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Bereich der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäuren und Proteine für den menschlichen
Kaliumkanal KCNQ2 sowie verwandte Vektoren, Wirtszellen, Herstellungsverfahren
und Verfahren der Verwendung. Die vorliegende Erfindung betrifft
auch Antikörper,
die spezifisch für
das menschliche KCNQ2-Protein sind. In der vorliegenden Erfindung
sind Screening-Verfahren für
Verbindungen eingeschlossen, die an das hierin offenbarte Kaliumkanal-Protein
binden und/oder es anderweitig modulieren.
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Hintergrund der Erfindung
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Unter
den Ionenkanälen
sind die Kaliumionen (K+)-Kanäle die am
häufigsten
vorkommenden und verschiedenartigsten. Sie schließen drei
strukturellen Hauptklassen ein – Kanäle mit sechs,
vier oder zwei Transmembran-Domänen.
Die Kaliumkanäle
mit sechs Transmembran-Domänen
werden weiter in verschiedene Familien wie Shaker-ähnliche,
eag-ähnliche
und Slo-ähnliche
Kaliumkanäle
unterteilt. Die kürzliche
Identifizierung von KvLQT1 etablierte eine neue Familie von sechs-Transmembran-Kaliumkanälen. Barhanin
et al. (1996) Nature 384: 78-80; Sanguinetti et al. (1996) Nature
384: 80-83; Yang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4017-22;
Wang et al. (1996) Nature Genetics 12: 17-23. Das Durchsuchen von
DNA- und Proteinsequenz-Datenbanken
legt zusätzliche
potenzielle Mitglieder von KvLQT1-verwandten Kanälen in C. elegans sowie im
Menschen offen. Wei et al. (1996), Neuropharmacology 35: 805-29;
Yang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4017-2.
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Ein
oder mehrere Typ(en) von K+-Kanälen befindet/befinden
sich auf Zellmembranen, wo er/sie bemerkenswert selektiv für K+ gegenüber
anderen Ionen ist/sind. In anregbaren Zellen modulieren K+-Kanäle
die Aktionspotenzial-Konfiguration.
Das Ausfließen
von Kalium ist der Hauptmechanismus für die Repolarisierung, das
Beibehalten und die Hyperpolarisierung eines ruhenden Membranpotenzials.
Halliwell (1990) in Potassium channels-structure, classification,
function and therapeutic potential (N. S. Cook, Hrsg.); 348-381;
Jan, L. Y. und Jan, Y. N. (1992), Ann. Rev. Physiol. 54: 537-55;
Pongs (1992), Physiol. Rev. 72: S69-S88.
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In
Neuronen regulieren K+-Kanäle die neuronale
Erregbarkeit, die Form und das Auslösungsmuster des Aktionspotenzials
und die Neurotransmitter-Freigabe. Diese Kanäle können durch verschiedene Stimuli wie
intrazelluläre
sekundäre
Botenstoffe, Membranpotenzial, Ionen und Neurotransmitter versperrt
werden. Hille (1992), Ionic channels of excitable membranes; Catterall
(1995), Ann. Rev. Biochem. 64: 493-531. Neuronale K+-Kanäle sind
kritisch für
solche neuronalen Funktionen wie Neurotransmission und Neuroprotektion, und
sie können
Wahrnehmungsvermögen,
Lernen, Verhalten und dergleichen beeinflussen.
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Vor
kurzem wurde die Nomenklatur für
KvLQT1 und die KvLQT1-verwandten Kanäle geändert. Biervert et al. (1998),
Science 279: 403-406. KvLQT1 wurde zu KCNQ1 umbenannt, und die KvLQT1-verwandten Kanäle (KvLR1
und KvLR2) wurden zu KCNQ2 beziehungsweise KCNQ3 umbenannt. Daher
ist im Verlauf dieser Beschreibung die Bezugnahme auf KCNQ1 äquivalent
zu KvLQT1; die Bezugnahme auf KCNQ2 ist äquivalent zu KvLR1; und die
Bezugnahme auf KCNQ3 ist äquivalent
zu KvLR2.
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Benigne
familiäre
neonatale Konvulsionen („BFNC"), eine Klasse der
generalisierten idiopathischen Epilepsie, ist eine autosomal dominant
vererbte Störung
von Neugeborenen. BFNC ist vor kurzem mit Mutationen in zwei mutmaßlichen
K+-Kanalgenen, KCNQ2 und KCNQ3, in Verbindung
gebracht worden. Biervert et al., vorstehend; Charlier et al. (1998),
Nature Genetics 18: 53-55; Singh et al. (1998) Nature Genetics 18: 25-29.
Eine vorläufige
funktionelle Charakterisierung von KCNQ2 bestätigte, dass dieses Gen einen
spannungsaktivierten K+-Kanal codiert. Singh
et al., vorstehend.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung offenbart den Nervensystem-spezifischen Kaliumkanal,
der hierin als KCNQ2 (früher
KvLR1 genannt) bezeichnet wird. Hierin wird auch der Nervensystem-spezifische
Kaliumkanal KCNQ3 (früher
KvLR2 genannt) beschrieben. Menschliches KCNQ2 (2)
liegt innerhalb der vorliegenden Erfindung. Menschliches KCNQ3 (23), murines KCNQ2 (10)
und Ratten-KCNQ2 (16 und 17) sind hierin beschrieben. Die Erfindung
umspannt die Aminosäuresequenzen
des menschlichen KCNQ2-Proteins und die Nucleinsäuresequenzen, die das Protein
codieren, sowie Variationen in den Nucleinsäuresequenzen aufgrund der Degeneriertheit
im genetischen Code.
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Die
vorliegende Erfindung liefert: (a) ein gereinigtes und isoliertes
Nucleinsäuremolekül, das ein KCNQ2-Protein
der vorliegenden Erfindung codiert; (b) Nucleinsäuresequenzen, die komplementär zu (a) sind,
oder (c) Nucleinsäuresequenzen,
die mindestens 80% Sequenzidentität, mehr bevorzugt mindestens 90%,
mehr bevorzugt mindestens 95% und am meisten bevorzugt mindestens
98% Sequenzidentität
zu (a) haben. Hierin wird auch ein Fragment von (a) oder (b) beschrieben,
das an (a) oder (b) unter stringenten Bedingungen hybridisieren
wird, wobei das Fragment vorzugsweise mindestens 15 Nucleotide umfasst.
Die Nucleinsäuresequenzen,
die das KCNQ2-Protein der vorliegenden Erfindung codieren, werden
in SEQ ID NO: 19 des Sequenzprotokolls, das als Anhang veröffentlicht
ist, gefunden. Das hierin beschriebene KCNQ3-Protein ist in SEQ
ID NO: 26 gezeigt.
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Die
Erfindung umfasst: (a) Aminosäuresequenzen,
umfassend das KCNQ2-Protein
der vorliegenden Erfindung; und (b) Aminosäuresequenzen, die mindestens
80%, mehr bevorzugt mindestens 90%, mehr bevorzugt mindestens 95%
und am meisten bevorzugt mindestens 98% Sequenzidentität zu (a)
haben. Die Aminosäuresequenz,
umfassend das KCNQ2-Protein der vorliegenden Erfindung, wird in
SEQ ID NO: 20 gefunden. Die Aminosäuresequenz des KCNQ3-Proteins
wird in SEQ ID NO: 27 gefunden, die als Anhang veröffentlicht
ist.
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Die
Erfindung betrifft darüber
hinaus neue Nucleinsäuren
und assoziierte Vektoren, Wirtszellen und Verfahren zur Verwendung.
Vorzugsweise ist das Nucleinsäuremolekül ein DNA-Molekül. Darüber hinaus
werden Nucleotidsequenzen, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 20
codieren, sowie Proteine, die etwa 80% oder mehr identisch zu dieser
Sequenz sind, bevorzugt. Es werden auch Nucleotidsequenzen bevorzugt, die
etwa 80% oder mehr identisch zu SEQ ID NO: 19 sind.
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Die
Erfindung betrifft darüber
hinaus Nucleinsäuren,
die durch PCR mit degenerierten Oligonucleotidprimern erhalten wurden.
Fachleute könnten
solche Primer basierend auf der Konsensus-Sequenz, die hierin beschrieben
wird, entwerfen. PCR-Techniken sind in White et al. (1989), Trends
Genet. 5: 185-9, beschrieben.
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Diese
Erfindung betrifft darüber
hinaus Nucleinsäure-Vektoren,
die eine Nucleinsäuresequenz,
die das KCNQ2-Protein codiert, umfassen, Wirtszellen, die solche
Vektoren enthalten, und Polypeptide, die die Aminosäuresequenz
des KCNQ2-Proteins umfassen. Vorzugsweise codiert der Vektor ein
Volllängen-KCNQ2-Protein, und das
Polypeptid ist ein Volllängen-KCNQ2-Protein.
Die Erfinder bevorzugen Frosch-Expressionsvektoren wie pSP64T oder
Derivate davon (Melton et al. (1984), Nucl. Acids Res. 12: 7057-70);
Säugerzell-Expressionsvektoren
wie pcDNA3 (erhältlich
von Invitrogen); oder Bakterienzell-Expressionsvektoren wie pET30
(erhältlich
von Novagen oder Promega).
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Diese
Erfindung betrifft darüber
hinaus Wirtszellen, die mit den oben beschriebenen Vektoren transformiert
wurden. Die Erfinder bevorzugen Xenopus-Oocyten, Säuger-Zellen (z.B. HEK293, CHO,
L929) und Bakterienzellen (z.B. E. coli, insbesondere BL21(DE3),
erhältlich
von Novagen). Die Erfinder bevorzugen insbesondere die Zellen, die
als ATCC-Hinterlegungsnummer CRL-1573 (American Type Culture Collection, 10801
University Boulevard, Manassas VA 20110-2209) hinterlegt sind.
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Die
Erfindung betrifft auch Verfahren zum Nachweisen von Nucleinsäuren, die
ein KCNQ2-Protein codieren, und Verfahren zum Nachweisen von Molekülen, die
an das KCNQ2-Protein binden und/oder anderweitig seine Aktivität modulieren. „Modulieren" umspannt sowohl
Kanalöffner/-aktivierer
als auch Kanalschließer/-inaktivierer.
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Die
Erfindung betrifft auch Verfahren zum Modulieren des KCNQ2-Proteins,
insbesondere Verfahren des Öffnens/Aktivierens
oder Schließens/Inaktivierens
des KCNQ2-Kanals. Zusätzlich
beschreibt die vorliegende Anwendung eine Verwendung eines Verfahrens
zum Behandeln einer Krankheit durch Modulieren der Aktivität des KCNQ2-Proteins.
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Beschreibung
der Zeichnungen
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1 zeigt
die Isolierung einer menschlichen Volllängen-KCNQ2/KvLR1-cDNA. Eine menschliche Volllängen-KCNQ2/KvLR1-cDNA
wurde von zwei überlappenden
cDNA-Clonen abgeleitet. "S1" bis „S6" bezeichnen die Transmembran-Domänen 1 bis
6; „H5" bezeichnet die Poren-bildende
Domäne
(diese Domäne wird
hierin auch als die „P"-Domäne bezeichnet);
ORF, der offene Leserahmen; 3'-UTR,
die 3'-nicht translatierten
Regionen. Die Lokalisierung von verschiedenen EST-Clonen und Sonden
sind auch gezeigt. (Die Figur ist nicht im Maßstab gezeichnet.)
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Die 2A bis 2F zeigen
die Nucleotid- (SEQ ID NO: 19) und die abgeleitete Aminosäuresequenz
(SEQ ID NO: 20) von menschlichem KCNQ2/KvLR1.
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3 zeigt
einen Sequenzvergleich von menschlichem KCNQ2/KvLR1 (SEQ ID NO:
20) und menschlichem KCNQ1/KvLQT1 (SEQ ID NO: 21). „|" bezeichnet eine
Aminosäuresequenzidentität. Die C-terminalen Aminosäuren von
beiden Proteinen sind nicht gezeigt.
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4 zeigt
einen Sequenzvergleich von menschlichem KCNQ3/KvLR2 (SEQ ID NO:
18) und menschlichem KCNQ1/KvLQT1 (SEQ ID NO: 21). „|" bezeichnet eine
Aminosäuresequenzidentität. Die C-terminalen Aminosäuren von
beiden Proteinen sind nicht gezeigt. Die N-terminalen Aminosäuren von
KCNQ3/KvLR2 sind nicht gezeigt.
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5 zeigt die Expression von KCNQ2/KvLR1
und KCNQ3/KvLR2 in menschlichen Geweben und verschiedenen Teilen
des menschlichen Gehirns. 5A zeigt
KCNQ2/KvLR1. 5B zeigt KCNQ3/KvLR2. Poly(A+)-mRNA-Northern
Blots wurden individuell an radioaktiv markierte KCNQ2-spezifische
(5A) oder KCNQ3-spezifische (5B)
Sonden hybridisiert. RNA-Molekulargewichtsmarker sind auf der linken
Seite angezeigt.
