-
Gebiet der
Erfindung
-
In
Säugetieren
wird der pH des extrazellulären
Kompartiments, einschließlich
der interstitiellen Flüssigkeiten
und des Blutes, strikt reguliert und auf einem konstanten Wert von
7,4 gehalten. Die Säureempfindlichkeit
ist eine spezifische Art der Chemorezeption, die eine kritische
Rolle in der Detektion von schmerzempfindenden (nociceptiven) pH-Ungleichgewichten
spielt, die z.B. bei Krampf-, Trauma-, Entzündungs- oder Hypoxie-Zuständen auftreten
(Lindahl, 1974). In Säugetieren
exprimiert eine Population von primären Sensorneuronen mit kleinem
Durchmesser in den Spinalganglien und Trigeminaganglien spezialisierte
pH-sensitive Oberflächenrezeptoren,
die durch Anstieg der extrazellulären Protonenkonzentration aktiviert
werden (Bevan and Yeats, 1991). Die Säuresensitivität der Sensor-
als auch der Zentralneuronen wird durch eine Familie von Protonengesteuerten
(„proton-gated") Kationenkanälen vermittelt,
die mit den Degenerinen von C. elegans und Epithel-Natriumkanälen von
Säugetieren
strukturell verwandt sind. Diese Erfindung betrifft diese Säure-empfindlichen
Ionenkanäle
(„Acid
Sensing Ion Channels",
ASIC), insbesondere einen nicht-inaktivierenden Protonen-gesteuerten
Kanal, benannt als hASIC3, dessen Assoziation mit anderen Kanaluntereinheiten
und die Verwendungen davon.
-
Hintergrund
der Erfindung
-
Gewebsazidose
ist mit einer Anzahl schmerzvoller physiologischer (z.B. Krämpfe) und
pathologischer Zustände
(z.B. Entzündung,
intermittierendes Hinken, Herzinfarkt) assoziiert. Experimentell
können
vergleichbare schmerzhafte Zustände
durch die Infusion von Lösungen
mit niedrigem pH in die Haut oder den Muskel reproduziert werden.
Weiterhin kann die verlängerte
intradermale Infusion von Lösungen
mit niedrigem pH die charakteristische Hyperalgesie von chronischem
Schmerz nachahmen. Um die Wirkungen von Protonen und deren Zusammenhang
mit Schmerz weiter zu charakterisieren, wurden Lösungen mit niedrigem pH auf „patch-clamped" Zentral- und Periphersensorneuronen
angewandt. Einströme
wurden induziert, wenn der pH auf saure Werte abfiel, womit der
Beweis für
die Existenz von Protonen-aktivierten Ionenkanälen erbracht wurde. Verschiedene
Arten nativer Ströme wurden
in Sensorneuronen der Ratten- und humanen Trigemina- und Spinalganglien
beobachtet:
- • schnell inaktivierende Ströme;
- • nicht-inaktivierende
Ströme
und
- • zweiphasige
Ströme,
die einen schnell inaktivierenden Strom zeigen, gefolgt von einem
nicht-inaktivierenden Strom.
-
Andere
Unterschiede bezüglich
Ionenselektivitäten
wurden ebenfalls beschrieben. Diese Ergebnisse weisen auf die Existenz
von verschiedenen Protonen-gesteuerten Ionenkanälen hin. Der verlängerte Schmerz, der
durch Ansäuerung
der Gewebe induziert wurde, ist wahrscheinlich mit einem nicht-inaktivierenden
Protonen-gesteuerten Ionenkanal assoziiert.
-
Klonierte Protonen gesteuerte
Ionenkanäle
-
Drei
Klassen von Protonen-gesteuerten Kationenkanälen von Säugetieren wurden kürzlich in
Ratten kloniert und als „ASIC" für Säure-empfindliche
Ionenkanäle
(„Acid
Sensing Ion Channels")
bezeichnet. Die Sequenzanalyse zeigt, dass diese zu den Mitgliedern
der DEG/ENaC-Superfamilie von Ionenkanälen zählen. Die mutmaßliche Membrantopologie
von ASIC-Rezeptoren deutet auf zwei Transmembran-Domänen mit
sowohl N- als auch C-Termini
in dem intrazellulären
Kompartiment hin, wie für
die Epithel-Natriumkanäle
(ENaC, „epithelial
sodium channels")
gezeigt wurde. Die veröffentlichten
ASIC-Rezeptoren sind unten beschrieben:
- 1)
ASIC1A (zuerst als ASIC beschrieben) zeigt einen schnell inaktivierenden
Strom mit einem pH50 von 6,2 (Waldmann R.
et al., Nature 1997; 386: 173-7). N.B.: pH50 zeigt
den pH an, bei dem die Spitze des Einstroms dem halbmaximalen Wert
entspricht.
- 2) ASIC1B (anfänglich
als ASIC-β beschrieben)
ist eine „Splice-Variante" von ASIC1A, in der
die ersten 185 Aminosäuren
von ASIC1A durch eine andere neue Sequenz von 172 Aminosäuren ersetzt
sind. ASIC1B zeigt ähnliche
Stromkinetiken und pH50 wie diejenigen,
die für
ASIC1A beobachtet wurden (Chen C-C et al., Proc Natl Acad Sci 1998;
95: 10240-5).
- 3) ASIC2A (zuerst als MDEG, später als MDEG1 beschrieben)
zeigt einen langsam inaktivierenden Strom mit einem pH50 von
4,05 (Waldmann R. et al., J Biol Chem 1996; 271: 10433-6).
- 4) ASIC2B (zuerst als MDEG2 beschrieben) ist eine „Splice-Variante" von ASIC2A, in der
die ersten 185 Aminosäuren
durch eine andere neue Sequenz von 236 Aminosäuren ersetzt sind (Lingueglia
E. et al., J Biol Chem 1997; 272: 29778-83). Sofern ASIC2B im heterologen
Expressionssystemen exprimiert wird, scheint er nicht durch Protonen
aktiviert zu werden.
- 5) DRASIC, der einen zweiphasigen Strom zeigt, in dem die schnell
inaktivierende Komponente einen pH50 von
6,5 und die nicht-inaktivierende Komponente einen pH50 von
3,5 aufweist (Waldmann R. et al., J Biol Chem 1997; 272: 20975-8).
-
Gewebsverteilung von klonierten
Protonen gesteuerten Ionenkanälen
-
ASIC1A-
und ASIC2B-mRNAs sind in sowohl den Gehirn- als auch den Sensorneuronen
vorhanden. ASIC2A-mRNA wird im Zentralnervensystem detektiert, fehlt
jedoch in den Sensorneuronen. ASIC1B und DRASIC werden ausschließlich in
den Sensorneuronen, überwiegend
in Neuronen mit kleinem Durchmesser, exprimiert. Die unterschiedlichen
ASIC-Untereinheiten
im Gehirn (ASIC1A, ASIC2A, ASIC2B) als auch die ASICs in den Sensorneuronen
(ASIC1B, ASIC2B und DRASIC) scheinen in den gleichen Neuronen coexprimiert
zu werden (Waldmann R. et al., Curr Opinion Neurobiol 1998; 8: 418-24).
-
Homo- und heteromultimerer
Aufbau von Protonen gesteuerten Kanal-Untereinheiten
-
Ionenkanäle sind
multimere Komplexe, die aus der Assoziation von verschiedenen identischen
(homopolymeren) und/oder unterschiedlichen (heteropolymeren) Kanal-Untereinheiten entstehen.
