DE69837267T2

DE69837267T2 - Kcnq kaliumkanäle und verfahren zur deren modulierung

Info

Publication number: DE69837267T2
Application number: DE69837267T
Authority: DE
Inventors: Michael A. Malvern BLANAR; Steven Middlefield DWORETZKY; Wen-Pin Princeton YANG; Paul C. Yardley LEVESQUE; Valentin K. Wallingford GRIBKOFF; Michael G. Skillman NEUBAUER; Wayne A. Pottstown LITTLE
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1997-08-12
Filing date: 1998-06-26
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2018-06-27
Also published as: US20070148692A1; ES2281129T3; AU8266598A; JP2001512673A; AU731087B2; US7262289B2; US6403360B1; DK1007638T3; US7482431B2; US20030044912A1; ATE356200T1; DE69837267D1; EP1007638A1; WO1999007832A1; US7041496B2; EP1007638A4; CA2300985A1; EP1007638B1; US20020168724A1

Description

Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäuren und Proteine für den menschlichen Kaliumkanal KCNQ2 sowie verwandte Vektoren, Wirtszellen, Herstellungsverfahren und Verfahren der Verwendung. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Antikörper, die spezifisch für das menschliche KCNQ2-Protein sind. In der vorliegenden Erfindung sind Screening-Verfahren für Verbindungen eingeschlossen, die an das hierin offenbarte Kaliumkanal-Protein binden und/oder es anderweitig modulieren.
Hintergrund der Erfindung
Unter den Ionenkanälen sind die Kaliumionen (K⁺)-Kanäle die am häufigsten vorkommenden und verschiedenartigsten. Sie schließen drei strukturellen Hauptklassen ein – Kanäle mit sechs, vier oder zwei Transmembran-Domänen. Die Kaliumkanäle mit sechs Transmembran-Domänen werden weiter in verschiedene Familien wie Shaker-ähnliche, eag-ähnliche und Slo-ähnliche Kaliumkanäle unterteilt. Die kürzliche Identifizierung von KvLQT1 etablierte eine neue Familie von sechs-Transmembran-Kaliumkanälen. Barhanin et al. (1996) Nature 384: 78-80; Sanguinetti et al. (1996) Nature 384: 80-83; Yang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4017-22; Wang et al. (1996) Nature Genetics 12: 17-23. Das Durchsuchen von DNA- und Proteinsequenz-Datenbanken legt zusätzliche potenzielle Mitglieder von KvLQT1-verwandten Kanälen in C. elegans sowie im Menschen offen. Wei et al. (1996), Neuropharmacology 35: 805-29; Yang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4017-2.
Ein oder mehrere Typ(en) von K⁺-Kanälen befindet/befinden sich auf Zellmembranen, wo er/sie bemerkenswert selektiv für K⁺ gegenüber anderen Ionen ist/sind. In anregbaren Zellen modulieren K⁺-Kanäle die Aktionspotenzial-Konfiguration. Das Ausfließen von Kalium ist der Hauptmechanismus für die Repolarisierung, das Beibehalten und die Hyperpolarisierung eines ruhenden Membranpotenzials. Halliwell (1990) in Potassium channels-structure, classification, function and therapeutic potential (N. S. Cook, Hrsg.); 348-381; Jan, L. Y. und Jan, Y. N. (1992), Ann. Rev. Physiol. 54: 537-55; Pongs (1992), Physiol. Rev. 72: S69-S88.
In Neuronen regulieren K⁺-Kanäle die neuronale Erregbarkeit, die Form und das Auslösungsmuster des Aktionspotenzials und die Neurotransmitter-Freigabe. Diese Kanäle können durch verschiedene Stimuli wie intrazelluläre sekundäre Botenstoffe, Membranpotenzial, Ionen und Neurotransmitter versperrt werden. Hille (1992), Ionic channels of excitable membranes; Catterall (1995), Ann. Rev. Biochem. 64: 493-531. Neuronale K⁺-Kanäle sind kritisch für solche neuronalen Funktionen wie Neurotransmission und Neuroprotektion, und sie können Wahrnehmungsvermögen, Lernen, Verhalten und dergleichen beeinflussen.
Vor kurzem wurde die Nomenklatur für KvLQT1 und die KvLQT1-verwandten Kanäle geändert. Biervert et al. (1998), Science 279: 403-406. KvLQT1 wurde zu KCNQ1 umbenannt, und die KvLQT1-verwandten Kanäle (KvLR1 und KvLR2) wurden zu KCNQ2 beziehungsweise KCNQ3 umbenannt. Daher ist im Verlauf dieser Beschreibung die Bezugnahme auf KCNQ1 äquivalent zu KvLQT1; die Bezugnahme auf KCNQ2 ist äquivalent zu KvLR1; und die Bezugnahme auf KCNQ3 ist äquivalent zu KvLR2.
Benigne familiäre neonatale Konvulsionen („BFNC"), eine Klasse der generalisierten idiopathischen Epilepsie, ist eine autosomal dominant vererbte Störung von Neugeborenen. BFNC ist vor kurzem mit Mutationen in zwei mutmaßlichen K⁺-Kanalgenen, KCNQ2 und KCNQ3, in Verbindung gebracht worden. Biervert et al., vorstehend; Charlier et al. (1998), Nature Genetics 18: 53-55; Singh et al. (1998) Nature Genetics 18: 25-29. Eine vorläufige funktionelle Charakterisierung von KCNQ2 bestätigte, dass dieses Gen einen spannungsaktivierten K⁺-Kanal codiert. Singh et al., vorstehend.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung offenbart den Nervensystem-spezifischen Kaliumkanal, der hierin als KCNQ2 (früher KvLR1 genannt) bezeichnet wird. Hierin wird auch der Nervensystem-spezifische Kaliumkanal KCNQ3 (früher KvLR2 genannt) beschrieben. Menschliches KCNQ2 (2) liegt innerhalb der vorliegenden Erfindung. Menschliches KCNQ3 (23), murines KCNQ2 (10) und Ratten-KCNQ2 (16 und 17) sind hierin beschrieben. Die Erfindung umspannt die Aminosäuresequenzen des menschlichen KCNQ2-Proteins und die Nucleinsäuresequenzen, die das Protein codieren, sowie Variationen in den Nucleinsäuresequenzen aufgrund der Degeneriertheit im genetischen Code.
Die vorliegende Erfindung liefert: (a) ein gereinigtes und isoliertes Nucleinsäuremolekül, das ein KCNQ2-Protein der vorliegenden Erfindung codiert; (b) Nucleinsäuresequenzen, die komplementär zu (a) sind, oder (c) Nucleinsäuresequenzen, die mindestens 80% Sequenzidentität, mehr bevorzugt mindestens 90%, mehr bevorzugt mindestens 95% und am meisten bevorzugt mindestens 98% Sequenzidentität zu (a) haben. Hierin wird auch ein Fragment von (a) oder (b) beschrieben, das an (a) oder (b) unter stringenten Bedingungen hybridisieren wird, wobei das Fragment vorzugsweise mindestens 15 Nucleotide umfasst. Die Nucleinsäuresequenzen, die das KCNQ2-Protein der vorliegenden Erfindung codieren, werden in SEQ ID NO: 19 des Sequenzprotokolls, das als Anhang veröffentlicht ist, gefunden. Das hierin beschriebene KCNQ3-Protein ist in SEQ ID NO: 26 gezeigt.
Die Erfindung umfasst: (a) Aminosäuresequenzen, umfassend das KCNQ2-Protein der vorliegenden Erfindung; und (b) Aminosäuresequenzen, die mindestens 80%, mehr bevorzugt mindestens 90%, mehr bevorzugt mindestens 95% und am meisten bevorzugt mindestens 98% Sequenzidentität zu (a) haben. Die Aminosäuresequenz, umfassend das KCNQ2-Protein der vorliegenden Erfindung, wird in SEQ ID NO: 20 gefunden. Die Aminosäuresequenz des KCNQ3-Proteins wird in SEQ ID NO: 27 gefunden, die als Anhang veröffentlicht ist.
Die Erfindung betrifft darüber hinaus neue Nucleinsäuren und assoziierte Vektoren, Wirtszellen und Verfahren zur Verwendung. Vorzugsweise ist das Nucleinsäuremolekül ein DNA-Molekül. Darüber hinaus werden Nucleotidsequenzen, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 20 codieren, sowie Proteine, die etwa 80% oder mehr identisch zu dieser Sequenz sind, bevorzugt. Es werden auch Nucleotidsequenzen bevorzugt, die etwa 80% oder mehr identisch zu SEQ ID NO: 19 sind.
Die Erfindung betrifft darüber hinaus Nucleinsäuren, die durch PCR mit degenerierten Oligonucleotidprimern erhalten wurden. Fachleute könnten solche Primer basierend auf der Konsensus-Sequenz, die hierin beschrieben wird, entwerfen. PCR-Techniken sind in White et al. (1989), Trends Genet. 5: 185-9, beschrieben.
Diese Erfindung betrifft darüber hinaus Nucleinsäure-Vektoren, die eine Nucleinsäuresequenz, die das KCNQ2-Protein codiert, umfassen, Wirtszellen, die solche Vektoren enthalten, und Polypeptide, die die Aminosäuresequenz des KCNQ2-Proteins umfassen. Vorzugsweise codiert der Vektor ein Volllängen-KCNQ2-Protein, und das Polypeptid ist ein Volllängen-KCNQ2-Protein. Die Erfinder bevorzugen Frosch-Expressionsvektoren wie pSP64T oder Derivate davon (Melton et al. (1984), Nucl. Acids Res. 12: 7057-70); Säugerzell-Expressionsvektoren wie pcDNA3 (erhältlich von Invitrogen); oder Bakterienzell-Expressionsvektoren wie pET30 (erhältlich von Novagen oder Promega).
Diese Erfindung betrifft darüber hinaus Wirtszellen, die mit den oben beschriebenen Vektoren transformiert wurden. Die Erfinder bevorzugen Xenopus-Oocyten, Säuger-Zellen (z.B. HEK293, CHO, L929) und Bakterienzellen (z.B. E. coli, insbesondere BL21(DE3), erhältlich von Novagen). Die Erfinder bevorzugen insbesondere die Zellen, die als ATCC-Hinterlegungsnummer CRL-1573 (American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas VA 20110-2209) hinterlegt sind.
Die Erfindung betrifft auch Verfahren zum Nachweisen von Nucleinsäuren, die ein KCNQ2-Protein codieren, und Verfahren zum Nachweisen von Molekülen, die an das KCNQ2-Protein binden und/oder anderweitig seine Aktivität modulieren. „Modulieren" umspannt sowohl Kanalöffner/-aktivierer als auch Kanalschließer/-inaktivierer.
Die Erfindung betrifft auch Verfahren zum Modulieren des KCNQ2-Proteins, insbesondere Verfahren des Öffnens/Aktivierens oder Schließens/Inaktivierens des KCNQ2-Kanals. Zusätzlich beschreibt die vorliegende Anwendung eine Verwendung eines Verfahrens zum Behandeln einer Krankheit durch Modulieren der Aktivität des KCNQ2-Proteins.
Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Isolierung einer menschlichen Volllängen-KCNQ2/KvLR1-cDNA. Eine menschliche Volllängen-KCNQ2/KvLR1-cDNA wurde von zwei überlappenden cDNA-Clonen abgeleitet. "S1" bis „S6" bezeichnen die Transmembran-Domänen 1 bis 6; „H5" bezeichnet die Poren-bildende Domäne (diese Domäne wird hierin auch als die „P"-Domäne bezeichnet); ORF, der offene Leserahmen; 3'-UTR, die 3'-nicht translatierten Regionen. Die Lokalisierung von verschiedenen EST-Clonen und Sonden sind auch gezeigt. (Die Figur ist nicht im Maßstab gezeichnet.)
Die 2A bis 2F zeigen die Nucleotid- (SEQ ID NO: 19) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 20) von menschlichem KCNQ2/KvLR1.
3 zeigt einen Sequenzvergleich von menschlichem KCNQ2/KvLR1 (SEQ ID NO: 20) und menschlichem KCNQ1/KvLQT1 (SEQ ID NO: 21). „|" bezeichnet eine Aminosäuresequenzidentität. Die C-terminalen Aminosäuren von beiden Proteinen sind nicht gezeigt.
4 zeigt einen Sequenzvergleich von menschlichem KCNQ3/KvLR2 (SEQ ID NO: 18) und menschlichem KCNQ1/KvLQT1 (SEQ ID NO: 21). „|" bezeichnet eine Aminosäuresequenzidentität. Die C-terminalen Aminosäuren von beiden Proteinen sind nicht gezeigt. Die N-terminalen Aminosäuren von KCNQ3/KvLR2 sind nicht gezeigt.