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6 zeigt eine funktionelle Charakterisierung
von KCNQ2/KvLR1-Strömen
in Xenopus-Oocyten.
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In
den 6A und 6B werden
Familien von Strömen
von Wasser-injizierten
(6A) und menschliche KCNQ2/KvLR1-cRNA-injizierten
(6B) Oocyten durch 1 Sekunden-Spannungsschritte
von einem Haltepotenzial von –80
mV hervorgerufen, um Potenziale im Bereich von –100 bis +40 mV in 10 mV-Schritten
zu testen.
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6C zeigt
das Peakstrom-Spannungs (I-V)-Verhältnis für Oocyten, die menschliches KCNQ2/KvLR1
exprimieren. Die Ströme
wurden unter Verwendung des Protokolls aufgezeichnet, das oben für die 6A und 6B beschrieben
wurde.
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6D zeigt
die Abhängigkeit
des Schwanzstrom-Umkehrpotenzials (Erev)
von der externen K+-Konzentration. Die Schwanzströme wurden
bei Potenzialen von –110
bis +10 mV nach einem 1 Sekunden Puls auf +20 mV ausgelöst (n =
6 Oocyten), während
die externe K+-Konzentration zwischen 2,
10, 40 und 98 mM variiert wurde. Erev unter
jeder Bedingung wurde für
jede Oocyte durch Messen des Null-Abschnitts "zero intercept" von einer Aufzeichnung der Schwanzstrom-Amplitude
gegen das Testpotenzial bestimmt. Die gestrichelte Linie hat einen
Anstieg von 58 mV und ist gemäß der Nernst-Gleichung
für einen
perfekt selektiven K+-Kanal gezeichnet.
Die Daten sind die Mittelwerte ± SEM von sechs Experimenten.
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7 zeigt
die pharmakologische Charakterisierung von KCNQ2/KvLR1-Strömen in Xenopus-Oocyten.
Insbesondere zeigt diese Figur die Wirkungen von E-4031, 4-AP, TEA,
Charybdotoxin und Clofilium auf den menschlichen KCNQ2/KvLR1-Strom. Überlagernde
Ströme
wurden während
1 Sekunden-Schritten von –80
mM auf +30 mV während
desselben Experiments aufgezeichnet. Die Verbindungen wurden über eine
Badperfusion geordnet von oben nach unten aufgetragen. Das Bad wurde
zwischen den Verbindungen für
5 Minuten oder bis die Wirkungen vollkommen aufgehoben waren mit
einer Kontrolllösung
perfundiert. Ähnliche
Ergebnisse wurden in drei zusätzlichen
Oocyten erhalten.
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8 zeigt die Co-Expression von minK und
menschlichem KCNQ2/KvLR1 in Xenopus-Oocyten.
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8A zeigt
die Wirkung von 1 mM TEA auf Membranströme, die von einer Oocyte aufgezeichnet wurden,
die mit menschlichem KCNQ2/KvLR1 alleine injiziert wurde. Überlagernde
Ströme
wurden während
1 Sekunden-Spannungsschritten von einem Haltepotenzial von –80 mV auf
+40 mV vor und nach dem Auftragen von TEA über das Bad aufgezeichnet.
TEA reduzierte den menschlichen KCNQ2/KvLR1-Strom um über 80%.
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8B zeigt
die Wirkung von 1 mM TEA auf die Membranströme, die von einer Oocyte aufgezeichnet wurden,
die mit minK und menschlichem KCNQ2/KvLR1 injiziert wurde. Die Ströme wurden
unter Verwendung des Protokolls in 8A hervorgerufen.
TEA inhibierte teilweise die minK + menschlichen KCNQ2/KvLR1-Ströme, die
Amplitude und Kinetik der TEA-unempfindlichen Stromkomponente waren
jedoch ähnlich
zu den Strömen,
die in Oocyten beobachtet wurden, die mit minK alleine injiziert
wurden.
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9 zeigt die Expression von murinem KCNQ2/KvLR1
im Gehirn einer erwachsenen Maus. 9A ist
eine Dunkelfeld-Fotographie einer koronalen Sektion durch ein erwachsenes
Mausgehirn, das mit einer radioaktiv markierten Antisense-KCNQ2/KvLR1-Sonde
hybridisiert wurde, was die KCNQ2/KvLR1-Transkripte in den Pyramidenzell-Schichten
des Hippocampus zeigt. Niedrigere Spiegel der Expression wurden
in den granulären
Zellschichten des Gyrus dentatus nachgewiesen.
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9B ist
eine Dunkelfeld-Fotographie einer ähnlichen Region, wie in 9A gezeigt,
aber mit einer Sense-Sonde hybridisiert; Mit dieser Sonde wurde
wenig KvLR1-spezifische Expression nachgewiesen. Vergrößerung:
125× sowohl
für 9A als
auch 9B.
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9C zeigt
eine teilweise murine KCNQ2/KvLR1-Nucleotidsequenz und -Aminosäuresequenz.
Diese Sequenz wurde durch eine PCR-Amplifizierung einer Mausgehirn-cDNA-Genbank
unter Verwendung der Oligonucleotide MABms 278 und MABms 315 basierend
auf der menschlichen KCNQ2/KvLR1-Sequenz erhalten. Die PCR-Fragmente
wurden isoliert, subcloniert und sequenziert. Ein 226 bp-Fragment,
wie oben gezeigt, wurde in einer Sonde für die in situ-Hybridisierung
verwendet. Die Nucleotidsequenz ist 80% identisch zum menschlichen
KCNQ2/KvLR1 (96% Identität
in der Aminosäuresequenz).
MABms
278:
5'-GGCCGAATTCTGTTTCTCAGCAGCTCCAGC-3'
MABms 315:
5'-GCGCGAATTCGAGCAGCACAGGCA(A/G)AA(A/G)CA-3'
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10A bis 10D zeigen
die DNA- und die translatierte Aminosäuresequenz des Mausgehirn-KCNQ2/KvLR1-Gens. 10E zeigt eine Hydropathie-Analyse des Mausgehirn-KCNQ2/KvLR1-Gens. Hydropathie-Aufzeichnung offenbart
das Muster, das für
spannungsempfindliche K+-Kanäle mit 6
mutmaßlichen
Membran-umspannenden Domänen
(S1-S6) und einer Poren-Region (P) typisch ist.
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11 zeigt
ein Sequenzalignment der Mausherz-KCNQ1/KvLQT1- und Mausgehirn-KCNQ2/KvLR1-Kaliumkanäle. Das
Alignment dieser zwei Gene zeigt eine 40% Gesamt-Aminosäureidentität (angezeigt
durch die schattierten Bereiche) und 62,5% Identität innerhalb
der umspannenden und der Poren-Domänen. Die mutmaßlichen
Membran-umspannenden und Poren-Domänen sind durch die Boxen angezeigt.
Die Zeichnungssequenz für
einen Kaliumkanal, GYG, wird innerhalb der Poren-Region beobachtet,
und der Spannungssensor RXXQXXRXXR liegt innerhalb der S4-Domäne.
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12 zeigt
Exons für
das alternative splicing im 3'-Ende
von murinem KCNQ2/KvLR1. Mindestens 2 Exons für das Splicing, die, wenn sie
translatiert werden, die in A und B gezeigten Aminosäuresequenzen ergeben,
sind im murinen KCNQ2/KvLR1-Gen bei den Aminosäurepositionen 372 beziehungsweise
406 identifiziert worden.
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13 zeigt
einen Northern Blot von mehreren Mausgeweben. Ein Northern Blot
wurde mit einem Fragment des Maus-KCNQ2/KvLR1-Gens (Nucleotide 1140-2306) sondiert. Ein
einziges Transkript von 8,2 kb wird im Gehirn beobachtet, wird aber
in anderen Geweben nicht gesehen.
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14 zeigt die in situ-Hybridisierung eines
Rattengehirns. Die Zusammensetzung zeigt drei Regionen, wo die Ratten-KCNQ2/KvLR1-Botschaft
stark exprimiert wird. Die Antisense-Sonden zeigen ein starkes Signal
im Hippocampus, dem Gyrus dentatus, dem Cortex und dem motorischen
Nucleus des Nervus trigeminus. Sense-Sonden-Kontrollen zeigen wenig
Hintergrund.
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15 zeigt die elektrophysiologische Charakterisierung
des Maus-KCNQ2/KvLR1-vermittelten Stroms
der Gesamtzelle, der in Xenopus-Oocyten exprimiert wird. In 15A produzierten 10 mV-Schritt-Depolarisierungen
von –80
zu +40 eine Familie von nach Außen
gerichteten Strömen,
die signifikant verschieden von den Kontrollzellen waren. Die Zugabe
von 1 mM TEA blockierte die KvLR1-vermittelten Ströme, und
Hintergrund-Chlorid-Ströme
wurden nicht durch TEA beeinflusst. Von Clofilium, einem Blocker
von Herz-Iκs-
und Iκr-Strömen, wurde gezeigt,
dass es die KCNQ2/KvLR1-vermittelten Ströme teilweise blockiert, wenn
sie von –80
auf +40 μV
depolarisiert wurden. 15B zeigt
nicht injizierte Kontrollen.
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16 zeigt ein Alignment der Konsensus-Nucleotidsequenz
(SEQ ID NO: 1) und der Nucleotidsequenzen des menschlichen KCNQ3/KvLR2
(SEQ ID NO: 26), des menschlichen KCNQ2/KvLR1 (SEQ ID NO: 19), des
Maus-KCNQ2/KvLR1 (SEQ ID NO: 22) und des Ratten-KCNQ2/KvLR1 (SEQ
ID NO: 7). „|" bezeichnet eine
Sequenzidentität; „–" stellt eine Nicht-Konsensus-Sequenz
dar; und „*" bezeichnet eine
Lücke,
die eingebracht wurde, um die Sequenzidentität zu optimieren.
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17 zeigt ein Alignment der Konsensus-Aminosäuresequenz
(SEQ ID NO: 2) und der Aminosäuresequenzen
der menschlichen KCNQ3/KvLR2- (SEQ ID NO: 27), der menschlichen
KCNQ2/KvLR1- (SEQ ID NO: 20), der Maus-KCNQ2/KvLR1- (SEQ ID NO: 23) und der
Ratten-KCNQ2/KvLR1- (SEQ ID NO: 8) Proteine. Wie in 16 bezeichnet „|"eine Sequenzidentität; „–" stellt eine Nicht-Konsensus-Sequenz
dar; und „*" bezeichnet eine
Lücke,
die eingebracht wurde, um die Sequenzidentität zu optimieren.
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18 zeigt die funktionelle Charakterisierung
von KCNQ3-Strömen. 18A zeigt Familien von Strömen von KCNQ3-cRNA-injizierten
Oocyten, die durch 1 Sek-Spannungsschritte von einem Haltepotenzial von –80 mV hervorgerufen
wurden, um die Potenziale im Bereich von –70 bis +50 mV in 10 mV-Schritten
zu testen. 18B zeigt das I-V-Verhältnis für Oocyten,
die KCNQ3 exprimieren (n = 6). Die Ströme wurden unter Verwendung
des Protokolls in 18A aufgezeichnet. 18C zeigt die Abhängigkeit des Schwanzstroms Erev von der externen K+-Konzentration.
Die Linie hat einen Anstieg, der durch die Nernst-Gleichung für einen perfekt
selektiven K+-Kanal vorhergesagt wird. Jeder
Wert ist der Mittelwert ± SEM
von 6 Oocyten. 18D zeigt die Wirkungen von
E-4031, 4-AP, TEA und Clofilium auf den KCNQ3-Strom. Überlagernde
Ströme
wurden während
1 Sek-Schritten von –80
mM auf +20 mV während
desselben Experiments aufgezeichnet. Die Verbindungen wurden über eine
Badperfusion geordnet von oben nach unten aufgetragen. Das Bad wurde zwischen
den Verbindungen für
5 Minuten oder bis die Wirkungen vollkommen aufgehoben waren mit
einer Kontrolllösung
perfundiert. Ähnliche
Ergebnisse wurden in drei zusätzlichen
Oocyten erhalten.
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19 zeigt die Co-Expression von KCNQ2 und
KCNQ3. 19A zeigt Familien von Strömen von KCNQ2-, 19B von KCNQ3- und 19C von
KCNQ2 + KCNQ3-cRNA-injizierten Oocyten, die durch 1 Sek-Spannungsschritte
von einem Haltepotenzial von –80
mV hervorgerufen wurden, um die Potenziale im Bereich von –70 bis
+50 mV (10 mV-Schritte) zu testen. 19D zeigt
das Strom-Spannungs
(I-V)-Verhältnis für Oocyten,
die KCNQ2 + KCNQ3 exprimieren (n = 6). Die Ströme wurden unter Verwendung
des Protokolls in den 19A-19C aufgezeichnet. 19E zeigt
die Abhängigkeit
des Schwanzstrom-Umkehrpotenzials
(Erev) von der externen K+-Konzentration.