Mit Ausnahme von ASIC2B assoziieren alle ASIC-Untereinheiten zu
homomultimeren Komplexen und ergeben die oben beschriebenen funktionellen
Kanäle.
Zusätzlich
wurde für
bestimmte ASIC-Untereinheiten gezeigt, dass diese funktionelle heteromultimere
Kanäle
mit ausgeprägten
spezifischen Eigenschaften ausbilden. Tatsächlich modifiziert ASIC2B,
der selbst nicht zu einem Protonen-gesteuerten Kanal führt, die
Kanal-Charakteristika
von ASIC2A und von DRASIC, wenn er mit dem einen oder dem anderen coexprimiert
wird. Der homomultimere ASIC2A-Kanal weist ein einzelnes exponentielles
Inaktivierungsprofil auf und ist für Natrium hoch selektiv. Wenn
er mit ASIC2B coexprimiert wird, werden die Inaktivierungs-Kinetiken
zweiphasig mit einer langsam inaktivierenden Komponente, die schlecht
zwischen Natrium(Na+)- und Kalium(K+)-Ionen unterscheidet. Entsprechend, wenn
DRASIC mit ASIC2B coexprimiert wurde, wurde der anhaltende Natrium-selektive
Strom von DRASIC für
Kationen nicht-selektiv (pNa+ = pK+) (Lingueglia E. et al., J Biol Chem 1997;
272: 29778-83).
-
Protonen gesteuerte Kanäle sind
mit Degenerinen und Mechanosensation verwandt
-
Wie
oben erwähnt,
gehören
ASICs zu der DEG/ENaC-Superfamilie von Rezeptoren, die ebenfalls
Epithel-Natriumkanäle
(ENaC), die an der Natrium-Homöostase
beteiligt sind, den FMRF-Amid-Peptid-aktivierten Kanal FaNaC von
Helix aspersa, der an der Neurotransmission beteiligt ist, die ATP-gesteuerten
Kationenkanäle,
die ebenfalls an der Neurotransmission beteiligt sind, als auch
die Degenerine von Caenorhabditis elegans, die an der Mechanotransduktion
beteiligt sind, einschließt.
Wie oben erwähnt,
erscheint die Beteiligung von Protonen-gesteuerten Ionenkanälen an der
Schmerzempfindung (Nociception) als wahrscheinlich. Jedoch müssen andere
Funktionen als Schmerzempfindung in Erwägung gezogen werden, da viele
der ASIC-Untereinheiten ebenfalls woanders als in den Sensorneuronen
exprimiert werden. Zusätzlich
zu ihren gesundheitsschädlichen
Wirkungen könnten
Protonen wichtige Rollen als Neurotransmitter spielen, wie aus Berichten über die
neuronale Aktivität
als Antwort auf pH-Fluktuationen impliziert wird. Es muss jedoch
noch bewiesen werden, dass hinreichende pH-Änderungen die ASIC-Kanäle mit niedrigem
pH50, wie beispielsweise ASIC2A- oder ASIC2A
+ ASIC2B-Kanäle,
aktivieren können.
Alternativ könnten
ASIC-Kanäle
ebenfalls durch andere Liganden, wie beispielsweise Neuropeptide
und Neurotransmitter, oder durch mechanische Energie aktiviert werden,
wie aus ihrer Sequenzhomologie mit anderen Mitgliedern der DEG/ENaC-Superfamilie
vermutet werden kann.
-
Zusammenfassung
der Erfindung
-
Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist es, die Primärstruktur, die funktionelle
Charakterisierung und die Gewebsverteilung eines humanen nicht-inaktivierenden
Amiloridsensitiven Protonen-gesteuerten Ionenkanals, hier als hASIC3
bezeichnet, bereitzustellen.
-
Wie
oben gezeigt, beschreiben Waldmann R. et al., J Biol Chem 1997;
272: 29075-8, die Klonierung des Ratten-DRASIC, eines H+-gesteuerten
Kationenkanals, der für
Sensorneuronen spezifisch ist, und der sowohl eine schnell inaktivierende
Komponente als auch eine anhaltende Komponente aufweist. Wie jedoch
aus dem Vergleich der Charakteristika von hASIC3 und DRASIC ersichtlich
wird, bestehen zwischen den beiden Ionenkanälen wichtige Unterschiede.
-
hASIC3
ist nicht das Orthologe des Ratten-DRASIC, wie durch den folgenden
Beweis belegt wird:
- 1) hASIC3 weist 83% Sequenzidentität mit dem
Ratten-DRASIC auf, während
die humanen und Ratten-ASIC1A-Orthologen eine Identität von 97,7%
zeigen und die humanen und Ratten-ASIC2A-Orthologen eine Identität von 99%
zeigen. (Garcia-Anoveros J. et al., Proc Natl Acad Sci 1997; 94:
1459-64).
- 2) Die Gewebsverteilung von hASIC3 ist im ganzen Körper weit
verteilt, während
die Ratten-DRASIC-mRNA auf die Sensorneuronen beschränkt ist
(vgl. 6 und Waldmann R. et al., J Biol Chem 1997; 272:
20975-8).
- 3) Die zweiphasigen Ströme
des hASIC3 und Ratten-DRASIC zeigen unterschiedliche Eigenschaften.
In der folgenden Diskussion bezieht sich der Term „schnelle
Komponente" auf
den schnell inaktivierenden Strom und der Term „langsame Komponente" bezieht sich auf
den anhaltenden Strom, der auf die schnelle Komponente folgt:
• Die schnelle
und langsame Komponente von hASIC3 weisen ähnliche pH50 (3,66
bzw. 3,82) auf, während der
Ratten-DRASIC unterschiedliche pH50 für die schnellen und
langsamen Komponenten (6,5 gegenüber 3,5)
aufweist (vgl. 3 und Waldmann R. et al., J
Biol Chem 1997; 272: 29075-8).
• Die langsame Komponente von
hASIC3 wird durch Amilorid inhibiert, während die langsame Komponente des
Ratten-DRASIC durch Amilorid verstärkt wird (vgl. 5A und 5B und
Waldmann et al., J Biol Chem 1997; 272: 29075-8).
• Umkehrpotentiale
für die
schnellen und langsamen Komponenten des hASIC3 unterschieden sich
durch 15 mV (EUmkschnell = +33 mV und EUmklangsam = +48 mV), während sowohl die schnellen
als auch die langsamen Komponenten des Ratten-DRASIC die gleichen EUmk von
+32 mV aufweisen (vgl. 4 und Waldmann
et al., J Biol Chem 1997; 272: 29075-8).
-
Ein
weiteres Ziel der folgenden Erfindung ist es, eine DNA-Sequenz bereitzustellen,
die für
einen neuen Subtyp eines humanen nicht-inaktivierenden Amilorid-sensitiven
Protonengesteuerten Ionenkanals, hASIC3 und Derivate davon, kodiert.
-
Demgemäß stellt
die vorliegende Erfindung einen isolierten Protonen-gesteuerten
Kationenkanal, eine entsprechende isolierte Nukleinsäure, Verfahren
zu deren Herstellung, entsprechende Zusammensetzungen/Kits und rekombinante
Wirtszellen, die diese enthalten, und die Verwendung derer in Screeningassays, wie
in den Ansprüchen
dargestellt, bereit.
-
In
einer Ausführungsform
wird ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereitgestellt,
das im Wesentlichen aus der Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO.:
1 dargestellt ist, besteht, und Derivate davon.
