ES2281129T3 - Canales de potasio kcnq y procedimientos para su modulacion. - Google Patents

Abstract

Una molécula de ácido nucleico que comprende: (a) polinucleótidos que codifican el polipéptido como se muestra en la Figura 2 (KCNQ2 humano); (b) polinucleótidos que comprenden la secuencia de ácido nucleico como se muestra en la Figura 2 (KCNQ2 humano); (c) polinucleótidos que están degenerados con respecto a los polinucleótidos de (a) o (b) en el código genético; o (d) polinucleótidos que muestran al menos el 80% de coincidencia de secuencia con los polinucleótidos de (a) a (c) y que codifican un polipéptido que tiene actividad de canal de potasio; o una cadena complementaria de tal polinucleótido.

Description

Canales de potasio KCNQ y procedimientos para su modulación.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a ácidos nucleicos y proteínas para el canal de potasio humano KCNQ2, así como vectores relacionados, células huésped, procesos para la preparación, y procedimientos de uso. La presente invención se refiere también a anticuerpos específicos para la proteína KCNQ2 humana. Se incluyen dentro de la presente invención procedimientos de selección de compuestos que se unen a y/o modulan de otra forma dicha proteína de canal de potasio aquí descrita.

Antecedentes de la invención

Entre los canales iónicos, los canales de ión potasio (K^{+}) son los más ubicuos y diversos. Incluyen tres clases estructurales principales, los canales con seis, cuatro o dos dominios transmembrana. Los canales de potasio con seis dominios transmembrana se dividen además en familias distintas, tales como canales de potasio similares a Shaker, similares a eag y similares a Slo. La reciente identificación de KvLQT1 ha establecido una familia nueva de canales de potasio de seis dominios transmembrana. Barhanin et al. (1996) Nature 384: 78-80; Sanguinetti et al. (1996) Nature 384: 80-83; Yang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4017-4022; Wang et al. (1996) Nature Genetics 12: 17-23. La búsqueda de bancos de datos de secuencias de DNA y proteína revela miembros potenciales adicionales de canales relacionados con KvLQT1 en C. elegans así como en el ser humano. Wei et al. (1996), Neuropharmacology 35: 805-829; Yang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4017-4022.

Uno o más tipos de canales de K^{+} residen sobre membranas celulares en las que son marcadamente selectivos para K^{+} sobre otros iones. En células excitables, los canales de K^{+} modulan la configuración del potencial de acción. El eflujo de potasio es el principal mecanismo de repolarización, mantenimiento, e hiperpolarización del potencial de membrana en reposo. Halliwell (1990) en Potassium channels-structure, classification, function and therapeutic potential (N. S. Cook, ed.)*; 348-381; Jan, L. Y. y Jan, Y. N. (1992), Ann. Rev. Physiol. 54: 537-555; Pongs (1992), Physiol. Rev. 72: S69-S88.

En las neuronas, los canales K^{+} regulan la excitabilidad neuronal, la forma y el patrón de activación del potencial de acción, y la liberación de neurotransmisores. Estos canales pueden abrirse mediante diversos estímulos, tales como segundos mensajeros intracelulares, potencial de membrana, iones, y neurotransmisores. Hille (1992), Ionic channels of excitable membranes; Catterall (1995), Ann. Rev. Biochem. 64: 493-531. Los canales K^{+} neuronales son críticos para funciones neuronales tales como la neurotransmisión y neuroprotección, y pueden afectar a la percepción, aprendizaje, comportamiento, y similares.

Recientemente, se cambió la nomenclatura para KvLQT1 y los canales relacionados con KvLQT1. Biervert et al. (1998), Science, 279:403-406. KvLQT1 se renombró como KCNQ1, y los canales relacionados con KvLQT1 (KvLR1 y KvLR2) se renombraron como KCNQ2 y KCNQ3, respectivamente.

Por tanto, en esta memoria descriptiva, la referencia a KCNQ1 es equivalente a KvLQT1; la referencia a KCNQ2 es equivalente a KvLR1; y la referencia a KCNQ3 es equivalente a KvLR2.

Las convulsiones neonatales familiares benignas ("BFNC"), una clase de epilepsia idiopática generalizada, es un trastorno hereditario predominantemente autosómico de los neonatos. Se ha relacionado recientemente la BFNC con mutaciones en dos genes canales K^{+} putativos, KCNQ2 y KCNQ3. Bievert et al., supra; Charlier et al. (1998), Nature Genetics 18:53-55; Singh et al. (1998) Nature Genetics 18:25-29. La caracterización funcional preliminar de KCNQ2 confirmó que este gen codifica un canal K^{+} activado por voltaje. Singh et al., supra.

Resumen de la invención

La presente invención describe el canal de potasio específico del sistema nervioso referido aquí como KCNQ2 (anteriormente llamado KvLR1). También se describe aquí el canal de potasio específico del sistema nervioso KCNQ3 (anteriormente llamado KvLR2). En la presente invención está el KCNQ2 humano (Figura 2). Se describen aquí el KCNQ3 humano (Figura 23), KCNQ2 murino (Figura 10), y KCNQ2 de rata (Figura 16 y Figura 17). La invención engloba las secuencias de aminoácidos de la proteína KCNQ2 humana y las secuencias de ácidos nucleicos que codifican dicha proteína, así como variaciones en las secuencias de ácidos nucleicos debidas a la degeneración en el código genético.

La presente invención proporciona: (a) una molécula de ácido nucleico aislada y purificada que codifica una proteína KCNQ2 de la presente invención; (b) secuencias de ácidos nucleicos complementarias de (a), o (c) secuencias de ácidos nucleicos que tienen al menos una coincidencia de secuencia del 80%, más preferiblemente al menos el 90%, y aún más preferiblemente al menos el 95%, y todavía más preferiblemente una coincidencia de secuencia del 98% con (a). También se describe aquí un fragmento de (a) o (b) que se hibridará con (a) o (b) bajo condiciones estrictas, comprendiendo preferiblemente dicho fragmento al menos 15 nucleótidos. La secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína KCNQ2 de la presente invención se encuentra en SEQ ID NO:19 del listado de secuencias publicado según Annex. La proteína KCNQ3 aquí descrita se muestra en SEQ ID NO:26.

La invención contempla: (a) secuencias de aminoácidos que comprenden la proteína KCNQ2 de la presente invención; y (b) secuencias de aminoácidos que tienen al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90%, y aún más preferiblemente al menos el 95%, y todavía más preferiblemente una coincidencia de secuencia del 98% con (a). La secuencia de aminoácidos que comprende la proteína KCNQ2 de la presente invención se encuentra en SEQ ID NO:20. La secuencia de aminoácido de la proteína KCNQ3 se encuentra en SEQ ID NO:27 publicado según Annex.

La invención se refiere además a ácidos nucleicos nuevos y vectores asociados, células huésped, y procedimientos de uso. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico es una molécula de DNA. También se prefieren secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:20, así como proteínas idénticas a esta secuencia en alrededor del 80% o más. También se prefieren secuencias de nucleótidos idénticas a SEQ ID NO:19 en alrededor del 80% o más.

La invención también se refiere a ácidos nucleicos obtenidos mediante PCR con cebadores de oligonucleótidos degenerados. Los expertos en la técnica podrían crear tales cebadores en base a la secuencia consenso aquí descrita. Las técnicas de PCR se describen en White et al. (1989), Trends Genet. 5: 185-189.

Esta invención también se refiere a vectores de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína KCNQ2, células huésped que contienen tales vectores, y polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de la proteína KCNQ2.

Preferiblemente, el vector codifica una proteína KCNQ2 de longitud completa y el polipéptido es una proteína KCNQ2 de longitud completa. Los inventores prefieren vectores de expresión de ranas tales como pSP64T o derivados del mismo (Melton et al. (1984), Nucl. Acids Res. 12: 7057-7070); vectores de expresión de células de mamíferos tales como pcDNA3 (disponible en Invitrogen); o vectores de expresión de células bacterianas tales como pET-30 (disponible en Novagen o Promega).

Esta invención también se refiere a células huésped transformadas con los vectores anteriormente descritos. Los inventores prefieren oocitos de Xenopus, células de mamíferos (p. ej., HEK293, CHO, L929), y células bacterianas (por ejemplo, E. coli, especialmente BL21 (DE3), disponible en Novagen). Los inventores prefieren particularmente las células depositadas según ATCC Acc. No. CRL-1573 (American Type Cultura Collection, 10801 University Boulevard, Manassas VA 20110-2209).

La invención también se refiere a procedimientos para detectar ácidos nucleicos que codifican la proteína KCNQ2 y procesos para detectar moléculas que se unen a y/o modulan de otra manera la actividad de la proteína KCNQ2. "Modulan" engloba los abridores/activadores de canal y oclusores/inactivadores de canal.

La invención también se refiere a procedimientos para modular la proteína KCNQ2, específicamente procedimientos para abrir/activar o cerrar/inactivar el canal KCNQ2. Además, la presente solicitud describe un uso de un procedimiento para tratar trastornos modulando la actividad de la proteína KCNQ2.

Descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra el aislamiento de un cDNA de KCNQ2/KvLR1 humano de longitud completa. Se derivó un cDNA de KCNQ2/KvLR1 humano de longitud completa a partir de dos clones de cDNA solapados. "S1" a "S6" significan dominios transmembrana de 1 a 6; "H5" significa el domino que forma el poro (este dominio también se refiere aquí como el dominio "P"); ORF, el marco de lectura abierto; 3’UTR, las regiones 3’ no traducidas. También se muestran las localizaciones de diversos clones y sondas EST. (La figura no está dibujada a escala).

Las Figuras 2A a 2F muestran el nucleótido (SEQ ID NO:19) y la secuencia de aminoácidos inferida (SEQ ID NO:20) del KCNQ2/KvLR1 humano.

La Figura 3 muestra una comparación de secuencia del KCNQ2/KvLR1 humano (SEQ ID NO:20) y KCNQ1/
KvLQT1 humano (SEQ ID NO:21). "|" indica coincidencia de secuencia de aminoácidos. No se muestran los aminoácidos C-terminales de ambas proteínas.

La Figura 4 muestra una comparación de secuencia del KCNQ3/KvLR2 humano (SEQ ID NO:18) y KCNQ1/
KvLQT1 humano (SEQ ID NO:21). "|" indica coincidencia de secuencia de aminoácidos. No se muestran los aminoácidos C-terminales de ambas proteínas. No se muestran los aminoácidos N-terminales del KCNQ3/KvLR2.

La Figura 5 muestra la expresión de KCNQ2/KvLR1 y KCNQ3/KvLR2 en tejidos humanos y diversas partes del cerebro humano. La Figura 5A muestra KCNQ2/KvLR1. La Figura 5B muestra KCNQ3/KvLR2. Se hibridaron transferencias Northern de mRNA poli(A+) individualmente con sondas radiomarcadas específicas de KCNQ2 (Figura 5A) o específicas de KCNQ3 (Figura 5B). En la izquierda se indican marcadores de peso molecular de RNA.

La Figura 6 muestra la caracterización funcional de corrientes de KCNQ2/KvLR1 en oocitos de Xenopus.

En las Figuras 6A y 6B, se obtuvieron familias de corrientes de oocitos inyectados con agua (Figura 6A) e inyectados con cRNA de KCNQ2/KvLR1 humano mediante pasos de voltaje de 1 segundo, desde un potencial de reposo de -80 mV, hasta potenciales de ensayo que varían desde -100 hasta +40 mV en incrementos de 10 mV.

