ES2279583T3

ES2279583T3 - Adn que codifica para un canal ionico regulado por protones humano y usos del mismo.

Info

Publication number: ES2279583T3
Application number: ES98951141T
Authority: ES
Inventors: Philippe Seguela; Kazimierz Babinski
Original assignee: McGill University
Current assignee: McGill University
Priority date: 1997-10-29
Filing date: 1998-10-29
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2018-10-29
Also published as: EP1025226B1; EP1025226A1; CA2308014A1; AU9732498A; WO1999021981A1; ATE347596T1; DE69836591D1; DE69836591T2

Abstract

Canal catiónico regulado por protones aislado que comprende una subunidad que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1A/B o una variante de esa secuencia que tiene al menos 531 aminoácidos y al menos una identidad del 85% con la misma, en el que el canal catiónico regulado por protones presenta una corriente bifásica y el componente lento de la corriente bifásica está inhibido por amilorida.

Description

ADN que codifica para un canal iónico regulado por protones humano y usos del mismo.

Campo de la invención

En los mamíferos, el pH del compartimento extracelular, incluyendo los líquidos intersticiales y la sangre, está regulado de manera estricta y se mantiene a un valor constante de 7,4. La sensibilidad al ácido es una clase específica de quimiorrecepción que desempeña un papel crítico en la detección de desequilibrios de pH nociceptivos que se producen, por ejemplo, en estados de calambres, traumatismo, inflamación o hipoxia (Lindahl, 1974). En los mamíferos, una población de neuronas sensitivas primarias de pequeño diámetro en los ganglios de la raíz dorsal y los ganglios del trigémino expresan receptores de superficie sensibles al pH especializados, activados por el aumento de la concentración extracelular de protones (Bevan y Yeats, 1991). La sensibilidad al ácido de las neuronas sensitivas así como del sistema nervioso central está mediada por una familia de canales catiónicos regulados por protones estructuralmente relacionados con canales epiteliales de sodio de mamíferos y degenerinas de C. elegans. Esta invención se refiere a estos canales iónicos sensibles a ácido (ASIC), particularmente a un canal regulado por protones no inactivante, denominado hASIC3, su asociación con otras subunidades de canal y usos del mismo.

Antecedentes de la invención

La acidosis tisular se asocia con varios estados dolorosos fisiológicos (por ejemplo, calambres) y patológicos (por ejemplo, inflamación, claudicación intermitente, infarto de miocardio). Experimentalmente, pueden reproducirse acontecimientos dolorosos similares infundiendo soluciones de pH bajo en la piel o el músculo. Además, la infusión intradérmica prolongada de soluciones de pH bajo puede imitar la hiperalgesia característica del dolor crónico. Para caracterizar adicionalmente los efectos de los protones y su relación con el dolor, se aplicaron soluciones de pH bajo a neuronas sensitivas del sistema nervioso central y periférico sometidas a registro electrofisiológico de fijación de voltaje ("patch clamp"). Se indujeron corrientes entrantes cuando el pH disminuyó hasta valores ácidos, proporcionando pruebas de la existencia de canales iónicos activados por protones. Se observaron varios tipos de corrientes nativas en las neuronas sensitivas de ganglios de la raíz dorsal y del trigémino humanos y de rata:

\blacksquare: corrientes rápidamente inactivantes;

\blacksquare: corrientes no inactivantes; y

\blacksquare: corrientes bifásicas que presentan una corriente rápidamente inactivante seguida por una corriente no inactivante.

También se notificaron otras diferencias referentes a las selectividades iónicas. Estos resultados sugieren la existencia de varios canales iónicos regulados por protones. El dolor prolongado inducido por la acidificación del tejido está asociado lo más probablemente con un canal iónico regulado por protones no inactivante.

Canales iónicos regulados por protones clonados

Recientemente, se han clonado tres clases de canales catiónicos regulados por protones de mamífero en rata y se han denominado "ASIC" para "Acid Sensing Ion Channels" ("canales iónicos sensibles al ácido"). El análisis de secuencia los identifica como miembros de la superfamilia DEG/ENaC de canales iónicos. La supuesta topología de membrana de los receptores de ASIC predice dos dominios transmembrana con ambos extremos N y C-terminales en el compartimento intracelular, tal como se muestra para los canales epiteliales de sodio (ENaC). Los receptores de ASIC publicados se describen a continuación:

1): ASIC1A (notificado por primera vez como ASIC), presenta una corriente rápidamente inactivante con un pH_{50} de 6,2 (Waldmann R. et al., Nature 1997; 386: 173-7). N.B.: pH_{50} indica el pH al que la corriente entrante pico es igual a la mitad del valor máximo.

2): ASIC1B (notificado inicialmente como ASIC-\beta), es una variante de corte y empalme de ASIC1A en la que se sustituyen los primeros 185 aminoácidos de ASIC1A por una nueva secuencia distinta de 172 aminoácidos. ASIC1B muestra una cinética de corriente similar y un pH_{50} como el observado para ASIC1A (Chen C-C et al., Proc Natl Acad Sci 1998; 95: 10240-5).

3): ASIC2A (notificado por primera vez como MDEG, luego MDEG1), presenta una corriente lentamente inactivante con un pH_{50} de 4,05 (Waldmann R. et al., J Biol Chem 1996; 271: 10433-6).

4): ASIC2B (notificado por primera vez como MDEG2) es una variante de corte y empalme de ASIC2A en la que se sustituyen los primeros 185 aminoácidos por una nueva secuencia distinta de 236 aminoácidos (Lingueglia E. et al., J Biol Chem 1997; 272: 29778-83). Cuando se expresa en sistemas de expresión heterólogos, ASIC2B no parece estar activado por protones.

\newpage

5): DRASIC, que presenta una corriente bifásica en la que el componente rápidamente inactivante tiene un pH_{50} de 6,5 y el componente no inactivante un pH_{50} de 3,5 (Waldmann R. et al., J Biol Chem 1997; 272: 20975-8).

