ES2224140T3 - Receptor para una toxina de bacillus thuringiensis. - Google Patents

Abstract

SE HA OBTENIDO Y SECUENCIADO EL CADN QUE CODIFICA UN RECEPTOR DE GLICOPROTEINA A PARTIR DEL GUSANO DEL TABACO QUE SE UNE A UNA TOXINA DEL "BACILLUS THURINGIENSIS". LA DISPONIBILIDAD DE ESTE CADN PERMITE LA RECUPERACION DE ADNS QUE CODIFICAN RECEPTORES HOMOLOGOS EN OTROS INSERTOS Y ORGANISMOS ASI COMO EL DISEÑO DE ENSAYOS PARA LA CITOTOXICIDAD Y LA AFINIDAD DE UNION DE PESTICIDAS POTENCIALES Y EL DESARROLLO DE METODOS PARA MANIPULAR RECEPTORES HOMOLOGOS NATURALES Y/O INTRODUCIDOS Y, DE ESTA FORMA, DESTRUIR CELULAS, TEJIDOS Y/O ORGANISMOS DE OBJETIVO.

Description

Receptor para una toxina de Bacillus thuringiensis.

Reconocimiento de apoyo gubernamental

El trabajo resultante de la presente invención fue subvencionado en parte por el Convenio de Investigación 58-319R-3-011 de la Office of International Cooperation and Development, U.S.D.A y por el Cooperative Agreement 58-5410-1-135 del Arthropod-Borne Animal Disease Laboratory, Agricultural Research Service, U.S.D.A. y por la subvención HD-18702 del National Institutes of Health. El gobierno de los Estados Unidos ostenta ciertos derechos sobre la presente invención.

Campo de la invención

La invención se refiere a los receptores que se unen a las toxinas del Bacillus thuringiensis y por consiguiente a los pesticidas y a la resistencia a las plagas. Mas particularmente, la invención se refiere a receptores producidos por procedimientos recombinantes que se unen directamente a la toxina BT y a sus utilizaciones en ensayos de pesticidas mejorados, así como en la participación en la destrucción, disociación, dispersión, asociación intercelular y los cambios de morfología de células y tejidos.

Antecedentes de la invención

Se ha reconocido desde hace tiempo que la bacteria Bacillus thuringiensis (BT) produce proteínas bactericidas que son tóxicas para un diversos insectos, principalmente del orden de los Lepidópteros, Coleópteros y Dipteros. Se an aprovechado tales toxinas para controlar las plagas, principalmente aplicando bacterias a las plantas o transformando las plantas propiamente de forma que generen las toxinas en virtud de su carácter transgénico. Las propias toxinas, son productos glicoproteicos del gen cry tal como describen Höfte, H. et al., Microbiology Rev. 53: 242 (1989). Se ha descubierto que tales toxinas actúan en el borde de cepillo del epitelio de las células del intestino medio del insecto, tal como describen Gill, S.S., et al., Annu. Rev. Entomol., 37:615 (1992). La unión específica de las toxinas de BT a las membranas de las vesículas del borde de cepillo del intestino medio a sido descrita por Hofmann, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:7844 (1988); Van Rie, J. et al., Eur. J. Biochem. 186:239 (1989) y Van Rie, J., et al., Appl. Environ. Microbiol., 56:1378 (1990).

Se supone que las toxinas generadas por BT ejercen sus efectos mediante algún tipo de interacción con receptores en el intestino medio. La purificación de un receptor en particular a partir de Manduca sexta fue publicada por el presente inventor en un artículo de Vadlamudi, R.K. et al., J. Biol.. Chem. 268:12334 (1993). En dicha publicación, la proteína receptora se aisló por inmunoprecipitación de los complejos proteicos que se unen a las toxinas con antisueros específicos para las toxinas y separando los complejos por SDS-PAGE seguida de electroelución. Sin embargo, hasta la fecha, no ha existido información estructural concerniente a ninguno de los receptores que se unen a la toxina BT en los insectos, ni, que sepan los solicitantes, se ha recuperado ningún gen codificante de dichos receptores.

La publicación de Vadlamundi et al., en el Journal of Biological Chemistry, 268:12334-12340 describe la identificación y purificación de una única proteína de unión a partir de un insecto lepidóptero, Manduca sexta, que es específica para una toxina crIA de B. thuringiensis. La proteína purificada apareció como una única banda de 210 kDa en un gel de dos dimensiones, y tuvo un pI de aproximadamente 5,5.

La publicación de Van Rie et al., en Science, 247:72-74 describe estudios de unión a receptores de la polilla India de la harina, cepa Plodia interpunctella, a la proteína cristalina insecticida de B. thuringiensis. En particular se estudiaron los efectos de la unión al receptor y la actividad proteasa sobre el mecanismo de resistencia.

