Smith,D.W.編、アカデミック・プ
レス、ニューヨーク、1993年;Computer Analysis of S
equence Data,パートI,Griffin,A.M.およびGriffin,
H.G.編、ヒューマン・プレス、ニュージャージー、1994
年;Sequence Analysis in Molecular Biology,von He
inje,G.、アカデミック・プレス、1987年;およびSeque
nce Analysis Primer,Gribskov,M.およびDevereux,J.
編、Mストックトン・プレス、ニューヨーク、1991
年)。二つの配列の同一性および類似性を測定する方法
は多くあるが、両用語共当業者に周知である(Sequence
Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.、ア
カデミック・プレス、1987年;Sequence Analysis Prim
er,Gribskov,M.およびDevereux,J.編、Mストックトン
・プレス、ニューヨーク、1991年;ならびにCarillo,H.
およびLipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(19
88))。配列間の同一性または類似性を測定するために
通常用いられる方法はCarillo,H.およびLipman,D.,SIA
M J.Applied Math.,48:1073(1988)等に開示されてい
るが、これらに限定するものではない。同一性を決定す
るための好ましい方法は、試験する配列間で最も良く適
合するように設計される。同一性および類似性を決定す
る方法は、公に入手できるコンピュータープログラムに
集成されている。二つの配列間の同一性および類似性を
測定する好ましいコンピュータープログラム法には、G
CGプログラムパッケージ(Devereux,J.ら、Nucleic A
cids Research12(1):387(1984)、BLASTP、BLASTN、お
よびFASTA(Atschul,S.F.ら、J.Molec.Biol.215:403-41
0(1990)))等があるが、これらに限定するものでは
ない。
【0014】本発明のポリペプチド 本発明HE8CH90は、配列番号:2のポリペプチ
ド;ならびに配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペ
プチド;および配列番号:2の全長に対して少なくとも
80%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチ
ド、さらに好ましくは少なくとも90%の同一性、その
うえさらに好ましくは少なくとも95%の同一性を有す
るアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。配列番
号:2のアミノ酸配列を有するポリペプチドの全長に対
して少なくとも80%の同一性、さらに好ましくは少な
くとも90%の同一性、そのうえさらに好ましくは少な
くとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を有するポ
リペプチドもHE8CH90ポリペプチドに含まれる。
好ましくは、HE8CH90ポリペプチドは、その受容
体の少なくとも1つの生物学的活性を示す。HE8CH
90ポリペプチドは「成熟」蛋白の形態であってもよ
く、あるいは融合蛋白のごとき大型の蛋白の一部であっ
てもよい。分泌またはリーダー配列、プロ配列、複数の
ヒスチジン残基のごとき精製を促進する配列、または組
み換え法を行っている間の安定性のためのさらなる配列
を含むさらなるアミノ酸配列を含んでいることがしばし
ば有利である。
ド;ならびに配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペ
プチド;および配列番号:2の全長に対して少なくとも
80%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチ
ド、さらに好ましくは少なくとも90%の同一性、その
うえさらに好ましくは少なくとも95%の同一性を有す
るアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。配列番
号:2のアミノ酸配列を有するポリペプチドの全長に対
して少なくとも80%の同一性、さらに好ましくは少な
くとも90%の同一性、そのうえさらに好ましくは少な
くとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を有するポ
リペプチドもHE8CH90ポリペプチドに含まれる。
好ましくは、HE8CH90ポリペプチドは、その受容
体の少なくとも1つの生物学的活性を示す。HE8CH
90ポリペプチドは「成熟」蛋白の形態であってもよ
く、あるいは融合蛋白のごとき大型の蛋白の一部であっ
てもよい。分泌またはリーダー配列、プロ配列、複数の
ヒスチジン残基のごとき精製を促進する配列、または組
み換え法を行っている間の安定性のためのさらなる配列
を含むさらなるアミノ酸配列を含んでいることがしばし
ば有利である。
【0015】生物学的に活性のあるHE8CH90のフ
ラグメントも本発明に含まれる。フラグメントは、前述
のHE8CH90ポリペプチドのアミノ酸配列のすべて
ではなく一部に対して全く同一であるアミノ酸配列を有
するポリペプチドである。HE8CH90ポリペプチド
では、フラグメントは「独立して存在するもの(freest
anding)」であるか、または一部分もしくは領域を形成
するより大きなポリペプチド内に含まれていてもよく、
最も好ましくは単一の連続した領域として、単一のより
大きなポリペプチドに含まれる。本発明ポリペプチドフ
ラグメントの典型例は、例えば、HE8CH90ポリペ
プチドのアミノ酸番号約1〜20、21〜40、41〜
60、61〜80、81〜100および101から末端
までからなるフラグメントを包含する。この意味におい
て、「約」とは、片方の端または両端において、示され
た数よりも数個、5個、4個、3個、2個または1個多
いかまたは少ない範囲を含む。好ましいフラグメント
は、例えば、アミノ末端を含む一連の残基が欠失、また
はカルボキシ末端を含む一連の残基が欠失、あるいは一
方がアミノ末端でもう一方がカルボキシ末端を含む2種
の一連の残基が欠失していること以外はHE8CH90
ポリペプチドのアミノ酸配列を有する末端切断ポリペプ
チドを包含する。また、構造的または機能的属性により
特徴づけられたフラグメント、例えばアルファーヘリッ
クスおよびアルファーヘリックス形成領域、ベータシー
トおよびベータシート形成領域、ターンおよびターン形
成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎
水性領域、アルファー両親媒性領域、ベータ両親媒性領
域、可変領域、表面形成領域、基質結合領域、および高
抗原性指標領域を含むフラグメントなども好ましい。受
容体活性を媒介する、生物学的に活性な領域もまた好ま
しく、類似の活性もしくは改善された活性のある、また
は望ましくない活性を減じたフラグメント等がある。動
物、とりわけヒトにおいて抗原的または免疫原的なフラ
グメントもまた含まれる。
ラグメントも本発明に含まれる。フラグメントは、前述
のHE8CH90ポリペプチドのアミノ酸配列のすべて
ではなく一部に対して全く同一であるアミノ酸配列を有
するポリペプチドである。HE8CH90ポリペプチド
では、フラグメントは「独立して存在するもの(freest
anding)」であるか、または一部分もしくは領域を形成
するより大きなポリペプチド内に含まれていてもよく、
最も好ましくは単一の連続した領域として、単一のより
大きなポリペプチドに含まれる。本発明ポリペプチドフ
ラグメントの典型例は、例えば、HE8CH90ポリペ
プチドのアミノ酸番号約1〜20、21〜40、41〜
60、61〜80、81〜100および101から末端
までからなるフラグメントを包含する。この意味におい
て、「約」とは、片方の端または両端において、示され
た数よりも数個、5個、4個、3個、2個または1個多
いかまたは少ない範囲を含む。好ましいフラグメント
は、例えば、アミノ末端を含む一連の残基が欠失、また
はカルボキシ末端を含む一連の残基が欠失、あるいは一
方がアミノ末端でもう一方がカルボキシ末端を含む2種
の一連の残基が欠失していること以外はHE8CH90
ポリペプチドのアミノ酸配列を有する末端切断ポリペプ
チドを包含する。また、構造的または機能的属性により
特徴づけられたフラグメント、例えばアルファーヘリッ
クスおよびアルファーヘリックス形成領域、ベータシー
トおよびベータシート形成領域、ターンおよびターン形
成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎
水性領域、アルファー両親媒性領域、ベータ両親媒性領
域、可変領域、表面形成領域、基質結合領域、および高
抗原性指標領域を含むフラグメントなども好ましい。受
容体活性を媒介する、生物学的に活性な領域もまた好ま
しく、類似の活性もしくは改善された活性のある、また
は望ましくない活性を減じたフラグメント等がある。動
物、とりわけヒトにおいて抗原的または免疫原的なフラ
グメントもまた含まれる。
【0016】好ましくは、これらのポリペプチドのすべ
ては、抗原性の活性を含めて受容体の生物学的活性を保
持している。上記配列およびフラグメントの変種もこの
グループに含まれる。好ましい変種は、保存的アミノ酸
置換により変化したものであり、すなわち、同様の特徴
を有するアミノ酸によち置換されているものである。典
型的なかかる置換は、Ala、Val、LeuおよびI
le間:SerおよびThr間;AspおよびGlu
間;AsnおよびGln間;ならびに塩基性残基Lys
およびArg間;あるいは芳香族残基PheおよびTy
r間におけるものである。数個、5ないし10個、1な
いし5個、または1ないし2個のアミノ酸がいずれかの
組み合わせで置換、欠失または付加されている変種が特
に好ましい。
ては、抗原性の活性を含めて受容体の生物学的活性を保
持している。上記配列およびフラグメントの変種もこの
グループに含まれる。好ましい変種は、保存的アミノ酸
置換により変化したものであり、すなわち、同様の特徴
を有するアミノ酸によち置換されているものである。典
型的なかかる置換は、Ala、Val、LeuおよびI
le間:SerおよびThr間;AspおよびGlu
間;AsnおよびGln間;ならびに塩基性残基Lys
およびArg間;あるいは芳香族残基PheおよびTy
r間におけるものである。数個、5ないし10個、1な
いし5個、または1ないし2個のアミノ酸がいずれかの
組み合わせで置換、欠失または付加されている変種が特
に好ましい。
【0017】いずれの適当な方法でも本発明HE8CH
90ポリペプチドを製造することができる。かかるポリ
ペプチドは、単離された天然ポリペプチド、組み換え法
によるポリペプチド、合成法によるポリペプチド、また
はこれらの方法の組み合わせによるポリペプチドを包含
する。かかるポリペプチドの製造手段は当該分野におい
てよく知られている。
90ポリペプチドを製造することができる。かかるポリ
ペプチドは、単離された天然ポリペプチド、組み換え法
によるポリペプチド、合成法によるポリペプチド、また
はこれらの方法の組み合わせによるポリペプチドを包含
する。かかるポリペプチドの製造手段は当該分野におい
てよく知られている。
【0018】本発明のポリヌクレオチド 本発明のもう1つの態様は、HE8CH90ポリヌクレ
オチドに関する。HE8CH90ポリヌクレオチドは、
HE8CH90ポリペプチドおよびフラグメントをコー
ドしているポリヌクレオチド、ならびにそれらに密接に
関連しているポリヌクレオチドを包含する。より詳細に
は、本発明HE8CH90ポリヌクレオチドは、配列番
号:2のHE8CH90ポリペプチドをコードしている
配列番号:1に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレ
オチド、ならびに配列番号:1の特定の配列を有するポ
リヌクレオチドを包含する。さらにHE8CH90ポリ
ヌクレオチドは、配列番号:2のHE8CH90ポリペ
プチドをコードしているポリヌクレオチドに対して全長
にわたり少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチ
ド配列を含むポリヌクレオチド、配列番号:1の配列を
有するポリヌクレオチドに対して全長にわたり少なくと
も80%の同一性を有するポリヌクレオチドを含む。ま
たHE8CH90ポリヌクレオチドは、配列番号:1に
含まれるヌクレオチド配列に対して十分な同一性を有
し、増幅に使用可能であるかまたはプローブもしくはマ
ーカーとして使用される条件下でハイブリダイゼーショ
ンするに十分な同一性を有するヌクレオチド配列でもあ
る。また本発明は、かかるHE8CH90ポリヌクレオ
チドに対して相補的なポリヌクレオチドも提供する。ヒ
ト・HE8CH90をコードしているcDNAの配列決
定の結果により示されるように、本発明HE8CH90
は、G蛋白結合受容体の他の蛋白に構造的に関連してい
る。そのcDNA配列は、351個のアミノ酸残基の蛋
白をコードしている読み枠を含み、推定分子量39.0
8kDaである。図1のHE8CH90(配列番号:
2)は、EDG2受容体(Zondag et al,AC#Y09
479、未公表,1996年)に対して314個のアミ
ノ酸残基において約56.4%の同一性を有する(FA
STAを用いた場合)。さらにそのうえ、HE8CH9
0(配列番号:2)は、REC1受容体(AC#U48
235,Premont et al,未公表,1996年)に対して
307個のアミノ酸残基において58%の同一性を有す
る。さらにそのうえ、HE8CH90(配列番号:2)
は、ヒト・EDG1様受容体(AC#P21453,Ma
ciag,T.et al,J.Biol.Chem.265:9308-9313,1990)に対
して35.1%の同一性を有する。図1のHE8CH9
0遺伝子(配列番号:1)は、Mus Musculusのリゾホス
ファチジン酸受容体V2g−1(AC#U70622,
Hecht J.H.et al,J.Cell Biol.135(4),1071-1083,199
6)に対して778個のヌクレオチド残基において約6
3.24%の同一性がある(BLASTを用いた場
合)。さらにそのうえ、HE8CH90(配列番号:
1)は、マウスの推定上のG蛋白結合受容体RECL
(AC#U48235,Macrae,A.D.et al,未公表)に
対して778個のヌクレオチド塩基残基において63.
11%の同一性がある。さらにそのうえ、HE8CH9
0(配列番号:1)は、ヒト・EDG2様受容体(AC
#U78192,Zondag et al,未公表,1996)に
対して778個のヌクレオチド塩基残基において60.