-
In
einer Ausführungsform
kodiert das isolierte Nukleinsäuremolekül der vorliegenden
Erfindung für
ein Peptid, das im Wesentlichen aus der Aminosäuresequenz besteht, die in
SEQ ID NO.: 2 aufgelistet ist, und Derivate davon.
-
In
einer anderen Ausführungsform
stellt die Erfindung eine isolierte Nukleinsäure bereit, kodierend für eine Untereinheit
des Protonen-gesteuerten Kationenkanals, die die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO.: 2 oder eine Variante dieser Sequenz, die mindestens
531 Aminosäuren
und 85% Identität
damit besitzt, aufweist, wobei der Protonen-gesteuerte Kationenkanal
einen zweiphasigen Strom zeigt und die langsame Komponente des zweiphasigen
Stroms Amilorid-sensitiv ist.
-
RNA,
die für
den hASIC3-Rezeptor kodiert und die aus der DNA in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung (SEQ ID NO.: 1) transkribiert werden
kann, und die im Wesentlichen frei von anderen RNAs ist, bildet
ebenfalls einen Teil der Erfindung und kann zu vielen Zwecken, einschließlich Hybridisierungs-Studien,
In-vitro-Translation genauso wie Translation in geeigneten In-vivo-Systemen,
wie beispielsweise Xenopus-Oozyten, geeignet sein.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls vollständige und/oder Teil-komplementäre und/oder „Antisense"-Nukleotidsequenzen,
die der in SEQ ID NO.: 1 aufgelisteten Nukleotidsequenz entsprechen.
-
In Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung wird ein Vektor, vorzugsweise ein
Expressionsvektor, ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus Plasmid, Phage, Retrovirus, Baculovirus,
Adenovirus und Integrationselementen, die das isolierte Nukleinsäuremolekül der vorliegenden
Erfindung einschließen,
bereitgestellt.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Wirtszellen, die mit einem
Vektor, wie oben beschrieben, transformiert oder transfiziert wurden.
Die Wirtszellen können
prokaryontisch oder eukaryontisch sein und schließen Säugetierzellen
(wie beispielsweise COS-, CHO-Zellen
und humane embryonale Nierenzellen, HEK293), Insektenzellen, Hefe
(wie beispielsweise Saccharomyces cerevisiae) und Bakterien (wie
beispielsweise Escherichia coli) ein. Die Wirtszellen werden entweder
vorübergehend
(„transiently") hASIC3 und/oder Derivate
davon exprimieren, wie im Fall von COS-Zellen, oder werden stabil
mit einem Vektor, der die hASIC3-Sequenz und/oder Derivate davon
trägt,
transfiziert. Eine CHO-Zelllinie oder jede andere Zelllinie, die hASIC3
und/oder beliebige Derivate davon stabil exprimiert, kann für elektrophysiologische,
Kalziumeinstroms-, Ionendarstellungs-, Ligandenbindungs-, Affinitätsaufreinigungs-,
Immunopräzipations-,
Westernbloting- und Immunobloting-Studien verwendet werden. Wirtszellen,
die den Rezeptor nicht exprimieren, können dennoch als Klonierungswirte
geeignet sein.
-
Ein
anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein
Verfahren zur Isolierung eines Liganden bereitzustellen, der das
hASIC3-Protein oder jedes beliebige Derivat davon bindet.
-
Ein
hASIC3 und/oder ein Derivat davon, der/das durch rekombinante DNA-Technologie
in Übereinstimmung
mit der Erfindung hergestellt wurde, findet entweder in situ in
der Membran des Expressionswirts oder in In-vitro-Systemen breite
Verwendung. Insbesondere kann der Rezeptor zum Screening von Liganden und/oder
Verbindungen, die für
eine Vielzahl an humanen (oder von anderen Lebewesen) Erkrankungen
und Zuständen,
wie beispielsweise Schmerz, Entzündung,
Ischämie
und neurodegenerativen Funktionsstörungen, geeignet sind, verwendet
werden. „Liganden" bezieht sich auf
jede beliebige chemische oder biologische Entität, die an jeden beliebigen
intrazellulären
und/oder extrazellulären
Abschnitt oder Teil des hASIC3 und/oder dessen Derivate bindet.
Solche Liganden schließen
Verbindungen ein, die in kombinatorischen chemischen Bibliotheken,
Peptid-Phage-Display-Bibliotheken,
Extrakten, die unbekannte Verbindungen enthalten (zum Beispiel Pflanzenextrakte,
Extrakte marinen Ursprungs, Toxine, Gifte), vorhanden sind, genauso
wie biologische Moleküle,
wie beispielsweise polyklonale und/oder monoklonale Antikörper, Neurotransmitter,
Peptide oder anorganische Ionen und Metalle.
-
Die
Verwendung einer rekombinanten Wirtszelle gemäß der Erfindung zum Screening
von Verbindungen, die als Liganden für den Protonen-gesteuerten
Kationenkanal geeignet sind, werden ebenfalls bereitgestellt. Eine
Nukleinsäure,
die für
einen Kanal der Erfindung kodiert, kann ebenfalls zum Screening
nach Verbindung, die als Liganden für den Protonengesteuerten Kationenkanal
geeignet sind, verwendet werden.
-
Die
Erfindung stellt ebenfalls Zusammensetzungen oder Kits zum Screening
nach Verbindungen, die als Liganden für den Protonen-gesteuerten
Kanal geeignet sind, bereit, welche mindestens eine Komponente, ausgewählt aus
einem Kanal gemäß der Erfindung,
einer Nukleinsäure
gemäß der Erfindung,
einem rekombinanten Vektor gemäß der Erfindung,
einer rekombinanten Wirtszelle gemäß der Erfindung, und jede beliebige geeignete
Hilfskomponente umfassen.
-
Zum
Beispiel wird in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Verwendung des
isolierten Nukleinsäuremoleküls, das
in SEQ ID NO.: 1 aufgelistet ist, oder einer Sequenz, die unter
stringenten Bedingungen mit der in SEQ ID NO.: 1 aufgelisteten Sequenz
hybridisiert, zur Herstellung eines Peptids, das im Wesentlichen
aus der in SEQ ID NO.: 2 aufgelisteten Aminosäuresequenz besteht, bereitgestellt, das
die folgenden Schritte umfasst:
- a) Transformieren
eines Wirts mit einer DNA-Sequenz, die in der Lage ist, für das Peptid
zu kodieren,
- b) Inkubieren des Wirts unter Bedingungen, die die Expression
der Proteinsequenz ermöglichen,
und
- c) Isolieren des Proteins aus dem Wirt durch alle möglichen
Hilfsmittel.
-
Ebenso
wird ein Verfahren zur Herstellung eines Protonen-gesteuerten Kationenkanals
gemäß der Erfindung
bereitgestellt, umfassend Inkubieren einer rekombinanten Wirtszelle
der Erfindung unter Bedingungen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz
ermöglichen,
und Isolieren des Proteins aus der rekombinanten Wirtszelle.
-
Aufzeichnung
oder Darstellung der Aktivität
des Proteins im Wirt kann durchgeführt werden, um die Aktivität des Proteins
zu bestätigen
oder zu verfolgen. Dieses Verfahren kann wiederholt werden, wobei
dieses Mal zwei oder mehr DNA-Sequenzen, die für zwei oder mehr unterschiedliche
Proteine kodieren, verwendet werden, was dazu führt, dass heteropolymere Kanäle erhalten
werden.
