DE69533165T2

DE69533165T2 - Rezeptor für bacillus thuringiensis toxin

Info

Publication number: DE69533165T2
Application number: DE69533165T
Authority: DE
Inventors: A. Lee BULLA; H. Tae JI
Original assignee: University of Wyoming
Current assignee: University of Wyoming
Priority date: 1994-10-19
Filing date: 1995-10-10
Publication date: 2005-07-28
Anticipated expiration: 2015-10-11
Also published as: ZA958851B; EP0787299A1; US5693491A; WO1996012964A1; NZ296265A; DE69533165D1; AU711066B2; AU4001595A; ATE269544T1; US6423502B2; CA2200427A1; ES2224140T3; MX9702551A; US6007981A; US20010010927A1; JPH10508198A; EP0787299B1; EP0787299A4

Description

Die Arbeiten, die zur vorliegenden Erfindung geführt haben, wurden teilweise durch Research Agreement 58-319R-3-011 von dem Office of International Cooperation and Development, U. S. D. A, und durch Cooperative Agreement 58-5410-1-135 vom Arthropod-Borne Animal Disease Laboratory, Agricultural Research Service, U. S. D. A. und durch Grant HD-18702 von den National Institutes of Health unterstützt. Die amerikanische Regierung besitzt bestimmte Rechte an dieser Erfindung.
Die Erfindung betrifft Rezeptoren, die Toxine von Bacillus thuringiensis binden, und somit Pestizide und die Erhöhung der Widerstandsfähigkeit gegenüber Schädlingen. Genauer gesagt bezieht sich die Erfindung auf rekombiniert erzeugte Rezeptoren, die BT-Toxin binden, und ihre Verwendung in Untersuchungen nach verbesserten Pestiziden sowie bei der Mediation einer Zellen- und Gewebezerstörung, Dissoziation, Dispersion, Zelle-Zelle-Assoziation und Änderungen in der Morphologie.
Es ist seit langem bekannt, dass das Bakterium Bacillus thuringiensis (BT) bakteriozide Proteine erzeugt, die in bezug auf einen begrenzten Bereich von Insekten, hauptsächlich der Reihen Lepidoptera, Coleoptera und Diptera, toxisch sind. Von diesen Toxinen wurde in vorteilhafter Weise bei der Überwachung von Schädlingen Gebrauch gemacht, hauptsächlich durch Aufbringen der Bakterien auf Pflanzen oder durch Umwandeln der Pflanzen selbst, so dass diese die Toxine aufgrund ihres transgenen Charakters erzeugen. Die Toxine selbst sind Glycoproteinprodukte des cry-Gens, wie von Höfte, H. et al. In Microbiol Rev (1989) 53: 242 beschrieben. Es wurde festgestellt, dass die Toxine im Bürstensaum der Epithelzellen des Insektenmitteldarmes wirken, wie von Gill, S. S. et al. in Annu Rev Entomol (1992) 37: 615 beschrieben. Die spezifische Bindung von BT-Toxinen an die Bürstensaummembranvesikel des Mitteldarmes wird von Hofmann, C. et al. in Proc Natl Acad Sci USA (1988) 85: 7844; Van Rie, J. et al. in Eur J Biochem (1989) 186: 239 und von Van Rie, J. et al. in Appl Environ Microbiol (1990) 56: 1378 berichtet.
Wahrscheinlich üben die durch BT erzeugten Toxine ihre Effekte über eine Art Wechselwirkung mit Rezeptoren im Mitteldarm aus. Die Reinigung eines speziellen Rezeptors von Manduca sexta wurde von den Erfindern in einem Artikel von Vadlamudi, R. K. et al. in J Biol Chem (1993) 268: 12334 beschrieben. Gemäß diesem Bericht wurde das Rezeptorprotein durch Immunoausfällen von toxinbindenden Proteinkomplexen mit toxinspezifischen Antiseren isoliert, und die Komplexe wurden durch SDS-PAGE mit nachfolgender Elektroelution getrennt. Bis heute gibt es jedoch noch keine strukturellen Informationen, die einen Insektenrezeptor betreffen, der BT-Toxin bindet. Ferner sind nach Kenntnis der Patentinha ber noch keine Gene gewonnen worden, die diese Rezeptoren codieren.
Der Bericht von Vadlamundi et al. in Journal of Biological Chemistry, Volume 268, Seiten 12334 bis 12340 beschreibt die Identifizierung und Reinigung eines einzelnen Bindungsproteins aus einem Lepidopteraninsekt, nämlich Manduca sexta, das spezifisch für ein cr1A-Toxin von B. thuringiensis ist. Das gereinigte Protein erschien als Einzelband von 210 kDa auf einem zweidimensionalen Gel und besaß einen pI von 5,5.
Der Bericht von Van Rie et al. in Science, Volume 247, Seiten 72 bis 74 beschreibt Rezeptorbindungsstudien der indischen Mehlmotte des Stammes Plodia interpunctella in bezug auf ein B. thuringiensis insektizides Kristallprotein.
Insbesondere wurden die Effekte der Rezeptorbindung und Proteaseaktivität auf den Widerstandsmechanismus untersucht.
Die Erfindung stellt rekombinierte Materialien für die Herstellung von BT-Toxin-Bindungsrezeptoren sowie Verfahren zur Verwendung dieser Materialien zur Erzeugung von Rezeptoren zur Verwendung in Untersuchungsproben für Pestizidkandidaten zur Verfügung. Da die native cDNA-Sequenz, die diesen Rezeptor, der als BT-R₁ bezeichnet wird, codiert, aus dem Tabakschwärmer gewonnen wird, kann eine DNA-Codierung für Rezeptoren in anderen Insektenspezies sowie in anderen Organismen, die Homologie in bezug auf den Tabakschwärmerrezeptor besitzen, erreicht werden.
Somit ist gemäß einem Aspekt die Erfindung auf ein Polynucleotid in gereinigter und isolierter Form gerichtet, das eine Nucleotidsequenz umfasst, welche einen Rezeptor codiert, der ein BT-Toxin und andere Liganden bindet und die erforderliche Homologie in bezug auf das BT-R₁-Protein besitzt.