Die gestrichelte Linie hat einen Anstieg, der durch die Nernst-Gleichung
für einen
perfekt selektiven K+-Kanal vorhergesagt
wird. Jeder Wert ist der Mittelwert ± SEM von 6 Oocyten. 19F zeigt die Wirkungen von 4-AP, TEA, Charybdotoxin
und Clofilium auf den KCNQ2 + KCNQ3-Strom. Überlagernde Ströme wurden
während
1 Sekunden-Schritten
von –80
mM auf +20 mV während
desselben Experiments aufgezeichnet. Die Verbindungen wurden über eine
Badperfusion in der Reihenfolge von oben nach unten aufgetragen. Ähnliche
Ergebnisse wurden in 4 zusätzlichen
Oocyten erhalten.
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20 zeigt die Interaktion von KCNE1 (minK)
mit KCNQ2 + KCNQ3-Strömen. Familien
von Strömen von
KCNE1- (20A), KCNQ2 + KCNQ3- (20B) und KCNQ2 + KCNQ3 + KCNE1- (20C) cRNA-injizierten Oocyten, die durch 1 Sek-Spannungsschritte
von einem Haltepotenzial von –80
mV hervorgerufen wurden, um die Potenziale im Bereich von –70 bis
+50 mV (10 mV-Schritte) zu testen. Der Einsatz von 20A zeigt KCNE1-Ströme, die durch 5 Sek-Spannungsschritte
von –80
mV zu Potenzialen von –30
bis +50 mV (20 mV-Schritte) in derselben Oocyte hervorgerufen wurden.
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21 ist ein Foto einer in situ-Hybridisierung
mit Ratten-KCNQ2, das einen Querschnitt des Rückenmarks der Ratte zeigt. 21(A) ist bei niedriger Vergrößerung (55×); einige
Bereiche können
mit einem relativ hohen Signal visualisiert werden. 21(B) ist
bei hoher Vergrößerung (322×); jeder
Bereich mit hohem Signal ist eine Zelle, und durch ihre Größe scheinen
sie Motoneuronen zu sein.
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22A zeigt den makroskopischen murinen KCNQ2-Strom,
der durch ein umgedrehtes Membanstück, das von einer CHO Zelle
ausgeschnitten wurde, die stabil murines KCNQ2 exprimiert, aufgezeichnet wurde.
Der Strom zeigt eine langsame Aktivierung und Auswärts-Gleichrichtung. 22B zeigt eine Patch-Clamp-Aufzeichung von einzelnen Kanalströmen in einem
ausgeschnittenen Stück
mit Innenseite nach Außen
von einer CHO/murinen KCNQ2-Zelle. Es gibt mindesten 2 Kanäle in dem
Stück.
Es wurde geschätzt, dass
die Einzelkanal-Leitfähigkeit
von KCNQ2 zwischen 24 und 30 pS liegt. Alle Aufzeichnungen wurden
in einem symmetrischen 140 mM K+ unter Verwendung
von Standardtechniken gemacht.
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23 zeigt die Nucleotid- und abgeleitete
Aminosäuresequenz
von menschlichem KCNQ3 (hierin auch als KvLR2 bezeichnet).
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Die
folgenden Definitionen betreffen Begriffe, die im Verlauf dieser
Beschreibung verwendet werden, außer wenn es anderweitig unter
besonderen Umständen
definiert wird:
„Clonieren" – Isolierung eines bestimmten
Gens aus genetischem Material, zum Beispiel einem Genom, einer genomischen
Genbank oder einer cDNA-Genbank,
in eine Plasmid oder einen anderen Vektor;
„KvLR-Protein" – ein Protein, das mindestens
etwa 70% Identität
mit der Konsensus-Sequenz
hat. Es kann auch als ein „KCNQ-Protein", „KvLR/KCNQ-Protein" oder „KCNQ/KvLR-Protein" bezeichnet werden.
„KCNQ1" – das Protein, das früher als
KvLQT1 bekannt war.
„KCNQ2" – das Protein, das früher als
KvLR1 bekannt war.
"KCNQ3" – das Protein, das früher als
KvLR2 bekannt war.
„stringente
Bedingungen" (wie
im Bezug auf die Nucleinsäure-Hybridisierung
verwendet) – Zum
Beispiel Southern-Blotting, gewaschen in 1 × SSC und 0,1% SDS bei einer
Temperatur von mindestens etwa 42°C.
Für zusätzliche
stringente Bedingungen siehe Maniatis et al., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, NY (1982).
„Vielkopien-Plasmid" – ein Plasmid, das mehr als
eine Kopie in einer Zelle vorhanden hat (typischerweise 10 bis 30
Kopien);
„Northern-Blotting" – ein Verfahren der Identifizierung
von bestimmten RNA-Fragmenten
durch Hybridisierung mit einer komplementären Nucleinsäure, typischerweise
einer cDNA oder einem Oligonucleotid;
„offener Leserahmen” oder „ORF" – eine DNA-Sequenz, die eine
Reihe von Nucleotid-Tripletts enthält, die Aminosäuren codieren
und denen jegliche Terminierungs-Codons fehlen;
„Plasmid" – cytoplasmatische, autonom
replizierende DNA-Elemente, die in Mikroorganismen gefunden werden;
„Promotor" – eine Region auf der DNA,
an der RNA-Polymerase bindet und die Transkription iniziiert; und
„Southern-Blotting" – ein Verfahren des Identifizierens
von bestimmten DNA-Fragmenten
durch Hybridisierung mit einer komplementären Nucleinsäure, typischerweise
einer cDNA oder einem Oligonucleotid.
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Für Definitionen
von anderen Begriffen in dieser Beschreibung siehe F. Sherman et
al., Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics, Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1987) und Lewin,
B., Genes IV, Oxford University Press, Oxford (1990).
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Die
folgenden Definitionen betreffen Abkürzungen in dieser Beschreibung,
außer
wenn es in spezifischen Umständen
anderweitig definiert ist:
- BFNC
- benigne familiäre neonatale
Konvulsionen
- BLAST
- basic local alignment
search tool – grundlegendes
lokales Anpassungs-Suchinstrument
- CHO
- Chinesische Hamster-Ovarzellen
- DTT
- Dithiothreitol
- DRG
- dorsales Wurzelganglion
- EDTA
- Ethylendiamin-Tetraessigsäure
- EST
- expressed sequence
tags – exprimierte
Sequenzmarkierungen
- GPCR
- G-Protein-gekoppelter
Rezeptor
- ORF
- offener Leserahmen
- PAGE
- Polyacrylamid-Gelelektrophorese
- PBS
- phosphatgepufferte
Salzlösung
- PCR
- Polymerase-Kettenreaktion
- SDS
- Natriumdodecylsulfat
- SSC
- Puffer, enthaltend
150 mM NaCl, 15 mM Na3-Citrat·2H2O, pH 7,0.
- TEA
- Tetraethylammonium
-
Für zusätzliche
Abkürzungen
siehe Aldrichimica Acta, Bd. 17, Nr. 1 (1984).
-
Verwendung und Nutzen
-
Fachleute
nehmen an, dass die KCNQ2-Proteine in die Neurotransmission involviert
sein können. Fachleute
können
das KCNQ2-Protein der vorliegenden Erfindung verwenden, um auf Modulatoren
von KCNQ2 zu testen. KCNQ2-Modulatoren
würden
in der Behandlung von solchen Störungen
wie Ataxie, Myokymie, Anfällen
(z.B. epileptischen Anfällen),
Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit,
alters-assoziiertem Gedächtnisverlust,
Lernschwierigkeiten, Motoneuronenerkrankungen, Schlaganfall und
dergleichen nützlich sein.
-
Weil
KCNQ2 ein Nervensystem-selektiver Kaliumkanal ist, wird die Arzneistoff-Spezifität in jedem KCNQ2-spezifischen
Modulator eingebaut. Ein Arzneimittel, das spezifisch für das KCNQ2-Protein
ist, würde daher
Nebenwirkungen auf periphäre
Gewebe, die Kaliumkanäle
enthalten, vermeiden. Signifikanterweise würde ein KCNQ2-spezifischer
Modulator Nebenwirkungen auf das Herz, das zahlreiche Typen von
Kaliumkanälen
enthält,
vermeiden.
-
Die
KCNQ2-Nucleinsäuren
der vorliegenden Erfindung oder Antisense-Nucleinsäuren können nützliche therapeutische oder
diagnostische Mittel sein. Für
solch eine Gentherapie können
die Nucleinsäuren
in Vektoren inkorporiert und/oder formuliert werden, wie unten und
in weiterem Detail auf dem Fachgebiet beschrieben.
-
Fachleute
können
die Polypeptide und Nucleinsäuren
dieser Erfindung verwenden, um Vektoren, Zellen oder Zelllinien
und Antikörper
herzustellen. Alle von diesen sind nützlich in Tests für die Identifizierung
von KCNQ2-Protein-Modulatoren.
-
Man
kann KCNQ2-Protein-Modulatoren an verschiedene Säugerarten wie Affen, Hunde,
Katzen, Mäuse,
Ratten, Menschen, usw. verabreichen. Fachleute der Pharmazie können durch
bekannte Verfahren KCNQ2-Protein-Modulatoren in eine konventionelle
systemische Dosierungsform wie eine Tablette, Kapsel, ein Elixier
oder ein injizierbares Präparat
inkorporieren. Die obigen Dosierungsformen werden auch jegliches notwendige
physiologisch verträgliche
Trägermaterial,
Vehikel, Gleitmittel, jeglichen Puffer, jegliches antibakterielle
Quellungsmittel (wie Mannit), jegliche Antioxidanzien (Ascorbinsäure oder
Natriumbisulfit) oder dergleichen einschließen.
-
Herstellungsverfahren
-
Im Allgemeinen
-
Diese
Beschreibung beschreibt das Clonieren und die funktionelle Expression
eines menschlichen Volllängen-cDNA-Clons
von KCNQ2 (KvLR1), vorzugsweise der menschlichen KCNQ2-Nucleinsäuresequenz (2), wie in SEQ ID NO: 19 gezeigt, und
der menschlichen KCNQ2-Aminosäuresequenz
(2), wie in SEQ ID NO: 20 gezeigt.
Es wird auch ein menschlicher Volllängen-cDNA-Clon von KCNQ3 (KvLR2)
(23) und ein muriner Volllängen-cDNA-Clon
von KCNQ2 (murines KvLR1; 10) offenbart.
Die menschliche KCNQ3- und die murine KCNQ2-Nucleinsäuresequenzen sind in den SEQ
ID NOs: 26 beziehungsweise 22 gezeigt. Die korrespondierenden Aminosäuresequenzen
sind in den SEQ ID NOs: 27 beziehungsweise 23 gezeigt. Zusätzlich beschreibt
die vorliegende Anmeldung eine Ratten-KCNQ2-Sequenz (16 und 17). Die
Ratten-KCNQ2-Nucleinsäuresequenz
ist in SEQ ID NO: 7 gezeigt, und die Ratten-KCNQ2-Aminosäuresequenz
ist in SEQ ID NO: 8 gezeigt. Die Versperrungskinetik und die makroskopischen
Strom-Eigenschaften der menschlichen, murinen und Ratten-KCNQ2- und -KCNQ3-Ströme sind ähnlich zu
jenen von KCNQ1. KCNQ2 und KCNQ3 sind jedoch spezifisch im Nervensystem
lokalisiert und haben andere pharmakologische Eigenschaften.
-
Nucleinsäuren
-
Mit
den menschlichen KCNQ2-, menschlichen KCNQ3-, murinen KCNQ2- und
Ratten-KCNQ2-Gensequenzen in der Hand kann ein Fachmann KCNQ-Nucleinsäuren dieser
Erfindung durch bekannte Verfahren erhalten. Solche Verfahren schließen ein:
(1) Southern- und Northern-Blotting; (2) Western Immunblotting;
(3) chemische Synthese; (4) Synthese durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
von Primern; (5) Expressions-Clonierung; und (6) subtraktive cDNA-Clonierung.
-
Fachleute
können
auch die Nucleinsäuren,
die das KCNQ2-Protein der vorliegenden Erfindung codieren, modifizieren,
um nützliche
Mutationen herzustellen. Zum Beispiel kann man die Sequenz modifizieren,
um zusätzliche
Restriktionsendonuclease-Erkennungsstellen in der Nucleinsäure bereitzustellen.
Solche Mutationen können
still sein oder können
die Aminosäure ändern, die
durch das mutierte Codon codiert wird. Man kann diese modifizierten
Nucleinsäuren
zum Beispiel durch Mutieren der Nucleinsäure, die KCNQ2 codiert, herstellen,
um in einer Deletion, Substitution, Insertion, Inversion oder Addition
von einer oder mehreren Aminosäuren
im codierten Polypeptid zu resultieren. Für Verfahren der ortsgerichteten
Mutagenese siehe Taylor, J. W. et al. (1985), Nucl. Acids Res. 13,
8749-64 und Kunkel, J. A. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 482-92.
Zusätzlich
sind Kits für
eine ortsgerichtete Mutagenese von kommerziellen Vertreibern erhältlich (z.B. BioRad
Laboratories, Richmond, CA; Amersham Corp., Arlington Heights, IL).