5 zeigt die Expression von KCNQ2/KvLR1 und KCNQ3/KvLR2 in menschlichen Geweben und verschiedenen Teilen des menschlichen Gehirns. 5A zeigt KCNQ2/KvLR1. 5B zeigt KCNQ3/KvLR2. Poly(A+)-mRNA-Northern Blots wurden individuell an radioaktiv markierte KCNQ2-spezifische (5A) oder KCNQ3-spezifische (5B) Sonden hybridisiert. RNA-Molekulargewichtsmarker sind auf der linken Seite angezeigt.
6 zeigt eine funktionelle Charakterisierung von KCNQ2/KvLR1-Strömen in Xenopus-Oocyten.
In den 6A und 6B werden Familien von Strömen von Wasser-injizierten (6A) und menschliche KCNQ2/KvLR1-cRNA-injizierten (6B) Oocyten durch 1 Sekunden-Spannungsschritte von einem Haltepotenzial von –80 mV hervorgerufen, um Potenziale im Bereich von –100 bis +40 mV in 10 mV-Schritten zu testen.
6C zeigt das Peakstrom-Spannungs (I-V)-Verhältnis für Oocyten, die menschliches KCNQ2/KvLR1 exprimieren. Die Ströme wurden unter Verwendung des Protokolls aufgezeichnet, das oben für die 6A und 6B beschrieben wurde.
6D zeigt die Abhängigkeit des Schwanzstrom-Umkehrpotenzials (E_rev) von der externen K⁺-Konzentration. Die Schwanzströme wurden bei Potenzialen von –110 bis +10 mV nach einem 1 Sekunden Puls auf +20 mV ausgelöst (n = 6 Oocyten), während die externe K⁺-Konzentration zwischen 2, 10, 40 und 98 mM variiert wurde. E_rev unter jeder Bedingung wurde für jede Oocyte durch Messen des Null-Abschnitts "zero intercept" von einer Aufzeichnung der Schwanzstrom-Amplitude gegen das Testpotenzial bestimmt. Die gestrichelte Linie hat einen Anstieg von 58 mV und ist gemäß der Nernst-Gleichung für einen perfekt selektiven K⁺-Kanal gezeichnet. Die Daten sind die Mittelwerte ± SEM von sechs Experimenten.
7 zeigt die pharmakologische Charakterisierung von KCNQ2/KvLR1-Strömen in Xenopus-Oocyten. Insbesondere zeigt diese Figur die Wirkungen von E-4031, 4-AP, TEA, Charybdotoxin und Clofilium auf den menschlichen KCNQ2/KvLR1-Strom. Überlagernde Ströme wurden während 1 Sekunden-Schritten von –80 mM auf +30 mV während desselben Experiments aufgezeichnet. Die Verbindungen wurden über eine Badperfusion geordnet von oben nach unten aufgetragen. Das Bad wurde zwischen den Verbindungen für 5 Minuten oder bis die Wirkungen vollkommen aufgehoben waren mit einer Kontrolllösung perfundiert. Ähnliche Ergebnisse wurden in drei zusätzlichen Oocyten erhalten.
8 zeigt die Co-Expression von minK und menschlichem KCNQ2/KvLR1 in Xenopus-Oocyten.
8A zeigt die Wirkung von 1 mM TEA auf Membranströme, die von einer Oocyte aufgezeichnet wurden, die mit menschlichem KCNQ2/KvLR1 alleine injiziert wurde. Überlagernde Ströme wurden während 1 Sekunden-Spannungsschritten von einem Haltepotenzial von –80 mV auf +40 mV vor und nach dem Auftragen von TEA über das Bad aufgezeichnet. TEA reduzierte den menschlichen KCNQ2/KvLR1-Strom um über 80%.
8B zeigt die Wirkung von 1 mM TEA auf die Membranströme, die von einer Oocyte aufgezeichnet wurden, die mit minK und menschlichem KCNQ2/KvLR1 injiziert wurde. Die Ströme wurden unter Verwendung des Protokolls in 8A hervorgerufen. TEA inhibierte teilweise die minK + menschlichen KCNQ2/KvLR1-Ströme, die Amplitude und Kinetik der TEA-unempfindlichen Stromkomponente waren jedoch ähnlich zu den Strömen, die in Oocyten beobachtet wurden, die mit minK alleine injiziert wurden.
9 zeigt die Expression von murinem KCNQ2/KvLR1 im Gehirn einer erwachsenen Maus. 9A ist eine Dunkelfeld-Fotographie einer koronalen Sektion durch ein erwachsenes Mausgehirn, das mit einer radioaktiv markierten Antisense-KCNQ2/KvLR1-Sonde hybridisiert wurde, was die KCNQ2/KvLR1-Transkripte in den Pyramidenzell-Schichten des Hippocampus zeigt. Niedrigere Spiegel der Expression wurden in den granulären Zellschichten des Gyrus dentatus nachgewiesen.
9B ist eine Dunkelfeld-Fotographie einer ähnlichen Region, wie in 9A gezeigt, aber mit einer Sense-Sonde hybridisiert; Mit dieser Sonde wurde wenig KvLR1-spezifische Expression nachgewiesen. Vergrößerung: 125× sowohl für 9A als auch 9B.
9C zeigt eine teilweise murine KCNQ2/KvLR1-Nucleotidsequenz und -Aminosäuresequenz. Diese Sequenz wurde durch eine PCR-Amplifizierung einer Mausgehirn-cDNA-Genbank unter Verwendung der Oligonucleotide MABms 278 und MABms 315 basierend auf der menschlichen KCNQ2/KvLR1-Sequenz erhalten. Die PCR-Fragmente wurden isoliert, subcloniert und sequenziert. Ein 226 bp-Fragment, wie oben gezeigt, wurde in einer Sonde für die in situ-Hybridisierung verwendet. Die Nucleotidsequenz ist 80% identisch zum menschlichen KCNQ2/KvLR1 (96% Identität in der Aminosäuresequenz).
MABms 278:
5'-GGCCGAATTCTGTTTCTCAGCAGCTCCAGC-3'
MABms 315:
5'-GCGCGAATTCGAGCAGCACAGGCA(A/G)AA(A/G)CA-3'
10A bis 10D zeigen die DNA- und die translatierte Aminosäuresequenz des Mausgehirn-KCNQ2/KvLR1-Gens. 10E zeigt eine Hydropathie-Analyse des Mausgehirn-KCNQ2/KvLR1-Gens. Hydropathie-Aufzeichnung offenbart das Muster, das für spannungsempfindliche K⁺-Kanäle mit 6 mutmaßlichen Membran-umspannenden Domänen (S1-S6) und einer Poren-Region (P) typisch ist.
11 zeigt ein Sequenzalignment der Mausherz-KCNQ1/KvLQT1- und Mausgehirn-KCNQ2/KvLR1-Kaliumkanäle. Das Alignment dieser zwei Gene zeigt eine 40% Gesamt-Aminosäureidentität (angezeigt durch die schattierten Bereiche) und 62,5% Identität innerhalb der umspannenden und der Poren-Domänen. Die mutmaßlichen Membran-umspannenden und Poren-Domänen sind durch die Boxen angezeigt. Die Zeichnungssequenz für einen Kaliumkanal, GYG, wird innerhalb der Poren-Region beobachtet, und der Spannungssensor RXXQXXRXXR liegt innerhalb der S4-Domäne.
12 zeigt Exons für das alternative splicing im 3'-Ende von murinem KCNQ2/KvLR1. Mindestens 2 Exons für das Splicing, die, wenn sie translatiert werden, die in A und B gezeigten Aminosäuresequenzen ergeben, sind im murinen KCNQ2/KvLR1-Gen bei den Aminosäurepositionen 372 beziehungsweise 406 identifiziert worden.
13 zeigt einen Northern Blot von mehreren Mausgeweben. Ein Northern Blot wurde mit einem Fragment des Maus-KCNQ2/KvLR1-Gens (Nucleotide 1140-2306) sondiert. Ein einziges Transkript von 8,2 kb wird im Gehirn beobachtet, wird aber in anderen Geweben nicht gesehen.
14 zeigt die in situ-Hybridisierung eines Rattengehirns. Die Zusammensetzung zeigt drei Regionen, wo die Ratten-KCNQ2/KvLR1-Botschaft stark exprimiert wird. Die Antisense-Sonden zeigen ein starkes Signal im Hippocampus, dem Gyrus dentatus, dem Cortex und dem motorischen Nucleus des Nervus trigeminus. Sense-Sonden-Kontrollen zeigen wenig Hintergrund.
15 zeigt die elektrophysiologische Charakterisierung des Maus-KCNQ2/KvLR1-vermittelten Stroms der Gesamtzelle, der in Xenopus-Oocyten exprimiert wird. In 15A produzierten 10 mV-Schritt-Depolarisierungen von –80 zu +40 eine Familie von nach Außen gerichteten Strömen, die signifikant verschieden von den Kontrollzellen waren. Die Zugabe von 1 mM TEA blockierte die KvLR1-vermittelten Ströme, und Hintergrund-Chlorid-Ströme wurden nicht durch TEA beeinflusst. Von Clofilium, einem Blocker von Herz-I_κs- und I_κr-Strömen, wurde gezeigt, dass es die KCNQ2/KvLR1-vermittelten Ströme teilweise blockiert, wenn sie von –80 auf +40 μV depolarisiert wurden. 15B zeigt nicht injizierte Kontrollen.
16 zeigt ein Alignment der Konsensus-Nucleotidsequenz (SEQ ID NO: 1) und der Nucleotidsequenzen des menschlichen KCNQ3/KvLR2 (SEQ ID NO: 26), des menschlichen KCNQ2/KvLR1 (SEQ ID NO: 19), des Maus-KCNQ2/KvLR1 (SEQ ID NO: 22) und des Ratten-KCNQ2/KvLR1 (SEQ ID NO: 7). „|" bezeichnet eine Sequenzidentität; „–" stellt eine Nicht-Konsensus-Sequenz dar; und „*" bezeichnet eine Lücke, die eingebracht wurde, um die Sequenzidentität zu optimieren.
17 zeigt ein Alignment der Konsensus-Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2) und der Aminosäuresequenzen der menschlichen KCNQ3/KvLR2- (SEQ ID NO: 27), der menschlichen KCNQ2/KvLR1- (SEQ ID NO: 20), der Maus-KCNQ2/KvLR1- (SEQ ID NO: 23) und der Ratten-KCNQ2/KvLR1- (SEQ ID NO: 8) Proteine. Wie in 16 bezeichnet „|"eine Sequenzidentität; „–" stellt eine Nicht-Konsensus-Sequenz dar; und „*" bezeichnet eine Lücke, die eingebracht wurde, um die Sequenzidentität zu optimieren.
18 zeigt die funktionelle Charakterisierung von KCNQ3-Strömen. 18A zeigt Familien von Strömen von KCNQ3-cRNA-injizierten Oocyten, die durch 1 Sek-Spannungsschritte von einem Haltepotenzial von –80 mV hervorgerufen wurden, um die Potenziale im Bereich von –70 bis +50 mV in 10 mV-Schritten zu testen. 18B zeigt das I-V-Verhältnis für Oocyten, die KCNQ3 exprimieren (n = 6). Die Ströme wurden unter Verwendung des Protokolls in 18A aufgezeichnet. 18C zeigt die Abhängigkeit des Schwanzstroms E_rev von der externen K⁺-Konzentration. Die Linie hat einen Anstieg, der durch die Nernst-Gleichung für einen perfekt selektiven K⁺-Kanal vorhergesagt wird. Jeder Wert ist der Mittelwert ± SEM von 6 Oocyten. 18D zeigt die Wirkungen von E-4031, 4-AP, TEA und Clofilium auf den KCNQ3-Strom. Überlagernde Ströme wurden während 1 Sek-Schritten von –80 mM auf +20 mV während desselben Experiments aufgezeichnet. Die Verbindungen wurden über eine Badperfusion geordnet von oben nach unten aufgetragen. Das Bad wurde zwischen den Verbindungen für 5 Minuten oder bis die Wirkungen vollkommen aufgehoben waren mit einer Kontrolllösung perfundiert. Ähnliche Ergebnisse wurden in drei zusätzlichen Oocyten erhalten.
19 zeigt die Co-Expression von KCNQ2 und KCNQ3. 19A zeigt Familien von Strömen von KCNQ2-, 19B von KCNQ3- und 19C von KCNQ2 + KCNQ3-cRNA-injizierten Oocyten, die durch 1 Sek-Spannungsschritte von einem Haltepotenzial von –80 mV hervorgerufen wurden, um die Potenziale im Bereich von –70 bis +50 mV (10 mV-Schritte) zu testen. 19D zeigt das Strom-Spannungs (I-V)-Verhältnis für Oocyten, die KCNQ2 + KCNQ3 exprimieren (n = 6). Die Ströme wurden unter Verwendung des Protokolls in den 19A-19C aufgezeichnet. 19E zeigt die Abhängigkeit des Schwanzstrom-Umkehrpotenzials (E_rev) von der externen K⁺-Konzentration. Die gestrichelte Linie hat einen Anstieg, der durch die Nernst-Gleichung für einen perfekt selektiven K⁺-Kanal vorhergesagt wird. Jeder Wert ist der Mittelwert ± SEM von 6 Oocyten. 19F zeigt die Wirkungen von 4-AP, TEA, Charybdotoxin und Clofilium auf den KCNQ2 + KCNQ3-Strom. Überlagernde Ströme wurden während 1 Sekunden-Schritten von –80 mM auf +20 mV während desselben Experiments aufgezeichnet. Die Verbindungen wurden über eine Badperfusion in der Reihenfolge von oben nach unten aufgetragen. Ähnliche Ergebnisse wurden in 4 zusätzlichen Oocyten erhalten.