Exposición de la invención

La invención proporciona materiales recombinantes para la producción de receptores que se unen a la toxina BT así como también procedimientos para la utilización de tales materiales en la generación de receptores para la utilización en ensayos de selección de candidatos a pesticidas. Debido a que la secuencia de cADN nativa codificante de tal receptor, designado BT-R_{1}, ha sido extraída del gusano cornudo del tabaco, se puede obtener ADN codificante para receptores en otras especies de insectos, así como también en otros organismos, con homología al receptor del gusano cornudo.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención se refiere a un polinucleótido en forma purificada y aislada que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de un receptor que se une a una toxina BT y otros ligandos y que tiene la homología requerida a la proteína BT-R_{1}.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a sistemas de expresión para secuencias de nucleótidos codificantes del receptor, a procedimientos para la producción recombinante del receptor, al receptor tal como se produce de esta forma, a anticuerpos específicamente inmunorreactivos con el receptor, a procedimientos de ensayo útiles para la selección de candidatos a pesticidas, a polinucleótidos antisentido correspondientes a la secuencia codificante, a procedimientos para dirigirse a tejidos y/o células utilizando las características de unión del receptor y a procedimientos para la manipulación de tejidos y/o células utilizando la función del receptor.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida del cADN codificante de la proteína BT-R_{1} de M. sexta.

La Figura 2 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos de los motivos cadherina (BTRcad-1 a 11) en BT-R1 con los de otras cadherinas.

Formas de realización de la invención

La invención proporciona, por primera vez, información sobre la secuencia concerniente a los receptores que se unen a las toxinas BT en los intestinos medios de los insectos.

El clon de cADn de BT-R_{1} derivado tal como se describe más adelante en los ejemplos codifica una proteína con una composición de aminoácidos idéntica a la descrita para el receptor nativo. Además, la especificidad de unión a la toxina y la inmunorreactividad son similares. El BT-R_{1} nativo de 210 kDa reconoce específicamente la toxina cryIA(b) de BT-berliner,: se obtuvo un valor de K_{d} de 708 pM para la proteína nativa.

La toxina cryIA(b) mata selectivamente las larvas de M. sexta con una LC_{50} de 7,5 ng/cm^{2} de superficies de la dieta. BT-R_{1} se une a la toxina tanto bajo condiciones reductoras como no reductoras y el tratamiento con proteasas de las vesículas BBMV intestinales preparadas a partir de M. sexta mostró que un fragmento de receptor de 50 kDa del receptor de 250 kDa es suficiente para la unión de la toxina. El dominio de 50 kDa de unión a la toxina es extracelular ya que las vesículas BBMV intestinales están predominantemente orientadas con el lado correcto hacia afuera tal como describen Haase, W.H. et al., Biochem. J. 172:57 (1978). Ello es consistente con las características de la secuencia de aminoácidos deducida del clon de cADN descrito más adelante, así como también con la unión de la toxina a la superficie de células embriónicas humanas 293 intactas transfectadas con BT-R_{1} tal como se describe en el Ejemplo 3.

Mientras que se ha descrito un clon particular de cADN del gusano cornudo del tabaco como ilustración, la disponibilidad de la información de dicha secuencia permite extraer los correspondientes receptores que responden a BT y toxinas relacionadas de otras especies. Esto se logra convenientemente utilizando el cADN obtenido en la presente invención como sonda para seleccionar cADN o librerías genómicas bajo condiciones de rigurosas que eliminen los falsos positivos y extraen esencialmente solo los receptores correspondientes con secuencias codificantes homólogas a la secuencia codificante para el receptor de la presente invención. Por consiguiente, la presente invención proporciona la proteína BT-R_{1} propiamente y las proteínas receptoras codificadas por secuencias de nucleótidos homólogas a la secuencia de nucleótidos nativa codificante de BT-R_{1}. Por el contrario, se puede utilizar clonaje mediante PCR; sin embargo, dicho procedimiento no aprovecha la completa y detallada información residente en la disponibilidad de la secuencia de nucleótidos codificante del receptor completo de M. sexta. Además, el clonaje mediante PCR introduce errores en la secuencia de ADN natural. Por consiguiente, mediante la utilización del cADN completo como sonda bajo condiciones apropiadamente rigurosas, solamente se obtendrán las secuencias de nucleótidos codificantes de los correspondientes receptores. Las condiciones estándar de hibridación incluyen la hibridación con ADN no específico tal como ADN de salmón a 500C y lavado a 450C. Para obtener receptores correspondientes con la mínima homología detectable con el receptor de M. sexta, la sonda de cADN se hibrida bajo condiciones estándar de bajo rigor (30-370C y 4-6 x SSC). Los receptores correspondientes más próximamente relacionados se obtienen por hibridación de la sonda de cADN bajo condiciones estándar de severidad moderadas (40-500C en 1 x SSC).

La distribución de receptores con homología apropiada en el reino animal se cree que es bastante amplia. Desde luego, se cree que los organismos superiores tales como los mamíferos, incluidos los primates, contienen receptores correspondientes homólogos a BT-R_{1} pero que responden a formas modificadas de las toxinas BT. Además, otros parásitos tales como los nematodos, tanto los que afectan a las plantas como los que afectan a los animales, contendrán los correspondientes receptores.