Gemäß anderen Aspekten bezieht sich die Erfindung auf Expressionssystme für Nucleotidsequenzen, die den Rezeptor codieren, Verfahren zur rekombinierten Erzeugung des Rezeptors, den als solchen erzeugten Rezeptor, Antikörper, die spezifisch immunoreaktiv in bezug auf den Rezeptor sind, Untersuchungsverfahren, die zur Untersuchung von Pestizidkandidaten geeignet sind, Antisense-Polynucleotide entsprechend der Codierungssequenz, Verfahren zum Abzielen auf Gewebe und/oder Zellen unter Ausnutzung der Bindungscharakteristiken des Rezeptors und Verfahren zum Manipulieren von Geweben und/oder Zellen unter Ausnutzung der Funktion des Rezeptors.
Es folgt nunmehr eine Kurzbeschreibung der Zeichnungen. Hiervon zeigen:
1 die Nucleotidsequenz und deduzierte Aminosäuresequenz von cDNA, welche das BT-R₁-Protein von M. sexta codiert; und
2 einen Vergleich von Aminosäuresequenzen von Cadherin-Motiven (BTRcad-1 bis 11) in BT-R₁ mit denen von anderen Cadherinen.
Die Erfindung liefert als erstes Sequenzinformationen in bezug auf Rezeptoren, die BT-Toxine im Mitteldarm von Insekten binden.
Das BT-R₁-cDNA-Klon, das in der in den nachfolgenden Beispielen beschriebenen Weise gewonnen wird, codiert ein Protein mit einer identischen Aminosäurezusammensetzung wie der, die für den nativen Rezeptor beschrieben wurde. Des weiteren entsprechen die Toxinbindungsspezifität und Immunoreaktivität einander. Das native 210 kD-BT-R₁ erkennt auf spezifische Weise das cryIA(b)-Toxin von BT-berliner, wobei ein K_d-Wert von 708 pM für das native Protein erhalten wurde.
Das cryIA(b)-Toxin tötet selektiv M. sexta-Larven mit einem LC₅₀ von 7,5 ng/cm² der Nährmitteloberfläche. BT-R1 bindet das Toxin sowohl unter reduzierenden als auch unter nichtreduzierenden Bedingungen, und die Proteasebehandlungen von Intestinal-BBMV-Vesikeln, die aus M. sexta hergestellt wurden, zeigen, dass ein 50 kD-Fragment des 210 kD-Rezeptors für die Toxinbindung ausreichend ist. Die 50 kD-Toxinbindungsdomäne ist extrazellular, da die Intestinal-BBMV-Vesikel vorherrschend von der rechten Seite nach außen orientiert sind, wie von Haase, W. H. et al. in Biochem J (1978) 172: 57 berichtet. Dies entspricht den Eigenschaften der nachfolgend beschriebenen deduzierten Aminosäuresequenz des cDNA-Klons sowie der Bindung des Toxins an die Oberfläche von intakten BT-R1-transfizierten menschlichen Embryo-293-Zellen, wie in Beispiel 3 beschrieben.
Während ein spezielles cDNA-Klon des Tabakschwärmers als Beispiel beschrieben wird, ermöglicht die Zurverfügungstellung dieser Sequenzinformation die Gewinnung von entsprechenden Rezeptoren, die auf BT und verwandte Toxine aus anderen Spezies ansprechen. Dies wird auf bequeme Weise erreicht, indem die erfindungsgemäß erhaltene cDNR als Probe zur Untersuchung von cDNA oder Genombanken unter Stringenzbedingungen, die falsche Werte eliminieren, verwendet wird und im wesentlichen nur entsprechende Rezeptoren mit Codiersequenzen, die homolog in bezug auf die Codiersequenz für den Rezeptor der vorliegenden Erfindung sind, gewonnen werden. Somit werden durch die vorliegende Erfindung das BT-R₁-Protein selbst und die von einer Nucleotidsequenz, die in bezug auf die native Nucleotidsequenz, die BT-R₁ codiert, homolog ist, codierten Rezeptorproteine von der Erfindung zur Verfügung gestellt. Alternativ dazu kann ein Klonen mittels PCR Anwendung finden. Dieses Verfahren macht jedoch nicht von dem Vorteil einer detaillierten und vollständigen Information, die die Verfügbarkeit der Nucleotidsequenz betrifft, welche den Rezeptor voller Länge von M. sexta codiert, Gebrauch. Auch werden durch das Klonen mittels PCR Fehler in die natürlichen DAN-Sequenzen eingeführt. Somit werden durch die Verwendung der cDNA voller Länge als Probe unter Bedingungen einer geeigneten Stringenz nur Nucleotidsequenzen erhalten, die die entsprechenden Rezeptoren codieren. Die Standardhybridisierungsbedingungen umfassen eine Hybridisierung nichtspezifischer DNA, wie Lachs-DNA, bei 500°C und Waschen bei 450°C. Um entsprechende Rezeptoren mit der niedrigsten detektierbaren Homologie mit dem Rezeptor von M. sexta zu erhalten, wird die cDNA-Probe unter Bedingungen einer niedrigen Standardstringenz (30–370C und 4–6 × SSC) hybridisiert. Entsprechende enger verwandte Rezeptoren werden durch Hybridisieren der cDNA-Probe unter moderaten Standardstringenzbedingungen (40–500C in 1 × SSC) erhalten.
Es wird angenommen, dass die Verteilung der Rezeptoren einer geeigneten Homologie im Tierreich ziemlich groß ist. In der Tat wird davon ausgegangen, dass höhere Organismen, wie Säugetiere einschließlich der Primaten, entsprechende Rezeptoren enthalten, die homolog in bezug auf BT-R₁ sind, jedoch auf modifizierte Formen von BT-Toxinen ansprechen. Ferner enthalten andere Parasiten, wie Nematoden, die sowohl Pflanzen als auch Tiere heimsuchen, entsprechende Rezeptoren.
Obwohl einer der Vorteile der Verwendung von BT-Toxinen als Insektizide deren Spezifizität für bestimmte Gattungen von Insekten ist, wird davon ausgegangen, dass diese Spezifizität aus der speziellen Struktur des BT-Toxins resultiert und nicht aus der Nichtverfügbarkeit eines entsprechenden Mechanismus in anderen Insektengattungen. Somit sind modifizierte Formen des BT-Toxins in bezug auf Insekten wirksam, die homologe, jedoch geringfügig verschiedene Formen des Rezeptors gegenüber dem nachfolgend dargestellten BT-R₁-Protein besitzen.