20 zeigt die Interaktion von KCNE1 (minK) mit KCNQ2 + KCNQ3-Strömen. Familien von Strömen von KCNE1- (20A), KCNQ2 + KCNQ3- (20B) und KCNQ2 + KCNQ3 + KCNE1- (20C) cRNA-injizierten Oocyten, die durch 1 Sek-Spannungsschritte von einem Haltepotenzial von –80 mV hervorgerufen wurden, um die Potenziale im Bereich von –70 bis +50 mV (10 mV-Schritte) zu testen. Der Einsatz von 20A zeigt KCNE1-Ströme, die durch 5 Sek-Spannungsschritte von –80 mV zu Potenzialen von –30 bis +50 mV (20 mV-Schritte) in derselben Oocyte hervorgerufen wurden.
21 ist ein Foto einer in situ-Hybridisierung mit Ratten-KCNQ2, das einen Querschnitt des Rückenmarks der Ratte zeigt. 21(A) ist bei niedriger Vergrößerung (55×); einige Bereiche können mit einem relativ hohen Signal visualisiert werden. 21(B) ist bei hoher Vergrößerung (322×); jeder Bereich mit hohem Signal ist eine Zelle, und durch ihre Größe scheinen sie Motoneuronen zu sein.
22A zeigt den makroskopischen murinen KCNQ2-Strom, der durch ein umgedrehtes Membanstück, das von einer CHO Zelle ausgeschnitten wurde, die stabil murines KCNQ2 exprimiert, aufgezeichnet wurde. Der Strom zeigt eine langsame Aktivierung und Auswärts-Gleichrichtung. 22B zeigt eine Patch-Clamp-Aufzeichung von einzelnen Kanalströmen in einem ausgeschnittenen Stück mit Innenseite nach Außen von einer CHO/murinen KCNQ2-Zelle. Es gibt mindesten 2 Kanäle in dem Stück. Es wurde geschätzt, dass die Einzelkanal-Leitfähigkeit von KCNQ2 zwischen 24 und 30 pS liegt. Alle Aufzeichnungen wurden in einem symmetrischen 140 mM K⁺ unter Verwendung von Standardtechniken gemacht.
23 zeigt die Nucleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz von menschlichem KCNQ3 (hierin auch als KvLR2 bezeichnet).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die folgenden Definitionen betreffen Begriffe, die im Verlauf dieser Beschreibung verwendet werden, außer wenn es anderweitig unter besonderen Umständen definiert wird:
„Clonieren" – Isolierung eines bestimmten Gens aus genetischem Material, zum Beispiel einem Genom, einer genomischen Genbank oder einer cDNA-Genbank, in eine Plasmid oder einen anderen Vektor;
„KvLR-Protein" – ein Protein, das mindestens etwa 70% Identität mit der Konsensus-Sequenz hat. Es kann auch als ein „KCNQ-Protein", „KvLR/KCNQ-Protein" oder „KCNQ/KvLR-Protein" bezeichnet werden.
„KCNQ1" – das Protein, das früher als KvLQT1 bekannt war.
„KCNQ2" – das Protein, das früher als KvLR1 bekannt war.
"KCNQ3" – das Protein, das früher als KvLR2 bekannt war.
„stringente Bedingungen" (wie im Bezug auf die Nucleinsäure-Hybridisierung verwendet) – Zum Beispiel Southern-Blotting, gewaschen in 1 × SSC und 0,1% SDS bei einer Temperatur von mindestens etwa 42°C. Für zusätzliche stringente Bedingungen siehe Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982).
„Vielkopien-Plasmid" – ein Plasmid, das mehr als eine Kopie in einer Zelle vorhanden hat (typischerweise 10 bis 30 Kopien);
„Northern-Blotting" – ein Verfahren der Identifizierung von bestimmten RNA-Fragmenten durch Hybridisierung mit einer komplementären Nucleinsäure, typischerweise einer cDNA oder einem Oligonucleotid;
„offener Leserahmen” oder „ORF" – eine DNA-Sequenz, die eine Reihe von Nucleotid-Tripletts enthält, die Aminosäuren codieren und denen jegliche Terminierungs-Codons fehlen;
„Plasmid" – cytoplasmatische, autonom replizierende DNA-Elemente, die in Mikroorganismen gefunden werden;
„Promotor" – eine Region auf der DNA, an der RNA-Polymerase bindet und die Transkription iniziiert; und
„Southern-Blotting" – ein Verfahren des Identifizierens von bestimmten DNA-Fragmenten durch Hybridisierung mit einer komplementären Nucleinsäure, typischerweise einer cDNA oder einem Oligonucleotid.
Für Definitionen von anderen Begriffen in dieser Beschreibung siehe F. Sherman et al., Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1987) und Lewin, B., Genes IV, Oxford University Press, Oxford (1990).
Die folgenden Definitionen betreffen Abkürzungen in dieser Beschreibung, außer wenn es in spezifischen Umständen anderweitig definiert ist:

BFNC: benigne familiäre neonatale Konvulsionen
BLAST: basic local alignment search tool – grundlegendes lokales Anpassungs-Suchinstrument
CHO: Chinesische Hamster-Ovarzellen
DTT: Dithiothreitol
DRG: dorsales Wurzelganglion
EDTA: Ethylendiamin-Tetraessigsäure
EST: expressed sequence tags – exprimierte Sequenzmarkierungen
GPCR: G-Protein-gekoppelter Rezeptor
ORF: offener Leserahmen
PAGE: Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PBS: phosphatgepufferte Salzlösung
PCR: Polymerase-Kettenreaktion
SDS: Natriumdodecylsulfat
SSC: Puffer, enthaltend 150 mM NaCl, 15 mM Na₃-Citrat·2H₂O, pH 7,0.
TEA: Tetraethylammonium

Für zusätzliche Abkürzungen siehe Aldrichimica Acta, Bd. 17, Nr. 1 (1984).
Verwendung und Nutzen
Fachleute nehmen an, dass die KCNQ2-Proteine in die Neurotransmission involviert sein können. Fachleute können das KCNQ2-Protein der vorliegenden Erfindung verwenden, um auf Modulatoren von KCNQ2 zu testen. KCNQ2-Modulatoren würden in der Behandlung von solchen Störungen wie Ataxie, Myokymie, Anfällen (z.B. epileptischen Anfällen), Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, alters-assoziiertem Gedächtnisverlust, Lernschwierigkeiten, Motoneuronenerkrankungen, Schlaganfall und dergleichen nützlich sein.
Weil KCNQ2 ein Nervensystem-selektiver Kaliumkanal ist, wird die Arzneistoff-Spezifität in jedem KCNQ2-spezifischen Modulator eingebaut. Ein Arzneimittel, das spezifisch für das KCNQ2-Protein ist, würde daher Nebenwirkungen auf periphäre Gewebe, die Kaliumkanäle enthalten, vermeiden. Signifikanterweise würde ein KCNQ2-spezifischer Modulator Nebenwirkungen auf das Herz, das zahlreiche Typen von Kaliumkanälen enthält, vermeiden.
Die KCNQ2-Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung oder Antisense-Nucleinsäuren können nützliche therapeutische oder diagnostische Mittel sein. Für solch eine Gentherapie können die Nucleinsäuren in Vektoren inkorporiert und/oder formuliert werden, wie unten und in weiterem Detail auf dem Fachgebiet beschrieben.
Fachleute können die Polypeptide und Nucleinsäuren dieser Erfindung verwenden, um Vektoren, Zellen oder Zelllinien und Antikörper herzustellen. Alle von diesen sind nützlich in Tests für die Identifizierung von KCNQ2-Protein-Modulatoren.
Man kann KCNQ2-Protein-Modulatoren an verschiedene Säugerarten wie Affen, Hunde, Katzen, Mäuse, Ratten, Menschen, usw. verabreichen. Fachleute der Pharmazie können durch bekannte Verfahren KCNQ2-Protein-Modulatoren in eine konventionelle systemische Dosierungsform wie eine Tablette, Kapsel, ein Elixier oder ein injizierbares Präparat inkorporieren. Die obigen Dosierungsformen werden auch jegliches notwendige physiologisch verträgliche Trägermaterial, Vehikel, Gleitmittel, jeglichen Puffer, jegliches antibakterielle Quellungsmittel (wie Mannit), jegliche Antioxidanzien (Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit) oder dergleichen einschließen.
Herstellungsverfahren
Im Allgemeinen
Diese Beschreibung beschreibt das Clonieren und die funktionelle Expression eines menschlichen Volllängen-cDNA-Clons von KCNQ2 (KvLR1), vorzugsweise der menschlichen KCNQ2-Nucleinsäuresequenz (2), wie in SEQ ID NO: 19 gezeigt, und der menschlichen KCNQ2-Aminosäuresequenz (2), wie in SEQ ID NO: 20 gezeigt. Es wird auch ein menschlicher Volllängen-cDNA-Clon von KCNQ3 (KvLR2) (23) und ein muriner Volllängen-cDNA-Clon von KCNQ2 (murines KvLR1; 10) offenbart. Die menschliche KCNQ3- und die murine KCNQ2-Nucleinsäuresequenzen sind in den SEQ ID NOs: 26 beziehungsweise 22 gezeigt. Die korrespondierenden Aminosäuresequenzen sind in den SEQ ID NOs: 27 beziehungsweise 23 gezeigt. Zusätzlich beschreibt die vorliegende Anmeldung eine Ratten-KCNQ2-Sequenz (16 und 17). Die Ratten-KCNQ2-Nucleinsäuresequenz ist in SEQ ID NO: 7 gezeigt, und die Ratten-KCNQ2-Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 8 gezeigt. Die Versperrungskinetik und die makroskopischen Strom-Eigenschaften der menschlichen, murinen und Ratten-KCNQ2- und -KCNQ3-Ströme sind ähnlich zu jenen von KCNQ1. KCNQ2 und KCNQ3 sind jedoch spezifisch im Nervensystem lokalisiert und haben andere pharmakologische Eigenschaften.
Nucleinsäuren
Mit den menschlichen KCNQ2-, menschlichen KCNQ3-, murinen KCNQ2- und Ratten-KCNQ2-Gensequenzen in der Hand kann ein Fachmann KCNQ-Nucleinsäuren dieser Erfindung durch bekannte Verfahren erhalten. Solche Verfahren schließen ein: (1) Southern- und Northern-Blotting; (2) Western Immunblotting; (3) chemische Synthese; (4) Synthese durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) von Primern; (5) Expressions-Clonierung; und (6) subtraktive cDNA-Clonierung.
Fachleute können auch die Nucleinsäuren, die das KCNQ2-Protein der vorliegenden Erfindung codieren, modifizieren, um nützliche Mutationen herzustellen. Zum Beispiel kann man die Sequenz modifizieren, um zusätzliche Restriktionsendonuclease-Erkennungsstellen in der Nucleinsäure bereitzustellen. Solche Mutationen können still sein oder können die Aminosäure ändern, die durch das mutierte Codon codiert wird. Man kann diese modifizierten Nucleinsäuren zum Beispiel durch Mutieren der Nucleinsäure, die KCNQ2 codiert, herstellen, um in einer Deletion, Substitution, Insertion, Inversion oder Addition von einer oder mehreren Aminosäuren im codierten Polypeptid zu resultieren. Für Verfahren der ortsgerichteten Mutagenese siehe Taylor, J. W. et al. (1985), Nucl. Acids Res. 13, 8749-64 und Kunkel, J. A. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 482-92. Zusätzlich sind Kits für eine ortsgerichtete Mutagenese von kommerziellen Vertreibern erhältlich (z.B. BioRad Laboratories, Richmond, CA; Amersham Corp., Arlington Heights, IL). Für Verfahren zur Zerstörung, Deletion und Verkürzung siehe Sayers, J. R. et al. (1988), Nucl. Acids Res. 16: 791-800.
Diese Erfindung umfasst auch modifizierte Nucleinsäuren, einschließlich (1) Varianten von Exons zum alternativen Splicing; (2) Allel-Varianten; und (3) chimerische Kanäle, in denen das Fusionskonstrukt eine KCNQ-modulierende Stelle umfasst. Solche modifizierten Nucleinsäuren können von Fachleuten erhalten werden, wenn sie mit der vorliegenden Offenbarung ausgestattet sind.
Expressionsvektoren
Diese Erfindung betrifft darüber hinaus Expressionsvektoren, die eine Nucleotidsequenz umfassen, die das KCNQ2-Protein der vorliegenden Erfindung codiert. Vorzugsweise umfassen die Expressionsvektoren die gesamte Nucleinsäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 19 gezeigt.