La Figura 6C muestra la relación voltaje-corriente máxima (I-V) para oocitos que expresan KCNQ2/KvLR1 humano. Se registraron las corrientes usando el protocolo descrito anteriormente para las Figuras 6A y 6B.

La Figura 6D muestra la dependencia del potencial de inversión de la corriente de cola (E_{rev}) de la concentración externa de K^{+}. Se obtuvieron las corrientes de cola a potenciales de -110 a +10 mV después de un pulso de 1 segundo hasta +20 mV (n = 6 oocitos) mientras la concentración externa de K^{+} se hacía variar entre 2, 10, 40, y 98 mM. Se determinó el E_{rev} bajo cada condición para cada oocito midiendo el intercepto en cero de un gráfico de la amplitud de corriente de cola contra el potencial de prueba. La línea discontinua tiene una pendiente de 58 mV y se traza de acuerdo con la ecuación de Nernst para un canal de K^{+} perfectamente selectivo. Los datos son la media \pm SEM de seis experimentos.

La Figura 7 muestra la caracterización farmacológica de corrientes de KCNQ2/KvLR1 en oocitos de Xenopus. En particular, esta figura muestra los efectos del E-4031, 4-AP, TEA, caribdotoxina y clofilium sobre la corriente de KCNQ2/KvLR1 humano. Se registraron corrientes superpuestas durante pasos de 1 segundo hasta +30 mV, desde -80 mV, durante el mismo experimento. Se aplicaron los compuestos mediante baño de perfusión en orden de arriba a abajo. El baño se perfusionó con solución control durante 5 minutos, o hasta que los efectos se invirtieron completamente, entre compuestos. Se obtuvieron resultados similares en tres oocitos adicionales.

La Figura 8 muestra la coexpresión de KCNQ2/KvLR1 de visón y humano en oocitos de Xenopus.

La Figura 8A muestra el efecto de TEA 1 mM sobre corrientes de membrana registradas a partir de un oocito inyectado solamente con KCNQ2/KvLR1 humano. Se registraron corrientes superpuestas durante pasos de voltaje de 1 segundo hasta +40 mV desde un potencial de reposo de -80 mV antes y después de aplicar TEA mediante el baño. El TEA redujo la corriente de KCNQ2/KvLR1 humano en aproximadamente el 80%.

La Figura 8B muestra el efecto de TEA 1 mM sobre corrientes de membrana registradas a partir de un oocito inyectado con KCNQ2/KvLR1 de visón y humano. Se obtuvieron las corrientes usando el protocolo de la Figura 8A. El TEA inhibió parcialmente las corrientes de KCNQ2/KvLR1 de visón y humano, no obstante, la amplitud y cinética del componente de corriente insensible al TEA fue similar a corrientes observadas en oocitos inyectados solamente con visón.

La Figura 9 muestra la expresión de KCNQ2/KvLR1 murino en el cerebro de ratón adulto. La Figura 9A es una fotografía de campo oscuro de una sección coronal de un cerebro de ratón adulto hibridado con una sonda de KCNQ2/KvLR1 antisentido radiomarcada, mostrando transcripciones de KCNQ2/KvLR1 en las capas de células piramidales del hipocampo. Se detectaron niveles de expresión más bajos en la capa de células granulares del gyrus dentado.

La Figura 9B es una fotografía de campo oscuro de una región similar a la mostrada en la Figura 9A, pero hibridada con una sonda sentido; se detectó poca expresión específica de KvLR1 con esta sonda. Magnificación: 125x para la Figura 9A y la Figura 9B.

La Figura 9C muestra una secuencia de nucleótidos parcial de KCNQ2/KvLR1 murino y una secuencia de aminoácidos. Esta secuencia se obtuvo mediante amplificación de PCR de un banco de cDNA de cerebro de ratón usando los oligonucleótidos MABms 278 y MABms 315 basados en la secuencia de KCNQ2/KvLR1 humano. Los fragmentos de PCR se aislaron, subclonaron, y secuenciaron. Se usó un fragmento de 226 pb como se muestra anteriormente en una sonda para hibridación in situ. La secuencia de nucleótidos es idéntica en 80% al KCNQ2/KvLR1 humano (96% de coincidencia en la secuencia de aminoácidos).

MABms 278:

5’-GGCCGAATTCTGTTTCTCAGCAGCTCCAGC-3’

MABms 315:

5’-GCGCGAATTCGAGCAGCACAGGCA(A/G)AA(A/G)CA-3’

La Figura 10A hasta la Figura 10D muestran el DNA y la secuencia de aminoácidos traducida del gen de KCNQ2/
KvLR1 del cerebro de ratón. La Figura 10E muestra un análisis de hidropatía del gen de KCNQ2/KvLR1 del cerebro de ratón. La gráfica de hidropatía revela el patrón típico de canales de K^{+} sensibles al voltaje con 6 dominios que abarcan la membrana putativos (S1-S6) y una región de poro (P).

La Figura 11 muestra el alineamiento de secuencias de canales de potasio de KCNQ2/KvLQT1 del corazón de ratón y de KCNQ2/KvLR1 del cerebro de ratón. El alineamiento de estos dos genes muestra una coincidencia global de aminoácidos del 40% (indicada por las zonas sombreadas) y una coincidencia del 62,5% dentro de los dominios de membrana y de poro. Los dominios de membrana putativos y de poro se indican mediante los recuadros. La secuencia firma para un canal de potasio, GYG, se observa en la región del poro, y el sensor de voltaje, RXXQXXRXXR, está dentro del dominio S4.

La Figura 12 muestra exones de ensamblaje alternativos en el extremo 3’ del KCNQ2/KvLR1 murino. Al menos dos exones de ensamblaje, que cuando se traducen producen las secuencias de aminoácidos mostradas en A y B, se han identificado en el gen de KCNQ2/KvLR1 murino en las posiciones de aminoácidos 372 y 406, respectivamente.

La Figura 13 muestra una transferencia Northern de tejido múltiple de ratón. Se sondó una transferencia Northern con un fragmento del gen de KCNQ2/KvLR1 de ratón (nucleótidos 1140-2306). Se observa una única transcripción de 8,2 Kb en el cerebro, pero no se ve en otros tejidos.

La Figura 14 muestra la hibridación in situ del cerebro de rata. La combinación muestra tres regiones en las que se expresa con gran potencia el mensaje de KCNQ2/KvLR1 de rata. Las sondas antisentido muestran una señal fuerte en el hipocampo, gyrus dentado, corteza, y núcleo motor del nervio trigémino. Los controles de sonda sentido muestran poco efecto de fondo.

La Figura 15 muestra la caracterización electrofisiológica de corrientes de células enteras mediadas por KCNQ2/
KvLR1 de ratón expresadas en oocitos de Xenopus. En la Figura 15A, las despolarizaciones en pasos de 10 mV desde -80 hasta +40 produjeron una familia de corrientes hacia el exterior que fueron significativamente diferentes a las de las células control. La adición de TEA 1 mM bloqueó las corrientes mediadas por KvLR1 y las corrientes de cloruro de fondo no se vieron afectadas por el TEA. Se mostró que el clofilium, un bloqueador de las corrientes I_{Ks} e I_{Kr} del corazón, bloqueaba parcialmente las corrientes mediadas por KCNQ2/KvLR1 cuando se despolarizaba desde -80 hasta +40 \muV. La Figura 15B muestra los controles no inyectados.

La Figura 16 muestra un alineamiento de la secuencia de nucleótidos consenso (SEQ ID NO:1) y las secuencias de nucleótidos del KCNQ3/KvLR2 humano (SEQ ID NO:26), KCNQ2/KvLR1 humano (SEQ ID NO:19), KCNQ3/
KvLR2 de ratón (SEQ ID NO:22), y KCNQ3/KvLR2 de rata (SEQ ID NO:7). "|" indica coincidencia de secuencia; "-" representa secuencia no consenso; y "*" indica un espacio introducido para optimizar la coincidencia de secuencia.

La Figura 17 muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos consenso (SEQ ID NO:2) y las secuencias de aminoácidos del KCNQ3/KvLR2 humano (SEQ ID NO:27), KCNQ2/KvLR1 humano (SEQ ID NO:20), KCNQ3/KvLR2 de ratón (SEQ ID NO:23), y KCNQ3/KvLR2 de rata (SEQ ID NO:8). Como en la Figura 16, "|" indica coincidencia de secuencia; "-" representa secuencia de no consenso; y "*" indica un espacio introducido para optimizar la coincidencia de secuencia.

La Figura 18 muestra la caracterización funcional de corrientes de KCNQ3. La Figura 18A muestra familias de corrientes de oocitos inyectados con cRNA de KCNQ3 provocadas por pasos de voltaje de 1 segundo, a partir de un potencial de reposo de -80 mV, hasta un potencial de ensayo que varía desde -70 hasta +50 mV en incrementos de 10 mV. La Figura 18B muestra la relación I-V para oocitos que expresan KCNQ3 (n=6). Se registraron las corrientes usando el protocolo de la Figura 18A. La Figura 18C muestra la dependencia del E_{rev} de la corriente de cola de la concentración externa de K^{+}. La línea tiene una pendiente predicha por la ecuación de Nernst para un canal de K^{+} perfectamente selectivo. Cada valor es la media \pm SEM de seis oocitos. La Figura 18D muestra efectos del E-4031, 4-AP, TEA y clofilium sobre la corriente de KCNQ3. Se registraron corrientes superpuestas durante pasos de 1 segundo hasta +20 mV, desde -80 mV, durante el mismo experimento. Se aplicaron los compuestos mediante un baño de perfusión en orden de arriba a abajo. El baño se perfusionó con solución control durante 5 minutos, o hasta que los efectos se invirtieron completamente, entre compuestos. Se obtuvieron resultados similares en tres oocitos adicionales.

La Figura 19 muestra la coexpresión de KCNQ2 y KCNQ3. La Figura 19A muestra familias de corrientes de oocitos inyectados con cRNA de KCNQ2, la Figura 19B con KCNQ3, y la Figura 19C con KCNQ2 + KCNQ3, provocadas por pasos de voltaje de 1 segundo, desde un potencial de reposo de -80 mV, hasta un potencial de ensayo que varía desde -70 hasta +50 mV (incrementos de 10 mV). La Figura 19D muestra la relación voltaje-corriente (I-V) para oocitos que expresan KCNQ2 + KCNQ3 (n=6). Se registraron las corrientes usando el protocolo de las Figuras 19A-19C. La Figura 19E muestra la dependencia del potencial de inversión de la corriente de cola (E_{rev}) de la concentración externa de K^{+}. La línea discontinua tiene una pendiente predicha por la ecuación de Nernst para un canal de K^{+} perfectamente selectivo. Cada valor es la media \pm SEM de seis oocitos. La Figura 19F muestra los efectos del 4-AP, TEA, caribdotoxina y clofilium sobre la corriente de KCNQ2 + KCNQ3. Se registraron corrientes superpuestas durante pasos de 1 segundo hasta +20 mV, desde -80 mV, durante el mismo experimento. Se aplicaron los compuestos mediante un baño de perfusión en orden de arriba abajo. Se obtuvieron resultados similares en 4 oocitos
adicionales.

