DE19722317C1 - Das Protein des humanen Ryanodinrezeptors vom Typ 3 sowie dafür kodierende DNA-Moleküle - Google Patents

Description

Der Gegenstand der Erfindung umfaßt Nukleinsäuren und Protein des humanen Ryanodinrezeptors vom Typ 3 (hRyR3), chimäre Ryanodin­ rezeptoren mit Anteilen des menschlichen Rezeptors sowie Verfahren zur Herstellung dieser Proteine. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft den Nachweis von Ryanodinrezeptoren in menschlichen Geweben zur Diagnose pathologischer Zustände und Verfahren zur Identifizierung von Aktivatoren oder Inhibitoren des hRyR3.

Zytoplasmatisches Kalzium spielt eine wichtige Rolle in der Zellaktivierung, Neurotransmitterfreisetzung, Muskelkontraktion und anderen biologischen Prozessen. Es wird durch den Einfluß extrazellulären Kalziums durch span­ nungsaktivierte und andere Ionenkanäle und über die Kalziumfreisetzung intrazellulärer Vorräte erhöht. Zur Zeit sind zwei intrazelluläre Kalziumfrei­ setzungskanäle bekannt, die Inositol 1,4,5-trisphosphatrezeptoren (IP3R) und die Ryanodinrezeptoren (RyR). Bei der Kalziumfreisetzung durch IP3R wird von einem ubiquitären Mechanismus ausgegangen, der für viele Zellen beschrieben wurde. Dagegen werden drei Typen von RyR-mRNA, RyR1, RyR2 und RyR3 gewebespezifisch exprimiert; RyR1 hauptsächlich in Skelettmuskel, RyR2 in Herzmuskel und Gehirn und RyR3 in Gehirn und glatter Muskulatur. Im Gehirn wird der RyR3 nur in sehr begrenzten Bereichen stark exprimiert, wie z. B. Hippocampus, Nucleus caudatus, Corpus callosum und Thalamus. Der RyR3 wird auch in nicht-erregbaren Zellen wie menschlichen T-Lymphozyten exprimiert. Eine Rolle des RyR3 in der Zellproliferation wird postuliert (Hakamata, Y. et al. FEBS Lett., 352 (1994), 206-210). Für RyR1 und RyR2 wurde gezeigt, daß bei der Erregungs-Kontraktions-Kopplung von Skelett- und Herzmuskel spannungsaktivierte Kalziumkanäle direkt den RyR1 in Skelett­ muskel und wahrscheinlich auch in Neuronen aktivieren, während das Kalzium der spannungsaktivierten Kanäle ein Auslöser zur Öffnung von RyR2 in Herzmuskel ist (kalziuminduzierte Kalziumfreisetzung).

Die Funktion des RyR3 ist Gegenstand einer Reihe von Spekulationen. Obwohl Kalzium ein wichtiger physiologischer Ligand von RyR3 zu sein scheint, spricht einiges dafür, daß die kalziuminduzierte Kalziumfreisetzung sich von derjenigen anderer RyR unterscheidet. Es wird angenommen, daß ein endo­ gener RyR3 für die wesentlich geringere Kalziumempfindlichkeit der restlichen Kalziumfreisetzungsaktivität von RyR1-defizienten Mausmuskelzellen verant­ wortlich ist. RyR3 ist nachweislich in einigen Fällen gegenüber Koffein unem­ pfindlich, der hauptsächlich zur RyR-Aktivierung verwendeten Substanz. Da RyR3 in nicht-erregbaren Zellen exprimiert wird, die praktisch über keine spannungsaktivierten Kalziumkanäle verfügen, scheint es möglich, daß RyR3 durch andere Mechanismen reguliert wird als die übrigen RyR. RyR3-defiziente Mausmutanten weisen eine erhöhte lokomotorische Aktivität auf.

Die cDNA-Sequenzen von RyR1, RyR2 und für den Kaninchen-RyR3 (Hakamata et al. (1992) FEBS Lett. 312, 229-235) (rRyR3) sind bereits bekannt, während die Nukleinsäuresequenz des RyR3 im Menschen (hRyR3) noch nicht untersucht wurde.

Trotz vielfältiger Teilinformationen über den RyR3 sind seine molekularphysio­ logischen Eigenschaften, seine Bedeutung in pathologischen Zuständen sowie Verfahren zur Beurteilung möglicher Inhibitoren und Aktivatoren seiner Aktivität weitgehend oder sogar völlig unbekannt. Auch geht die Übertragung zur Zeit vorhandener Informationen aus Untersuchungen mit isolierten RyR3 nichthumanen Ursprungs auf den Menschen mit einer nicht unerheblichen Unsicherheit einher.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Bereitstellung der Nukleinsäure­ sequenz des humanen Ryanodinrezeptors vom Typ 3, seine Aminosäure­ sequenz sowie die Feststellung struktureller und physiologischer Besonder­ heiten, die den hRyR3 von allen anderen RyR unterscheiden.

Die Aufgabe konnte mit der vorliegenden Erfindung im Rahmen der Beschreibung und der Patentansprüche gelöst werden, indem Polypeptide zur Verfügung gestellt werden, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie mindestens 96% Aminosäuresequenzidentität mit dem humanen Ryanodin- Rezeptor vom Typ 3 (hRyR3) mit der Aminosäuresequenz gemäß Fig. 7 aufweist.

In einer speziellen Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung den humanen Ryanodinrezeptor vom Typ 3 (hRyR3) mit der Aminosäuresequenz gemäß Fig. 7.

Die bereitgestellten Polypeptide und funktionellen Derivate des hRyR3 ermöglichen es nun erstmals, den humanen RyR3 mit RyR-Typen anderer Spezies zu vergleichen und Unterschiede aufzuzeigen.

Die bereitgestellten erfindungsgemäßen Polypeptide umfassen den humanen RyR3 sowie seine "funktionellen Derivate", die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie aus einem erfindungsgemäßen Polypeptid als Fragment, Variante oder chemisches Derivat abgeleitet sind unter Erhalt der wesentlichen biologischen Aktivität des nativen humanen Ryanodinrezeptors vom Typ 3 (hRyR3) mit der Aminosäuresequenz gemäß Fig. 7.

Unter dem der vorliegenden Erfindung zugrundeliegenden Begriff "funktionelles Derivat" ist im Rahmen der Erfindung eine Komponente mit der biologischen Aktivität, die im wesentlichen ähnlich der biologischen Aktivität des nativen hRyR3 ist, gemeint. Die biologische Fähigkeit bezieht sich sowohl auf das Bindungsvermögen von Inhibitoren und Aktivatoren wie Koffein als auch von weiteren physiologischen Liganden des nativen Rezeptors sowie die Freisetzung von intrazellulärem Kalzium. Ein "funktionelles Derivat" umfasst aber auch Teile der hRyR, dessen biologische Eigenschaften durch Fragmente anderer Proteine wie z. B. anderer RyR verändert wurden. In einer besonderen Ausführungsform sei hier auf das Beispiel eines chimären Rezeptors aus hRyR3 und rRyR2 verwiesen. Der Ausdruck "funktionelle Derivate" soll "Fragmente", Varianten" und "chemische Derivate" umfassen.

