JPH09191882A - ヒト新規ｋ＋チャネル蛋白質をコードするｄｎａおよびその断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、胎児期及び成人の脳において発現
するヒトＫ⁺ チャネル蛋白質をコードする、単離された
遺伝子を提供する。 【解決手段】 本発明の遺伝子は、ヒト神経芽腫細胞由
来のｃＤＮＡライブラリーから、プラークハイブリダイ
ゼーション法により調製され、配列番号２に示す塩基配
列よりなる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒト新規Ｋ⁺ チャネル蛋
白質をコードする遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】神経細胞、筋細胞などの興奮性細胞、血
管内皮細胞などの非興奮性細胞は、いずれも様々な種類
の細胞膜Ｋ⁺ チャネルを所有し、その機能を調節してい
る。Ｋ⁺ チャネルは多種多様であり、１つの細胞が数種
類のＫ⁺ チャネルを発現していることも多い。各チャネ
ルの開閉は膜電位、細胞内セカンドメッセンジャーの挙
動、細胞の代謝変化、ＧＴＰ結合蛋白質、蛋白キナー
ゼ、ホスファターゼ等、様々な機構により複合的に制
御、修飾され、細胞膜Ｋ⁺ コンダクタンスの微妙な変化
は、細胞機能の巧妙な調節に重要な役割を果たしてい
る。１９８７年にショウジョウバエのミュータントであ
るＳｈａｋｅｒから、最初の膜電位依存性Ｋ⁺ チャネル
の遺伝子が単離されて以来（サイエンス ２３７巻 ７
４９頁（１９８７）、サイエンス ２３７巻、 ７７０
頁（１９８７）、Ｃｅｌｌ ５０巻 ４０５頁（１９８
７）、Ｋ⁺ チャネルの分子生物学的研究は爆発的に進め
られてきた。

【０００３】以上のようにＫ⁺ チャネル蛋白質は中枢神
経系および末梢神経系の神経細胞において、重要な働き
をしている。ヒトＫ⁺ チャネル蛋白質をコードする遺伝
子をクローニングし、その構造を明確にすることは脳、
神経系の機能を研究する上で非常に重要である。また、
得られた遺伝子が組織、あるいは癌細胞特異的な発現パ
ターンを示すものであるなら、その遺伝子断片が組織や
細胞を認識する、あるいは癌の診断に有効な遺伝子マー
カーにもなりうる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、胎児
期及び成人の脳において発現するヒトＫ⁺ チャネル蛋白
質をコードする遺伝子を提供することにある。本発明は
さらに、神経芽腫細胞において発現するヒトＫ⁺ チャネ
ル蛋白質を提供する。

【０００５】さらに本発明は、ヒトの神経細胞および神
経芽腫細胞を同定するためのプローブまたはプライマー
として有用なＤＮＡ断片を提供することも目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記事情
に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、ヒト新規Ｋ⁺ チャネル
蛋白質をコードするｃＤＮＡを単離し、その塩基配列を
決定して、そのアミノ酸配列を推定した。その結果、ヒ
ト新規Ｋ⁺ チャネル蛋白質は、後掲の配列表において配
列番号１で表されるアミノ酸配列を有することが判明し
た。

【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。

【０００８】ヒト新規Ｋ⁺ チャネル蛋白質遺伝子 本発明のヒト新規Ｋ⁺ チャネル蛋白質遺伝子は、配列表
の配列番号１で示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配
列において１又は複数のアミノ酸が付加、欠如若しくは
置換されており、且つヒト新規Ｋ⁺ チャネル蛋白質をコ
ードするＤＮＡである。本発明のＤＮＡがヒト新規Ｋ⁺
チャネル蛋白質の生物活性をコードする事実は、後掲の
実施例中の(7) に説明した理由により確認された。

【０００９】本発明により決定されたヒト新規Ｋ⁺ チャ
ネル蛋白質遺伝子をコードする遺伝子の塩基配列は、配
列表の配列番号２にそれがコードする推定アミノ酸配列
とともに示されている。この配列から明らかなように、
このｃＤＮＡは、塩基番号１から１１８２の合計１１８
２塩基対からなる。塩基番号１から３は翻訳開始遺伝暗
号に相当し、塩基番号１１８０から１１８２までは翻訳
停止遺伝暗号に相当する。この塩基番号１１８０ないし
１１８２の＊＊＊はＴＧＡ、ＴＡＡまたはＴＡＧのいず
れでも良い。配列番号１は配列番号２に示す塩基配列か
ら推定されるアミノ酸を示したものである。

【００１０】従って、本発明の遺伝子は下記実施例に記
載されているように、ヒト神経芽腫細胞ｍＲＮＡ由来の
ｃＤＮＡライブラリーから、例えばプラークハイブリダ
イゼーション法を利用して得ることもできるが、本発明
により決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、ヒト神
経芽腫細胞ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリーを鋳型
とするＰＣＲ法により、又はヒト神経芽腫細胞ｍＲＮＡ
を出発物質とするＲＴ−ＰＣＲ法により容易に調製する
こともできる。このように調製したヒト新規Ｋ⁺ チャネ
ル蛋白質 ｃＤＮＡを利用して下記の方法により変異体
を調製することもできる。

【００１１】１つのアミノ酸をコードするコドンは複数
存在するので、コードされるアミノ酸配列が同じであれ
ば、どのような塩基配列のＤＮＡも本発明の範囲に含ま
れる。配列番号２に示される推定アミノ酸配列を抜き出
して示したものが配列番号１に示すアミノ酸配列であ
る。従って、本発明には配列番号１で示されるアミノ酸
配列をコードするいずれのＤＮＡも含まれる。

【００１２】さらに、一般に生理活性を有するぺプチド
のアミノ酸配列が多少変更された場合、すなわち、該ア
ミノ酸配列の中の１又は複数のアミノ酸が置換され、若
しくは欠失し又は１又は複数のアミノ酸が付加された場
合でも該ぺプチドの生理活性が維持される場合があるこ
とは周知の事実である。したがって、配列番号１で示さ
れるアミノ酸配列において、このような修飾が加えら
れ、かつヒト新規Ｋ⁺ チャネル様蛋白質の変異体も本発
明の範囲内である。さらに、当該変異体蛋白質をコード
するＤＮＡも本発明の範囲に含まれる。

【００１３】アミノ酸の付加、欠失又は置換による変異
体は、例えばそれをコードするＤＮＡに、例えば、周知
技術である部位特異的変異誘発（例えばNucleic Acid R
esearch, Vo1.10, No.20, p6487-6500, 1982) を施すこ
とにより実施することができる。本明細書において「１
又は複数のアミノ酸」とは、部位特異的変異誘発法によ
り付加、欠失又は置換できる程度の数のアミノ酸を意味
する。

【００１４】部位特異的変異誘発は、例えば、所望の変
異である特定の不一致の他は変異を受けるべき一本鎖フ
ァージＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライ
マーを用いて次のように行うことができる。すなわち、
プライマーとして上記合成オリゴヌクレオチドを用いて
ファージに相補的な鎖を合成させ、得られた二重鎖ＤＮ
Ａで宿主細菌を形質転換する。形質転換された細菌の培
養物を寒天にプレートし、ファージを含有する単一細胞
からプラークを形成せしめる。そうすると、理論的に
は、５０％の新コロニーが単鎖として変異を有するファ
ージを含有し、残りの５０％が元の配列を有する。得ら
れたプラークを上記所望の変異を有するＤＮＡと完全に
一致するものとはハイブリッド形成するが、もとの鎖を
有する不一致のものとはハイブリッド形成しない温度に
おいて、キナーゼ処理された合成プローブとハイブリッ
ド形成せしめる。次に該プローブとハイブリッド形成す
るプラークを拾い、培養し、ＤＮＡを回収する。