Der hier verwendete Begriff „ein Rezeptor, der auf spezifische Weise ein BT-Toxin bindet" betrifft einen Rezeptor, der in bezug auf das hier dargestellte BT-R₁-Protein homolog ist und entweder BT-Toxine selbst oder BT-Toxine, die in ausreichender Weise modifiziert sind, bindet, um auf diese Weise diese Rezeptoren, die für die erforderliche Homologie in bezug auf BT-R₁ sorgen, zu binden.
Die Kriterien zum Einschluss eines Rezeptors gemäß der vorliegenden Erfindung sind die folgenden Anforderungen: 1) Der Rezeptor soll sich als Rezeptor verhalten, d. h. in der Lage sein, an der Zellmembran angezeigt zu werden; 2) der Rezeptor soll in ausreichender Weise homolog in bezug auf den hier beschriebenen BT-R₁-Rezeptor sein, so dass eine das Protein codierende Nucleotidsequenz unter den vorstehend beschriebenen Stringenzbedingungen zu der in 1 gezeigten BT-R₁ codierenden Nucleotidsequenz hybridisiert; und 3) wenn er auf der Oberfläche einer Zelle angezeigt wird, soll der Rezeptor in der Lage sein, ein BT-Toxin oder eine modifizierte Form eines BT-Toxins zu binden, das bzw. die einen zytotoxischen Effekt entweder auf die Zelle, in der der Rezeptor vorhanden ist, oder in einem Gewebe, mit dem die Zelle assoziiert ist, ausübt.
Die strukturellen Eigenschaften des „modifizierten BT-Toxins" werden durch die vorstehend beschriebene Funktionseigenschaft definiert. Es kann jedoch auch zweckmäßig sein, modifizierte Formen von BT-Toxin durch konservative Aminosäuresubstitutionen oder andere bekannte Proteinmanipulationstechniken, die bei natürlich vorkommenden BT-Toxinen Anwendung finden, zu entwickeln.
Das Vorhandensein von entsprechenden Rezeptoren in anderen Organismen als Insekten sowie in anderen Insekten neben denen, die das BT-R₁ beherbergen, wird durch die Sequenzähnlichkeit des BT-R₁-Proteins mit den verschiedenen Mit gliedern der Cadherin-Superfamilie von Proteinen gestützt, bei denen es sich um Membranglycoproteine handelt, die, wie man annimmt, eine calciumabhängige Zellaggregation und Sortierung bewirken, siehe beispielsweise Takeichi, M. Science (1991) 251: 1451 und Takeichi, M. N Rev Biochem (1990) 59: 237.
Diese Superfamilie enthält Desmoglien, Desmocollins, den Drosophila fat-Tumorsuppressor, das menschliche Intestinalpeptidtransportprotein und T-Cadherin. Alle diese Proteine weisen gemeinsame Extrazellularmotive auf, obwohl ihre zytoplastischen Domänen verschiedenen sind, siehe Goodwin L. et al. Biochem Biophys Res Commun (1990) 173: 1224; Holton, J. L. et al. J Cell Sci (1990) 97: 239; Bestal, D. J. J Cell Biol (1992) 119: 451; Mahoney, P. A. et al. Cell (1991) 853; Dantzig, A. H. et al. Science (1994) 264: 430 und Sano, K. et al. EMBO J (1993) 12: 2249. Der Einschluss von BT-R₁ in die Cadherinsuperfamile wird weiter unterstützt durch den Bericht, dass EDTA die Bindung des cryIA(B)-Toxins von BT an den 210 kD-Rezeptor von M. sexta herabsetzt (Martinez-Ramirez, A. C. et al. Biochem Biophys Res Commun (1994) 201: 782).
Die Aminosäuresequenz von BT-R₁ ergibt, dass ein Calciumbindungsmotiv vorhanden ist. Dies stimmt mit der Möglichkeit überein, dass Zellen mit Rezeptoren zur Bindung von Toxin selbst überleben können, obwohl sie die Gewebe, in denen sie eingeschlossen sind, durchlässig gegenüber Lösungen machen und somit eine Desintegration des Gewebes bewirken. Ein solcher Mechanismus wird für den Tod von Insekten vorgeschlagen, die das Toxin über die Epithelzellen in ihren Mitteldärmen aufnehmen, wie von Knowles, B. H. et al. Biochim Biophys Acta (1987) 924: 09 angegeben. Ein solcher Mechanismus wird auch teilweise durch die im nachfolgenden Beispiel 4 angegebenen Ergebnisse gestützt, die anzeigen, dass der Effekt des Toxins auf Embryo-293-Zellen, die modifiziert sind, um den Rezeptor an ihrer Oberfläche zum Ausdruck zu bringen, reversibel ist.
Zusammengefasst sieht somit die Erfindung eine Familie von Rezeptoren vor, die in der Lage sind, die von BT-Toxin oder seinen modifizierten Formen auf die Zellen, die den Rezeptor ausdrücken, ausgeübten negativen Effekte zu erzeugen, indem die Zellen selbst und/oder das Gewebe oder Organ, von dem die Zellen einen Teil bilden, beschädigt werden. Der Rezeptor kann nativ auf der Oberfläche der Zielzellen zum Ausdruck gebracht werden, oder die Zielzellen können modifiziert werden, um ein Expressionssystem zu enthalten, das die Anzeige des Rezeptors an der Oberfläche bewirkt. Die Zurverfügungstellung dieser Familie von Rezeptoren und von rekombinanten Verfahren für deren Herstellung und für die Herstellung von Zellen, die diese an ihren Oberflächen anzeigen, führt zu einer Reihe von Gelegenheiten, Untersuchungen nach verbesserten Toxinen, insbesondere Insektizidtoxinen, zur Erzeugung von Antikörpern durchzuführen, die nützlich sein können als Alternativen zu chemotherapeutischen Mitteln für die Zerstörung und/oder Dissoziation von unerwünschten Zellen oder Geweben und für die Entwicklung von verbesserten Toxinen und Pharmazeutika.