-
Derivate
von hASIC3 schließen
funktionelle und/oder strukturelle Varianten, wie unten beschrieben, ein:
- • Derivate
von hASIC3 schließen
Moleküle
ein, deren Sequenz sich durch eine Modifikation und/oder Substitution
und/oder Insertion (Einfügung)
und/oder Deletion (Entfernung) eines oder mehrerer Aminosäurereste
von der hASIC3-Sequenz unterscheidet, solange wie diese Modifikation
und/oder Substitution und/oder Insertion und/oder Deletion die funktionellen
und/oder strukturellen Eigenschaften des hASIC3-Kanals, hauptsächlich die
Aktivierung durch Protonen, nicht modifiziert. Die Aminosäuresequenz der
Derivate muss zu mindestens 85% oder mehr mit der Aminosäuresequenz
von hASIC3 identisch sein. Solche Derivate können durch einen Fachmann nach
etablierten Techniken synthetisiert und/oder analysiert werden.
- • Derivate
von hASIC3 schließen
ebenfalls Moleküle
ein, deren Sequenz sich durch eine Modifikation und/oder Substitution
und/oder Insertion und/oder Deletion eines oder mehrerer Aminosäurereste
von der hASIC3-Sequenz unterscheidet, sogar falls diese Modifikation
und/oder Substitution und/oder Insertion und/oder Deletion die funktionellen
und/oder strukturellen Eigenschaften des hASIC3-Kanals modifiziert, wonach
dieser nicht oder unterschiedlich auf Protonen reagiert.
-
Beispiele
für Derivate
sind hASIC3-artige Kanal-Untereinheiten, die den partiellen Nukleotidsequenzen
entsprechen (exprimierter Sequenz-Tag („Expressed Sequence Tag") erhältlich aus öffentlichen „dbest"-Datenbanken, wie
beispielsweise EST Nr. AI024055, AA628357, AA448259, AA449322, hASIC3-Kanal-Untereinheiten,
die Epitop-„getaggt" am N-Terminus und/oder
C-Terminus sind, genauso wie eine hASIC3-Kanal-Untereinheit, in
der die ersten 150-200 Aminosäuren
durch eine neue und unterschiedliche Aminosäuresequenz, in einer ähnlichen
Weise wie für
ASIC1A und ASIC1B und ASIC2A und ASIC2B beschrieben, substituiert
wurden.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft die Assoziierung von hASIC3 und Derivaten
davon mit anderen Kanal-Untereinheiten, wie beispielsweise den Untereinheiten
des Protonengesteuerten Ionenkanals und Derivaten davon (zum Beispiel
ASIC1A, ASIC1B, ASIC2A, ASIC2B), oder anderen Kanal-Untereinheiten,
die mit der DEG/ENaC-Superfamilie von Rezeptoren verwandt sind,
wie beispielsweise alpha-, beta-, gamma-, delta-ENaC-Untereinheiten oder
den Untereinheiten des P2x-ATP-gesteuerten Ionenkanals. Solche Assoziationen schließen Interaktionen
zwischen Untereinheiten unterschiedlicher Spezies ein, die bevorzugte
Assoziation kommt jedoch zwischen den Untereinheiten der gleichen
Spezies vor.
-
Ein
Beispiel einer heteromeren Assoziation zwischen hASIC3 und Ratten-P2x2
wird hier nachfolgend angegeben. Der resultierende neue Kanal ist
ein neuer Protonen-gesteuerter Ionenkanal, der gegenüber dem pH
höhere
Sensitivität
zeigt. Wenn hASIC3 und P2x2 in Xenopus-Oozyten coinjiziert werden,
können
tatsächlich
Einströme
durch leichte Ansäuerung
auf pH 6,5 aktiviert werden, während
der homomere hASIC3 einen pH von 4,0 erfordert. Diese unterschiedliche
pharmakologische Eigenschaft beweist, dass hASIC3 und P2x2 physikalisch
miteinander assoziieren und einen neuen Ionenkanal erzeugen.
-
Ein
isolierter humaner Protonen-gesteuerter Kationenkanal, der eine
Untereinheit umfasst, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu
mindestens 85% mit der Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO.: 2 identisch ist, wobei der Protonen-gesteuerte Kationenkanal
einen zweiphasigen Strom zeigt, wenn er durch eine extrazelluläre Protonenkonzentration,
die unter dem physiologischen pH liegt, aktiviert wird, und wobei
die langsame Komponente des zweiphasigen Stroms Amilorid-sensitiv
ist, wird ebenfalls bereitgestellt.
-
Die
Erfindung stellt weiterhin einen isolierten Protonen-gesteuerten
Kationenkanal bereit, umfassend eine Untereinheit, die die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO.: 2 oder eine Variante dieser Sequenz, die mindestens
531 Aminosäuren
und mindestens 85% Identität
damit besitzt, aufweist, wobei der Kanal einen zweiphasigen Strom
zeigt, wenn er durch eine extrazelluläre Protonenkonzentration aktiviert
wird, die unter dem physiologischen pH liegt, und die langsame Komponente
des zweiphasigen Stroms Amilorid-sensitiv ist.
-
Beschreibung
der Erfindung
-
Die
Erfindung wird durch spezifische Ausführungsformen, Beispiele und
Figuren beschrieben, mit der Absicht, die Erfindung zu veranschaulichen,
aber nicht deren Umfang zu beschränken.
-
Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
-
1. Nukleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenz
von hASIC3-cDNA (SEQ ID NO.: 1 bzw. NO.: 2) (A), hinterlegt in der
Genbank-Datenbank unter der Zugangsnummer AF057711. Zwei Abschnitte
von 20-34 Aminosäuren,
die den potentiellen Transmembran-Domänen
entsprechen und die im „Kyte-Doolitle"-Hydrophobizitätsplot identifiziert
wurden, sind hervorgehoben. Übereinstimmende
Phosphorylierungs-Stellen in der intrazellulären Domänen und N-Glycosylierungs-Stellen
in der extrazellulären
Domäne
sind durch eingekreiste bzw. umrahmte Reste gezeigt. Homologie (in
%) von hASIC3 (B) und phylogenetische Beziehungen (C) mit bekannten
Mitgliedern der humanen ASIC/ENaC-Familie. Protein-Dendrogramm,
das unter Verwendung des UPGMA-Algorithmus erzeugt wurde (Geneworks
2.5.1, Oxford Molecular Group).
-
2. Zweiphasiger Strom-Phänotyp von
homomeren hASIC3-Kanälen:
Wirkungen von steigenden Raten der pH-Änderung. Oozyten wurden bei –70 mV eingespannt
(„clamped") und kontinuierlich
mit Ringer'schem
Puffer, enthaltend 10 mM HEPES bei pH 7,6, perfudiert. Der pH wurde
nachfolgend für
10 s auf 4,0 erniedrigt und aufsteigende pH-Gradienten wurden durch Erhöhung der
Pufferkapazität-Differenziale
zwischen den Kontroll- und Testpuffern erhalten: A. pH 7,6 auf pH
4,0 in 10 mM HEPES; B. pH 7,6 in 5 mM auf pH 4,0 in 10 mM HEPES
und C. pH 7,6 in 5 mM auf pH 4,0 in 20 mM HEPES. Kontrollen, die
mit den Testpuffern bei pH 7,6 durchgeführt wurden, aktivierten den
hASIC3-Kanal nicht. Die lediglich mit dem Injektionspuffer injizierten
Oozyten zeigten keine Einströme.
