JPH09191883A - ヒトＮＢＰｈｏｘタンパク質をコードするＤＮＡ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、神経芽腫細胞において特異的に発
現するヒトＮＢＰｈｏｘタンパク質をコードする、単離
されたホメオボックス遺伝子を提供する。 【解決手段】 本発明の遺伝子は、ヒト神経芽腫細胞ｍ
ＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリーからプラークハイブ
リダイゼーション法等により調製でき、配列番号２に示
す配列番号からなる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトＮＢＰｈｏｘ
（neuroblastoma specific paired-like homeobox）を
コードするＤＮＡに関する。

【０００２】

【従来技術】胚発生過程で前後軸が確立し文節構造が形
成されると、各体節が独自の構造を形成するようにな
る。この各体節の特異性決定を司るのがホメオティック
遺伝子である。ホメオティック遺伝子は発生過程で固有
の体節予定領域で発現し、そのタンパク質産物は転写因
子として固有の標的遺伝子群の発現調節を行っている。
ホメオティック遺伝子は、ホメオボックス遺伝子群に属
する一群の遺伝子である。

【０００３】ホメオボックス遺伝子は、ショウジョウバ
エにおいて初めて発見されたが、他の生物においても種
々のものが見いだされている。ホメオボックス遺伝子
は、典型的にはホメオボックスという１８０塩基対から
なる互いに極めて類似したドメインを持っている。この
ドメインはタンパク質産物中ホメオドメインと呼ばれる
３個のアルファヘリックス構造をとり、ＤＮＡへの結合
ドメインとして機能している（Trends Genet. ６巻 ３
２３頁 (1990)）。このホメオボックスを持つ遺伝子、
すなわちホメオボックス遺伝子は脊椎動物においても存
在し、生物の種を越えてＤＮＡ配列が保存されており
（サイエンス２４９巻３７４頁 (1990)）、生物個体の
発生、形態形成にとって最も重要な遺伝子群の一つと考
えられている。最近の遺伝子ターゲティングの手法を用
いて、マウス個体レベルでのホメオボックス遺伝子群の
機能解析が進んでいる。ホメオボックス遺伝子の異常と
ヒトの疫病（奇形、癌等）との関連もクローズアップさ
れてきている（Cell 67巻 767頁 (1991)、Cell 69巻 25
1頁 (1992)、Cell 69巻 719頁 (1992)、Nature Genetic
s 3巻 299頁 (1993)）。

【０００４】ホメオボックス遺伝子の中で、神経特異的
に発現しているホメオボックス遺伝子Ｐｈｏｘ２は、１
９９３年マウスの神経芽腫細胞のｃＤＮＡライブラリー
から単離同定された２８０個のアミノ酸をコードする遺
伝子で、神経系特異的に発現している細胞接着分子 neu
ral cell adhesion molecule（ＮＣＡＭ）遺伝子の転写
を正に制御する転写因子である。成体マウスでのＰｈｏ
ｘ２の発現は、末梢神経では自律神経系の神経節におい
て強く発現し、脳では後脳において発現している。脳の
発生過程におけるＰｈｏｘ２の発現は、（ノル）アドレ
ナリン系神経細胞およびその前駆細胞において強く発現
している（Development 119巻 881頁 (1993)）。この事
からＰｈｏｘ２は、ＮＣＡＭ遺伝子の転写制御のみなら
ず、神経細胞の神経伝達物質に関する表現型への分化を
調節している因子の一員であると考えられている。

【０００５】以上のようにホメオボックス遺伝子は生物
個体の発生、形態形成にとって最も重要な遺伝子群の一
つであり、その中でも神経特異的ホメオボックス遺伝子
は中枢神経系および末梢神経系の神経細胞の分化過程に
おいて重要な働きをしていると考えられる。ヒトの神経
特異的ホメオボックス遺伝子をクローニングし、その構
造を明確にすることは脳、神経系の発生、分化を研究す
るうえで非常に重要である。

【０００６】さらに、得られた遺伝子が組織あるいは癌
細胞特異的な発現パターンを示すものであるなら、その
遺伝子断片が組織や細胞を認識する、あるいは癌の診断
に有効な遺伝子マーカーにもなり得る。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、神経芽腫細
胞において特異的に発現するヒトＮＢＰｈｏｘタンパク
質をコードする、単離されたホメオボックス遺伝子を提
供する。本発明はさらに、神経芽腫細胞において特異的
に発現するヒトＮＢＰｈｏｘタンパク質を提供する。

【０００８】さらに本発明は、ヒト神経芽腫の診断のた
めのプローブまたはプライマーとして有用なＤＮＡ断片
を提供する。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、ホメオボックス遺伝子であるヒトＮＢＰ
ｈｏｘをコードするｃＤＮＡを単離し、その塩基配列を
決定して、そのアミノ酸配列を推定した。その結果、ヒ
トＮＢＰｈｏｘタンパク質は、後述の配列表において配
列番号１で表されるアミノ酸配列を有することが判明し
た。本明細書において、”ＮＢＰｈｏｘ”は、神経系特
異的に発現している細胞接着分子 neural cell adhesio
n molecule（ＮＣＡＭ）遺伝子の転写を制御する転写因
子であって、神経細胞の神経伝達物質に関する表現型へ
の分化を調節する機能をも有するタンパク質を意味す
る。