Expressionsvektoren sind normalerweise Plasmide, aber die Erfindung schließt andere Vektorformen ein, die äquivalente Funktionen liefern und auf dem Fachgebiet hierzu danach bekannt werden. Ein Fachmann könnte auch eine Sequenz, die ein KCNQ2-Protein codiert, stabil in das Chromosom einer geeigneten Wirtszelle integrieren.
Expressionsvektoren enthalten typischerweise regulatorische Elemente, die zum Beeinflussen der Expression eines KCNQ2-Proteins in der Lage sind. Diese regulatorischen Elemente können heterologe oder natürliche KCNQ2-Elemente sein. Typischerweise enthält ein Vektor einen Replikationsursprung, einen Promotor und eine Transkriptions-Terminierungssequenz. Der Vektor kann auch andere regulatorische Sequenzen einschließen, einschließlich mRNA-Stabilitätssequenzen, die die Stabilität des Expressionsprodukts bereitstellen; sekretorische Leader-Sequenzen, die die Sekretion des Expressionsprodukts bereitstellen; Umwelt-Feedback-Sequenzen, die die Expression des zu modulierenden Strukturgens ermöglichen (z.B. durch das Vorliegen oder Fehlen von Nährstoffen oder anderen Induzierern im Wachstumsmedium); Markierungssequenzen, die zum Liefern einer phänotypischen Selektion in transformierten Wirtszellen in der Lage sind; Restriktionsstellen, die Stellen für die Spaltung durch Restriktionsendonucleasen bereitstellen; und Sequenzen, die die Expression in verschiedenen Typen von Wirten, einschließlich Prokaryonten, Hefen, Pilzen, Pflanzen und höheren Eukaryonten, ermöglichen.
Ein Expressionsvektor dieser Erfindung ist zumindest zum Steuern der Replikation und vorzugsweise der Expression der Nucleinsäuren und des Proteins dieser Erfindung in der Lage. Geeignete Replikationsursprünge schließen zum Beispiel die Col E1-, die SV40-, virale und die M13-Replikationsursprünge ein. Geeignete Promotoren schließen zum Beispiel den Cytomegalievirus-Promotor, den lacZ-Promotor, den gal10-Promotor und den polyhedralen Autographa californica multiples nukleäres Polyhedrosis-Virus (AcMNPV)-Promotor ein. Geeignete Terminierungssequenzen schließen zum Beispiel die Polyadenylierungssignale des bovinen Wachstumshormons, von SV40, lacZ und des polyhedralen AcMNPV ein. Beispiele von selektierbaren Markern schließen die Neomycin-, Ampicillin- und Hygromycin-Resistenz und dergleichen ein.
Fachleute können eine DNA, die ein KCNQ2-Protein der vorliegenden Erfindung codiert, in einige kommerziell erhältliche Vektoren inserieren. Beispiele schließen Vektoren, die mit Säugerzellen kompatibel sind, wie pcDNA3 oder pCEP4; Baculovirus-Vektoren wie pBlueBac; prokaryontische Vektoren wie pcDNA2; und Hefe-Vektoren wie pYes2 ein. Für Vektor-Modifizierungsverfahren siehe Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
Wirtszellen
Diese Erfindung betrifft zusätzlich Wirtszellen, die einen Expressionsvektor enthalten, der eine Sequenz umfasst, die ein KCNQ2-Protein der vorliegenden Erfindung codiert. Die Wirtszellen enthalten vorzugsweise einen Expressionsvektor, der die gesamte oder einen Teil der DNA-Sequenz umfasst, die die Nucleinsäure aufweist, im Wesentlichen wie sie in SEQ ID NO: 19 gezeigt ist, insbesondere die codierenden Regionen davon. Geeignete Wirtszellen schließen sowohl prokaryontische Zellen (z.B. die E. coli-Stämme HB101, DH5a, XL1 Blue, Y1090 und JM101) und eukaryontische Zellen (z.B. Spodoptera frugiperda-Insektenzellen, CHO-Zellen, COS-7-Zellen, HEK 293-Zellen, menschliche Hautfibroblasten und S. cerevisiae-Zellen) ein.
Fachleute können Expressionsvektoren durch verschiedene Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, in Wirtszellen einbringen. Beispielhafte Verfahren sind Transfektion durch Calciumphosphat-Präzipitation, Elektroporation, liposomale Fusion, nukleäre Injektion und virale oder Phagen-Infektion. Man kann dann die Wirtszelle unter Bedingungen züchten, die die Expression von großen Mengen des KCNQ2-Proteins erlauben.
Man kann solche modifizierten Wirtszellen durch jeden von sechs allgemeinen Ansätzen identifizieren:

(a) DNA-DNA-Hybridisierung mit Sonden, die komplementär zu der Sequenz sind, die das KCNQ-Protein codiert (Southern-Blotting).
(b) Nachweis von Markergen-Funktionen wie der Thymidinkinase-Aktivität, der Resistenz gegen Antibiotika und dergleichen. Ein Markergen kann in dasselbe Plasmid wie die KCNQ-Sequenz unter der Regulierung desselben oder eines anderen Promotors platziert werden.
(c) Nachweis von mRNA-Transkripten durch Hybridisierungstests (z.B. Northern-Blotting oder einen Nuclease-Protektionstest unter Verwendung einer Sonde, die komplementär zu der RNA-Sequenz ist).
(d) Immunnachweis der Genexpression (z.B. durch Western-Blotting mit einem Antikörper gegen das KCNQ-Protein).
(e) Nachweis der Kaliumkanal-Aktivität wie durch Patch-Clamp-Analyse, Radioisotopen (z.B. ⁸⁶Rb)-Ablass oder Membranpotenzial-empfindliche Reagenzien (z.B. Dibac von Molecular Probes International).
(f) PCR mit Primern, die homolog zu den Expressionsvektorsequenzen oder den Sequenzen sind, die das KCNQ-Protein codieren. Die PCR produziert ein DNA-Fragment von vorhergesagter Länge, das auf die Inkorporierung des Expressionssystems in der Wirtszelle hinweist.

Fachleute können DNA-Sequenzen durch verschiedene bekannte Verfahren bestimmen. Siehe zum Beispiel das Didesoxykettenterminierungsverfahren in Sanger et al. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-7 und das Maxam-Gilbert-Verfahren in Maxam-Gilbert (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560-4.
Man kann die Wirtszellen dieser Erfindung auf eine Vielzahl von Arten verwenden, die jetzt offensichtlich sind. Man kann die Zellen verwenden, um auf Verbindungen zu screenen, die an das KCNQ2-Protein, das für die Modulierung, zum Beispiel Aktivierung der KCNQ2-Protein-Aktivität nützlich sein würde, binden oder es anderweitig modulieren oder dessen Funktion regulieren; um Signaltransduktions-Mechanismen und Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen; und um ein KCNQ2-Protein für die unten beschriebenen Verwendungen herzustellen.
Nicht alle Expressionsvektoren und regulatorischen DNA-Sequenzen werden gleich gut wirken, um die DNA-Sequenzen dieser Erfindung zu exprimieren. Noch werden alle Wirtszellen gleich gut mit demselben Expressionssystem wirken. Ein Fachmann kann jedoch unter Verwendung der hierin bereitgestellten Anleitungen ohne unangemessenes Experimentieren und ohne vom Rahmen der Erfindung abzuweichen eine Auswahl aus den Expressionsvektoren, den regulatorischen DNA-Sequenzen und den Wirtszellen treffen.
Polypeptide
Diese Erfindung betrifft weiterhin Polypeptide, die die gesamten Aminosäuresequenzen eines KCNQ2-Proteins umfassen. Die Erfinder bevorzugen Polypeptide, die die gesamten Aminosäuresequenzen, wie sie in SEQ ID NO: 20 gezeigt sind, umfassen. Wo ein Teil des KCNQ2-Proteins verwendet werden kann, zeigt der Teil vorzugsweise ein K⁺-Kanal-Aktivität oder kann moduliert werden, um eine K⁺-Kanal-Aktivität zu zeigen. Zum Beispiel und im Rahmen der Erfindung sind Polypeptide, die das gesamte KCNQ2 umfassen, das eine oder mehrere Mutation(en) enthalten kann, damit das Protein versagt, eine K⁺-Kanal-Aktivität zu zeigen, aber die verwendet werden können, um auf Verbindungen zu screenen, die das Protein oder einen Teil davon aktivieren werden.
Fachleute können diese Polypeptide durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, herstellen. Zum Beispiel kann man eine chemische Synthese wie das Festphasenverfahren, das von Houghton et al. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 5131-5 beschrieben wurde, verwenden werden. Ein anderes Verfahren ist die in vitro-Translation von mRNA. Man kann auch die Polypeptide in den oben beschriebenen Wirtszellen produzieren, was das bevorzugte Verfahren ist. Zum Beispiel kann man durch PCR, wie oben beschrieben, eine DNA synthetisieren, die die gesamte oder einen Teil der SEQ ID NO: 19 umfasst, die synthetisierte DNA in einen Expressionsvektor inserieren, eine Wirtszelle mit dem Expressionsvektor transformieren und die Wirtszelle kultivieren, um die gewünschten Polypeptide zu produzieren.
Fachleute können solche Polypeptide durch irgendeine von einigen bekannten Techniken isolieren und reinigen; zum Beispiel Ionenaustausch-Chromatographie, Gelfiltrations-Chromatographie und Affinitätschromatographie. Solche Techniken können eine Modifikation des Proteins erfordern. Zum Beispiel kann man eine Histidin-Markierung zu dem Protein zufügen, um die Reinigung auf einer Nickelsäule zu ermöglichen.
Fachleute können die Polypeptide der Erfindung auf eine breite Vielzahl von Arten verwenden. Zum Beispiel kann man sie verwenden, um polyclonale oder monoclonale Antikörper herzustellen. Man kann solche Antikörper dann für einen Immunnachweis (z.B. Radioimmun-Test, Enzymimmun-Test oder Immuncytochemie), eine immun-Reinigung (z.B. Affinitätschromatographie) von Polypeptiden von verschiedenen Quellen oder eine Immuntherapie (d.h. für eine Kaliumkanal-Inhibition oder -Aktivierung) verwenden.
Fachleute können modifizierte KCNQ2-Polypeptide durch bekannte Techniken erzeugen. Solche Modifikationen können eine höhere oder niedrigere Aktivität bewirken, höhere Spiegel der Proteinproduktion erlauben oder die Reinigung des Proteins vereinfachen. Solche Modifikationen können helfen, spezifische KCNQ2-Aminosäuren, die in eine Bindung involviert sind, zu identifizieren, was im Gegenzug einer vernünftigen Arzneistoff-Gestaltung eines KCNQ2-Modulators helfen kann. Man kann Aminosäuresubstitutionen basierend auf einer Ähnlichkeit in der Polarität, der Ladung, der Löslichkeit, der Hydrophobie, der Hydrophilie und/oder des amphipatischen Wesens der involvierten Reste machen. Zum Beispiel schließen negativ geladene Aminosäuren Asparginsäure und Glutaminsäure ein; positiv geladene Aminosäuren schließen Lysin und Arginin ein; Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen oder nicht-polaren Kopfgruppen, die ähnliche Hydrophilie-Werte haben, schließen die folgenden ein: Leucin, Isoleucin, Valin, Glycin, Alanin; Aspargin, Glutamin; Serin, Threonin; Phenylalanin, Tyrosin. Alle solchen modifizierten Polypeptide sind im Rahmen der Erfindung eingeschlossen.
Die Erfinder ziehen eine Zahl von anderen Variationen der oben beschriebenen Polypeptide in Betracht. Solche Variationen schließen Salze und Ester der Polypeptide so wie Vorläufer der vorher erwähnten Polypeptide (z.B. die N-terminale Substituenten wie Methionin, N-Formylmethionin und Leader-Sequenzen haben) ein. Die Erfindung schließt alle solchen Variationen ein.
Verfahren zum Nachweisen von Nucleinsäuren
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Nachweisen von Nucleinsäuren, die ein KCNQ2-Protein codieren. In diesem Verfahren (a) bringt ein Fachmann Nucleinsäuren von unbekannter Sequenz mit einer Nucleinsäure in Kontakt, die eine Sequenz hat, die komplementär zu einer bekannten codierenden Sequenz ist (z.B. einer Sequenz von mindestens etwa 10 Nucleotiden von SEQ ID NO: 19, insbesondere den codierenden Regionen davon), worin die letztere Nucleinsäure einen nachweisbaren Marker aufweist; und (b) weist das Vorliegen des Markers nach, der an irgendeine der Nucleinsäuren von unbekannter Sequenz gebunden ist. Das Vorliegen des gebundenen Markers weist auf das Vorliegen der gewünschten Nucleinsäuren hin. Man kann dieses Verfahren anwenden, um KCNQ2-Nucleinsäuren von anderen Geweben (die andere regulatorische Elemente haben können) und Nucleinsäuren von anderen Arten (z.B. Affe) nachzuweisen.