Für Verfahren
zur Zerstörung, Deletion
und Verkürzung
siehe Sayers, J. R. et al. (1988), Nucl. Acids Res. 16: 791-800.
-
Diese
Erfindung umfasst auch modifizierte Nucleinsäuren, einschließlich (1)
Varianten von Exons zum alternativen Splicing; (2) Allel-Varianten;
und (3) chimerische Kanäle,
in denen das Fusionskonstrukt eine KCNQ-modulierende Stelle umfasst.
Solche modifizierten Nucleinsäuren
können
von Fachleuten erhalten werden, wenn sie mit der vorliegenden Offenbarung
ausgestattet sind.
-
Expressionsvektoren
-
Diese
Erfindung betrifft darüber
hinaus Expressionsvektoren, die eine Nucleotidsequenz umfassen, die
das KCNQ2-Protein der vorliegenden Erfindung codiert. Vorzugsweise
umfassen die Expressionsvektoren die gesamte Nucleinsäuresequenz,
wie in SEQ ID NO: 19 gezeigt.
-
Expressionsvektoren
sind normalerweise Plasmide, aber die Erfindung schließt andere
Vektorformen ein, die äquivalente
Funktionen liefern und auf dem Fachgebiet hierzu danach bekannt
werden. Ein Fachmann könnte
auch eine Sequenz, die ein KCNQ2-Protein codiert, stabil in das
Chromosom einer geeigneten Wirtszelle integrieren.
-
Expressionsvektoren
enthalten typischerweise regulatorische Elemente, die zum Beeinflussen
der Expression eines KCNQ2-Proteins in der Lage sind. Diese regulatorischen
Elemente können
heterologe oder natürliche
KCNQ2-Elemente sein. Typischerweise enthält ein Vektor einen Replikationsursprung,
einen Promotor und eine Transkriptions-Terminierungssequenz. Der
Vektor kann auch andere regulatorische Sequenzen einschließen, einschließlich mRNA-Stabilitätssequenzen,
die die Stabilität
des Expressionsprodukts bereitstellen; sekretorische Leader-Sequenzen, die die
Sekretion des Expressionsprodukts bereitstellen; Umwelt-Feedback-Sequenzen,
die die Expression des zu modulierenden Strukturgens ermöglichen
(z.B. durch das Vorliegen oder Fehlen von Nährstoffen oder anderen Induzierern
im Wachstumsmedium); Markierungssequenzen, die zum Liefern einer
phänotypischen
Selektion in transformierten Wirtszellen in der Lage sind; Restriktionsstellen,
die Stellen für
die Spaltung durch Restriktionsendonucleasen bereitstellen; und
Sequenzen, die die Expression in verschiedenen Typen von Wirten,
einschließlich
Prokaryonten, Hefen, Pilzen, Pflanzen und höheren Eukaryonten, ermöglichen.
-
Ein
Expressionsvektor dieser Erfindung ist zumindest zum Steuern der
Replikation und vorzugsweise der Expression der Nucleinsäuren und
des Proteins dieser Erfindung in der Lage. Geeignete Replikationsursprünge schließen zum
Beispiel die Col E1-, die SV40-, virale und die M13-Replikationsursprünge ein.
Geeignete Promotoren schließen
zum Beispiel den Cytomegalievirus-Promotor, den lacZ-Promotor, den
gal10-Promotor und den polyhedralen Autographa californica multiples
nukleäres
Polyhedrosis-Virus (AcMNPV)-Promotor ein. Geeignete Terminierungssequenzen
schließen
zum Beispiel die Polyadenylierungssignale des bovinen Wachstumshormons,
von SV40, lacZ und des polyhedralen AcMNPV ein. Beispiele von selektierbaren
Markern schließen
die Neomycin-, Ampicillin- und Hygromycin-Resistenz und dergleichen
ein.
-
Fachleute
können
eine DNA, die ein KCNQ2-Protein der vorliegenden Erfindung codiert,
in einige kommerziell erhältliche
Vektoren inserieren. Beispiele schließen Vektoren, die mit Säugerzellen
kompatibel sind, wie pcDNA3 oder pCEP4; Baculovirus-Vektoren wie
pBlueBac; prokaryontische Vektoren wie pcDNA2; und Hefe-Vektoren
wie pYes2 ein. Für
Vektor-Modifizierungsverfahren siehe Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, NY.
-
Wirtszellen
-
Diese
Erfindung betrifft zusätzlich
Wirtszellen, die einen Expressionsvektor enthalten, der eine Sequenz
umfasst, die ein KCNQ2-Protein der vorliegenden Erfindung codiert.
Die Wirtszellen enthalten vorzugsweise einen Expressionsvektor,
der die gesamte oder einen Teil der DNA-Sequenz umfasst, die die
Nucleinsäure
aufweist, im Wesentlichen wie sie in SEQ ID NO: 19 gezeigt ist,
insbesondere die codierenden Regionen davon. Geeignete Wirtszellen
schließen
sowohl prokaryontische Zellen (z.B. die E. coli-Stämme HB101, DH5a,
XL1 Blue, Y1090 und JM101) und eukaryontische Zellen (z.B. Spodoptera
frugiperda-Insektenzellen, CHO-Zellen,
COS-7-Zellen, HEK 293-Zellen, menschliche Hautfibroblasten und S.
cerevisiae-Zellen) ein.
-
Fachleute
können
Expressionsvektoren durch verschiedene Verfahren, die auf dem Fachgebiet
bekannt sind, in Wirtszellen einbringen. Beispielhafte Verfahren
sind Transfektion durch Calciumphosphat-Präzipitation, Elektroporation,
liposomale Fusion, nukleäre
Injektion und virale oder Phagen-Infektion. Man kann dann die Wirtszelle
unter Bedingungen züchten,
die die Expression von großen
Mengen des KCNQ2-Proteins erlauben.
-
Man
kann solche modifizierten Wirtszellen durch jeden von sechs allgemeinen
Ansätzen
identifizieren:
- (a) DNA-DNA-Hybridisierung
mit Sonden, die komplementär
zu der Sequenz sind, die das KCNQ-Protein codiert (Southern-Blotting).
- (b) Nachweis von Markergen-Funktionen wie der Thymidinkinase-Aktivität, der Resistenz
gegen Antibiotika und dergleichen. Ein Markergen kann in dasselbe
Plasmid wie die KCNQ-Sequenz unter der Regulierung desselben oder
eines anderen Promotors platziert werden.
- (c) Nachweis von mRNA-Transkripten durch Hybridisierungstests
(z.B. Northern-Blotting oder einen Nuclease-Protektionstest unter
Verwendung einer Sonde, die komplementär zu der RNA-Sequenz ist).
- (d) Immunnachweis der Genexpression (z.B. durch Western-Blotting
mit einem Antikörper
gegen das KCNQ-Protein).
- (e) Nachweis der Kaliumkanal-Aktivität wie durch Patch-Clamp-Analyse,
Radioisotopen (z.B. 86Rb)-Ablass oder Membranpotenzial-empfindliche
Reagenzien (z.B. Dibac von Molecular Probes International).
- (f) PCR mit Primern, die homolog zu den Expressionsvektorsequenzen
oder den Sequenzen sind, die das KCNQ-Protein codieren. Die PCR
produziert ein DNA-Fragment
von vorhergesagter Länge,
das auf die Inkorporierung des Expressionssystems in der Wirtszelle
hinweist.
-
Fachleute
können
DNA-Sequenzen durch verschiedene bekannte Verfahren bestimmen. Siehe
zum Beispiel das Didesoxykettenterminierungsverfahren in Sanger
et al. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-7 und das Maxam-Gilbert-Verfahren in Maxam-Gilbert
(1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560-4.
-
Man
kann die Wirtszellen dieser Erfindung auf eine Vielzahl von Arten
verwenden, die jetzt offensichtlich sind. Man kann die Zellen verwenden,
um auf Verbindungen zu screenen, die an das KCNQ2-Protein, das für die Modulierung,
zum Beispiel Aktivierung der KCNQ2-Protein-Aktivität nützlich sein
würde,
binden oder es anderweitig modulieren oder dessen Funktion regulieren;
um Signaltransduktions-Mechanismen und Protein-Protein-Interaktionen
zu untersuchen; und um ein KCNQ2-Protein für die unten beschriebenen Verwendungen
herzustellen.
-
Nicht
alle Expressionsvektoren und regulatorischen DNA-Sequenzen werden
gleich gut wirken, um die DNA-Sequenzen dieser Erfindung zu exprimieren.
Noch werden alle Wirtszellen gleich gut mit demselben Expressionssystem
wirken. Ein Fachmann kann jedoch unter Verwendung der hierin bereitgestellten
Anleitungen ohne unangemessenes Experimentieren und ohne vom Rahmen
der Erfindung abzuweichen eine Auswahl aus den Expressionsvektoren,
den regulatorischen DNA-Sequenzen
und den Wirtszellen treffen.
-
Polypeptide
-
Diese
Erfindung betrifft weiterhin Polypeptide, die die gesamten Aminosäuresequenzen
eines KCNQ2-Proteins umfassen. Die Erfinder bevorzugen Polypeptide,
die die gesamten Aminosäuresequenzen, wie
sie in SEQ ID NO: 20 gezeigt sind, umfassen. Wo ein Teil des KCNQ2-Proteins
verwendet werden kann, zeigt der Teil vorzugsweise ein K+-Kanal-Aktivität oder kann moduliert werden,
um eine K+-Kanal-Aktivität zu zeigen. Zum Beispiel und
im Rahmen der Erfindung sind Polypeptide, die das gesamte KCNQ2
umfassen, das eine oder mehrere Mutation(en) enthalten kann, damit
das Protein versagt, eine K+-Kanal-Aktivität zu zeigen, aber
die verwendet werden können,
um auf Verbindungen zu screenen, die das Protein oder einen Teil
davon aktivieren werden.
-
Fachleute
können
diese Polypeptide durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt
sind, herstellen. Zum Beispiel kann man eine chemische Synthese
wie das Festphasenverfahren, das von Houghton et al. (1985), Proc.
Natl. Acad. Sci. 82: 5131-5 beschrieben wurde, verwenden werden.
Ein anderes Verfahren ist die in vitro-Translation von mRNA. Man
kann auch die Polypeptide in den oben beschriebenen Wirtszellen
produzieren, was das bevorzugte Verfahren ist. Zum Beispiel kann
man durch PCR, wie oben beschrieben, eine DNA synthetisieren, die die
gesamte oder einen Teil der SEQ ID NO: 19 umfasst, die synthetisierte
DNA in einen Expressionsvektor inserieren, eine Wirtszelle mit dem
Expressionsvektor transformieren und die Wirtszelle kultivieren,
um die gewünschten
Polypeptide zu produzieren.
-
Fachleute
können
solche Polypeptide durch irgendeine von einigen bekannten Techniken
isolieren und reinigen; zum Beispiel Ionenaustausch-Chromatographie,
Gelfiltrations-Chromatographie und Affinitätschromatographie. Solche Techniken
können
eine Modifikation des Proteins erfordern. Zum Beispiel kann man eine
Histidin-Markierung zu dem Protein zufügen, um die Reinigung auf einer
Nickelsäule
zu ermöglichen.
-
Fachleute
können
die Polypeptide der Erfindung auf eine breite Vielzahl von Arten
verwenden. Zum Beispiel kann man sie verwenden, um polyclonale oder
monoclonale Antikörper
herzustellen. Man kann solche Antikörper dann für einen Immunnachweis (z.B.
Radioimmun-Test, Enzymimmun-Test oder Immuncytochemie), eine immun-Reinigung
(z.B. Affinitätschromatographie)
von Polypeptiden von verschiedenen Quellen oder eine Immuntherapie
(d.h. für
eine Kaliumkanal-Inhibition oder -Aktivierung) verwenden.
-
Fachleute
können
modifizierte KCNQ2-Polypeptide durch bekannte Techniken erzeugen.
Solche Modifikationen können
eine höhere
oder niedrigere Aktivität
bewirken, höhere
Spiegel der Proteinproduktion erlauben oder die Reinigung des Proteins
vereinfachen. Solche Modifikationen können helfen, spezifische KCNQ2-Aminosäuren, die
in eine Bindung involviert sind, zu identifizieren, was im Gegenzug
einer vernünftigen
Arzneistoff-Gestaltung eines KCNQ2-Modulators helfen kann. Man kann
Aminosäuresubstitutionen
basierend auf einer Ähnlichkeit
in der Polarität,
der Ladung, der Löslichkeit,
der Hydrophobie, der Hydrophilie und/oder des amphipatischen Wesens
der involvierten Reste machen. Zum Beispiel schließen negativ
geladene Aminosäuren
Asparginsäure
und Glutaminsäure
ein; positiv geladene Aminosäuren
schließen
Lysin und Arginin ein; Aminosäuren
mit ungeladenen polaren Kopfgruppen oder nicht-polaren Kopfgruppen,
die ähnliche Hydrophilie-Werte
haben, schließen
die folgenden ein: Leucin, Isoleucin, Valin, Glycin, Alanin; Aspargin,
Glutamin; Serin, Threonin; Phenylalanin, Tyrosin. Alle solchen modifizierten
Polypeptide sind im Rahmen der Erfindung eingeschlossen.