Die Amplitude der früheren,
jedoch nicht der späteren
Komponente und somit das Verhältnis
der Früher/Später-Spitzenströme schien
sehr sensitiv gegenüber
der Geschwindigkeit zu sein, mit welcher der pH von normalen auf
saure pH-Werte abfällt.
-
3.
Dosis-Reaktions-Kurven der pH-Aktivierung von hASIC3-Strömen. Dosis-Reaktions-Kurven wurden in
20 mM HEPES erstellt, der bei unterschiedlichen pH-Werten von 6,0
bis 3,0 gepuffert war. Spitzenströme der schnellen und langsamen
Ströme
wurden mit der Vier-Parameter-Logistik-Gleichung
(„four
parameter logistic equation")
und dem partiellen F-Test zum statistischen Vergleich analysiert.
Jeder Punkt repräsentiert
einen Mittelwert +/– SEM
aus diesem typischen Experiment. Außer der maximalen Reaktion
wurde kein anderer signifikanter Unterschied zwischen beiden Kurven
beobachtet.
-
4. Strom-Spannung(I/V)-Beziehung der schnellen
und langsamen hASIC3-Ströme.
Die Aufzeichnungen wurden im Ringer'schen Puffer, enthaltend (in mM): NaCl
115, KCl 2,5, CaCl2 1,8 und HEPES 5, pH 7,6,
durchgeführt.
Die I/V-Beziehung wurde durch Messung der Spitzenströme von sowohl
den schnellen als auch den langsamen Reaktionen auf pH 4,0 (angewandt
1 s nach dem Spannungsschritt) bei unterschiedlichen Membranpotentialen,
nach der Subtraktion der Hintergrundströme, die ohne die pH-Anwendungen
aufgezeichnet wurden, ermittelt (A). Spitzenstromwerte wurden geplottet
(B) und das Umkehrpotential aus der linearen (langsamer Strom) und
nicht-linearen (schneller Strom) Regressionsanalyse abgeschätzt. Felder
A und B repräsentieren
ein typisches Experiment, in dem Umkehrpotentiale 33,4 mV bzw. 44,8
mV für
die schnellen bzw. langsamen Ströme
betrugen.
-
5. Unterschiedliche Sensitivität der schnellen
und langsamen hASIC3-Ströme
auf Amilorid. hASIC3-Ströme
wurden durch pH 4,0 in Gegenwart und Abwesenheit von 100 μM Amilorid
aktiviert (A). Die Inhibierung durch Amilorid war viel stärker auf
den schnellen als auf den anhaltenden Strom. Die Daten in B repräsentieren
einen Mittelwert +/– SEM
(n = 17) der verbleibenden Spitzenströme während der Amilorid-Anwendung
auf die schnellen (37,2 +/– 6,4
%) und anhaltenden (72,0 +/– 3,8%)
Komponenten, die als Prozentsatz der Kontrollen dargestellt wurden.
Statistische Signifikanz (P) wurde durch ungepaarte Zwei-Enden-t-Tests („unpaired
two-tailed t-test")
bestimmt (***P < 0,001).
-
6.
Verteilung der hASIC3-mRNA in normalen humanen Geweben. Hochstringenz-Hybridisierung von
radiomarkierter hASIC3-cDNA an humane polyA+-RNA, die aus Gehirn,
Rückenmark,
inneren Geweben genauso wie aus 17-28-Wochen-alten fötalen Geweben
isoliert wurde, wurde durch densitometrische Analyse im Phosphorimaging
quantifiziert. Die Mengen des PolyA+-RNA-Targets wurden über die
Gewebe normiert, um direkte Vergleiche der Transkriptionsniveaus
zu ermöglichen
(siehe Materialien und Verfahren für Details).
-
7.
Hohe Transkriptionsniveaus des hASIC3-Gens in Sensorganglien sind
in schmerzempfindenden Neuronen angereichert. Lokalisierung der
hASIC3- und Reporter-G3PDH-mRNA
in humanen Trigeminaganglien (TG), Kleinhirn („cerebellum", CB) und Lunge (L)
unter Verwendung von RT-PCR-Amplifizierung mit spezifischen genau
passenden Primern (siehe Abschnitt „Materialien und Verfahren" für Details).
-
8.
Veranschaulichung einer Aufzeichnung des nicht-inaktivierenden Kationenstroms,
der durch starke Säure
(pH 4,0) in Xenopus-Oozyten induziert wurde, in die lediglich der
hASIC3-Klon im pcDNA3-Vektor injiziert wurde.
-
9.
Veranschaulichung einer Aufzeichnung des nicht-inaktivierenden Kationenstroms,
der durch schwache Säure
(pH 6,5) in Xenopus-Oozyten induziert wurde, in die der hASIC3-Klon
und Ratten-P2x2-Klon, beide im pcDNA3-Vektor, coinjiziert wurden.
-
Beispiel 1: Charakterisierung
eines humanen nicht-inaktivierenden Protonen-gesteuerten Ionenkanals, hASIC3
-
Einführung
-
Die
Säureempfindlichkeit
ist eine spezifische Art der Chemorezeption, die eine kritische
Rolle in der Detektion der schmerzempfindenden (nociceptiven) pH-Ungleichgewichte
spielt, die bei Krampf-, Trauma-, Entzündungs- oder Hypoxie-Zuständen auftreten
(Lindahl, 1974). In Säugetieren
exprimiert eine Population von primären Sensorneuronen mit kleinem
Durchmesser in den Spinalganglien und Trigeminaganglien spezialisierte
pH-sensitive Oberflächenrezeptoren,
die durch Erhöhung
der extrazellulären
Protonenkonzentration aktiviert werden (Bevan und Yeats, 1991).
Native elektrophysiologische Reaktionen der Sensorneuronen auf Anwendung
von pH 5,8-6,5 sind durch einen schnell desensibilisierenden Einstrom,
gefolgt von einem langsamen anhaltenden Strom charakterisiert (Krishtal
und Pidoplichko, 1981). Die Aufklärung der nativen molekularen
Zusammensetzung der Protonensensoren in humanen Sensorneuronen wird
ein wichtiger Schritt für
die rationale Entwicklung einer neuen Klasse von Analgetika sein.
Eine Familie von Genen, die für
neuronale Protonen-gesteuerte Kanal-Untereinheiten kodieren, wurde
kürzlich
entdeckt (Garcia-Anoveros
et al., 1997; Waldmann et al., 1997). Heterolog exprimierter Amilorid-sensitiver
homomerer Ratten-ASIC ("Acid
Sensing Ion Channel")
(Waldmann et al., 1997) reagiert auf geringe pH-Änderungen durch einen schnellen
desensibilisierenden Natrium-selektiven Strom, während MDEG1 („Mammalian
DEGenerin 1", Säugetier-DEGenerin-1) (Waldmann
et al., 1996) und DRASIC („Dorsal
Root ganglia ASIC",
Spinalganglien-ASIC) (Waldmann et al., 1997) drastische pH-Änderungen
erfordern, um desensibilisierende bzw. zweiphasige Ströme zu steuern („gate"). ASIC und MDEG1
können
miteinander assoziieren und einen heteromeren Kanal erzeugen, der
bei niedrigem pH (< 5)
aktiviert wird, mit einzigartigen Kinetiken und Ionenselektivitäten (Bassilana
et al., 1997). Für
eine neuronale „Splice"-Variante von MDEG1 wurde gezeigt, dass
diese biophysikalische Eigenschaften von DRA-SIC durch heteromere Assoziation moduliert
(Lingueglia et al., 1997). Diese Protonen gesteuerten Kanäle haben
eine mutmaßliche
Zwei-Transmembrandomänen-Topologie
und die Colokalisierung in Capsaicin-sensitiven Sensorneuronen mit
kleinem Durchmesser mit P2x-ATP-gesteuerten Kanälen gemeinsam (North, 1997).