Der Ausdruck "Fragment" bezieht sich auf jedes Polypeptid, das gemessen am nativen Rezeptor, eine verkleinerte Form darstellt und mindestens eine Bindungsstelle für einen Liganden des hRyR aufweist.

Eine "Variante" umfasst Moleküle, die im wesentlichen in Funktion und Struktur vom nativen hRyR3 abgeleitet sind, wie z. B. allele Formen. Demnach beinhaltet der Ausdruck "Variante" z. B. die Moleküle, die eine ähnliche Aktivität, aber z. B. eine veränderte Aminosäuresequenz haben.

Ein chemisches Derivat schließt zusätzliche chemische Gruppen ein, die normalerweise nicht Teil des Moleküls sind. Diese Gruppen können z. B. die biologische Aktivität des Moleküls verstärken oder abschwächen.

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft chimäre Polypeptide, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie neben mindestens einem Fragment des humanen Ryanodinrezeptors vom Typ 3 (hRyR3) mindestens ein weiteres Fragment eines anderen Polypeptids enthalten.

In einer besonderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung chimäre Polypeptide, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie neben einem Fragment des hRyR3 mindestens ein weiteres Fragment aus der Familie der nicht humanen Ryanodinrezeptoren enthalten.

In einer speziellen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung chimäre Polypeptide, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie neben einem Fragment des hRyR3 mindestens ein Fragment des Kaninchen-Ryanodin-Rezeptors Typ 2 (rRyR2) enthalten.

In einer weiteren besonderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein chimäres Polypeptid, daß dadurch gekennzeichnet ist, daß es im Bereich der Aminosäure 1300 des hRyR3 ein Fragment des rRyR2 enthält, welches hohe Kalzium- bzw. Koffeinempfindlichkeit verleiht.

Aufgrund der im Vergleich zu den anderen RyR-Typen geringeren Kalzium­ freisetzungsaktivität des RyR3 ist die Messung der Kalziumfreisetzung durch bekannte Aktivatoren wie z. B. Koffein ungenau oder sogar nicht möglich. Dies hat große Bedeutung für die Identifizierung möglicher Inhibitoren oder Aktivatoren der biologischen Wirkung des RyR3. Es wurde nun über­ raschenderweise gefunden, daß ein chimäres Polypeptid, das über eine erhöhte Kalzium- bzw. Koffeinempfindlichkeit verfügt, aus einem Fragment des RyR vom Typ 3 und einem anderen Protein hergestellt werden kann. In einer besonderen Ausführungsform wird ein chimäres Polypeptid aus einem Anteil hRyR3 und einem nichthumanen Anteil, wie z. B. einem Fragment des Kaninchen-rRyR2, vorgestellt. Überraschenderweise wurde gefunden, daß das Ersetzen des hRyR3 im Bereich der Aminosäure 1300 durch einen Teil des rRyR2 eine erhöhte Koffein- bzw. Kalziumempfindlichkeit vermittelt. Diese erhöhte Kalzium- bzw. Koffeinempfindlichkeit ermöglicht nun dem Fachmann in hochsensiblen Testsystemen, z. B. in vivo Zellsystemen, Aktivatoren und Inhibitoren durch ihren Einfluß auf den intrazellulären Kalziumgehalt zu bestimmen.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst Nukleinsäuren, die für die erfindungsgemäßen Polypeptide mit der biologischen Aktivität des nativen hRyR3 kodieren. Nukleinsäuren umfassen DNA sowie auch RNA. Alle erfindungsgemäßen Nukleinsäuren zeichnen sich dadurch aus, daß Sie mit einer Nukleinsäure entsprechend der erfindungsgemäßen Polypeptid­ sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Unter stringenten Bedingungen hybridisieren DNA-Sequenzen mit mehr als 85% Homologie und bevorzugt mit einer Homologie von mehr als 90%. Unter stringenten Bedingungen versteht der Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie Hybridisierungsbedingungen wie sie z. B. in "Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd. Ed., Sambrook, Fritsch, Maniatis; Cold Spring Harbor Press, 1989" und "Haymes, B. D. et al., Nucleic Acid Hybridisation, a Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)" beschrieben werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kodieren diese DNA-Moleküle für chimäre Polypeptide, die neben einem Anteil hRyR3 mindestens ein weiteres DNA-Fragment enthalten, das z. B. aus der Familie der Ryanodin­ rezeptoren stammen kann. In einer besonderen Ausführungsform wird eine Nukleinsäure für ein chimäres Polypeptid aus einem Fragment des hRyR3 zur Verfügung gestellt, dessen Bereich um die Aminosäure 1300 durch ein Fragment des Kaninchen RyR2 ersetzt wurde.

In einer weiteren besonderen Ausführungsform umfasst die Erfindung alle zur rekombinanten Darstellung der erfindungsgemäßen Polypeptide notwendigen Nukleinssäuresequenzen. Die Sequenzen schließen somit alle zusätzlichen Sequenzen ein, die zur rekombinanten Herstellung der Polypeptide notwendig sind, wie z. B. Vektor- und Wirtsnukleinsäuren.

In einem zusätzlichen Aspekt wird von der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Polypeptide bereitgestellt, daß dadurch gekennzeichnet ist, daß eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in eine Zelle oder ein zellfreies In-Vitro-Translations-System eingebracht wird. Ferner ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure Bestandteil eines Expressionsvektors sein kann. Entsprechende verwendbare Expressionsvektoren, Zellen, zellfreie In-Vitro-Translations-Systeme sowie die notwendigen Methoden zur Herstellung der Polypeptide sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie geläufig.

Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Polypeptide und/oder Nukleinsäuren als Pharma­ zeutikum oder als Bestandteil eines Pharmazeutikums, bzw. die Verwendung der Polypeptide und/oder zur Behandlung von hRyR3 assoziierten Erkrankungen.

Ferner umfasst die Erfindung jedoch auch Nukleinsäuren als Pharmazeutikum oder als Bestandteil eines Pharmazeutikums, die der Nukleinsäure eines der erfindungsgemäßen Proteine komplementär ist. Solche komplementären Nukleinsäuren sind dem Fachmann unter dem Namen "Antisense"-Nuklein­ säuren bekannt und ihre therapeutische Bedeutung ist dem Fachmann geläufig.