-
Die
Erfinder ziehen eine Zahl von anderen Variationen der oben beschriebenen
Polypeptide in Betracht. Solche Variationen schließen Salze
und Ester der Polypeptide so wie Vorläufer der vorher erwähnten Polypeptide
(z.B. die N-terminale
Substituenten wie Methionin, N-Formylmethionin und Leader-Sequenzen
haben) ein. Die Erfindung schließt alle solchen Variationen
ein.
-
Verfahren zum Nachweisen
von Nucleinsäuren
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Nachweisen
von Nucleinsäuren,
die ein KCNQ2-Protein codieren. In diesem Verfahren (a) bringt ein
Fachmann Nucleinsäuren
von unbekannter Sequenz mit einer Nucleinsäure in Kontakt, die eine Sequenz
hat, die komplementär
zu einer bekannten codierenden Sequenz ist (z.B. einer Sequenz von
mindestens etwa 10 Nucleotiden von SEQ ID NO: 19, insbesondere den
codierenden Regionen davon), worin die letztere Nucleinsäure einen
nachweisbaren Marker aufweist; und (b) weist das Vorliegen des Markers
nach, der an irgendeine der Nucleinsäuren von unbekannter Sequenz
gebunden ist. Das Vorliegen des gebundenen Markers weist auf das
Vorliegen der gewünschten
Nucleinsäuren
hin. Man kann dieses Verfahren anwenden, um KCNQ2-Nucleinsäuren von
anderen Geweben (die andere regulatorische Elemente haben können) und
Nucleinsäuren
von anderen Arten (z.B. Affe) nachzuweisen.
-
Fachleute
wissen im Allgemeinen, wie man Nucleinsäuren, die in diesem Verfahren
analysiert werden sollen, erhält.
Für genomische
DNA kann man Gewebe schnell einfrieren, das Gewebe in leicht verdauliche Stücke brechen
und das zerbrochene Gewebe in Proteinase K und SDS inkubieren, um
die meisten zellulären Proteine
abzubauen. Man kann dann die genomische DNA durch aufeinander folgende
Phenol/Chloroform-Isoamylalkohol-Extraktionen vom Protein befreien,
die DNA durch Ethanol-Präzipitation
gewinnen, sie trocknen und sie in einem Puffer resuspendieren. Für RNA kann
man gezüchtete
Zellen in 4M Guanidinium-Lösung
lysieren, das Lysat durch eine 20-Gauge-Nadel ziehen, die RNA durch
einen Cäsiumchlorid-Stufengradienten
pelletieren und den Überstand
entfernen. Das Pellet sollte gereinigte RNA enthalten.
-
Der
nachweisbare Marker kann ein radioaktives Ion sein, das an eines
der Nucleotide der komplementären
Nucleinsäure
gebunden ist. Übliche
radioaktive Markierungen sind 32P und 35S, obwohl man auch andere Markierungen
wie Biotin verwenden kann. Fachleute kennen verschiedene Verfahren,
um die Markierungen an die komplementäre Nucleinsäure zu binden (z.B. das zufällige Primer-Verfahren
zur Bindung von 32P oder 35S).
-
Fachleute
wissen im Allgemeinen, wie solch ein Nachweisverfahren von Nucleinsäuren ausgeführt wird.
Zum Beispiel kann man einen Southern oder Northern Blot unter Verwendung
einer radioaktiv markierten komplementären KCNQ-Oligonucleotid-Sonde durchführen. Man
kann dann die Hybridisierung durch Autoradiographie nachweisen.
Abhängig
von dem Marker kann man auch andere Nachweisverfahren (z.B. Spektrophotometrie)
verwenden.
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Verfahren zum Nachweisen
von KCNQ2/KCNQ3-Protein-Modulatoren
-
Diese
Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zum Nachweisen von Modulatoren
des KCNQ2-Proteins der vorliegenden Erfindung. Ein Screenen auf
KCNQ-Protein-Modulatoren
bedingt das Nachweisen der Bindung von Molekülen (z.B. Polypeptiden, natürlichen
Produkten, synthetischen Verbindungen) in Zellen, die das KCNQ2-Protein
exprimieren.
-
Das
Clonieren und Sequenzieren des KCNQ2-Proteins ermöglicht die
Konstruktion von Zellen, die im Screenen auf natürliche Produkte und synthetische
Verbindungen, die an das KCNQ2-Protein binden und/oder dessen Aktivität modulieren,
nützlich
sind. Ein Nachweisverfahren für
KCNQ2-Protein-Modulatoren erfordert das Transformieren eines geeigneten
Vektors in kompatible Wirtszellen, wie es vorher hierin beschrieben
wurde. Man behandelt solche transformierten Zellen mit Testsubstanzen
(z.B. synthetischen Verbindungen oder natürlichen Produkten) und misst
dann die Aktivität
in der Anwesenheit oder Abwesenheit der Testsubstanz.
-
Gentherapie
-
Fachleute
können
auch Sense- und Antisense-Nucleinsäuremoleküle als therapeutische Mittel
für mit KCNQ2
in Beziehung stehende Indikationen verwenden. Man kann Vektoren
konstruieren, die die Synthese der erwünschten DNA oder RNA steuern
oder die Nucleinsäure,
wie auf dem Fachgebiet beschrieben, formulieren.
-
Einige
Bezugnahmen beschreiben die Nützlichkeit
eines Antisense-Moleküls.
Siehe Toulme und Helene (1988), Gene 72: 51-8; Inouye (1988), Gene,
72: 25-34; Uhlmann und Peyman (1990), Chemical Reviews 90: 543-584;
Biotechnology Newswatch (15. Januar, 1996), S. 4; Robertson, Nature
Biotechnology 15: 209 (1997); Gibbons und Dzau (1996), Science 272:
689-93. Man kann sie basierend auf genomischer DNA und/oder cDNA,
5'- und 3'-flankierenden Kontrollregionen, anderen
flankierenden Sequenzen, Intron-Sequenzen und nicht-klassischen
Watson und Crick-Basenpaarungssequenzen, die in der Bildung einer
Triplex-DNA verwendet werden, gestalten. Solche Antisense-Moleküle schließen Antisense-Oligoribonucleotide
ein und können
mindestens etwa 15 bis 25 Basen umfassen.
-
Antisense-Moleküle können nicht-kovalent
oder kovalent an die KCNQ-DNA oder -RNA binden. Solch eine Bindung
könnte
zum Beispiel die KCNQ-DNA oder -RNA spalten oder deren Spaltung
erleichtern, den Abbau von nukleärer
oder cytoplasmatischer mRNA erhöhen
oder die Transkription, die Translation, die Bindung von transaktivierenden
Faktoren oder das prä-mRNA-Splicing
oder -Prozessieren inhibieren. Antisense-Moleküle können auch zusätzliche
Funktionalitäten
enthalten, die die Stabilität,
den Transport in und aus Zellen, die Bindungsaffinität, die Spaltung
eines Zielmoleküls
und dergleichen erhöhen.
Alle diese Wirkungen würden
die Expression des KCNQ2-Proteins erniedrigen und so die Antisense-Moleküle als KCNQ2-Protein-Modulatoren
nützlich
machen.
-
Detaillierte Beschreibung
von menschlichem KCNQ2 und KCNQ3
-
Genetische Eigenschaften
-
KCNQ1-verwandte
(KCNQ2/KCNQ3) exprimierte Sequenzmarkierungen (ESTs) wurden durch
eine GCG-BLAST-Suche der GenBank-Datenbank mit einer KCNQ1-Sequenz
entdeckt. Primer, die von den Konsensus-Sequenzen der EST-Clone abgeleitet
wurden, wurden verwendet, um eine menschliche, vom Gehirn stammende
cDNA zu amplifizieren, und 877 bp- und 325 bp-Fragmente wurden für KCNQ2
beziehungsweise KCNQ3 isoliert. (1, Sonde
1). Um die Volllängen-cDNA-Sequenzen von
beiden Genen zu erhalten, wendeten wir die 5'-RACE-PCR, das Screenen von cDNA-Genbanken
und Gen-Einfang("Gene
Trapper")-Techniken
an. Die zusammengesetzten Volllängen-cDNAs
von KCNQ2 (SEQ ID NO: 19) und KCNQ3 (SEQ ID NO: 26) enthalten einen
offenen Leserahmen (ORF), der ein 871 (SEQ ID NO: 20) beziehungsweise
ein 854 (SEQ ID NO: 27)-Aminosäure-Polypeptid
codiert (2 und 23).
Eine DNA-Sequenzanalyse und eine konzeptionelle Translation von
beiden cDNAs legt offen, dass sie Proteine mit den strukturellen
Eigenschaften eines Spannungs-abgegrenzten Kaliumkanals codieren
und äußerst nahe
verwandt zu KCNQ1 sind. Sanguinetti et al. (1996), Nature 384: 80-83;
Yang et al. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4017-2. KCNQ2
zeigt einen hohen Grad der Sequenzähnlichkeit mit KCNQ3 (= 70%),
was darauf hinweist, dass sie zu derselben Unterfamilie gehören. Beide
Proteine haben eine längere
C-terminale Domäne
(~200 Aminosäuren)
als KCNQ1. Das Startcodon für
KCNQ2 wird von einer Konsensus-Ribosomenbindungsstelle (d.h. Kozak)
ACCATGG flankiert (2).
-
Auf
Aminosäureebene
legt die Sequenzanalyse offen, dass KCNQ2/KvLR1 die GYG (d.h. Gly-Tyr-Gly)-Kaliumkanalporen-„Kennungssequenz" enthält, daher
wahrscheinlich einen Kalium-selektiven Kanal codiert. Ein Vergleich
von KCNQ2 und KCNQ1 (KvLQT1) legt offen, dass die Aminosäuresequenz-Identität ungefähr 60% in
den Transmembran- und Porenregionen ist (3). KCNQ3
zeigt etwa denselben Grad der Identität (etwa 56%) mit KCNQ1 in den
Transmembran- und Porenregionen wie KCNQ2 (4). Die
Identität
in der Amino-terminalen und Carboxy-terminalen Domäne ist viel
weniger im Vergleich zu den zentralen konservierten Regionen (3).
Solche Ergebnisse legen nahe, dass KCNQ2/KvLR1 und KCNQ3/KvLR2 zusätzliche
Mitglieder der KCNQ1/KvLQT1-Familie von Ionenkanälen sind.
-
KCNQ2-
und KCNQ3-spezifische Transkripte sind nur im menschlichen Gehirn
nachweisbar (5). Dieses Expressionsmuster
ist verschieden von KCNQ1/KvLQT1, das stark im menschlichen Herz
und Pankreas exprimiert wird, was durch Northern Blot-Analyse offen
gelegt wurde. Sanguinetti et al. (1996) Nature 384: 80-83; Yang
et al. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4017-2. Die Expression
von menschlichem KCNQ2/KvLR1 ist hoch im Hippocampus, Nucleus caudatus
und dem Mandelkern; mittel im Thalamus; und schwach im subthalamischen
Nucleus, der Substantia nigra und dem Corpus callosum (5). Ein getrennter Northern Blot zeigt,
dass die Expression von menschlichem KCNQ2/KvLR1 hoch im cerebralen
Cortex ist; mittel im Putamen, dem temporalen Lappen, dem frontalen
Lappen, dem occipitalen Pol und dem Cerebellum ist; und niedrig
in der Medulla und im Rückenmark
ist (5). KCNQ3 zeigt ein beinahe identisches
Expressionsmuster im Gehirn (5). Um
die Zelltypen, die KCNQ2/KvLR1 exprimieren, weiter zu charakterisieren,
wurde ein Maus-spezifisches KCNQ2/KvLR1-cDNA-Fragment isoliert und
als eine in situ-Hybridisierungssonde verwendet. Das Ergebnis (9) zeigt, dass KCNQ2/KvLR1 im Maus-Hippocampus
und dem Gyrus dentatus, Bereichen, die wichtig für Lernen und Gedächtnis sind,
exprimiert wird.
-
Elektrophysiologische
Eigenschaften
-
Die
menschlichen Volllängen-KCNQ2-
und -KCNQ3-cDNAs wurden in einen Xenopus-Expressionsvektor subcloniert,
und cRNA wurde durch in vitro-Transkription
hergestellt. Die Eigenschaften der Kanäle, die durch menschliches
KCNQ2 und KCNQ3 codiert werden, wurden durch Exprimieren der transkribierten
cRNA in Xenopus-Oocyten untersucht. 6 vergleicht
die Ströme,
die von Oocyten aufgezeichnet wurden, die 5 Tage vorher mit entweder
Wasser (6A) oder 14 ng menschlicher
KCNQ2/KvLR1-cRNA (6B) injiziert wurden. Oocyten,
die mit menschlicher KCNQ2/KvLR1-cRNA injiziert wurden, zeigten
nach außen
gerichtete Ströme,
die bei Potentialen, die positiv bis –60 mV sind, aktivierten, und
hatten eine maximale Amplitude von 1 μA bei +40 mV. Ähnliche
Ströme
wurden nie in Wasser-injizierten Kontrolloocyten beobachtet, und
eine kleine undichte Stelle oder endogene Ströme, die in Kontrolloocyten
aufgezeichnet wurden, überschritten
nie 0,15 mA bei +40 mV. Die menschlichen KCNQ2/KvLR1-Ströme zeigten
einen schnell aktivierenden verzögerten Gleichrichterstrom-Phänotyp, der
sehr ähnlich
zum hKCNQ1/KvLQT1-Strom war. Barhanin et al. (1996) Nature 384:
78-80; Sanguinetti et al. (1996), Nature 384: 80-83; Yang et al.