Distribución tisular de los canales iónicos regulados por protones clonados

Los ARNm de ASIC1A y ASIC2B están presentes tanto en neuronas sensitivas como cerebrales. El ARNm de ASIC2A se detecta en el sistema nervioso central pero está ausente en las neuronas sensitivas. ASIC1B y DRASIC se expresan exclusivamente en las neuronas sensitivas, predominantemente en neuronas de pequeño diámetro. Las diferentes subunidades de ASIC en el cerebro (ASIC1A, ASIC2A, ASIC2B) así como los ASIC en las neuronas sensitivas (ASIC1B, ASIC2B y DRASIC) parecen coexpresarse en las mismas neuronas (Waldmann R. et al., Curr Opinion Neurobiol 1998; 8: 418-24).

Ensamblaje homo y heteromultimérico de subunidades de canales regulados por protones

Los canales iónicos son complejos multiméricos que resultan de la asociación de varias subunidades de canal idénticas (homopoliméricas) y/o diferentes (heteropoliméricas). A excepción de ASIC2B, todas las subunidades de ASIC se asocian en complejos homomultiméricos y producen los canales funcionales descritos anteriormente. Además, se ha mostrado que ciertas subunidades de ASIC forman canales heteromultiméricos funcionales con propiedades distintivas. De hecho, ASIC2B, que por sí mismo no da lugar a un canal regulado por protones, modifica las características de canal de ASIC2A y de DRASIC cuando se coexpresa con uno u otro. El canal ASIC2A homomultimérico tiene un perfil de inactivación exponencial único y es sumamente selectivo para el sodio. Cuando se coexpresa con ASIC2B, la cinética de inactivación se vuelve bifásica con un componente lentamente inactivante que discrimina escasamente entre iones sodio (Na^{+}) y potasio (K^{+}). De manera similar, cuando se coexpresó DRASIC con ASIC2B, la corriente selectiva al sodio sostenida de DRASIC se volvió no selectiva a los cationes (pNa^{+} = pK^{+}) (Lingueglia E. et al., J Biol Chem 1997; 272: 29778-83).

Los canales regulados por protones están relacionados con degenerinas y mecanosensibilidad

Tal como se mencionó anteriormente, los ASIC pertenecen a la superfamilia DEG/ENaC de receptores, que también incluye canales epiteliales de sodio (EnaC) que participan en la homeostasis del sodio, el canal activado por el péptido FMRF-amida, FaNaC, de Helix aspersa, que participa en la neurotransmisión, los canales catiónicos regulados por ATP, que también participan en la neurotransmisión, así como las degenerinas de Caenorhabditis elegans, que participan en la mecanotransducción. Tal como se mencionó anteriormente, la participación de canales iónicos regulados por protones en la nocicepción parece probable. Sin embargo, puesto que muchas de las subunidades de ASIC también se expresan en otros lugares distintos a las neuronas sensitivas, también deben considerarse otras funciones aparte de la nocicepción. Además de sus efectos perjudiciales, los protones podrían desempeñar importantes papeles como neurotransmisores tal como dan a entender informes de actividad neuronal en respuesta a fluctuaciones de pH. Sin embargo, aún queda por demostrar que pueden producirse cambios de pH suficientes para activar los canales ASIC con bajo pH_{50}, tales como canales ASIC2A o ASIC2A+ASIC2B. Alternativamente, los canales ASIC podrían activarse también por otros ligandos, tales como neuropéptidos y neurotransmisores, o mediante energía mecánica, tal como se sugiere por su homología de secuencia con los otros miembros de la superfamilia DEG/EnaC.

Sumario de la invención

El objeto de la presente invención es proporcionar la estructura primaria, caracterización funcional y distribución tisular de un canal iónico regulado por protones, sensible a amilorida no inactivante humano, designado en el presente documento como hASIC3.

Tal como se indicó anteriormente, Waldmann R. et al., J Biol Chem 1997; 272: 29075-8 describe la clonación de DRASIC de rata, un canal catiónico regulado por H^{+}, neuronas sensitivas o especificadas que tienen tanto un componente rápidamente inactivante como un componente sostenido. Sin embargo, tal como resultará evidente a partir de la comparación de las características de hASIC3 y DRASIC, existen importantes diferencias entre estos dos canales iónicos.

hASIC3 no es el ortólogo de DRASIC de rata tal como lo apoyan las siguientes pruebas:

1): hASIC3 tiene una identidad de secuencia del 83% con DRASIC de rata mientras que los ortólogos de ASIC1A humano y de rata muestran una identidad del 97,7% y los ortólogos de ASIC2A humano y de rata muestran una identidad del 99%. (Garcia-Anoveros J. et al., Proc Natl Acad Sci 1997; 94: 1459-64).

2): La distribución tisular de hASIC3 está generalizada por todo el organismo mientras que el ARNm de DRASIC de rata se limita a neuronas sensitivas (compárense la figura 6 y Waldmann R. et al., J Biol Chem 1997; 272: 20975-8)

3): Las corrientes bifásicas de DRASIC de rata y hASIC3 presentan diferentes propiedades. En la siguiente discusión "componente rápido" se referirá a la corriente rápidamente inactivante y "componente lento" se referirá a la corriente sostenida, que sigue al componente rápido:

\blacksquare: El componente rápido y lento de hASIC3 tienen pH_{50} similares (3,66 y 3,82, respectivamente), mientras que DRASIC de rata tiene diferentes pH_{50} para los componentes rápido y lento (6,5 frente a 3,5, respectivamente) (compárense la figura 3 y Waldmann et al., J Biol Chem 1997; 272: 29075-8).

\blacksquare: El componente lento de hASIC3 está inhibido por amilorida mientras que el componente lento de DRASIC de rata está potenciado por amilorida (compárense las figuras 5A y 5B y Waldmann et al., J Biol Chem 1997; 272: 29075-8).

\blacksquare: Los potenciales de inversión para los componentes rápido y lento de hASIC3 difirieron en 15 mV (E_{inv} rápido = +33 mV y E_{inv} lento = +48 mV), mientras que los componentes tanto rápido como lento de DRASIC de rata tienen el mismo E_{inv} de +32 mV. (compárense la figura 4 y Waldmann et al., J Biol Chem 1997; 272: 20975-8).