【００１５】なお、酵素のアミノ酸配列に、酵素活性を
喪失せしめない１又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は
挿入の方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他に
も、遺伝子を変異原で処理する方法及び遺伝子を選択的
に開裂し、次に選択されたヌクレオチドを除去、付加、
又は置換し、次いで連結する方法もある。なお、上記し
た本発明のＤＮＡの両端、すなわち翻訳開始暗号および
翻訳停止暗号は、それぞれ任意のＤＮＡ断片と結合する
ことができる。このＤＮＡ断片の塩基配列及びサイズは
重要ではなく、バクテリア等の有する核外遺伝子と連結
するための適当なＤＮＡ断片であればよい。例えば下記
実施例においては翻訳開始暗号は配列番号３で表される
塩基配列を有するＤＮＡ断片と翻訳停止暗号は配列番号
４で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片とそれぞれ結
合されている。

【００１６】変異体は保存的に置換された配列を含んで
いてもよく、これは、特定のアミノ酸残基が類似の物理
化学的特徴を有する残基によって置き換えられていても
よいことを意味している。保存的置換の非限定的な例に
は、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＡｌａ相互の置換の如
き脂肪族基含有アミノ酸残基の間の置換、又はＬｙｓと
Ａｒｇ間の如き極性基含有アミノ酸残基の間の置換が含
まれる。

【００１７】本発明の範囲内に入る塩基配列には、温和
な又は苛酷なストリンジェンシーの条件下で本明細書に
開示したヒト新規Ｋ⁺ チャネル様蛋白質の塩基配列にハ
イブリダイズし、かつ生物学的に活性なヒト新規Ｋ⁺ チ
ャネル様蛋白質をコードする単離されたＤＮＡ及びＲＮ
Ａが含まれる。温和なストリンジェンシーによるハイブ
リダイゼーションの条件は、例えば、Sambrookら, Mole
cular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol.1, p
p. 1. 101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s, (1989)に記載された条件を意味する。Sambrookらに
より定義されているように、温和なストリンジェンシー
の条件には、５×ＳＳＣ，0.５％ＳＤＳ，1.０ｍＭＥＤ
ＴＡ（ｐＨ8.０）の前洗浄用溶液と約５５℃，５×ＳＳ
Ｃ，一晩のハイブリダイゼーション条件の使用が含まれ
る。苛酷なストリンジェンシーの条件には、より高温の
ハイブリダイゼーションと洗浄が含まれる。その際、プ
ローブの長さ等の各種要因に応じて温度及び洗浄溶液の
塩濃度は適宜調節される。

【００１８】ヒト新規Ｋ⁺ チャネル様蛋白質遺伝子の分
化、発生の研究試薬としての使用 ヒト新規Ｋ⁺ チャネル様蛋白質遺伝子のＤＮＡは、ヒト
臓器、細胞における発現パターンの違いを比較するため
に使用することができる。これにより、ヒト臓器、細胞
の分化、発生の研究が促進される。例えば、本発明者ら
は、ノーザン解析の結果からヒト新規Ｋ⁺ チャンネル蛋
白質はヒト肝臓癌細胞株、ヒト子宮頚癌細胞株、ヒト成
人の膵臓、腎臓、骨格筋、肝臓、肺、胎盤、心臓には発
現しておらず、ヒト神経芽腫細胞およびヒト成人の脳だ
けに発現しているという結果を得ている。

【００１９】ヒト新規Ｋ⁺ チャネル様蛋白質遺伝子のプ
ローブとしての使用 本発明は、上記のようにヒト新規Ｋ⁺ チャネル様蛋白質
がヒト神経芽腫細胞、ヒト成人の脳および睾丸にだけ発
現しているという発見に基づき、ヒト新規Ｋ⁺チャネル
様蛋白質遺伝子の配列に特異的にハイブリダイズするＤ
ＮＡ断片を適当な標識で標識して、ヒト神経芽腫細胞お
よびヒト成人の脳の同定を行う技術を提供する。

【００２０】プローブは配列番号２、３または４のいず
れの配列に基づいて設計してもよい。その長さは少なく
とも連続する１５塩基以上であることが好ましいが、１
５塩基以上であれば、各配列番号の全長まであるいは配
列番号３、２および４の合計までのいずれの長さであっ
てもよい。例えばプローブとして使用可能な部分は、配
列番号５に相当する部分である。プローブは一本鎖でも
二本鎖でもよいが少なくとも使用時には一本鎖となる。
さらに、上述したように塩基配列２から選定されたＤＮ
Ａ断片プローブを、ヒト新規Ｋ⁺ チャネル様蛋白質遺伝
子に特異的にハイブリダイズする性質を失わないよう
に、塩基の追加、削除、変更等により修飾した配列も本
発明に含まれる。

【００２１】限定されるわけではないが、プローブは本
明細書に開示された方法により得られた単離されたヒト
新規Ｋ⁺ チャネル様蛋白質遺伝子のｃＤＮＡ断片を、適
当な制限酵素によって切断することにより調製できる。
または、ヒト新規Ｋ⁺ チャネル様蛋白質遺伝子を含む試
料を用いてＰＣＲ反応を行うことによって、プローブを
調製することもできる。あるいは、市販のＤＮＡ合成機
（例えば、パーキンエルマー社製）により慣用された方
法により、プローブとなる一本鎖ＤＮＡを合成すること
もできる。

【００２２】プローブは慣用された方法により、例え
ば、放射性同位元素、検出可能な酵素等により標識でき
る。例えば³²Ｐを用いる場合、一般にヒト新規Ｋ⁺ チャ
ネル様蛋白質遺伝子のｃＤＮＡ断片を使用する場合は、
ランダムプライミングラベルにより標識し、また、合成
プライマーを使用する場合はリン酸化酵素により５'末
端標識すると都合がよい。ヒト新規Ｋ⁺ チャネル様蛋白
質を含むと予想される試料と、上記本発明のプローブと
のハイブリダイゼーションは、慣用された方法により行
うことができる。一般には、中程度のハイブリダイゼー
ション強度（４２℃〜５０℃でハイブリダイゼーション
を行い、０.１×ＳＳＣで洗浄）によって行う。

【００２３】例えば、患者の骨髄液から抽出したｍＲＮ
Ａを電気泳動し、ナイロンメンブレンにトランスファー
したものとプローブとのハイブリダイゼーションがオー
トラジオグラフ等により検出された場合、当該試料は神
経芽腫細胞を含有すると診断される。神経芽腫細胞は小
児の副腎髄質と全身の交感神経節から発生する癌であ
り、骨に転移が起こりやすいのが特徴である。小児癌の
検査は、これまで尿中に含まれる神経芽細胞の検出によ
って行っていたが、尿中に神経芽細胞が排出されない場
合もある。したがって、骨髄液中に神経芽腫細胞が含ま
れるか否かを調べることによって、小児癌発見の精度を
上げることが可能である。

【００２４】ヒト新規Ｋ⁺ チャネル様蛋白質遺伝子のＰ
ＣＲプライマーとしての使用 ヒト新規Ｋ⁺ チャネル様蛋白質遺伝子の配列又はその相
補鎖の一部分とハイブリダイズするＤＮＡ断片は、ＰＣ
Ｒのプライマーとして用いることもできる。このような
ＤＮＡ断片の組をプライマーとしてＰＣＲを行い、試料
中のｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡが増幅されるか否
かを調べることにより、ヒト神経芽腫細胞およびヒト成
人の脳の存在を調べることができる。