Aunque una de las desventajas de la utilización de toxinas BT como insecticidas es su especificidad por ciertos órdenes de insectos, dicha especificidad se cree que resulta más bien de la estructura particular de la toxina BT que de la indisponibilidad de los correspondientes mecanismos en otros órdenes de insectos. Por consiguiente, las formas modificadas de la toxina BT serían efectivas con respecto a los insectos que contienen formas del receptor homólogas pero ligeramente diferentes a las de la proteína BT-R_{1} ilustrada más adelante.

Tal como se utiliza en la presente solicitud, "Un receptor que se une específicamente a la toxina BT" se refiere a un receptor que es homólogo a la proteína BT-R_{1} ilustrada en la presente solicitud y que se une a las toxinas BT propiamente o a las toxinas BT que están suficientemente modificadas como para unirse a los receptores que proporcionan la necesaria homología a BT-R_{1}.

Los criterios para la inclusión de un receptor en la presente invención son la necesidad de que 1) se comporte como un receptor, es decir, tenga capacidad para ser expuesto en la membrana celular; 2) sea lo suficientemente homólogo al receptor BT-R_{1} descrito en la presente solicitud como para que una secuencia de nucleótidos codificante de la proteína se hibride, bajo las condiciones de rigurosidad descritas anteriormente, a la secuencia de nucleótidos codificante de BT-R_{1} tal como se muestra en la Figura 1; y 3) cuando expuesto en la membrana de una célula, sea capaz de unirse a la toxinas BT o una forma modificada de la toxina BT que ejerce un efecto citotóxico sobre la célula en la que reside el receptor o sobre el tejido con el que la célula se encuentra asociado.

Las características estructurales de la "toxina BT modificada" están definidas por la propiedad funcional descrita anteriormente, pero podría ser conveniente diseñar formas modificadas de la toxina BT mediante sustituciones conservadoras de aminoácidos u otros procedimientos conocidos para la manipulación de proteínas aplicados a las toxinas BT naturales.

La presencia de receptores similares en organismos no de insecto así como también en otros insectos además de los portadores de BT-R_{1} está apoyada por la semejanza de la secuencia de la proteína BT-R_{1} con la de diversos miembros de la superfamilia de proteínas cadherina, que so unas glicoproteínas de membrana que se cree participa en la agregación y separación de las células mediada por el calcio. Ver, por ejemplo, Takeichi, M. Science 251:1451 (1991) y Takeichi, M. N. Rev. Biochem. 59:237 (1990).

Incluida en dicha superfamilia se encuentran desmoglien, desmocollinas, el supresor de tumores Drosophila fat, la proteína intestinal humana transportadora de péptidos y la cadherina-T. Todas estas proteínas comparten motivos extracelulares comunes aunque sus dominios citoplasmáticos difieren. Goodwin, L. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.,173:1224 (1990); Holton, J.L. et al., J. Cell. Sci., 97:239 (1990); Bestal., D.J., J. Cell Biol., 119:451 (1992); Mahoney, P.A., et al., Cell 853: (1991); Dantzig, A.H., et al., Science, 264:430 (1994) and Sano, K. et al., EMBO J., 12:2249 (1993). La inclusión de BT-R_{1} en la superfamilia de la cadherina está además apoyada por la publicación de que el EDTA disminuye la unión de la toxina cryIA(b) de BT al receptor de 210 kDa de M. sexta (Martínez-Ramirez, A.C., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 201:782 (1994)).

Se subraya más adelante que la secuencia de aminoácidos de BT-R_{1} revela que el motivo de unión a calcio se encuentra presente. Ello es consistente con la posibilidad de que las células con receptores para unirse a la toxina puedan sobrevivir aunque hagan al tejido en el que están incluidas permeable a los solutos y por consiguiente produzcan la desintegración del tejido. Tal es el mecanismo propuesto por Knowles, B.H., et al., Biochem. Biophys. Acta, 924:509 (1987) para la muerte de los insectos que ingieren la toxina mediante las células epiteliales en su intestino medio. Dicho mecanismo también está apoyado en parte por los resultados expuestos en el Ejemplo 4, más adelante en la presente solicitud, que indica que el efecto de la toxina sobre loas células 293 embriónicas modificadas para expresar el receptor en su superficie es reversible.

Por consiguiente, en resumen, la presente invención proporciona una familia de receptores capaz de mediar en los efectos negativos ejercidos por la toxina BT o sus formas modificadas sobre las células que expresan el receptor, dañando a las mismas células y/o el tejido u órgano del cual las células forman parte. El receptor se puede expresar nativamente en la superficie de las células diana o las células diana se pueden modificar para contener un sistema de expresión que producirá el despliegue de receptores en la superficie. La disponibilidad de dicha familia de receptores y procedimientos recombinantes para su producción y para la producción de células expresándolos en su superficie proporciona múltiples oportunidades para realizar ensayos de selección de toxinas mejoradas, en particular toxinas insecticidas, para la generación de anticuerpos que pueden ser útiles como alternativas a los agentes quimioterapéuticos para la destrucción y/o disociación de las células no deseadas o tejidos y para el diseño de mejores toxinas y fármacos.