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar una secuencia de ADN que codifica para un subtipo novedoso de canal iónico regulado por protones, sensible a amilorida, no inactivante humano, hASIC3 y derivados del mismo.

En consecuencia, la presente invención proporciona un canal catiónico regulado por protones aislado, un ácido nucleico aislado correspondiente, métodos para preparar los mismos, composiciones/kits correspondientes y células huésped recombinantes que contienen los mismos, y el uso de los mismos en ensayos de selección tal como se expone en las reivindicaciones.

En una realización, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada, que consiste esencialmente en la secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID No. 1, y derivados de la misma.

En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención codifica para un péptido que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos enumerada en la SEQ ID No.: 2, y derivados de la misma.

En otra realización, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica para una subunidad de canal catiónico regulado por protones que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o una variante de esa secuencia que tiene al menos 531 aminoácidos y una identidad del 85% con la misma, en el que el canal catiónico regulado por protones presenta una corriente bifásica y el componente lento de la corriente bifásica es sensible a amilorida.

El ARN que codifica para el receptor de hASIC3, que puede transcribirse a partir del ADN según la presente invención (SEQ ID No.: 1) y sustancialmente libre de otros ARN, también forma parte de la invención, y puede ser útil para varios fines incluyendo estudios de hibridación, traducción in vitro así como traducción en sistemas in vivo apropiados tales como ovocitos de Xenopus.

La presente invención también se refiere a secuencias de nucleótidos complementarias y/o antisentido, completas y/o parciales, correspondientes a la secuencia de nucleótidos enumerada en la SEQ ID No. 1.

Según la presente invención, se proporciona un vector, preferiblemente un vector de expresión, seleccionado del grupo que consiste en plásmido, fago, retrovirus, baculovirus, adenovirus y elementos de integración, que incluye la molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención.

La presente invención también se refiere a células huésped transformadas o transfectadas con un vector según se describió anteriormente. Las células huésped pueden ser procariotas o eucariotas e incluyen células de mamífero (tales como células COS, CHO y células de riñón embrionario humano, HEK293), células de insecto, levaduras (tales como Saccharomyces cerevisiae) y bacterias tales como Escherichia coli. Las células huésped o bien expresarán de manera transitoria hASIC3 y/o derivados del mismo, como en el caso de células COS, o bien se transfectarán de manera estable con un vector que lleva la secuencia de hASIC3 y/o derivados de la misma. Puede usarse una línea de células CHO o cualquier otra línea celular que exprese de manera estable hASIC3 y/o cualquier derivado del mismo para estudios electrofisiológicos, de entrada de calcio, obtención de imágenes de iones, unión de ligandos, purificación por afinidad, inmunoprecipitación, inmunotransferencia de tipo Western e inmunotransferencia. Las células huésped que no expresan el receptor todavía pueden ser útiles como huéspedes de clonación.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para aislar un ligando que se unirá a la proteína hASIC3, o cualquier derivado de la misma.

Un hASIC3 y/o un derivado del mismo preparado mediante tecnología de ADN recombinante según la invención tiene varios usos, o bien in situ en la membrana del huésped de expresión o bien en sistemas in vitro. En particular, el receptor puede usarse para una selección de ligandos y/o compuestos útiles en una variedad de enfermedades y estados humanos (o de otros animales), tales como dolor, inflamación, isquemia y trastornos neurodegenerativos. Los ligandos se refieren a cualquier entidad química o biológica que se une a cualquier región o parte intracelular y/o extracelular del hASIC3 y/o sus derivados. Tales ligandos incluyen compuestos presentes en bibliotecas químicas combinatorias, bibliotecas de presentación en fago de péptidos, extractos que contienen compuestos desconocidos (por ejemplo, extractos de plantas, extractos de organismos marinos, toxinas, venenos) así como moléculas biológicas tales como anticuerpos policlonales y/o monoclonales, neurotransmisores, péptidos o metales e iones
inorgánicos.

También se proporciona el uso de una célula huésped recombinante según la invención para seleccionar compuestos útiles como ligandos de un canal catiónico regulado por protones. También puede usarse un ácido nucleico que codifica para un canal de la invención para seleccionar compuestos útiles como ligandos de un canal catiónico regulado por protones.

La invención también proporciona composiciones o kits para seleccionar compuestos útiles como ligandos de un canal regulado por protones, que comprenden al menos uno de un canal según la invención, un ácido nucleico según la invención, un vector recombinante según la invención, una célula huésped recombinante según la invención, y cualquier componentes auxiliar adecuado.

Por ejemplo, según la presente invención se proporciona un método de uso de la molécula de ácido nucleico aislada enumerada en la SEQ ID No. 1, o una secuencia que se hibrida en condiciones rigurosas a la secuencia enumerada en la SEQ ID No. 1, para producir un péptido que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos enumerada en la SEQ ID No. 2, que comprende las etapas de:

a) transformar un huésped con una secuencia de ADN que puede codificar para el péptido

b) incubar el huésped en condiciones que permiten que se exprese la secuencia de la proteína y

c) aislar por todos los medios la proteína del huésped.

También se proporciona un método de producción de un canal catiónico regulado por protones según la invención que comprende incubar una célula huésped recombinante de la invención en condiciones que permiten que se exprese la secuencia de ácido nucleico, y aislar la proteína de la célula huésped recombinante.

Puede realizarse el registro o la obtención de imágenes de la actividad de la proteína a partir del huésped para confirmar o monitorizar la actividad de la proteína. Este método puede repetirse, esta vez con dos o más secuencias de ADN que codifican para dos o más proteínas diferentes, que dan como resultado la obtención de canales heteropoliméricos.

Los derivados de hASIC3 incluyen variantes funcionales y/o estructurales según se describe a continuación:

\blacksquare: Los derivados de hASIC3 incluyen moléculas cuya secuencia difiere de la secuencia de hASIC3 en una modificación y/o sustitución y/o inserción y/o deleción de uno o varios residuos de aminoácido siempre que esta modificación y/o sustitución y/o inserción y/o deleción no modifique las propiedades funcionales y/o estructurales del canal hASIC3, principalmente la activación por protones. La secuencia de aminoácidos de los derivados debe ser al menos idéntica en un 85% o superior a la secuencia de aminoácidos de hASIC3. Tales derivados pueden sintetizarse y/o analizarse por un experto en la técnica siguiendo técnicas establecidas.