La Figura 20 muestra la interacción de KCNE1 (visón) con corrientes de KCNQ2 + KCNQ3. Familias de corrientes de oocitos inyectados con cRNA de KCNE1 (Figura 20), KCNQ2 + KCNQ3 (Figura 20B) y KCNQ2 + KCNQ3 + KCNE1 (Figura 20C) provocadas por pasos de voltaje de 1 segundo, desde un potencial de reposo de -80 mV, hasta un potencial de ensayo que varía desde -70 hasta +50 mV (incrementos de 10 mV). El recuadro de la Figura 20A muestra corrientes de KCNE1 provocadas por pasos de voltaje de 5 segundos, desde -80 mV hasta potenciales que varían desde -30 hasta +50 mV (incrementos de 20 mV) en el mismo oocito.

La Figura 21 es una fotografía de una hibridación in situ con KCNQ2 de rata que muestra una sección transversal de la médula espinal de rata. La Figura 21(A) se realiza con magnificación baja (55x); se pueden visualizar diversas áreas con una señal relativamente alta. La Figura 21(A) se realiza con magnificación alta (322x); cada área de señal alta es una célula y por su tamaño parecen ser motoneuronas.

La Figura 22A muestra la corriente de KCNQ2 murino macroscópica registrada a partir de una zona de la membrana, desde el interior hacia el exterior, extirpada de una célula CHO que expresa de forma estable KCNQ2 murino. La corriente muestra activación lenta y rectificación hacia el exterior. La Figura 22B muestra el registro de pinzamiento zonal de corrientes de un único canal en una zona, desde el interior hacia el exterior, extirpada de una célula de KCNQ2 murina/CHO. Hay al menos 2 canales en la zona; se estimó que la conductancia de un único canal de KCNQ2 estaba entre 24 y 30 pS. Todos los registros se hicieron en K^{+} 140 mM simétricos usando técnicas convencionales.

La Figura 23 muestra la secuencia de nucleótidos y la de aminoácidos inferida del KCNQ3 humano (también referido aquí como KvLR2).

Descripción detallada de la invención

Las siguientes definiciones se aplican a los términos usados a lo largo de esta memoria, a menos que se defina de otra manera en casos específicos:

"clonación" - aislamiento de un gen particular a partir de material genético, por ejemplo un genoma, banco genómico, o banco de cDNA hacia un plásmido u otro vector;

"proteína KvLR" - una proteína que tiene al menos aproximadamente el 70% de coincidencia con la secuencia consenso. También puede estar referida como "proteína KCNQ", "proteína KvLR/KCNQ" o "proteína KCNQ/KvLR".

"KCNQ1" - la proteína anteriormente conocida como KvLQT1.

"KCNQ2" - la proteína anteriormente conocida como KvLR1.

"KCNQ3" - la proteína anteriormente conocida como KvLR2.

"condiciones estrictas" (usado en referencia a la hibridación de ácido nucleico) - Por ejemplo, transferencia Southern lavada en SSC 1x y SDS al 0,1% a una temperatura de al menos aproximadamente 42ºC. Para condiciones estrictas adicionales, ver Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York (1982).

"plásmido multi-copia" - un plásmido que tiene más de una copia presente en una célula (típicamente de 10 a 30 copias).

"Transferencia Northern" - un procedimiento para identificar fragmentos particulares de RNA mediante hibridación con un ácido nucleico complementario, típicamente un cDNA o un oligonucleótido;

"marco de lectura abierto" u "ORF" - una secuencia de DNA que contiene una serie de tripletes de nucleótido que codifican aminoácidos y carecen de cualquier código de terminación;

"plásmido" - elementos citoplásmicos, que replican DNA autónomamente localizados en microorganismos;

"promotor" - una región del DNA a la que la RNA polimerasa se une e inicia la transcripción; y

"transferencia Southern" - un procedimiento para identificar fragmentos particulares de DNA mediante hibridación con un ácido nucleico complementario, típicamente un cDNA o un oligonucleótido.

Para definiciones de otros términos de esta memoria, ver F. Sherman et al., Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York (1987) y Lewin, B., Genes IV, Oxford University Press, Oxford (1990).

Las siguientes definiciones se aplican a abreviaturas de esta memoria, a menos que se defina de otra manera en casos específicos:

BFNC

convulsiones neonatales familiares benignas

BLAST

herramienta de búsqueda del alineamiento local básico

CHO

células ováricas de hámster chino

DTT

ditiotreitol

DRG

ganglio de la raíz dorsal

EDTA

ácido etilendiaminotetracético

EST

marcadores de secuencia expresados

GPCR

receptor acoplado a proteína-G

ORF

marco de lectura abierto

PAGE

electroforesis en gel de poliacrilamida

PBS

disolución salina tamponada con fosfato

PCR

reacción de la cadena de polimerasa

SDS

dodecil sulfato sódico

SSC

tampón que contiene NaCl 150 mM, citrato de Na_{3} \cdot 2 H_{2}O 15 mM, pH 7,0.

TEA

tetraetilamonio

Para abreviaturas adicionales, ver Aldrichimica Acta, Vol. 17, Nº 1 (1984).

Uso y utilidad

Los expertos en la técnica creen que las proteínas KCNQ2 pueden estar implicadas en la neurotransmisión. Los expertos en la técnica pueden usar la proteína KCNQ2 de la presente invención para ensayar moduladores de KCNQ2. Los moduladores de KCNQ2 serían útiles en el tratamiento de trastornos tales como ataxia, mioquimia, ataques (p. ej., ataques epilépticos), enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, pérdida de memoria asociada al envejecimiento la edad, deficiencias de aprendizaje, enfermedades de neuronas motoras, ictus, y similares.

Como el KCNQ2 es un canal de potasio selectivo del sistema nervioso, se incorpora una especificidad de fármaco en cualquier modulador específico del KCNQ2. Un fármaco específico para la proteína KCNQ2 evitaría por tanto efectos secundarios sobre los tejidos periféricos que contienen canales de potasio. De forma significativa, un modulador específico de KCNQ2 evitaría los efectos secundarios sobre el corazón, que contiene numerosos tipos de canales de potasio.

Los ácidos nucleicos de KCNQ2 de la presente invención, o ácidos nucleicos antisentido, pueden ser agentes terapéuticos o diagnósticos útiles. Para tal terapia génica, los ácidos nucleicos pueden incorporarse en vectores y/o formularse como se describe en lo que sigue y con más detalle en la técnica.

Los expertos en la técnica pueden usar los polipéptidos y ácidos nucleicos de esta invención para preparar vectores, células o líneas celulares, y anticuerpos. Todos ellos son útiles en ensayos para la identificación de moduladores de la proteína KCNQ2.

Se pueden administrar moduladores de la proteína KCNQ2 a diversas especies de mamíferos, tales como monos, perros, gatos, ratones, ratas, humanos, etc. Mediante procedimientos conocidos, expertos en la técnica farmacéutica pueden incorporar moduladores de la proteína KCNQ2 en una forma de dosificación sistémica convencional, tal como un comprimido, una cápsula, elixir o formulación inyectable. Las formas de dosificación anteriores también incluirán cualquier material vehículo, excipiente, lubricante, tampón, antibacteriano, agente de relleno (tal como manitol), antioxidantes (ácido ascórbico o bisulfito sódico) aceptables fisiológicamente necesarios o similares.

Proceso de preparación En general

Esta memoria describe la clonación y expresión funcional del clon de cDNA humano de longitud completa de KCNQ2 (KvLR1), preferiblemente la secuencia de ácido nucleico de KCNQ2 (Figura 2) como se muestra en SEQ ID NO:19 y la secuencia de aminoácidos de KCNQ2 humano (Figura 2) como se muestra en SEQ ID NO:20. También se describe un clon de cDNA humano de longitud completa de KCNQ3 (KvLR2) (Figura 23) y un clon de cDNA murino de longitud completa de KCNQ2 (KvLR1 murina; Figura 10). Las secuencias de ácidos nucleicos de KCNQ3 humano y KCNQ2 murino se muestran en SEQ ID NO: 26 y 22, respectivamente. Las correspondientes secuencias de aminoácidos se muestran en SEQ ID NO:27 y 23, respectivamente. Además, la presente solicitud describe una secuencia de KCNQ2 de rata (Figura 16 y Figura 17). La secuencia de ácido nucleico de KCNQ2 de rata se muestra en SEQ ID NO:7, y la secuencia de aminoácidos de KCNQ2 de rata se muestra en SEQ ID NO:8. La cinética de apertura y las propiedades de corriente macroscópicas de las corrientes de KCNQ2 y KCNQ3 humanos, murinos y de rata son similares a las de KCNQ1. Sin embargo, KCNQ2 y KCNQ3 se localizan específicamente en el sistema nervioso y tienen propiedades farmacológicas diferentes.

Ácidos nucleicos

Con las secuencias génicas del KCNQ2 humano, KCNQ3 humano, KCNQ2 murino, y KCNQ2 de rata en la mano, alguien experto en la técnica puede obtener ácidos nucleicos de KCNQ de esta invención mediante procedimientos conocidos. Tales procedimientos incluyen: (1) Transferencia Southern y Northern; (2) Inmunotransferencia Western; (3) síntesis química; (4) síntesis mediante reacción de la cadena de polimerasa (PCR) a partir de promotores; (5) clonación de expresión; y (6) clonación de cDNA sustractiva.

Los expertos en la técnica también pueden modificar los ácidos nucleicos que codifican la proteína KCNQ2 de la presente invención para preparar mutaciones útiles. Por ejemplo, se puede modificar la secuencia para proporcionar sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción adicionales en el ácido nucleico. Tales mutaciones pueden ser silenciosas o pueden cambiar el aminoácido codificado por el codón mutado. Se pueden preparar estos ácidos nucleicos modificados, por ejemplo, mutando el ácido nucleico que codifica KCNQ2 para provocar la deleción, sustitución, inserción, inversión o adición de uno o más aminoácidos en el polipéptido codificado. Para procedimientos de mutagénesis dirigida a sitio, ver Taylor, J. W. et al. (1985), Nucl. Acids Res. 13, 8749-8764 y Kunkel, J. A. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 482-492. Además, hay disponibles equipos para mutagénesis dirigida a sitio de vendedores comerciales (por ejemplo, BioRad Laboratorios, Richmond, CA; Amersham Corp., Arlington Heights, IL). Para procedimientos de disrupción, deleción y truncado, ver Sayers, J. R. et al. (1988), Nucl. Acids Res. 16: 7191-800.

Esta invención comprende también ácidos nucleicos modificados, que incluyen (1) variantes de exones de ensamblaje alternativos; (2) variantes alélicos; y (3) canales quiméricos en los que el constructo de fusión comprende un sitio modulador de KCNQ. Los expertos en la técnica pueden obtener tales ácidos nucleicos modificados cuando utilicen la presente descripción.

Vectores de expresión

Esta invención también se refiere a vectores de expresión que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína KCNQ2 de la presente invención. Preferiblemente, los vectores de expresión comprenden toda la secuencia del ácido nucleico como se muestra en SEQ ID NO:19.

Los vectores de expresión habitualmente son plásmidos, pero la invención incluye otras formas de vectores que cumplen funciones equivalentes y que llegarán a conocerse en la técnica. Un experto en la técnica también podría integrar de manera estable una secuencia que codifique una proteína KCNQ2 en el cromosoma de una célula huésped apropiada.