【００２５】本発明のプライマーは配列番号２、３また
は４から以下の条件を満たすように２つ選定することが
できる。

【００２６】１）プライマーの長さが１５−３０塩基、
好ましくは、２０−２５塩基であること； ２）プライマーの中のＧ（グアニン）＋Ｃ（シトシン）
の割合が４０−６０％、好ましくは４５−５５％、より
好ましくは約５０％であること； ３）プライマーの配列に含まれるＡ（アデニン）、Ｔ
（チミン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）の分布が
部分的に偏らないこと、例えば、ＧＴが繰り返し分布す
るような領域は特異性が低いと考えられるのでプライマ
ーとして採用できない。

【００２７】４）選定される２つのプライマーに対応す
るヒト新規Ｋ⁺ チャネル様蛋白質遺伝子の塩基配列上の
距離が１００−１０００塩基、好ましくは。１５０−５
００塩基、より好ましくは１５−３００塩基であるこ
と；および ５）各プライマー自身の内部または２つのプライマー間
に相補的な配列部分が存在しないこと。

【００２８】好ましいプライマーの例は、以下の通りで
ある。

【００２９】５’側プライマー： ５’−ＡＧＴＣＧＧ
ＣＣＴＧＧＡＧＡＴＴＣＴＡＣ−３’（配列番号５の塩
基番号６−２５） ３’側プライマー： ５’−ＡＡＣＡＡＣＡＡＡＡＡＧ
ＴＧＧＧＧＴＴＴ−３’（配列番号５の塩基番号１６５
−１８４の相補配列） これらのプライマーは、二つを組にして用いてもよく、
それぞれを他の適当なＤＮＡ断片と組にして用いてもよ
い。さらに、上記の好ましいプライマーをヒトＡＭＹに
特異的にハイブリダイズする性質を失わないように、塩
基の追加、削除、変更等により修飾した配列もＰＣＲプ
ライマーとして使用可能である。

【００３０】プライマーの配列が選定されれば市販のＤ
ＮＡ合成機（例えば、パーキンエルマー社製）により慣
用された方法により、プライマーとなる一本鎖ＤＮＡを
合成できる。プライマーは一本鎖でも二本鎖でもよいが
使用時には一本鎖となる。

【００３１】さらに、上述した選定条件を満たすように
配列番号２、３または４から選択した塩基配列を、ヒト
新規Ｋ⁺ チャネル様蛋白質に特異的にハイブリダイズす
る性質を失わないように、塩基の追加、削除、変更等に
より修飾した配列も本発明の範囲に含まれる。

【００３２】ＰＣＲのＤＮＡ鎖合成反応に用いるポリメ
ラーゼは熱耐性ポリメラーゼ（典型的にはＴａｑポリメ
ラーゼ）を使用するのが好ましい。ＰＣＲ反応用のポリ
メラーゼ、デオキシリボ核酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、反応溶液等は必要であればキット
として市販されている。

【００３３】ＰＣＲ反応は、試料中のｍＲＮＡから調製
されたｃＤＮＡとプライマーとのアニーリング、ポリメ
ラーゼ反応および熱変性の３工程からなる一連の複製反
応を１サイクルとする。必ずしも以下の条件に拘束され
るわけではないが、本発明においては、アニーリングは
３５〜７０℃、好ましくは４５〜５５℃、より好ましく
は約５０℃で、２０秒から２分、好ましくは約１分行
う。ポリメラーゼ反応は、６０〜８０℃、好ましくは７
０〜７５℃で、１〜３分行う。熱変性は９０〜９５℃
で、３０秒〜１分行う。サイクル数は、２５〜３５回と
するのが好ましい。ＰＣＲ反応は、市販のＰＣＲ用自動
機器（例えば、パーキンエルマー社製）を用いて行うこ
とができる。

【００３４】ＰＣＲ反応の結果、例えば、患者の骨髄液
のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡの中にヒト新規Ｋ⁺ チ
ャネル様蛋白質遺伝子が存在する場合、使用した２種類
のプライマーがアニーリングした鋳型ＤＮＡの間の領域
が増幅される。反応後の溶液をアガロースやポリアクリ
ルアミド等の媒体中で電気泳動すると、使用したプライ
マーから予想される長さのバンドを検出することができ
る。このようにしてバンドが検出される場合、試料中に
神経芽腫細胞が存在すると診断される。

【００３５】組換えヒト新規Ｋ⁺ チャネル様蛋白質の製
造 さらに、本発明はヒト新規Ｋ⁺ チャネル様蛋白質 ｃＤ
ＮＡを含む発現ベクター、及びこれら発現ベクターを含
有する宿主細胞をヒト新規Ｋ⁺ チャネル様蛋白質の発現
に適する条件下で培養して、その発現されたヒト新規Ｋ
⁺ チャネル様蛋白質を回収することにより、組換えヒト
新規Ｋ⁺ チャネル様蛋白質を製造する方法も提供する。

【００３６】本発明の組換えヒト新規Ｋ⁺ チャネル様蛋
白質を製造するためには、使用する宿主細胞に応じて選
ばれた発現ベクターに、哺乳動物、微生物、ウィルス、
又は昆虫遺伝子等から誘導された、適当な転写又は翻訳
調節ヌクレオチド配列に連結したヒト新規Ｋ⁺ チャネル
様蛋白質のＤＮＡ配列を挿入する。調節配列の例とし
て、転写プロモーター、オペレーター、又はエンハンサ
ー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、及び転写及び翻訳の
開始及び終結を制御する適切な配列が挙げられる。加え
て、ヒト新規Ｋ⁺ チャネル様蛋白質遺伝子に本来存在し
ない適切なシグナルペプチドをコードする配列を発現ベ
クター内に組み込んでもよい。

【００３７】ヒト新規Ｋ⁺ チャネル様蛋白質の発現に適
する宿主細胞には、原核細胞、酵母又は高等真核細胞が
含まれる。細菌、真菌、酵母、及び哺乳動物細胞宿主で
用いる適切なクローニング及び発現ベクターは、例え
ば、Pouwels ら, Cloning Vectors: A Laboratory Manu
al, Elsevier, New York, (1985)に記載されている。

【００３８】原核生物には、グラム陰性又はグラム陽性
菌、例えば、大腸菌又は枯草菌が含まれる。大腸菌のよ
うな原核細胞内では、ヒト新規Ｋ⁺ チャネル様蛋白質
は、原核細胞内でも組換えポリペプチドの発現を容易に
するためにＮ末端メチオニン残基を含んでもよい。この
Ｎ末端Ｍｅｔは、発現後に組換えヒト新規Ｋ⁺ チャネル
様蛋白質から切り離すことができる。

【００３９】原核宿主細胞内で用いる発現ベクターは、
一般に１又は２以上の表現型選択可能マーカー遺伝子を
含む。表現型選択可能マーカー遺伝子は、例えば、抗生
物質耐性を付与するか又は独立栄養要求性を付与する遺
伝子である。原核宿主細胞に適する発現ベクターの例に
は、ｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の如き市販の
プラスミドまたはそれから誘導されるものが含まれる。
ｐＢＲ３２２は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐
性のための遺伝子を含有するので、形質転換細胞を同定
するのが簡単である。適切なプロモーターおよびヒト新
規Ｋ⁺ チャネル様蛋白質 ＤＮＡ配列が、このｐＢＲ３
２２ベクター内に挿入される。他の市販のベクターに
は、例えば、ｐＫＫ２２３−３（スェーデン、ウプサラ
の Pharmacia Fine Chemicals）及びｐＧＥＭ１（米
国、ウィスコンシン州、マジソンの Promega Biotec）
が含まれる。