\blacksquare: Los derivados de hASIC3 también incluyen moléculas cuya secuencia difiere de la secuencia de hASIC3 en una modificación y/o sustitución y/o inserción y/o deleción de uno o varios residuos de aminoácido aunque esta modificación y/o sustitución y/o inserción y/o deleción sí modifique las propiedades funcionales y/o estructurales del canal hASIC3, haciéndolo no sensible o sensible de manera diferentes a los protones.

Ejemplos de los derivados son subunidades de canal similares a hASIC3 correspondientes a las secuencias de nucleótidos parciales (etiqueta de secuencia expresada ("Expressed Sequence Tag") disponibles de bases de datos dbest públicas, tales como EST nº A1024055, AA628357, AA448259, AA449322, subunidades de canal hASIC3 marcadas con etiqueta en epítopos en el extremo N-terminal y/o C-terminal, así como subunidad de canal hASIC3 en la que se sustituyeron los primeros 150-200 aminoácidos por una secuencia de aminoácidos nueva y diferente, de manera similar a lo notificado para ASIC1A y ASIC1 B, y ASIC2A y ASIC2B.

La presente invención se refiere a la asociación de hASIC3 y derivados del mismo con otras subunidades de canal tales como las subunidades de canal iónico regulado por protones y derivados de las mismas (por ejemplo ASIC1A, ASIC1B, ASIC2A, ASIC2B), u otras subunidades de canal relacionadas con la superfamilia DEG/EnaC de receptores, tales como subunidades alfa, beta, gamma, delta-EnaC o las subunidades de canal iónico regulado por ATP P2x. Tales asociaciones incluyen interacciones entre subunidades de diferentes especies, pero la asociación preferida es entre subunidades de la misma especie.

A continuación en el presente documento, se facilita un ejemplo de asociación heteromérica entre hASIC3 y P2x2 de rata. El nuevo canal resultante es un canal iónico regulado por protones novedoso, que presenta mayor sensibilidad al pH. De hecho, cuando se inyectan conjuntamente hASIC3 y P2x2 en ovocitos de Xenopus, pueden activarse corrientes entrantes con una ligera acidificación hasta pH 6,5, mientras que el hASIC3 homomérico requiere un pH de 4,0. Esta propiedad farmacológica diferente demuestra que hASIC3 y P2x2 se asocian físicamente para generar un nuevo canal iónico.

También se proporciona un canal catiónico regulado por protones humano aislado que comprende una subunidad que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 85% a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, en el que canal catiónico regulado por protones presenta una corriente bifásica cuando se activa mediante una concentración extracelular de protones que es inferior al pH fisiológico, y en el que el componente lento de la corriente bifásica es sensible a amilorida.

La invención proporciona además un canal catiónico regulado por protones aislado que comprende una subunidad que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o una variante de esa secuencia que tiene al menos 531 aminoácidos y al menos una identidad del 85% con ella, en el que el canal presenta una corriente bifásica cuando se activa mediante una concentración extracelular de protones que es inferior al pH fisiológico y el componente lento de la corriente bifásica es sensible a amilorida.

Descripción de la invención

Esta invención se describirá por medio de realizaciones específicas, ejemplos y figuras, cuyo fin es ilustrar la invención en lugar de limitar su alcance.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Secuencia de nucleótidos y de aminoácidos prevista del ADNc de hASIC3 (SEQ ID No. 1 y No. 2, respectivamente) (A), depositadas en la base de datos Genbank con el número de registro AF057711. Se destacan dos tramos de 20-34 aminoácidos correspondientes a los posibles dominios transmembrana, identificados en un perfil de hidrofobicidad de Kyte-Doolitle. Los sitios de fosforilación consenso en dominios extracelulares y los sitios de N-glucosilación en el dominio extracelular se indican mediante residuos encerrados en un círculo y un recuadro, respectivamente. Homología (en %) de hASIC3 (B) y relaciones filogenéticas (C) con miembros conocidos de la familia ASIC/ENaC humana. Dendrograma de proteínas generado usando el algoritmo UPGMA (Geneworks 2.5.1, Oxford Molecular Group).

Figura 2. Fenotipo de corriente bifásica de canales hASIC3 homoméricos: efectos de tasas crecientes de cambio de pH. Se sometieron ovocitos a fijación de voltaje a -70 mV y se perfundieron continuamente con tampón de Ringer que contenía HEPES 10 mM a pH 7,6. Entonces se disminuyó el pH hasta 4,0 durante 10 seg con gradientes crecientes de pH obtenidos elevando el diferencial de capacidad tamponante entre los tampones control y de prueba: A. de pH 7,6 a pH 4,0 en HEPES 10 mM; B. de pH 7,6 en HEPES 5 mM a pH 4,0 en 10 nM; y C. de pH 7,6 en HEPES 5 mM a pH 4,0 en 20 mM. Los controles realizados con los tampones de prueba a pH 7,6 no activaron el canal hASIC3. Los ovocitos a los que se les inyectó tampón de inyección solo no mostraron corrientes entrantes. La amplitud del componente temprano, pero no del tardío, y por tanto, la razón de corrientes pico temprana/tardía, parecen ser muy sensibles a la velocidad a la que disminuye el pH desde valores de pH normales hasta ácidos.

Figura 3. Curvas de dosis-respuesta de la activación por pH de las corrientes de hASIC3. se construyeron las curvas de dosis-respuesta en HEPES 20 mM tamponado a diferentes valores de pH desde 6,0 hasta 3,0. Se analizaron las corrientes de pico de las corrientes rápida y lenta con la ecuación logística de cuatro parámetros y la prueba F parcial para la comparación estadística. Cada punto representa la media +/- EEM de este experimento típico. Aparte de la respuesta máxima, no se observó ninguna otra diferencia significativa entre ambas curvas.