Untersuchungen
Die Zurverfügungstellung der rekombinanten Familie von Rezeptoren der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Entwicklung von geradlinigen Untersuchungen in bezug auf Toxine, die in erfolgreicher Weise mit diesen Rezeptoren in Wechselwirkung stehen und zu messbaren Effekten in bezug auf die Zellen, in denen die Rezeptoren vorhanden sind, führen. Kurz gesagt, geeignete Wirtzellen, wie COS-Zellen zur Übergangsexpression, CHO-Zellen für eine beständige Expression und eine Vielzahl von anderen Säugetier- und Insektenwirtzellen, können modifiziert werden, um Expressionsvektoren zu enthalten, die für die Wirte geeignet sind, um die Rezeptoren der Erfindung, die auf den Oberflächen der Zellen angezeigt werden, herzustellen. Da es sich bei den Rezeptoren um native Membranproteine handelt, ist keine spezielle Ausbildung des Expressionssystems erforderlich, um deren Disposition an der Zelloberfläche zu bewirken. Expressionsvektoren, die für jeden gewünschten Wirt geeignet sind, sind generell bekannt. Beispielsweise umfassen für die Säugetierexpression geeignete Steuersequenzen die SV40- und Adenovirus-Promotor als konstitutive Promoter, die mit Metallothioneininduzierbaren Promotor, geeignete Verstärker, falls gewünscht, und Terminationssignale u. ä. Für Insektenzellen wird das Bacculovirussystem bevorzugt. Für andere eucaryotische Zellen, wie Hefe, werden üblicherweise die glycolytischen Enzympromoter und diversen Aminosäuresynthesepromoter eingesetzt. Procaryotische Zellen, wie E. coli, können ebenfalls für die Expression des Rezeptors in der erfindungsgemäßen Probe ver wendet werden, beispielsweise unter Einsatz eines Reportergens unter der Steuerung von zyklischem AMP, das mit dem Rezeptor über das Protein G verknüpft ist, so dass die Toxinbindung die Adenylzyklaseaktivität unterbricht und auf diese Weise eine detektierbare Veränderung in der Reportergenaktivität verursacht wird. Das Untersuchungssystem in einem prokaryotischen Wirt kann eine weitere Modifikation erforderlich machen, um das Fehlen von Glycosylation zu kompensieren, das in bekannter Weise in Insektenzellen auftritt, in denen das BT-R₁-Protein auf natürliche Weise ausgedrückt wird.
Zellen werden durch Transfizierung, retrovirale Infektion, Elektroporation oder andere bekannte Mittel modifiziert, um das gewünschte Expressionssystem zu enthalten, und dann unter Bedingungen kultiviert, gemäß denen das Rezeptorprotein erzeugt und angezeigt wird. Falls gewünscht, werden die Zellen dann aus der Kultur zur Verwendung in der Probe gewonnen, oder die Kultur selbst kann als solche verwendet werden.
In den Proben werden die modifizierten Zellen mit dem Toxinkandidat kontaktiert, und der Effekt auf Metabolismus oder Morphologie wird in der Gegenwart oder Abwesenheit des Kandidaten festgestellt. Der Effekt kann zytotoxisch sein, d. h. die Zellen können selbst einen der Indices des Zellentodes aufweisen, wie reduzierte Thymidinaufnahme, langsameres Wachstum der optischen Dichte der Kultur, reduzierte Exklusion von Vitalfarbstoffen (d. h. Trypanblau), erhöhtes Freisetzen von Viabilitätsmarkern, wie Chrom und Rubidium, u. ä. Das unterschiedliche Ansprechverhalten zwischen den toxinbehandelten Zellen und den toxinfreien Zellen wird dann notiert. Die Stärke des Toxins kann durch Feststellung der Stärke des Ansprechverhaltens ermittelt werden.
Diese Untersuchungen können direkt in der vorstehend beschriebenen Weise oder im Vergleich mit bekannten Toxinen durchgeführt werden. Beispielsweise kann ein Versuch darin bestehen, die Verminderung der Bindung von markiertem BT-cry-Toxin in Gegenwart und Abwesenheit des Toxinkandidaten zu messen.
Zusätzlich zur einfachen Untersuchung der Kandidaten kann die Untersuchung dazu verwendet werden, verbesserte Formen von Toxinen zu entwickeln, die mehr oder weniger spezifisch gegenüber speziellen Klassen von Insekten sind, wie gewünscht. Die Fähigkeit zur Bestimmung der Bindungsaffinität (K_a und K_d), der Dissoziations- und Assozitationsraten und der zytotoxischen Effekte eines Kandidaten ermöglicht rasche, genaue und reproduzierbare Untersuchungstechniken in bezug auf eine große Zahl von Toxinen und andere Liganden unter identischen Bedingungen, was bisher nicht möglich war. Diese Informationen erleichtern die Auswahl der wirksamsten Toxine und Liganden für jeden vorgegebenen Rezeptor, der von irgendeiner gewünschten Wirtzelle erhalten wurde.
Bei Vergleichsuntersuchungen können ferner Antikörper Verwendung finden, die spezifisch immunoreaktiv mit dem Rezeptor sind. Solche Antikörper können in herkömmlicher Weise erzeugt werden, indem der gereinigte Rezeptor einem Wirbeltier verabreicht wird, Antikörpertiter überwacht werden und die Antiseren oder Antikörper erzeugenden Zellen für eine Immortalisierung gewonnen werden, um immortalisierte Zellen zu erhalten, die geeignet sind, Antikörper der geeigneten Spezifität zu sekretieren. Techniken zum Erhalten von immortalisierten B-Zellen und zum Untersuchen derselben in bezug auf die Sekretion der gewünschten Antikörper sind nunmehr bekannt. Die resultierenden monoklonalen Antikörper können wirksamer sein als die polyklonalen Antiseren als Vergleichsmittel. Des weiteren stellt die Verfügbarkeit der immortalisierten Zelllinie, die die gewünschten Antikörper sekretiert, die Gleichmäßigkeit der Erzeugung des gleichen Reagensmittels über die Zeit sicher. Die Informationen und strukturellen Eigenschaften der untersuchten Toxine und Liganden ermöglichen eine rationale Annäherung an die Entwicklung von wirksameren Toxinen und Liganden. Des weiteren führen diese Untersuchungen zu einem besseren Verständnis der Funktion und der Struktur/Funktionsbeziehung von Toxin/Ligand und BT-R₁-Analogen. Dies wiederum ermöglicht die Entwicklung von besonders wirksamen Toxinen/Liganden. Die Liganden umfassen natürliche und modifizierte Toxine, Antikörper (Anti-Rezeptor- und antiidiotypische Antikörper, die einen Teil eines Toxins nachahmen, der an einen Rezeptor gebunden ist) und welche Kleinmoleküle auch immer die Rezeptoren binden.