Nach ihrer Sequenz gehören
sie zu einer expandierenden Gen-Superfamilie, einschließlich der Ephitel-Natriumkanäle von Säugetieren
(Canessa et al., 1994) „pickpocket"(PPK)- und „ripped
pocket"(RPK)-Untereinheiten
von Drosophila (Adams et al., 1998), der Degenerine von C. elegans
(Corey and Garcia-Anoveros,
1996) und des FMRF-Amid-gesteuerten Kanals von Helix aspersa (Lingueglia
et al., 1995). Trotz ihrer potentiellen Bedeutung in der Verfolgung
von pH-Änderungen
im Zentralnervensystem und in den Sensorwegen wurden die humanen
Protonenrezeptor-Gene bisher nicht funktionell charakterisiert.
Wir berichten hier zum ersten Mal von der heterologen Expression
eines humanen Protonen-gesteuerten Kanals genauso wie von signifikanten
Unterschieden zwischen den Spezies, die sowohl für funktionelle Eigenschaften
als auch für örtliche
Verteilungen der Säuresensoren
beobachtet wurden.
-
Material und Verfahren
-
Molekulares Klonieren
-
Unter
Verwendung des tblastn-Algorithmus führte das virtuelle Screening
der dbEST-Datenbank
von NCBI (Lennon et al., 1996) mit Sonden, die dem Proteinmotiv
LXFPAVTLCNXNXXRXS entsprechen, das bei allen bekannten Mitgliedern
der Degenerin/ENaC/ASIC-Familie konserviert ist, zur Identifizierung
von humanen EST-Sequenzen, die für
ein neues Mitglied der Protonensensor-Genfamilie kodieren (Genbank-Zugangsnummern AA449579
und AA429417). Der Klon, der durch 5'-EST AA449579 und durch 3'-EST AA449322 aus einer
gesamten fötalen
cDNA-Bibliothek „getaggt" wurde, wurde an
beiden Strängen
unter Verwendung von wandernden Primern und eines ALF-DNA-Sequenzierers (Pharmacia-LKB)
sequenziert. hASIC3 mit voller Länge
wurde direkt in die einzigen EcoRI- und NotI-Stellen des eukaryontischen
Vektors pcDNA3 (Invitrogen) zur CMV-Promotor-gesteuerten heterologen
Expression in Xenopus-Oozyten subkloniert.
-
Elektrophysiologie in
Xenopus-Oozyten
-
Oozyten,
die chirurgisch aus adultem Xenopus laevis entnommen wurden, wurden
für 2 h
bei Raumtemperatur mit Typ-II-Collagenase (Gibco-BRL) in der Barth'schen Lösung unter
konstantem Rühren/Schütteln behandelt.
Ausgewählte
Oozyten in Phase IV-V wurden vor den Kern-Mikroinjektionen (Bertrand
et al., 1991) mit 5 ng hASIC3 in dem pcDNA3-Vektor manuell defollikuliert.
Nach 2-4 Tagen Expression bei 19°C
in der Barth'schen
Lösung,
enthaltend 50 μg/ml
Gentamycin, wurden die Ströme
in der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme-Konfiguration
unter Verwendung eines OC-725B-Amplifiers (Vervielfachers) (Warner
Instruments) aufgezeichnet. Ströme
ganzer Zellen wurden erzielt und bei 500 Hz auf einem Macintosh-Ilci-Computer
mit einer A/D NB-M1016XL-Schnittstelle (National Instruments) digitalisiert
und nachfolgend wurden die aufgezeichneten Spuren bei 100 Hz im
Axographen (Axon Instruments) nachgefiltert. Agonist, Amilorid und
die Waschlösungen
wurden in einer modifizierten Ringer'schen Lösung, enthaltend 115 mM NaCl,
2,5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2 in 5-20 mM HEPES-Puffer
(Sigma), mit NaOH oder HCl auf pH 2 bis 8 eingestellt, hergestellt
und auf Oozyten bei konstanter Perfusion (10-12 ml/min) bei Raumtemperatur
angewandt. Mittelwerte +/– SEM
entsprachen den Messungen von mindestens 5 Oozyten.
-
RT-PCR und mRNA-„dot blot"-Hybridisierung
-
Die
Gesamt-RNA von Obduktionsproben normaler humaner Trigeminaganglien
wurde unter Verwendung von Trizol-Reagenz (Gibco-BRL) isoliert und
nachfolgend wurde 1 μg
einer zufällig
geprimten reversen Transkription unter Verwendung von Superscript
(Gibco-BRL) unterzogen. Etwa 100 ng RT-cDNA wurden als Matrize für die PCR
mit der Expand-DNA-Polymerase
(Boehringer-Mannheim) verwendet. Spezifische hASIC3-Primer, TCAGTGGCCACCTTCCTCTA
(vorwärts)
und ACAGTCCAGCAGCATGTCATC (rückwärts), wurden
zur Amplifizierung der den Nukleotiden 175-513 (1A)
entsprechenden Region verwendet. Nach anfänglicher Matrizen-Denaturierung
von 2 min bei 94°C
bestanden die Thermozyklen aus: 45 s bei 94°C, 45 s bei 55°C und 2 min
bei 72°C
für 30
Zyklen. Die molekulare Identität
und Homogenität
der PCR-Produkte wurde über
die Größenbestimmung
und über
spezifische Restriktionsmuster überprüft. Anfängliche
Probenbeladung wurde über
Coamplifizierung von Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase(G3PDH)-Grundausstattungs („house-keeping")-mRNA überprüft. RNA-Proben,
die nicht der reversen Transkription unterzogen wurden, jedoch über PCR
unter identischen Bedingungen amplifiziert wurden, stellten unsere
Negativkontrollen.
-
Bekannte
Mengen der humanen polyA+-RNA (89-514 ng), die aus verschiedenen
fötalen
und adulten normalen Geweben isoliert wurden und auf die Transkriptionsniveaus
von verschiedenen Grundausstattungs(„housekeeping")-Genen (Clontech)
normiert wurden, wurden als Punkte geplottet („dot-blotted") und mit dem [32P]-markierten EcoRI-XbaI-Fragment der hASIC3-cDNA
unter hoher Stringenz (Endelution bei 65°C in 0,3 X-SSC-Puffer für 10 min)
untersucht („probed"). Nach einer Exposition
für 16
Stunden wurden Hybridisierungssignale erhalten und unter Verwendung
eines Storm-Phosphorimagers (Molecular Dynamics) quantifiziert und
anschließend
mit der ImageQuant-Software (Molecular Dynamics) densitometrisch
analysiert.
-
Ergebnisse
-
Primärstruktur der hASIC3-Kanal-Untereinheit
-
Die
Sequenzanalyse der 1,7-kb-langen hASIC3-polyA+-mRNA zeigte einen
offenen Leserahmen, kodierend für
531 Aminosäuren
(1A), wobei die Translation an dem proximalen Met-Codon,
der an der Nukleotidposition 22 lokalisiert ist, initiiert wird.