Figura 4. Relación entre corriente-voltaje (I/V) de las corrientes rápida y lenta de hASIC3. se realizaron registros en tampón de Ringer que contiene (en mM): NaCl 115, KCI 2,5, CaCl_{2} 1,8 y HEPES 5, pH 7,6. Se estableció la relación I/V midiendo las corrientes pico para las respuestas tanto rápida como lenta a pH 4,0 (aplicado 1 seg tras la etapa de voltaje) a diferentes potenciales de membrana, tras restar las corrientes de fondo registradas sin aplicaciones de pH (A). Se representaron los valores de corriente pico (B) y el potencial de inversión estimado a partir de análisis de regresión lineal (corriente lenta) y no lineal (corriente rápida). Los paneles A y B representan un experimento típico en el que los potenciales de inversión fueron de 33,4 mv y 44,8 mv, respectivamente, para las corrientes rápida y
lenta.

Figura 5. Sensibilidad de las de las corrientes de hASIC3 rápida y lenta frente a amilorida. Se activaron las corrientes de hASIC3 mediante pH 4,0 en presencia y ausencia de amilorida 100 \muM (A). La inhibición por amilorida fue mucho más intensa en la corriente rápida que en la sostenida. Los datos en B representan la media +/- EEM (n= 17) de de corrientes pico residuales durante la aplicación de amilorida para los componentes rápido (37,2 +/- 6,4%) y sostenido (72,0 +/- 3,8%) expresados como porcentaje de los controles. Se evaluó la significación estadística (P) mediante una prueba de la t bilateral para datos independientes (*** P < 0,001).

Figura 6. Distribución de ARNm de hASIC3 en tejidos humanos normales. Se cuantificó la hibridación de alta rigurosidad de ADNc de hASIC3 radiomarcado en ARN poliA+ aislado de cerebro, médula espinal, tejidos internos así como de tejidos fetales de 17-28 semanas mediante análisis densitométrico en detección y cuantificación de la radiactividad ("phosphorimaging"). Se normalizaron las cantidades de ARN poliA+ diana a través de los tejidos para permitir comparaciones directas de los niveles de transcripción (para detalles, véase Materiales y métodos).

Figura 7. Altos niveles de transcripción del gen de hASIC3 en ganglios sensitivos enriquecidos en neuronas nociceptivas. Localización de ARNm de G2PDH indicador y hASIC3 en ganglios del trigémino (TG), cerebelo (CB) y pulmón (L) humanos usando amplificación por RT-PCR con cebadores de coincidencia exacta específicos (para detalles, véase la sección Materiales y método).

Figura 8. Ilustración de un registro de corriente catiónica no inactivante inducida por ácido fuerte (pH 4,0) en ovocitos de Xenopus a los que se les inyectó clon de hASIC3 solo en el vector pcADN3.

Figura 9. Ilustración de un registro de corriente catiónica no inactivante inducida por ácido débil (pH 6,5) en ovocitos de Xenopus a los que se les inyectó conjuntamente clon de hASIC3 y clon de P2x2 de rata, ambos en el vector pcADN3.

Ejemplo 1 Caracterización de un canal iónico regulado por protones no inactivante humano, hASIC3 Introducción

La sensibilidad al ácido es una clase específica de quimiorrecepción que desempeña un papel fundamental en la detección de desequilibrios de pH nociceptivos que se producen en estados de calambres, traumatismo, inflamación e hipoxia (Lindahl, 1974). En los mamíferos, una población de neuronas sensitivas primarias de pequeño diámetro en los ganglios de la raíz dorsal y ganglios del trigémino expresan receptores de superficie sensibles al pH especializados, activados por el aumento de la concentración extracelular de protones (Bevan y Yeats, 1991). Las respuestas electrofisiológicas nativas de las neuronas sensitivas frente a aplicaciones de pH 5,8-6,5 se caracterizan por una corriente entrante de desensibilización rápida seguida por una corriente sostenida lenta (Krishtal y Pidoplichko, 1981). Dilucidar la composición molecular nativa de sensores de protones en neuronas sensitivas humanas será una etapa importante en el desarrollo racional de una clase novedosa de analgésicos. Recientemente, se ha descubierto una familia de genes que codifican para subunidades de canales neuronales regulados por protones (Garcia-Anoveros et al., 1997; Waldmann et al., 1997). El ASIC (canal iónico sensible al ácido) de rata homomérico sensible a amilorida expresado de manera heteróloga (Waldmann et al., 1997) responde a pequeños cambios de pH mediante una corriente de desensibilización rápida selectiva al sodio, mientras que MDEG1 (degenerina 1 de mamíferos) (Waldmann et al., 1996) y DRASIC (ASIC de ganglios de la raíz dorsal) (Waldmann et al., 1997) requieren cambios drásticos de pH para regular corrientes de desensibilización y bifásicas, respectivamente. ASIC y MDEG1 pueden asociarse juntos para generar un canal heteromérico activado a pH bajo (< 5) con cinética y selectividades iónicas únicas (Bassilana et al., 1997). Se mostró que una variante de corte y empalme neuronal de MDEG1 modula las propiedades biofísicas de DRASIC mediante asociación heteromérica (Lingueglia et al., 1997). Estos canales regulados por protones comparten una supuesta topología de dos dominios transmembrana y ubicación conjunta en neuronas sensitivas sensibles a capsaicina de pequeño diámetro con canales regulados por ATP P2X (North, 1997). A partir de su secuencia, pertenecen a una superfamilia de genes en expansión que incluye canales epiteliales de sodio de mamíferos (Canessa et al., 1994), subunidades "pickpocket" (PPK) y "ripped pocket" (RPK) de Drosophila (Adams et al., 1998), degenerinas de C. elegans (Corey y Garcia-Anoveros, 1996), y el canal regulado por FMRF-amida de Helix aspersa (Lingueglia et al., 1995). A pesar de su posible importancia para monitorizar cambios de pH en rutas del sistema nervioso central o sensitivas, aún no se han caracterizado funcionalmente los genes de receptores de protones humanos. En el presente documento, se notifica por primera vez la expresión heteróloga de un canal regulado por protones humano, así como diferencias significativas entre especies observadas tanto en las propiedades funcionales como en las distribuciones regionales de sensores de ácido.