(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4017-2. Der KCNQ2/KvLR1-Strom
wurde bei positiven Spannungen schwach gleichgerichtet.
-
Obwohl
die makroskopischen KCNQ2/KvLR1- und KCNQ1/KvLQT1-Ströme ähnlich sind,
fehlt den KCNQ2/KvLR1-Schwanzströmen
der „Haken", der mit KCNQ1/KvLQT1-Schwanzströmen beobachtet
wird. 6C zeigt das Gipfelstrom-Spannungs (IV)-Verhältnis für Oocyten,
die KCNQ2/KvLR1 exprimieren (n = 12). Die K+-Selektivität des exprimierten
Stroms wurde durch Untersuchung der Schwanzstrom-Umkehrpotenziale in
Badlösungen,
enthaltend 2, 10, 40 und 98 mM K+, untersucht.
Die Umkehrpotenziale folgten eng dem Nernst-Potenzial für K+, was einen K+-selektiven
Kanal offenbarte (n = 6; 6D). Das
Umkehrpotenzial für den
KCNQ2/KvLR1-Strom verlagerte sich um 52 mV pro 10-facher Änderung
im externen K. Die gestrichelte Linie hat einen Anstieg, der von
der Nernst-Gleichung für
einen perfekt selektiven K+-Kanal vorhergesagt
wird.
-
Eine
Familie von Strömen,
die durch depolarisierende Spannungsschritte in einer Oocyte, die
mit KCNQ3-cRNA injiziert wurde, hervorgerufen wurden, ist in 18A gezeigt. Die Ströme aktiveren bei Potenzialen,
die positiv bis –70
mV sind, und bei Potenzialen, die größer als 0 mV sind, Einwärts-Gleichrichtes,
was aus dem IV- Verhältnis offensichtlich
ist (18B). Das KCNQ3-Umkehrpoteinzial
verlagerte sich um 49 mV pro 10-facher Änderung im externen K+ (18C).
Daher ist KCNQ3, obwohl es noch vorwiegend selektiv für K+ ist, etwas weniger K+-selektiv
als KCNQ2.
-
Die
Coexpression von KCNE1 (KCNE1 ist auch als „minK" oder „lsk" bekannt) mit KCNQ1/KvLQT1 ändert die
Amplitude und die Gating-Kinetik des KCNQ1/KvLQT1-Stroms dramatisch.
Barhanin et al. (1996) Nature 384: 78-80; Sanguinetti et al. (1996),
Nature 384: 80-83; Yang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:
4017-2. MinK ist ein Polypeptid, von dem angenommen wird, dass es
einen K+-Kanal codiert oder reguliert. Folander
et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci USA 87: 2975-2979; Varnum et
al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11528-11532; Ben-Efraim et al. (1996)
J. Biol. Chem. 271: 8768-8771. Diese Untersuchungen legen nahe,
dass sich minK und KCNQ1/KvLQT1 gemeinsam anordnen, um den K+-Kanal zu bilden, der dem langsamen verzögerten Gleichrichterstrom
im Herzen unterliegt. Eine ähnliche
Assoziation zwischen minK und KCNQ2/KvLR1 wurde getestet. Die Coexpression
von KCNE1 mit KCNQ2/KvLR1 hatte eine geringe Wirkung auf den KCNQ2/KvLR1-Strom
in Oocyten, und getrennte Ströme,
die durch KCNQ1/KvLQT1- und KCNQ2/KvLR1-Kanäle getragen
werden, konnten in Oocyten, die mit minK und KCNQ2/KvLR1 co-injiziert wurden,
unter Verwendung von selektiven Inhibitoren für jeden der Kanäle abgegrenzt
werden. Daher interagiert KCNQ2/KvLR1 unterschiedlich mit KCNE1
als es KCNQ1/KvLQT1 tut. Andere KCNQ-Mitglieder können mit
Proteinen, die strukturell ähnlich
zu KCNE1 sind, funktionell interagieren.
-
Pharmakologische
Eigenschaften
-
Inhibitoren
von verschiedenen Kaliumkanälen,
die im Gehirn oder anderen Geweben vorhanden sind, wurden verwendet,
um die Pharmakologie von KCNQ2/KvLR1 zu untersuchen. Die Wirkungen
von 0,2 mM 4-Aminopyridin (4-AP), 10 μM E-4031, 10 μM Clofilium,
0,1 mM Charybdotoxin und 1 mM Tetraethylammonium (TEA) auf die KCNQ2/KvLR1-Ströme, die
von einer einzelnen Oocyte aufgezeichnet wurden, sind in 7 gezeigt.
Jede dieser Verbindungen wurde auch alleine in individuellen Oocyten
getestet, und die Wirkungen von jedem Mittel waren nicht anders.
-
Charybdotoxin
ist ein Skorpiongift-Protein, das eine Vielzahl von Ca2+-aktivierten und spannungsabhängigen K+-Kanälen
inhibiert. Miller et al. (1985), Nature 313: 316-8; Sugg et al.
(1990), J. Biol. Chem. 265: 18745-8. Charybdotoxin inhibierte den
KCNQ2/KvLR1-Strom bei den getesteten Konzentrationen nicht. Dieses
Toxin hatte auch keine Wirkung auf KCNQ1/KvLQT1.
-
E-4031
(10 mM) ist ein selektiver Inhibitor von Iκr.
Sanguinetti et al. (1990) J. Gen. Physiol. 96: 195-215. 4-AP (0,2
mM) ist ein Inhibitor von K+-Kanälen vom
Shaker-Typ. Deal et al. (1996) Physiol. Rev. 76: 49-67. Weder E-4031
noch 4-AP erzeugten signifikante Wirkungen auf den KCNQ2/KvLR1-Strom.
In ähnlicher
Weise inhibieren beide Reagenzien nicht die KCNQ1/KvLQT1-Ströme. Yang
et al. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4017-21.
-
TEA
ist ein schwacher Inhibitor von KCNQ1/KvLQT1, wohingegen Clofilium
ein starker Inhibitor von KCNQ1/KvLQT1 ist. Yang et al. (1997),
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:. Clofilium inhibiert auch Herz-Iκr und
-Iκs. Arena
et al. (1988), Molecular Pharmacology 34: 60-66; Colatsky et al.
(1990), Circulation 82: 2235-42. Im Gegensatz dazu hatte Clofilium
für KCNQ2/KvLR1
eine geringe Wirkung, wohingegen TEA den Strom um über 85%
bei einer Konzentration von 1 mM inhibierte.
-
Die
Pharmakologie von KCNQ3 war signifikant anders als jene von KCNQ2
(18D). Clofilium (10 μM) reduzierte den KCNQ3-Strom
um 30% von der Kontrolle, hatte aber eine geringe Wirkung auf KCNQ2. TEA,
das KCNQ2 bei 1 mM stark inhibierte, produzierte bei 5 mM eine geringe
Inhibition von KCNQ3. CTX (100 nM), 4-AP (2 mM) und E-4031 (10 μM) hatten
auch keine Wirkung auf den KCNQ3-Strom.
-
Wie
aus diesen Ergebnissen gesehen werden kann, sind die pharmakologischen
Eigenschaften von KCNQ3/KvLR2, KCNQ2/KvLR1 und KCNQ1/KvLQT1 ziemlich
verschieden.
-
KCNQ2 und KCNQ3 interagieren
funktionell
-
Das überlappende
Expressionsmuster von KCNQ2 und KCNQ3 in verschiedenen Gehirnregionen (5) veranlasste uns, auf eine funktionelle
Interaktion zwischen den zwei Kanälen zu testen. Familien von Strömen, die
durch depolarisierende Spannungsschritte in Oocyten, die mit KCNQ2
und KCNQ3 alleine und zusammen injiziert wurden, hervorgerufen wurden,
sind in 19A bis 19C gezeigt.
Strom-Amplituden, die von Oocyten, die die zwei Kanäle co-exprimieren,
aufgezeichnet wurden, waren 15-mal größer als in Oocyten, die individuell
mit jedem der Kanäle
injiziert wurden. Peakstrom-Amplituden bei +30 mV für KCNQ2, KCNQ3
und KCNQ2 + KCNQ3 waren 0,98 ± 0,09
(n = 6), 0,98 ± 0,06
(n = 5) beziehungsweise 14,2 ± 0,62 μM (n = 6).
Quantitativ ähnliche
Ergebnisse wurden in 3 getrennten Chargen von Oocyten erhalten.
Das IV-Verhältnis
zeigt, dass KCNQ2 + KCNQ3-Ströme bei Potenzialen,
die positiv bis –60
mV waren, aktivierten und im Gegensatz zu KCNQ2 und besonders KCNQ3
bei positiven Spannungen nicht gleichrichteten (19D). Das Umkehrpotenzial der Schwanzströme verschob
sich um 57 mV pro 10-facher Änderung
im externen K+, was darauf hinweist, dass
KCNQ2 + KCNQ3 beinahe perfekt selektiv für K+ ist
(19E). Der KCNQ2 + KCNQ3-Strom ist schwach sensitiv
auf eine Inhibition durch 5 mM TEA und 10 μM Clofilium, aber nicht auf
100 nM CTX oder 2 mM 4-AP (19F).
Auch E-4031 (10 μM)
inhibierte nicht den KCNQ2 + KCNQ3-Strom (nicht gezeigt). Diese
Ergebnisse legen stark nahe, dass KCNQ2 + KCNQ3 interagieren, um
einen Kanal mit Eigenschaften zu bilden, die verschieden von entweder
den KCNQ2- oder den KCNQ3-Kanälen
alleine sind.
-
KCNE1 interagiert mit
KCNQ2 + KCNQ3-Kanälen
-
Die β-Untereinheit
KCNE1 ändert
die Amplitude und die Gating-Kinetik des KCNQ1-Kanals dramatisch.
Barhanin et al. (1996) Nature 384: 78-80; Sanguinetti et al. (1996),
Nature 384: 80-83; Yang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
94: 4017-2; Romey et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 16713-16716.
Weil KCNQ2 und KCNQ3 Mitglieder derselben K+-Kanal-Unterfamilie
sind, testeten wir auf eine Interaktion zwischen KCNE1 und den KCNQ2
+ KCNQ3-Kanälen. 20 zeigt Ströme, die durch 1 sec-depolarisierende
Spannungsschritte in Oocyten hervorgerufen wurden, die KCNE1 alleine
(20A), KCNQ2 + KCNQ3 (20B) und
KCNQ2 + KCNQ3 + KCNE1 (20C)
exprimieren. KCNE1 schwächte
die KCNQ2 + KCNQ3-Stromamplitude signifikant ab und verlangsamte
die Gating-Kinetik. Die Peakstrom-Amplitude bei +30 mV wurde in
Oocyten, die KCNE1 co-exprimieren, um 62 ± 6,0% reduziert (n = 6).
Aktivierende Ströme
wurden an eine bi-exponentielle Funktion angepasst, um schnelle
und langsame Zeitkonstanten der Aktivierung zu bestimmen. Schnelle
und langsame Zeitkonstanten für
die Aktivierung des KCNQ2 + KCNQ3-Stroms bei +10 mV waren 50,1 ± 3,4 (n
= 6) beziehungsweise 239,3 ± 17,5
ms (n = 6); diese wurden auf 124,7 ± 8,8 (n = 5) und 680,7 ± 71,4
ms (n = 6) verlagert, wenn KCNE1 zusammen mit KCNQ2 + KCNQ3 injiziert
wurde. Ähnliche
Ergebnisse wurden in mehr als 15 Oocyten von jeder Gruppe in dieser
und zwei zusätzlichen
Chargen von Oocyten erhalten. KCNE1-Ströme scheinen aufgrund der Dauer
(1 sec) der verwendeten Spannungsschritte und des Maßstabs,
bei dem die Ströme
gezeigt sind, zu fehlen. Wie jedoch deutlich im Einsatz in 20A gezeigt ist, riefen 5 sec-Spannungsschritte
typische KCNE1-Ströme
in derselben Oocyte hervor. Die Wirkung von KCNE1 auf die Gating-Kinetik
ist ähnlich
für KCNQ1-
und KCNQ2 + KCNQ3-Kanäle.
Im Gegensatz dazu steigert KCNE1 den KCNQ1-Strom aber inhibiert
KCNQ2 + KCNQ3.