Das vorhergesagte Molekulargewicht von 59 kDa für das unreife Protein wurde
durch In-vitro Translation bestätigt
(Daten nicht gezeigt). Gemäß dem derzeitigen
topologischen Model, das auf der Primärstrukturanalyse und auf biochemischen
Tests beruht, liegt eine große
Domäne
von 365 Aminosäuren
auf der extrazellulären
Seite der Plasmamembran (Canessa et al., 1994). In dieser extrazellulären Domäne sind
insgesamt 15 Cystein-Reste in der ASIC-Familie hoch konserviert,
mit der Ausnahme, dass lediglich Cys267 in humanem BNaC1 (hASIC2)
fehlt. Zwei potentielle Stellen für die Asn-gebundene Glycosylierung,
Asn175 und Asn398, sind in diesem Cystein-reichen Loop lokalisiert.
Consensus-Stellen zur Phosphorylierung durch Casein-Kinase-II (Ser5)
und durch Protein-Kinase-C (Ser39, Ser478, Ser493, Ser521) werden
in der intrazellulären
N-terminalen Domäne
von hASIC3 genauso wie in der intrazellulären C-terminalen Domäne (1A)
vorgefunden. Die hASIC3-Untereinheit zeigt auf dem Aminosäure-Niveau
83% Identität mit
der Ratten-DRASIC-Untereinheit, 48% mit dem humanen BNaC2 (hASIC1)
und 47% mit BNaC1 (hASIC2) (1B). Demnach
gehört
hASIC3 zu der Protonen-gesteuerten Kanal-Familie, die selbst einen
Ast des phylogenetischen Baumes des Degenerin/ENaC/FMRF-Amid-gesteuerten
Kanals (1C) darstellt.
-
Funktionelle und pharmakologische
Eigenschaften von homomeren hASIC3-Kanälen
-
Wenn
sie heterolog in Xenopus-Oozyten exprimiert werden, assemblieren
hASIC3-Untereinheiten
zu funktionellen homomeren Kanälen,
die durch einen niedrigen extrazellulären pH aktiviert werden (2A). Schnelle Änderungen
des extrazellulären
pH (2B-C) zeigten eine zweiphasige Reaktion. Dieser
einzigartige Phänotyp
wurde durch einen schnellen und schnell desensibilisierenden Strom,
gefolgt von einem langsamen und anhaltenden Strom, charakterisiert,
der erst nach der Einstellung des physiologischen pH auf die Basislinie
zurückfiel.
Die relative Amplitude des schnellen Stroms schien vom Anstieg des
angewandten pH-Gradienten abhängig
zu sein (2A-C). Wir haben jedoch festgestellt,
dass die pH-Sensitivität
der zwei hASIC3-vermittelten Ströme
mit einem pH50 von 3,66 +/– 0,06 (schnell)
gegenüber
3,82 +/– 0,04
(langsam) nahezu identisch ist (3). Die
positive Kooperativität,
die in dem Dosis-Reaktions-Kurvenprofil widergespiegelt wurde, nHschnell
= 1,57 +/– 0,3
und nHlangsam = 1,55 +/– 0,17,
deutete darauf hin, dass mindestens zwei Protonierungen an zwei
Untereinheiten erforderlich sind, um den Kationenkanal zu steuern
(„gate"). Um mögliche Unterschiede
der ionischen Selektivität
zwischen den schnellen und langsamen Komponenten zu untersuchen,
führten
wir eine Strom-Spannungs-Beziehung
bei pH 4,0 im normalen Ringer (-Puffer) durch. Die Spitzenamplitude
der schnellen Komponente zeigte gewisse Spannungsabhängigkeit
von deren leichten Einstromgleichrichtung („inward rectification"), während die
langsame und anhaltende Komponente im Bereich von –70 bis
+70 mV ohmsch war (4B). Obwohl beide Umkehrpotentiale
größer als
30 mV waren, wie für Kanäle, die
hauptsächlich
Natrium leiten, erwartet wurde, haben wir weiterhin eine EUmk = +15 +/– 3,2 mV (p < 0,01) zwischen
der schnellen (+32,9 +/– 4,4
mV) und der langsamen Komponente (+48,2 +/– 4,8 mV) gemessen (4A-B).
Diese zwei Phasen des Protonen-induzierten hASIC3-Stroms unterschieden
sich ebenfalls durch ihre Sensitivität gegenüber dem Antagonisten Amilorid.
Coanwendung von 100 μM
Amilorid mit pH 4,0 unter Bedingungen der zweiphasigen Reaktion
zeigten eine wirksamere Blockade des schnellen (62,8 +/– 6,5%)
als des langsamen Stroms (28,7 +/– 4,6%) durch Amilorid (5AB).
-
Zentrale und periphere
Verteilung der hASIC3-Genexpression
-
Als
einen ungefähren
Index für
die anatomische Verteilung und mRNA-Menge entdeckten wir verschiedene
cDNAs, die für
hASIC3 kodieren, in den Gesamt-Fötus-
und Hoden-cDNA-Bibliotheken,
die in der dbEST-Datenbank repräsentiert
waren. Die in der RNA-Hybridisierung
bei hoher Stringenz erhaltenen Ergebnisse bestätigten, dass das hASIC3-Gen
in einem breiten Spektrum der inneren Organe genauso wie im Zentralnervensystem
exprimiert wird (6). Im Erwachsenenstadium wurde
das transkribierte hASIC3 in der Lunge, den Lymphknoten, der Niere,
der Hypophyse, dem Herzen und dem Hoden genauso wie im Gehirn und Rückenmark
detektiert. Eine durch die Entwicklung bewirkte Hochregulierung
der hASIC3-Genexpression war offensichtlich, nachdem fötale mit
adulten mRNA-Niveaus
in der Lunge und Niere verglichen wurden (6). Somit
ist die Expression der hASIC3-Untereinheiten im Gegensatz zum Ratten-DRASIC
nicht ausschließlich auf
die Sensorganglien beschränkt,
was unsere Entscheidung erklärt,
eine chronologische Nomenklatur, die unabhängig von der Verteilung ist,
zu verwenden. Die potentiell bedeutende Funktion der nicht-inaktivierenden Protonen-gesteuerten
Kanäle
in schmerzempfindenden Sensorneuronen wurde dennoch durch die Detektion von
höheren
Niveaus von ASIC3-mRNA in adulten humanen Trigeminaganglien unter
Verwendung der RT-PCR bestätigt.
(7).
-
Beispiel 2: Heteromultimerer
Kanal, zusammengesetzt aus hASIC3 und Ratten-P2x2
-
Um
die Möglichkeit
einer heteromultimeren Assoziation zwischen hASIC3 und/oder Derivaten
davon und anderen Ionenkanal-Untereinheiten zu zeigen, coexprimierten
wir die hASIC3- und Ratten-P2x2-Konstrukte in den Xenopus-Oozyten,
um zu bestimmen, ob die Gegenwart einer ATP-gesteuerten Ionenkanal-Untereinheit
die hASIC3-Kanal-Eigenschaften modifizieren kann. P2x2 zeigt große Ähnlichkeiten
zum hASIC3, wie beispielsweise die Gesamtmembrantopologie (zwei
Transmembran-Domänen,
Cystein-reiche extrazelluläre Domäne), pH-Sensitivität (die Reaktion
des P2x2-homomultimeren Kanals auf ATP wird durch sauren pH stark vergrößert) und
die Gewebsverteilung (sowohl hASIC3 als auch P2x2 sind in den Sensorneuronen
colokalisiert).