Materiales y métodos Clonación molecular

Usando el algoritmo tblastn, la exploración virtual de la base de datos dbEST de NCBI (Lennon et al., 1996) con sondas correspondientes al motivo de proteína LXFPAVTLCNXNXXRXS, conservado en todos los miembros conocidos de la familia de degenerina/ENaC/ASIC, condujo a la identificación de secuencias de EST humanas que codificaban para un miembro novedoso de la familia de genes de sensores de protones (números de registro de Genbank AA449579 y AA429417). Se secuenció el clon marcado con etiqueta mediante EST en 5' AA449579 y mediante EST en 3' AA449322 de una biblioteca de ADNc de feto total en ambas cadenas usando cebadores para paseo y un secuenciador de ADN ALF (Pharmacia-LKB). Se subclonó de manera direccional el hASIC3 de longitud completa en sitios EcoRI y NotI únicos del vector eucariota pcDNA3 (Invitrogen) para determinar la expresión heteróloga impulsada por promotor de CMV en ovocitos de Xenopus.

Electrofisiología en ovocitos de Xenopus

Se trataron ovocitos extraídos quirúrgicamente de Xenopus laevis adulto durante 2 h a temperatura ambiente con colagenasa de tipo II (Gibco-BRL) en solución de Barth con agitación constante. Se desfolicularon manualmente los ovocitos seleccionados en fase IV-V antes de realizar microinyecciones nucleares (Bertrand et al., 1991) de 5 ng de hASIC3 en vector pcDNA3. Tras 2-4 días de expresión a 19ºC en solución de Barth que contenía gentamicina 50 Êg/ml, se registraron las corrientes en la configuración de fijación de voltaje de dos electrodos usando un amplificador OC-725B (Warner Instruments). Se adquirieron corrientes de células completas y se digitalizaron a 500 Hz en un ordenador Macintosh IIci con una interfaz A/D NB-MIO16XL (National Instruments), luego se filtraron posteriormente los gráficos registrados a 100 Hz en Axograph (Axon Instruments). Se prepararon soluciones de agonista, de amilorida y de lavado en una solución de Ringer modificada que contenía NaCl 115 mM, KCl 2,5 mM, CaCl_{2} 1,8 mM en tampón HEPES 5-20 mM (Sigma) ajustado con NaOH o HCl a pH de 2 a 8 y se aplicaron en ovocitos mediante perfusión constante (10-12 ml/min) a temperatura ambiente. Los valores de la media \pm EEM correspondían a mediciones de un mínimo de 5 ovocitos.

Hibridación por inmunotransferencia de puntos de ARNm y RT-PCR

Se aisló ARN total de muestras post-mortem de ganglios del trigémino humanos normales usando reactivo Trizol (Gibco-BRL), luego se sometió 1 Eg a transcripción inversa con cebador al azar usando Superscript (Gibco-BRL). Se usaron aproximadamente 100 ng de RT-ADNc como molde para la PCR con ADN polimerasa Expand (Boerhinger-Mannheim). Se usaron cebadores de hASIC3 específicos TCAGTGGCCACCTTCCTCTA (directo) y ACAGTCCAG
CAGCATGTCATC (inverso) para amplificar la región correspondiente a los nucleótidos 175-513 (figura IA). Tras la desnaturalización de molde inicial de 2 min a 94ºC, los ciclos térmicos consistieron en 45 seg a 94ºC, 45 seg a 55ºC y 2 min a 72ºC durante 30 ciclos. Se comprobaron la homogeneidad e identidad molecular de los productos de PCR separando por tamaño y mediante patrones de restricción específicos. Se comprobó la carga de muestras inicial mediante amplificación conjunta de ARNm de mantenimiento de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH). Las muestras de ARN no sometidas a transcripción inversa pero amplificadas mediante PCR en condiciones idénticas proporcionaron los controles negativos.

Se realizó la inmunotransferencia de puntos de cantidades conocidas de ARN poliA+ humano (89-514 ng), aislado de varios tejidos normales adultos y fetales y normalizado para los niveles de transcripción de varios genes de mantenimiento (Clontech), y se exploraron con sondas con el fragmento de EcoRI-XbaI marcado con [^{32}P] de ADNc de hASIC3 con alta rigurosidad (elución final a 65ºC en 0,3 X tampón SSC durante 10 min). Tras la exposición durante 16 horas, se adquirieron señales de hibridación y se cuantificaron usando un dispositivo de detección y cuantificación de la radiactividad ("phosphorimager") Storm (Molecular Dynamics), luego se analizó su densitometría con un software ImageQuant (Molecular Dynamics).

Resultados Estructura primaria de la subunidad del canal hASIC3

El análisis de secuencias del ARNm poliA+ de hASIC3 de 1,7 kb de longitud reveló un marco de lectura abierto que codifica para 531 aminoácidos (figura IA), con inicio de traducción en el codón de Met proximal ubicado en la posición del nt. 22. El peso molecular previsto de 59 kDa para la proteína inmadura se confirmó mediante traducción in vitro (datos no mostrados). Según el modelo topológico actual basado en el análisis de la estructura primaria y pruebas bioquímicas, un dominio grande de 365 aminoácidos da hacia el lado extracelular de la membrana plasmática (Canessa et al., 1994). En este dominio extracelular, un total de 15 residuos de cisteína están altamente conservados en la familia de ASIC, a excepción de Cys267, que está ausente sólo en BNaC1 humano (hASIC2). Dos sitios posibles para la glucosilación unida a Asn, Asn175 y Asn398, están ubicados en este bucle rico en cisteínas. Los sitios consenso para la fosforilación por caseína cinasa II (Ser5) y por proteína cinasa C (Ser39, Ser478, Ser493, Ser521) se encuentran en el dominio N-terminal intracelular de hASIC3 así como en el dominio C-terminal intracelular (figura IA). La subunidad de hASIC3 presenta una identidad del 83% con la subunidad de DRASIC de rata a nivel de aminoácidos, un 48% con BNaC2 humano (hASIC1) y un 47% con BNaC1 (hASIC2) (figura 1B). Por tanto, el hASIC3 pertenece a la familia de canales regulados por protones, que a su vez es una ramificación del árbol filogenético de canales regulados por degenerina/ENaC/FMRF-amida (figura 1C).