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Die
Ergebnisse erklären,
warum Mutationen in jedem von zwei nicht verbundenen K+-Kanal-codierenden
Genen denselben Phänotyp
erbringen. BFNC-assoziierte
Mutationen in sowohl KCNQ2 als auch KCNQ3 könnten eine schwere Reduktion
in der KCNQ2 + KCNQ3-Stromamplitude bewirken. Eine Untersuchung
hat gezeigt, dass eine BFNC-verursachende Mutation, die in einem
nicht funktionellen, verkürzten
KCNQ2-Protein resultiert, versagte, eine dominant-negative Inhibition
von Wildtyp-KCNQ2-Kanälen,
die in Oocyten exprimiert werden, zu produzieren. Biervert et al.
(1998), Science 279: 403-406. Die vorliegende Erfindung, die eine
synergistische Interaktion zwischen KCNQ2 und KCNQ3 zeigt, kann
eine wahrscheinliche Erklärung
für dieses Ergebnis
liefern. Das heißt,
Mutationen in KCNQ2 können
nur dominant-negative Wirkungen produzieren, wenn sie mit den Wildtyp-KCNQ3-Kanälen co-exprimiert
werden und umgekehrt.
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Molekulargenetik
-
Neuere
Fortschritte in der Molekulargenetik haben uns ermöglicht,
Kaliumkanäle
mit Krankheiten im Nervensystem zu korrelieren. Vor kurzem und wie
oben diskutiert, wurde BFNC, eine Klasse von idiopathischer generalisierter
Epilepsie, neulich mit Mutationen in KCNQ2 und KCNQ3 in Verbindung
gebracht. Biervert et al., vorstehend; Charlier et al., vorstehend;
und Singh et al., vorstehend. Die Identifizierung und Expression
von menschlichem KCNQ2 und menschlichem KCNQ3 wird es uns ermöglichen,
weitere Korrelationen mit BFNC und anderen potenziellen menschlichen
Krankheiten zu untersuchen. Die vorliegende Erfindung wird jetzt Fachleuten
erlauben, Modulatoren, z.B. Aktivatoren, von KCNQ2 und/oder KCNQ3
zu identifizieren. Modulatoren von KCNQ2 und/oder KCNQ3 können eine
Gelegenheit zur Behandlung einer Krankheit wie BFNC bereitstellen.
Zusätzlich
können,
weil menschliches KCNQ2 und KCNQ3 hochgradig in Bereichen exprimiert
werden, die mit Lernen und Gedächtnis
assoziiert sind, Modulatoren von KCNQ2 und/oder KCNQ3 auch eine
Gelegenheit zur pharmakologischen Behandlung des Gedächtnisverlusts,
der mit fortgeschrittenem Alter assoziiert ist, der Parkinson-Krankheit oder der
Alzheimer-Krankheit liefern.
-
Murines KvLR1
-
Beginnend
mit einer exprimierten Sequenzmarkierung (EST, öffentliche Domänen-Datenbank)
des Gehirns, die ähnlich
zu dem KvLQT1-Gen ist, wurde ein neues Kaliumkanal-Gen von einer
Mausgehirn-Genbank cloniert und funktionell exprimiert. 10A bis 10D zeigt
das murine KCNQ2/KvLR1-Gen (SEQ ID NO: 22), das ein Protein mit
722 Aminosäuren
(SEQ ID NO: 23) und einem berechneten Molekulargewicht von 80,4
kDa codiert. Eine Hydropathie-Analyse (10E)
illustriert, dass die Computererzeugte Topologie von KvLR1 6 Membran-umspannende Domänen und
eine Poren-Domäne
hat, die typisch für
spannungsbegrenzte Kaliumkanäle
sind.
-
Das
Aminosäure-Alignment
des murinen KCNQ2/KvLR1-Kanals mit dem murinen KCNQ1/KvLQT1-Kanal
ist in 11 gezeigt. Insgesamt gibt es
40% Identität
zwischen den zwei Kanälen
mit 62,5% Identität
innerhalb der umspannenden und Poren-Domänen. Eine phylogenetische Analyse
legt nahe, dass das murine KCNQ2/KvLR1-Gen ein Mitglied der KCNQ1/KvLQT1-Genfamilie
ist und entfernt verwandt mit dem HERG-Gen und anderen spannungsbegrenzten
Familienmitgliedern ist. Kennungs-Aminosäuresequenzen, die charakteristisch
für spannungsbegrenzte
Kaliumkanäle
sind, sind innerhalb des murinen KCNQ2/KvLR1 vorhanden; ein sich
wiederholendes Argininmuster wird innerhalb der S4-umspannenden Domäne, die
als der Spannungssensor bekannt ist, und eine GYG-Sequenz innerhalb
der Porenregion gesehen. Eine weitere Analyse von einigen 3'-RACE-Clonen weist auf eine Diversität über die
S6-Membran-umspannende Domäne
hinaus hin. Bis jetzt sind zwei alternative Splice-Exons, A (SEQ
ID NO: 13) und B (SEQ ID NO: 14), identifiziert worden, die Aminosäuresequenzen
davon sind in 12 gezeigt.
-
Um
die Gewebeverteilung von murinem KCNQ2/KvLR1 zu bestimmen, wurden
ein Northern Blot mit einer Sonde des murinen KCNQ2/KvLR1-Kanals,
die nicht die Poren- oder Spannungssensorregionen enthält, durchgeführt. Diese
Sequenz des Gens vermeidet eine mögliche Kreuzreaktivität mit anderen
Kanälen. Die
Ergebnisse, die in 13 gezeigt sind, weisen auf
eine äußerst reichliche
8,2 kb-Botschaft hin, die nur im Gehirn gefunden und nicht in periphären Geweben
beobachtet wird. Obwohl nicht uneingeschränkt, wiesen längere Aussetzungszeiten
des Northern Blots nicht auf das Vorliegen der Botschaft in den
peripheren Geweben hin, angezeigt in 5.
-
Um
eine höhere
Auflösung
der Botschafts-Lokalisierung innerhalb des Gehirns zu erhalten,
wurde eine in situ-Hybridisierung durchgeführt. Ein positives Hybridisierungssignal
mit einer Antisense-RNA-Sonde, die für eine nicht konservierte Region
des KCNQ2/KvLR1-Gens spezifisch ist, wird mit einer weiten Verteilung quer
durch den Großteil
des Rattengehirns beobachtet. Die Maussonde war 99% identisch zu
der Rattensequenz. Ein stabiles Signal wird jedoch mit einer eingeschränkteren
Verteilung in den folgenden Regionen beobachtet: Cortex piriformis,
Nucleus supraopticus, Mandelkern, Hippocampus, einschließlich der
CA1-, 2- und 3-Regionen, und dem Gyrus dentatus, MO5 (Motornucleus
des trigeminalen Hirnstamms), Nucleus facialis, Nucleus hypoglossis,
dem inferioren Nuclei olivarii, den tiefen Nuclei cerebelli, den
Nuclei gigantocellularii, den lateralen und medialen Nuclei vestibulari,
den Motoneuronen des Rückenmarks
und den sensorischen Neuronen des dorsalen Wurzelganglions. Moderate
Spiegel des Hybridisierungssignals werden auch im Cortex, Septum,
Striatum, Hypothalamus, Thalamus, der medialen Habenula, der Substantia
nigra compacta, den Nuclei mammillarii, dem lateralen und medialen
Geniculat, Nucleus interfasicularis, den Purkinje- und Granula-Zellen
des Cerebellums, den Nuclei parabrachialii, den dorsalen und ventralen
Nuclei cochlearii und anderen Hirnstamm-Nuclei beobachtet. Eine
zusammengesetzte Ansicht der drei Regionen ist in 14 gezeigt.
-
Um
auf eine funktionelle Expression zu testen, wurde cRNA des murinen
KCNQ2/KvLR1-Gens hergestellt und in Xenopus-Oocyten injiziert. In
einer Zweielektroden-Spannungsklammer wurde eine Familie von nach
Außen
gerichteten Strömen
in mit muriner KCNQ2/KvLR1-cRNA injizierten Oocyten (n > 20) hergestellt. Nach
einem Minimum von 48 Stunden waren die Ströme, die qualitativ und quantitativ
anders als natürliche Ströme waren,
die mit identischen Protokollen in Wasser-injizierten oder nicht-injizierten
Kontrollzellen hergestellt wurden (die Ca2+-aktivierte Chloridströme und andere
natürliche
Ströme
repräsentieren)
(15). Die murinen KCNQ2/KvLR1-vermittelten
Ströme
wurden durch 1 mM TEA blockiert. Ähnliche Ströme wurden von CHO-Zellen erhalten,
die murines KCNQ2 stabil exprimieren, und unter Verwendung von Patch-Clamp-Techniken
aufgezeichnet. Von einzelnen Kanal-Leitwerten wurde geschätzt, dass
sie 24-30 pS in symmetrischem 140 mM Kalium sind. (22).
-
Um
festzustellen, ob murines KCNQ2/KvLR1 eine ähnliche Pharmakologie zu Iκs-
und Iκr-Strömen in Herz-Myocyten
hat, wurde Clofilium an Oocyten getestet, die murines KCNQ2 exprimieren.
Bei 20 μM
wurde für
Clofilium gezeigt, dass es die murinen KCNQ2-vermittelten Ströme teilweise
blockiert. Andere spezifische K+-Kanal-blockierende
Toxine, einschließlich
Iberiotoxin, α-Dendrotoxin
und Charybdotoxin, hatten keine signifikante Wirkung auf murine
KCNQ2-vermittelte Ströme.
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Materialien und Verfahren
-
Menschliches KCNQ2
-
Molekulares Clonieren
und Expression von menschlichem KCNQ2 (menschlichem KcLR1) und menschlichem KCNQ3
(menschlichem KvLR2)
-
Eine
5'-RACE-PCR wurde
durch Amplifizieren von menschlichen Gehirn- oder fötalen Gehirn-cDNA-Genbanken
oder Marathon-Ready-cDNAs (Clontech) unter Verwendung von Primern
durchgeführt,
die von den KvLQT1-verwandten EST-Sequenzen (EST# yn72g11, yo31c08, ys93a07
(die Sequenzen können
in der Genbank-Datenbank gefunden werden)) abgeleitet wurden (1).
Die PCR-Produkte
wurden gelgereinigt, subcloniert und sequenziert. Zufällig geprimte 32P-markierte
DNA-Sonden, die spezifische Regionen der KCNQ2- oder KCNQ3-Sequenz enthalten,
wurden für
das Screenen von cDNA-Genbanken und eine Northern Blot-Analyse unter
Verwendung eines Standardprotokolls verwendet. Zum Beispiel wurde
die KCNQ2-Sonde I (1) für die Northern Blot-Analyse
verwendet; die Sonde II (1) wurde für das Screenen von menschlichen
Gehirn-cDNA-Genbanken
gemäß Standardprotokollen
verwendet.
-
Das
Gen-Einfang-Experiment wurde unter Verwendung des Protokolls, wie
es im Handbuch des Herstellers (LifeTechnologies) beschrieben ist,
durchgeführt.
Die zusammengesetzten menschlichen Volllängen-KCNQ2- und menschlichen
KCNQ3-cDNA-Clone
wurden durch Restriktionsenzymverdau und Ligierung von überlappenden
cDNA-Clonen erhalten. Die Volllängen-cDNAs
wurden in einen Xenopus-Expressionsvektor, der vom pSP64T-Plasmid
stammt, subcloniert. Eine gekappte cRNA für die Mikroinjektion wurde
unter Verwendung des mMESSAGE mMACHINE-Kits (Ambion) synthetisiert.
-
Für den Nachweis
der Expression von KCNQ2, wie in den 9A und 9B gezeigt,
wurden Gewebeverarbeitung, histologische Analysen und in situ-Hybridisierungsanalysen
im Wesentlichen, wie in Fagan et al. (1996), J. Neurosci. 16 (19):
6208-18 beschrieben, durchgeführt.
-
Elektrophysiologische
und pharmakologische Charakterisierung von KCNQ2 und KCNQ3
-
Stadium
V- und VI-Xenopus laevis-Oocyten wurden mit einer Kollagenase-Behandlung von Follikeln befreit
und mit cRNAs, wie in Yang et al., vorstehend, beschrieben, injiziert.
Die Ströme
wurden bei Zimmertemperatur unter Verwendung der zwei-Mikroelektroden-Spannungsklammer
(Dagan TEV-200)-Technik zwischen 3-5 Tage nach der Injektion von
KCNQ2- (15 ng), KCNQ3- (15 ng) oder KCNE1- (2 ng) cRNA alleine oder
in Kombination aufgezeichnet. Die Mikroelektroden (0,8 bis 1,5 MΩ) wurden
mit 3 M KCl gefüllt.
Die Badlösung
enthielt (in mM): 96 NaCl, 2 KCl, 0,4-1,8 CaCl2,
1-2 MgCl2 und 5 HEPES (pH 7,5). KCl wurde
in manchen Experimenten durch eine äquimolare Substitution mit
NaCl variiert.