Ein zusätzlicher Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Polypeptide sowie deren Nukleinsäuren zum Nachweis der erfindungsgemäßen Polypeptide sowie deren Nukleinsäuren.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide ermöglichen nun erstmals die Bereit­ stellung hochspezifischer immunologischer Methoden, diese Polypeptide in geringen Konzentrationen nachzuweisen.

In einer besonderen Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polypeptids zur Herstellung monoklonaler oder polyklonaler Antikörper zum Nachweis eines erfindungsgemäßen Polypeptids.

Immunologische Methoden, wie z. B. die Herstellung, Reinigung und Anwendung monoklonaler und polyklonaler Antikörper zum quantitativen und qualitativen hochspezifischen Nachweis von Peptiden sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt. Ferner umfasst die Erfindung in einer weiteren besonderen Ausführungsform auch den molekularbiologischen Nachweis der für die Polypeptide kodierenden Nukleinsäure. Molekularbiologische Nachweise sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie bestens bekannt und umfassen u. a. Hybridisierungs- und PCR- (Polymerase Chain Reaction) Methoden.

In einer besonderen Ausführungsform ist die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder eines Teils einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure zum Nachweis einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, daß eine zu dieser Nukleinsäure oder zu einem Teil dieser Nukleinsäure komplementäre Nukleinsäure zur Hybridisierung eingesetzt wird.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst die Verwendung der bereitgestellten Polypeptide und/oder Nukleinsäuren zur Bestimmung möglicher Inhibitoren und Aktivatoren des hRyR3.

Demzufolge umfasst die vorliegende Erfindung auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren zur in vitro- und/oder in vivo-Identifizierung von Aktivatoren und/oder Inhibitoren des hRyR3, die dadurch gekennzeichnet ist, daß eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in eine Zelle oder ein zellfreies System eingebracht und exprimiert wird, das Expressionsprodukt einem potentiellen Inhibitor oder Aktivator ausgesetzt wird und der durch das Expressionsprodukt vermittelte Ionenfluß gemessen wird.

Der Begriff in vitro bezieht sich auf zellfreie, der Begriff in vivo auf Zellsysteme. In einer besonderen Ausführungsform werden Aktivatoren und/oder Inhibitoren in membranumschlossene zellfreie Systeme eingebracht, die die erfindungsge­ mäßen Polypeptide exprimieren und nach Zusatz potentieller Aktivatoren und Inhibitoren die Änderung der Ionenkonzentration im membranumschlossenen Raum bestimmt. In einer ganz besonderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung erstmals durch die Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide in RyR-defizienten Zellen ein System in vivo zur Verfügung, daß es ermöglicht, Aktivatoren und Inhibitoren des hRyR3 in isolierten Zellen zu bestimmen. Methoden zur Expression von Polypeptiden in Zellen und zellfreien Systemen unter Verwendung der entsprechenden Nukleinsäure sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt. Neben der Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide in Zellen oder zellfreien Systemen umfasst die Erfindung in einer ganz besonderen Ausführungsform auch die Injektion der Polypeptide in diese Zellen und Systeme zur Identifikation von Inhibitoren und/oder Aktivatoren nach den oben beschriebenen Methoden. Die Identifizierung von potentiellen Inhibitoren und Aktivatoren erfolgt durch Nachweis des veränderten Einflusses des Expressionsprodukts auf die Zelle. Der veränderte Einfluss des Peptids bzw. Expressionsprodukts ist durch den vermittelten Ionenfluss meßbar bzw. durch die Veränderung der Ionenkon­ zentration im membranumschlossenen Raum. Im allgemeinen wird die Konzentration intrazellulärer Kalziumionen gemessen. Ein beispielhafter Versuchsaufbau eines solchen Verfahrens zur Bestimmung von Aktivatoren oder Inhibitoren besteht z. B. aus einem hRyR3 exprimierenden Zellsystem oder zellfreien System, das über keinerlei oder nur geringe endogene Ryanodin­ rezeptoraktivität verfügt, wobei nach dem Zusatz von potentiellen Inhibitoren oder Aktivatoren eine meßbare Änderung der Ionenkonzentration innerhalb des Zellsystems oder des membranumschlossenen Raums bestimmt wird. Für den RyR1 und RyR2 sind Systeme zur Bestimmung von Aktivatoren und Inhibitoren bereits bekannt.

In einem weitereren zusätzlichen Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung den Nachweis der erfindungsgemäßen Polypeptide und/oder des hRyR3, zur Diagnose von pathologisch veränderten Geweben.

In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung können die erfindungsgemäßen Polypeptide und/oder Nukleinsäuren zur Herstellung eines Diagnostikums verwendet werden, welches deren Verwendung zur Diagnose von pathologischen Zuständen, wie z. B. die Überexpression oder der Mangel an hRyR3 in Geweben, ermöglicht, die dadurch gekennzeichnet ist, daß das Vorhandensein, die Überexpression oder der Mangel eines der erfindungsge­ mäßen Polypeptide nachgewiesen wird. Eine ganz besondere Ausführungs­ form der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von Antikörpern zur Diagnose pathologischer Zustände durch den immunologischen Nachweis der erfindungsgemäßen Polypeptide durch Antikörperbindung.

Unter einem pathologischen Zustand eines Gewebes versteht der Fachmann jegliche Abweichung der physio­ logischen Normalverhältnisse wie sie bei der Mehrheit eindeutig gesunder Gewebe ausgeprägt sind. Die Feststellung der Überexpression oder des Mangels der erfindungsgemäßen Polypeptide in Geweben und Zellen kann sowohl durch immunologische Methoden als auch durch den molekular­ biologischen Nachweis der für die Polypeptide kodierenden Nukleinsäure erfolgen.

In einer weiteren besonderen Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure zur Diagnose pathologischer Zustände, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die für das erfindungsgemäße Polypeptid kodierende Nukleinsäure nachgewiesen wird.