Propiedades funcionales y farmacológicas de canales hASIC3 homoméricos

Cuando se expresan de manera heteróloga en ovocitos de Xenopus, las subunidades de hASIC3 se ensamblan para dar canales homoméricos funcionales activados por pH extracelular bajo (figura 2A). Los cambios rápidos de pH extracelular (figura 2B-C) revelaron una respuesta bifásica. Este fenotipo único se caracterizó por una corriente rápida y rápidamente desensibilizante seguida por una corriente sostenida y lenta que volvía al nivel inicial sólo al volver al pH fisiológico. La amplitud relativa de la corriente rápida pareció depender de la pendiente del gradiente de pH aplicado (figuras 2A-C). Sin embargo, se encontró que la sensibilidad al pH de las dos corrientes mediadas por hASIC3 era casi idéntica con un pH_{50} de 3,66 +/- 0,06 (rápida) frente a 3,82 +/- 0,04 (lenta) (figura 3). La cooperatividad positiva reflejada en el perfil de la curva dosis-respuesta, nHrápido = 1,57 +/- 0,3 y nHlento = 1,55 +/- 0,17, indicó que se requieren al menos dos protonaciones en dos subunidades con el fin de regular el canal catiónico. Para estudiar las posibles diferencias de selectividad iónica entre los componentes rápido y lento, se realizó una relación de corriente-voltaje a pH 4,0 en solución de Ringer normal. La amplitud pico del componente rápido presentó algo de dependencia con el voltaje desde su ligera rectificación entrante, mientras que el componente sostenido y lento era óhmico en el intervalo de desde -70 hasta +70 mv (figura 4B). Además, aunque ambos potenciales de inversión fueron superiores a 30 mv, tal como se esperaba para canales que transportan principalmente sodio, se midió un Einv = +15 +/- 3,2 mv (p < 0,01) entre el componente rápido (+32,9 +/- 4,4 mv) y el lento (+48,2 +/- 4,8 mv) (figuras 4A-B). Estas dos fases de corriente de hASIC3 inducida por protones también se diferenciaron por su sensibilidad frente al antagonista amilorida. La aplicación conjunta de amilorida 100 microM con pH 4,0 en condiciones de respuesta bifásica demostró un bloqueo más eficaz de la corriente rápida (62,8 +/- 6,5%) que de la lenta (28,7 +/- 4,6%) por amilorida (figura 5AB).

Distribución central y periférica de la expresión del gen de hASIC3

Como índice aproximado de la distribución anatómica y abundancia de ARNm, se observaron varios ADNc que codificaban para hASIC3 en bibliotecas de ADNc de testículos y feto total representadas en la base de datos dbEST. Los resultados obtenidos en la hibridación de ARN con alta rigurosidad confirmaron que el gen de hASIC3 se transcribe en un amplio espectro de órganos internos así como el sistema nervioso central (figura 6). En la fase adulta, se detectaron transcritos de hASIC3 en el pulmón, ganglios linfáticos, riñón, hipófisis, corazón y testículos así como en el cerebro y la médula espinal. Una regulación por incremento en el desarrollo de la expresión del gen de hASIC3 resultó evidente cuando se compararon niveles de ARNm fetal frente a de adulto en pulmón y riñón (figura 6). Por tanto, la expresión de la subunidad hASIC3 no se limita exclusivamente a los ganglios sensitivos tal como en DRASIC de rata, lo que explica la decisión de utilizar una nomenclatura cronológica que es independiente de la distribución. No obstante, se confirmó la función potencialmente importante de canales regulados por protones no inactivantes en neuronas sensitivas nociceptivas mediante la detección de altos niveles de ARNm de ASIC3 en ganglios del trigémino humanos adultos usando RT-PCR (figura 7).

Ejemplo 2 Canal heteromultimérico compuesto por hASIC3 y P2x2 de rata

Para demostrar la posibilidad de asociación heteromultimérica entre hASIC3 y/o derivados del mismo y otras subunidades de canales iónicos, se expresaron conjuntamente constructos de hASIC3 y P2x2 de rata en ovocitos de Xenopus para verificar si la presencia de una subunidad de canal iónico regulado por ATP puede modificar las propiedades del canal hASIC3. P2X2 presenta similitudes importantes con hASIC3, tales como la topología de membrana global (dos dominios transmembrana, dominio extracelular rico en cisteínas), sensibilidad a pH (la respuesta frente a ATP del canal homomultimérico P2X2 está fuertemente potenciada por el pH ácido), y distribución tisular (tanto hASIC3 como P2X2 se ubican conjuntamente en neuronas sensitivas).

En la figura 8 se muestra el registro de corriente catiónica no inactivante inducida por ácido fuerte (pH 4,0) en ovocitos de Xenopus a los que se inyecta el clon de hASIC3 solo en el vector pcDNA3. Estos datos demuestran que hASIC3 solo puede asociarse en canales catiónicos homoméricos funcionales.

En la figura 9 se muestra el registro de corriente catiónica no inactivante inducida por ácido débil (pH 6,5) en ovocitos de Xenopus a los que se inyecta conjuntamente clon de hASIC3 y clon de P2x2 de rata, ambos en el vector pcDNA3. Estos datos demuestran que la expresión conjunta de hASIC3 y P2x2 de rata cambia la sensibilidad al pH de hASIC3 homomérico o conduce a la formación de canales sensibles a pH heteromultiméricos.