93%の同一性がある。
オチドに関する。HE8CH90ポリヌクレオチドは、
HE8CH90ポリペプチドおよびフラグメントをコー
ドしているポリヌクレオチド、ならびにそれらに密接に
関連しているポリヌクレオチドを包含する。より詳細に
は、本発明HE8CH90ポリヌクレオチドは、配列番
号:2のHE8CH90ポリペプチドをコードしている
配列番号:1に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレ
オチド、ならびに配列番号:1の特定の配列を有するポ
リヌクレオチドを包含する。さらにHE8CH90ポリ
ヌクレオチドは、配列番号:2のHE8CH90ポリペ
プチドをコードしているポリヌクレオチドに対して全長
にわたり少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチ
ド配列を含むポリヌクレオチド、配列番号:1の配列を
有するポリヌクレオチドに対して全長にわたり少なくと
も80%の同一性を有するポリヌクレオチドを含む。ま
たHE8CH90ポリヌクレオチドは、配列番号:1に
含まれるヌクレオチド配列に対して十分な同一性を有
し、増幅に使用可能であるかまたはプローブもしくはマ
ーカーとして使用される条件下でハイブリダイゼーショ
ンするに十分な同一性を有するヌクレオチド配列でもあ
る。また本発明は、かかるHE8CH90ポリヌクレオ
チドに対して相補的なポリヌクレオチドも提供する。ヒ
ト・HE8CH90をコードしているcDNAの配列決
定の結果により示されるように、本発明HE8CH90
は、G蛋白結合受容体の他の蛋白に構造的に関連してい
る。そのcDNA配列は、351個のアミノ酸残基の蛋
白をコードしている読み枠を含み、推定分子量39.0
8kDaである。図1のHE8CH90(配列番号:
2)は、EDG2受容体(Zondag et al,AC#Y09
479、未公表,1996年)に対して314個のアミ
ノ酸残基において約56.4%の同一性を有する(FA
STAを用いた場合)。さらにそのうえ、HE8CH9
0(配列番号:2)は、REC1受容体(AC#U48
235,Premont et al,未公表,1996年)に対して
307個のアミノ酸残基において58%の同一性を有す
る。さらにそのうえ、HE8CH90(配列番号:2)
は、ヒト・EDG1様受容体(AC#P21453,Ma
ciag,T.et al,J.Biol.Chem.265:9308-9313,1990)に対
して35.1%の同一性を有する。図1のHE8CH9
0遺伝子(配列番号:1)は、Mus Musculusのリゾホス
ファチジン酸受容体V2g−1(AC#U70622,
Hecht J.H.et al,J.Cell Biol.135(4),1071-1083,199
6)に対して778個のヌクレオチド残基において約6
3.24%の同一性がある(BLASTを用いた場
合)。さらにそのうえ、HE8CH90(配列番号:
1)は、マウスの推定上のG蛋白結合受容体RECL
(AC#U48235,Macrae,A.D.et al,未公表)に
対して778個のヌクレオチド塩基残基において63.
11%の同一性がある。さらにそのうえ、HE8CH9
0(配列番号:1)は、ヒト・EDG2様受容体(AC
#U78192,Zondag et al,未公表,1996)に
対して778個のヌクレオチド塩基残基において60.
93%の同一性がある。
【0019】標準的クローニングおよびスクリーニング
を用い、ヒト胎児の脳またはヒトの8週の全胚の細胞中
のmRNA由来のcDNAライブラリーから、発現配列
タグ(EST)分析(Adams,M.D.,et al.Science(1991)
252:1651-1656;Adams,M.D.etal.,Nature(1992)355:632-
634;Adams,M.D.,et al.,Nature(1995)377 Supp:3-174)
を用いて、HE8CH90をコードしている本発明の1
のポリヌクレオチドを得てもよい。ゲノムDNAライブ
ラリーのごとき天然起源から本発明ポリヌクレオチドを
得ることもでき、あるいはよく知られ市販されている方
法を用いて合成することもできる。
を用い、ヒト胎児の脳またはヒトの8週の全胚の細胞中
のmRNA由来のcDNAライブラリーから、発現配列
タグ(EST)分析(Adams,M.D.,et al.Science(1991)
252:1651-1656;Adams,M.D.etal.,Nature(1992)355:632-
634;Adams,M.D.,et al.,Nature(1995)377 Supp:3-174)
を用いて、HE8CH90をコードしている本発明の1
のポリヌクレオチドを得てもよい。ゲノムDNAライブ
ラリーのごとき天然起源から本発明ポリヌクレオチドを
得ることもでき、あるいはよく知られ市販されている方
法を用いて合成することもできる。
【0020】よって、配列番号:2のHE8CH90ポ
リペプチドをコードしているヌクレオチド配列は図1の
コーディング配列(配列番号:1)に対して全長にわた
って同一であってもよく、あるいは配列番号:2のポリ
ペプチドをコードしている好ましくはヌクレオチド配列
の縮重形態であってもよく、あるいは配列番号:2のポ
リペプチドをコードしているヌクレオチド配列に対して
非常に高い同一性を有するものであってもよい。好まし
くは、本発明ポリペプチドは、HE8CH90ポリペプ
チドをコードしているヌクレオチド配列に対して高い同
一性、少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド
配列、あるいは図1(配列番号:1)に示すヌクレオチ
ド配列に対して少なくとも80%の同一性を有するヌク
レオチド配列、あるいは配列番号:2のポリペプチドを
コードしているヌクレオチド配列に対して少なくとも8
0%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
リペプチドをコードしているヌクレオチド配列は図1の
コーディング配列(配列番号:1)に対して全長にわた
って同一であってもよく、あるいは配列番号:2のポリ
ペプチドをコードしている好ましくはヌクレオチド配列
の縮重形態であってもよく、あるいは配列番号:2のポ
リペプチドをコードしているヌクレオチド配列に対して
非常に高い同一性を有するものであってもよい。好まし
くは、本発明ポリペプチドは、HE8CH90ポリペプ
チドをコードしているヌクレオチド配列に対して高い同
一性、少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド
配列、あるいは図1(配列番号:1)に示すヌクレオチ
ド配列に対して少なくとも80%の同一性を有するヌク
レオチド配列、あるいは配列番号:2のポリペプチドを
コードしているヌクレオチド配列に対して少なくとも8
0%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【0021】本発明ポリヌクレオチドをHE8CH90
ポリペプチドの組み換え生産に用いる場合、ポリヌクレ
オチドはそれ自体、成熟ポリペプチドまたはそのフラグ
メントのコーディング配列を含むものであってもよく;
あるいは他のコーディング配列を伴った読み枠中の成熟
ポリペプチドまたはフラグメントのコーディング配列を
含むものであってもよい。他のコーディング配列として
は、例えば、リーダーまたは分泌配列、プレ、プロ、プ
レプロ蛋白配列をコードするコーディング配列、または
他の融合ペプチド部分が挙げられる。例えば、融合ポリ
ペプチドの精製を促すマーカー配列をコードしていても
よい。本発明のある好ましい態様において、マーカー配
列は、pQEベクター(Qiagen,Inc.)に提供されるよ
うなヘキサ−ヒスチジンペプチド(Gentzら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.,USA,86:821-824(1989)に記載される)
またはHAタグ(Wilsonら、Cell,37:767(1984))で
ある。本発明のポリヌクレオチドはまた、構造遺伝子お
よび遺伝子発現を調節する天然の配列をも含むが、これ
らに限定するものではない。ポリヌクレオチドは、例え
ば、転写された非翻訳配列、終止シグナル、リボソーム
結合部位、mRNAを安定化する配列、イントロン、ポ
リアデニル化シグナル等の転写非翻訳配列、および付加
アミノ酸をコードする付加コーディング配列等の非コー
ディング5'および3'配列等の非コーディング配列をも
含有していてもよい。
ポリペプチドの組み換え生産に用いる場合、ポリヌクレ
オチドはそれ自体、成熟ポリペプチドまたはそのフラグ
メントのコーディング配列を含むものであってもよく;
あるいは他のコーディング配列を伴った読み枠中の成熟
ポリペプチドまたはフラグメントのコーディング配列を
含むものであってもよい。他のコーディング配列として
は、例えば、リーダーまたは分泌配列、プレ、プロ、プ
レプロ蛋白配列をコードするコーディング配列、または
他の融合ペプチド部分が挙げられる。例えば、融合ポリ
ペプチドの精製を促すマーカー配列をコードしていても
よい。本発明のある好ましい態様において、マーカー配
列は、pQEベクター(Qiagen,Inc.)に提供されるよ
うなヘキサ−ヒスチジンペプチド(Gentzら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.,USA,86:821-824(1989)に記載される)
またはHAタグ(Wilsonら、Cell,37:767(1984))で
ある。本発明のポリヌクレオチドはまた、構造遺伝子お
よび遺伝子発現を調節する天然の配列をも含むが、これ
らに限定するものではない。ポリヌクレオチドは、例え
ば、転写された非翻訳配列、終止シグナル、リボソーム
結合部位、mRNAを安定化する配列、イントロン、ポ
リアデニル化シグナル等の転写非翻訳配列、および付加
アミノ酸をコードする付加コーディング配列等の非コー
ディング5'および3'配列等の非コーディング配列をも
含有していてもよい。
【0022】本発明の特に好ましい具体例は、図1に示
すアミノ酸配列(配列番号:2)を有するHE8CH9
0ポリペプチドおよびその変種をコードしているポリヌ
クレオチドである。さらなる好ましい具体例は、図1の
HE8CH90のアミノ酸配列(配列番号:2)を有し
ているが、数個、5ないし10個、1ないし5個、1な
いし3個、1ないし2個または1個のアミノ酸残基がい
ずれかの組み合わせで置換、欠失または付加されている
HE8CH90変種をコードしているポリヌクレオチド
である。さらに本発明は、上記配列にハイブリダイゼー
ションするポリヌクレオチドにも関する。この点におい
て、本発明は、厳密な条件下で上記ポリヌクレオチドに
ハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドに特別に
関連する。本明細書の用語「厳密な条件」とは、配列間
に少なくとも95%、好ましくは少なくとも97%の同
一性がある場合にのみハイブリダイゼーションが起こる
ことを意味する。
すアミノ酸配列(配列番号:2)を有するHE8CH9
0ポリペプチドおよびその変種をコードしているポリヌ
クレオチドである。さらなる好ましい具体例は、図1の
HE8CH90のアミノ酸配列(配列番号:2)を有し
ているが、数個、5ないし10個、1ないし5個、1な
いし3個、1ないし2個または1個のアミノ酸残基がい
ずれかの組み合わせで置換、欠失または付加されている
HE8CH90変種をコードしているポリヌクレオチド
である。さらに本発明は、上記配列にハイブリダイゼー
ションするポリヌクレオチドにも関する。この点におい
て、本発明は、厳密な条件下で上記ポリヌクレオチドに
ハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドに特別に
関連する。本明細書の用語「厳密な条件」とは、配列間
に少なくとも95%、好ましくは少なくとも97%の同
一性がある場合にのみハイブリダイゼーションが起こる
ことを意味する。
【0023】配列番号:1に含まれるヌクレオチド配列
に対して十分に同一である本発明ポリヌクレオチドをc
DNAおよびゲノムDNA用のハイブリダイゼーション
プローブとして用いて全長のcDNAおよびHE8CH
90をコードしているゲノムクローンを単離し、またH
E8CH90遺伝子に対して高い類似性を有する配列を
有するcDNAおよび他の遺伝子のゲノムクローンを単
離してもよい。かかるハイブリダイゼーション法は当業
者に知られている。典型的には、これらのヌクレオチド
配列は、対照に対して70%、好ましくは80%、より
好ましくは90%の同一性を有する。一般的には、プロ
ーブは少なくとも15個のヌクレオチドを含む。好まし
くは、かかるプローブは少なくとも30個のヌクレオチ
ドを有し、少なくとも50個のヌクレオチドを有してい
てもよい。特に好ましいプローブは30ないし50個の
範囲のヌクレオチドを含む。1の具体例において、G蛋
白結合受容体をコードしているポリヌクレオチドを得る
ことは、配列番号:1またはそのフラグメント配列を有
する標識プローブを用いて厳密なハイブリダイゼーショ
ン条件下で適当なライブラリーをスクリーニングし、次
いで、該ポリヌクレオチド配列を有する全長のcDNA
およびゲノムクローンを単離する工程を含む。かかるハ
イブリダイゼーション法は当業者によく知られている。
厳密なハイブリダイゼーション条件は上で定義したもの
であるか、または50%ホルムアミド、5xSSC(1
50mM NaCl、15mMクエン酸三ナトリウ
ム)、50mM リン酸ナトリウム(pH7.6)、5
xデンハーツ溶液、10%デキストラン硫酸、および2
0マイクログラム/mlの変性剪断サケ・精子DNAを
含む溶液中、42℃で一晩、次いで、約65℃での0.
1xSSC中での洗浄といった条件であってもよい。本
発明ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、動物およ
びヒトの疾病の研究試薬ならびに治療および診断のため
の材料として用いてもよい。
に対して十分に同一である本発明ポリヌクレオチドをc
DNAおよびゲノムDNA用のハイブリダイゼーション
プローブとして用いて全長のcDNAおよびHE8CH
90をコードしているゲノムクローンを単離し、またH
E8CH90遺伝子に対して高い類似性を有する配列を
有するcDNAおよび他の遺伝子のゲノムクローンを単
離してもよい。かかるハイブリダイゼーション法は当業
者に知られている。典型的には、これらのヌクレオチド
配列は、対照に対して70%、好ましくは80%、より
好ましくは90%の同一性を有する。一般的には、プロ
ーブは少なくとも15個のヌクレオチドを含む。好まし
くは、かかるプローブは少なくとも30個のヌクレオチ
ドを有し、少なくとも50個のヌクレオチドを有してい
てもよい。特に好ましいプローブは30ないし50個の
範囲のヌクレオチドを含む。1の具体例において、G蛋
白結合受容体をコードしているポリヌクレオチドを得る
ことは、配列番号:1またはそのフラグメント配列を有
する標識プローブを用いて厳密なハイブリダイゼーショ
ン条件下で適当なライブラリーをスクリーニングし、次
いで、該ポリヌクレオチド配列を有する全長のcDNA
およびゲノムクローンを単離する工程を含む。かかるハ
イブリダイゼーション法は当業者によく知られている。
厳密なハイブリダイゼーション条件は上で定義したもの
であるか、または50%ホルムアミド、5xSSC(1
50mM NaCl、15mMクエン酸三ナトリウ
ム)、50mM リン酸ナトリウム(pH7.6)、5
xデンハーツ溶液、10%デキストラン硫酸、および2
0マイクログラム/mlの変性剪断サケ・精子DNAを
含む溶液中、42℃で一晩、次いで、約65℃での0.