Ensayos de selección

La disponibilidad de la familia de receptores recombinantes de la presente invención permite diseñar ensayos de selección directos para las toxinas que interacturán con éxito con dichos receptores produciendo efectos medibles en las células en las que los receptores residen. En breve, las células huésped adecuadas, tales como células COS para la expresión transitoria, células CHO para la expresión estable y diversas células huésped de mamífero e insecto se pueden modificar para que contengan vectores de expresión adecuados al huésped para la producción de los receptores de la presente invención desplegados en la superficie de las células. Ya que los receptores son nativamente proteínas de membrana, no es necesario un diseño particular de sistema de expresión para que se produzca su disposición en la superficie celular. En la técnica se conocen vectores de expresión adecuados para cualquier huésped. Por ejemplo, para la expresión en mamíferos, las secuencias control adecuadas incluyen los promotores de SV40 y adenovirus como promotores constitutivos, el promotor inducible de metalotionina, amplificadores adecuados, si es deseable y señales de terminación y semejantes. Para las células de insectos, se prefiere el sistema de baculovirus. Para otras células eucarióticas tales como las levaduras, se utilizan generalmente los promotores de los enzimas glicolíticos y diversos promotores de la síntesis de aminoácidos. Las células procarióticas tales como E. coli también se pueden adaptar para la expresión de receptor en el ensayo de la invención, por ejemplo, mediante la utilización de un gen reportador bajo el control de AMP cíclico y asociado funcionalmente al receptor mediante proteína G de forma tal que la unión de la toxina interrumpa la actividad de adenilciclasa y de esta forma produzca un cambio detectable en la actividad del gen reportador. El sistema de ensayo en un huésped procariótico puede necesitar modificación adicional para compensar la pérdida de glicosilación que se conoce ocurre en las células de los insectos donde la proteína BT-R_{1} se expresa naturalmente.

Las células se modifican por transfección, infección con retrovirus, electroporación u otros procedimientos conocidos, para que contengan el sistema de expresión deseado y a continuación se cultivan en condiciones bajo las cuales se produce y despliega la proteína del receptor. Si se desea, a continuación las células se extraen del cultivo para su utilización en el ensayo, o el cultivo en si se puede utilizar tal cual.

En los ensayos, las células modificadas se ponen en contacto con la toxina candidata y se registra el efecto sobre el metabolismo o la morfología en presencia o ausencia del candidato. El efecto puede ser citotóxico, es decir, las células propiamente pueden mostrar uno de los índices de muerte celular, tal como la reducción en la admisión de timidina, un más bajo incremento de la densidad óptica del cultivo, una reducción en la exclusión de colorantes vitales (p. ej. azúl trypan), una incrementada liberación de los marcadores de viabilidad tales como cromo, rubidio y semejantes. A continuación se registra la respuesta diferencial entre las células tratadas con toxina y las células ausentes de toxina. La potencia de la toxina se puede medir registrando la intensidad de la respuesta.

Tales ensayos se pueden realizar directamente tal como se describieron anteriormente o competitivamente con toxinas conocidas. Por ejemplo, una estrategia puede ser la de medir la disminución en la unión de toxina cry de BT marcada en presencia o ausencia de la toxina candidata.

Además de simplemente seleccionar candidatos, la selección se puede utilizar para diseñar formas mejoradas de las toxinas que sean más o menos específicas para clases particulares de insectos según se desee. La capacidad para determinar la afinidad de la unión (K_{a} y K_{d}), las velocidades de disociación y asociación y los efectos citotóxicos de un candidato permite disponer de procedimientos rápidos, precisos y reproducibles para la selección de muchas toxinas y otros ligandos bajo condiciones idénticas lo que no era posible hasta ahora. Tal información facilitará la selección de las toxinas y ligandos más efectivos para cualquier receptor determinado obtenido de cualquier célula huésped deseada.

Los ensayos de competición también pueden utilizar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con el receptor. Tales anticuerpos se pueden preparar de forma convencional por administración del receptor purificado a un animal vertebrado, siguiendo la titulación de anticuerpo y recobrando el antisuero o las células productoras de anticuerpo para su inmortalización, para obtener células inmortalizadas capaces de segregar anticuerpos con la especificidad apropiada. Los procedimientos para obtener células B inmortalizadas y para seleccionarlas para la secreción del anticuerpo deseado son conocidos en la técnica. Los anticuerpos monoclonales resultantes pueden ser más efectivos que los antisueros policlonales como reactivos para la competición, además, la disponibilidad de la línea celular inmortalizada que segregue el anticuerpo deseado asegura la uniformidad de la producción del mismo reactivo a lo largo del tiempo. La información y las características estructurales de la toxina y los ligandos ensayados permitirá una estrategia racional en el diseño de toxinas y ligandos más eficaces. Además, dichos ensayos conducirán a un mejor entendimiento de la función y la relación estructura/función de la toxina/ligando como de los análogos BT-R_{1}. A su vez, ello permitirá el desarrollo de toxinas/ligando muy efectivos. Los ligandos incluyen las toxinas naturales y modificadas, anticuerpos (anticuerpos antirreceptor y antiidiotipo que imitan una parte de la toxina que se une al receptor) y cualquier molécula pequeña que se una al receptor.