Therapeutische Strategien
Die Fähigkeit von Rezeptoren, die Zerstörung, Dissoziation oder Assoziation von Zellen, Geweben oder Organen zu vermitteln, kann in vorteilhafter Weise ausgenutzt werden, in dem die Untersuchungen als Verfahren zum Identifizieren von erfolgreichen therapeutischen Mitteln bei der Behandlung von beispielsweise bösartigen Geschwulsten, Metastasen und infektiösen Mikroorganismen, die in natürlicher Weise Rezeptoren entsprechend BT-R₁ ausdrücken, eingesetzt werden. Das Vorhandensein von Rezeptoren entsprechend dem hier beschriebenen BT-R₁-Rezeptor und von Elementen aus der Familie der von der Erfindung umfassten Rezeptoren in den unerwünschten Zellen kann ausgenutzt werden, indem zuerst die Wechselwirkung eines vorgeschlagenen therapeutischen Mittels mit den Rezeptoren auf diese Zellen in Kultur abgeschätzt wird und dann Mittel identifiziert werden, die auf erfolgreiche Weise mit den Rezeptoren als geeignete Reagenzmittelkandidaten wirken. Mit diesen Rezeptoren reaktive Antikörper umfassen eine Klasse von erfolgversprechenden therapeutischen Mitteln.
Bei einigen Anwendungsfällen können Zielzellen, Gewebe, Organe und Mikroorganismen, die keinen effektiven Rezeptor entsprechend dem BT-R₁-Rezeptor zum Ausdruck bringen, transformiert oder transfiziert werden, um einen effektiven entsprechenden Rezeptor zum Ausdruck zu bringen. Diese Zielzellen werden dann mit Toxin oder anderen Liganden getötet oder manipuliert. Beispielsweise können Hefezellen, die für Toxinproben für ein spezielles Insekt verwendet werden sollen, mit einem genetischen Konstrukt zur Expression des Rezeptors von diesem Insekt, das dem BT-R₁-Rezeptor entspricht, transformiert werden.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung können die BT-R₁ in bestimmten Zielzellen entsprechenden Rezeptoren durch modifiziertes Toxin oder andere Liganden manipuliert werden, um das normale Ansprechen auf Toxin (Dissoziation, Beschädigung und Tod der Membranen, Zellen, Gewebe und Organismen) zu verhindern. Beispielsweise verhindert auf diese Weise ein Ligand, der auf solche Weise an einen entsprechenden Rezeptor gebunden ist, dass eine normale Rezeptorfunktion verhindert wird, dass der Rezeptor die üblichen zerstörenden Effekte in Gegenwart eines normalen Liganden, wie beispielsweise eines Toxins, initiiert. Mit anderen Worten, die Erfindung ermöglicht die Entwicklung von Wettbewerbsinhibitoren eines Toxins oder anderen Liganden, die normalerweise zerstörende oder andere Effekte über einen BT-R₁ entsprechenden Rezeptor initiieren.
Die folgenden Beispiele dienen dazu, die Erfindung zu erläutern, beschränken diese jedoch nicht.
Beispiel 1
Reinigung und Sequenzbestimmung von BT-R₁-Protein
Es wurden die Mitteldärme von M. sexta extrahiert, und das BT-R₁-Protein wurde mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren von Vadlamudi, R. K. et al. J Biol Chem (1993) 268: 1233 gereinigt. Es wurde bestätigt, dass das elektroeluierte Band BT-R₁-Protein durch Bindung an ¹²⁵I-cryIA(b)-Toxin enthielt. In der Gelelektrophorese besaß das an das Toxin gebundene Protein ein scheinbares Gewicht von etwa 210 kD unter reduzierenden und nichtreduzierenden Bedingungen.
Das gereinigte elektroeluierte BT-R₁ wurde einer Cyanogenbromiddigestion unterzogen, und die Cyanogenbromidfragmente wurden auf einem 17% hochauflösenden Tricin SDS-Polyacrylamidgel separiert, wie von Schagger, H. et al. Anal Biochem (1987) 166: 368 beschrieben. Die separierten Fragmente wurden auf Problott-Membranen (Applied Biosystems) übertragen, und fünf Bänder wurden extrahiert und einem Microsequenzing unter Einsatz von Standardinstrumentierung unterzogen. Dabei wurden folgende Aminosäuresequenzen erhalten:

1. (Met)-Leu-Asp-Tyr-Glu-Val-Pro-Glus-Phe-Gln-Ser-Ile-Thr-Ile-Arg-Val-Val-Ala-Thr-Asp-Asn-Asn-Asp-Thr-Arg-His-Val-Gly-Val-A1a;
2. (Met)-X-Glu-Thr-Tyr-Glu-Leu-Ile-Ile-His-Pro-Phe-Asn-Tyr-Tyr-Ala;
3. (Met)-X-X-X-His-Gln-Leu-Pro-Leu-Ala-Gln-Asp-Ile-Lys-Asn-His;
4. (Met)-Phe/Pro-Asn/Ile-Val-Arg/Tyr-Val-Asp-Ile/Gly;
5. (Met)-Asn-Phe-Phe/His-Ser-Val-Asn-Arg/Asp-Glu.