1xSSC中での洗浄といった条件であってもよい。本
発明ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、動物およ
びヒトの疾病の研究試薬ならびに治療および診断のため
の材料として用いてもよい。
【0024】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、ポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌ
クレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝子
操作する宿主細胞および組換え技法による本発明のポリ
ペプチドの製造にも関する。無細胞翻訳系もまた、本発
明のDNA構築物に由来するRNAを用いて、このよう
な蛋白を製造できる。組換え体を製造するために、宿主
細胞を遺伝子操作して、発現系もしくはそれらの一部、
または本発明のポリヌクレオチドを組み込むことができ
る。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、例えば、
Davisら、Basic Methods in Molecular Biology(198
6);Sambrookら、Molecular Cloning;A Laboratory M
anual、第2版;コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバ
ー、ニューヨーク(1989)のように、多くの標準的な実
験マニュアルに記載される方法により行うことができ、
例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、DEA
E−デキストラン媒介トランスフェクション、トランス
ベクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質
媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、
トランスダクション、スクレープ負荷(scrapeloadin
g)、バリスティック導入(Ballistic introduction)
および感染等がある。
クレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝子
操作する宿主細胞および組換え技法による本発明のポリ
ペプチドの製造にも関する。無細胞翻訳系もまた、本発
明のDNA構築物に由来するRNAを用いて、このよう
な蛋白を製造できる。組換え体を製造するために、宿主
細胞を遺伝子操作して、発現系もしくはそれらの一部、
または本発明のポリヌクレオチドを組み込むことができ
る。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、例えば、
Davisら、Basic Methods in Molecular Biology(198
6);Sambrookら、Molecular Cloning;A Laboratory M
anual、第2版;コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバ
ー、ニューヨーク(1989)のように、多くの標準的な実
験マニュアルに記載される方法により行うことができ、
例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、DEA
E−デキストラン媒介トランスフェクション、トランス
ベクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質
媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、
トランスダクション、スクレープ負荷(scrapeloadin
g)、バリスティック導入(Ballistic introduction)
および感染等がある。
【0025】適当な宿主の代表的なものには、細菌細
胞、例えば連鎖球菌属(streptococci)、ブドウ球菌属
(staphylococci)、大腸菌(E.coli)、ストレプトミ
セスおよび枯草菌(Bacillus subtiis)細胞;真菌細胞
例えば酵母細胞およびアスペルギルス属(Aspergillu
s)細胞;昆虫細胞例えばショウジョウバエS2(Droso
phila S2)およびスポドプテラSf9(Spodoptera Sf
9)細胞;動物細胞例えばCHO、COS、HeLa、
C127、3T3、BHK、293およびボウズ(Bow
s)黒色腫細胞;ならびに植物細胞等がある。
胞、例えば連鎖球菌属(streptococci)、ブドウ球菌属
(staphylococci)、大腸菌(E.coli)、ストレプトミ
セスおよび枯草菌(Bacillus subtiis)細胞;真菌細胞
例えば酵母細胞およびアスペルギルス属(Aspergillu
s)細胞;昆虫細胞例えばショウジョウバエS2(Droso
phila S2)およびスポドプテラSf9(Spodoptera Sf
9)細胞;動物細胞例えばCHO、COS、HeLa、
C127、3T3、BHK、293およびボウズ(Bow
s)黒色腫細胞;ならびに植物細胞等がある。
【0026】本発明のポリペプチドを製造するために非
常に多くの発現系を使用できる。このようなベクターに
は、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクタ
ー、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由
来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エ
レメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキ
ュロウイルス、パポバウイルス、例えばSV40、ワク
シニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性
狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイルス由来
のベクター、ならびにそれらを組み合わせた物に由来す
るベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファー
ジ遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコスミド
およびファージミド等がある。発現系の構築物には発現
を制御および引き起こす調節領域を含有できる。一般的
には、宿主中にポリヌクレオチドを保持、伸長または発
現するのに、および/またはポリペプチドを発現するの
に適した任意の系またはベクターを、この点に関する発
現に使用できる。周知のおよび通常的な種々の任意の技
術により、適当なDNA配列を発現系に挿入でき、例え
ばSambrookら、Molecular Cloning,A Laboratory Manu
al(上述)に記載されている。
常に多くの発現系を使用できる。このようなベクターに
は、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクタ
ー、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由
来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エ
レメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキ
ュロウイルス、パポバウイルス、例えばSV40、ワク
シニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性
狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等のウイルス由来
のベクター、ならびにそれらを組み合わせた物に由来す
るベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファー
ジ遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコスミド
およびファージミド等がある。発現系の構築物には発現
を制御および引き起こす調節領域を含有できる。一般的
には、宿主中にポリヌクレオチドを保持、伸長または発
現するのに、および/またはポリペプチドを発現するの
に適した任意の系またはベクターを、この点に関する発
現に使用できる。周知のおよび通常的な種々の任意の技
術により、適当なDNA配列を発現系に挿入でき、例え
ばSambrookら、Molecular Cloning,A Laboratory Manu
al(上述)に記載されている。
【0027】翻訳蛋白を、小胞体内腔、ペリプラスミッ
クスペースまたは細胞外環境へ分泌させるために、適当
な分泌シグナルを発現するポリペプチドに組み込むこと
ができる。これらのシグナルはポリペプチドに本来的な
ものであってもく、あるいは異種性のシグナルでもよ
い。
クスペースまたは細胞外環境へ分泌させるために、適当
な分泌シグナルを発現するポリペプチドに組み込むこと
ができる。これらのシグナルはポリペプチドに本来的な
ものであってもく、あるいは異種性のシグナルでもよ
い。
【0028】HE8CH90ポリペプチドをスクリーニ
ングアッセイのために発現させる場合、一般的には、細
胞表面にポリペプチドを生産させるのが好ましい。この
場合、スクリーニングアッセイに使用する前に細胞を集
めてもよい。HE8CH90ポリペプチドを培地中でス
クリーニングする場合、培地を回収してポリペプチドを
回収し精製することができる。細胞内に生成される場
合、まず細胞を溶解し、次いで、ポリペプチドを回収し
なければならない。HE8CH90ポリペプチドは周知
の方法により、組換え細胞培養物から回収および精製で
き、その方法には例えば硫酸アンモニウムまたはエタノ
ール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマ
トグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、
疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグ
ラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー
およびレクチンクロマトグラフィー等がある。高速液体
クロマトグラフィー(「HPLC」)を精製に用いるの
が最も好ましい。ポリペプチドが単離および/または精
製中に変性した場合、再び活性な立体配座にするため
に、蛋白再生のための周知の技法を用いることができ
る。
ングアッセイのために発現させる場合、一般的には、細
胞表面にポリペプチドを生産させるのが好ましい。この
場合、スクリーニングアッセイに使用する前に細胞を集
めてもよい。HE8CH90ポリペプチドを培地中でス
クリーニングする場合、培地を回収してポリペプチドを
回収し精製することができる。細胞内に生成される場
合、まず細胞を溶解し、次いで、ポリペプチドを回収し
なければならない。HE8CH90ポリペプチドは周知
の方法により、組換え細胞培養物から回収および精製で
き、その方法には例えば硫酸アンモニウムまたはエタノ
ール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマ
トグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、
疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグ
ラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー
およびレクチンクロマトグラフィー等がある。高速液体
クロマトグラフィー(「HPLC」)を精製に用いるの
が最も好ましい。ポリペプチドが単離および/または精
製中に変性した場合、再び活性な立体配座にするため
に、蛋白再生のための周知の技法を用いることができ
る。
【0029】診断アッセイ 本発明はまた診断試薬としての本発明HE8CH90ポ
リヌクレオチドの使用にも関する。真核生物とりわけ哺
乳動物、特にヒトにおけるHE8CH90の検出は、疾
患の診断のための診断法を提供する。真核生物(本明細
書において「個体」とも称する)とりわけ哺乳動物、特
にヒトがHE8CH90遺伝子を含む生物に感染する
と、種々の方法によりDNAレベルで検出できる。診断
用の核酸は、感染した個体の細胞および組織、例えば
骨、血液、筋肉、軟骨および皮膚より得ることができ
る。ゲノムDNAは直接的に検出するのに使用できる
か、または分析の前にPCRもしくはその他の増幅法を
用いることにより酵素的に増幅できる。RNAまたはc
DNAもまた同じ方法で用いることができる。増幅法を
用いると、真核生物とりわけ哺乳動物、特にヒトに存在
する原核生物株を、原核生物遺伝子の遺伝子型の分析に
より特徴づけすることができる。対照配列の遺伝子型に
比較した増幅産物の大きさの変化により、欠損および挿
入を検出できる。点突然変異は、増幅DNAを標識化H
E8CH90ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズす
ることにより同定できる。完全に対合した配列はRNア
ーゼ消化により、または融解温度の差により、誤対合二
重らせんから区別できる。DNA配列の差はまた、変性
物質を伴うまたは伴わないゲル中のDNAフラグメント
の電気泳動の移動度の変化を検出することにより、また
は直接的なDNAの配列決定により検出できる。例えば
Meyers et.al.Science,230:1242(1985)参照。特
異的な位置での配列の変化はまた、ヌクレアーゼ保護ア
ッセイ例えばRNアーゼおよびS1保護または化学的切
断法によっても明らかにすることができる。例えばCo
tton et al.Proc.Natl.Aca
d.Sci.,USA,85:4397-4401(1985)参照。も
う1つの具体例において、IL−1raベータヌクレオ
チド配列由来のフラグメントを含むオリゴヌクレオチド
プローブのアレイ(array)を構築して、例えば遺伝学
的変異の有効なスクリーニングを行うことができる。ア
レイ法はよく知られており、広い適用範囲があり、遺伝
子発現、遺伝学的連関および遺伝学的変化を包含する分
子遺伝学における種々の問題を解明するためにこの方法
を用いることができる(例えば、M.Chee et al.,Scienc
e,Vol 274,pp 610-613(1996))。
リヌクレオチドの使用にも関する。真核生物とりわけ哺
乳動物、特にヒトにおけるHE8CH90の検出は、疾
患の診断のための診断法を提供する。真核生物(本明細
書において「個体」とも称する)とりわけ哺乳動物、特
にヒトがHE8CH90遺伝子を含む生物に感染する
と、種々の方法によりDNAレベルで検出できる。診断
用の核酸は、感染した個体の細胞および組織、例えば
骨、血液、筋肉、軟骨および皮膚より得ることができ
る。ゲノムDNAは直接的に検出するのに使用できる