-
In 8 wird
die Aufzeichnung des nicht-inaktivierenden kationischen Stroms gezeigt,
der durch starke Säure
(pH 4,0) in Xenopus-Oozyten induziert wurde, in die lediglich der
hA SIC3-Klon im pcDNA3-Vektor injiziert wurde. Diese Daten zeigen,
dass hASIC3 allein zu funktionellen homomeren Kationenkanälen assoziieren
kann.
-
In 9 wird
die Aufzeichnung des nicht-inaktivierenden Kationenstroms gezeigt,
der durch schwache Säure
(pH 6,5) in den Xenopus-Oozyten induziert wurde, in die der hASIC3-Klon
und der Ratten-P2x2-Klon, beide im pcDNA3-Vektor, coinjiziert wurden.
Diese Daten zeigen, dass die Coexpression des hASIC3 und Ratten-P2x2
die pH-Sensitivität
des homomeren hASIC3 ändert
oder zur Bildung von heteromultimeren pH-sensitiven Kanälen führt.
-
Referenzen
-
- Adams C.M., Anderson M.G., Motto D.G., Price M.P., Johnson
WA., and Welsh M.J. (1998) Ripped pocket and pickpocket, novel Drosophila
DEG/ENaC subunits expressed in early development and in mechanosensory neurons.
J. Cell Biol. 140, 143-152.
- Bassilana F., Champigny G., Waldmann R., de Weille J.R., Heurteaux
C., and Lazdunski M. (1997) The acid-sensitive ionic channel subunit
ASIC and the mammalian degenerin MDEG form a heteromultimeric H+-gated
Na+ channel with novel properties. J. Biol. Chem. 272, 28819-28822.
- Bertrand D., Cooper E., Valera S., Rungger D., and Ballivet
M. (1991) Electrophysiology of neuronal nicotinic acetylcholine
receptors expressed in Xenopus oocytes following nuclear injection
of genes or cDNAs. In: Methods in Neurosciences (Conn M.P., ed.)
pp 174-193. New York: Academic.
- Bevan S., and Winter J. (1995) Nerve growth factor (NGF) differentially
regulates the chemosensitivity of adult rat cultured sensory neurons.
J. Neurosci. 15, 4918-4926.
- Bevan S., and Yeats J. (1991) Protons activate a cation conductance
in a sub-population of rat dorsal root ganglion neurones. J. Physiol.
433, 145-161.
- Canessa C.M., Merillat A.M., and Rossier B.C. (1994) Membrane
topology of the epithelial sodium channel in intact cells. Am. J.
Physiol. 267, C1682-1690.
- Canessa C.M., Schild L., Buell G., Thorens B., Gautschi I.,
Horisberger J.-D., and Rossier B.C. (1994) Amiloride-sensitive epithelial
Na+channel is made of three homologous subunits. Nature 367, 463-467.
- Corey D.P., and Garcia-Anoveros J. (1996) Mechanosensation and
the DEG/ENaC ion channels. Science 273, 323-324.
- Coscoy S., Lingueglia E., Laedunski M., and Barbry P. (1998)
The Phe-Met-Arg-Phe-amideactivated sodium channel is a tetramer.
J. Biol. Chem. 273, 8317-8322.
- De LCan A., Munson P.J., and Rodbard D. (1978) Simultaneous
analysis of families of sigmoidal curves: application to bioassay,
radioligand assay, and physiological dose-response curves. Am. J.
Physiol. 235, E97-E102.
- Dray A., and Perkins M. (1993) Bradykinin and inflammatory pain.
Trends Neurosci. 16, 99-104.
- Firsov D., Gautschi I., Merillat A.-M., Rossier B.C., and Schild
L. (1998) The heterotetrameric architecture of the epithelial sodium
channel (ENaC). The EMBO J. 17, 344-352.
- Garcia-Anoveros J., Dertler B., Neville-Golden J., Hyman B.T.,
and Corey D.P. (1997) BNaC1 and BNaC2 constitute a new family of
human neuronal sodium channels related to degenerins and epithelial
sodium channels. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1459-1464.
- Ishibashi K., and Marumo F. (1998) Molecular cloning of a DEG/ENaC
sodium channel from human testis. Biochem. Biophys. Res. Comm. 245,
589-593.
- Kleyman T.R., and Cragoe E.J. (1988) Amiloride and its analogs
as tools in the study of ion transport. J. Membr. Biol. 105, 1-21.
- Konnerth A., Lux H.D., and Morad M. (1987) Proton-induced transformation
of calcium channel in chick dorsal root ganglion cells. J. Physiol.
386, 603-33.
- Krishtal O.A., and Pidoplichko V.I. (1981) A receptor for protons
in the membrane of sensory neurons may participate in nociception.
Neuroscience 6, 2599-2601.
- Krishtal O.A., Osipchuk Y.V., Shelest T.N., and Smirnoff S.V.
(1987) Rapid extracellular pH transients related to synaptic transmission
in rat hippocampal slices. Brain Res. 436, 352356.
- Lennon G., Auffray C., Polymeropoulos M., and Soares M.B. (1996)
The I.M.A.G.E. consortium; an integrated molecular analysis of genomes
and their expression. Genomics 33, 151-152.
- Lindahl O. (1974) Pain- a general chemical explanation. Advances
Neurol. 4, 45-47.
- Lingueglia E., Champigny G., Lazdunski M., and Barbry P. (1995)
Cloning of the amiloridesensitive FNIRFamide peptide-gated sodium
channel. Nature 378, 730-733.
- Lingueglia E., de Weille J.R., Bassilana F., Heurteaux C., Sakai
H., Waldmann R., and Lazdunski M. (1997) A modulatory subunit of
acid sensing ion channels in brain and dorsal root ganglion cells.
J. Biol. Chem. 272, 29778-29783.
- North R.A. (1997) Families of ion channels with two hydrophobic
segments. Current Opinion in Cell Biology 8, 474-483.
- Price M.P., Snyder P.M., and Welsh M.J. (1996) Cloning and expression
of a novel human brain Na+ channel. J. Biol. Chem. 271, 7879-7882.
- Snyder P.M., Cheng C., Prince L.S., Rogers J.C., and Welsh MJ.
(1998) Electrophysiological and biochemical evidence that DEG/ENaC
cation channels are composed of nine subunits. J. Biol. Chem. 273,
681-4.
- Tavernarakis N., Shreffler W., Wang S., and Driscoll M. (1997)
unc-8, a DEG/ENaC family member, encodes a subunit of a candidate
mechanically gated channel that modulates C. elegans locomotion.
Neuron 18, 107-119.
- Waldmann R., Bassilana F., de Weille J., Champigny G., Heurteaux
C., and Lazdunski, M. (1997) Molecular cloning of a non-inactivating
proton-gated Na+ channel specific for sensory neurons. J. Biol.
Chem. 272, 20975-20978.
- Waldmann R., Champigny G., Bassilana F., Heurteaux C., and Lazdunski
M. (1997) A proton-gated cation channel involved in acid-sensing.
Nature 386, 173-177.
- Waldmann R., Champigny G., Voilley N., Lauritzen I., and Lazdunski
M. (1996) The mammalian degenerin MDEG, an amiloride-sensitive cation
channel activated by mutations causing neurodegeneration in Caenorhabditis
elegans. J. Biol. Chem. 271, 0433-10436.
-
-
-
-
-
-
-