Los vectores de expresión contienen típicamente elementos reguladores capaces de afectar a la expresión de una proteína KCNQ2. Estos elementos reguladores pueden ser elementos KCNQ2 heterólogos o nativos. Típicamente, un vector contiene un origen de replicación, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción. El vector puede incluir también otras secuencias reguladoras, que incluyen secuencias de estabilidad de mRNA, que proporcionan estabilidad del producto de expresión; secuencias conductoras secretoras, que proporcionan la secreción del producto de expresión; secuencias de retroalimentación ambiental, que permiten que se module la expresión del gen estructural (por ejemplo, mediante la presencia o ausencia de nutrientes u otros inductores en el medio de cultivo); secuencias de marcaje, que son capaces de proporcionar una selección fenotípica en células huésped transformadas; sitios de restricción, que proporcionan sitios para la ruptura mediante endonucleasas de restricción; y secuencias que permiten la expresión en diversos tipos de huéspedes, incluyendo procariotas, levaduras, hongos, plantas y eucariotas superiores.

Un vector de expresión de la presente invención es capaz al menos de dirigir la replicación, y preferiblemente la expresión, de los ácidos nucleicos y proteína de esta invención. Los orígenes de replicación adecuados incluyen, por ejemplo, los orígenes de replicación Col E1, el SV40 viral y el M13. Los promotores adecuados incluyen, por ejemplo, el promotor de citomegalovirus, el promotor lacZ, el promotor gal10 y el promotor poliédrico del virus de la polihedrosis nuclear múltiple de Autographa californica (AcMNPV). Las secuencias de terminación adecuadas incluyen, por ejemplo, las señales de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina, del SV40, del lacZ y la poliédrica del AcMNPV. Los ejemplos de marcadores seleccionables incluyen resistencia a neomicina, ampicilina, higromicina y similares.

Los expertos en la técnica pueden insertar DNA que codifique una proteína KCNQ2 de la presente invención en diversos vectores disponibles comercialmente. Los ejemplos incluyen vectores compatibles con células de mamíferos, tales como pcDNA3 o pCEP4; vectores de baculovirus tales como pBlueBac; vectores procarióticos tales como pcDNA2; y vectores de levaduras tales como pYes2. Para obtener técnicas de modificación de vectores, ver Sambrook et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York.

Células huésped

Esta invención también se refiere a células huésped que contienen un vector de expresión que comprende una secuencia que codifica una proteína KCNQ2 de la presente invención. Las células huésped contienen preferiblemente un vector de expresión que comprende toda o una parte de la secuencia de DNA que tiene la secuencia de nucleótidos fundamentalmente como se muestra en SEQ ID NO:19, particularmente las regiones codificadoras de la misma. Las células huésped adecuadas incluyen células procarióticas (por ejemplo, las cepas HB101, DH5a, XL1 Blue, Y1090 y JM101 de E. coli) y células eucarióticas (por ejemplo, células del insecto Spodoptera frugiperda, células CHO, células COS-7, células HEK 293, fibroblastos de piel humana, y células de S. cerevisiae).

Los expertos en la técnica pueden introducir vectores de expresión en células huésped mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica. Los procedimientos ejemplares son la transfección mediante precipitación de fosfato cálcico, electroporación, fusión liposómica, inyección nuclear, e infección vírica o de fagos. Después se puede cultivar la célula huésped bajo condiciones que permitan la expresión de grandes cantidades de proteína KCNQ2.

Se pueden identificar tales células huésped modificadas mediante cualquiera de seis propuestas generales:

(a) hibridación DNA-DNA con sondas complementarias con la secuencia que codifica la proteína KCNQ (transferencia Southern).

(b) detección de funciones de gen marcador, tales como actividad timidina quinasa, resistencia a antibióticos, y similares. Se puede situar un gen marcador en el mismo plásmido que la secuencia de KCNQ bajo la regulación del mismo promotor o de un promotor distinto.

(c) detección de transcripciones de mRNA mediante ensayos de hibridación (por ejemplo, transferencia Northern o un ensayo de protección de endonucleasa que usa una sonda complementaria con la secuencia de RNA).

(d) inmunodetección de la expresión génica (por ejemplo, mediante transferencia Western con anticuerpo contra la proteína KCNQ).

(e) detección de actividad del canal de potasio, tal como mediante análisis de pinzamiento zonal, eflujo de radioisótopos (por ejemplo, ^{86}Rb), o reactivos sensibles al potencial de membrana (por ejemplo, Dibac de Molecular Probes International).

(f) PCR con cebadores homólogos con secuencias del vector de expresión o secuencias que codifican la proteína KCNQ. La PCR produce un fragmento de DNA de longitud predicha, que indica incorporación del sistema de expresión en la célula huésped.

Los expertos en la técnica pueden determinar secuencias de DNA mediante diversos procedimientos conocidos. Ver por ejemplo, el procedimiento de terminación de cadena didesoxi en Sanger et al. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467 y el procedimiento de Maxam-Gilbert en Maxam-Gilbert (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560-564.

Se pueden usar las células huésped de la presente invención en una diversidad de formas que son ahora evidentes. Se pueden usar las células para seleccionar compuestos que se unen o modulan o regulan de otra manera la función de la proteína KCNQ2, que sería útil para la modulación, por ejemplo activación, de la actividad de la proteína KCNQ2; para estudiar mecanismos de transducción de señales e interacciones proteína-proteína; y para preparar proteína KCNQ2 para los usos descritos a continuación.

No todos los vectores de expresión y secuencias reguladoras de DNA funcionarán igual de bien al expresar las secuencias de DNA de la presente invención, ni tampoco funcionarán igual de bien todas las células huésped con el mismo sistema de expresión. Sin embargo, un experto en la técnica puede hacer una selección entre vectores de expresión, secuencias reguladoras de DNA, y células huésped usando la orientación proporcionada aquí sin demasiada experimentación y sin apartarse del alcance de la invención.

Polipéptidos

Esta invención también se refiere a polipéptidos que comprenden todas las secuencias de aminoácidos de una proteína KCNQ2. Los inventores prefieren polipéptidos que comprendan todas las secuencias de aminoácidos que aparecen como en SEQ ID NO:20. Cuando se puede usar una porción de la proteína KCNQ2, la porción exhibe preferiblemente actividad del canal de K^{+} o puede modularse para exhibir actividad del canal de K^{+}. Por ejemplo, y dentro del alcance de la presente invención, hay polipéptidos que comprenden todas las KCNQ2 que puedan contener una o más o mutaciones para que la proteína no llegue a exhibir actividad del canal de K^{+}, pero que pueda usarse para seleccionar compuestos que activarán la proteína o una porción de la misma.

Los expertos en la técnica pueden preparar estos polipéptidos mediante procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede usar síntesis química, tal como el procedimiento de fase sólida descrito por Houghton et al. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5131-5135. Otro procedimiento es la traducción in vitro de mRNA. También se pueden producir los polipéptidos en las células huésped descritas anteriormente, que es el procedimiento preferido. Por ejemplo, se puede sintetizar DNA que comprenda toda o una parte de SEQ ID NO:19 mediante PCR como se describe anteriormente, insertar el DNA sintetizado en un vector de expresión, transformar una célula huésped con el vector de expresión, y cultivar la célula huésped para producir los polipéptidos deseados.

Los expertos en la técnica pueden aislar y purificar tales polipéptidos mediante cualquiera de varias técnicas conocidas; por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel y cromatografía de afinidad. Tales técnicas pueden requerir la modificación de la proteína. Por ejemplo, se puede añadir un marcador de histidina a la proteína para posibilitar la purificación sobre una columna de níquel.

Los expertos en la técnica pueden usar los polipéptidos de la invención en una amplia variedad de formas. Por ejemplo, se pueden usar para generar anticuerpos policlonales o monoclonales. Después se pueden usar tales anticuerpos para la inmunodetección (por ejemplo, radioinmunoensayo, inmunoensayo enzimático, o inmunocitoquímica), inmunopurificación (por ejemplo, cromatografía de afinidad) de polipéptidos de varias fuentes, o inmunoterapia (es decir, para inhibición o activación del canal de potasio).

Los expertos en la técnica pueden fabricar polipéptidos de KCNQ2 modificados mediante técnicas conocidas. Tales modificaciones pueden provocar una mayor o menor actividad, permitir la producción de niveles mayores de proteína, o simplificar la purificación de la proteína. Tales modificaciones pueden ayudar a identificar aminoácidos de KCNQ2 específicos implicados en la unión, que a su vez pueden ayudar al diseño consecuente de fármacos del modulador de KCNQ2. Se pueden hacer sustituciones de aminoácidos basadas en la similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza antipática de los restos implicados. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; los aminoácidos con grupos de cabeza polar no cargados o grupos de cabeza no polares que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen los siguientes: leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina; asparagina, glutamina; serina, treonina; fenilalanina, tirosina. Tales polipéptidos modificados están todos incluidos dentro del alcance de la invención.

Los inventores contemplan un número de otras variaciones de los polipéptidos anteriormente descritos. Tales variaciones incluyen sales y ésteres de los polipéptidos, así como precursores de los polipéptidos anteriormente mencionados (por ejemplo, que tienen sustituyentes N-terminales tales como metionina, N-formilmetionina y secuencias conductoras). La invención incluye tales variaciones.

Procedimiento para detectar ácidos nucleicos

La presente invención también se refiere a un procedimiento para detectar ácidos nucleicos que codifican una proteína KCNQ2. En este procedimiento, un experto en la técnica (a) pone en contacto ácidos nucleicos de secuencia desconocida con un ácido nucleico que tiene una secuencia complementaria con una secuencia codificadora conocida (por ejemplo, una secuencia de al menos aproximadamente 10 nucleótidos de SEQ ID NO:19, particularmente las regiones codificadoras de las mismas), en el que el último ácido nucleico tiene un marcador detectable; y (b) determina la presencia de marcador ligado a cualquiera de los ácidos nucleicos de secuencia desconocida. La presencia de marcador ligado indica la presencia de los ácidos nucleicos deseados. Se puede aplicar este procedimiento para detectar ácidos nucleicos de KCNQ2 de otros tejidos (que pueden tener elementos reguladores distintos) y ácidos nucleicos de otras especies (por ejemplo, mono).

Los expertos en la técnica generalmente saben cómo obtener ácidos nucleicos para analizar con este procedimiento. Para DNA genómico, se puede congelar rápidamente tejido, triturar el tejido en trozos fácilmente digeribles, e incubar el tejido triturado en proteinasa K y SDS para degradar la mayoría de las proteínas celulares. Después se puede desproteinizar el DNA genómico mediante extracciones sucesivas en fenol/cloroformo/alcohol isoamílico, la recuperación del DNA mediante precipitación en etanol, secarlo y resuspenderlo en tampón. Para RNA, se pueden lisar células cultivadas en solución de guanidina 4M, extraer el lisado mediante una aguja de calibre 20, sedimentar el RNA a través de
un gradiente en etapas de cloruro de cesio, y eliminar el sobrenadante. El sedimento debería contener RNA purificado.

El marcador detectable puede ser un ión radioactivo unido a uno de los nucleótidos del ácido nucleico complementario. Los marcadores radiactivos habituales son ^{32}P y ^{35}S, aunque también se pueden usar otros marcadores tales como biotina. Los expertos en la técnica conocen diversos procedimientos para fijar los marcadores al ácido nucleico complementario (por ejemplo, el procedimiento del cebador aleatorio para la unión de ^{32}P o ^{35}S).