Bibliografía

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE:

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(A): NOMBRE: McGill University

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(B): CALLE: 3550 University Street

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(C): CIUDAD: Montreal

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(D): ESTADO: Québec

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(E): PAÍS: CANADÁ

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(F): CÓDIGO POSTAL (CP): H3A 2A7

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(G): TELÉFONO: (514) 398-9898

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(H): FAX: (514) 398-8479

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(A): NOMBRE: SEGUELA, Philippe

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(B): CALLE: 890 Davaar

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(C): CIUDAD: Outremont

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(D): ESTADO: Québec

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(E): PAÍS: CANADÁ

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(F): CÓDIGO POSTAL (CP): H2V 3B5

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(A): NOMBRE: BABINSKI, Kazimierz

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(B): CALLE: 364 Berkley Circle

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(C): CIUDAD: Dorval

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(D): ESTADO: Québec

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(E): PAÍS: CANADÁ

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(F): CÓDIGO POSTAL (CP): H9S 1H4

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ADN QUE CODIFICA PARA UN CANAL IÓNICO REGULADO POR PROTONES HUMANO Y USOS DEL MISMO

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 5

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(iv): FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

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(B): ORDENADOR: PC IBM compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)

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(v): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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: NÚMERO DE SOLICITUD: CA PCT/CA98/01016

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(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: CA 2.219.713

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 29-OCT-1997

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 1732 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE CADENA: doble

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(ix): RASGO:

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(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): UBICACIÓN:22..1614

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(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

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1

2

3

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 531 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

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4

5

6

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 17 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): TIPO DE CADENA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(ix): RASGO:

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(A): NOMBRE/CLAVE: Región

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(B): UBICACIÓN: 2

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(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Xaa = aminoácido sin identificar"

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(ix): RASGO:

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(A): NOMBRE/CLAVE: Región

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(B): UBICACIÓN:11

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(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Xaa = aminoácido sin identificar."

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(ix): RASGO:

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(A): NOMBRE/CLAVE: Región

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN:13..14

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(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Xaa = aminoácido sin identificar."

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(ix): RASGO:

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(A): NOMBRE/CLAVE: Región

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(B): UBICACIÓN:16

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(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Xaa = aminoácido sin identificar."

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(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

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\sa{Leu Xaa Phe Pro Ala Val Thr Leu Cys Asn Xaa Asn Xaa Xaa Arg Xaa}

\sac{Ser}

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 20 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE CADENA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCAGTGGCCA CCTTCCTCTA

\hfill

20

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 21 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

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\hskip-.1em\dddseqskip

ACAGTCCAGC AGCATGTCAT C

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21

Claims

1. Canal catiónico regulado por protones aislado que comprende una subunidad que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1A/B o una variante de esa secuencia que tiene al menos 531 aminoácidos y al menos una identidad del 85% con la misma, en el que el canal catiónico regulado por protones presenta una corriente bifásica y el componente lento de la corriente bifásica está inhibido por amilorida.

2. Canal según la reivindicación 1, que es un canal homopolimérico.

3. Canal según la reivindicación 1, que es un canal heteropolimérico.

4. Canal según la reivindicación 3, que tiene al menos una subunidad que pertenece a la superfamilia de canales de degenerina/ENaC.

5. Canal según la reivindicación 3, que tiene al menos una subunidad que pertenece a la familia del canal regulado por ATP P2X.

6. Canal según la reivindicación 5, en el que la subunidad de la familia de P2X es P2X2.

7. Uso de un canal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para seleccionar compuestos útiles como ligandos de canales catiónicos regulados por protones.

8. Ácido nucleico aislado que codifica para una subunidad de canal catiónico regulado por protones que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1A/B o una variante de esa secuencia que tiene al menos 531 aminoácidos y al menos una identidad del 85% con la misma, en el que el canal catiónico regulado por protones presenta una corriente bifásica y el componente lento de la corriente bifásica está inhibido por amilorida.

9. Ácido nucleico que codifica para una subunidad de canal catiónico regulado por protones según la reivindicación 1, y otra subunidad de canal catiónico según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.

10. Vector recombinante que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 8 o 9.

11. Método de producción de un canal catiónico regulado por protones según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende expresar una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 8 o 9, en el que dicho método no es un método para el tratamiento del cuerpo humano o de animales mediante cirugía o terapia o un método de diagnóstico practicado en el cuerpo humano o de animales.

12. Célula huésped recombinante que comprende un vector según la reivindicación 10, que puede expresar el canal catiónico según la reivindicación 1 o 2, en la que dicha célula huésped no está presente en el cuerpo humano.

13. Célula huésped recombinante que comprende un vector según la reivindicación 10, que puede expresar el canal catiónico según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en la que dicha célula huésped no está presente en el cuerpo humano.

14. Método de producción de un canal catiónico regulado por protones según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende incubar la célula huésped recombinante según la reivindicación 12 o 13 en condiciones que permiten que se exprese la secuencia de ácido nucleico, y aislar la proteína de la célula huésped recombinante.

15. Uso de una célula huésped recombinante según la reivindicación 13 o 14, para seleccionar compuestos útiles como ligandos de canales catiónicos regulados por protones.

16. Uso de un ácido nucleico que codifica para un canal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para seleccionar compuestos útiles como ligandos de canales catiónicos regulados por protones.

17. Composición o kit para seleccionar compuestos útiles como ligandos de canales catiónicos regulados por protones, que comprende al menos uno de un canal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un ácido nucleico según la reivindicación 8 o 9, un vector recombinante según la reivindicación 10, una célula huésped recombinante según la reivindicación 12 o 13, y cualquier componente auxiliar adecuado.

18. Composición o kit según la reivindicación 17, en el que los ligandos son analgésicos.

19. Canal catiónico regulado por protones humano aislado que comprende una subunidad que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica en un 85% a la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1A/B, en el que el canal catiónico regulado por protones presenta una corriente bifásica cuando se activa mediante una concentración extracelular de protones que es inferior al pH fisiológico, y en el que el componente lento de la corriente bifásica está inhibido por amilorida.

20. Subunidad de canal catiónico regulado por protones aislada que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1A/B.

21. Canal catiónico regulado por protones aislado que comprende una subunidad según la reivindicación 20.

22. Ácido nucleico aislado que codifica para una subunidad de canal catiónico regulado por protones, en el que dicho ácido nucleico codifica para la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1A/B.