【００４０】原核宿主細胞用の発現ベクターに普通に用
いられるプロモーター配列には、β−ラクタマーゼ（ペ
ニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター（Chang ら,N
ature 275:615, 1978；及び Goeddelら, Nature 281:54
4, 1979）等が含まれる。特に有用な原核宿主細胞発現
系は、ファージλＰ_Lプロモーター及びｃＩ８５７ｔｓ
不耐熱性レプレッサー配列を用いる。λＰ_Lプロモータ
ーの誘導体を取り込んでいるアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションから入手できるプラスミドベクタ
ーには、プラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌株ＪＭＢ９（Ａ
ＴＣＣ３７０９２）内に存する）及びｐＰＬｃ２８（大
腸菌ＲＰ１（ＡＴＣＣ５３０８２）内に存する）が含ま
れる。

【００４１】また、ヒト新規Ｋ⁺ チャネル様蛋白質を酵
母宿主細胞内で発現させてもよい。好ましくはサッカロ
ミセス属（例えば、Ｓ．セレビシエ）を用いるが、ピキ
ア (Pichia) 又はクルイベロミセス (Kluyveromyces)の
如き他の酵母の属も用いてもよい。酵母ベクターは、２
μ酵母プラスミドからの複製起点の配列、自律複製配列
（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のため
の配列、転写終結のための配列、及び選択可能なマーカ
ー遺伝子を含有することが多い。酵母α因子リーダー配
列を用いて、ヒト新規Ｋ⁺ チャネル様蛋白質の分泌を行
わせることもできる。酵母宿主からの組換えポリペプチ
ドの分泌を促進するのに適する他のリーダー配列も知ら
れている。酵母を形質転換する方法は、例えば Hinnen
ら, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978に記載
されている。

【００４２】哺乳動物又は昆虫宿主細胞培養系を用い
て、組換えヒト新規Ｋ⁺ チャネル様蛋白質を発現するこ
ともできる。哺乳動物起源の株化細胞系も用いることが
できる。哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写及
び翻訳制御配列は、ウィルスゲノムから得ることができ
る。普通に用いられるプロモーター配列及びエンハンサ
ー配列は、ポリオーマウィルス、アデノウィルス２等か
ら誘導される。ＳＶ４０ウィルスゲノム、例えば、ＳＶ
４０起点、初期及び後期プロモーター、エンハンサー、
スプライス部位、及びポリアデニル化部位から誘導され
るＤＮＡ配列を用いて、哺乳動物宿主細胞内での構造遺
伝子配列の発現のための他の遺伝子要素を与えてもよ
い。哺乳動物宿主細胞内で用いるための発現ベクター
は、例えば Okayama及び Berg（Mol. Cell. Biol. 3:28
0, 1983）の方法で構築することができる。

【００４３】本発明のヒト新規Ｋ⁺ チャネル様蛋白質を
産生する１つの方法は、ヒト新規Ｋ⁺ チャネル様蛋白質
をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターで形質転換
した宿主細胞を、ヒト新規Ｋ⁺ チャネル様蛋白質が発現
する条件下で培養することを含む。次いで、用いた発現
系に応じて、ヒト新規Ｋ⁺ チャネル様蛋白質を培養培地
又は細胞抽出液から回収する。組換えヒト新規Ｋ⁺ チャ
ネル様蛋白質を精製する操作は、用いた宿主細胞の型及
びヒト新規Ｋ⁺ チャネル様蛋白質が培養培地中に分泌さ
れるかどうかといった要因に従って適宜選択する。

【００４４】本発明のヒト新規Ｋ⁺ チャネル様蛋白質
は、ヒトの中枢神経系および神経内分泌系の研究のため
の貴重な試薬になると期待される。さらに、そのような
研究の結果ヒト新規Ｋ⁺ チャネル様蛋白質の作用が明ら
かになれば、ヒト新規Ｋ⁺ チャネル様蛋白質自体、ある
いはそのインヒビターを神経系疾患の治療薬として利用
できるものと期待される。

【００４５】

【実施例】以下、この発明を実施例により説明する。以
下の実施例は、後掲の配列表において配列番号２で表さ
れる塩基配列に、塩基番号１の塩基に配列番号３で表さ
れる配列を有する塩基対が、また塩基番号１１８２の塩
基に配列番号４で表される配列を有する塩基対がそれぞ
れ結合した塩基配列を有するＤＮＡの製造法を説明する
ものである。もっとも、本発明は下記実施例に限定され
るものではないことは明らかである。なお、下記実施例
において、各操作は、特に明示がない限り、マニアテイ
ス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、〔モレキュラー・クローニ
ング・ラボラトリーマニュアル 第２版（１９８９）、
コールド・スプリング・ハーバー〕記載の方法により行
った。また、制限酵素は市販のものを用い、その具体的
な使用法は市販品の指示書に従った。さらに、使用した
神経芽腫細胞ＣＨＰ１３４、ＬＡ−Ｎ−１、ＬＡ−Ｎ−
２、ＬＡ−Ｎ−５、ＭＣ−ＮＢ−１、ＮＢ６９、および
ヒト肝臓癌細胞株ＨｅｐＧ２は、理化学研究所細胞開発
銀行より入手可能であり、ＨｅＬａおよびＩＭＲ３２
は、財団法人がん研究振興財団のＪａｐａｎｅｓｅＣａ
ｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｒｓ
Ｂａｎｋより入手可能である。

【００４６】（１） ヒト神経芽腫細胞ＣＨＰ１３４の
ｍＲＮＡの調製 約１０⁷ 個のヒト神経芽腫細胞ＣＨＰ１３４に、１８ｍ
ｌのＳｏｌｕｔｉｏｎＤ液（４Ｍ グアニジンチオシア
ネート、２５ｍＭ クエン酸ナトリウム、０．５％ サ
ルコシル、０．１Ｍ ２−メルカプトエタノール）を加
え、ラバーポリスマンで細胞をはがし溶解させた後、素
早くホモジナイズした。得られたホモジネートを５０ｍ
ｌの遠心管に移し、２Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４）を
２ｍｌ加え、混和した。次に、水飽和フェノ−ルを２０
ｍｌ加え、混和した。そして最後に、クロロホルムを５
ｍｌ加え混和した後、１５分氷冷した。その後、４℃で
４０００×ｇ、１時間遠心した。遠心後、水層を別の遠
心管に移し、その水層に３２ｍｌのエタノールを加え、
混和した。−２０℃に１時間置くことによりＲＮＡを沈
殿させた。遠心分離により回収したＲＮＡは、８０％エ
タノールで洗浄後、真空乾燥させ、滅菌蒸留水に溶解し
た。次に得られたＲＮＡ水溶液を、以下の手順で処理し
てポリ（Ａ）を有するｍＲＮＡを分離した。すなわち、
滅菌蒸留水に溶解したＲＮＡに、等量の２×ｅｌｕｔｉ
ｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２
ｍＭ ＥＤＴＡ，０．２％ ＳＤＳ）と、宝酒造株式会
社から市販されているＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０溶液
を２倍量加え、攪拌した。攪拌後、６５℃で５分間熱処
理を施し、３分間氷冷した。氷冷後、５Ｍ ＮａＣｌ溶
液を１／１０量加え、３７℃で１０分間放置し、遠心分
離によりｍＲＮＡと結合しているＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄ
Ｔ３０を回収した。回収したＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３
０は、ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％ ＳＤＳ，
０．１Ｍ ＮａＣｌ）により洗浄した。洗浄後、滅菌蒸
留水を加え、６５℃で５分間熱処理を施し、ｍＲＮＡを
溶出した。遠心分離により、溶出したｍＲＮＡを単離
し、エタノール沈殿により回収した。回収したｍＲＮＡ
は、８０％エタノールで洗浄後、真空乾燥させ、滅菌蒸
留水に溶解した。このｍＲＮＡを用いて以下のｃＤＮＡ
合成を行った。