Los expertos en la técnica generalmente saben como llevar a cabo tal procedimiento para detectar ácidos nucleicos. Por ejemplo, se puede realizar una transferencia Southern o Northern usando una sonda radiomarcada de oligonucleótido complementario con KCNQ. Después se puede detectar la hibridación mediante autorradiografía. Dependiendo del marcador, también se pueden usar otros procedimientos de detección (por ejemplo, espectrofotometría).

Procedimientos para detectar moduladores de la proteína KCNQ2/KCNQ3

Esta invención también se refiere a procedimientos para detectar moduladores de la proteína KCNQ2 de la presente invención. Una selección de moduladores de la proteína KCNQ conlleva detectar la unión de moléculas (por ejemplo, polipéptidos, productos naturales, compuestos sintéticos) en células que expresan la proteína KCNQ2.

La clonación y secuenciación de la proteína KCNQ2 posibilita la construcción de células útiles para seleccionar productos naturales y compuestos sintéticos que se unen y/o modulan la actividad de la proteína KCNQ2. Un proceso para detectar moduladores de la proteína KCNQ2 requiere transformar un vector adecuado en células huésped compatibles como se describió aquí previamente. Se tratan tales células transformadas con sustancias de ensayo (por ejemplo, compuestos sintéticos o productos naturales), y después se mide la actividad en presencia y en ausencia de la sustancia de ensayo.

Terapia génica

Los expertos en la técnica también pueden usar moléculas de ácidos nucleicos sentido y antisentido como agentes terapéuticos para indicaciones relacionadas con KCNQ2. Se pueden construir vectores que dirijan la síntesis del DNA o RNA deseado o formular el ácido nucleico como se describe en la técnica.

Diversas referencias describen la utilidad de la molécula antisentido. Ver Toulme y Helene (1988), Gene, 72: 51-58; Inouye (1988), Gene, 72: 25-34; Uhlmann y Peyman (1990), Chemical Reviews, 90: 543-584; Biotechnology Newswatch (15 de Enero, 1996), p. 4; Robertson, Nature Biotechnology 15: 209 (1997); Gibbons y Dzau (1996), Science 272: 689-693. Se pueden diseñar en base a DNA y/o cDNA genómico, regiones control flanqueantes 5’ y 3’, otras secuencias flanqueantes, secuencias de intrones, y secuencias de aporeamiento de bases de Watson y Crick no clásicas usadas en la formación de DNA tríplex. Tales moléculas antisentido incluyen oligorribonucleótidos antisentido y pueden comprender al menos aproximadamente de 15 a 25 bases.

Las moléculas antisentido se pueden unir no covalente o covalentemente al DNA o RNA de KCNQ. Tal unión podría, por ejemplo, romper o facilitar la ruptura del DNA o RNA de KCNQ, aumentar la degradación de mRNA nuclear o citoplásmico, o inhibir la transcripción, traducción, la unión de factores de transactivación, o el ensamblaje o procesado de pre-mRNA. Las moléculas antisentido pueden contener además funcionalidades adicionales que aumenten la estabilidad, el transporte dentro y fuera de células, la afinidad de unión, la ruptura de la molécula diana, y similares. Todos estos efectos disminuirían la expresión de proteína KCNQ2 y por tanto convierten a las moléculas antisentido en útiles como moduladores de la proteína KCNQ2.

Descripción detallada de KCNQ2 y KCNQ3 humanas Propiedades genéticas

Los marcadores de secuencia expresados (ESTs) relacionados con la KCNQ1 (KCNQ2/KCNQ3) se descubrieron mediante una exploración BLAST GCG de la base de datos GenBank con la secuencia de KCNQ1. Se usaron cebadores, derivados de las secuencias consenso de clones de EST, para amplificar cDNA derivado del cerebro humano y se aislaron fragmentos de 877 pb y 325 pb para la KCNQ2 y KCNQ3, respectivamente. (Figura 1, sonda I). Para obtener secuencias de cDNA de longitud completa de ambos genes, se empleó PCR 5’RACE, selección de bancos de cDNA, y técnicas de Cazador de Genes. Los cDNA compuestos de longitud completa de KCNQ2 (SEQ ID NO:19) y KCNQ3 (SEQ ID NO:26) contienen un marco de lectura abierto (ORF) que codifica un polipéptido de 871 (SEQ ID NO:20) y 854 (SEQ ID NO:27) aminoácidos, respectivamente (Figura 2 y Figura 23). El análisis de la secuencia del DNA y la traducción conceptual de ambos cDNA revela que codifican proteínas con las características estructurales de un canal de potasio de apertura por voltaje y están más estrechamente relacionadas con la KCNQ1. Sanguinetti et al. (1996), Nature 384: 80-83; Yang et al. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4017-4021. La KCNQ2 exhibe un elevado grado de similitud de secuencia con la KCNQ3 (casi 70%), indicando que pertenecen a la misma subfamilia. Ambas proteínas tienen un dominio C-terminal más largo (aproximadsamente 200 aminoácidos) que la KCNQ1. El codón de inicio para la KCNQ2 está flanqueado por un sitio consenso de unión a ribosoma (es decir, Kozak) ACCATGG (Figura 2).

En el nivel de aminoácidos, el análisis de secuencia revela que la KCNQ2/KvLR1 contiene la "secuencia firma" de poro del canal de potasio GYG (es decir, Gly-Tyr-Gly) y, por lo tanto, es probable que codifique un canal selectivo de potasio. Una comparación de KCNQ2 y KCNQ1 (KvLQT1) revela que la coincidencia de la secuencia de aminoácidos es aproximadamente del 60% en las regiones transmembrana y del poro (Figura 3). La KCNQ3 exhibe aproximadamente el mismo grado de coincidencia (aproximadamente el 56%) con KCNQ1 que la KCNQ2 en las regiones transmembrana y del poro (Figura 4). La coincidencia en el dominio amino-terminal y carboxi-terminal es mucho menor comparada con las regiones centrales conservadas (Figura 3). Tales hallazgos sugieren que la KCNQ2/KvLR1 y la KCNQ3/KvLR2 son miembros adicionales de la familia de canales iónicos KCNQ1/KvLQT1.

Las transcripciones específicas de KCNQ2 y KCNQ3 solamente son detectables en el cerebro humano (Figura 5). Este patrón de expresión es distinto de KCNQ1/KvLQT1, que se expresa fuertemente en el corazón y páncreas humano como se reveló mediante análisis de la transferencia Northern. Sanguinetti et al. (1996) Nature 384: 80-83; Yang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4017-4021. La expresión de KCNQ2/KvLR1 es elevada en el hipocampo, núcleo caudado, y amígdala; moderada en el tálamo; y débil en el núcleo subtalámico, sustancia negra y cuerpo calloso (Figura 5). Una transferencia Northern diferente demuestra que la expresión de KCNQ2/KvLR1 humana es elevada en la corteza cerebral; es moderada en el putamen, lóbulo temporal, lóbulo frontal, polo occipital y cerebelo; y es baja en el bulbo raquídeo y médula espinal (Figura 5). La KCNQ3 exhibe un patrón de expresión casi idéntico en el cerebro (Figura 5). Para caracterizar más a fondo los tipos celulares que expresan KCNQ2/KvLR1, se aisló un fragmento de cDNA de KCNQ2/KvLR1 específico murino y se usó como sonda de hibridación in situ. El resultado muestra que la KCNQ2/KvLR1 se expresa en el hipocampo y gyrus dentado del ratón, áreas que son importantes en el aprendizaje y memoria.

Propiedades electrofisiológicas

Se subclonaron los cDNAs de KCNQ2 y KCNQ3 humanas de longitud completa en un vector de expresión de Xenopus y se generó cRNA mediante transcripción in vitro. Se investigaron las propiedades de los canales codificados por la KCNQ2 y KCNQ3 humanas expresando el cRNA transcrito en oocitos de Xenopus. La Figura 6 compara corrientes registradas de oocitos a los que 5 días antes se les inyectó agua (Figura 6A) o 14 ng de cRNA de KCNQ2/KvLR1 humana (Figura 6B).

Los oocitos inyectados con cRNA de KCNQ2/KvLR1 humana exhibieron corrientes salientes que se activaron a potenciales positivos de hasta -60 mV y tuvieron una amplitud máxima de 1 \muA a +40 mV. Nunca se observaron corrientes similares en oocitos control inyectados con agua, y las pequeñas fugas o corrientes endógenas registradas en oocitos control nunca superaron los 0,15 mA a +40 mV. Las corrientes de KCNQ2/KvLR1 humana mostraron un fenotipo de corriente rectificadora retardada que se activa rápidamente muy similar a la corriente de hKCNQ1/KvLQT1. Barhanin et al. (1996) Nature 384: 78-80; Sanguinetti et al. (1996) Nature 384: 80-83; Yang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4017-4021. La corriente de KCNQ2/KvLR1 se rectificó débilmente a voltajes positivos.

Aunque las corrientes macroscópicas de KCNQ2/KvLR1 y KCNQ1/KvLQT1 son similares, las corrientes de cola de KCNQ2/KvLR1 carecen del "gancho" observado con la corriente de cola de KCNQ1/KvLQT1. La Figura 6C muestra la relación máxima de corriente-voltaje (IV) para oocitos que expresan la KCNQ2/KvLR1 (n=12). Se examinó la selectividad del K^{+} de la corriente expresada mediante la investigación de los potenciales de inversión de la corriente de cola en soluciones de baño que contenían 2, 10, 40 y 98 mM de K^{+}. Los potenciales de inversión siguieron de cerca al potencial de Nernst para K^{+} revelando un canal selectivo de K^{+} (n=6; Figura 6D). El potencial de inversión para la corriente de KCNQ2/KvLR1 se desplazó en 52 mV por cada cambio de 10 veces en el K^{+} externo. La línea discontinua tiene una pendiente predicha a partir de la ecuación de Nernst para un canal de K^{+} perfectamente selectivo.

En la Figura 18A se muestra una familia de corrientes provocadas por pasos de voltaje despolarizadores en un oocito inyectado con cRNA de KCNQ3. Las corrientes se activan a potenciales positivos hasta -70 mV y se rectifican interiormente a potenciales mayores de 0 mV, como resulta obvio a partir de la relación IV (Figura 18B). El potencial de inversión de KCNQ3 se desplazó en 49 mV por cada cambio de 10 veces en el K^{+} externo (Figura 18C). Por lo tanto, aunque todavía sea predominantemente selectivo para K^{+}, KCNQ3 es ligeramente menos selectivo para K^{+} que KCNQ2.

La co-expresión de KCNE1 (la KCNE1 también se conoce como "visón" o "Isk") con KCNQ1/KvLQT1 altera de manera espectacular la amplitud y cinética de apertura de la corriente de KCNQ1/KvLQT1. Barhanin et al. (1996) Nature 384: 78-80; Sanguinetti et al. (1996) Nature 384: 80-83; Yang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4017-4021. El visón es un polipéptido pensado para codificar o regular un canal de K^{+}. Folander et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2975-2979; Varnum et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8768-8771. Estos estudios sugieren que el visón y la KCNQ1/KvLQT1 se coensamblan para formar el canal de K^{+} que subyace a la corriente lenta retardada de rectificación en el corazón. Se ensayó una asociación similar entre el visón y la KCNQ2/KvLR1. La coexpresión de KCNE1 con KCNQ2/KvLR1 tuvo poco efecto sobre la corriente de KCNQ2/KvLR1 en oocitos, y podrían definirse corrientes distintas llevadas a cabo por canales KCNQ1/KvLQT1 y KCNQ2/KvLR1 en oocitos co-inyectados con visón y KCNQ2/KvLR1 usando inhibidores selectivos para cada uno de los canales. Por tanto, la KCNQ2/KvLR1 interactúa de manera distinta con la KCNE1 a como lo hace con la KCNQ1/KvLQT1. Distintos miembros de KCNQ pueden interaccionar funcionalmente con proteínas estructuralmente similares a la KCNE1.