Beispiel 2
Gewinnung von cDNA
Eine M. Sexta cDNA-Bank wurde aus dem Mitteldarmgewebe in Sgt10 unter Anwendung des Superscript Choice Systems nach den Instruktionen des Herstellers (Life Technologies, Inc.) konstruiert. Degenerierte Oligonucleotidproben wurden auf der Basis der Peptidsequenzen gemäß Beispiel 1 unter Anwendung der in Zhang, S. et al. Gene (1991) 105: 61 beschriebenen Verfahren und des darin beschriebenen Versuches konstruiert. Synthetische Oligonucleotide entsprechend den Peptiden 1–3 von Beispiel 1 wurden mit K³²P unter Verwendung von Polynucleotidkinase markiert und als Proben verwendet, wie im Standardklonhandbuch von Maniatis, T. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2. Ausgabe 1989) beschrieben. Ein alle drei Proben hybridisierendes Klon, identifiziert aus 40 positiven Klonen als alle drei Proben hybridisierend, wurde aus einer Reihe von 4 × 10⁵ Rekombinanten plaque-gereinigt und in pBluescript (Stratagene) subgeklont. Es enthielt einen Einsatz von 5571 bp.
Doppelstrang-cDNA in pBluescript wurde in beiden Richtungen über das Dideoxyterminationsverfahren mit Sequanase (USB) gemäß den Instruktionen des Herstellers sequenziert. Die Sequenzierung zeigte einen offenen Leserahmen von 4584 Basispaaren oder 1528 Aminosäuren zusammen mit einem Polyadenylationssignal bei Position 5561. Die erhaltene Sequenz und die deduzierte Aminosäuresequenz sind in 1 gezeigt.
Somit hatte das deduzierte Protein eine molekulare Masse von 172 kD und einen pI von etwa 4,5. Die Aminosäuresequenzen der Cyanogenbromidfragmente des nativen Rezeptors passen perfekt in die deduzierte Aminosäuresequenz. Der offene Leserahmen beginnt mit einem ATG, das von der Konsensus-Translationsinitiationssequenz GAGATGG für eucaryotische mRNAs flankiert wird, wie von Kozak, M. Nucleic Acids Res (1987) 15: 8125 beschrieben.
Wie in 1 gezeigt, besitzt die deduzierte Aminosäuresequenz ein unterstrichen dargestelltes Putativsignal, das dem mature N-terminus Asn-Glu-Arg-etc. vorausgeht. Elf Wiederholungen (cad1–cad11) sind im Extrazellularbereich aufstromseitig der Membrandomäne stark unterstrichen an den Positionen 1406–1427 gezeigt. Das Ende der 11ten Wiederholung ist mit einer Pfeilspitze dargestellt. Die Positionen der fünf CNBR-Fragmente sind ebenfalls unter der kompletten Sequenz gezeigt.
In 2 ist die hier erhaltene BT-R₁-Sequenz mit anderen Elementen der Cadherinfamilie verglichen. Wie bekannte Cadherine ist die externe Domäne von BT-R₁ stark repetiv und enthält elf Wiederholungen (cad1–cad11, siehe 2A). Bei den anderen in 2B verglichen Cadherinen handelt es sich um Maus p Cadherin (mP EC1), Drosophila fat EC18 (fat EC18) und Protocadherin (PC42 EC2) sowie den menschlichen Intestinaltransporter (HPT-I-EC-1). Die elf Wiederholungen des Cadherinmotivs in BT-R₁ (cad1–cad11) sind in dividuell in einer einzigen Motivsequenz von jedem der anderen Elemente der Cadherinfamilie ausgerichtet. Konservierte Reste sind in Kästen dargestellt. Größte Ähnlichkeit von BT-R₁ mit den Cadherinen besteht in den extrazellularen Wiederholungen des Cadherinmotivs von Maus P-Cadherin, Drosophila fat-Tumorunterdrücker und den Protocadherinen, obwohl die Homologien nicht hoch sind (20–40 Homologie und 30–60% Ähnlichkeit). Die konservierten Wiederholungen von BT-R₁ enthalten AXDXD, DXE, DXNDXXP, einen Glutaminsäurerest und zwei Glycinreste (2B). Die Motive A/VXDXD, DXNDN stellen die Konsensus-Sequenzen für die Calciumbindung dar, und zwei von solchen Bereichen sind in einer typischen Cadherinwiederholung enthalten. Bei allen Wiederholungen von BT-R₁ gehen der Sequenz DXNDN 8 bis 14 hydrophobe Aminosäuren voraus. Entsprechende hydrophobe Sequenzen wurden auch in den Cadherinen beobachtet. Die Länge der hydrophoben Stränge legt nahe, dass diese Bereiche keine Transmembranbereiche sind, sondern J-Blatt-Strukturen repräsentieren, die üblicherweise in cadherinähnlichen Wiederholungen vorhanden sind. BT-R¹ enthält eine putative zytoplasmische Domäne von 101 Aminosäuren, die kleiner ist als zytoplasmische Cadherin-Domänen von Wirbeltieren (160 Aminosäuren), und zeigt keine Homologie in bezug auf irgendeine der zytoplasmischen Caherindomänen oder zytoplasmischen Domänen von anderen Proteinen, mit denen es in einer gegenwärtigen Sequenzdatenbasis verglichen wurde.
Um zu bestätigen, dass das sequenzierte Klon das Volllängen-BT-R₁-Protein codierte, wurde total mRNA aus den Mitteldärmen von M. sexta, die der Northern blot-Analyse unterzogen wurden, durch Hybridisierung mit dem Antisense 4,8 kb SacI-Fragment des BT-R₁-cDNA-Klons hergestellt. Die Northern blot-Analyse wurde durch Hybridisierung der Antisense-Probe bei 420°C und 50% Formamid, 5 × Denhardt's Reagenz, 5 × SSCP und 50 Tg/ml Lachssperma DNA durchgeführt. Das Filter wurde dann zweimal mit 1 × SSC + 0,1% SDS und zweimal mit 0,15 × SSC + 0,1% SDS bei 420°C gewaschen. Jede Waschung dauerte etwa 20 Minuten. Das Filter wurde dann 24 h einem Röntgenfilm ausgesetzt. Die 4,8 kb-Probe hybridisierte zu einem einzigen 5,6 kb-Band.