【００４７】（２） ３’ｄｉｅｃｔｅｄ ｃＤＮＡラ
イブラリーの作製 大久保らの方法（Ｄｎａ Ｓｅｑ．２（１９９１）１３
７−１４４）により、上記のヒト神経芽腫細胞ＣＨＰ１
３４のｍＲＮＡを用いて、ｐＵＣ１１９をベクターとす
る３’ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃＤＮＡライブラリーを作製
した。この方法により、ｐＵＣ１１９のＢａｍＨＩサイ
トとＰｓｔ Ｉサイトの間に、ｃＤＮＡの３’末端の配
列が挿入したプラスミドライブラリーを作製した。

【００４８】このライブラリーより無作為に約１３００
クローンのｃＤＮＡ塩基配列を解析した。この解析した
クローンの中から、ヒト神経芽腫細胞ＣＨＰ１３４にお
いて特異的に発現していると考えられるクローンを選択
した。選択に際しては、大阪大学細胞生体工学センター
の松原謙一教授の研究室において作製された（Ｇｅｎｅ
１３５（１９９３）２６５−２７４）遺伝子発現情報
データバンク（Ｂｏｄｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍａ
ｐ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅｓ）を利用した。

【００４９】（３） ヒト細胞株およびヒト各臓器にお
けるＧＳ008740遺伝子の発現の確認 ヒト神経芽腫細胞ＣＨＰ１３４において特異的に発現し
ていると考えられるクローンの１つとして、ＧＳ008740
遺伝子を選択した。ＧＳ008740遺伝子の塩基配列を後掲
の配列表において配列番号５として示す。ノーザン解析
法を利用して、ＧＳ008740遺伝子のヒト細胞株およびヒ
ト各臓器における発現を解析した。ヒト細胞株の解析と
して、ヒト神経芽腫細胞株ＣＨＰ１３４、ＬＡ−Ｎ−
１、ＬＡ−Ｎ−２、ＬＡ−Ｎ−５、ＭＣ−ＮＢ−１、Ｎ
Ｂ６９、ＩＭＲ３２、ヒト肝臓癌細胞株ＨｅｐＧ２、ヒ
ト子宮頚癌細胞株ＨｅＬａ由来の全ＲＮＡ３０μｇをア
ガロースゲルで電気泳動後、トランスファーしたナイロ
ンメンブレンを作製した。そして、ヒト脳、膵臓、腎
臓、骨格筋、肝臓、肺、胎盤、心臓由来のｍＲＮＡ各２
μｇをアガロースゲルで電気泳動後、トランスファーし
たナイロンメンブレン（クローンテック社製）を購入し
て解析に利用した。これらのナイロンメンブレンをハイ
ブリパックに入れ、１０ｍｌのハイブリダイゼーション
緩衝液（５×ＳＳＰＥ、５０％ホルムアミド、５×Ｄｅ
ｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム、
４０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ）を加えて４２℃、１時
間反応させた。

【００５０】プローブの³²Ｐ標識は、ｐＵＣ１１９のＢ
ａｍＨＩサイトとＰｓｔＩサイトの間に挿入されたＧＳ
008740遺伝子のＰＣＲ断片を鋳型として、マルチプライ
マーキット（アマシャム社製）を用いて行った。この³²
Ｐ標識したプローブを上記反応液に加えてさらに１４時
間以上ハイブリダイゼーション反応を行った。その後、
フィルターを０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを含む５
００ｍｌの２×ＳＳＣにより５０℃で２回、２０分間ず
つ洗い、さらに０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを含む
５００ｍｌの０．１×ＳＳＣにより５０℃で２回、２０
分間ずつ洗った。その後、−７０℃でインテンシファイ
スクリーンを用いて２日間オートラジオグラフィーを行
った。結果は図１に示す。なお、上記ＰＣＲにおいて使
用したプライマーの塩基配列は次のとおりである。

【００５１】5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3' 5'-ACCATGATTACGCCAAGCTTG-3' ＧＳ008740遺伝子はヒト肝臓癌細胞株、ヒト子宮頚癌細
胞株、ヒト成人の膵臓、腎臓、骨格筋、肝臓、肺、胎
盤、心臓には発現しておらず、ヒト神経芽腫細胞および
ヒト成人の脳だけに発現していることが分かる。ＧＳ00
8740遺伝子はヒト神経芽腫細胞およびヒト成人の脳の遺
伝子マーカーとして利用することが考えられる。

【００５２】（４） ヒト神経芽腫細胞ＩＭＲ３２のｍ
ＲＮＡの調製 ＧＳ008740遺伝子の全長ｃＤＮＡを得るために、ｃＤＮ
Ａライブラリーを作製した。まず、ヒト神経芽腫細胞Ｉ
ＭＲ３２のｍＲＮＡの調製をおこなった。約１０⁷ 個の
ヒト神経芽腫細胞ＩＭＲ３２に、１８ｍｌのＳｏｌｕｔ
ｉｏｎ Ｄ液（４Ｍ グアニジンチオシアネート、２５
ｍＭ クエン酸ナトリウム、０．５％サルコシル、０．
１Ｍ ２−メルカプトエタノール）を加え、ラバーポリ
スマンで細胞をはがし溶解させた後、素早くホモジナイ
ズした。得られたホモジネートを５０ｍｌの遠心管に移
し、２Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４）を２ｍｌ加え、混
和した。次に、水飽和フェノ−ルを２０ｍｌ加え、混和
した。そして最後に、クロロホルムを５ｍｌ加え混和し
た後、１５分氷冷した。その後、４℃で４０００×ｇ、
１時間遠心した。遠心後、水層を別の遠心管に移し、そ
の水層に３２ｍｌのエタノールを加え、混和した。−２
０℃に１時間置くことによりＲＮＡを沈殿させた。遠心
分離により回収したＲＮＡは、８０％エタノールで洗浄
後、真空乾燥させ、滅菌蒸留水に溶解した。次に得られ
たＲＮＡ水溶液を、以下の手順で処理してポリ（Ａ）を
有するｍＲＮＡを分離した。すなわち、滅菌蒸留水に溶
解したＲＮＡに、等量の２×ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆ
ｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２ｍＭ ＥＤＴ
Ａ，０．２％ ＳＤＳ）と、宝酒造株式会社から市販さ
れているＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０溶液を２倍量加
え、攪拌した。攪拌後、６５℃で５分間熱処理を施し、
３分間氷冷した。氷冷後、５Ｍ ＮａＣｌ溶液を１／１
０量加え、３７℃で１０分間放置し、遠心分離によりｍ
ＲＮＡと結合しているＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０を回
収した。回収したＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０は、ｗａ
ｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％イＳＤＳ，０．１Ｍ
ＮａＣｌ）により洗浄した。洗浄後、滅菌蒸留水を加
え、６５℃で５分間熱処理を施し、ｍＲＮＡを溶出し
た。遠心分離により、溶出したｍＲＮＡを単離し、エタ
ノール沈殿により回収した。回収したｍＲＮＡは、８０
％エタノールで洗浄後、真空乾燥させ、滅菌蒸留水に溶
解した。このｍＲＮＡを用いて以下のｃＤＮＡ合成を行
った。