か、または分析の前にPCRもしくはその他の増幅法を
用いることにより酵素的に増幅できる。RNAまたはc
DNAもまた同じ方法で用いることができる。増幅法を
用いると、真核生物とりわけ哺乳動物、特にヒトに存在
する原核生物株を、原核生物遺伝子の遺伝子型の分析に
より特徴づけすることができる。対照配列の遺伝子型に
比較した増幅産物の大きさの変化により、欠損および挿
入を検出できる。点突然変異は、増幅DNAを標識化H
E8CH90ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズす
ることにより同定できる。完全に対合した配列はRNア
ーゼ消化により、または融解温度の差により、誤対合二
重らせんから区別できる。DNA配列の差はまた、変性
物質を伴うまたは伴わないゲル中のDNAフラグメント
の電気泳動の移動度の変化を検出することにより、また
は直接的なDNAの配列決定により検出できる。例えば
Meyers et.al.Science,230:1242(1985)参照。特
異的な位置での配列の変化はまた、ヌクレアーゼ保護ア
ッセイ例えばRNアーゼおよびS1保護または化学的切
断法によっても明らかにすることができる。例えばCo
tton et al.Proc.Natl.Aca
d.Sci.,USA,85:4397-4401(1985)参照。も
う1つの具体例において、IL−1raベータヌクレオ
チド配列由来のフラグメントを含むオリゴヌクレオチド
プローブのアレイ(array)を構築して、例えば遺伝学
的変異の有効なスクリーニングを行うことができる。ア
レイ法はよく知られており、広い適用範囲があり、遺伝
子発現、遺伝学的連関および遺伝学的変化を包含する分
子遺伝学における種々の問題を解明するためにこの方法
を用いることができる(例えば、M.Chee et al.,Scienc
e,Vol 274,pp 610-613(1996))。
【0030】診断アッセイは、本明細書記載の方法によ
りHE8CH90遺伝子の変異を検出することにより、
細菌、真菌、原生動物およびウイルス感染のごとき感染
症、詳細にはHIV−1またはHIV−2による感染;
痛み;癌;拒食症;大食症;喘息;パーキンソン病;急
性心臓疾患;低血圧;高血圧;尿閉;骨粗鬆症;狭心
症;心筋梗塞;潰瘍;アレルギー;良性前立腺肥大;な
らびに不安症、分裂病、躁鬱病、せん妄、痴呆、重度の
精神遅滞および運動障害(例えば、Huntington病または
Gilles dela Toutrett症候群)を包含する精神病および
神経学的疾病に対する感受性の診断または決定方法を提
供する。
りHE8CH90遺伝子の変異を検出することにより、
細菌、真菌、原生動物およびウイルス感染のごとき感染
症、詳細にはHIV−1またはHIV−2による感染;
痛み;癌;拒食症;大食症;喘息;パーキンソン病;急
性心臓疾患;低血圧;高血圧;尿閉;骨粗鬆症;狭心
症;心筋梗塞;潰瘍;アレルギー;良性前立腺肥大;な
らびに不安症、分裂病、躁鬱病、せん妄、痴呆、重度の
精神遅滞および運動障害(例えば、Huntington病または
Gilles dela Toutrett症候群)を包含する精神病および
神経学的疾病に対する感受性の診断または決定方法を提
供する。
【0031】さらに、対象由来の試料の異常に上昇また
は低下したHE8CH90ポリペプチドまたはHE8C
H90 mRNAレベルを調べることを特徴とする方法
によって、細菌、真菌、原生動物およびウイルス感染の
ごとき感染症、詳細にはHIV−1またはHIV−2に
よる感染;痛み;癌;拒食症;大食症;喘息;パーキン
ソン病;急性心臓疾患;低血圧;高血圧;尿閉;骨粗鬆
症;狭心症;心筋梗塞;潰瘍;アレルギー;良性前立腺
肥大;ならびに不安症、分裂病、躁鬱病、せん妄、痴
呆、重度の精神遅滞および運動障害(例えば、Huntingt
on病またはGillesdela Toutrett症候群)を包含する精
神病および神経学的疾病を診断することができる。HE
8CH90ポリヌクレオチドの発現の増加または低下
は、ポリヌクレオチドの定量法として当該分野で周知の
方法の任意の方法、例えば増幅、PCR、RTPCR、
RNアーゼ保護、ノーザンブロッティングおよびその他
のハイブリダイゼーション法を用いて測定できる。宿主
由来のサンプル中のHE8CH90蛋白のレベルを決定
するために用いることができるアッセイ法は、当業者に
周知である。このようなアッセイ法には、ラジオイムノ
アッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析
およびELISAアッセイ等がある。
は低下したHE8CH90ポリペプチドまたはHE8C
H90 mRNAレベルを調べることを特徴とする方法
によって、細菌、真菌、原生動物およびウイルス感染の
ごとき感染症、詳細にはHIV−1またはHIV−2に
よる感染;痛み;癌;拒食症;大食症;喘息;パーキン
ソン病;急性心臓疾患;低血圧;高血圧;尿閉;骨粗鬆
症;狭心症;心筋梗塞;潰瘍;アレルギー;良性前立腺
肥大;ならびに不安症、分裂病、躁鬱病、せん妄、痴
呆、重度の精神遅滞および運動障害(例えば、Huntingt
on病またはGillesdela Toutrett症候群)を包含する精
神病および神経学的疾病を診断することができる。HE
8CH90ポリヌクレオチドの発現の増加または低下
は、ポリヌクレオチドの定量法として当該分野で周知の
方法の任意の方法、例えば増幅、PCR、RTPCR、
RNアーゼ保護、ノーザンブロッティングおよびその他
のハイブリダイゼーション法を用いて測定できる。宿主
由来のサンプル中のHE8CH90蛋白のレベルを決定
するために用いることができるアッセイ法は、当業者に
周知である。このようなアッセイ法には、ラジオイムノ
アッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析
およびELISAアッセイ等がある。
【0032】染色体アッセイ 本発明ヌクレオチド配列は染色体の同定にも価値があ
る。該配列は、個々のヒト・染色体上の特定の位置を標
的とし、これにハイブリダイゼーションしうる。本発明
による重要な部分の染色体へのマッピングは、それらの
配列を遺伝子関連疾病と関連づける重要な第1工程であ
る。配列を正確な染色体位置にマッピングしたならば、
染色体上の配列の物理的位置を遺伝学的地図のデータと
関連づけることができる。かかるデータは、例えば、V.
McKusick,Mendelian Inheritance in Man(Johns Hopki
ns University Weich Medical Libraryからオンライン
で利用できる)に見いだされる。次いで、連関(物理的
に近接した遺伝子の同時遺伝)の分析により、同じ染色
体領域にマッピングされた遺伝子と疾病との関係を同定
する。罹病個体と未罹病個体との間のcDNAまたはゲ
ノム配列の相違も調べることができる。罹病個体のいく
つかまたは全部において変異が観察されるが正常個体に
おいては観察されない場合、その変異は疾病の原因であ
る可能性がある。
る。該配列は、個々のヒト・染色体上の特定の位置を標
的とし、これにハイブリダイゼーションしうる。本発明
による重要な部分の染色体へのマッピングは、それらの
配列を遺伝子関連疾病と関連づける重要な第1工程であ
る。配列を正確な染色体位置にマッピングしたならば、
染色体上の配列の物理的位置を遺伝学的地図のデータと
関連づけることができる。かかるデータは、例えば、V.
McKusick,Mendelian Inheritance in Man(Johns Hopki
ns University Weich Medical Libraryからオンライン
で利用できる)に見いだされる。次いで、連関(物理的
に近接した遺伝子の同時遺伝)の分析により、同じ染色
体領域にマッピングされた遺伝子と疾病との関係を同定
する。罹病個体と未罹病個体との間のcDNAまたはゲ
ノム配列の相違も調べることができる。罹病個体のいく
つかまたは全部において変異が観察されるが正常個体に
おいては観察されない場合、その変異は疾病の原因であ
る可能性がある。
【0033】抗体 本発明のポリペプチドもしくはそれらの変種、またはそ
れらを発現する細胞は、このようなポリペプチドに免疫
特異的な抗体を産生する免疫原として用いることができ
る。本明細書で用いる「抗体」には、モノクローナルお
よびポリクローナル抗体、キメラ、一本鎖、サル化抗体
およびヒト化抗体、ならびにFab免疫グロブリン発現
ライブラリーの産物等のFabフラグメント等がある。
本発明のポリペプチドに対して生じる抗体は、ポリペプ
チドまたはエピトープが付いたフラグメント、アナログ
または細胞を、好ましくはヒトはでない動物に、通常の
実験法を用いて投与することにより得ることができる。
連続的細胞系培養により産生される抗体を提供する、当
業者周知の技術を用いて、モノクローナル抗体を調製す
ることができる。実例としては、Kohler,G. and Milste
in,C.,Nature,256:495-497(1975);Kozbor et al.I
mmunology Today,4:72(1983);Cole et al.Monoclon
al Antibodies and Cancer Therapy,Alan R Liss,Inc.,
77-96頁(1985)に記載されるような種々の技法があ
る。
れらを発現する細胞は、このようなポリペプチドに免疫
特異的な抗体を産生する免疫原として用いることができ
る。本明細書で用いる「抗体」には、モノクローナルお
よびポリクローナル抗体、キメラ、一本鎖、サル化抗体
およびヒト化抗体、ならびにFab免疫グロブリン発現
ライブラリーの産物等のFabフラグメント等がある。
本発明のポリペプチドに対して生じる抗体は、ポリペプ
チドまたはエピトープが付いたフラグメント、アナログ
または細胞を、好ましくはヒトはでない動物に、通常の
実験法を用いて投与することにより得ることができる。
連続的細胞系培養により産生される抗体を提供する、当
業者周知の技術を用いて、モノクローナル抗体を調製す
ることができる。実例としては、Kohler,G. and Milste
in,C.,Nature,256:495-497(1975);Kozbor et al.I
mmunology Today,4:72(1983);Cole et al.Monoclon
al Antibodies and Cancer Therapy,Alan R Liss,Inc.,
77-96頁(1985)に記載されるような種々の技法があ
る。
【0034】一本鎖抗体の産生のために記載された技術
(米国特許第4946778号)は、本発明のポリペプ
チドに対する一本鎖抗体を産生するのに適用できる。ま
た、トランスジェニックマウスまたはその他の生物、例
えばその他の哺乳動物は、ヒト化抗体等の抗体を発現す
るのに用いることができる。上記抗体を用いて、ポリペ
プチドを発現するクローンを単離または同定してもよ
く、あるいはアフィニティークロマトグラフィーにより
ポリペプチドを精製してもよい。
(米国特許第4946778号)は、本発明のポリペプ
チドに対する一本鎖抗体を産生するのに適用できる。ま
た、トランスジェニックマウスまたはその他の生物、例
えばその他の哺乳動物は、ヒト化抗体等の抗体を発現す
るのに用いることができる。上記抗体を用いて、ポリペ
プチドを発現するクローンを単離または同定してもよ
く、あるいはアフィニティークロマトグラフィーにより
ポリペプチドを精製してもよい。
【0035】HE8CH90ポリペプチドに対する抗体
を用いて、細菌、真菌、原生動物およびウイルス感染の
ごとき感染症、詳細にはHIV−1またはHIV−2に
よる感染;痛み;癌;拒食症;大食症;喘息;パーキン
ソン病;急性心臓疾患;低血圧;高血圧;尿閉;骨粗鬆
症;狭心症;心筋梗塞;潰瘍;アレルギー;良性前立腺
肥大;ならびに不安症、分裂病、躁鬱病、せん妄、痴
呆、重度の精神遅滞および運動障害(例えば、Huntingt
on病またはGilles dela Toutrett症候群)を包含する精
神病および神経学的疾病を治療してもよい。
を用いて、細菌、真菌、原生動物およびウイルス感染の
ごとき感染症、詳細にはHIV−1またはHIV−2に
よる感染;痛み;癌;拒食症;大食症;喘息;パーキン
ソン病;急性心臓疾患;低血圧;高血圧;尿閉;骨粗鬆
症;狭心症;心筋梗塞;潰瘍;アレルギー;良性前立腺
肥大;ならびに不安症、分裂病、躁鬱病、せん妄、痴
呆、重度の精神遅滞および運動障害(例えば、Huntingt
on病またはGilles dela Toutrett症候群)を包含する精
神病および神経学的疾病を治療してもよい。
【0036】ワクチン 本発明の別の態様は、哺乳動物における免疫学的反応を
誘起する方法に関し、該方法は、抗体および/またはT
細胞を産生させるに十分なHE8CH90またはそれら
のフラグメントを哺乳動物に接種して、細菌、真菌、原
生動物およびウイルス感染のごとき感染症、詳細にはH
IV−1またはHIV−2による感染;痛み;癌;拒食
症;大食症;喘息;パーキンソン病;急性心臓疾患;低
血圧;高血圧;尿閉;骨粗鬆症;狭心症;心筋梗塞;潰
瘍;アレルギー;良性前立腺肥大;ならびに不安症、分
裂病、躁鬱病、せん妄、痴呆、重度の精神遅滞および運
動障害(例えば、Huntington病またはGilles dela Tout
rett症候群)を包含する精神病および神経学的疾病から
該動物を防御することを特徴とする。本発明のもう1つ
の態様は、哺乳動物における免疫学的応答を誘導する方
法に関し、該方法は、HE8CH90ポリペプチドまた
はそのフラグメントもしくは変種を発現させるための核
酸ベクターを送達し、インビボでHE8CH90ポリペ
プチドを発現させて、該動物を疾患から保護する抗体を
生じる、かかる免疫学的応答を誘導することを特徴とす
る。
誘起する方法に関し、該方法は、抗体および/またはT
細胞を産生させるに十分なHE8CH90またはそれら
のフラグメントを哺乳動物に接種して、細菌、真菌、原
生動物およびウイルス感染のごとき感染症、詳細にはH
IV−1またはHIV−2による感染;痛み;癌;拒食
症;大食症;喘息;パーキンソン病;急性心臓疾患;低
血圧;高血圧;尿閉;骨粗鬆症;狭心症;心筋梗塞;潰
瘍;アレルギー;良性前立腺肥大;ならびに不安症、分
裂病、躁鬱病、せん妄、痴呆、重度の精神遅滞および運
動障害(例えば、Huntington病またはGilles dela Tout
rett症候群)を包含する精神病および神経学的疾病から
該動物を防御することを特徴とする。本発明のもう1つ
の態様は、哺乳動物における免疫学的応答を誘導する方
法に関し、該方法は、HE8CH90ポリペプチドまた
はそのフラグメントもしくは変種を発現させるための核
酸ベクターを送達し、インビボでHE8CH90ポリペ
プチドを発現させて、該動物を疾患から保護する抗体を
生じる、かかる免疫学的応答を誘導することを特徴とす
る。
【0037】本発明のさらなる態様は免疫学的ワクチン
処方(組成物)に関し、それは、哺乳動物宿主中に導入
された場合、HE8CH90ポリペプチドに対する哺乳
動物の免疫学的応答を誘導する。該組成物はHE8CH
90ポリペプチドまたはHE8CH90遺伝子を含んで
なる。ワクチン処方は、さらに適当な担体を含んでいて
もよい。HE8CH90ポリペプチドは胃で分解される