Propiedades farmacológicas

Se usaron inhibidores de diversos canales de potasio presentes en el cerebro y otros tejidos para investigar la farmacología de KCNQ2/KvLR1. En la Figura 7 se muestran los efectos de la 4-aminopiridina 0,2 mM (4-AP), E-4031 10 \muM, clofilium 10 \muM, caribdotoxina 0,1 mM, y tetraetilamonio 1 mM (TEA) sobre corrientes de KCNQ2/KvLR1 registradas a partir de un único oocito. Cada uno de estos compuestos se ensayó solo también en oocitos individuales y los efectos de cada agente no fueron distintos.

La caribdotoxina es una proteína del veneno de escorpión que inhibe una diversidad de canales de K^{+} dependientes de voltaje y activados por Ca^{2+}. Miller et al. (1985), Nature 313: 316-318; Sugg et al. (1990), J. Biol. Chem. 265: 18745-18748. La caribdotoxina no inhibió la corriente de KCNQ2/KvLR1 a la concentración ensayada. Esta toxina tampoco tuvo efecto sobre la KCNQ1/KvLQT1.

E-4031 (10 mM) es un inhibidor selectivo de I_{Kr}. Sanguinetti et al. (1990) J. Gen. Physiol. 96: 195-215). 4-AP (0,2 mM) es un inhibidor de los canales de K^{+} de tipo Shaker. Deal et al. (1996) Physiol. Rev. 76: 49-67. Ni el E-4031 ni el 4-AP produjeron efectos significativos sobre la corriente de KCNQ2/KvLR1. De forma similar, ninguno de los dos reactivos inhibe las corrientes de KCNQ1/KvLQT1. Yang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4017-4021.

El TEA es un inhibidor débil de KCNQ1/KvLQT1 mientras que el clofilium es un inhibidor fuerte de KCNQ1/
KvLQT1. Yang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:. El clofilium también inhibe el I_{Kr} e I_{Ks} cardíacos. Arena et al. (1988), Molecular Pharmacology 34: 60-66; Colatsky et al. (1990), Circulation 82: 2235-2242. Para la KCNQ2/KvLR1, por contraste, el clofilium tuvo poco efecto mientras que el TEA inhibió la corriente en alrededor del 85% a una concentración de 1 mM.

La farmacología de KCNQ3 fue significativamente distinta de la de KCNQ2 (Figura 18D). El clofilium (10 \muM) redujo la corriente de KCNQ3 en un 30% respecto al control pero tuvo poco efecto sobre la KCNQ2. El TEA, que inhibió fuertemente la KCNQ2 a 1 mM, produjo poca inhibición de KCNQ3 a 5 mM. CTX (100 nM), 4-AP (2 mM) y E-4031 (10 \muM) tampoco tuvieron efecto sobre la corriente de KCNQ3.

Como se puede ver a partir de estos resultados, las propiedades farmacológicas de KCNQ3/KvLR2, KCNQ2/
KvLR1 y KCNQ1/KvLTQ1 son bastante distintas.

KCNQ2 y KCNQ3 interactúan funcionalmente

El patrón de expresión de solapamiento de KCNQ2 y KCNQ3 en regiones cerebrales distintas (Figura 5), indujo a ensayar la interacción funcional entre los dos canales. Se muestran las familias de corrientes provocadas por pasos de voltaje despolarizadores en oocitos inyectados con KCNQ2 y KCNQ3 individualmente y juntos de la Figura 19A a la Figura 19C. Las amplitudes de corriente registradas a partir de oocitos que coexpresan los dos canales fueron 15 veces mayores que en oocitos inyectados con cada uno de los canales individualmente. Las amplitudes de corriente máximas a +30 mV para KCNQ2, KCNQ3 y KCNQ2 + KCNQ3 fueron de 0,98\pm0,09 (n=6), 0,98\pm0,06 (n=5) y 14,2\pm0,62 \muM (n=6), respectivamente. Se obtuvieron resultados cuantitativamente similares en 3 series diferentes de oocitos. La relación IV muestra que las corrientes de KCNQ2 + KCNQ3 se activaron a potenciales positivos hasta -60 mV y no se rectificaron, a diferencia de KCNQ2 y particularmente KCNQ3, a voltajes positivos (Figura 19D). El potencial de inversión de las corrientes de cola se desplazó en 57 mV por cada cambio de 10 veces en el K^{+} externo indicando que la combinación KCNQ2 + KCNQ3 es casi perfectamente selectiva para K^{+} (Figura 19E). La corriente de KCNQ2 + KCNQ3 es débilmente sensible a la inhibición por TEA 5 mM y clofilium 10 \muM pero no al CTX 100 nM o al 4-AP 2 mM (Figura 19F). El E-4031 (10 \muM) tampoco inhibió la corriente de KCNQ2 + KCNQ3 (no reflejado). Estos resultados sugieren plenamente que KCNQ2 + KCNQ3 interactúan para formar un canal con propiedades distintas a las de los canales KCNQ2 y KCNQ3 individualmente.

KCNE1 interactúa con los canales KCNQ2 + KCNQ3

La subunidad \beta de KCNE1 altera espectacularmente la amplitud y cinética de apertura del canal KCNQ1. Barhanin et al. (1996) Nature 384: 78-80; Sanguinetti et al. (1996) Nature 384: 80-83; Yang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4017-4021; Romey et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 16713-16716. Como KCNQ2 y KCNQ3 son miembros de la misma subfamilia de canal K^{+}, se ensayó una interacción entre canales KCNE1 y KCNQ2 + KCNQ3. La Figura 20 muestra las corrientes provocadas por pasos de voltaje despolarizadores de 1 seg en oocitos que expresan KCNE1 solamente (Figura 20A), KCNQ2 + KCNQ3 (Figura 20B), y KCNQ2 + KCNQ3 + KCNE1 (Figura 20C). KCNE1 atenuó significativamente la amplitud de corriente de KCNQ2 + KCNQ3 y ralentizó la cinética de apertura. La amplitud de corriente máxima a +30 mV se redujo en un 62\pm6,0% (n=6) en oocitos que coexpresan KCNE1. Se ajustaron las corrientes activadoras a una función bi-exponencial para determinar constantes de activación de duración rápida y lenta. Las constantes de duración rápida y lenta para la activación de la corriente de KCNQ2 + KCNQ3 a +10 mV fueron de 50,1\pm3,4 (n=6) y 239\pm17,5 ms (n=6), respectivamente; éstas se desplazaron a 124,7\pm8,8 (n=5) y 680,7\pm71,4 ms (n=6) cuando se inyectó KCNE1 junto con KCNQ2 + KCNQ3. Se obtuvieron resultados similares en más de 15 oocitos de cada grupo en ésta y en dos series adicionales de oocitos. Las corrientes de KCNE1 están ausentes debido a la duración (1 seg) de los pasos de voltaje usados y la escala a la que se muestran las corrientes. Sin embargo, como se muestra claramente en el recuadro de la Figura 20A, los pasos de voltaje de 5 seg provocaron corrientes de KCNE1 típicas en el mismo oocito. El efecto de KCNE1 sobre la cinética de apertura es similar para los canales KCNQ1 y KCNQ2 + KCNQ3. Por contraste, KCNE1 aumenta la corriente de KCNQ1 pero inhibe la de KCNQ2 + KCNQ3.

Los resultados explican por qué las mutaciones en cualquiera de los dos genes que codifican un canal de K^{+} no ligados producen el mismo fenotipo. Las mutaciones asociadas a BFNC en KCNQ2 o KCNQ3 podrían provocar una profunda reducción de la amplitud de corriente de KCNQ2 + KCNQ3. Un estudio ha demostrado que una mutación que provocaba BFNC que tuvo como resultado una proteína KCNQ2 truncada, no funcional, no produjo una inhibición negativa dominante de canales KCNQ2 de tipo salvaje expresados en oocitos. Biervert et al. (1998), Science 279: 403-406. La presente invención, que demuestra una interacción sinérgica entre KCNQ2 y KCNQ3, puede proporcionar una probable explicación para este hallazgo. Esto es, las mutaciones en KCNQ2 solamente pueden producir efectos negativos dominantes cuando se coexpresa con los canales KCNQ3 de tipo salvaje, y viceversa.

Genética molecular

Los últimos avances en genética molecular han permitido correlacionar los canales de potasio con enfermedades del sistema nervioso. Más recientemente, y como se analiza anteriormente, la BFNC, una clase de epilepsia idiopática generalizada, se asoció recientemente a mutaciones en KCNQ2 y KCNQ3. Bievert et al., supra; Charlier et al., supra; y Singh et al., supra. La identificación y expresión de KCNQ2 humano y KCNQ3 humano permitirá investigar más correlaciones con la BFNC y otras enfermedades humanas potenciales. La presente invención permitirá ahora a los expertos en la técnica identificar moduladores, por ejemplo, activadores, de KCNQ2 y/o KCNQ3. Los moduladores de KCNQ2 y/o KCNQ3 pueden proporcionar la oportunidad para el tratamiento de enfermedades, tales como la BFNC. Además, como los KCNQ2 y KCNQ3 humanos se expresan con gran potencia en áreas asociadas con el aprendizaje y la memoria, los moduladores de KCNQ2 y/o KCNQ3 pueden proporcionar también la oportunidad para el tratamiento farmacológico de la pérdida de memoria asociada con la edad avanzada, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer.

KvLR1 murina

Comenzando con un marcador de secuencia expresada en el cerebro (EST, base de datos de dominio público) similar al gen de KvLQT1, se clonó un gen nuevo del canal de potasio a partir de un banco de cerebro de ratón y se expresó funcionalmente. De la Figura 10A a la Figura 10D se muestra el gen de KCNQ2/KvLR1 murino (SEQ ID NO:22) que codifica una proteína de 722 aminoácidos (SEQ ID NO:23) y de un peso molecular calculado de 80,4 KDa. El análisis de hidropatía (Figura 10E) ilustra que la topología generada por ordenador de la KvLR1 tiene 6 dominios de membrana y un dominio de poro típico de canales de potasio modulados por voltaje.

En la Figura 11 se muestra el alineamiento de aminoácidos del canal KCNQ2/KvLR1 murino con el canal KCNQ1/
KvLQT1 murino. En conjunto, hay un 40% de coincidencia entre los dos canales con un 62,5% de coincidencia dentro de los dominios de membrana y de poro. El análisis filogenético sugiere que el gen de KCNQ2/KvLR1 murino es un miembro de la familia del gen de KCNQ1/KvLQT1 y que se relaciona lejanamente con el gen HERG y otros miembros de la familia modulados por voltaje. Dentro del gen de KCNQ2/KvLR1 murino aparecen secuencias firma de aminoácidos características de canales de potasio modulados por voltaje; se observa un patrón de arginina repetido en el dominio de membrana S4 conocido como sensor de voltaje, y una secuencia GYG en la región del poro. Otros análisis de diversos clones RACE 3’ indica diversidad después del dominio de membrana S6. Hasta la fecha, se han identificado dos exones de ensamblaje alternativos, A (SEQ ID NO:13) y B (SEQ ID NO:14), cuyas secuencias de aminoácidos se muestran en la Figura12. Para determinar la distribución de KCNQ2/KvLR1 en los tejidos, se realizó una transferencia Northern con una sonda del canal KCNQ2/KvLR1 murino que no contenía las regiones del poro ni del sensor de voltaje. Esta secuencia del gen evita la posible reactividad cruzada con otros canales. Los resultados, mostrados en la Figura 13, indican un mensaje de 8,2 Kb muy abundante hallado solamente en el cerebro y no observado en tejidos periféricos. Aunque no es absoluto, unas exposiciones largas de transferencia Northern no indicaron la presencia del mensaje en los tejidos periféricos indicados en la Figura 5.