Estrategias terapéuticas

Se puede aprovechar la capacidad de los receptores para mediar en la destrucción, disociación o asociación de las células, tejidos u órganos utilizando el ensayo de selección como procedimiento para identificar terapéuticas exitosas en el tratamiento de, por ejemplo, los cánceres, metástasis y los microorganismos infecciosos que naturalmente expresan los receptores correspondientes a BT-R_{1}. La presencia de receptores correspondientes al receptor BT-R_{1} ilustrado en la presente solicitud y los miembros de la familia de receptores incluidos en la invención en las células no deseables se puede explotar primero evaluando la interacción del agente terapéutico propuesto con el receptor en tales células en cultivo y a continuación identificando agentes que interactúen con éxito con los receptores como agentes candidatos útiles. Los anticuerpos reactivos con dichos receptores comprenden una clase de candidatos terapéuticos prometedores.

En algunas aplicaciones las células diana, tejidos, órganos y microorganismos que no expresan un receptor efectivo correspondiente a BT-R_{1} se pueden transformar o transfectar para que expresen un receptor correspondiente efectivo. A continuación se matarán o manipularán dichas dianas con toxinas u otros ligandos. Por ejemplo, se pueden transformar células de levadura útiles para ensayos de toxinas para un insecto en particular con una construcción genética para la expresión del receptor de tal insecto que corresponde al receptor BT-R_{1}.

En otro aspecto de la presente invención los receptores correspondientes a BT-R_{1} en ciertas células diana se pueden manipular mediante toxinas modificadas u otros ligandos para evitar la respuesta normal a la toxina (disociación, daño y muerte de las membranas, células, tejidos y organismos). Por ejemplo, un ligando que se une a un receptor correspondiente de tal forma que la función normal de receptor es inhibida podría de esta forma evitar que el receptor iniciase los efectos destructivos normales en presencia del ligando normal tal como una toxina. En otras palabras, la invención permite el desarrollo de inhibidores competitivos de una toxina u otro ligando que normalmente inicie efectos destructivos u otros mediante un receptor correspondiente a BT-R_{1}.

Se pretende que los siguientes ejemplos ilustren pero no limiten la invención.

Ejemplo 1 Purificación y determinación de la secuencia de la proteína BT-R_{1}

Se extrajeron intestinos medios de M. sexta y se purificó proteína BT-R_{1} según el procedimiento de Vadlamudi, R.K., et al., J. Biol. Chem., 268:1233 (1993), anteriormente referido e incorporado en la presente solicitud por referencia. Se confirmó que la banda electroeluida contenía BT-R_{1} por unión a toxina ^{125}I-cryIA(b). En la electroforesis en gel, las bandas de proteína unidas a toxina tuvieron un peso molecular aparente de aproximadamente 210 kDa en condiciones reductoras y no reductoras.

BT-R_{1} purificado y electroeluido se sometió a digestión con bromuro de cianógeno y los fragmentos de bromuro de cianógeno se separaron en un gel de elevada resolución del 17% poliacrilamida tricina SDS tal como describen Schagger, H. et al., Anal. Biochem. 166:368 (1987). Los fragmentos separados se transfirieron a membranas Problott (Applied Biosystems) y cinco bandas se extrajeron y sometieron a microsecuenciación utilizando instrumentación estándar. Las secuencias de aminoácidos obtenidas fueron:

1.

(Met)-Leu-Asp-Tyr-Glu-Val-Pro-Glu-Phe-Gln-Ser-Ile-Thr-Ile-Arg-Val-Val-Ala-Thr-Asp-Asn-Asn-Asp- Thr-Arg-His-Val-Gly-Val-Ala;

2.

(Met)-X-Glu-Thr-Tyr-Glu-Leu-Ile-Ile-His-Pro-Phe-Asn-Tyr-Tyr-Ala;

3.

(Met)-X-X-X-His-Gln-Leu-Pro-Leu-Ala-Gln-Asp-Ile-Lys-Asn-His;

4.

(Met)-Phe/Pro-Asn/Ile-Val-Arg/Tyr-Val-Asp-Ile/Gly:

5.

(Met)-Asn-Phe-Phe/His-Ser-Val-Asn-Arg/Asp-Glu.