可能性があるので、好ましくは非経口投与する(皮下、
筋肉内、静脈、皮内等への注射を包含)。非経口投与に
適した処方は、抗酸化剤、バッファー、静細菌剤および
処方をレシピエントの血液と等張にする溶質を含んでい
てもよい水性または非水性滅菌注射用溶液;ならびに懸
濁剤または増粘剤を含んでいてもよい水性または非水性
滅菌懸濁液を包含する。処方を1回量または複数回とし
て容器に入れて提供してもよく、例えば、密封アンプル
およびバイアルに入れて提供してもよく、また使用直前
に滅菌液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥状態と
して保存してもよい。またワクチン処方は、水中油系お
よび当該分野で知られた他の系のごとき処方の免疫原性
を高めるためのアジュバント系を含んでいてもよい。用
量は、個々のワクチンの活性に左右され、通常の実験に
より容易に決定することができる。
処方(組成物)に関し、それは、哺乳動物宿主中に導入
された場合、HE8CH90ポリペプチドに対する哺乳
動物の免疫学的応答を誘導する。該組成物はHE8CH
90ポリペプチドまたはHE8CH90遺伝子を含んで
なる。ワクチン処方は、さらに適当な担体を含んでいて
もよい。HE8CH90ポリペプチドは胃で分解される
可能性があるので、好ましくは非経口投与する(皮下、
筋肉内、静脈、皮内等への注射を包含)。非経口投与に
適した処方は、抗酸化剤、バッファー、静細菌剤および
処方をレシピエントの血液と等張にする溶質を含んでい
てもよい水性または非水性滅菌注射用溶液;ならびに懸
濁剤または増粘剤を含んでいてもよい水性または非水性
滅菌懸濁液を包含する。処方を1回量または複数回とし
て容器に入れて提供してもよく、例えば、密封アンプル
およびバイアルに入れて提供してもよく、また使用直前
に滅菌液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥状態と
して保存してもよい。またワクチン処方は、水中油系お
よび当該分野で知られた他の系のごとき処方の免疫原性
を高めるためのアジュバント系を含んでいてもよい。用
量は、個々のワクチンの活性に左右され、通常の実験に
より容易に決定することができる。
【0038】スクリーニングアッセイ 本発明受容体ポリペプチドに結合してこれを活性化(ア
ゴニスト)または阻害(アンタゴニスト)する化合物の
スクリーニングプロセスにおいて本発明HE8CH90
を用いてもよい。よって、本発明ポリペプチドを用い
て、小型分子基質およびリガンド、例えば細胞、無細胞
調製物、化学ライブラリーおよび天然産物混合物の結合
を評価してもよい。これらの基質およびリガンドは天然
の基質およびリガンドであってもよく、あるいは構造ま
たは機能を模倣したものであってもよい。Coligan et a
l.,Current Protocols in Immunology 1(2):Chapter5(1
991)参照。
ゴニスト)または阻害(アンタゴニスト)する化合物の
スクリーニングプロセスにおいて本発明HE8CH90
を用いてもよい。よって、本発明ポリペプチドを用い
て、小型分子基質およびリガンド、例えば細胞、無細胞
調製物、化学ライブラリーおよび天然産物混合物の結合
を評価してもよい。これらの基質およびリガンドは天然
の基質およびリガンドであってもよく、あるいは構造ま
たは機能を模倣したものであってもよい。Coligan et a
l.,Current Protocols in Immunology 1(2):Chapter5(1
991)参照。
【0039】HE8CH90蛋白は哺乳動物宿主に広く
存在し、多くの生物学的機能に関与しており、多くの病
気にもかかわっている。したがって、HE8CH90を
刺激する化合物および薬剤、あるいはまたHE8CH9
0を阻害しうる化合物または薬剤を見いだすことが望ま
れる。一般的には、細菌、真菌、原生動物およびウイル
ス感染のごとき感染症、詳細にはHIV−1またはHI
V−2による感染;痛み;癌;拒食症;大食症;喘息;
パーキンソン病;急性心臓疾患;低血圧;高血圧;尿
閉;骨粗鬆症;狭心症;心筋梗塞;潰瘍;アレルギー;
良性前立腺肥大;ならびに不安症、分裂病、躁鬱病、せ
ん妄、痴呆、重度の精神遅滞および運動障害(例えば、
Huntington病またはGilles dela Toutrett症候群)を包
含する精神病および神経学的疾病のごとき状態を治療ま
たは予防するためにアゴニストが用いられる。細菌、真
菌、原生動物およびウイルス感染のごとき感染症、詳細
にはHIV−1またはHIV−2による感染;痛み;
癌;拒食症;大食症;喘息;パーキンソン病;急性心臓
疾患;低血圧;高血圧;尿閉;骨粗鬆症;狭心症;心筋
梗塞;潰瘍;アレルギー;良性前立腺肥大;ならびに不
安症、分裂病、躁鬱病、せん妄、痴呆、重度の精神遅滞
および運動障害(例えば、Huntington病またはGilles d
ela Toutrett症候群)を包含する精神病および神経学的
疾病のごとき状態の種々の治療または予防のためのアン
タゴニストを用いてもよい。
存在し、多くの生物学的機能に関与しており、多くの病
気にもかかわっている。したがって、HE8CH90を
刺激する化合物および薬剤、あるいはまたHE8CH9
0を阻害しうる化合物または薬剤を見いだすことが望ま
れる。一般的には、細菌、真菌、原生動物およびウイル
ス感染のごとき感染症、詳細にはHIV−1またはHI
V−2による感染;痛み;癌;拒食症;大食症;喘息;
パーキンソン病;急性心臓疾患;低血圧;高血圧;尿
閉;骨粗鬆症;狭心症;心筋梗塞;潰瘍;アレルギー;
良性前立腺肥大;ならびに不安症、分裂病、躁鬱病、せ
ん妄、痴呆、重度の精神遅滞および運動障害(例えば、
Huntington病またはGilles dela Toutrett症候群)を包
含する精神病および神経学的疾病のごとき状態を治療ま
たは予防するためにアゴニストが用いられる。細菌、真
菌、原生動物およびウイルス感染のごとき感染症、詳細
にはHIV−1またはHIV−2による感染;痛み;
癌;拒食症;大食症;喘息;パーキンソン病;急性心臓
疾患;低血圧;高血圧;尿閉;骨粗鬆症;狭心症;心筋
梗塞;潰瘍;アレルギー;良性前立腺肥大;ならびに不
安症、分裂病、躁鬱病、せん妄、痴呆、重度の精神遅滞
および運動障害(例えば、Huntington病またはGilles d
ela Toutrett症候群)を包含する精神病および神経学的
疾病のごとき状態の種々の治療または予防のためのアン
タゴニストを用いてもよい。
【0040】一般的には、かかるスクリーニング手順
は、細胞表面に本発明受容体ポリペプチドを発現する適
当な細胞を製造することを含む。かかる細胞は、哺乳動
物由来の細胞、酵母、ショウジョウバエ(Drosophila)
または大腸菌(E.coli)を包含する。次いで、受容体発
現細胞(または発現された受容体を含む細胞膜)を試験
化合物と接触させて、結合または機能的応答の刺激もし
くは阻害を観察する。
は、細胞表面に本発明受容体ポリペプチドを発現する適
当な細胞を製造することを含む。かかる細胞は、哺乳動
物由来の細胞、酵母、ショウジョウバエ(Drosophila)
または大腸菌(E.coli)を包含する。次いで、受容体発
現細胞(または発現された受容体を含む細胞膜)を試験
化合物と接触させて、結合または機能的応答の刺激もし
くは阻害を観察する。
【0041】1のスクリーニング方法は、本発明受容体
を発現する細胞(例えば、トランスフェクションされた
CHO細胞)を使用し、系において受容体活性化により
引き起こされる細胞外pHまたは細胞内カルシウム変化
を測定することを用いる。この方法において、本発明受
容体ポリペプチドを発現する細胞に化合物を接触させて
もよい。次いで、2次的メッセンジャー応答、例えば、
シグナル伝達、pH変化、またはカルシウムレベル変化
を測定して候補化合物が受容体を活性化または阻害する
かどうかを決定する。
を発現する細胞(例えば、トランスフェクションされた
CHO細胞)を使用し、系において受容体活性化により
引き起こされる細胞外pHまたは細胞内カルシウム変化
を測定することを用いる。この方法において、本発明受
容体ポリペプチドを発現する細胞に化合物を接触させて
もよい。次いで、2次的メッセンジャー応答、例えば、
シグナル伝達、pH変化、またはカルシウムレベル変化
を測定して候補化合物が受容体を活性化または阻害する
かどうかを決定する。
【0042】もう1つの方法は、受容体により伝達され
るcAMPおよび/またはアデニレートシクラーゼ蓄積
の阻害または刺激を調べることにより受容体阻害剤をス
クリーニングすることを包含する。かかる方法は、本発
明受容体で真核細胞をトランスフェクションして細胞表
面に受容体を発現させることを用いる。次いで、本発明
受容体存在下において細胞を候補アンタゴニストと接触
させる。次いで、cAMP蓄積量を測定する。候補アン
タゴニストが受容体に結合し、受容体結合を阻害する場
合には、受容体により伝達されるcAMPのレベルまた
はアデニレートシクラーゼ活性が低下または上昇するで
あろう。
るcAMPおよび/またはアデニレートシクラーゼ蓄積
の阻害または刺激を調べることにより受容体阻害剤をス
クリーニングすることを包含する。かかる方法は、本発
明受容体で真核細胞をトランスフェクションして細胞表
面に受容体を発現させることを用いる。次いで、本発明
受容体存在下において細胞を候補アンタゴニストと接触
させる。次いで、cAMP蓄積量を測定する。候補アン
タゴニストが受容体に結合し、受容体結合を阻害する場
合には、受容体により伝達されるcAMPのレベルまた
はアデニレートシクラーゼ活性が低下または上昇するで
あろう。
【0043】本発明受容体のアゴニストまたはアンタゴ
ニストを検出するためのもう1つの方法は、米国特許第
5482835号記載の酵母による方法である。そのア
ッセイは候補化合物の結合を試験するだけでよく、候補
化合物に直接的または間接的に結合した標識を用いるこ
とにより、あるいは標識競争物質との競争を用いるアッ
セイにより、受容体を有する細胞への付着を検出する。
さらに、これらのアッセイにおいて、受容体を表面に有
する細胞に適する検出系を用いて、受容体活性化により
発生するシグナルを候補化合物が生じるかどうかを試験
してもよい。一般的には、既知アゴニスト存在下におい
て活性化阻害剤をアッセイし、アゴニストによる活性化
に対する候補化合物の存在の影響を観察する。かかるス
クリーニングアッセイを行うための標準的方法は当該分
野においてよく理解されている。潜在的なHE8CH9
0アンタゴニストの例は、抗体、あるいはいくつかの場
合にはオリゴヌクレオチドまたはHE8CH90のリガ
ンドに密接に関連した蛋白(例えば、リガンドのフラグ
メント、または受容体に結合するが応答を誘発せず、そ
の結果受容体活性を保持する小型分子)を包含する。
ニストを検出するためのもう1つの方法は、米国特許第
5482835号記載の酵母による方法である。そのア
ッセイは候補化合物の結合を試験するだけでよく、候補
化合物に直接的または間接的に結合した標識を用いるこ
とにより、あるいは標識競争物質との競争を用いるアッ
セイにより、受容体を有する細胞への付着を検出する。
さらに、これらのアッセイにおいて、受容体を表面に有
する細胞に適する検出系を用いて、受容体活性化により
発生するシグナルを候補化合物が生じるかどうかを試験
してもよい。一般的には、既知アゴニスト存在下におい
て活性化阻害剤をアッセイし、アゴニストによる活性化
に対する候補化合物の存在の影響を観察する。かかるス
クリーニングアッセイを行うための標準的方法は当該分
野においてよく理解されている。潜在的なHE8CH9
0アンタゴニストの例は、抗体、あるいはいくつかの場
合にはオリゴヌクレオチドまたはHE8CH90のリガ
ンドに密接に関連した蛋白(例えば、リガンドのフラグ
メント、または受容体に結合するが応答を誘発せず、そ
の結果受容体活性を保持する小型分子)を包含する。
【0044】予防および治療方法 本発明は、過剰または不十分な量のHE8CH90活性
に関連する異常な状態の処置方法を提供する。HE8C
H90活性が過剰な場合、いくつかの方法を用いること
ができる。1の方法は、有効量の上記阻害剤化合物(ア
ンタゴニスト)を医薬上許容される担体とともに対象に
投与して、HE8CH90へのリガンドの結合をブロッ
クすることあるいは第2のシグナルを阻害することによ
り活性化を阻害し、そのことにより異常な状態を改善す
ることを特徴とする。
に関連する異常な状態の処置方法を提供する。HE8C
H90活性が過剰な場合、いくつかの方法を用いること
ができる。1の方法は、有効量の上記阻害剤化合物(ア
ンタゴニスト)を医薬上許容される担体とともに対象に
投与して、HE8CH90へのリガンドの結合をブロッ
クすることあるいは第2のシグナルを阻害することによ
り活性化を阻害し、そのことにより異常な状態を改善す
ることを特徴とする。
【0045】もう1つのアプローチにおいて、内在性H
E8CH90と競争してリガンドに結合する能力をやは
り有している可溶性形態のHE8CH90ポリペプチド
を投与してもよい。かかる競争物質の典型的な具体例は
HE8CH90ポリペプチドのフラグメントを含む。
E8CH90と競争してリガンドに結合する能力をやは
り有している可溶性形態のHE8CH90ポリペプチド
を投与してもよい。かかる競争物質の典型的な具体例は
HE8CH90ポリペプチドのフラグメントを含む。
【0046】さらにもう1つの方法において、発現ブロ
ック法を用いて内在性HE8CH90をコードしている
遺伝子の発現を阻害してもよい。知られているかかる方
法には、細胞内で生成した、あるいは別個に投与された
アンチセンス配列を用いる。例えば、Oligodeoxynucleo
tides as Antisense Inhibitors of Gene Expression,C
RC Press,Boca Raton, FL(1988)中、O'Coccor,J.Neuroc
hem(1991)56:560を参照のこと。別法として、遺伝子と
ともに三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを提供
してもよい。例えば、Lee et al.,Nucleic Acids Res(1
979)6:3073;Cooney et al.,Science(1988)241:456;Derv
an et al.,Science(1991)251:1360参照。これらのオリ
ゴヌクレオチドはそれ自体投与することができ、あるい
は重要部分のオリゴマーをインビボで発現させることも
できる。
ック法を用いて内在性HE8CH90をコードしている
遺伝子の発現を阻害してもよい。知られているかかる方
法には、細胞内で生成した、あるいは別個に投与された
アンチセンス配列を用いる。例えば、Oligodeoxynucleo
tides as Antisense Inhibitors of Gene Expression,C
RC Press,Boca Raton, FL(1988)中、O'Coccor,J.Neuroc
hem(1991)56:560を参照のこと。別法として、遺伝子と
ともに三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを提供