Entsprechende molekularbiologische Nachweise sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie bestens bekannt und umfassen u. a. Hybridisierungs­ methoden und PCR-(Polymerase Chain Reaction) Methoden. Ferner erlaubt die vorliegende Erfindung durch Bereitstellung der Nukleinsäuresequenz des hRyR3 dem Fachmann erstmals die Darstellung hochspezifischer hRyR3- Hybridierungssonden, mit denen die Gegenwart oder der Mangel an Nukleinsäuren des hRyR3 in Geweben nachgewiesen werden kann. Auch können nun hochspezifische Sonden zum Nachweis des hRyR3 durch PCR ("Polymerase Chain Reaction") entwickelt werden. Dadurch können erfindungs­ gemäß pathologische Zustände in Geweben durch molekularbiologische Methoden nachgewiesen werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird im folgenden die Sequenz und molekularphysiologische Charakterisierung der cDNA-Sequenz des erfindungs­ gemäßen nativen Peptids des hRyR3 offenbart. Die cDNA Sequenz wurde durch dem Fachmann bekannte molekularbiologische Hybridisierungs­ methoden und anschließendes Sequenzieren mehrerer überlappender cDNA- Klone identifiziert und charakterisiert. (Siehe Beispiel 1). Die Primärstruktur des erfindungsgemäßen nativen Polypeptids ist durch den Vergleich des korrespondierenden Leserasters der Aminosäuresequenz des Kaninchen- RyR3 bestimmt worden (Hakamata, Y. et al. FEBS Lett. 312 (1992), 229-235). Die Aminosäuresequenz des nativen Polypeptids ist 4866 Aminosäuren lang und entspricht einem Molekulargewicht von 551046 Da. Fig. 1 zeigt die aus der cDNA abgeleitete Aminosäuresequenz des hRyR3. Die Nukleotidsequenz GAGCCATGG im Bereich um das translationale Initiationskodon stimmt gut mit der Konsensusinitationssequenz CCA(G)CCATGG überein (Kozack M. Nucleic. Acids. Res. 12 (1984), 857-872). Die 3'-nichtkodierende Region ist 873 Nukleotide lang (ohne den poly (da)-Bereich); das Polyadenylierungs­ signal AATAAA (Goeddel, D. V. et al. Nature 290 (1981), 20-26) befindet sich 21 Nukleotide oberhalb des poly (da)-Bereichs. Der Aminosäuresequenzver­ gleich weist jeweils über 90% (ca. 96%) Identität zwischen hRyR3/rRyR3 auf, bzw. über 60% Identität zwischen hRyR3/rRyR2 (ca. 69%) sowie hRyR3/RyR1 (ca. 67%). Das Hydropathizitätsprofil des hRyR3 ist vergleichbar mit denen von Kaninchen-rRyR3, rRyR2, rRyR1 sowie humanem RyR1 insoweit, daß keine hydrophobe aminoterminale Sequenz, die eine Signalsequenz anzeigt, vorhanden ist und, daß die restlichen Bereiche hauptsächlich hydrophil sind sowie, daß sich vier stark hydrophobe Segmente (benannt als M1, M2, M3 und M4) im carboxy-terminalen Ende befinden. Besonders gut konserviert in allen RyR ist die carboxyterminale Region im Bereich der M3- und M4-Segmente. Es sind auch deutliche Unterschiede vorhanden. So fehlt z. B. sowohl in hRyR3 als auch in rRyR3 in der Nähe der Aminosäure 1300 ein Bereich von etwa 100 Aminosäuren; RyR2 hat in dieser Region eine EF-Hand-Konsensussequenz (Moncrief, N. D. J. Mol. Evol. 30 (1990), 522-562) (im Bereich der Aminosäuren 1336-1347) und eine Nukleotidbindungskonsensussequenz GXGXXG (Wierenga, R. K. Nature 302 (1983), 842-844) (Aminosäurereste 1324-1329) (Nakai, J. et al. FEBS Lett. 271 (1990), 169-177). Desweiteren unterscheidet sich die Region direkt vor dem M1-Segment, in der eine Divergenz zwischen hRyR3 und rRyR3 besteht. Der hRyR3 verfügt über vier sich wiederholende Sequenzen in zwei Tandempaaren (Aminosäurereste 841-954, 955-1070, 2600-2711 und 2712-2791). Potentielle Ligandenbindungsstellen sind über vorgeschlagene Konsensusaminosäuresequenzen bestimmbar. Eine dem Motif der EF-Hand (Moncrief, N. D. J. Mol. Evol. 30 (1990), 522-562) ähnliche Sequenz ist bei Aminosäureresten 3928-3939 erkennbar, eine Region, die auch in rRyR3, RyR2 und RyR1 relativ gut konserviert ist. Desweiteren ist eine potentielle Calmodulin-Bindungsstelle (Aminosäuren 3465-3476), bestehend aus einer amphipathischen Helix mit zwei Gruppen positiver Ladungen, die durch eine hydrophobe Region getrennt sind (Blumenthal, D. K. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82 (1985), 3187-3191), besonders gut in rRyR3, rRyR2 und rRyR1 konserviert. Das Molekül weist vier Kopien der Nukleotidbindungs­ konsensussequenz GXGXXG (Wierenga, R. K. Nature 302 (1983), 842-844) (Aminosäurereste 697-702, 699-704, 1135-1140, 2235-2240 und 2524-2529) auf, von denen die Aminosäuren 2235-2240 in rRyR3, rRyR2 und rRyR3 gut konserviert sind. Durch Verwendung der Konsensussequenz RXXS/T, ergeben sich 21 potentielle Posphorylierungsstellen für Ca²⁺/Calmodulin-abhängige Proteinkinasen, von denen vier (Serinrest 2707 und die Threoninreste 130, 290, und 4150) in rRyR3, rRyR2 und rRyR3 konserviert sind. Es sind zwei potentielle cAMP-abhängige Phosphorylierungsstellen (Threoninreste 1244 und 4158), definiert als KRXXS/T oder RRXS/T (Kemp, B. E. and Pearson R. B. Trends. Biochem. Sci. 15 (1990), 342-346), vorhanden, die jedoch nicht in rRyR konserviert sind. All diese potentiellen Bindungsstellen sind auf der wahrscheinlich zytoplasmatischen Seite, entsprechend des Transmembran­ topologiemodels (Takeshima, H. et al. Nature 339 (1989), 439-445), angeordnet. Argininrest 613 oder 614, dessen Ersatz durch Cystein in RyR1 mit maligner Hyperthermie (MH) in Schwein und Mensch assoziiert ist, ist in allen drei Typen von RyR konserviert. Es ist nun möglich, durch Vergleich der Primärstruktur des hRyR3 mit anderen Ryanodinrezeptoren, quantitative und qualitative Aussagen über seine molekularen Eigenschaften zu machen. Dem Fachmann auf dem Gebiet der Proteinchemie bietet die Primärstruktur des nativen Proteins desweiteren die Möglichkeit, Struktur- und Bindungsmodelle, die bei der Aufklärung der physiologischen Funktion und der Bestimmung möglicher Inhibitoren und Aktivatoren dieses Rezeptors hilfreich sind, zu entwerfen.