Ejemplo 2 Recuperación de cADN

Se construyó una librería de cADN de M. sexta a partir de tejido de intestino medio en Sgt10 utilizando el Superscript Choice System según las instrucciones del fabricante (Life Technologies, Inc.). Se construyeron sondas de oligonucleótidos degeneradas basadas en las secuencias de péptidos determinadas en el Ejemplo 1 utilizando el procedimiento y estrategias descritos por Zhang, S., et al., Gene 105:61 (1991). Los polinucleótidos sintéticos correspondientes a los péptidos 1-3 del Ejemplo 1 se marcaron con K^{32}P utilizando polinucleótido kinasa y se utilizaron como sondas tal como se describe en el manual estándar de clonaje de Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2ª Ed. 1989). Se purificó de placa un clon que hibridó con las tres sondas de entre 40 clones positivos identificados por hibridar con las tres sondas, a partir de una selección de 4x10^{5} recombinantes y se subclonó en pBluescript (Stratagene). Contuvo un inserto de 5571 bp.

El ADN de doble cadena en pBluescript se secuenció en ambas direcciones mediante el procedimiento de terminación por dideoxi con Sequenase (USB) según las instrucciones del fabricante. La secuencia mostró un marco de lectura abierto de 4584 pares de bases o 1528 aminoácidos junto con una señal de poliadenilación en la posición 5561. La secuencia obtenida y la secuencia de aminoácidos se muestran en la Figura 1.

Por consiguiente, la proteína deducida tiene una masa molecular de 172 kDa y un pI de aproximadamente 4,5. La secuencia de aminoácidos de los fragmentos de bromuro de cianógeno del receptor nativo coincide perfectamente con la secuencia de aminoácidos deducida. El marco de lectura abierto comienza con un ATG que se encuentra flanqueado por la secuencia consensuada de iniciación de traducción GAGATGG para mARNs eucarióticos tal como describe Kozak, M., Nucleic Acids Res. 15:8125 (1987).

Tal como se muestra en la Figura 1, la secuencia de aminoácidos deducida incluye una señal putativa, subrayada, que precede el extremo N-terminal maduro Asn-Glu-Arg-etc. Se muestran once repeticiones (cad1-cad11) en la región extracelular corriente arriba del dominio de membrana, subrayados con línea gruesa, en las posiciones 1406-1427. El final de la repetición 11 se muestra con una punta de flecha. La posición de los cinco fragmentos de CNBR se muestra también debajo de la secuencia completa.

La Figura 2 compara la secuencia de BT-R_{1} obtenida en la presente solicitud con las de otros miembros de la familia de las cadherinas. Tal como en las cadherinas conocidas, el dominio externo de BT-R_{1} es muy repetitivo y contiene 11 repeticiones (cad1-cad11; ver Figura 2A). Las demás cadherinas comparadas en la Figura 2B son la cadherina P de ratón (mP EC1); Drosophila fat EC18 (fat EC18) y protocadherina (PC42 EC2) y el transportador intestinal humano (HPT-1-EC-1). Las once repeticiones del motivo cadherina en BT-R_{1} (cad1-cad11) están individualmente alineadas con una secuencia de motivo único de cada una de los demás miembros de la familia de las cadherinas. Los residuos conservados están en cuadrados. La mayor semejanza de BT-R_{1} con las cadherinas se encuentra con las repeticiones extracelulares del motivo cadherina de la cadherina P de ratón, el supresor de tumores fat y la protocadherina, aunque las homologías no son elevadas (20-40 homología y un 30-60% de semejanza). Las repeticiones conservadas de BT-R_{1} incluyen AXDXD, DXE, DXNDXXP, el residuo de ácido glutámico y dos residuos de glicina (Figura 2B). Los motivos A/VXDXD, DXNDN son las secuencias consensuadas de unión a calcio y dos de tales regiones se encuentran presentes en una repetición de cadherina típica. En todas las repeticiones de BT-R_{1}, la secuencia DXNDN está precedida por 8 a 14 aminoácidos hidrófobos. En las cadherinas también se han observado secuencias hidrófobas semejantes. La longitud de las secciones hidrófobas sugiere que estas zonas no son regiones transmembrana sino que representan estructuras en lámina J comúnmente presentes en las repeticiones de cadherina. BT-R_{1} contiene un dominio citoplasmático putativo de 101 aminoácidos, más pequeño que el dominio citoplasmático de las cadherinas de los vertebrados (160 aminoácidos) y no muestra homología con ninguno de los dominios citoplasmáticos de las cadherinas o los dominios citoplasmáticos de otras proteínas con las que se han comparado en las bases de datos de secuencias actuales.

Para confirmar que el clon secuenciado codifica toda la longitud de la proteína BT-R_{1}, se preparó mARN total a partir de intestino medio de M. sexta y se sometió a transferencia Northern mediante hibridación con el fragmento antisentido Sac I de 4,8 kb del clon de cADN de BT-R_{1}. Se realizó el análisis de la transferencia Northern mediante hibridación con la sonda antisentido a 420C y 50% formamida, 5 x reactivo de Denhardt, 5 x SSCP y 50Tg/ml de ADN de esperma de salmón. A continuación se lavó el filtro dos veces con 1 x SSC + 0,1% SDS y dos veces con 0,15 x SSC + 0,1% SDS a 420C. Cada lavado duró aproximadamente 20 minutos. A continuación se expuso el filtro a película de rayos X durante 24 horas. La sonda de 4,8 kb se hibridó a una única banda de 5,6 kb.