【００５３】（５） ｃＤＮＡライブラリーの作製 調製したｍＲＮＡからのｃＤＮＡ合成は、ＧＩＢＣＯ
ＢＲＬ社から市販されている逆転写酵素ＳＵＰＥＲ Ｓ
ＣＲＩＰＴ ＩＩを用い、製品に添付されているプロト
コールに従って行った。逆転写酵素により、ｍＲＮＡに
相補的なｃＤＮＡを合成した後、リボヌクレアーゼＨ
で、ＲＮＡ鎖にニックとギャップを入れ、これを大腸菌
ＤＮＡリガーゼを用いて修複合成することにより、ＲＮ
Ａ鎖をｃＤＮＡ鎖に置換した。最後に、Ｔ４ ＤＮＡポ
リメラーゼにより、ｃＤＮＡ鎖の両端を平滑化した。続
いて、アマシャム社から市販されているλＭＯＳＳｌｏ
ｘライブラリーシステムを用いて、ｃＤＮＡライブラリ
ーを作製した。方法は、すべて製品に添付されているプ
ロトコールに従って行った。すなわち、まず、合成ｃＤ
ＮＡの両端にＥｃｏＲＩアダプターを付加し、これと予
めＥｃｏＲＩで切断処理が施されているλＭＯＳＳｌｏ
ｘアームとを連結した。その後、インビトロパッケージ
ングを行い、大腸菌ＥＲ株（製品に付属）に感染させる
ことにより、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。

【００５４】（６） ＧＳ008740遺伝子の全長ｃＤＮＡ
クローンの選抜 上記（５）において調製したｃＤＮＡライブラリーのう
ち、約１０万個のファージ群を大腸菌ＥＲ株に吸収させ
て寒天プレートにまき、３７℃で１２時間培養した。そ
の寒天上にナイロンメンブレンフィルターを置き、１分
間放置してファージをフィルターに吸着させた後、フィ
ルターを寒天から剥がし、変性液（０．５Ｍ ＮａＯ
Ｈ，１．５Ｍ ＮａＣｌ）中で５分間変性処理を行っ
た。ペーパータオル上で十分変性液を除いた後、中和液
（３Ｍ 酢酸ナトリウム ｐＨ５．５）中で５分間中和
反応をし、紫外線照射をおこない、続いて２×ＳＳＣ
（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む１５ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム塩酸緩衝液、ｐＨ７）中で３０分
間洗浄した。このフィルターをハイブリダイゼーション
液（７％ポリエチレングリコール６０００、１０％ドデ
シル硫酸ナトリウム）に浸し、６５℃にて１時間反応さ
せた。

【００５５】プローブの³²Ｐ標識は、上記（３）におい
て調製したＧＳ008740遺伝子のＰＣＲ断片を鋳型とし
て、マルチプライマーキット（アマシャム社製）を用い
て行った。この³²Ｐ標識したプローブを上記反応液に加
えてさらに１４時間以上ハイブリダイゼーション反応を
行った。その後、フィルターを０．１％ドデシル硫酸ナ
トリウムを含む５００ｍｌの２×ＳＳＣにより６５℃で
２回、２０分間ずつ洗い、さらに０．１％ドデシル硫酸
ナトリウムを含む５００ｍｌの０．１×ＳＳＣにより６
５℃で２回、２０分間ずつ洗った。その後、−７０℃で
インテンシファイスクリーンを用いて２日間オートラジ
オグラフィーを行った。

【００５６】プローブとして用いたＧＳ008740遺伝子の
配列を含むｃＤＮＡが挿入されているファージＤＮＡに
は、³²Ｐ標識したＤＮＡプローブが結合する。したがっ
てナイロンメンブレンフィルターに吸着されたファージ
ＤＮＡのプラークに相当する部分はＸ線フィルムに黒点
を生じる。この黒点を生じたプラークのファージを寒天
プレートから単離し、約１．５ｋｂｐの長さのｃＤＮＡ
が挿入されているクローンを得た。

【００５７】得られたファージクローンから大腸菌ＢＭ
株（アマシャム社製品に付属）を用いた方法により、イ
ンサートを含むプラスミドを回収した。この際の詳細な
方法は、すべてアマシャム社のプロトコールに従った。

【００５８】（７） ｃＤＮＡインサートの全塩基配列
の決定 ｃＤＮＡインサートの全塩基配列をダイデオキシターミ
ネーターキット（ＡＢＩ社製）を用いてプライマーウォ
ーキング法により決定した。決定した全塩基配列を後掲
の配列表において配列番号２、３および４として示す。
ここで配列番号３で表される配列は配列番号２で表され
る配列の塩基番号１の塩基に結合しており、配列番号４
で表される配列は配列番号２で表される配列の塩基番号
１１８２の塩基に結合している。クローンｐＨＫＣは、
１４４８塩基対を挿入ＤＮＡとして含み、翻訳開始遺伝
暗号ＡＴＧから翻訳停止遺伝暗号ＴＡＧまでの１１８２
塩基対を連続した最も大きなオープンリーディングフレ
ームとして持っていた。配列番号２で表されるＤＮＡ塩
基配列から誘導されるアミノ酸配列を配列番号１として
配列表に示した。

【００５９】クローンｐＨＫＣに挿入されたＤＮＡ塩基
配列から誘導されるアミノ酸配列は、既知のＫ⁺ チャネ
ルのアミノ酸配列と一部相同性を示した。最も相同性の
高かった領域はＫ⁺ チャネルのＨ５領域（Ｈｙｄｒｏｐ
ｈｏｂｉｃ ｓｅｇｍｅｎｔ５）であり、この領域はＫ
⁺ チャネルの孔（ポア）を形成する部分で、重要な領域
である（Ｎｅｕｒｏｎ ５巻 ７６７頁（１９９０）、
サイエンス ２５１巻 ９３９頁（１９９１）、サイエ
ンス ２５１巻 ９４２頁（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ
３４９巻 ７００頁（１９９１））。このＨ５領域に
はコンセンサス配列と呼ばれるポア形成に影響のある配
列があり（Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，ｖｏｌ．６６，１０
６１−１０６７（１９９４））、クローンｐＨＫＣに挿
入されたＤＮＡ配列から誘導されるアミノ酸配列は、コ
ンセンサス配列を保持しており、またアミノ酸配列は１
００％一致した。また、クローンｐＨＫＣに挿入された
ＤＮＡ塩基配列から誘導されるアミノ酸配列は、Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．ｖｏｌ．１５７，１０５（１９８２）
のＨｙｄｒｏｐｈａｔｈｙ ａｎａｌｙｓｉｓによれ
ば、膜電位依存性Ｋ⁺ チャネルの構造上の特徴であるこ
とが知られている６つの膜貫通部位Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、
Ｓ４、Ｓ５およびＳ６セグメントを持ち、さらにこのＳ
４セグメントは、図２に示すとおり、２０４番目のグル
タミン残基を除けば、正電荷を帯びたアルギニンまたは
リジン残基が３残基おきに存在するＫ⁺ チャネル蛋白質
に特徴的な一次構造をとっている。このような一次構造
は、電位センサーの機能に関与していると考えられてい
る（Ｎａｔｕｒｅ ３４９巻３０５頁（１９９１））。
Ｓ４セグメント内の正電荷を帯びたアミノ酸残基は、チ
ャネル活性化の際に観察されるゲート電流に関与するこ
とも示されている（Ｎａｔｕｒｅ ３５３巻 ７５２頁
（１９９１））。またＳ４セグメントのアミノ酸配列
は、電位依存性Ｋ⁺ チャネルがチャネル構造を形成する
上で重要な核（ｃｏｒｅ）になるとも考えられている
（Ｎａｔｕｒｅ ３４５巻 ６７２頁（１９９１））。
これらのことからクローンｐＨＫＣは新規の膜電位依存
性Ｋ⁺ チャネルをコードする遺伝子であると考えられ
る。

【００６０】

【発明の効果】以上述べたように、この発明によれば、
ヒト新規Ｋ⁺ チャネル蛋白質をコードする遺伝子が提供
された。この遺伝子はヒト脳および神経芽腫細胞の特異
的な遺伝子マーカーとして利用することができる。すな
わち、本発明により、神経芽腫細胞を同定するためのプ
ローブまたはプライマーとして利用可能なＤＮＡ断片が
提供された。