Fachleute wissen im Allgemeinen, wie man Nucleinsäuren, die in diesem Verfahren analysiert werden sollen, erhält. Für genomische DNA kann man Gewebe schnell einfrieren, das Gewebe in leicht verdauliche Stücke brechen und das zerbrochene Gewebe in Proteinase K und SDS inkubieren, um die meisten zellulären Proteine abzubauen. Man kann dann die genomische DNA durch aufeinander folgende Phenol/Chloroform-Isoamylalkohol-Extraktionen vom Protein befreien, die DNA durch Ethanol-Präzipitation gewinnen, sie trocknen und sie in einem Puffer resuspendieren. Für RNA kann man gezüchtete Zellen in 4M Guanidinium-Lösung lysieren, das Lysat durch eine 20-Gauge-Nadel ziehen, die RNA durch einen Cäsiumchlorid-Stufengradienten pelletieren und den Überstand entfernen. Das Pellet sollte gereinigte RNA enthalten.
Der nachweisbare Marker kann ein radioaktives Ion sein, das an eines der Nucleotide der komplementären Nucleinsäure gebunden ist. Übliche radioaktive Markierungen sind ³²P und ³⁵S, obwohl man auch andere Markierungen wie Biotin verwenden kann. Fachleute kennen verschiedene Verfahren, um die Markierungen an die komplementäre Nucleinsäure zu binden (z.B. das zufällige Primer-Verfahren zur Bindung von ³²P oder ³⁵S).
Fachleute wissen im Allgemeinen, wie solch ein Nachweisverfahren von Nucleinsäuren ausgeführt wird. Zum Beispiel kann man einen Southern oder Northern Blot unter Verwendung einer radioaktiv markierten komplementären KCNQ-Oligonucleotid-Sonde durchführen. Man kann dann die Hybridisierung durch Autoradiographie nachweisen. Abhängig von dem Marker kann man auch andere Nachweisverfahren (z.B. Spektrophotometrie) verwenden.
Verfahren zum Nachweisen von KCNQ2/KCNQ3-Protein-Modulatoren
Diese Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zum Nachweisen von Modulatoren des KCNQ2-Proteins der vorliegenden Erfindung. Ein Screenen auf KCNQ-Protein-Modulatoren bedingt das Nachweisen der Bindung von Molekülen (z.B. Polypeptiden, natürlichen Produkten, synthetischen Verbindungen) in Zellen, die das KCNQ2-Protein exprimieren.
Das Clonieren und Sequenzieren des KCNQ2-Proteins ermöglicht die Konstruktion von Zellen, die im Screenen auf natürliche Produkte und synthetische Verbindungen, die an das KCNQ2-Protein binden und/oder dessen Aktivität modulieren, nützlich sind. Ein Nachweisverfahren für KCNQ2-Protein-Modulatoren erfordert das Transformieren eines geeigneten Vektors in kompatible Wirtszellen, wie es vorher hierin beschrieben wurde. Man behandelt solche transformierten Zellen mit Testsubstanzen (z.B. synthetischen Verbindungen oder natürlichen Produkten) und misst dann die Aktivität in der Anwesenheit oder Abwesenheit der Testsubstanz.
Gentherapie
Fachleute können auch Sense- und Antisense-Nucleinsäuremoleküle als therapeutische Mittel für mit KCNQ2 in Beziehung stehende Indikationen verwenden. Man kann Vektoren konstruieren, die die Synthese der erwünschten DNA oder RNA steuern oder die Nucleinsäure, wie auf dem Fachgebiet beschrieben, formulieren.
Einige Bezugnahmen beschreiben die Nützlichkeit eines Antisense-Moleküls. Siehe Toulme und Helene (1988), Gene 72: 51-8; Inouye (1988), Gene, 72: 25-34; Uhlmann und Peyman (1990), Chemical Reviews 90: 543-584; Biotechnology Newswatch (15. Januar, 1996), S. 4; Robertson, Nature Biotechnology 15: 209 (1997); Gibbons und Dzau (1996), Science 272: 689-93. Man kann sie basierend auf genomischer DNA und/oder cDNA, 5'- und 3'-flankierenden Kontrollregionen, anderen flankierenden Sequenzen, Intron-Sequenzen und nicht-klassischen Watson und Crick-Basenpaarungssequenzen, die in der Bildung einer Triplex-DNA verwendet werden, gestalten. Solche Antisense-Moleküle schließen Antisense-Oligoribonucleotide ein und können mindestens etwa 15 bis 25 Basen umfassen.
Antisense-Moleküle können nicht-kovalent oder kovalent an die KCNQ-DNA oder -RNA binden. Solch eine Bindung könnte zum Beispiel die KCNQ-DNA oder -RNA spalten oder deren Spaltung erleichtern, den Abbau von nukleärer oder cytoplasmatischer mRNA erhöhen oder die Transkription, die Translation, die Bindung von transaktivierenden Faktoren oder das prä-mRNA-Splicing oder -Prozessieren inhibieren. Antisense-Moleküle können auch zusätzliche Funktionalitäten enthalten, die die Stabilität, den Transport in und aus Zellen, die Bindungsaffinität, die Spaltung eines Zielmoleküls und dergleichen erhöhen. Alle diese Wirkungen würden die Expression des KCNQ2-Proteins erniedrigen und so die Antisense-Moleküle als KCNQ2-Protein-Modulatoren nützlich machen.
Detaillierte Beschreibung von menschlichem KCNQ2 und KCNQ3
Genetische Eigenschaften
KCNQ1-verwandte (KCNQ2/KCNQ3) exprimierte Sequenzmarkierungen (ESTs) wurden durch eine GCG-BLAST-Suche der GenBank-Datenbank mit einer KCNQ1-Sequenz entdeckt. Primer, die von den Konsensus-Sequenzen der EST-Clone abgeleitet wurden, wurden verwendet, um eine menschliche, vom Gehirn stammende cDNA zu amplifizieren, und 877 bp- und 325 bp-Fragmente wurden für KCNQ2 beziehungsweise KCNQ3 isoliert. (1, Sonde 1). Um die Volllängen-cDNA-Sequenzen von beiden Genen zu erhalten, wendeten wir die 5'-RACE-PCR, das Screenen von cDNA-Genbanken und Gen-Einfang("Gene Trapper")-Techniken an. Die zusammengesetzten Volllängen-cDNAs von KCNQ2 (SEQ ID NO: 19) und KCNQ3 (SEQ ID NO: 26) enthalten einen offenen Leserahmen (ORF), der ein 871 (SEQ ID NO: 20) beziehungsweise ein 854 (SEQ ID NO: 27)-Aminosäure-Polypeptid codiert (2 und 23). Eine DNA-Sequenzanalyse und eine konzeptionelle Translation von beiden cDNAs legt offen, dass sie Proteine mit den strukturellen Eigenschaften eines Spannungs-abgegrenzten Kaliumkanals codieren und äußerst nahe verwandt zu KCNQ1 sind. Sanguinetti et al. (1996), Nature 384: 80-83; Yang et al. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4017-2. KCNQ2 zeigt einen hohen Grad der Sequenzähnlichkeit mit KCNQ3 (= 70%), was darauf hinweist, dass sie zu derselben Unterfamilie gehören. Beide Proteine haben eine längere C-terminale Domäne (~200 Aminosäuren) als KCNQ1. Das Startcodon für KCNQ2 wird von einer Konsensus-Ribosomenbindungsstelle (d.h. Kozak) ACCATGG flankiert (2).
Auf Aminosäureebene legt die Sequenzanalyse offen, dass KCNQ2/KvLR1 die GYG (d.h. Gly-Tyr-Gly)-Kaliumkanalporen-„Kennungssequenz" enthält, daher wahrscheinlich einen Kalium-selektiven Kanal codiert. Ein Vergleich von KCNQ2 und KCNQ1 (KvLQT1) legt offen, dass die Aminosäuresequenz-Identität ungefähr 60% in den Transmembran- und Porenregionen ist (3). KCNQ3 zeigt etwa denselben Grad der Identität (etwa 56%) mit KCNQ1 in den Transmembran- und Porenregionen wie KCNQ2 (4). Die Identität in der Amino-terminalen und Carboxy-terminalen Domäne ist viel weniger im Vergleich zu den zentralen konservierten Regionen (3). Solche Ergebnisse legen nahe, dass KCNQ2/KvLR1 und KCNQ3/KvLR2 zusätzliche Mitglieder der KCNQ1/KvLQT1-Familie von Ionenkanälen sind.
KCNQ2- und KCNQ3-spezifische Transkripte sind nur im menschlichen Gehirn nachweisbar (5). Dieses Expressionsmuster ist verschieden von KCNQ1/KvLQT1, das stark im menschlichen Herz und Pankreas exprimiert wird, was durch Northern Blot-Analyse offen gelegt wurde. Sanguinetti et al. (1996) Nature 384: 80-83; Yang et al. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4017-2. Die Expression von menschlichem KCNQ2/KvLR1 ist hoch im Hippocampus, Nucleus caudatus und dem Mandelkern; mittel im Thalamus; und schwach im subthalamischen Nucleus, der Substantia nigra und dem Corpus callosum (5). Ein getrennter Northern Blot zeigt, dass die Expression von menschlichem KCNQ2/KvLR1 hoch im cerebralen Cortex ist; mittel im Putamen, dem temporalen Lappen, dem frontalen Lappen, dem occipitalen Pol und dem Cerebellum ist; und niedrig in der Medulla und im Rückenmark ist (5). KCNQ3 zeigt ein beinahe identisches Expressionsmuster im Gehirn (5). Um die Zelltypen, die KCNQ2/KvLR1 exprimieren, weiter zu charakterisieren, wurde ein Maus-spezifisches KCNQ2/KvLR1-cDNA-Fragment isoliert und als eine in situ-Hybridisierungssonde verwendet. Das Ergebnis (9) zeigt, dass KCNQ2/KvLR1 im Maus-Hippocampus und dem Gyrus dentatus, Bereichen, die wichtig für Lernen und Gedächtnis sind, exprimiert wird.
Elektrophysiologische Eigenschaften
Die menschlichen Volllängen-KCNQ2- und -KCNQ3-cDNAs wurden in einen Xenopus-Expressionsvektor subcloniert, und cRNA wurde durch in vitro-Transkription hergestellt. Die Eigenschaften der Kanäle, die durch menschliches KCNQ2 und KCNQ3 codiert werden, wurden durch Exprimieren der transkribierten cRNA in Xenopus-Oocyten untersucht. 6 vergleicht die Ströme, die von Oocyten aufgezeichnet wurden, die 5 Tage vorher mit entweder Wasser (6A) oder 14 ng menschlicher KCNQ2/KvLR1-cRNA (6B) injiziert wurden. Oocyten, die mit menschlicher KCNQ2/KvLR1-cRNA injiziert wurden, zeigten nach außen gerichtete Ströme, die bei Potentialen, die positiv bis –60 mV sind, aktivierten, und hatten eine maximale Amplitude von 1 μA bei +40 mV. Ähnliche Ströme wurden nie in Wasser-injizierten Kontrolloocyten beobachtet, und eine kleine undichte Stelle oder endogene Ströme, die in Kontrolloocyten aufgezeichnet wurden, überschritten nie 0,15 mA bei +40 mV. Die menschlichen KCNQ2/KvLR1-Ströme zeigten einen schnell aktivierenden verzögerten Gleichrichterstrom-Phänotyp, der sehr ähnlich zum hKCNQ1/KvLQT1-Strom war. Barhanin et al. (1996) Nature 384: 78-80; Sanguinetti et al. (1996), Nature 384: 80-83; Yang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4017-2. Der KCNQ2/KvLR1-Strom wurde bei positiven Spannungen schwach gleichgerichtet.
Obwohl die makroskopischen KCNQ2/KvLR1- und KCNQ1/KvLQT1-Ströme ähnlich sind, fehlt den KCNQ2/KvLR1-Schwanzströmen der „Haken", der mit KCNQ1/KvLQT1-Schwanzströmen beobachtet wird. 6C zeigt das Gipfelstrom-Spannungs (IV)-Verhältnis für Oocyten, die KCNQ2/KvLR1 exprimieren (n = 12). Die K⁺-Selektivität des exprimierten Stroms wurde durch Untersuchung der Schwanzstrom-Umkehrpotenziale in Badlösungen, enthaltend 2, 10, 40 und 98 mM K⁺, untersucht. Die Umkehrpotenziale folgten eng dem Nernst-Potenzial für K⁺, was einen K⁺-selektiven Kanal offenbarte (n = 6; 6D). Das Umkehrpotenzial für den KCNQ2/KvLR1-Strom verlagerte sich um 52 mV pro 10-facher Änderung im externen K. Die gestrichelte Linie hat einen Anstieg, der von der Nernst-Gleichung für einen perfekt selektiven K⁺-Kanal vorhergesagt wird.