El clon de BT-R_{1} se tradujo utilizando un lisado de reticulocitos de conejo y los correspondientes productos de traducción se inmunoprecipitaron con antisuero generado contra la proteína nativa codificada por BT-R_{1}. Para la traducción in vitro, se linearizó el plásmido pBluescript conteniendo el cADN de BT-R_{1} y se transcribió con polimerasa T_{3} (Pharmacia). La traducción se realizó según las instrucciones del fabricante con lisado de reticulocitos de conejo tratado con nucleasa (Life Technologies Inc.). Después de una hora de incubación a 300C, la mezcla de reacción se combinó con un volumen igual de tampón de SDS o se lisó con tampón 50 mM Tris que contiene 1% NP40 y 250 mM NaCl (pH 8,0) para la inmunoprecipitación. Se utilizó suero preinmune como control. Los productos de traducción e inmunoprecipitación se analizaron por electroforesis en un gel de 7,5% poliacrilamida SDS, se fijaron, se trataron con Enhance (Dupont NEN), se secaron y se expusieron a película de rayos X durante 12 horas.

Se obtuvieron dos bandas de proteína de aproximadamente 172 kD y 150 kD según la determinación por SDS-PAGE; se postula que el producto de traducción de 150 kD fue debido a la iniciación de traducción a partir de una metionina interna en el aminoácido 242. Ello es consistente con la observación de Kozak, M. Mol. Cell Biol., 9:5073 (1989).

Por consiguiente, ambos resultados confirman que se obtuvo un clon de la longitud total.

Ejemplo 3 Producción recombinante y características de la proteína BT-R_{1}

El clon de cADN de BT-R_{1} se subclonó en el vector de expresión en mamíferos pcDNA3 (Invitrogen) y la construcción se transfectó en células COS-7. Las membranas aisladas de los transfectantes COS-7 se disolvieron, analizaron por electroforesis, transferidas y analizadas con el ligando ^{125}I-cryIA(b). Las células se cosecharon 60 horas después de la transfección, se lavaron con disolución salina tamponada con fosfato y fragmentadas por congelación en nitrógeno líquido. Las membranas celulares se prepararon por centrifugación diferencial según describen Elshourbagy, N.A., et al., J. Biol.. Chem. 266:3873 (1993). Las células control fueron células COS-7 transfectadas con pcDNA3.

Las membranas celulares (10 Tg) se separaron por 7,5% SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de nylon y se bloquearon con disolución salina tamponada con Tris que contiene 5% de leche en polvo desnatada, 5% glicerina y 1% Tween-20. Las membranas de nylon se incubaron a continuación con toxina ^{125}I-cryIA(b) (2 x 10^{5} cpm/ml) durante dos horas con tampón de bloqueo, se secó y se expuso a película de rayos X a -70ºC. La toxina se unió a una proteína de aproximadamente 210 + 5 kD; la banda de 210 kD se observó solamente en los carriles conteniendo membranas preparadas de M. sexta o células COS-7 transfectadas con la construcción de cADN de BT-R_{1} conteniendo 4810 bp DE cADN comprendiendo el marco de lectura abierto.

La discrepancia entre la proteína de 210 kD expresada y el peso de 172 kD calculado es debido a la glicosilación de la proteína; la traducción in vitro del clon de cADN, tal como se describió anteriormente, que no produce glicosilación, genera una proteína de 172 kD. Para verificar esto, la proteína producida en células COS-7 se sometió a digestión con N-glicosidasa-F, primero desnaturalizando la proteína purificada hirviéndola en 1% SDS durante 5 minutos seguido de la adición de NP-40 a una concentración final de 1% en presencia de 0,1% SDS y luego incubando la proteína desnaturalizada en tampón de fosfato, pH 8,5 a 370C con N-glicosidasa-F durante 10 horas. Los controles se incubaron en las mismas condiciones sin enzima. Los productos de digestión se separaron por 7,5% SDS-PAGE y se tiñeron con Coomasie azul brillante. El tratamiento con glicosidasa redujo el peso molecular de la proteína BT-R_{1} de 210 a 190 kD; lo que indica N-glicosilación en alguno de los 16 lugares consensuados para la N-glicosilación de la proteína. El tratamiento de BT-R_{1} con O-glicosidasa y neuraminidasa no alteró la movilidad de la proteína.

Además, se transfectadas células 293 embriónicas con el clon de cADN de BT-R_{1} en pcADN3 y se incubaron con la toxina marcada (0,32 nM) en presencia de concentraciones crecientes (0 a 10^{-6} M) de toxina no marcada. La unión no específica se midió como la radioactividad unida en presencia de 1 TM de toxina no marcada. Se determinó un valor para la constante de disociación (K_{d}) de 1015 pM mediante análisis Scatchard; éste es aproximadamente el mismo valor obtenido para el receptor natural según describen Vadlamudi, R.K, et al., J. Biol. Chem. (1993) (supra).