Das BT-R₁-Klon wurde unter Verwendung von Kaninchenreticulolysat umcodiert, und die entstandenen umcodierten Produkte wurden mit Antiseren gegen das durch BT-R₁ codierte native Protein einer Immunopräzipitation unterzogen. Für die in vitro Umcodierung wurde pBluescript-Plasmid, das BT-R₁-cDNA enthielt, linearisiert und mit T₃ Polymerase (Pharmacia) umgesetzt. Die Umcodierung wurde gemäß den Instruktionen des Herstellers mit mit Nuclease behandeltem Kaninchenreticulolysat (Life Technologies, Inc.) durchgeführt. Nach einer Inkubation von einer Stunde bei 300°C wurde das Reaktionsgemisch mit einem gleichen Volumen von SDS-Puffer kombiniert oder mit 50 mM Tris-Puffer enthaltend 1% NP40 und 250 mM NaCl (pH 8,0) versetzt, um die Immunopräzipitation durchzuführen. Das vorimmune Serum wurde als Kontrolle verwendet. Die Umcodierungs- und Immunopräzipitationsprodukte wurden auf einem 7,5% fixierten SDS-Polyacrylamidgel einer Elektrophorese unterzogen, mit Enhance (Dupont NEN) behandelt, getrocknet und 12 Stunden lang einem Röntgenfilm ausgesetzt.
Es wurden zwei Proteinbänder von etwa 172 kD und 150 kD erhalten, wie durch SDS-PAGE ermittelt. Es wird postuliert, dass das 150 kD-Umcodierungsprodukt auf die Initiierung der Umcodierung von einem internen Methionin bei Aminosäure 242 zurückzuführen war. Dies stimmt mit den Beobachtungen von Kozak, M. Mol Cell Biol (1989) 9: 5073 überein.
Somit bestätigen beide Ergebnisse, dass ein Klon voller Länge erhalten wurde.
Beispiel 3
Rekombinierte Herstellung und Eigenschaften des BT-R₁-Proteins
Das BT-R₁-cDNA-Klon wurde in den Säugetierexpressionsvektor pcDNA3 (Invitrogen) subgeklont, und das Konstrukt wurde in COS-7-Zellen transfiziert. Aus den COS-7-Zellen isolierte Membranen wurden gelöst, einer Elektrophorese unterzogen und mit ¹²⁵I-cryIA(b)-Toxin ligandengeblottet. Die Zellen wurden 60 Stunden nach der Transfizierung geerntet, mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen und durch Einfrieren in flüssigem Stickstoff lysiert. Die Zellmembranen wurden durch Differentialzentrifugation gewonnen, wie von Elshourbagy, N. A. et al. in J Biol Chem (1993) 266: 3873 beschrieben. Die Kontrollzellen waren mit pcDNA3 transfizierte COS-7-Zellen.
Die Zellmembranen (10 Tg) wurden auf 7,5% SDS-PAGE (blotted auf einer Nylonmembran) getrennt und mit Tris-gepuffer ter Salzlösung enthaltend 5% fettfreies Trockenmilchpulver, 5% Glycerol und 1% Tween-20 blockiert. Die Nylonmembran wurde dann mit ¹²⁵I-cryIA(b)-Toxin (2 × 10⁵ cpm/ml) über zwei Stunden mit Blockierpuffer inkubiert, getrocknet und einem Röntgenfilm bei –700°C ausgesetzt. Das markierte Toxin wurde an ein 210 ± 5 kD-Protein gebunden. Das 210 kD-Band wurde nur in Straßen beobachtet, die Membranen enthielten, welche entweder aus M. sexta oder COS-7-Zellen, die mit dem BT-R₁-cDNR-Konstrukt enthaltend 4810 bp von cDNA mit dem offenen Leserahmen transfiziert worden waren, gewonnen wurden.
Die Diskrepanz zwischen dem 210 kD-Protein und dem berechneten 172 kD-Molekulargewicht ist auf die Glycosylation des Proteins zurückzuführen. Eine in vitro-Umcodierung des cDNA-Klons, wie vorstehend beschrieben, die nicht zu einer Glycosylation führt, erzeugt das 172 kD-Protein. Um dies zu verifizieren, wurde das COS-7-erzeugte Protein einer Digestion mit N-Glycosidase-F unterzogen, indem zuerst das gereinigte Protein durch Sieden in 1% SDS über 5 Minuten denaturiert wurde, wonach eine Zugabe von NP-40 bis zu einer Endkonzentration von 1% in Gegenwart von 0,1% SDS folgte. Dann wurde das denaturierte Protein in einem Natriumphosphatpuffer bei pH 8,5 und 370°C mit N-Gly-cosidase-F über 10 h inkubiert. Kontrollbeispiele wurden unter den gleichen Bedingungen ohne Enzym inkubiert. Die Digestionsprodukte wurden auf einem 7,5% SDS-PAGE separiert und mit Coomassie brilliant Blau verunreinigt. Diese Glycosidasebehandlung reduzierte das Molekulargewicht des BT-R₁-Proteins von 210 auf 190 kD. Dies zeigt eine N-Glycosylation bei einigen der 16 Konsensus-N-Glycosylati onsstellen im Protein an. Die Behandlung von BT-R₁ mit O-Glycosidase und Neuraminidase änderte nicht die Mobilität des Proteins.
Ferner wurden Embryo-293-Zellen mit dem BT-R₁-cDNA-Klon in pcDNA3 transfiziert und mit dem markierten Toxin (0,32 nM) in Gegenwart von ansteigenden Konzentrationen (0 bis 10^–6 M) von nichtmarkiertem Toxin inkubiert. Eine nichtspezifische Bindung wurde als gebundene Radioaktivität in Gegenwart von 1 TM nichtmarkiertes Toxin gemessen. Ein Wert für die Dissoziationskonstante (K_d) von 1015 pM wurde durch die Scatchard-Analyse bestimmt. Dies ist etwa der gleiche Wert, der für den natürlichen Rezeptor erhalten wurde, wie von Vadlamudi, R. K. et al. in J Biol Chem (1993) (supra) beschrieben.
Beispiel 4
Physiologischer Effekt von BT-Toxin auf modifizierte Embryo-293-Zellen
Sowohl nichtmodifizierte Embryo-293-Zellen als auch 293-Zellen, die modifiziert wurden, um den BT-R1-Rezeptor wie in Beispiel 3 zu erzeugen, bilden, wenn sie in vitro kultiviert werden, anhaftende sternförmige Cluster. Wenn BT-Toxin (200 nM) dem serumfreien Medium zugesetzt wird, werden die Cluster aufgerundet und lösen sich von den Kunststoffflächen der Kulturschale. Dieser Effekt wird auch unter bekannten Zytotoxizitätsbedingungen für 293-Zellen beobachtet. Es wird nur beobachtet, wenn die Zellen in serum freiem Medium kultiviert werden, da sich das Toxin an das Serum bindet und sonst unter Bedingungen, bei denen das Serum vorhanden ist, ineffektiv wird.