してもよい。例えば、Lee et al.,Nucleic Acids Res(1
979)6:3073;Cooney et al.,Science(1988)241:456;Derv
an et al.,Science(1991)251:1360参照。これらのオリ
ゴヌクレオチドはそれ自体投与することができ、あるい
は重要部分のオリゴマーをインビボで発現させることも
できる。
【0047】HE8CH90およびその活性の発現不足
に関連する異常な症状の処置には、いくつかの方法が用
いられる。1の方法は、HE8CH90を活性化する治
療上有効量の化合物(すなわち上記アゴニスト)を医薬
上許容される担体とともに投与し、そのことにより異常
な状態を改善することを特徴とする。別法として、遺伝
子治療を用いて、対象中の細胞によるHE8CH90の
細胞内での生成を有効ならしめてもよい。例えば、上記
のごとく本発明ポリヌクレオチドを処理加工して複製欠
損レトロウイルスベクターに入れて発現するようにして
もよい。次いで、レトロウイルス発現構築物を単離し、
本発明ポリペプチドをコードしているRNAを含むレト
ロウイルスプラスミドベクターでトランスダクションし
たパッケージング細胞中に導入して、今度はパッケージ
ング細胞が目的遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を生成
するようにしてもよい。これらのプロデューサー細胞を
対象に投与して細胞をインビボで処理加工して、インビ
ボでポリペプチドを発現するようにしてもよい。遺伝子
治療の概説としては、Human Molecular Genetics,T.Str
achan and A.P.Read,BIOS Scientific Publishers Ltd
(1986)中、第20章、Gene Therapy and other Molecul
ar Genetic-based Therapeutic Approaches(およびそ
の中の引用文献)参照。
に関連する異常な症状の処置には、いくつかの方法が用
いられる。1の方法は、HE8CH90を活性化する治
療上有効量の化合物(すなわち上記アゴニスト)を医薬
上許容される担体とともに投与し、そのことにより異常
な状態を改善することを特徴とする。別法として、遺伝
子治療を用いて、対象中の細胞によるHE8CH90の
細胞内での生成を有効ならしめてもよい。例えば、上記
のごとく本発明ポリヌクレオチドを処理加工して複製欠
損レトロウイルスベクターに入れて発現するようにして
もよい。次いで、レトロウイルス発現構築物を単離し、
本発明ポリペプチドをコードしているRNAを含むレト
ロウイルスプラスミドベクターでトランスダクションし
たパッケージング細胞中に導入して、今度はパッケージ
ング細胞が目的遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を生成
するようにしてもよい。これらのプロデューサー細胞を
対象に投与して細胞をインビボで処理加工して、インビ
ボでポリペプチドを発現するようにしてもよい。遺伝子
治療の概説としては、Human Molecular Genetics,T.Str
achan and A.P.Read,BIOS Scientific Publishers Ltd
(1986)中、第20章、Gene Therapy and other Molecul
ar Genetic-based Therapeutic Approaches(およびそ
の中の引用文献)参照。
【0048】処方および投与 可溶性形態のHE8CH90ポリペプチドのごときペプ
チド、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストペプチ
ドまたは小型分子を、適当な医薬担体と混合して処方し
てもよい。かかる処方は、治療上有効量のポリペプチド
または化合物、および医薬上許容される担体または賦形
剤を含んでなる。かかる担体としては、セイライン、緩
衝化セイライン、デキストロース、水、グリセロール、
エタノール、およびそれらの混合物が挙げられるが、こ
れらに限らない。処方は投与経路に適したものとすべき
であり、当業者によく知られている。さらに本発明は、
上記本発明成分の1種またはそれ以上を充填した、1個
またはそれ以上の容器を含んでなる医薬パックおよびキ
ットにも関する。
チド、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストペプチ
ドまたは小型分子を、適当な医薬担体と混合して処方し
てもよい。かかる処方は、治療上有効量のポリペプチド
または化合物、および医薬上許容される担体または賦形
剤を含んでなる。かかる担体としては、セイライン、緩
衝化セイライン、デキストロース、水、グリセロール、
エタノール、およびそれらの混合物が挙げられるが、こ
れらに限らない。処方は投与経路に適したものとすべき
であり、当業者によく知られている。さらに本発明は、
上記本発明成分の1種またはそれ以上を充填した、1個
またはそれ以上の容器を含んでなる医薬パックおよびキ
ットにも関する。
【0049】本発明ポリペプチドおよび他の化合物を単
独で使用してもよく、あるいは治療化合物のごとき他の
化合物と一緒に使用してもよい。医薬組成物の全身投与
の好ましい形態は、注射、典型的には静脈注射を包含す
る。皮下、筋肉内または腹腔内のごとき他の注射経路を
用いることもできる。全身投与のための別の手段は、胆
汁酸塩またはフシジン酸または他の界面活性剤のごとき
浸透剤を用いる経粘膜または経皮投与を包含する。さら
に、腸溶処方またはカプセル処方がうまく処方されるな
らば、経口投与も可能である。これらの化合物の投与は
局所的なものであってもよく、膏薬、パスタ、ゲル等の
形態であってもよい。
独で使用してもよく、あるいは治療化合物のごとき他の
化合物と一緒に使用してもよい。医薬組成物の全身投与
の好ましい形態は、注射、典型的には静脈注射を包含す
る。皮下、筋肉内または腹腔内のごとき他の注射経路を
用いることもできる。全身投与のための別の手段は、胆
汁酸塩またはフシジン酸または他の界面活性剤のごとき
浸透剤を用いる経粘膜または経皮投与を包含する。さら
に、腸溶処方またはカプセル処方がうまく処方されるな
らば、経口投与も可能である。これらの化合物の投与は
局所的なものであってもよく、膏薬、パスタ、ゲル等の
形態であってもよい。
【0050】必要な用量範囲は、ペプチド、投与経路、
処方の性質、対象の症状の性質、および担当医師の判断
による。しかしながら、適当な用量は対象の体重1kg
あたり0.1ないし100μgの範囲である。しかしな
がら、種々の使用化合物および種々の投与経路のさまざ
まな有効性を考慮すれば、必要な用量は広範囲なものと
思われる。例えば、経口投与には静脈注射よりも多い用
量が必要であると考えられる。当該分野においてよく知
られた最適化のための標準的な常套的実験を用いてこれ
らの用量の変更を行うことができる。
処方の性質、対象の症状の性質、および担当医師の判断
による。しかしながら、適当な用量は対象の体重1kg
あたり0.1ないし100μgの範囲である。しかしな
がら、種々の使用化合物および種々の投与経路のさまざ
まな有効性を考慮すれば、必要な用量は広範囲なものと
思われる。例えば、経口投与には静脈注射よりも多い用
量が必要であると考えられる。当該分野においてよく知
られた最適化のための標準的な常套的実験を用いてこれ
らの用量の変更を行うことができる。
【0051】しばしば「遺伝子治療」と称される上記治
療方法において、処置に使用するポリペプチドを対象中
において得ることもできる。よって、例えば、レトロウ
イルスプラスミドベクターを用いて対象由来の細胞をD
NAまたはRNAのごときポリヌクレオチドでエクスビ
ボで処理加工してもよい。次いで、細胞を対象に導入す
る。
療方法において、処置に使用するポリペプチドを対象中
において得ることもできる。よって、例えば、レトロウ
イルスプラスミドベクターを用いて対象由来の細胞をD
NAまたはRNAのごときポリヌクレオチドでエクスビ
ボで処理加工してもよい。次いで、細胞を対象に導入す
る。
【0052】
【実施例】特記しないかぎり、当業者によく知られた標
準的方法を用いて下記実施例を行う。実施例は本発明を
例示説明するものであり、本発明を限定するものではな
い。 実施例1 cDNA配列をコードしている7−TMドメインを伴う
発現配列タグ(EST)として知られる短い配列からな
るHuman Genome SciencesからのランダムcDNAデー
タベースをBLASTアルゴリズムを用いて検索するこ
とにより、T細胞受容体と相同的なESTが示された。
全長のクローンを得るために、自動DNA配列決定を用
いてインサートの完全DNA配列を推定した。GCGソ
フトウェアを用いるDNA配列のマップ分析により、3
51個のアミノ酸残基からなる読み枠(ORF)が示さ
れた。FASTAおよびBLASTアルゴリズムによるDNA配列
のさらなる分析により、7−トランスメンブラン様G蛋
白結合受容体に対するこのポリペプチドの相同性が示さ
れた。さらに、lasergene proteanソフトウェアを用い
る疎水性プロット分析により、G蛋白結合受容体と共通
したいくつかの特徴が示された。最大の特徴は、それぞ
れ約20ないし30個のアミノ酸からなる7つの疎水的
領域の存在であり、それらはG蛋白結合スーパーファミ
リーの受容体に見いだされる7−トランスメンブラン構
造トポロジーを形成する膜貫通ドメインとなっている可
能性がある。当該クローンの同一性をさらに確認するた
めに、読み枠(ORF)のヌクレオチド配列を用いてP
CRプライマーを設計し、ヒト胎児脳ライブラリーから
DNA配列を増幅した。正しいサイズのPCRバンドを
PCR2.1ベクター(Stratageneから得た)中にサブ
クローンし、配列決定した。
準的方法を用いて下記実施例を行う。実施例は本発明を
例示説明するものであり、本発明を限定するものではな
い。 実施例1 cDNA配列をコードしている7−TMドメインを伴う
発現配列タグ(EST)として知られる短い配列からな
るHuman Genome SciencesからのランダムcDNAデー
タベースをBLASTアルゴリズムを用いて検索するこ
とにより、T細胞受容体と相同的なESTが示された。
全長のクローンを得るために、自動DNA配列決定を用
いてインサートの完全DNA配列を推定した。GCGソ
フトウェアを用いるDNA配列のマップ分析により、3
51個のアミノ酸残基からなる読み枠(ORF)が示さ
れた。FASTAおよびBLASTアルゴリズムによるDNA配列
のさらなる分析により、7−トランスメンブラン様G蛋
白結合受容体に対するこのポリペプチドの相同性が示さ
れた。さらに、lasergene proteanソフトウェアを用い
る疎水性プロット分析により、G蛋白結合受容体と共通
したいくつかの特徴が示された。最大の特徴は、それぞ
れ約20ないし30個のアミノ酸からなる7つの疎水的
領域の存在であり、それらはG蛋白結合スーパーファミ
リーの受容体に見いだされる7−トランスメンブラン構
造トポロジーを形成する膜貫通ドメインとなっている可
能性がある。当該クローンの同一性をさらに確認するた
めに、読み枠(ORF)のヌクレオチド配列を用いてP
CRプライマーを設計し、ヒト胎児脳ライブラリーから
DNA配列を増幅した。正しいサイズのPCRバンドを
PCR2.1ベクター(Stratageneから得た)中にサブ
クローンし、配列決定した。
【0053】実施例2:哺乳動物細胞での発現 本発明受容体は、ヒト胚腎臓293細胞(HEK29
3)または付着性dhfr CHO細胞のいずれかにお
いて発現される。受容体発現を最大にするために、CD
NまたはpCDNA3ベクターに挿入する前にすべての
5’および3’非翻訳領域(UTR)を受容体cDNA
から除去した。リポフェクチンにより個々の受容体cD
NAで細胞をトランスフェクションし、400mg/m
lのG418存在下で選択した。3週間の選択期間後、
個々のクローンを拾い、さらなる分析のために増殖させ
た。ベクターのみでトランスフェクションされたHEK
293またはCHO細胞は負の対照として役立った。個
々の受容体を安定に発現する細胞系を単離するために、
典型的には、約24個のクローンを選択し、ノーザンブ
ロット分析により分析した。受容体mRNAは、分析し
たG418耐性クローンの約50%において検出され
た。
3)または付着性dhfr CHO細胞のいずれかにお
いて発現される。受容体発現を最大にするために、CD
NまたはpCDNA3ベクターに挿入する前にすべての
5’および3’非翻訳領域(UTR)を受容体cDNA
から除去した。リポフェクチンにより個々の受容体cD
NAで細胞をトランスフェクションし、400mg/m
lのG418存在下で選択した。3週間の選択期間後、
個々のクローンを拾い、さらなる分析のために増殖させ
た。ベクターのみでトランスフェクションされたHEK
293またはCHO細胞は負の対照として役立った。個
々の受容体を安定に発現する細胞系を単離するために、
典型的には、約24個のクローンを選択し、ノーザンブ
ロット分析により分析した。受容体mRNAは、分析し
たG418耐性クローンの約50%において検出され
た。
【0054】実施例3:結合アッセイおよび機能のアッ
セイのためのリガンドバンク スクリーニングのために、200個以上の推定受容体の
バンクを集めた。バンクは、ヒトの7トランスメンブラ
ン(7TM)受容体を介して作用することが知られてい
る伝達物質、ホルモンおよびケモカイン;ならびにヒト
・7TM受容体の推定アゴニストである天然の化合物、
哺乳動物の相当物がまだ同定されていない非哺乳動物の
生物学的活性ペプチド;ならびに天然には存在しないが
未知の天然リガンドとともに7TM受容体を活性化する
化合物を含む。機能(すなわち、カルシウム、cAM
P、マイクロフィジオメーター(microphysiometer)、
卵母細胞の電気生理学的性質等)のアッセイならびに結
合アッセイを用い、このバンクを用いて、まず、既知リ
ガンドの受容体をスクリーニングする。
セイのためのリガンドバンク スクリーニングのために、200個以上の推定受容体の
バンクを集めた。バンクは、ヒトの7トランスメンブラ
ン(7TM)受容体を介して作用することが知られてい
る伝達物質、ホルモンおよびケモカイン;ならびにヒト
・7TM受容体の推定アゴニストである天然の化合物、
哺乳動物の相当物がまだ同定されていない非哺乳動物の
生物学的活性ペプチド;ならびに天然には存在しないが
未知の天然リガンドとともに7TM受容体を活性化する
化合物を含む。機能(すなわち、カルシウム、cAM
P、マイクロフィジオメーター(microphysiometer)、
卵母細胞の電気生理学的性質等)のアッセイならびに結
合アッセイを用い、このバンクを用いて、まず、既知リ
ガンドの受容体をスクリーニングする。
【0055】実施例4:リガンド結合アッセイ リガンド結合アッセイは、受容体機能を確認するための
直接的方法を提供し、高処理量フォーマットに適用可能
である。受容体に対する精製リガンドを放射性標識して
高比活性(50ないし2000Ci/mmol)とし、
結合の研究に備える。次いで、放射性標識のプロセスが
受容体に対するリガンドの活性を減じないように測定を
行う。バッファー、イオン、pHおよびヌクレオチドの