Para obtener mayor resolución de la localización del mensaje en el cerebro, se realizó una hibridación in situ. Se observa una señal de hibridación positiva con una ribosonda antisentido específica para una región no conservada del gen de KCNQ2/KvLR1 con una amplia distribución a través de gran parte del cerebro de la rata. La sonda de ratón era idéntica al 99% a la secuencia de la rata. No obstante, se observa una señal robusta con una distribución más limitada en las siguientes regiones: corteza piriforme, núcleo supraóptico, amígdala, hipocampo, que incluye las regiones CA1, 2, y 3 y el gyrus dentado, MO5 (núcleo motor del tronco trigémino cerebral), núcleo facial, núcleo hipoglósico, núcleos oliváricos inferiores, núcleos cerebelares profundos, núcleos gigantocelulares, núcleos vestibulares laterales y medios, neuronas motoras de la médula espinal, y neuronas sensoriales del ganglio de la raíz dorsal. También se observan niveles moderados de señal de hibridación en la corteza, septo, estriado, hipotálamo, tálamo, habénula media, sustancia negra compacta, núcleos mamilarios, geniculado lateral y medio, núcleo interfascicular, células granulares y de Purkinje del cerebelo, núcleos parabraquiales, núcleos cocleares dorsales y ventrales, y otros núcleos del tronco cerebral. En la Figura 14 se muestra un fotomontaje de las tres regiones.

Para ensayar la expresión funcional, se preparó cRNA a partir del gen de KCNQ2/KvLR1 murino y se inyectó en oocitos de Xenopus. En un pinzamiento por voltaje de dos electrodos, se generó una familia de corrientes salientes en oocitos (n>20) inyectados con cRNA de KCNQ2/KvLR1 murino. Tras un mínimo de 48 horas, las corrientes son diferentes cualitativa y cuantitativamente de las corrientes nativas generadas con protocolos idénticos en células inyectadas con agua o células control no inyectadas (que representan corrientes de cloruro activadas por Ca^{2+} y otras corrientes nativas) (Figura 15). Las corrientes mediadas por KCNQ2/KvLR1 murino se bloquearon mediante TEA 1 mM. Se obtuvieron corrientes similares a partir de células CHO que expresan de forma estable KCNQ2 murino y se registraron usando técnicas de pinzamiento zonal. Se estimó que las conductancias del canal único eran de 24-30 pS en potasio 140 mM simétrico (Figura 22).

Para determinar si el KCNQ2/KvLR1 murino tiene una farmacología similar a las corrientes I_{ks} e I_{kr} en los miocitos cardíacos, se probó clofilium sobre oocitos que expresan KCNQ2 murino. A 20 \muM, se demostró que el clofilium bloquea parcialmente las corrientes mediadas por KCNQ2 murino. Otras toxinas bloqueadoras específicas del canal K^{+}, que incluyen iberiotoxina, \alpha-dendrotoxina y caribdotoxina, no tuvieron efecto significativo sobre las corrientes mediadas por KCNQ2 murino.

Materiales y procedimientos KCNQ2 humano Clonación molecular y expresión de KCNQ2 humano (KvLR1 humano) y KCNQ3 humano (KvLR2 humano)

Se realizó una PCR de RACE 5’ amplificando bancos de cDNA de cerebro humano o de cerebro fetal o cDNA Maratón-Ready (Clontech) usando promotores derivados de secuencias EST relacionadas con el KvLQT1 (EST yn72g11, yo31c08, ys93a07 (se pueden encontrar las secuencias en la base de datos Genbank)) (Figura 1). Los productos del PCR se purificaron en gel, se subclonaron y se secuenciaron. Se usaron sondas de DNA marcadas con ^{32}P cebadas aleatoriamente que contienen regiones específicas de la secuencia KCNQ2 y KCNQ3 para seleccionar bancos de
cDNA y un análisis de la transferencia Northern usando el protocolo convencional. Por ejemplo, se usó la Sonda I de KCNQ2 (Figura 1) para el análisis de la transferencia Northern; se usó la Sonda II (Figura 1) para seleccionar bancos de cDNA de cerebro humano de acuerdo con protocolos convencionales.

Se realizó el experimento del Cazador de Genes usando el protocolo como se describe en el manual del fabricante (Life Technologies). Los clones de cDNA de KCNQ2 humano y KCNQ3 humano de longitud completa se obtuvieron mediante digestión con enzimas de restricción y acoplamiento de los clones de cDNA superpuestos. Los cDNA de longitud completa se subclonaron en un vector de expresión de Xenopus derivado del plásmido pSP64T. Se sintetizó cRNA con caperuza para microinyección usando el Equipo mMESSAGE mMACHINE (Ambion).

Para la detección de la expresión de KCNQ2 como se muestra en las Figuras 9A y 9B, se realizó un procesado tisular, análisis histológicos y análisis de hibridación in situ fundamentalmente como se describe en Fagan et al. (1996), J. Neurosci. 16 (19): 6208-6218.

Caracterización electrofisiológica y farmacológica de KCNQ2 y KCNQ3

Se desfolicularon oocitos de Xenopus laevis de los estados V y VI con tratamiento de colagenasa y se les inyectó cRNA, como se describe en Yang et al., supra.

Se registraron corrientes a temperatura ambiente usando la técnica de pinzamiento por voltaje de dos microelectrodos (Dagan TEV-200) entre 3 -5 días después de la inyección de cRNA de KCNQ2 (15 ng), KCNQ3 (15 ng), o KCNE1 (2 ng) sólo o en combinación.

Se rellenaron microelectrodos (0,8 a 1,5 M\Omega) con KCl 3 M. La solución de baño contenía (en mM): NaCl 96, KCl 2, CaCl_{2} 0,4-1,8, MgCl_{2} 1-2 y HEPES 5 (pH 7,5). El KCl se varió en algunos experimentos mediante sustitución equimolar con NaCl.

Se evaluó la selectividad del K^{+} determinando la dependencia del potencial de inversión de la corriente de cola sobre la concentración externa de K+. Se provocaron corrientes de cola potenciales de -110 hasta +10 mV después de un paso de voltaje a +20 mV mientras se varió la concentración externa de K+ entre 2, 10, 40, y 98 mM. Se determinó el potencial de inversión de corriente bajo cada condición para cada oocito midiendo el intercepto en cero de un gráfico de la amplitud de corriente de cola frente al potencial de prueba.

Se usó Axoclamp (Axon Instruments) para generar órdenes de pinzamiento por voltaje y adquirir datos y se usó Axograph 3.0 (Axon Instruments) para el análisis de los datos. Todos los datos se muestrearon a velocidades de al menos dos veces la velocidad de paso de filtro baja. Los experimentos se realizaron a 22-25ºC. Se obtuvo clofilium de RBI Biochemicals y se obtuvo 4-aminopiridina (4-AP), TEA y caribdotoxina de Sigma Chemical Co. El E-4031 se sintetizó a partir de información publicada por los Laboratorios de Investigación Esai.

KvLR1 murino Preparación de la sonda y selección del banco

Se identificó un marcador de secuencia exclusivo expresado (EST) de la base de datos pública que tiene similitud con el gen de KvLQT. Se sintetizaron cebadores de oligonucleótidos a partir de la secuencia EST para experimentos. El cebador directo (SEQ ID NO:15) era:

5’-GAG TAT GAG AAG AGC TCG GA-3’

y el cebador inverso (SEQ ID NO:16) era:

5’-CAG ATG TGG CAA AGA CGT TGC-3’.

Se realizó la transcripción inversa de RNA poliA+ de cerebro de rata con hexámeros aleatorios y se amplificó mediante PCR [60 seg a 94ºC, 90 seg a 55ºC, 120 seg a 72ºC, 30 ciclos] con los cebadores anteriores. Se aisló un fragmento de DNA de KCNQ2/KvLR1 de rata de 240 pb mediante electroforesis en gel y se subclonó en pCRII (En Vitrogen). Se marcó el fragmento de DNA de 240 pb con cebador aleatoriamente con dCTP-^{32}P y se usó como sonda para seleccionar un banco del plásmido pcDNA1 de cerebro de ratón (Clontech, Palo Alto, CA). En general, se seleccionaron 2 x 10^{5} colonias usando protocolos convencionales de recogida de filtro. Los filtros se hibridaron durante toda la noche en formamida al 50%, PIPES 2X y SDS al 1% a 42ºC y se lavaron 1x en SSC 1X y después 3x 20 minutos en SSC 0,1x, SDS al 0,1% a 53ºC. Se expusieron los filtros toda la noche a -70ºC. Solamente se identificó una colonia positiva y se volvió a cultivar en placa hasta que quedó purificada. El clon miembro 26,1, designado KvLR1 murino, se secuenció en ambas cadenas mediante reacciones de terminación didesoxi.

Transferencias Northern

Se realizaron transferencias Northern con la transferencia de tejido múltiple de ratón (Clontech) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, se prehibridó la transferencia a 68ºC con solución de ExpressHyb durante 30 minutos. Se aisló un fragmento de DNA de la región codificadora del KvLR1 murino mediante la enzima de restricción PvuII, que eliminó las secuencias consenso del poro y del sensor de voltaje, y se marcó con cebador aleatoriamente con dCTP-^{32}P, se desnaturalizó a 100ºC durante 5 minutos, se congeló sobre hielo y se añadió a ExpressHyb recién preparado antes de la adición a la transferencia Northern. Se incubó la transferencia durante 60 minutos a 68ºC con agitación continua. Se lavó la transferencia 2X a 50ºC en SSC 0,1X y SDS al 0,1%. Se envolvió la transferencia en papel de embalar y se expuso a una película de rayos-X toda la noche a temperatura ambiente. Se usó el mismo protocolo para la sonda de actina proporcionada con la transferencia.

Hibridación in situ

Se fijaron secciones congeladas cortadas a intervalos de 225 \mum a través de todo el cerebro de rata adulta mediante inmersión (sin descongelarse) en formaldehído helado al 10% en PBS durante 20 minutos y se lavó con PBS. Se trataron secciones fijadas de DRG de rata con Triton X-100 al 0,5% en Tris 0,1 M, pH 8,0, y EDTA 0,05 M durante 30 minutos y se lavó durante 3 minutos en Tris 0,1 M, pH 8,0, y EDTA 0,05 M. Después se trató el tejido con TEA 0,1 M, pH 8,0, más anhídrido acético al 0,25% durante 10 minutos a temperatura ambiente, se lavó (3 X) en SSC 2X, se deshidrató mediante una serie de alcoholes, se deslipidó en cloroformo, y se secó al aire.