Eine Familie von Strömen, die durch depolarisierende Spannungsschritte in einer Oocyte, die mit KCNQ3-cRNA injiziert wurde, hervorgerufen wurden, ist in 18A gezeigt. Die Ströme aktiveren bei Potenzialen, die positiv bis –70 mV sind, und bei Potenzialen, die größer als 0 mV sind, Einwärts-Gleichrichtes, was aus dem IV- Verhältnis offensichtlich ist (18B). Das KCNQ3-Umkehrpoteinzial verlagerte sich um 49 mV pro 10-facher Änderung im externen K⁺ (18C). Daher ist KCNQ3, obwohl es noch vorwiegend selektiv für K⁺ ist, etwas weniger K⁺-selektiv als KCNQ2.
Die Coexpression von KCNE1 (KCNE1 ist auch als „minK" oder „lsk" bekannt) mit KCNQ1/KvLQT1 ändert die Amplitude und die Gating-Kinetik des KCNQ1/KvLQT1-Stroms dramatisch. Barhanin et al. (1996) Nature 384: 78-80; Sanguinetti et al. (1996), Nature 384: 80-83; Yang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4017-2. MinK ist ein Polypeptid, von dem angenommen wird, dass es einen K⁺-Kanal codiert oder reguliert. Folander et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci USA 87: 2975-2979; Varnum et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11528-11532; Ben-Efraim et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 8768-8771. Diese Untersuchungen legen nahe, dass sich minK und KCNQ1/KvLQT1 gemeinsam anordnen, um den K⁺-Kanal zu bilden, der dem langsamen verzögerten Gleichrichterstrom im Herzen unterliegt. Eine ähnliche Assoziation zwischen minK und KCNQ2/KvLR1 wurde getestet. Die Coexpression von KCNE1 mit KCNQ2/KvLR1 hatte eine geringe Wirkung auf den KCNQ2/KvLR1-Strom in Oocyten, und getrennte Ströme, die durch KCNQ1/KvLQT1- und KCNQ2/KvLR1-Kanäle getragen werden, konnten in Oocyten, die mit minK und KCNQ2/KvLR1 co-injiziert wurden, unter Verwendung von selektiven Inhibitoren für jeden der Kanäle abgegrenzt werden. Daher interagiert KCNQ2/KvLR1 unterschiedlich mit KCNE1 als es KCNQ1/KvLQT1 tut. Andere KCNQ-Mitglieder können mit Proteinen, die strukturell ähnlich zu KCNE1 sind, funktionell interagieren.
Pharmakologische Eigenschaften
Inhibitoren von verschiedenen Kaliumkanälen, die im Gehirn oder anderen Geweben vorhanden sind, wurden verwendet, um die Pharmakologie von KCNQ2/KvLR1 zu untersuchen. Die Wirkungen von 0,2 mM 4-Aminopyridin (4-AP), 10 μM E-4031, 10 μM Clofilium, 0,1 mM Charybdotoxin und 1 mM Tetraethylammonium (TEA) auf die KCNQ2/KvLR1-Ströme, die von einer einzelnen Oocyte aufgezeichnet wurden, sind in 7 gezeigt. Jede dieser Verbindungen wurde auch alleine in individuellen Oocyten getestet, und die Wirkungen von jedem Mittel waren nicht anders.
Charybdotoxin ist ein Skorpiongift-Protein, das eine Vielzahl von Ca²⁺-aktivierten und spannungsabhängigen K⁺-Kanälen inhibiert. Miller et al. (1985), Nature 313: 316-8; Sugg et al. (1990), J. Biol. Chem. 265: 18745-8. Charybdotoxin inhibierte den KCNQ2/KvLR1-Strom bei den getesteten Konzentrationen nicht. Dieses Toxin hatte auch keine Wirkung auf KCNQ1/KvLQT1.
E-4031 (10 mM) ist ein selektiver Inhibitor von I_κr. Sanguinetti et al. (1990) J. Gen. Physiol. 96: 195-215. 4-AP (0,2 mM) ist ein Inhibitor von K⁺-Kanälen vom Shaker-Typ. Deal et al. (1996) Physiol. Rev. 76: 49-67. Weder E-4031 noch 4-AP erzeugten signifikante Wirkungen auf den KCNQ2/KvLR1-Strom. In ähnlicher Weise inhibieren beide Reagenzien nicht die KCNQ1/KvLQT1-Ströme. Yang et al. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4017-21.
TEA ist ein schwacher Inhibitor von KCNQ1/KvLQT1, wohingegen Clofilium ein starker Inhibitor von KCNQ1/KvLQT1 ist. Yang et al. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:. Clofilium inhibiert auch Herz-I_κr und -I_κs. Arena et al. (1988), Molecular Pharmacology 34: 60-66; Colatsky et al. (1990), Circulation 82: 2235-42. Im Gegensatz dazu hatte Clofilium für KCNQ2/KvLR1 eine geringe Wirkung, wohingegen TEA den Strom um über 85% bei einer Konzentration von 1 mM inhibierte.
Die Pharmakologie von KCNQ3 war signifikant anders als jene von KCNQ2 (18D). Clofilium (10 μM) reduzierte den KCNQ3-Strom um 30% von der Kontrolle, hatte aber eine geringe Wirkung auf KCNQ2. TEA, das KCNQ2 bei 1 mM stark inhibierte, produzierte bei 5 mM eine geringe Inhibition von KCNQ3. CTX (100 nM), 4-AP (2 mM) und E-4031 (10 μM) hatten auch keine Wirkung auf den KCNQ3-Strom.
Wie aus diesen Ergebnissen gesehen werden kann, sind die pharmakologischen Eigenschaften von KCNQ3/KvLR2, KCNQ2/KvLR1 und KCNQ1/KvLQT1 ziemlich verschieden.
KCNQ2 und KCNQ3 interagieren funktionell
Das überlappende Expressionsmuster von KCNQ2 und KCNQ3 in verschiedenen Gehirnregionen (5) veranlasste uns, auf eine funktionelle Interaktion zwischen den zwei Kanälen zu testen. Familien von Strömen, die durch depolarisierende Spannungsschritte in Oocyten, die mit KCNQ2 und KCNQ3 alleine und zusammen injiziert wurden, hervorgerufen wurden, sind in 19A bis 19C gezeigt. Strom-Amplituden, die von Oocyten, die die zwei Kanäle co-exprimieren, aufgezeichnet wurden, waren 15-mal größer als in Oocyten, die individuell mit jedem der Kanäle injiziert wurden. Peakstrom-Amplituden bei +30 mV für KCNQ2, KCNQ3 und KCNQ2 + KCNQ3 waren 0,98 ± 0,09 (n = 6), 0,98 ± 0,06 (n = 5) beziehungsweise 14,2 ± 0,62 μM (n = 6). Quantitativ ähnliche Ergebnisse wurden in 3 getrennten Chargen von Oocyten erhalten. Das IV-Verhältnis zeigt, dass KCNQ2 + KCNQ3-Ströme bei Potenzialen, die positiv bis –60 mV waren, aktivierten und im Gegensatz zu KCNQ2 und besonders KCNQ3 bei positiven Spannungen nicht gleichrichteten (19D). Das Umkehrpotenzial der Schwanzströme verschob sich um 57 mV pro 10-facher Änderung im externen K⁺, was darauf hinweist, dass KCNQ2 + KCNQ3 beinahe perfekt selektiv für K⁺ ist (19E). Der KCNQ2 + KCNQ3-Strom ist schwach sensitiv auf eine Inhibition durch 5 mM TEA und 10 μM Clofilium, aber nicht auf 100 nM CTX oder 2 mM 4-AP (19F). Auch E-4031 (10 μM) inhibierte nicht den KCNQ2 + KCNQ3-Strom (nicht gezeigt). Diese Ergebnisse legen stark nahe, dass KCNQ2 + KCNQ3 interagieren, um einen Kanal mit Eigenschaften zu bilden, die verschieden von entweder den KCNQ2- oder den KCNQ3-Kanälen alleine sind.
KCNE1 interagiert mit KCNQ2 + KCNQ3-Kanälen
Die β-Untereinheit KCNE1 ändert die Amplitude und die Gating-Kinetik des KCNQ1-Kanals dramatisch. Barhanin et al. (1996) Nature 384: 78-80; Sanguinetti et al. (1996), Nature 384: 80-83; Yang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4017-2; Romey et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 16713-16716. Weil KCNQ2 und KCNQ3 Mitglieder derselben K⁺-Kanal-Unterfamilie sind, testeten wir auf eine Interaktion zwischen KCNE1 und den KCNQ2 + KCNQ3-Kanälen. 20 zeigt Ströme, die durch 1 sec-depolarisierende Spannungsschritte in Oocyten hervorgerufen wurden, die KCNE1 alleine (20A), KCNQ2 + KCNQ3 (20B) und KCNQ2 + KCNQ3 + KCNE1 (20C) exprimieren. KCNE1 schwächte die KCNQ2 + KCNQ3-Stromamplitude signifikant ab und verlangsamte die Gating-Kinetik. Die Peakstrom-Amplitude bei +30 mV wurde in Oocyten, die KCNE1 co-exprimieren, um 62 ± 6,0% reduziert (n = 6). Aktivierende Ströme wurden an eine bi-exponentielle Funktion angepasst, um schnelle und langsame Zeitkonstanten der Aktivierung zu bestimmen. Schnelle und langsame Zeitkonstanten für die Aktivierung des KCNQ2 + KCNQ3-Stroms bei +10 mV waren 50,1 ± 3,4 (n = 6) beziehungsweise 239,3 ± 17,5 ms (n = 6); diese wurden auf 124,7 ± 8,8 (n = 5) und 680,7 ± 71,4 ms (n = 6) verlagert, wenn KCNE1 zusammen mit KCNQ2 + KCNQ3 injiziert wurde. Ähnliche Ergebnisse wurden in mehr als 15 Oocyten von jeder Gruppe in dieser und zwei zusätzlichen Chargen von Oocyten erhalten. KCNE1-Ströme scheinen aufgrund der Dauer (1 sec) der verwendeten Spannungsschritte und des Maßstabs, bei dem die Ströme gezeigt sind, zu fehlen. Wie jedoch deutlich im Einsatz in 20A gezeigt ist, riefen 5 sec-Spannungsschritte typische KCNE1-Ströme in derselben Oocyte hervor. Die Wirkung von KCNE1 auf die Gating-Kinetik ist ähnlich für KCNQ1- und KCNQ2 + KCNQ3-Kanäle. Im Gegensatz dazu steigert KCNE1 den KCNQ1-Strom aber inhibiert KCNQ2 + KCNQ3.
Die Ergebnisse erklären, warum Mutationen in jedem von zwei nicht verbundenen K⁺-Kanal-codierenden Genen denselben Phänotyp erbringen. BFNC-assoziierte Mutationen in sowohl KCNQ2 als auch KCNQ3 könnten eine schwere Reduktion in der KCNQ2 + KCNQ3-Stromamplitude bewirken. Eine Untersuchung hat gezeigt, dass eine BFNC-verursachende Mutation, die in einem nicht funktionellen, verkürzten KCNQ2-Protein resultiert, versagte, eine dominant-negative Inhibition von Wildtyp-KCNQ2-Kanälen, die in Oocyten exprimiert werden, zu produzieren. Biervert et al. (1998), Science 279: 403-406. Die vorliegende Erfindung, die eine synergistische Interaktion zwischen KCNQ2 und KCNQ3 zeigt, kann eine wahrscheinliche Erklärung für dieses Ergebnis liefern. Das heißt, Mutationen in KCNQ2 können nur dominant-negative Wirkungen produzieren, wenn sie mit den Wildtyp-KCNQ3-Kanälen co-exprimiert werden und umgekehrt.
Molekulargenetik
Neuere Fortschritte in der Molekulargenetik haben uns ermöglicht, Kaliumkanäle mit Krankheiten im Nervensystem zu korrelieren. Vor kurzem und wie oben diskutiert, wurde BFNC, eine Klasse von idiopathischer generalisierter Epilepsie, neulich mit Mutationen in KCNQ2 und KCNQ3 in Verbindung gebracht. Biervert et al., vorstehend; Charlier et al., vorstehend; und Singh et al., vorstehend. Die Identifizierung und Expression von menschlichem KCNQ2 und menschlichem KCNQ3 wird es uns ermöglichen, weitere Korrelationen mit BFNC und anderen potenziellen menschlichen Krankheiten zu untersuchen. Die vorliegende Erfindung wird jetzt Fachleuten erlauben, Modulatoren, z.B. Aktivatoren, von KCNQ2 und/oder KCNQ3 zu identifizieren. Modulatoren von KCNQ2 und/oder KCNQ3 können eine Gelegenheit zur Behandlung einer Krankheit wie BFNC bereitstellen. Zusätzlich können, weil menschliches KCNQ2 und KCNQ3 hochgradig in Bereichen exprimiert werden, die mit Lernen und Gedächtnis assoziiert sind, Modulatoren von KCNQ2 und/oder KCNQ3 auch eine Gelegenheit zur pharmakologischen Behandlung des Gedächtnisverlusts, der mit fortgeschrittenem Alter assoziiert ist, der Parkinson-Krankheit oder der Alzheimer-Krankheit liefern.