【００６１】

【配列表】

【００６２】配列番号１ 配列の長さ: 393 アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数: 一本鎖 トポロジー: 直線状 配列の種類: タンパク質 配列 Met Val Gln Lys Ser Arg Asn Gly Gly Val Tyr Pro Gly Pro Ser Gly 1 5 10 15 Glu Lys Lys Leu Lys Val Gly Phe Val Gly Leu Asp Pro Gly Ala Pro 20 25 30 Asp Ser Thr Arg Asp Gly Ala Leu Leu Ile Ala Gly Ser Glu Ala Pro 35 40 45 Lys Arg Gly Ser Ile Leu Ser Lys Pro Arg Ala Gly Gly Ala Gly Ala 50 55 60 Gly Lys Pro Pro Lys Arg Asn Ala Phe Tyr Arg Lys Leu Gln Asn Phe 65 70 75 80 Leu Tyr Asn Val Leu Glu Arg Pro Arg Gly Trp Ala Phe Ile Tyr His 85 90 95 Ala Tyr Val Phe Leu Leu Val Phe Ser Cys Leu Val Leu Ser Val Phe 100 105 110 Ser Thr Ile Lys Glu Tyr Glu Lys Ser Ser Glu Gly Ala Leu Tyr Ile 115 120 125 Leu Glu Ile Val Thr Ile Val Val Phe Gly Val Glu Tyr Phe Val Arg 130 135 140 Ile Trp Ala Ala Gly Cys Cys Cys Arg Tyr Arg Gly Trp Arg Gly Arg 145 150 155 160 Leu Lys Phe Ala Arg Lys Pro Phe Cys Val Ile Asp Ile Met Val Leu 165 170 175 Ile Ala Ser Ile Ala Val Leu Ala Ala Gly Ser Gln Gly Asn Val Phe 180 185 190 Ala Thr Ser Ala Leu Arg Ser Leu Arg Phe Leu Gln Ile Leu Arg Met 195 200 205 Ile Arg Met Asp Arg Arg Gly Gly Thr Trp Lys Leu Leu Gly Ser Val 210 215 220 Val Tyr Ala His Ser Lys Glu Leu Val Thr Ala Trp Tyr Ile Gly Phe 225 230 235 240 Leu Cys Leu Ile Leu Ala Ser Phe Leu Val Tyr Leu Ala Glu Lys Gly 245 250 255 Glu Asn Asp His Phe Asp Thr Tyr Ala Asp Ala Leu Trp Trp Gly Leu 260 265 270 Ile Thr Leu Thr Thr Ile Gly Tyr Gly Asp Lys Tyr Pro Gln Thr Trp 275 280 285 Asn Gly Arg Leu Leu Ala Ala Thr Phe Thr Leu Ile Gly Val Ser Phe 290 295 300 Phe Ala Leu Pro Ala Gly Ile Leu Gly Ser Gly Phe Ala Leu Lys Val 305 310 315 320 Gln Glu Gln His Arg Gln Lys His Phe Glu Lys Arg Arg Asn Pro Ala 325 330 335 Ala Gly Leu Ile Gln Ser Ala Trp Arg Phe Tyr Ala Thr Asn Leu Ser 340 345 350 Arg Thr Asp Leu His Ser Thr Trp Gln Tyr Tyr Glu Arg Thr Val Thr 355 360 365 Val Pro Met Tyr Arg Tyr Arg Arg Arg Ala Pro Ala Thr Lys Gln Leu 370 375 380 Phe His Phe Leu Phe Ser Ile Cys Ser 385 390

【００６３】配列番号２ 配列の長さ: 1182塩基対 配列の型：核酸 鎖の数: 二本鎖 トポロジー: 直線状 配列の種類: cDNA 配列 ATG GTG CAG AAG TCG CGC AAC GGC GGC GTA TAC CCC GGC CCG AGC GGG 48 Met Val Gln Lys Ser Arg Asn Gly Gly Val Tyr Pro Gly Pro Ser Gly 1 5 10 15 GAG AAG AAG CTG AAG GTG GGC TTC GTG GGG CTG GAC CCC GGC GCG CCC 96 Glu Lys Lys Leu Lys Val Gly Phe Val Gly Leu Asp Pro Gly Ala Pro 20 25 30 GAC TCC ACC CGG GAC GGG GCG CTG CTG ATC GCC GGC TCC GAG GCC CCC 144 Asp Ser Thr Arg Asp Gly Ala Leu Leu Ile Ala Gly Ser Glu Ala Pro 35 40 45 AAG CGC GGC AGC ATC CTC AGC AAA CCT CGC GCG GGC GGC GCG GGC GCC 192 Lys Arg Gly Ser Ile Leu Ser Lys Pro Arg Ala Gly Gly Ala Gly Ala 50 55 60 GGG AAG CCC CCC AAG CGC AAC GCC TTC TAC CGC AAG CTG CAG AAT TTC 240 Gly Lys Pro Pro Lys Arg Asn Ala Phe Tyr Arg Lys Leu Gln Asn Phe 65 70 75 80 CTC TAC AAC GTG CTG GAG CGG CCG CGC GGC TGG GCG TTC ATC TAC CAC 288 Leu Tyr Asn Val Leu Glu Arg Pro Arg Gly Trp Ala Phe Ile Tyr His 85 90 95 GCC TAC GTG TTC CTC CTG GTT TTC TCC TGC CTC GTG CTG TCT GTG TTT 336 Ala Tyr Val Phe Leu Leu Val Phe Ser Cys Leu Val Leu Ser Val Phe 100 105 110 TCC ACC ATC AAG GAG TAT GAG AAG AGC TCG GAG GGG GCC CTC TAC ATC 384 Ser Thr Ile Lys Glu Tyr Glu Lys Ser Ser Glu Gly Ala Leu Tyr Ile 115 120 125 CTG GAA ATC GTG ACT ATC GTG GTG TTT GGC GTG GAG TAC TTC GTG CGG 432 Leu Glu Ile Val Thr Ile Val Val Phe Gly Val Glu Tyr Phe Val Arg 130 135 140 ATC TGG GCC GCA GGC TGC TGC TGC CGG TAC CGT GGC TGG AGG GGG CGG 480 Ile Trp Ala Ala Gly Cys Cys Cys Arg Tyr Arg Gly Trp Arg Gly Arg 145 150 155 160 CTC AAG TTT GCC CGG AAA CCG TTC TGT GTG ATT GAC ATC ATG GTG CTC 528 Leu Lys Phe Ala Arg Lys Pro Phe Cys Val Ile Asp Ile Met Val Leu 165 170 175 ATC GCC TCC ATT GCG GTG CTG GCC GCC GGC TCC CAG GGC AAC GTC TTT 576 Ile Ala Ser Ile Ala Val Leu Ala Ala Gly Ser Gln Gly Asn Val Phe 180 185 190 GCC ACA TCT GCG CTC CGG AGC CTG CGC TTC CTG CAG ATT CTG CGG ATG 624 Ala Thr Ser Ala Leu Arg Ser Leu Arg Phe Leu Gln Ile Leu Arg Met 195 200 205 ATC CGC ATG GAC CGG CGG GGA GGC ACC TGG AAG CTG CTG GGC TCT GTG 672 Ile Arg Met Asp Arg Arg Gly Gly Thr Trp Lys Leu Leu Gly Ser Val 210 215 220 GTC TAT GCC CAC AGC AAG GAG CTG GTC ACT GCC TGG TAC ATC GGC TTC 720 Val Tyr Ala His Ser Lys Glu Leu Val Thr Ala Trp Tyr Ile Gly Phe 225 230 235 240 CTT TGT CTC ATC CTG GCC TCG TTC CTG GTG TAC TTG GCA GAG AAG GGG 768 Leu Cys Leu Ile Leu Ala Ser Phe Leu Val Tyr Leu Ala Glu Lys Gly 245 250 255 GAG AAC GAC CAC TTT GAC ACC TAC GCG GAT GCA CTC TGG TGG GGC CTG 816 Glu Asn Asp His Phe Asp Thr Tyr Ala Asp Ala Leu Trp Trp Gly Leu 260 265 270 ATC ACG CTG ACC ACC ATT GGC TAC GGG GAC AAG TAC CCC CAG ACC TGG 864 Ile Thr Leu Thr Thr Ile Gly Tyr Gly Asp Lys Tyr Pro Gln Thr Trp 275 280 285 AAC GGC AGG CTC CTT GCG GCA ACC TTC ACC CTC ATC GGT GTC TCC TTC 912 Asn Gly Arg Leu Leu Ala Ala Thr Phe Thr Leu Ile Gly Val Ser Phe 290 295 300 TTC GCG CTG CCT GCA GGC ATC TTG GGG TCT GGG TTT GCC CTG AAG GTT 960 Phe Ala Leu Pro Ala Gly Ile Leu Gly Ser Gly Phe Ala Leu Lys Val 305 310 315 320 CAG GAG CAG CAC AGG CAG AAG CAC TTT GAG AAG AGG CGG AAC CCG GCA 1008 Gln Glu Gln His Arg Gln Lys His Phe Glu Lys Arg Arg Asn Pro Ala 325 330 335 GCA GGC CTG ATC CAG TCG GCC TGG AGA TTC TAC GCC ACC AAC CTC TCG 1056 Ala Gly Leu Ile Gln Ser Ala Trp Arg Phe Tyr Ala Thr Asn Leu Ser 340 345 350 CGC ACA GAC CTG CAC TCC ACG TGG CAG TAC TAC GAG CGA ACG GTC ACC 1104 Arg Thr Asp Leu His Ser Thr Trp Gln Tyr Tyr Glu Arg Thr Val Thr 355 360 365 GTG CCC ATG TAC AGG TAC CGC CGC CGG GCA CCT GCC ACC AAG CAA CTG 1152 Val Pro Met Tyr Arg Tyr Arg Arg Arg Ala Pro Ala Thr Lys Gln Leu 370 375 380 TTT CAT TTT TTA TTT TCC ATT TGT TCT TAA 1182 Phe His Phe Leu Phe Ser Ile Cys Ser *** 385 390