Se sintetizaron ribosondas usando el Sistema II de Transcripción de Ribosondas Promega con 250 \muCi ^{35}S-UTP y 250 \muCi ^{35}S-CTP en un volumen total de reacción de 10 \mul. Se añadió UTP y CTP no marcados a 25 \muM cada uno y ATP y GTP a 500 \muM cada uno. El plásmido de KCNQ2/KvLR1 murino (nucleótidos 552-1125 subclonados en el pBluescript II) se linealizó con Sac I y se transcribió usando RNA polimerasa T3, y con BamHI y se transcribió usando RNA polimerasa SP6 para generar sondas antisentido y sentido, respectivamente. Se añadió un \mug de plásmido linealizado a cada reacción. Se purificaron las ribosondas mediante extracción en fenol:cloroformo y dos precipitaciones en etanol usando acetato de amonio. Las secciones de tejido seco se hibridaron con 1 X 10^{7} cpm/ml de ribosonda en tampón de hibridación (formamida al 50%, NaCl 0,3 M, Tris 10 mM, EDTA 1 mM, solución de Denhardt 1X, de sulfato dextrano al 10%, 500 \mug/ml de tRNA y DTT 10 mM) toda la noche a 55ºC. La solución de hibridación se eliminó enjuagando 4 veces en SSC 4X, 5 minutos por cada lavado. Las secciones se incubaron en 0,02 mg/ml de RNasa, NaCl 0,5 M, Tris 10 mM, pH 8,0, y EDTA 1 mM durante 30 minutos a 37ºC, después se lavó en SSC 2X, SSC 1X y SSC 0,5X, todos conteniendo DTT 1 mM, durante 10 minutos por lavado a temperatura ambiente. Los tejidos se incubaron en SSC 0,1X, DTT 1 mM durante 30 minutos a 55ºC, luego se lavaron brevemente en SSC 0,1X y DTT 1 mM a temperatura ambiente, se deshidrataron, y se secaron al aire. Las secciones secas se expusieron a película XOMAT (Kodak, Rochester, Nueva York), después se empaparon en emulsión NTB2 (Kodak, Rochester, Nueva York) para determinar la localización celular de cada mRNA).

Expresión y Registro en Oocitos

Se linealizaron los DNA de KCNQ2/KvLR1 murinos con la enzima de restricción NotI y se transcribieron in vitro usando el Equipo mMESSAGE mMACHINE de RNA polimerasa T7 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Ambion, Austin, Texas). Los cRNA se diluyeron en agua libre de RNasa, y se almacenaron a -70ºC a una concentración de 1,0 \mug/\mul. Se prepararon oocitos de rana y se les inyectó usando técnicas convencionales (Colman, 1984). En los experimentos de expresión del KvLR1 murino, a cada oocito se le inyectó aproximadamente 35-40 nl del cRNA. Después de la inyección, los oocitos se mantuvieron a 17ºC en medio ND96 constituido por (en mM): NaCl, 90; KCl, 1,0; CaCl_{2}, 1,0; MgCl_{2}, 10; HEPES, 5,0; pH 7,5. Se añadió suero de caballo y penicilina/estreptomicina, ambas al 5% del volumen final, como suplementos del medio de incubación. El registro electrofisiológico comenzó 2-6 días después de la inyección de cRNA. Antes del inicio de un experimento los oocitos se colocaron en una cámara de registro y se incubaron en Solución de Barth Modificada (MBS) constituida por (en mM): NaCl, 88; NaHCO_{3}, 2,4; KCl, 1,0; HEPES, 10; MgSO_{4}, 0,82; Ca(NO_{3})_{2}, 0,33; CaCl_{2}, 0,41; pH 7,5. Se atravesaron los oocitos con electrodos (1-2 M\Omega) y se emplearon técnicas convencionales de pinzamiento por voltaje de 2 electrodos para registrar las corrientes de la membrana de células completas (Stuhmer, 1992; TEC 200, Dagan Instruments). Los protocolos de pinzamiento por voltaje están constituidos típicamente por una serie de pasos de voltaje de 100-500 ms de duración, en pasos de +10 mV desde un potencial de reposo de -60 mV a -90 mV hasta un potencial máximo de +40 mV a +50 mV; los registros se digitalizaron a 5 KHz y se almacenaron en un ordenador usando el programa informático pClamp 6.0 (Axon Instruments), y se analizaron usando el programa informático ClampFit o AxoGraph (Axon Instruments).

Expresión y Registro en células CHO

Se obtuvieron registros de pinzamiento zonal de células CHO que expresaban de forma temporal o estable canales KCNQ2 murinos. Se prepararon electrodos usando un tirador de pipeta de Sach-Flaming PC-84 (Sutter Instruments) y se pulieron al fuego hasta una resistencia límite final de 3-5 M\Omega. Las pipetas se llenaron con una solución que estaba constituida por (en mM) KCl (140), MOPS (20), K_{2}EGTA (1,0), CaCl_{2} (0,89), pH 7,2. Algunas veces la solución de la pipeta contenía MgCl_{2} (1,0) para ayudar a la formación de sellado. Las células se cultivaron sobre cubreobjetos revestidos de poli-D-lisina, y se dispusieron trozos de los cubreobjetos que contenían células CHO en una cámara sobre un microscopio invertido para el registro. Antes de registrar, y durante la formación del sellado, las células se bañaron en una solución externa constituida por (en mM) NaCl (145), KCl (3), CaCl_{2} (2,5), MgCl_{2} (1,0), HEPES (10), pH 7,4. Los electrodos se bajaron a la superficie de las células bajo inspección visual; después de la formación de gigasellado se extirparon zonas de la membrana, desde el interior hacia el exterior, en una solución interna constituida por (en mM) KCl (140), MOPS (20), K_{2}EGTA (1,0), CaCl_{2} (0,89), pH 7,2. Todos los registros se hicieron bajo condiciones de K^{+} simétricas. Tras la extirpación de zonas se obtuvieron registros de pinzamiento por voltaje del protocolo por pasos y continuos, y se realizaron análisis, usando un amplificador de Pinzamiento Zonal AxoPatch 200B y el programa informático pClamp (Axon Instruments). Los resultados se muestran en la Figura 22.

Aunque la presente invención se ha descrito con cierto detalle por medio de ilustraciones y ejemplos para objetos de claridad y comprensión, resultará evidente que se pueden practicar ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

<110> Blanar, Michael A.

\hskip1cm Dworetzky, Steven

\hskip1cm Gribkoff, Valentin K.

\hskip1cm Levesque, Paul C.

\hskip1cm Little, Wayne A.

\hskip1cm Neubauer, Michael G.

\hskip1cm Yang, Wen-Pin

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<120> CANALES DE POTASIO DE KCNQ Y PROCEDIMIENTOS PARA MODULAR LOS MISMOS

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<130> DC58A

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<140>

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<141>

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<160> 27

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<170> Patent In Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 896

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia de nucleótidos consenso como se representa en las Fig. 16A-16D

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<400> 1

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1

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<210> 2

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<211> 298

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia de aminoácidos consenso como se representa en las Fig. 17A-17B

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<400> 2

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2

3

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<210> 3

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<211> 900

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

4

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<210> 4

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<211> 300

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

5

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<210> 5

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<211> 900

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<212> DNA

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<213> Murino

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<400> 5

6

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<210> 6

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<211> 300

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<212> PRT

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<213> Ratón

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<400> 6

7

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<210> 7

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<211> 735

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<212> DNA

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<213> Rata

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 245

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rata

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 226

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Murino

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

12

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda de PCR basada en la secuencia de KCNQ2/KvLR1 humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggccgaattc tgtttctcag cagctccagc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sonda de PCR basada en la secuencia de KCNQ2/KvLR1 humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgcgaattc gagcagcaca ggcaraarca

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Ser Gln Thr Gln Thr Tyr Gly Ala Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Gly Ser Pro Cys Arg Gly Pro Leu Cys Gly Cys Cys Pro Gly Arg}

\sac{Ser Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador directo de la secuencia EST similar al gen de KvLQT

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagtatgaga agagctcgga

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador inverso de la secuencia EST similar al gen de KvLQT

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagatgtggc aaagacgttg c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 930

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 310

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

14

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3287

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 871

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

17

18

19

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 430

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

22

23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2169

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

24

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 722

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

26

27

28

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 605

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

30

31

32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia firma para un canal de potasio

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2565

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

33

34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 854

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

35

36

37

38

Claims (10)

1. Una molécula de ácido nucleico que comprende:

(a)

polinucleótidos que codifican el polipéptido como se muestra en la Figura 2 (KCNQ2 humano);

(b)

polinucleótidos que comprenden la secuencia de ácido nucleico como se muestra en la Figura 2 (KCNQ2 humano);

(c)

polinucleótidos que están degenerados con respecto a los polinucleótidos de (a) o (b) en el código genético; o

(d)

polinucleótidos que muestran al menos el 80% de coincidencia de secuencia con los polinucleótidos de (a) a (c) y que codifican un polipéptido que tiene actividad de canal de potasio;

o una cadena complementaria de tal polinucleótido.

2. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

3. Una célula huésped procariótica o eucariótica que comprende el vector de la reivindicación 2.

4. Una proteína o polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

5. Un procedimiento de selección de un compuesto que es capaz de modular la actividad de la proteína o polipéptido KCNQ2 como se define en la reivindicación 4, que comprende los pasos de:

(a) proporcionar una célula huésped de la reivindicación 3;

(b) determinar la actividad de dicha proteína KCNQ2 en ausencia de dicho compuesto;

(c) poner la célula en contacto con dicho compuesto; y

(d) determinar la actividad de dicha proteína KCNQ2 en presencia de dicho compuesto,

en el que una diferencia entre la actividad de dicha proteína KCNQ2 en presencia de dicho compuesto y en ausencia de dicho compuesto indica un compuesto modulador.

6. Un anticuerpo específico para la proteína o polipéprtido de la reivindicación 4.

7. El anticuerpo de la reivindicación 6, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

8. Una molécula antisentido constituida por oligorribonucleótidos que se une a la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

9. Una composición farmacéutica que comprende la proteína o polipéptido de la reivindicación 4, la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, el anticuerpo de la reivindicación 6 ó 7, o la molécula antisentido de la reivindicación 8.

10. Uso de un compuesto seleccionado entre el grupo constituido por

(a) una molécula de ácido nucleico que comprende:

(i)

polinucleótidos que codifican el polipéptido o una parte del mismo como se muestra en la Figura 2 (KCNQ2 humano), en el que dicha parte tiene actividad de canal de potasio;

(ii)

polinucleótidos que comprenden toda o una parte de una secuencia de ácido nucleico como se muestra en la Figura 2 (KCNQ2 humano), en el que dicha parte codifica un polipéptido que tiene actividad de canal de potasio;

(iii)

polinucleótidos que están degenerados con respecto a los polinucleótidos de (i) o (ii) en el código genético; o

polinucleótidos que muestran al menos el 80% de coincidencia de secuencia con los polinucleótidos de (i) a (iii) y que codifican un polipéptido que tiene actividad de canal de potasio;

o una cadena complementaria de tal polinucleótido;

(b) un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de (a);

(c) un anticuerpo específico para la proteína de (b); y

(d) una molécula antisentido que se une a la molécula de ácido nucleico de (a),

para la preparación de un producto farmacéutico para el tratamiento de la ataxia, mioquimia, ataques, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, pérdida de memoria asociada al envejecimiento, deficiencias de aprendizaje, enfermedades de neuronas motoras o ictus.