Die funktionelle Untersuchung des RyR3 hat bis jetzt noch keinen direkten Nachweis seiner Funktion als Kalziumfreisetzungskanal zeigen können. In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde nun erstmals die funktionelle rekombinante Expression des des hRyR3 durch Myotuben aus Mäusen ohne die Skelettmuskelisoform des RyR (Nakai, J. et al. Nature 380 (1996), 72-75) gezeigt. Die Expression des Wildtyp-hRyR3 in Myotuben aus RyR1-defizienten (dyspedischen) Mäusen durch Injektion der cDNA in die Kerne ist möglich, aber bedingt durch eine endogene Koffeinreaktion der dyspedischen Myotuben durch Koffein schlecht nachweisbar, da der Unterschied zwischen der Koffeinreaktion von nicht- injizierten Myotuben und mit RyR3-cDNA injizierten Myotuben nur undeutlich ist (10 mM Koffein). Dieses Ergebnis war nicht unerwartet, da hRyR3 in humanen T-Lymphozyten auch keine Koffeinreaktion aufzeigen (Hakamata, Y. et al. Febbs Lett. 352 (1994), 206-210). Es wird angenommen, daß Koffein durch die Verstärkung der Kalziumempfindlichkeit auf den RyR wirkt. Deshab wurde in erfinderischer Weise die Aufgabe gelöst, eine erhöhte Kalziumempfindlichkeit in den RyR3 einzubringen. Ausgehend von der Annahme, daß die fehlende Region um den Aminosäurerest 1300 die kalziumempfindlichkeitsbestimmende Region enthält, ist es möglich, ein chimäres RyR-Molekül herzustellen, in dem die fehlende Region durch eine Sequenz des RyR2 ersetzt wird, welcher eine hohe Kalziumempfindlichkeit aufweist. Ein solches chimäres Molekül des RyR kann z. B. zu einem Drittel aus der rRyR2-Aminosäuresequenz im N-Terminus und zu zwei Dritteln aus der hRyR3-Sequenz im C-Terminus bestehen (Fig. 2A). Fig. 2B zeigt eine Koffeinreaktion des in dyspedischen Myotuben exprimierten chimären RyR. Der chimäre RyR reagiert auf 1 mM Koffein (Fig. 2B, n = 5 von 20). Dagegen zeigen nicht-injizierte dyspedische Myotuben keinerlei Reaktion auf 1 mM Koffein (Fig. 2B, n = 0 von 20). Dadurch wird erstmals gezeigt, daß chimäre RyR intrazelluläre Kalziumkanäle ausbilden können, die auf Koffein reagieren. Basierend auf der Strukturvorhersage der RyR-Aminosäuresequenz liegt die kanalbildende Region des RyR im C- terminalen Zehntel der RyR-Moleküle (Takeshima, H. et al. Nature 339 (1989), 439-445; Nakai, J. et al. FEBS Lett. 271 (1990), 169-177; Hakamata, Y. et al. FEBS Lett. 312 (1992), 229-235; Zorzato, F. et al. J. Biol. Chem. 265 (1990), 2244-2256). Es ist davon auszugehen, daß die C-terminalen zwei Drittel des hRyR3 die Kalziumfreisetzungskanalaktivität beinhalten und, daß das N- terminale Drittel der RyR-Sequenz die Region, die die Koffein und/oder Kalziumempfindlichkeit bestimmt, enthält.

Eine ganz besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft den Nachweis von hRyR3 in Geweben. Dieses ist mit hRyR3-spezifischen Sonden und der Northern-Blot-Analyse von mRNA aus diversen menschlichen Geweben möglich. Es kann gezeigt werden, daß, obwohl in Gesamtgehirn nur ein schwaches Signal für RNA beobachtet werden kann, ein ca. 16 kb großes RNA-Stück mit hRyR-cDNA-Proben in relativ großer Menge in begrenzten Gehirnbereichen wie Nucleus caudatus, Amygdala und Hippocampus sowie in etwas geringeren Mengen in Corpus callosum, Substantia nigra und Thalamus (Fig. 3) hybridisiert. Die begrenzte Verteilung von RyR3 im menschlichen Gehirn ermöglicht die folgenden Annahmen. Es ist bekannt, daß der RyR auch im Gehirn direkt an L-Typ-Kalziumkanäle gekoppelt ist. Während P-Typ und andere Typen von Kalziumkanälen im ganzen Gehirn exprimiert werden, wird der R-Typ-Kalziumkanal nur in den sehr begrenzten Regionen des Gehirns, wie im Nucleus caudatus und Hippocampus exprimiert (Niidome, T. et al. FEBS Lett. 308 (1992), 7-13). Bei einer ähnlichen Verteilung von R-Typ-Kalziumkanal und RyR3 ist es wahrscheinlich, daß der RyR3 direkt mit dem R-Typ- Kalziumkanal in diesen Regionen wechselwirken kann. Da die Regionen der RyR3-Expression auch grob mit den Gebieten korrespondieren, in denen der "verzögerte neuronale Tot" nach Hypoxie im Gehirn stattfindet, ist es wahrscheinlich, daß dieser Typ des RyR eine wichtige Rolle in pathologischen Zuständen spielt. Die erhöhte lokomotorische Aktivität von RyR3-defizienten Mäusen reflektiert diese Verteilung des RyR3.

In einem weiteren Ausführungsbeispiel kann gezeigt werden, daß auch außerhalb des Gehirns in Skelettmuskel der Nachweis einer RNA-Spezies gelingt, die mit hRyR3-cDNA-Proben hybridisiert (Fig. 4). Die Größe der RNA- Spezies dieser Gewebe von ca. 16 kb entspricht der Spezies im Gehirn. Ein schwaches Signal legt die Existenz von RyR3-mRNA in Herzgewebe nahe. Die Verteilung von mRNA außerhalb des Gehirns unterscheidet sich vom Kaninchen, da die RyR3-Expression in Kaninchenskelettmuskel nicht nachweisbar ist. Bedingt durch den großen Gehalt an RyR1-mRNA in Skelettmuskel ist ein geringer Beitrag durch Kreuzhybridisierung von RyR3- Proben mit RyR1-mRNA nicht ausgeschlossen. Allerdings führte mRNA aus Herz zu einem wesentlich geringeren Hybridisierungsignal, trotz der höheren Homologie von RyR3 mit RyR2 im Vergleich zu RyR1. Dieses, zusammen mit der Isolierung von RyR3-cDNA aus einer cDNA-Bibliothek aus Skelettmuskel, deutet daraufhin, daß RyR3 tatsächlich in Herzmuskel exprimiert wird. Zudem ist RyR3 in Skelettmuskel anderer Spezies wie z. B. Maus, Vogel und Frosch nachweisbar.

In einem weiteren Ausführungsbeispiel zum Nachweis des hRyR3 wird gezeigt, daß die RyR3-Expression zwischen den Spezies variiert und, daß die RyR3- Expression in humanem Skelettmuskel stärker ausgeprägt ist als in anderen Spezies. Es ist bekannt, daß eine akute Erhöhung von intrazellulärem Kalzium in menschlichem Skelettmuskel maligne Hyperthermie (MH) auslöst (MacLennan, D. H. and Philips, M. S. Science 256 (1992), 789-794). Obwohl MH mit Mutationen von RyR1 assoziiert wird (Gillard, E. F. et al. Genomics 11 (1991), 751-755), weisen nur 5% der MH-Fälle eine Mutation in Position 614 des RyR1-Gens durch Arg zu Cys Substitution auf. Die reichliche Expression von RyR3 in menschlichem Skelettmuskel macht eine Beteiligung des RyR3 an varianten Formen von MH sehr wahrscheinlich. Zudem besteht die Möglichkeit, daß der RyR3 auch an anderen Störungen der intrazellulären Kalziumregulation beteiligt sein könnte.