Murines KvLR1
Beginnend mit einer exprimierten Sequenzmarkierung (EST, öffentliche Domänen-Datenbank) des Gehirns, die ähnlich zu dem KvLQT1-Gen ist, wurde ein neues Kaliumkanal-Gen von einer Mausgehirn-Genbank cloniert und funktionell exprimiert. 10A bis 10D zeigt das murine KCNQ2/KvLR1-Gen (SEQ ID NO: 22), das ein Protein mit 722 Aminosäuren (SEQ ID NO: 23) und einem berechneten Molekulargewicht von 80,4 kDa codiert. Eine Hydropathie-Analyse (10E) illustriert, dass die Computererzeugte Topologie von KvLR1 6 Membran-umspannende Domänen und eine Poren-Domäne hat, die typisch für spannungsbegrenzte Kaliumkanäle sind.
Das Aminosäure-Alignment des murinen KCNQ2/KvLR1-Kanals mit dem murinen KCNQ1/KvLQT1-Kanal ist in 11 gezeigt. Insgesamt gibt es 40% Identität zwischen den zwei Kanälen mit 62,5% Identität innerhalb der umspannenden und Poren-Domänen. Eine phylogenetische Analyse legt nahe, dass das murine KCNQ2/KvLR1-Gen ein Mitglied der KCNQ1/KvLQT1-Genfamilie ist und entfernt verwandt mit dem HERG-Gen und anderen spannungsbegrenzten Familienmitgliedern ist. Kennungs-Aminosäuresequenzen, die charakteristisch für spannungsbegrenzte Kaliumkanäle sind, sind innerhalb des murinen KCNQ2/KvLR1 vorhanden; ein sich wiederholendes Argininmuster wird innerhalb der S4-umspannenden Domäne, die als der Spannungssensor bekannt ist, und eine GYG-Sequenz innerhalb der Porenregion gesehen. Eine weitere Analyse von einigen 3'-RACE-Clonen weist auf eine Diversität über die S6-Membran-umspannende Domäne hinaus hin. Bis jetzt sind zwei alternative Splice-Exons, A (SEQ ID NO: 13) und B (SEQ ID NO: 14), identifiziert worden, die Aminosäuresequenzen davon sind in 12 gezeigt.
Um die Gewebeverteilung von murinem KCNQ2/KvLR1 zu bestimmen, wurden ein Northern Blot mit einer Sonde des murinen KCNQ2/KvLR1-Kanals, die nicht die Poren- oder Spannungssensorregionen enthält, durchgeführt. Diese Sequenz des Gens vermeidet eine mögliche Kreuzreaktivität mit anderen Kanälen. Die Ergebnisse, die in 13 gezeigt sind, weisen auf eine äußerst reichliche 8,2 kb-Botschaft hin, die nur im Gehirn gefunden und nicht in periphären Geweben beobachtet wird. Obwohl nicht uneingeschränkt, wiesen längere Aussetzungszeiten des Northern Blots nicht auf das Vorliegen der Botschaft in den peripheren Geweben hin, angezeigt in 5.
Um eine höhere Auflösung der Botschafts-Lokalisierung innerhalb des Gehirns zu erhalten, wurde eine in situ-Hybridisierung durchgeführt. Ein positives Hybridisierungssignal mit einer Antisense-RNA-Sonde, die für eine nicht konservierte Region des KCNQ2/KvLR1-Gens spezifisch ist, wird mit einer weiten Verteilung quer durch den Großteil des Rattengehirns beobachtet. Die Maussonde war 99% identisch zu der Rattensequenz. Ein stabiles Signal wird jedoch mit einer eingeschränkteren Verteilung in den folgenden Regionen beobachtet: Cortex piriformis, Nucleus supraopticus, Mandelkern, Hippocampus, einschließlich der CA1-, 2- und 3-Regionen, und dem Gyrus dentatus, MO5 (Motornucleus des trigeminalen Hirnstamms), Nucleus facialis, Nucleus hypoglossis, dem inferioren Nuclei olivarii, den tiefen Nuclei cerebelli, den Nuclei gigantocellularii, den lateralen und medialen Nuclei vestibulari, den Motoneuronen des Rückenmarks und den sensorischen Neuronen des dorsalen Wurzelganglions. Moderate Spiegel des Hybridisierungssignals werden auch im Cortex, Septum, Striatum, Hypothalamus, Thalamus, der medialen Habenula, der Substantia nigra compacta, den Nuclei mammillarii, dem lateralen und medialen Geniculat, Nucleus interfasicularis, den Purkinje- und Granula-Zellen des Cerebellums, den Nuclei parabrachialii, den dorsalen und ventralen Nuclei cochlearii und anderen Hirnstamm-Nuclei beobachtet. Eine zusammengesetzte Ansicht der drei Regionen ist in 14 gezeigt.
Um auf eine funktionelle Expression zu testen, wurde cRNA des murinen KCNQ2/KvLR1-Gens hergestellt und in Xenopus-Oocyten injiziert. In einer Zweielektroden-Spannungsklammer wurde eine Familie von nach Außen gerichteten Strömen in mit muriner KCNQ2/KvLR1-cRNA injizierten Oocyten (n > 20) hergestellt. Nach einem Minimum von 48 Stunden waren die Ströme, die qualitativ und quantitativ anders als natürliche Ströme waren, die mit identischen Protokollen in Wasser-injizierten oder nicht-injizierten Kontrollzellen hergestellt wurden (die Ca²⁺-aktivierte Chloridströme und andere natürliche Ströme repräsentieren) (15). Die murinen KCNQ2/KvLR1-vermittelten Ströme wurden durch 1 mM TEA blockiert. Ähnliche Ströme wurden von CHO-Zellen erhalten, die murines KCNQ2 stabil exprimieren, und unter Verwendung von Patch-Clamp-Techniken aufgezeichnet. Von einzelnen Kanal-Leitwerten wurde geschätzt, dass sie 24-30 pS in symmetrischem 140 mM Kalium sind. (22).
Um festzustellen, ob murines KCNQ2/KvLR1 eine ähnliche Pharmakologie zu I_κs- und I_κr-Strömen in Herz-Myocyten hat, wurde Clofilium an Oocyten getestet, die murines KCNQ2 exprimieren. Bei 20 μM wurde für Clofilium gezeigt, dass es die murinen KCNQ2-vermittelten Ströme teilweise blockiert. Andere spezifische K⁺-Kanal-blockierende Toxine, einschließlich Iberiotoxin, α-Dendrotoxin und Charybdotoxin, hatten keine signifikante Wirkung auf murine KCNQ2-vermittelte Ströme.
Materialien und Verfahren
Menschliches KCNQ2
Molekulares Clonieren und Expression von menschlichem KCNQ2 (menschlichem KcLR1) und menschlichem KCNQ3 (menschlichem KvLR2)
Eine 5'-RACE-PCR wurde durch Amplifizieren von menschlichen Gehirn- oder fötalen Gehirn-cDNA-Genbanken oder Marathon-Ready-cDNAs (Clontech) unter Verwendung von Primern durchgeführt, die von den KvLQT1-verwandten EST-Sequenzen (EST# yn72g11, yo31c08, ys93a07 (die Sequenzen können in der Genbank-Datenbank gefunden werden)) abgeleitet wurden (1). Die PCR-Produkte wurden gelgereinigt, subcloniert und sequenziert. Zufällig geprimte ³²P-markierte DNA-Sonden, die spezifische Regionen der KCNQ2- oder KCNQ3-Sequenz enthalten, wurden für das Screenen von cDNA-Genbanken und eine Northern Blot-Analyse unter Verwendung eines Standardprotokolls verwendet. Zum Beispiel wurde die KCNQ2-Sonde I (1) für die Northern Blot-Analyse verwendet; die Sonde II (1) wurde für das Screenen von menschlichen Gehirn-cDNA-Genbanken gemäß Standardprotokollen verwendet.
Das Gen-Einfang-Experiment wurde unter Verwendung des Protokolls, wie es im Handbuch des Herstellers (LifeTechnologies) beschrieben ist, durchgeführt. Die zusammengesetzten menschlichen Volllängen-KCNQ2- und menschlichen KCNQ3-cDNA-Clone wurden durch Restriktionsenzymverdau und Ligierung von überlappenden cDNA-Clonen erhalten. Die Volllängen-cDNAs wurden in einen Xenopus-Expressionsvektor, der vom pSP64T-Plasmid stammt, subcloniert. Eine gekappte cRNA für die Mikroinjektion wurde unter Verwendung des mMESSAGE mMACHINE-Kits (Ambion) synthetisiert.
Für den Nachweis der Expression von KCNQ2, wie in den 9A und 9B gezeigt, wurden Gewebeverarbeitung, histologische Analysen und in situ-Hybridisierungsanalysen im Wesentlichen, wie in Fagan et al. (1996), J. Neurosci. 16 (19): 6208-18 beschrieben, durchgeführt.
Elektrophysiologische und pharmakologische Charakterisierung von KCNQ2 und KCNQ3
Stadium V- und VI-Xenopus laevis-Oocyten wurden mit einer Kollagenase-Behandlung von Follikeln befreit und mit cRNAs, wie in Yang et al., vorstehend, beschrieben, injiziert. Die Ströme wurden bei Zimmertemperatur unter Verwendung der zwei-Mikroelektroden-Spannungsklammer (Dagan TEV-200)-Technik zwischen 3-5 Tage nach der Injektion von KCNQ2- (15 ng), KCNQ3- (15 ng) oder KCNE1- (2 ng) cRNA alleine oder in Kombination aufgezeichnet. Die Mikroelektroden (0,8 bis 1,5 MΩ) wurden mit 3 M KCl gefüllt. Die Badlösung enthielt (in mM): 96 NaCl, 2 KCl, 0,4-1,8 CaCl₂, 1-2 MgCl₂ und 5 HEPES (pH 7,5). KCl wurde in manchen Experimenten durch eine äquimolare Substitution mit NaCl variiert.
Die K⁺-Selektivität wurde durch Bestimmen der Anhängigkeit des Schwanzstrom-Umkehrpotenzials von der externen K⁺-Konzentration bewertet. Die Schwanzströme wurden bei Potenzialen von –110 bis +10 mV nach einem Spannungsschritt auf +20 mV hervorgerufen, während die externe K⁺-Konzentration zwischen 2, 10, 40 und 98 mM variiert wurde. Das Strom-Umkehrpotenzial bei jeder Bedingung wurde für jede Oocyte durch Messen des Null-Abschnitts von einem Stück der Schwanzstrom-Amplitude gegen ein Testpotenzial bestimmt.
Axoclamp (Axon Instruments) wurde für das Herstellen von Spannungsklammer-Anweisungen und das Beschaffen von Daten verwendet, und Axograph 3.0 (Axon Instruments) wurde für die Datenanalyse verwendet. Alle Daten wurden in einer Frequent von mindestens zweimal der niedrigen Filter-Durchgangsgeschwindigkeit abgefragt. Die Experimente wurden bei 22-25°C durchgeführt. Clofilium wurde von RBI Biochemicals erhalten, und 4-Aminopyridin (4-AP), TEA und Charybdotoxin wurden von Sigma Chemical Co. erhalten. E-4031 wurde mittels der Information, die durch Esai Research Laboratories veröffentlicht wurde, synthetisiert.
Murines KvLR1
Sondenherstellung und Genbank-Screening
Eine einzigartige exprimierte Sequenzmarkierung (EST), die eine Ähnlichkeit zum KvLQT-Gen aufweist, wurde aus der öffentlichen Datenbank identifiziert. Die Oligonucleotidprimer wurden für die PCR-Experimente aus der EST-Sequenz synthetisiert. Der Vorwärtsprimer (SEQ ID NO: 15) war
5'-GAG TAT GAG AAG AGC TCG GA-3',
und der Rückwärtsprimer (SEQ ID NO: 16) war
5'-CAG ATG TGG CAA AGA CGT TGC-3'.
Rattengehirn-polyA⁺-RNA wurde mit zufälligen Hexameren revers transkribiert und durch PCR [60 sec 94°C, 90 sec 55°C, 120 sec 72°C, 30 Zyklen] mit den obigen Primern amplifiziert. Ein 240 bp-DNA-Fragment von Ratten-KCNQ2/KvLR1 wurde durch Gelelektrophorese isoliert und in pCRII (InVitrogen) subcloniert. Das 240 bp-DNA-Fragment wurde mit ³²P-dCTP zufällig grundmarkiert und als eine Sonde verwendet, um eine Mausgehirn-pcDNA1-Plasmid-Genbank (Clontech, Palo Alto, CA) zu screenen. Insgesamt wurden 2 × 10⁵ Kolonien unter Verwendung des Filterhebe-Standardprotokolls gescreent. Die Filter wurden über Nacht in 50% Formamid, 2 × PIPES und 1% SDS bei 42°C hybridisiert und 1× in 1 × SSC, dann 3 × 20 Minuten in 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 53°C gewaschen. Die Filter wurden über Nacht bei –70°C ausgesetzt. Nur eine positive Kolonie wurde identifiziert und wieder plattiert, bis sie gereinigt war. Clon mbr 26.1, der murines KvLR1 genannt wurde, wurde an beiden Strängen durch Didesoxy-Terminierungsreaktionen sequenziert.