ごとき他のモジュレーターに関するアッセイ条件を最適
化して、膜および全細胞受容体源に関して測定可能な雑
音対シグナル比を得る。これらのアッセイにために、過
剰の未標識競争リガンドの存在下で測定した放射活性を
全結合放射活性から差し引いたものを、特異的受容体結
合を定義する。可能ならば、1種よりも多い競争リガン
ドを用いて残りの非特異的結合を決定する。
直接的方法を提供し、高処理量フォーマットに適用可能
である。受容体に対する精製リガンドを放射性標識して
高比活性(50ないし2000Ci/mmol)とし、
結合の研究に備える。次いで、放射性標識のプロセスが
受容体に対するリガンドの活性を減じないように測定を
行う。バッファー、イオン、pHおよびヌクレオチドの
ごとき他のモジュレーターに関するアッセイ条件を最適
化して、膜および全細胞受容体源に関して測定可能な雑
音対シグナル比を得る。これらのアッセイにために、過
剰の未標識競争リガンドの存在下で測定した放射活性を
全結合放射活性から差し引いたものを、特異的受容体結
合を定義する。可能ならば、1種よりも多い競争リガン
ドを用いて残りの非特異的結合を決定する。
【0056】実施例5:アフリカツメガエル・卵母細胞
における機能のアッセイ 本発明受容体cDNAをコードしている直鎖状にしたプ
ラスミド鋳型由来のキャップしたRNA転写物を、標準
的手順に従ってRNAポリメラーゼを用いて合成する。
インビトロ転写物を水に懸濁して最終濃度0.2mg/
mlとする。卵巣葉を成体メスのカエルから取り、段階
Vの脱卵胞した卵母細胞を得て、Drummond微量注入装置
を用いてRNA転写物(10ng/卵母細胞)を50μ
lのボーラスとして注入する。2個の電極電圧クランプ
を用いて個々のアフリカツメガエル卵母細胞からの電流
を測定する。室温のCa2+不含Barth培地中で記録を行
う。アフリカツメガエルの系を用いて、リガンド活性化
に関して既知リガンドおよび組織/細胞抽出物をスクリ
ーニングすることができる。
における機能のアッセイ 本発明受容体cDNAをコードしている直鎖状にしたプ
ラスミド鋳型由来のキャップしたRNA転写物を、標準
的手順に従ってRNAポリメラーゼを用いて合成する。
インビトロ転写物を水に懸濁して最終濃度0.2mg/
mlとする。卵巣葉を成体メスのカエルから取り、段階
Vの脱卵胞した卵母細胞を得て、Drummond微量注入装置
を用いてRNA転写物(10ng/卵母細胞)を50μ
lのボーラスとして注入する。2個の電極電圧クランプ
を用いて個々のアフリカツメガエル卵母細胞からの電流
を測定する。室温のCa2+不含Barth培地中で記録を行
う。アフリカツメガエルの系を用いて、リガンド活性化
に関して既知リガンドおよび組織/細胞抽出物をスクリ
ーニングすることができる。
【0057】実施例6:マイクロフィジオメトリックア
ッセイ(Microphysiometric Assays) 種々の2次メッセンジャー系の活性化により、少量の酸
が細胞から生じる。大まかにいえば、生じた酸は、細胞
内シグナリングプロセスの燃料として必要な代謝活性の
増大の結果である。細胞周辺の培地のpH変化は非常に
小さいが、サイトセンサー・マイクロフィジオメーター
(CYTOSENSOR microphysiometer)(Molecular Devices
Ltd.,Menlo Park,CA)により検出可能である。よっ
て、CYTOSENSORは、本発明G蛋白結合受容体のごときエ
ネルギーを使用する細胞内シグナリング経路に連動した
受容体の活性化を検出することができる。
ッセイ(Microphysiometric Assays) 種々の2次メッセンジャー系の活性化により、少量の酸
が細胞から生じる。大まかにいえば、生じた酸は、細胞
内シグナリングプロセスの燃料として必要な代謝活性の
増大の結果である。細胞周辺の培地のpH変化は非常に
小さいが、サイトセンサー・マイクロフィジオメーター
(CYTOSENSOR microphysiometer)(Molecular Devices
Ltd.,Menlo Park,CA)により検出可能である。よっ
て、CYTOSENSORは、本発明G蛋白結合受容体のごときエ
ネルギーを使用する細胞内シグナリング経路に連動した
受容体の活性化を検出することができる。
【0058】実施例7:抽出物/細胞上清のスクリーニ
ング いままでのところ、リガンドを活性化する同族物質(ア
ゴニスト)は多くの哺乳動物ペプチドの哺乳動物におい
て存在していない。よって、この受容体に対する活性リ
ガンドが、現在に至るまで同定されてきたリガンドバン
ク中に含まれていない可能性がある。したがって、組織
抽出物についても本発明7TM受容体を機能面でスクリ
ーニング(カルシウム、cAMP、マイクロフィジオメ
ーター等を用いる機能のスクリーニング)して天然リガ
ンドを同定する。次いで、正の機能の応答を示す抽出物
をサブフラクションに分けて、活性化リガンドを単離、
同定することができる。
ング いままでのところ、リガンドを活性化する同族物質(ア
ゴニスト)は多くの哺乳動物ペプチドの哺乳動物におい
て存在していない。よって、この受容体に対する活性リ
ガンドが、現在に至るまで同定されてきたリガンドバン
ク中に含まれていない可能性がある。したがって、組織
抽出物についても本発明7TM受容体を機能面でスクリ
ーニング(カルシウム、cAMP、マイクロフィジオメ
ーター等を用いる機能のスクリーニング)して天然リガ
ンドを同定する。次いで、正の機能の応答を示す抽出物
をサブフラクションに分けて、活性化リガンドを単離、
同定することができる。
【0059】実施例8:カルシウムおよびcAMP機能
アッセイ HEK293細胞において発現される7TM受容体は、
PLCおよびカルシウム可動化の活性化および/または
cAMP刺激もしくは抑制に機能的に連動していること
が示されている。HEK293細胞、受容体でトランス
フェクションされた細胞、あるいはベクターで制御され
ている細胞における基底カルシウムレベルが正常である
こと、すなわち100nMないし200nMの範囲であ
ることが観察された。組み換え受容体を発現するHEK
293細胞をfura2とともに負荷し、1日で150個以
上の選択リガンドまたは組織/細胞抽出物を、アゴニス
トにより誘導されるカルシウム可動化について評価す
る。同様に、標準cAMP定量アッセイを用いて、組み
換え受容体を発現するHEK293細胞をcAMP産生
の刺激もしくは抑制について評価する。カルシウムトラ
ンジエントまたはcAMP変動を示すアゴニストをベク
ターで制御された細胞において試験して、応答が受容体
を発現するトランスフェクション細胞に独自のものであ
るかどうかを決定する。
アッセイ HEK293細胞において発現される7TM受容体は、
PLCおよびカルシウム可動化の活性化および/または
cAMP刺激もしくは抑制に機能的に連動していること
が示されている。HEK293細胞、受容体でトランス
フェクションされた細胞、あるいはベクターで制御され
ている細胞における基底カルシウムレベルが正常である
こと、すなわち100nMないし200nMの範囲であ
ることが観察された。組み換え受容体を発現するHEK
293細胞をfura2とともに負荷し、1日で150個以
上の選択リガンドまたは組織/細胞抽出物を、アゴニス
トにより誘導されるカルシウム可動化について評価す
る。同様に、標準cAMP定量アッセイを用いて、組み
換え受容体を発現するHEK293細胞をcAMP産生
の刺激もしくは抑制について評価する。カルシウムトラ
ンジエントまたはcAMP変動を示すアゴニストをベク
ターで制御された細胞において試験して、応答が受容体
を発現するトランスフェクション細胞に独自のものであ
るかどうかを決定する。
【0060】
【0061】(1)一般的情報: (i)出願人:サザ,ギャネシュ バーグスマ,ダーク (ii)発明の名称:新規7−トランスメンブラン受容
体をコードしているcDNAクローンHE8CH90 (iii)配列の数:2 (vi)連絡先: (A)宛て名:スミスクライン・ビーチャム (B)通り名:スウェードランド・ロード709番 (C)都市名:キング・オブ・プルシア (D)州名:ペンシルベニア (E)国名:アメリカ合衆国 (F)ZIP:19406 (v)コンピューター・リーダブル・フォーム: (A)媒体タイプ:ディスケット (B)コンピューター:IBMコンパチブル (C)作動システム:DOS (D)ソフトウェア:Windowsバージョン2.0
用FastSEQ (vi)本願のデータ: (A)出願番号:不明 (B)出願日:1997年1月28日 (C)分類:不明 (vii)先の出願データ: (A)出願番号: (B)出願日: (viii)代理人等の情報: (A)氏名:ハン,ウィリアム・ティ (B)登録番号:34344 (C)代理人等における処理番号:ATG50050 (xi)テレコミュニケーションの情報: (A)電話番号:610−270−5219 (B)ファックス番号:610−270−4026 (C)テレックス:
体をコードしているcDNAクローンHE8CH90 (iii)配列の数:2 (vi)連絡先: (A)宛て名:スミスクライン・ビーチャム (B)通り名:スウェードランド・ロード709番 (C)都市名:キング・オブ・プルシア (D)州名:ペンシルベニア (E)国名:アメリカ合衆国 (F)ZIP:19406 (v)コンピューター・リーダブル・フォーム: (A)媒体タイプ:ディスケット (B)コンピューター:IBMコンパチブル (C)作動システム:DOS (D)ソフトウェア:Windowsバージョン2.0
用FastSEQ (vi)本願のデータ: (A)出願番号:不明 (B)出願日:1997年1月28日 (C)分類:不明 (vii)先の出願データ: (A)出願番号: (B)出願日: (viii)代理人等の情報: (A)氏名:ハン,ウィリアム・ティ (B)登録番号:34344 (C)代理人等における処理番号:ATG50050 (xi)テレコミュニケーションの情報: (A)電話番号:610−270−5219 (B)ファックス番号:610−270−4026 (C)テレックス:
【0062】(2)配列番号:1に関する情報: (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:1260塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:1本 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:cDNA (xi)配列の記載:配列番号:1: ACCCTTGTGT GCACACGCTC CCGGGTCTTA TTAGTAGGTA AGAAACAGCT GCTCCTCCAC 60 CTCCACCCCA GCCCCATGGA GCTTGCTTTT TCCAGGCCAC CGTAGTCCTC ACCACTGCCA 120 CTTTGCTTCG AGATGGTCAT CATGGGCCAG TGCTACTACA ACGAGACCAT CGGCTTCTTC 180 TATAACAACA GTGGCAAAGA GCTCAGCTCC CACTGGCGGC CCAAGGATGT GGTCGTGGTG 240 GCACTGGGGC TGACCGTCAG CGTGCTGGTG CTGCTGACCA ATCTGCTGGT CATAGCAGCC 300 ATCGCCTCCA ACCGCCGCTT CCACCAGCCC ATCTACTACC TGCTCGGCAA TCTGGCCGCG 360 GCTGACCTCT TCGCGGGCGT GGCCTACCTC TTCCTCATGT TCCACACTGG TCCCCGCACA 420 GCCCGACTTT CACTTGAGGG CTGGTTCCTG CGGCAGGGCT TGCTGGACAC AAGCCTCACT 480 GCGTCGGTGG CCACACTGCT GGCCATCGCC GTGGAGCGGC ACCGCAGTGT GATGGCCGTG 540 CAGCTGCACA GCCGCCTGCC CCGTGGCCGC GTGGTCATGC TCATTGTGGG CGTGTGGGTG 600 GCTGCCCTGG GCCTGGGGCT GCTGCCTGCC CACTCCTGGC ACTGCCTCTG TGCCCTGGAC 660 CGCTGCTCAC GCATGGCACC CCTGCTCAGC CGCTCCTATT TGGCCGTCTG GGCTCTGTCG 720 AGCCTGCTTG TCTTCCTGCT CATGGTGGCT GTGTACACCC GCATTTTCTT CTACGTGCGG 780 CGGCGAGTGC AGCGCATGGC AGAGCATGTC AGCTGCCACC CCCGCTACCG AGAGACCACG 840 CTCAGCCTGG TCAAGACTGT TGTCATCATC CTGGGGGCGT TCGTGGTCTG CTGGACACCA 900 GGCCAGGTGG TACTGCTCCT GGATGGTTTA GGCTGTGAGT CCTGCAATGT CCTGGCTGTA 960 GAAAAGTACT TCCTACTGTT GGCCGAGGCC AACTCACTGG TCAATGCTGC TGTGTACTCT 1020 TGCCGAGATG CTGAGATGCG CCGCACCTTC CGCCGCCTTC TCTGCTGCGC GTGCCTCCGC 1080 CAGTCCACCC GCGAGTCTGT CCACTATACA TCCTCTGCCC AGGGAGGTGC CAGCACTCGC 1140 ATCATGCTTC CCGAGAACGG CCACCCACTG ATGGACTCCA CCCTTTAGCT ACCTTGAACT 1200 TCAGCGGTAC GCGGCAAGCA ACAAATCCAC AGCCCCTGAT GACTTGTGGG TGCTCCTGGC 1260