In einer weiteren ganz besonderen Ausführungsform wurde deshalb festgestellt, daß der hRyR3 bei pathologischen Zuständen im Menschen vorhanden ist und in pathologisch veränderten Geweben nachgewiesen werden kann. Zu diesem Zweck wurde an Zellinien, abgeleitet aus humanen Gehirntumoren, gezeigt, daß die gewebespezifische Verteilung des RyR3 in menschlichem Gehirn in Zusammenhang mit der zellspezifischen Kalzium­ regulation bei der Proliferation steht. RyR3-mRNA wird in mehreren menschlichen Zellinien exprimiert (Fig. 5). Eine reichliche Expression ist in U373 feststellbar, einer Zelle aus malignem Astrozytoma, eine schwache Expression in IMR-32 aus malignen Neuroblastomazellen sowie einer noch geringeren Expression in H4 aus malignen Neurogliomazellen. Trotz der RyR2- Expression in IMR-32 sind keine weiteren RyR-Typen in U373 oder H4 feststellbar. RyR3-Expression in den neuronalen Zellen SK-N-MC oder SK-N- SH konnte trotz ihrer Malignität nicht nachgewiesen werden. U373 und H4 reagierten auf Ryanodin, nicht jedoch auf Koffein mit einer Erhöhung des intrazellulären Kalziums, während eine Koffeinreaktion unter gleichen Bedingungen in RyR2-exprimierenden CHO-Kaninchenzellen nachweisbar ist (Fig. 6). Die Ryanodin- und Koffeinreaktionen von U373 und H4 ist auch in T- Lymphozyten zu beobachten, ein typisches Merkmal für RyR3 (Hakamata, Y. FEBS Lett. 352 (1994), 206-210).

Beispiele 1. Klonierung der cDNA

Es wurden Oligo (dT)- und Zufalls-Primer- cDNA-Bibiotheken aus menschlichem Gehirn (Nucleus caudatus) der Firma Clontech (USA) verwendet, die aus poly(A)⁺RNA isoliert und in λgt10 Phagen einkloniert wurden. Das Durchsuchen der cDNA-Bibliotheken (~ 3,0 × 10⁵ Plaques) mit dem Fragment Pstl(9790)/EcoRl(11834) aus dem Kaninchen RyR3 cDNA-Klon pBRR74 (9) führte zu λhBRR79. Die Schnittstellen der Restriktionsendo­ nukleasen werden durch Zahlen (in Klammern) gekennzeichnet, die das aus der Spaltung hervorgehende 5'-terminale Nukleotid beschreiben: die Nukleotidreste sind in 5'-3'-Richtung nummeriert, angefangen mit dem ersten Rest des ATG-Triplets, das das wahrscheinlich initiierende Methionin kodiert. Das Subklonieren des cDNA-Inserts von λhBRR79 in die EcoRI Schnittstelle von pBluescript SK(-) (Stratagene) führte zu phBRR79. Die Bibliothek wurde neun mal mit verschiedenen Proben durchsucht:

Desweiteren wurden zwei zusätzliche Klone durch RT-PCR gewonnen. 1 µg poly(A)⁺RNA (Clontech) aus menschlichem Gehirn wurde zusammen mit RNase H^-Reverse Transkriptase aus Moloney's murinem Leukemievirus (Gibco BRL) mit Zufallsprimer inkubiert. Der erste synthetisierte cDNA- Strang wurde entsprechend der Herstellerangaben (TaKaRa LA PCR Kit) mit Hilfe eines DNA Thermal Cycler's (Perkin-Elmer Corp.) amplifiziert. Nach einem Heißstart (1 min, 94°C) wurden die Proben 30 Zyklen von 20 s bei 98°C und 5 min bei 68°C ausgesetzt. Primerpaare für phBRR501 waren jeweils synthetische 25-Nukleotidoligomere der Basen 2949-2973 (oberer Primer, AGTGGATAAACTTGCAGAAAATGCA) und 3495-3519 (unterer Primer, TGGGGAGCTGCTGATCACCAATAAA) der phBRR61- und der phBRR51-Klone. Primerpaare für phBRR502 waren jeweils synthetische 20- Nukleotidoligomere der Basen 11369-11388 (oberer Primer, TTGATGATGAATCTGGACAGCAC) und 12353-12372 (unterer Primer, ACGTGTTAGAAATTGCGGGT) der phBRR79- und der phBRR91-Klone.

Die cDNA-Klone zur Nukleotidsequenzanalyse waren: phBRR22 (mit den Nukleotiden -86 bis 1263), phBRR61 (991-3103), phBRR501 (2949-3519), phBRR51 (3435-5253), phBRR53 (4444-7346), phBRR411 (7330-9900), phBRR79 (8358-11408), phBRR502 (11369-12372) und phBRR91 (11468- 15486). Alle cDNA-Einschübe außer phBRR501 und phBRR502 wurden in die EcoRI-Schnittstelle von pBluescript SK(-) subkloniert. Das 0,6-kb Hindlll (2956)/-Bcll (3506) Fragment von phBRR501 wurde in die BamHl/Hindlll Schnittstelle und das 0,5-kb Apal (11451)/Accl (11930) Fragment von phBRR502 in die Accl/Apal Schnittstelle von pBluescript SK(-) subkloniert.

Beide Stränge der resultierenden cDNA und die PCR-Produkte der Reversen Transkriptase wurden über die Dideoxy-Ketten-Terminations- Methode sequenziert (Sanger, F. et al., Proc. NatlAcad. S ci. U. S. A., 74, (1977), 5463-5467).