Ejemplo 4 Efectos fisiológicos de la toxina BT en células embriónicas BT modificadas

Tanto las células embriónicas 293 no modificadas como las células 293 modificadas para producir receptor BT-R_{1} según se describió en el Ejemplo 3, cuando se cultivan in vitro forman racimos adherentes en forman de estrella. Cuando se añade toxina BT (200 nM) a medio libre de suero, los racimos se redondean y se sueltan de la superficie del plástico de las placas de cultivo. Tal efecto también se observa bajo condiciones conocidas de citotoxicidad para las células 293. El anterior efecto se observa solamente cuando las células son cultivadas en medio libre de suero ya que la toxina se une al suero y es por consiguiente inefectiva en condiciones en las que el suero está presente.

Sin embargo, en presencia de antisuero antirreceptor, dicho efecto de la toxina BT queda bloqueado. Además, cuando el suero se añade de vuelta al cultivo de células E293 modificadas que han sido tratadas con toxina en condiciones libres de suero, las células revierten a las formas normales de racimo adherente en estrella. Ello indica que el efecto de la toxina es reversible.

Claims (15)

1. Polinucleótido en forma purificada y aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un receptor que se une específicamente a la toxina de Bacillus thuringiensis (BT) en el que dicho receptor tiene la secuencia de aminoácidos del receptor mostrada en la Figura 1, o en el que dicho receptor está codificado por una secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones de rigor estándar a la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1.

2. Polinucleótido según la reivindicación 1, en el que dicha toxina es la toxina cryIA(b) de B. thuringiensis subesp. Berliner, o en el que dicha toxina es una forma modificada de la toxina BT; o en el que dicho receptor es el receptor BT-R_{1} del gusano cornudo del tabaco Manduca sexta.

3. Sistema recombinante de expresión para la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica un receptor que se une específicamente a una toxina BT, en el que dicho receptor tiene la secuencia de aminoácidos del receptor mostrada en la Figura 1, o en la que dicho receptor está codificado por una secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones de rigor estándar a la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1, comprendiendo dicho sistema de expresión dicha secuencia de nucleótidos codificante funcionalmente ligada a una secuencia de control funcional en las células huésped.

4. Células huésped modificadas para contener el sistema de expresión según la reivindicación 3.

5. Procedimiento para producir un receptor que se une a una toxina BT, comprendiendo dicho procedimiento cultivar las células según la reivindicación 4 bajo condiciones en las que se produce dicho receptor; y opcionalmente recuperar dicho receptor del cultivo.

6. Procedimiento según la reivindicación 5 en el que dicho receptor está dispuesto en la superficie de dichas células, y en el que opcionalmente las células se recuperan del cultivo para utilizarlas en un ensayo.

7. Células que expresa el receptor de la toxina BT dispuesto en su superficie susceptibles de ser preparadas mediante un procedimiento que comprende cultivar células huésped modificadas para contener el sistema de expresión según la reivindicación 3, en el que el receptor está dispuesto sobre la superficie de las células y en el que las células opcionalmente se recuperan del cultivo para utilizarlas en un ensayo.

8. Procedimiento para evaluar las citotoxicidad de un candidato a pesticida para un receptor de insecto que se une a la toxina BT, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto dicho candidato con las células según la reivindicación 7 en condiciones tales que permitan que tenga lugar la unión, y evaluar la citotoxicidad de dicho candidato con respecto a dichas células.

9. Procedimiento para evaluar la afinidad de unión de un pesticida candidato a un receptor de insecto que se une a la toxina BT, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto dicho candidato con las células según la reivindicación 7 en condiciones tales que permiten que tenga lugar la unión, y detectar la presencia o ausencia de la unión de dicho pesticida candidato a dichas células.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, que comprende medir la afinidad de unión del pesticida candidato al receptor.

11. Polinucleótido purificado y aislado que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos codificante de un receptor que se une a la toxina BT en el que dicho receptor tiene la secuencia de aminoácidos del receptor mostrada en la Figura 1, o en el que dicho receptor está codificado por una secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones estándar de rigor a la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1.

12. Composición que comprende anticuerpos específicamente inmunorreactivos con el receptor que se une específicamente a la toxina BT, estando dicho receptor codificado por el polinucleótido según la reivindicación 1.

13. Procedimiento para modificar células diana de forma que se hagan susceptibles a la interacción con la toxina BT, comprendiendo dicho procedimiento modificar dichas células para que contengan el sistema de expresión según la reivindicación 3; y cultivar las células en condiciones en las que dicho receptor se encuentra dispuesto en la superficie de las células.

14. Células modificadas por el procedimiento según la reivindicación 13.

15. Procedimiento para ejercer un efecto citotóxico sobre células diana o sobre un tejido con el que están asociadas dichas células diana, en el que dichas células diana incluyen, en su superficie, un receptor que se une específicamente a la toxina BT, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto dichas células con la composición de anticuerpo según la reivindicación 12.