Northern Blot
Northern Blots wurden mit dem Maus-Blot für mehrere Gewebe (Clontech) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Kurz, der Blot wurde bei 68°C mit ExpressHyb-Lösung für 30 Minuten vorhybridisiert. Ein DNA-Fragment wurde von der murinen KvLR1-codierenden Region durch das Restriktionsenzym PvuII, das die Poren- und Spannungssensor-Konsensussequenzen eliminierte, isoliert und mit ³²P-dCTP zufällig grundmarkiert, bei 100°C für 5 Minuten denaturiert, auf Eis gekühlt und vor der Zugabe zum Northern Blot zu frischem ExpressHyb zugefügt. Der Blot wurde für 60 Minuten bei 68°C unter dauerndem Schwenken inkubiert. Der Blot wurde 2× bei 50°C in 0,1 × SSC und 0,1% SDS gewaschen. Der Blot wurde in Saranfolie gepackt und über Nacht bei Zimmertemperatur einem Röntgenfilm ausgesetzt. Dasselbe Protokoll wurde für die Actin-Sonde, die mit dem Blot geliefert wurde, verwendet.
In situ-Hybridisierung
Gefrorene Schnitte, die in Abständen von 225 μm durch das gesamte erwachsene Rattengehirn geschnitten wurden, wurden durch Eintauchen (ohne Auftauen) in eiskaltes 10% Formaldehyd in PBS für 20 Minuten fixiert und mit PBS abgespült. Die fixierten Schnitte des Ratten-DRG wurden mit 0,5% Triton X-100 in 0,1 M Tris, pH 8,0, und 0,05 M EDTA für 30 Minuten behandelt und für 3 Minuten in 0,1 M Tris, pH 8,0, und 0,05 M EDTA gespült. Das Gewebe wurde dann mit 0,1 M TEA, pH 8,0, plus 0,25% saures Anhydrid für 10 Minuten bei Zimmertemperatur behandelt, in 2 × SSC gespült (3×), durch eine Reihe von Alkoholen dehydriert, in Chloroform von Lipiden befreit und luftgetrocknet.
Die RNA-Sonden wurden unter Verwendung des Promega Riboprobe-Transcription System II mit 250 μCi ³⁵S-UTP und 250 μCi ³⁵S-CTP in einem Gesamtreaktionsvolumen von 10 μL synthetisiert. Unmarkiertes UTP und CTP wurden zu je 25 μM und ATP und GTP zu je 500 μM zugefügt. Das murine KCNQ2/KvLR1-Plasmid (nts 552-1125, subcloniert in pBluescript II) wurde mit SacI linearisiert und unter Verwendung der T3-RNA-Polymerase transkribiert, und mit BamHI und unter Verwendung der SP6-RNA-Polymerase transkribiert, um Antisense- beziehungsweise Sense-Sonden herzustellen. Ein μg linearisiertes Plasmid wurde für jede Reaktion zugefügt. Die RNA-Sonden wurden durch Phenol:Chloroform-Extraktion und zwei Ethanol-Präzipitationen unter Verwendung von Ammoniumacetat gereinigt. Die getrockneten Gewebeschnitte wurden mit 1 × 10⁷ cpm/ml RNA-Sonde in Hybridisierungspuffer (50% Formamid, 0,3 M NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 1 × Denhardt-Lösung, 10% Dextransulfat, 500 μg/ml tRNA und 10 mM DTT) über Nacht bei 55°C hybridisiert. Die Hybridisierungslösung wurde durch viermaliges Spülen in 4 × SSC, 5 Minuten für jeden Waschschritt, entfernt. Die Schnitte wurden in 0,02 mg/ml RNase, 0,5 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, und 1 mM EDTA für 30 Minuten bei 37°C inkubiert, dann in 2 × SSC, 1 × SSC und 0,5 × SSC, alle 1 mM DTT enthaltend, für 10 Minuten pro Waschschritt bei Zimmertemperatur gewaschen. Die Gewebe wurden in 0,1 × SSC, 1 mM DTT für 30 Minuten bei 55°C inkubiert, dann kurz in 0,1 × SSC und 1 mM DTT bei Zimmertemperatur abgespült, dehydriert und luftgetrocknet. Die getrockneten Schnitte wurden einem XOMAT-Film (Kodak, Rochester, NY) ausgesetzt, wurden dann in NTB2-Emulsion (Kodak, Rochester, NY) eingetaucht, um die zelluläre Lokalisierung von jeder mRNA zu bestimmen.
Expression und Aufzeichnung in Oocyten
Die murinen KCNQ2/KvLR1-cDNAs wurden mit dem Restriktionsenzym NotI linearisiert und unter Verwendung des mMessage mMachine T7 RNA-Polymerase-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers (Ambion, Austin, TX) in vitro transkribiert. Die cRNAs wurden in RNase-freiem Wasser gelöst und bei –70°C in einer Konzentration von 1,0 μg/μl gelagert. Frosch-Oocyten wurden vorbereitet und unter Verwendung von Standardtechniken (Colman, 1984) injiziert. In murinen KvLR1-Expressionsexperimenten wurde jede Oocyte mit ungefähr 35-40 nl der cRNA injiziert. Nach der Injektion wurden die Oocyten bei 17°C in ND96-Medium, bestehend aus (in mM): NaCl, 90; KCl, 1,0; CaCl₂, 1,0; MgCl₂, 1,0; HEPES, 5,0; pH 7,5, belassen. Pferdeserum und Penicillin/Streptomycin, je 5% des Endvolumens, wurden als Ergänzungen zum Inkubationsmedium zugefügt. Eine elektrophysiologische Aufzeichnung begann 2-6 Tage nach der cRNA-Injektion. Vor dem Beginn eines Experiments wurden die Oocyten in eine Aufzeichnungskammer platziert und in modifizierter Barth-Lösung (MBS), bestehend aus (in mM): NaCl, 88; NaHCO₃, 2,4; KCl, 1,0; HEPES, 10; MgSO₄, 0,82; Ca(NO₃)₂, 0,33; CaCl₂, 0,41; pH 7,5, inkubiert. Oocyten wurden mit Elektroden (1-2 MΩ) aufgespießt, und 2-Elektroden-Spannungsklammer-Standardtechniken wurden angewendet, um Membranströme der ganzen Zelle aufzuzeichnen (Stuhmer, 1992; TEC 200, Dagan Instruments). Spannungsklammer-Protokolle bestanden typischerweise aus einer Reihe von Spannungsschritten von 100-500 ms-Dauer in +10 mV-Schritten von einem Haltepotenzial von –60 mV bis –90 mV zu einem maximalen Potenzial von +40 mV bis +50 mV; Aufzeichnungen wurden bei 5 kHz digitalisiert und auf einem Computer unter Verwendung der pClamp 6.0-Software (Axon Instruments) gespeichert und unter Verwendung der ClampFit- oder AxoGraph-Software (Axon Instruments) analysiert.
Expression und Aufzeichnung in CHO-Zellen
Patch-Clamp-Aufzeichnungen wurden von CHO-Zellen erhalten, die transient oder stabil murine KCNQ2-Kanäle exprimierten. Die Elektroden wurden unter Verwendung eines PC-84 Sachs-Flaming-Pippentenziehgerätes (Sutter Instruments) vorbereitet und auf eine endgültige Spitzenresistenz von 3-5 MΩ feuerpoliert. Die Pipetten wurden mit einer Lösung gefüllt, die aus (in mM) KCl (140), MOPS (20), K₂EGTA (1,0), CaCl₂ (0,89), ph 7,2, bestand. Die Pipettenlösung enthielt manchmal MgCl₂ (1,0), um bei der Dichtungsbildung zu helfen. Die Zellen wurden auf Poly-D-Lysin-beschichteten Deckgläsern gezüchtet, und Stücke der Deckgläser, die CHO-Zellen enthielten, wurden für die Aufzeichnung in eine Kammer auf einem invertierten Mikroskop platziert. Vor der Aufzeichnung und während der Dichtungsbildung wurden die Zellen in einer externen Lösung gebadet, die aus (in mM) NaCl (145), KCl (3), CaCl₂ (2,5), MgCl₂ (1,0), HEPES (10), pH 7,4, bestand. Die Elektroden wurden unter visueller Betrachtung auf die Oberfläche der Zellen abgesenkt; nach einer Giga-Dichtungsbildung wurden umgedrehte Membranstücke in eine interne Lösung, bestehend aus (in mM) KCl (140), MOPS (20), K₂EGTA (1,0), CaCl₂ (0,89), pH 7,2, ausgeschnitten. Alle Aufzeichnungen wurden unter symmetrischen K⁺-Bedingungen gemacht. Nach dem Ausschneiden des Stückes wurden kontinuierliche und Schritt-Protokoll-Spannungsklammer-Aufzeichnungen erhalten und Analysen unter Verwendung eines AxoPatch 200B-Patch Clamp-Amplifizierers und der pClamp-Software (Axon Instruments) durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 22 gezeigt.
Obwohl die vorliegende Erfindung durch Veranschaulichung und Beispiel zu Zwecken der Klarheit und des Verstehens in einem gewissen Detail beschrieben worden ist, wird es offensichtlich werden, dass bestimmte Änderungen und Modifikationen innerhalb des Rahmens der angefügten Ansprüche praktiziert werden können.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Nucleinsäuremolekül, umfassend: (a) Polynucleotide, die das in 2 gezeigte Polypeptid (menschliches KCNQ2) codieren; (b) Polynucleotide, die die in 2 gezeigte Nucleinsäure (menschliches KCNQ2) umfassen; (c) Polynucleotide, die zu den Polynucleotiden nach (a) oder (b) im genetischen Code degeneriert sind; oder (d) Polynucleotide, die mindestens 80% Sequenzidentität zu den Polynucleotiden nach (a) bis (c) aufweisen und die ein Polypeptid mit Kaliumkanal-Aktivität codieren; oder einen komplementären Strang eines solchen Polynucleotids.
Vektor, der das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 umfasst.
Prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle, die den Vektor nach Anspruch 2 umfasst.
Protein oder Polypeptid, das von dem Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 codiert wird.
Verfahren zum Screenen einer Verbindung, die die Aktivität des wie in Anspruch 4 definierten KCNQ2-Proteins oder -Polypeptids modulieren kann, umfassend: (a) das Bereitstellen einer Wirtszelle nach Anspruch 3; (b) das Bestimmen der Aktivität des KCNQ2-Proteins in der Abwesenheit der Verbindung; (c) das Inkontaktbringen der Zelle mit der Verbindung; und (d) das Bestimmen der Aktivität des KCNQ2-Proteins in der Anwesenheit der Verbindung, wobei ein Unterschied zwischen der Aktivität des KCNQ2-Proteins in der Anwesenheit der Verbindung und in der Abwesenheit der Verbindung eine modulierende Verbindung anzeigt.
Antikörper, der spezifisch für das Protein oder Polypeptid nach Anspruch 4 ist.
Antikörper nach Anspruch 6, wobei der Antikörper ein monoclonaler Antikörper ist.
Antisense-Molekül, bestehend aus Oligoribonucleotiden, das an das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 bindet.
Arzneimittel, umfassend das Protein oder Polypeptid nach Anspruch 4, das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, den Antikörper nach Anspruch 6 oder 7 oder das Antisense-Molekül nach Anspruch 8.
Verwendung einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) einem Nucleinsäuremolekül umfassend: (i) Polynucleotide, die das Polypeptid oder einen Teil davon wie in 2 gezeigt (menschliches KCNQ2) codieren, wobei der Teil Kaliumkanal-Aktivität hat; (ii) Polynucleotide, die die gesamte oder einen Teil einer Nucleinsäuresequenz wie in 2 gezeigt (menschliches KCNQ2) umfassen, wobei der Teil ein Polypeptid mit Kaliumkanal-Aktivität codiert; (iii) Polynucleotide, die zu den Polynucleotiden nach (i) oder (ii) im genetischen Code degeneriert sind; oder (iv) Polynucleotide, die mindestens 80% Sequenzidentität zu den Polynucleotiden nach (i) bis (iii) aufweisen und die ein Polypeptid mit Kaliumkanal-Aktivität codieren; oder einen komplementären Strang eines solchen Polynucleotids; (b) einem Polypeptid, das von dem Nucleinsäuremolekül nach (a) codiert wird; (c) einem Antikörper, der spezifisch für das Protein nach (b) ist; und (d) einem Antisense-Molekül, das an das Nucleinsäuremolekül nach (a) bindet für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Ataxie, Myokymie, epileptischen Anfällen, Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, altersassoziierten Gedächtnisverlust, Lernschwierigkeiten, Motorneuronerkrankungen oder Schlaganfall.