2. Physiologische Charakterisierung

Die gesamte proteinkodierende Sequenz des humanen RyR3 wurde in die EcoRI/Notl-Schnittstelle von pCl-neo (Promega) einkloniert und resultierte in hNRR9. Das cDNA-Insert wurde aus den folgenden Fragmenten konstruiert: EcoRl (Vector)/Mrol (1232) erhalten aus IhBRR22, Mrol (1232)/Hindlll (2956) aus IhBRR61, Hindlll (2956)/ Bcll (3506) aus IhBRR501, Bcll (3506)/PmaCl (4750) aus IhBRR51, PmaCl (4750)/ Pstl (7339) aus IhBRR53, Pstl (7339)/Clal (9559) aus IhBRR411, Clal (9559)/Spel(10569) aus IhBRR79, Spel (10569)/Apal (11451) aus IhBRR407, Apal (11451)/EcoRl (11815) aus IhBRR502, EcoRl (11815)/EcoRl (14861) aus IhBRR91. Das Expressionsplasmid der chimären Ryanodine Receptor­ cDNA aus humanem RyR3 und dem Kaninchen-RyR2 wurde wie folgt konstruiert: Das Sall (vector)/PmaCl (5038) Fragment aus der Kaninchen- RyR2 cDNA (Nakai, J. et al FEBS Lett. 271 (1990), 169-177) und das PmaCl (4750)/Notl (vector) Fragment aus der humanen RyR3-cDNA wurde in die Sall/Notl-Schnittstelle von pCl-neo ligiert. Kulturen von Myotuben aus RyR1-defizienten (dyspedischen) Mäusen und cDNA-Injektion sind bereits bekannt (Nakai, J. et al., Nature 380, (1996), 72-75). Fluoreszenz­ änderungen (dimensionslose willkürliche Einheiten) wurden nach der Beladung der Myotuben mit Fluo-3 AM gemessen (Garcia, J., und Beam, K. G., J. Gen. Physiol. 103, (1994), 107-123). Koffein wurde durch lokale Injektion mit Hilfe einer "wide-tipped"-Pipette (10-50 mm Durchmesser) appliziert. Als Waschlösung wurde normale Nager-Ringer-Lösung der folgenden Zusammensetzung verwendet (mM): 145 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 10 HEPES, pH 7,4 mit NaOH eingestellt. Die Temperatur betrug 20- 22°C.

3. Northern Blot Analyse

Zur Northern-Blotanalyse von humanem Gehirn und anderen Geweben wurden käufliche Multiple Tissue Northern (MTN) Blots (Clontech) verwendet. Jede Bahn der MTN-Blots enthält ungefähr 2 µg poly(A)⁺RNA aus den folgenden Hirnregionen: Amygdala, Nukleus caudatus, Corpus callosum, Hippocampus, Gesamtgehirn, Substantia nigra, subthalamischen Nucleus and Thalamus. Jede Bahn des anderen MTN-Blots enthält ungefähr 2 mg poly(A)⁺RNA der folgenden humanen Gewebe: Herz, Gehirn, Placenta, Lunge, Leber, Skeletmuskel, Niere und Pankreas. Jede Bahn des dritten Blots enthält ungefähr 20 mg Gesamt-RNA der folgenden humanen Zellinien (Hakamata Y., et al. FEBS Lett. 312 (1992), 229-235): SK-N-MC (abgeleitet aus ursprünglichen Neuroblastoma), IMR-32 (Neuroblastoma), HEL-299 (Lungenfibroblast), H4 (Neuroglioma), SK-N-SH (Neuroblastoma), HEK-293 (embryonale Nierenzelle) und U373 (Astrocytoma). Da die aus cDNA-Teilen des humanen Ryanodin-Rezeptors gewonnenen Sonden nur schwache Signale ermöglichten, wurde für die Northern Blot Analyse das 14,9-kb Nall(Vector)/Notl(Vector) Fragment aus phNRR9 verwendet. Die Probe wurde mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase und [³²P] dCTP (Feinberg, A. P. & Vogelstein, B. Anal. Biochem. 132 (1983), 6-13) durch Zufallsoligonukleotidprimer hergestellt. Der Blot wurde bei 42°C hybridisiert und drei mal mit 0,3 × SSC, 0,1% SDS bei 50°C gewaschen.

4. Lumineszenz-Bestimmung

Die Lumineszenz-Bestimmung wurde wie erst kürzlich veröffentlicht durchgeführt (Maeda, A. et al., Anal. Biochem. 242, (1996), 58-66). Dazu wurden die Zellen (1 × 10⁵ Zellen/Gefäß) in die Lösung des Kalzium-Assays mit der folgenden Zusammensetzung transferiert (mM): 140 NaCl, 5 KCI, 1,5 MgCl₂, 2,5 CaCl₂, 5 Glukose und 10 HEPES, PH 7,4 mit NaOH eingestellt, einschließlich 2,5 mM Coelenterazin, das intermediäre Substrat von Aequorin, und bei 37°C für 6 h inkubiert. Das System zur Lumineszenz-Messung bestand aus dem Spektroflucrometer CAF-110 (Jasco) (Hakamata Y. et al., FEBS Lett. 352, (1994), 206-210), das mit einer Lumineszenz-Einheit PL-03 (Jasco) verbunden ist. Die Mobilisierung intrazellulären Kalziums wurde durch Injection von Koffein in einer Endkonzentration von 10 mM und Ryanodinrezeptor von 100 mM induziert. Die Gesamtmenge der Aequorin-Aktivität wurde nach der Permeabilisierung der Zellen mit Digitonin in einer Endkonzentration von 200 mg/ml gemessen. Die Ethanolkonzentration betrug 0,5% oder weniger, da es unter diesen Bedingungen nicht zu einer Kalziumfreisetzung kommt.

Legenden zu den Figuren

Fig. 1 vergleicht die Aminosäuresequenzen der RyR-Isoformen, durch Ausrichtung der abgeleiten Aminosäuresequenz des humanen RyR3 (oben), mit dem Kaninchen-RyR3 (obere Mitte), dem Kaninchen-RyR2 (untere Mitte) und dem Kaninchen-RyR1 (unten). Vier identische Reste in der gleichen Position sind durch durchgezogene Linien eingerahmt, während Folgen von vier identischen oder konservierten Resten mit gestrichelten Linien umrahmt sind. Die Aminosäurereste sind, angefangen am initiierenden Methionin, nummeriert. Die mutmaßlichen Transmembransegmente M1 bis M4 sind gekennzeichnet; die Enden eines jeden Segments sind durch den Vergleich mit dem Kaninchen-RyR3 bestimmt worden. Vier sich wiederholende Sequenzen, die in Tandempaaren vorkommen sind durch Pfeile gekennzeichnet,

Fig. 2 zeigt die Reaktion des chimären humanen RyR3 in dyspedischen Myotuben aus RyR1-defizienten (despedischen) Mäusen auf Koffein. A, Schematische Darstellung der Struktur des chimären RyR aus Kaninchen- RyR2 (offenes Rechteck) und humanem RyR3 (gefülltes Rechteck).

B, Intrazelluläres Kalziumsignal als Reaktion auf Koffein in dyspedischen Myotuben, die den chimären humann RyR3 exprimieren. (a) Nicht-injizierte dyspedische Myotuben reagieren nicht auf 1 mM Koffein (n = 20). (b) Dyspedische Myotuben, in die chimäre humane RyR3-cDNA injiziert wurde, reagieren auf 1 mM Koffein (n = 5 von 20). Der Verlauf der Basislinie wurde möglicherweise durch das Ausbleichen des Farbstoffs hervorgerufen.