【0063】(2)配列番号:2に関する情報: (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:351アミノ酸 (B)配列の型:アミノ酸 (C)鎖の数:1本 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:蛋白 (xi)配列の記載:配列番号:2: Met Val Ile Met Gly Gln Cys Tyr Tyr Asn Glu Thr Ile Gly Phe Phe 1 5 10 15 Tyr Asn Asn Ser Gly Lys Glu Leu Ser Ser His Trp Arg Pro Lys Asp 20 25 30 Val Val Val Val Ala Leu Gly Leu Thr Val Ser Val Leu Val Leu Leu 35 40 45 Thr Asn Leu Leu Val Ile Ala Ala Ile Ala Ser Asn Arg Arg Phe His 50 55 60 Gln Pro Ile Tyr Tyr Leu Leu Gly Asn Leu Ala Ala Ala Asp Leu Phe 65 70 75 80 Ala Gly Val Ala Tyr Leu Phe Leu Met Phe His Thr Gly Pro Arg Thr 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Leu Glu Gly Trp Phe Leu Arg Gln Gly Leu Leu Asp 100 105 110 Thr Ser Leu Thr Ala Ser Val Ala Thr Leu Leu Ala Ile Ala Val Glu 115 120 125 Arg His Arg Ser Val Met Ala Val Gln Leu His Ser Arg Leu Pro Arg 130 135 140 Gly Arg Val Val Met Leu Ile Val Gly Val Trp Val Ala Ala Leu Gly 145 150 155 160 Leu Gly Leu Leu Pro Ala His Ser Trp His Cys Leu Cys Ala Leu Asp 165 170 175 Arg Cys Ser Arg Met Ala Pro Leu Leu Ser Arg Ser Tyr Leu Ala Val 180 185 190 Trp Ala Leu Ser Ser Leu Leu Val Phe Leu Leu Met Val Ala Val Tyr 195 200 205 Thr Arg Ile Phe Phe Tyr Val Arg Arg Arg Val Gln Arg Met Ala Glu 210 215 220 His Val Ser Cys His Pro Arg Tyr Arg Glu Thr Thr Leu Ser Leu Val 225 230 235 240 Lys Thr Val Val Ile Ile Leu Gly Ala Phe Val Val Cys Trp Thr Pro 245 250 255 Gly Gln Val Val Leu Leu Leu Asp Gly Leu Gly Cys Glu Ser Cys Asn 260 265 270 Val Leu Ala Val Glu Lys Tyr Phe Leu Leu Leu Ala Glu Ala Asn Ser 275 280 285 Leu Val Asn Ala Ala Val Tyr Ser Cys Arg Asp Ala Glu Met Arg Arg 290 295 300 Thr Phe Arg Arg Leu Leu Cys Cys Ala Cys Leu Arg Gln Ser Thr Arg 305 310 315 320 Glu Ser Val His Tyr Thr Ser Ser Ala Gln Gly Gly Ala Ser Thr Arg 325 330 335 Ile Met Leu Pro Glu Asn Gly His Pro Leu Met Asp Ser Thr Leu 340 345 350
【図1】 ヒト・HE8CH90のヌクレオチド配列お
よび推定アミノ酸配列(配列番号:1および2)を示す
図である。
よび推定アミノ酸配列(配列番号:1および2)を示す
図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI A61K 38/00 ADZ C07K 14/705 45/00 C12P 21/02 C 48/00 AAB C12Q 1/02 ADY A61K 37/02 ABF C07K 14/705 ABN C12N 5/10 ACV C12P 21/02 ADZ C12Q 1/02 C12N 5/00 B //(C12P 21/02 C12R 1:91) (72)発明者 ダーク・バーグスマ アメリカ合衆国19312ペンシルベニア州バ ーウィン、アイリッシュ・ロード271番
Claims (28)
- 【請求項1】 配列番号:2のポリペプチドをコードし
ているヌクレオチド配列に対してその全長にわたり少な
くとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む
単離ポリヌクレオチド;あるいは上記ヌクレオチド配列
に対して相補的なヌクレオチド配列。 - 【請求項2】 DNAまたはRNAである請求項1のポ
リヌクレオチド。 - 【請求項3】 ヌクレオチド配列が配列番号:1に含ま
れるヌクレオチド配列に対して少なくとも80%の同一
性を有するものである請求項1のポリヌクレオチド。 - 【請求項4】 ヌクレオチド配列が配列番号:1に含ま
れるHE8CH90ポリペプチドをコードしている配列
を含むものである請求項3のポリヌクレオチド。 - 【請求項5】 請求項1のポリヌクレオチド。
- 【請求項6】 請求項3のポリヌクレオチドの少なくと
も15個の連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチ
ドプローブまたはプライマー。 - 【請求項7】 発現系が適合する宿主細胞中に存在する
場合に、配列番号:2のポリペプチドをコードしている
ヌクレオチド配列に対して少なくとも80%の同一性を
有する、HE8CH90ポリペプチドを生成する能力の
ある発現系を含むDNAまたはRNA分子。 - 【請求項8】 請求項7の発現系を含む宿主細胞。
- 【請求項9】 HE8CH90ポリペプチドの生成に十
分な条件下で請求項8の宿主を培養することを特徴とす
るHE8CH90ポリペプチドの製造方法。 - 【請求項10】 該ポリペプチドが該細胞の表面に発現
される請求項9の方法。 - 【請求項11】 さらに培地からポリペプチドを回収す
ることを含む、請求項9の方法。 - 【請求項12】 請求項7の発現系で宿主細胞を形質転
換またはトランスフェクションして、適当な培養条件下
で宿主細胞がHE8CH90ポリペプチドを生成するよ
うにすることを特徴とする、HE8CH90ポリペプチ
ド生成する細胞の製造方法。 - 【請求項13】 請求項12の方法により製造される細
胞。 - 【請求項14】 配列番号:2に含まれるアミノ酸配列
に対してその全長にわたり少なくとも80%同一である
アミノ酸配列を含むHE8CH90ポリペプチド。 - 【請求項15】 配列番号:2のアミノ酸配列を含む請
求項14のポリペプチド。 - 【請求項16】 配列番号:2のポリペプチド。
- 【請求項17】 請求項11の方法により製造されるH
E8CH90ポリペプチド。 - 【請求項18】 請求項14のHE8CH90ポリペプ
チドに免疫特異的な抗体。 - 【請求項19】 (a)受容体に対する治療上有効量の
アゴニストを対象に投与すること;および/または
(b)受容体活性をインビボで生じる形態のHE8CH
90ポリヌクレオチドを対象に与えることを特徴とす
る、HE8CH90活性の増強を必要とする対象の治療
方法。 - 【請求項20】 (a)受容体に対する治療上有効量の
アンタゴニストを対象に投与すること;および/または
(b)受容体をコードしているヌクレオチド配列の発現
を阻害する核酸分子を対象に投与すること;および/ま
たは(c)受容体リガンドを求めて受容体と競争する治
療上有効量のポリペプチドを対象に投与することを特徴
とする、HE8CH90活性の阻害を必要とする対象の
治療方法。 - 【請求項21】 (a)対象のゲノムにおいてHE8C
H90をコードしているヌクレオチド配列中の変異の存
在または不存在を決定すること;および/または(b)
対象由来の試料中のHE8CH90の存在または発現量
を分析することを特徴とする、対象におけるHE8CH
90の発現または活性に関連した疾病またはかかる疾病
に対する感受性の診断方法。 - 【請求項22】 (a)請求項13の細胞を候補化合物
と接触させること;(b)次いで、候補化合物の細胞へ
の結合能を評価することを特徴とする、HE8CH90
に結合する化合物の同定方法。 - 【請求項23】 候補化合物が、細胞表面におけるHE
8CH90ポリペプチドの活性化により発生するシグナ
ルを生じさせるかどうかを決定することをさらに含み、
該シグナルを発生させる候補化合物がアゴニストである
と同定されるものである、請求項22の方法。 - 【請求項24】 請求項23の方法により同定されるア
ゴニスト。 - 【請求項25】 細胞をHE8CH90ポリペプチドに
対する既知アゴニストと接触させること;次いで、該ア
ゴニストにより発生するシグナルが該候補化合物の存在
下において減少するかどうかを決定することをさらに含
み、該シグナルを減少させる候補化合物が該HE8CH
90に対するアンタゴニストであると同定される、請求
項22の方法。 - 【請求項26】 請求項25の方法により同定されるア
ンタゴニスト。 - 【請求項27】 配列番号:1の配列またはそのフラグ
メントの配列を有するプローブを用いて厳密なハイブリ
ダイゼーション条件下でHE8CH90遺伝子を含む適
当なライブラリーをスクリーニングし、次いで、DNA
配列を単離することにより得ることのできるDNA配列
を必須として含むポリヌクレオチド。 - 【請求項28】 配列番号:1のヌクレオチド配列を含
むヌクレオチド配列を発現することにより得ることので
きるポリペプチド。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/789982 | 1997-01-28 | ||
US08/789,982 US6037146A (en) | 1997-01-28 | 1997-01-28 | CDNA clone HE8CH90 that encodes a novel 7-transmembrane receptor |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH10210993A true JPH10210993A (ja) | 1998-08-11 |
Family
ID=25149294
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP10015539A Withdrawn JPH10210993A (ja) | 1997-01-28 | 1998-01-28 | 新規7−トランスメンブラン受容体をコードしているcDNAクローンHE8CH90 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6037146A (ja) |
EP (1) | EP0855443A3 (ja) |
JP (1) | JPH10210993A (ja) |
CA (1) | CA2220851A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000021999A1 (fr) * | 1998-10-09 | 2000-04-20 | Chugai Research Institute For Molecular Medicine, Inc. | Nouveaux recepteurs couples a la proteine g |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6020158A (en) * | 1997-05-22 | 2000-02-01 | Allelix Biopharmaceuticals, Inc. | Isolated polynucleotide for novel G-protein coupled receptor |
US6812335B1 (en) * | 1999-03-23 | 2004-11-02 | The Regents Of The University Of California | Human polypeptide receptors for lysophospholipids and sphingolipids and nucleic acids encoding the same |
AU2003276221A1 (en) * | 2002-11-13 | 2004-06-03 | Bayer Healthcare Ag | Diagnostics and therapeutics for diseases associated with endothelial differentiation, sphingolipid g-protein-coupled receptor 4 (edg4) |
WO2004046332A2 (en) * | 2002-11-19 | 2004-06-03 | Amgen Inc. | Amplified genes involved in cancer |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0817800A4 (en) * | 1995-03-30 | 1999-06-16 | Human Genome Sciences Inc | RECEPTORS COUPLED BY HUMAN G PROTEIN |
US6020158A (en) * | 1997-05-22 | 2000-02-01 | Allelix Biopharmaceuticals, Inc. | Isolated polynucleotide for novel G-protein coupled receptor |
AU9794598A (en) * | 1997-10-10 | 1999-05-03 | Lxr Biotechnology Inc. | Methods for detecting compounds which modulate the activity of an lpa receptor |
-
1997
- 1997-01-28 US US08/789,982 patent/US6037146A/en not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-01-08 EP EP98300129A patent/EP0855443A3/en not_active Withdrawn
- 1998-01-19 CA CA002220851A patent/CA2220851A1/en not_active Abandoned
- 1998-01-28 JP JP10015539A patent/JPH10210993A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000021999A1 (fr) * | 1998-10-09 | 2000-04-20 | Chugai Research Institute For Molecular Medicine, Inc. | Nouveaux recepteurs couples a la proteine g |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US6037146A (en) | 2000-03-14 |
EP0855443A2 (en) | 1998-07-29 |
EP0855443A3 (en) | 2000-03-01 |
CA2220851A1 (en) | 1998-07-28 |
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Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
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