In Gegenwart der Anti-Rezeptor-Antiseren wird dieser Effekt des BT-Toxins jedoch blockiert. Ruch wenn Serum einer Kultur von modifizierten E293-Zellen zugesetzt wird, die unter serumfreien Bedingungen mit dem Toxin behandelt. wurden, kehren die Zellen in ihre normalen sternförmigen anhaftenden Clusterformen zurück. Dies zeigt an, dass der Effekt des Toxins reversibel ist.

Claims

Polynucleotid in gereinigter und isolierter Form, welches eine Nucleotid-Sequenz umfasst, die einen Rezeptor codiert, der spezifisch ein Bacillus thuringiensis (BT)-Toxin bindet, wobei der Rezeptor die Aminosäuresequenz des in 1 gezeigten Rezeptors aufweist oder wobei der Rezeptor durch eine Nucleotid-Sequenz codiert wird, die unter Standardstringenzbedingungen mit der in 1 gezeigten Nucleotid-Sequenz hybridisiert.
Polynucleotid nach Anspruch 1, bei welchem das Toxin das cryIA(b)-Toxin des B. thuringiensis subsp. Berliner ist, oder bei welchem das Toxin eine modifizierte Form von BT-Toxin ist; oder bei welchem der Rezeptor der BT-R₁-Rezeptor der Tabak-Schwärmerraupe Manduca sexta ist.
Rekombinantes Expressionssystem zur Expression einer Nucleotid-Sequenz, die einen Rezeptor codiert, der spezifisch ein BT-Toxin bindet; wobei der Rezeptor die Aminosäuresequenz des in 1 gezeigten Rezeptors aufweist, oder wobei der Rezeptor durch eine Nucleotid-Sequenz codiert wird, die unter Standardstringenzbedingungen mit der in 1 gezeigten Nucleotid-Sequenz hybridisiert, wobei das Expressionssystem die codierende Nucleotid-Sequenz operativ verknüpft mit Konstrollsequenzen umfasst, die in Wirtszellen operativ sind.
Rekombinante Wirtszellen, die so modifiziert sind, dass sie das Expressionssystem nach Anspruch 3 enthalten.
Verfahren zum Herstellen eines Rezeptors, der ein BT-Toxin bindet, wobei das Verfahren die Kultivierung der Zellen nach Anspruch 4 unter solchen Bedingungen beinhaltet, bei welchen der Rezeptor hergestellt wird; sowie optional die Wiedergewinnung des Rezeptors aus der Kultur.
Verfahren nach Anspruch 5, bei welchem der Rezeptor auf der Oberfläche der Zellen angeordnet ist und bei welchem die Zellen optional aus der Kultur zur Verwendung in einem Assay wiedergewonnen werden.
Zellen, die einen an ihrer Oberfläche angeordneten BT-Toxin-Rezeptor exprimieren und durch ein Verfahren herstellbar sind, bei welchem Wirtszellen kultiviert werden, welche derart modifiziert sind, dass sie das Expressionssystem nach Anspruch 3 enthalten, wobei der Rezeptor an der Oberfläche der Zellen angeordnet ist, und wobei die Zellen optional aus der Kultur zur Verwendung in einem Assay wiedergewonnen werden.
Verfahren zur Bewertung der Zytotoxizität eines Testpestizids für einen Insektenrezeptor, der BT-Toxin bindet, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: das Testpestizid wird mit den Zellen nach Anspruch 7 unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die eine Bindung erlauben; und die Zytotoxizität des Testpestizids mit Bezug auf die Zellen wird bewertet.
Verfahren zur Beurteilung der Bindungsaffinität eines Testpestizids mit einem Insektenrezeptor, der BT-Toxin bindet, bei welchem Verfahren das Testpestizid mit den Zellen nach Anspruch 7 unter Bedingungen kontaktiert wird, welche eine Bindung erlauben; und bei welchem das Vorhandensein oder Nicht-Vorhandensein von Bindung des Testpestizids an die Zellen beurteilt wird.
Verfahren nach Anspruch 9, bei welchem die Bindungsaffinität des Testpestizids an den Rezeptor gemessen wird.
Gereinigtes und isoliertes Polynucleotid, welches eine Nucleotid-Sequenz enthält, die zu einer Nucleotid-Sequenz komplementär ist, die einen Rezeptor codiert, der sich an BT-Toxin bindet, wobei der Rezeptor die Aminosäuresequenz des in 1 gezeigten Rezeptors aufweist oder wobei der Rezeptor durch eine Nuucleotid-Sequenz codiert wird, die unter Standardstringenzbedingungen mit der in 1 gezeigten Nucleotid-Sequenz hybridisiert.
Zusammensetzung, welche Antikörper enthält, die spezifisch auf einen Rezeptor immunreaktiv sind, der spezifisch, ein BT-Toxin bindet, wobei der Rezeptor durch das Polynucleotid nach Anspruch 1 codiert wird.
Verfahren zum Modifizieren von Zielzellen, um sie empfindlich auf eine Wechselwirkung mit einem BT-Toxin zu machen, bei welchem Verfahren die Zellen so modifiziert werden, dass sie das Expressionssystem nach Anspruch 3 enthalten; und die Zellen unter Bedingungen kultiviert werden, bei welchen der Rezeptor an der Oberfläche der Zellen angeordnet ist.
Zellen, die durch das Verfahren nach Anspruch 13 modifiziert wurden.
Verfahren zur Ausübung einer zytotoxischen Wirkung auf Zielzellen oder auf ein Gewebe, mit dem die Zielzellen zusammenhängen, wobei die Zielzellen auf ihrer Oberfläche einen Rezeptor enthalten, der spezifisch BT-Toxin bindet, bei welchem Verfahren die Zellen mit der Antikörperzusammensetzung nach Anspruch 12 in Kontakt gebracht werden.