Fig. 3 zeigt die Verteilung des humanen RyR3 in humanem Gehirn durch die Northern-Blot-Analyse verschiedener Regionen des Gehirns mit cDNA- Proben für humane RyR3-mRNAs. Es wurden jeweils 2 mg poly(A)⁺RNA verwendet. Die Autoradiographie wurde bei -70°C über 7 Tage mit einem intensivierenden Schirm durchgeführt.

Fig. 4 zeigt die Exprimierung von humanem RyR3 durch die Northern-Blot- Analyse verschiedener humaner Gewebe mit cDNA-Proben für humane RyR3-mRNAs. Es wurden jeweils 2 mg poly (A)⁺ RNA verwendet. Die Autoradiographie wurde bei -70°C über 7 Tage mit einem intensivierenden Schirm durchgeführt.

Fig. 5 zeigt die Verteilung des humanen RyR3 in humanen Zellinien durch die Northern-Blot-Analyse der humanen RyR-mRNA Expression in Kaninchenskelettmuskel, Kaninchenherz, Kaninchengesamtgehirn und humanen Zellinien wie Neuroblastoma (SK-N-MC, IMR-32), Lungenfibroblasten (HEL-299), Neuroglioma (H4), Neuroblastoma (SK-N- SH), embryonale Nierenzellen (HEK293) und Astrocytoma (U373) mit cDNA- Sonden für humane RyR3- mRNAs. Es wurden jeweils 20 mg Gesamt-RNA verwendet. Die Autoradiographie wurde bei -70°C über 4 Tage mit einem intensivierenden Schirm durchgeführt.

Fig. 6 zeigt die Zunahme von intrazellulärem Kalzium in U373-Zellen nach Zugabe von Koffein und Ryanodin. A: CHO-Zellen transfiziert mit Kaninchen RyR2-cDNA; (Maeda, A. et al., Anal. Biochem. 242, (1996), 58-66) zeigen einen klaren Anstieg des intracellulären Kalzium als Reaktion auf Koffein (n = 11 von 11). B: Koffein führt zu keinem Effekt in U373-Zellen (n = 7). C: Ryanodin löst vorübergehende Kalziumschwankungen aus (n = 2 out of 4). Einige Zellen reagieren nicht auf die Ryanodin-Zugabe (n = 2 out of 4). Die uneinheitliche Reaktion ist wahrscheinlich nicht darauf zurückzuführen, daß der Ryanodin- Rezeptor den Wirkort nicht erreicht, wie kürzlich beschrieben (Penner, R. et al., FEBS Lett. 259, (1989), 217-221). Der Zeitpunkt der Zugabe von Koffein und Ryanodin-Rezeptor ist durch kleine Balken markiert.

Fig. 7 zeigt die aus der DNA-Sequenz abgeleitete Aminosäuresequenz der humanen Ryanodinrezeptors.

Fig. 8 zeigt die DNA-Sequenz des humanen Ryanodinrezeptors.

Claims (21)

1. Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens 96% Aminosäure­ sequenzidentität mit dem humanen Ryanodinrezeptor vom Typ 3 (hRyR3) mit der Aminosäuresequenz gemäß Fig. 7 aufweist, wobei Fig. 7 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

2. Polypeptid, gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um den humanen Ryanodinrezeptor vom Typ 3 (hRyR3) mit der Aminosäuresequenz gemäß Fig. 7 handelt, wobei Fig. 7 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

3. Ein funktionelles Derivat, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder 2 als Fragment, Variante oder chemisches Derivat abgeleitet ist unter Erhalt der wesentlichen biologischen Aktivität des nativen humanen Ryanodinrezeptors vom Typ 3 (hRyR3) mit der Aminosäuresequenz gemäß Fig. 7, wobei Fig. 7 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

4. Chimäres Polypeptid dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens ein Fragment des Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und mindestens ein weiteres Fragment eines anderen Polypeptids enthält.

5. Chimäres Polypeptid gemäß Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, daß das andere Protein aus der Familie der nicht humanen Ryanodinrezeptoren ausgewählt ist.

6. Chimäres Polypeptid gemäß Anspruch 4 oder 5 dadurch gekennzeichnet, daß das Fragment des anderen Proteins vom Kaninchen-Ryanodin-Rezeptor Typ 2 (rRyR2) stammt.

7. Chimäres Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6 dadurch gekennzeichnet, daß es im Bereich der Aminosäure 1300 des hRyR3 ein Fragment des rRyR2 enthält, welches hohe Kalzium- bzw. Koffeinempfindlichkeit verleiht.

8. Nukleinsäure kodierend für ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7.

9. Nukleinsäure dadurch gekennzeichnet, daß sie unter stringenten Bedingungen mit einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 8 hybridisiert.

10. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 8 oder 9 in eine Zelle oder ein zellfreies In-Vitro-Translations-System eingebracht wird.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure Bestandteil eines Expressionsvektors ist.

12. Pharmazeutikum, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 und/oder eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 8 oder 9 enthält.

13. Pharmazeutikum, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Nukleinsäure die einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 8 oder 9 komplementär ist enthält.

14. Verwendung einer Nukleinsäure oder eines Teils einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 8 oder 9 zum Nachweis einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß eine zu der nachzuweisenden Nukleinsäure komplementäre Nukleinsäure zur Hybridisierung eingesetzt wird.

15. Verwendung eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung monoklonaler oder polyklonaler Antikörper zum Nachweis eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7.

16. Verwendung der Polypeptide gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 oder der Nukleinsäuren gemäß Anspruch 8 oder 9 zur Identifizierung von Aktivatoren und/oder Inhibitoren des hRyR3.

17. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 10 zur Identifizierung von Aktivatoren und/oder Inhibitoren des hRyR3, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 10 in eine Zelle oder ein zellfreies System eingebracht und exprimiert wird, das Expressionsprodukt einem potentiellen Inhibitor oder Aktivator ausgesetzt wird und der durch das Expressionsprodukt vermittelte Ionenfluß gemessen wird.

18. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 10 zur Identifizierung von Aktivatoren und/oder Inhibitoren des hRyR3, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 10 in eine Zelle oder ein membranumschlossenes zellfreies System eingebracht und exprimiert wird, ein potentieller Inhibitor oder Aktivator zugesetzt wird und die Ionenkonzentration im membranumschlossenen Raum bestimmt wird.

19. Verwendung eines Antikörpers gemäß Anspruch 15 zur Diagnose von pathologischen Zuständen in Geweben, dadurch gekennzeichnet, daß das Vorhandensein, die Überexpression oder der Mangel eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 nachgewiesen wird.

20. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 14 zur Diagnose von pathologischen Zuständen in Geweben, dadurch gekennzeichnet, daß das Vorhandensein, die Überexpression oder der Mangel eines einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 8 oder 9 nachgewiesen wird.

21. Verwendung der Polypeptide gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 und/oder Nukleinsäuren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 9 zur Behandlung von hRyR3 assoziierten Erkrankungen.