【００６４】配列番号３ 配列の長さ: 177 塩基対 配列の型：核酸 鎖の数: 二本鎖 トポロジー: 直線状 配列の種類: cDNA 配列 CGCGGAGCGA GGTGGCCGCA GCGTCTCCGC GCGCGGCCCA AGCCCGGCAG GAGTGCGGAA 60 CCGCCGCCTC GGCCATGCGG CTCCCGGCCG GGGGGCCTGG GCTGGGGCCC GCGCCGCCCC 120 CCGCGCTCCG CCCCCGCTGA GCCTGAGCCC GACCCGGGGC GCCTCCCGCC AGGCACC 177

【００６５】配列番号４ 配列の長さ: 89塩基対 配列の型：核酸 鎖の数: 二本鎖 トポロジー: 直線状 配列の種類: cDNA 配列 ACCCCACTTT TTGTTGTTCA TTATTTTGAT TGATTTTTTT TCTTTAAAAT GTATTTTTCA 60 CAAAGGAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAA 89

【００６６】配列番号５ 配列の長さ:255塩基対 配列の型：核酸 鎖の数: 二本鎖 トポロジー: 直線状 配列の種類: cDNA 配列 GATCCAGTCG GCCTGGAGAT TCTACGCCAC CAACCTCTCG CGCACAGACC TGCACTCCAC 60 GTGGCAGTAC TACGAGCGAA CGGTCACCGT GCCCATGTAC AGGTACCGCC GCCGGGCACC 120 TGCCACCAAG CAACTGTTTC ATTTTTTATT TTCCATTTGT TCTTAAACCC CACTTTTTGT 180 TGTTCATTAT TTTGATTGAT TTTTTTTCTT TAAAATGTAT TTTTCACAAA GGAAAAAAAA 240 AAAAAAAAAA AAAAA 255

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ヒト細胞株およびヒト各臓器におけ
るＧＳ008740遺伝子の発現を調べるためのノーザン分析
の結果を示す図である。

【図２】 図２は、本発明の遺伝子がコードする蛋白質
の一次構造が、膜電位依存性Ｋ⁺ チャネルに関与する蛋
白質に特徴的であることを示す図である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成８年４月２４日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ヒト細胞株およびヒト各臓器における
ＧＳ００８７４０遺伝子の発現を調べるためのノーザン
分析の結果を示す電気泳動写真である。

【図２】図２は、本発明の遺伝子がコードする蛋白質の
一次構造が、膜電位依存性Ｋ^＋チャネルに関与する蛋白
質に特徴的であることを示す図である。

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 大久保 公策 大阪府吹田市山田丘１−３ 大阪大学 細 胞生体工学センター内

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に記載するアミノ酸配列を有
   するヒトＫ⁺ チャネル蛋白質、または上記アミノ酸配列
   において１または複数のアミノ酸残基が付加、欠失若し
   くは置換されている蛋白質であって、かつヒトＫ⁺ チャ
   ネル蛋白質の生物活性を有する蛋白質をコードするＤＮ
   Ａ。
2. 【請求項２】 配列番号１に記載するアミノ酸配列を有
   する蛋白質をコードする請求項１記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 配列番号２に記載する塩基配列を有す
   る、請求項２記載のに記載のＤＮＡ。
4. 【請求項４】 配列番号２、３若しくは４に記載する塩
   基配列、またはそれらに相補的な塩基配列中の、少なく
   とも連続する１５塩基の配列を有するＤＮＡ断片よりな
   る、神経芽腫診断用のプローブ。
5. 【請求項５】 配列番号５に記載する塩基配列を有する
   ＤＮＡ断片よりなる、請求項４に記載のプローブ。
6. 【請求項６】 神経芽腫瘍診断のための複製連鎖反応
   （ＰＣＲ）に用いるプライマーであって、配列番号２、
   ３または４に記載されたヒトＫ⁺ チャネル蛋白質の生物
   活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列から
   以下の条件を満たす２つの領域を選択し： １）各領域の長さが１５−３０塩基であること； ２）各領域中のＧ＋Ｃの割合が４０−６０％であるこ
   と； ３）各領域中のＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの分布が部分的に偏らな
   いこと； ４）各領域間の距離が１００−１０００塩基であるこ
   と； ５）各領域自身の中または２つの領域間に相補的な配列
   部分が存在しないこと；そして上記領域と同じ塩基配列
   若しくは上記領域に相補的な塩基配列を有する一本鎖Ｄ
   ＮＡを製造し、さらに必要であれば上記ヒトＫ⁺ チャネ
   ル蛋白質の生物活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
   の塩基配列に対する結合性を失わないように修飾した上
   記一本鎖ＤＮＡを製造することからなる方法によって製
   造された、上記プライマー。
7. 【請求項７】 以下の塩基配列：５’−ＡＧＴＣＧＧＣ
   ＣＴＧＧＡＧＡＴＴＣＴＡＣ−３’（配列番号５の塩基
   番号６−２５）および５’−ＡＡＣＡＡＣＡＡＡＡＡＧ
   ＴＧＧＧＧＴＴＴ−３’（配列番号５の塩基番号１６５
   −１８４の相補配列）を有するＤＮＡ断片の組よりな
   る、請求項６のプライマー。