-
Die
K+-Selektivität wurde durch Bestimmen der
Anhängigkeit
des Schwanzstrom-Umkehrpotenzials von der externen K+-Konzentration
bewertet. Die Schwanzströme
wurden bei Potenzialen von –110
bis +10 mV nach einem Spannungsschritt auf +20 mV hervorgerufen,
während
die externe K+-Konzentration zwischen 2, 10,
40 und 98 mM variiert wurde. Das Strom-Umkehrpotenzial bei jeder
Bedingung wurde für
jede Oocyte durch Messen des Null-Abschnitts von einem Stück der Schwanzstrom-Amplitude
gegen ein Testpotenzial bestimmt.
-
Axoclamp
(Axon Instruments) wurde für
das Herstellen von Spannungsklammer-Anweisungen und das Beschaffen
von Daten verwendet, und Axograph 3.0 (Axon Instruments) wurde für die Datenanalyse
verwendet. Alle Daten wurden in einer Frequent von mindestens zweimal
der niedrigen Filter-Durchgangsgeschwindigkeit
abgefragt. Die Experimente wurden bei 22-25°C durchgeführt. Clofilium wurde von RBI
Biochemicals erhalten, und 4-Aminopyridin (4-AP), TEA und Charybdotoxin wurden von
Sigma Chemical Co. erhalten. E-4031 wurde mittels der Information,
die durch Esai Research Laboratories veröffentlicht wurde, synthetisiert.
-
Murines KvLR1
-
Sondenherstellung und
Genbank-Screening
-
Eine
einzigartige exprimierte Sequenzmarkierung (EST), die eine Ähnlichkeit
zum KvLQT-Gen aufweist, wurde aus der öffentlichen Datenbank identifiziert.
Die Oligonucleotidprimer wurden für die PCR-Experimente aus der
EST-Sequenz synthetisiert. Der Vorwärtsprimer (SEQ ID NO: 15) war
5'-GAG TAT GAG AAG
AGC TCG GA-3',
und
der Rückwärtsprimer
(SEQ ID NO: 16) war
5'-CAG
ATG TGG CAA AGA CGT TGC-3'.
-
Rattengehirn-polyA+-RNA wurde mit zufälligen Hexameren revers transkribiert
und durch PCR [60 sec 94°C,
90 sec 55°C,
120 sec 72°C,
30 Zyklen] mit den obigen Primern amplifiziert. Ein 240 bp-DNA-Fragment von
Ratten-KCNQ2/KvLR1 wurde durch Gelelektrophorese isoliert und in
pCRII (InVitrogen) subcloniert. Das 240 bp-DNA-Fragment wurde mit 32P-dCTP
zufällig
grundmarkiert und als eine Sonde verwendet, um eine Mausgehirn-pcDNA1-Plasmid-Genbank
(Clontech, Palo Alto, CA) zu screenen. Insgesamt wurden 2 × 105 Kolonien unter Verwendung des Filterhebe-Standardprotokolls
gescreent. Die Filter wurden über
Nacht in 50% Formamid, 2 × PIPES
und 1% SDS bei 42°C
hybridisiert und 1× in
1 × SSC,
dann 3 × 20
Minuten in 0,1 × SSC, 0,1%
SDS bei 53°C
gewaschen. Die Filter wurden über
Nacht bei –70°C ausgesetzt.
Nur eine positive Kolonie wurde identifiziert und wieder plattiert,
bis sie gereinigt war. Clon mbr 26.1, der murines KvLR1 genannt
wurde, wurde an beiden Strängen
durch Didesoxy-Terminierungsreaktionen sequenziert.
-
Northern Blot
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Northern
Blots wurden mit dem Maus-Blot für
mehrere Gewebe (Clontech) gemäß den Anweisungen des
Herstellers durchgeführt.
Kurz, der Blot wurde bei 68°C
mit ExpressHyb-Lösung
für 30
Minuten vorhybridisiert. Ein DNA-Fragment wurde von der murinen
KvLR1-codierenden Region durch das Restriktionsenzym PvuII, das
die Poren- und Spannungssensor-Konsensussequenzen eliminierte, isoliert
und mit 32P-dCTP zufällig grundmarkiert, bei 100°C für 5 Minuten
denaturiert, auf Eis gekühlt
und vor der Zugabe zum Northern Blot zu frischem ExpressHyb zugefügt. Der
Blot wurde für
60 Minuten bei 68°C
unter dauerndem Schwenken inkubiert. Der Blot wurde 2× bei 50°C in 0,1 × SSC und
0,1% SDS gewaschen. Der Blot wurde in Saranfolie gepackt und über Nacht
bei Zimmertemperatur einem Röntgenfilm
ausgesetzt. Dasselbe Protokoll wurde für die Actin-Sonde, die mit
dem Blot geliefert wurde, verwendet.
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In situ-Hybridisierung
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Gefrorene
Schnitte, die in Abständen
von 225 μm
durch das gesamte erwachsene Rattengehirn geschnitten wurden, wurden
durch Eintauchen (ohne Auftauen) in eiskaltes 10% Formaldehyd in
PBS für
20 Minuten fixiert und mit PBS abgespült. Die fixierten Schnitte
des Ratten-DRG wurden mit 0,5% Triton X-100 in 0,1 M Tris, pH 8,0,
und 0,05 M EDTA für
30 Minuten behandelt und für
3 Minuten in 0,1 M Tris, pH 8,0, und 0,05 M EDTA gespült. Das
Gewebe wurde dann mit 0,1 M TEA, pH 8,0, plus 0,25% saures Anhydrid
für 10 Minuten
bei Zimmertemperatur behandelt, in 2 × SSC gespült (3×), durch eine Reihe von Alkoholen
dehydriert, in Chloroform von Lipiden befreit und luftgetrocknet.
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Die
RNA-Sonden wurden unter Verwendung des Promega Riboprobe-Transcription System
II mit 250 μCi 35S-UTP und 250 μCi 35S-CTP
in einem Gesamtreaktionsvolumen von 10 μL synthetisiert. Unmarkiertes UTP
und CTP wurden zu je 25 μM
und ATP und GTP zu je 500 μM
zugefügt.
Das murine KCNQ2/KvLR1-Plasmid (nts 552-1125, subcloniert in pBluescript
II) wurde mit SacI linearisiert und unter Verwendung der T3-RNA-Polymerase
transkribiert, und mit BamHI und unter Verwendung der SP6-RNA-Polymerase
transkribiert, um Antisense- beziehungsweise Sense-Sonden herzustellen.
Ein μg linearisiertes
Plasmid wurde für jede
Reaktion zugefügt.
Die RNA-Sonden wurden durch Phenol:Chloroform-Extraktion und zwei
Ethanol-Präzipitationen
unter Verwendung von Ammoniumacetat gereinigt. Die getrockneten
Gewebeschnitte wurden mit 1 × 107 cpm/ml RNA-Sonde in Hybridisierungspuffer
(50% Formamid, 0,3 M NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 1 × Denhardt-Lösung, 10%
Dextransulfat, 500 μg/ml
tRNA und 10 mM DTT) über
Nacht bei 55°C
hybridisiert. Die Hybridisierungslösung wurde durch viermaliges
Spülen
in 4 × SSC,
5 Minuten für
jeden Waschschritt, entfernt. Die Schnitte wurden in 0,02 mg/ml
RNase, 0,5 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, und 1 mM EDTA für 30 Minuten
bei 37°C
inkubiert, dann in 2 × SSC,
1 × SSC
und 0,5 × SSC,
alle 1 mM DTT enthaltend, für
10 Minuten pro Waschschritt bei Zimmertemperatur gewaschen. Die
Gewebe wurden in 0,1 × SSC,
1 mM DTT für
30 Minuten bei 55°C
inkubiert, dann kurz in 0,1 × SSC
und 1 mM DTT bei Zimmertemperatur abgespült, dehydriert und luftgetrocknet.
Die getrockneten Schnitte wurden einem XOMAT-Film (Kodak, Rochester,
NY) ausgesetzt, wurden dann in NTB2-Emulsion (Kodak, Rochester,
NY) eingetaucht, um die zelluläre
Lokalisierung von jeder mRNA zu bestimmen.
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Expression und Aufzeichnung
in Oocyten
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Die
murinen KCNQ2/KvLR1-cDNAs wurden mit dem Restriktionsenzym NotI
linearisiert und unter Verwendung des mMessage mMachine T7 RNA-Polymerase-Kits gemäß den Anweisungen
des Herstellers (Ambion, Austin, TX) in vitro transkribiert. Die
cRNAs wurden in RNase-freiem Wasser gelöst und bei –70°C in einer Konzentration von
1,0 μg/μl gelagert.
Frosch-Oocyten wurden vorbereitet und unter Verwendung von Standardtechniken
(Colman, 1984) injiziert. In murinen KvLR1-Expressionsexperimenten
wurde jede Oocyte mit ungefähr
35-40 nl der cRNA injiziert. Nach der Injektion wurden die Oocyten
bei 17°C
in ND96-Medium, bestehend aus (in mM): NaCl, 90; KCl, 1,0; CaCl2, 1,0; MgCl2, 1,0;
HEPES, 5,0; pH 7,5, belassen. Pferdeserum und Penicillin/Streptomycin,
je 5% des Endvolumens, wurden als Ergänzungen zum Inkubationsmedium
zugefügt. Eine
elektrophysiologische Aufzeichnung begann 2-6 Tage nach der cRNA-Injektion.
Vor dem Beginn eines Experiments wurden die Oocyten in eine Aufzeichnungskammer
platziert und in modifizierter Barth-Lösung (MBS), bestehend aus (in
mM): NaCl, 88; NaHCO3, 2,4; KCl, 1,0; HEPES,
10; MgSO4, 0,82; Ca(NO3)2, 0,33; CaCl2, 0,41;
pH 7,5, inkubiert. Oocyten wurden mit Elektroden (1-2 MΩ) aufgespießt, und
2-Elektroden-Spannungsklammer-Standardtechniken
wurden angewendet, um Membranströme
der ganzen Zelle aufzuzeichnen (Stuhmer, 1992; TEC 200, Dagan Instruments).
Spannungsklammer-Protokolle bestanden typischerweise aus einer Reihe
von Spannungsschritten von 100-500 ms-Dauer in +10 mV-Schritten
von einem Haltepotenzial von –60
mV bis –90
mV zu einem maximalen Potenzial von +40 mV bis +50 mV; Aufzeichnungen
wurden bei 5 kHz digitalisiert und auf einem Computer unter Verwendung
der pClamp 6.0-Software (Axon Instruments) gespeichert und unter
Verwendung der ClampFit- oder AxoGraph-Software (Axon Instruments)
analysiert.
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Expression
und Aufzeichnung in CHO-Zellen
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Patch-Clamp-Aufzeichnungen
wurden von CHO-Zellen erhalten, die transient oder stabil murine KCNQ2-Kanäle exprimierten.
Die Elektroden wurden unter Verwendung eines PC-84 Sachs-Flaming-Pippentenziehgerätes (Sutter
Instruments) vorbereitet und auf eine endgültige Spitzenresistenz von
3-5 MΩ feuerpoliert.
Die Pipetten wurden mit einer Lösung
gefüllt,
die aus (in mM) KCl (140), MOPS (20), K2EGTA
(1,0), CaCl2 (0,89), ph 7,2, bestand. Die
Pipettenlösung
enthielt manchmal MgCl2 (1,0), um bei der
Dichtungsbildung zu helfen. Die Zellen wurden auf Poly-D-Lysin-beschichteten
Deckgläsern
gezüchtet,
und Stücke
der Deckgläser, die
CHO-Zellen enthielten,
wurden für
die Aufzeichnung in eine Kammer auf einem invertierten Mikroskop
platziert. Vor der Aufzeichnung und während der Dichtungsbildung
wurden die Zellen in einer externen Lösung gebadet, die aus (in mM)
NaCl (145), KCl (3), CaCl2 (2,5), MgCl2 (1,0), HEPES (10), pH 7,4, bestand. Die
Elektroden wurden unter visueller Betrachtung auf die Oberfläche der
Zellen abgesenkt; nach einer Giga-Dichtungsbildung wurden umgedrehte
Membranstücke
in eine interne Lösung,
bestehend aus (in mM) KCl (140), MOPS (20), K2EGTA
(1,0), CaCl2 (0,89), pH 7,2, ausgeschnitten.
Alle Aufzeichnungen wurden unter symmetrischen K+-Bedingungen gemacht.
Nach dem Ausschneiden des Stückes
wurden kontinuierliche und Schritt-Protokoll-Spannungsklammer-Aufzeichnungen
erhalten und Analysen unter Verwendung eines AxoPatch 200B-Patch
Clamp-Amplifizierers und der pClamp-Software (Axon Instruments)
durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in 22 gezeigt.
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Obwohl
die vorliegende Erfindung durch Veranschaulichung und Beispiel zu
Zwecken der Klarheit und des Verstehens in einem gewissen Detail
beschrieben worden ist, wird es offensichtlich werden, dass bestimmte Änderungen
und Modifikationen innerhalb des Rahmens der angefügten Ansprüche praktiziert
werden können.
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