【００１０】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１１】ＮＢＰｈｏｘ遺伝子 本発明のＮＢＰｈｏｘ遺伝子は、配列表の配列番号１で
示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１又
は複数のアミノ酸が付加、欠如または置換されており、
かつヒトＮＢＰｈｏｘの生物活性を有するタンパク質を
コードするＤＮＡである。本発明のＤＮＡが、ヒトＮＢ
Ｐｈｏｘの生物活性を有するタンパク質をコードする事
実は、配列番号１における９７番目−１５８番目の部分
がＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１１９巻８８１頁 (１９９
３)に報告されているマウスのＰｈｏｘ２のホメオドメ
インと１００％の相同性を有することにより確認され
た。

【００１２】本発明により決定されたヒトＮＢＰｈｏｘ
をコードする遺伝子の塩基配列は、配列番号２にそれが
コードする推定アミノ酸配列とともに示されている。こ
の配列から明らかなように、このｃＤＮＡは塩基番号１
から９４５の合計９４５塩基対からなる。塩基番号１か
ら３は翻訳開始遺伝暗号に相当し、塩基番号９４３から
９４５までは翻訳停止遺伝暗号に相当する。この塩基番
号９４３から９４５の配列（＊＊＊）はＴＧＡ、ＴＡＡ
またはＴＡＧのいずれでもよい。配列番号１は配列番号
２に示す塩基配列から推定されるアミノ酸を示したもの
である。

【００１３】従って、本発明の遺伝子は下記実施例に記
載されているように、ヒト神経芽腫細胞ｍＲＮＡ由来の
ｃＤＮＡライブラリーから、例えばプラークハイブリダ
イゼーション法を利用して得ることもできるが、本発明
により決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、ヒト神
経芽腫細胞ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリーを鋳型
とするＰＣＲ法により、又はヒト神経芽腫細胞ｍＲＮＡ
を出発物質とするＲＴ−ＰＣＲ法により容易に調製する
こともできる。このように調製したヒトＮＢＰｈｏｘ
ｃＤＮＡを利用して後述する方法により変異体を調製す
ることもできる。

【００１４】１つのアミノ酸をコードするコドンは複数
存在するので、コードされるアミノ酸配列が同じであれ
ば、どのような塩基配列のＤＮＡも本発明の範囲に含ま
れる。従って、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコ
ードするいずれのＤＮＡも本発明の範囲に含まれる。

【００１５】さらに、一般に生理活性を有するペプチド
のアミノ酸配列が多少変更された場合、即ち、該アミノ
酸配列の中の１又は複数のアミノ酸が置換され若しくは
欠失し、または１又は複数のアミノ酸が付加された場合
でも該ペプチドの生理活性が維持される場合があること
は周知の事実である。したがって、配列番号１で示され
るアミノ酸配列において、このような修飾が加えられ、
かつヒトＮＢＰｈｏｘの生物活性を有するヒトＮＢＰｈ
ｏｘタンパク質の変異体も本発明の範囲内である。さら
に、当該変異体タンパク質をコードするＤＮＡも本発明
の範囲に含まれる。

【００１６】アミノ酸の付加、欠失または置換による変
異体は、例えばそれをコードするＤＮＡに例えば、周知
技術である部位特異的変異誘発（例えば、Nucleic Acid
Research, Vol.10, No.20, p.6487-6500, 1982）を施
すことにより作成できる。本明細書において「１又は複
数のアミノ酸」とは、部位特異的変異誘発法により付
加、欠失または置換できる程度の数のアミノ酸を意味す
る。

【００１７】部位特異的変異誘発法は、例えば、所望の
変異である特定の不一致の他は、変異を受けるべき一本
鎖ファージＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いて次のように行うことができる。即ち、
プライマーとして上記合成オリゴヌクレオチドを用いて
ファージに相補的な鎖を合成させ、得られた二重鎖ＤＮ
Ａで宿主細胞を形質転換する。形質転換された細菌の培
養物を寒天にプレートし、ファージを含有する単一細胞
からプラークを形成せしめる。そうすると、理論的には
５０％の新コロニーが一本鎖として変異を有するファー
ジを含有し、残りの５０％が元の配列を有する。上記所
望の変異を有するＤＮＡと完全に一致するものとはハイ
ブリダイズするが、元の鎖を有する不一致のものとはハ
イブリダイズしない温度において、得られたプラークを
キナーゼ処理された合成プローブとハイブリダイズさせ
る。次に該プローブとハイブリダイズするプラークを拾
い、培養しＤＮＡを回収する。

【００１８】尚、酵素などの生物活性ペプチドのアミノ
酸配列にその活性を喪失せしめない１又は複数のアミノ
酸の置換、欠失または挿入を施す方法としては、上記の
部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理す
る方法及び遺伝子を選択的に開裂し、次に選択されたヌ
クレオチドを除去、付加または置換し、次いで連結する
方法もある。尚、上記した本発明のＤＮＡの両端、即ち
翻訳開始暗号および翻訳停止暗号は、それぞれ任意のＤ
ＮＡ断片と結合することができる。このＤＮＡ断片の塩
基配列のサイズは重要ではなく、バクテリア等の有する
核外遺伝子と連結するための適当なＤＮＡ断片であれば
よい。例えば下記実施例においては翻訳開始暗号は配列
番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片と翻訳停
止暗号は配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡ
断片とそれぞれ結合されている。

【００１９】変異体は保存的に置換された配列を含んで
いてもよく、これは、特定のアミノ酸残基が類似の物理
化学的特徴を有する残基によって置き換えられていても
よいことを意味している。保存的置換の非限定的な例に
は、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＡｌａ相互の置換の如
き脂肪族基含有アミノ酸残基の間の置換、又はＬｙｓと
Ａｒｇ間の如き極性基含有アミノ酸残基の間の置換が含
まれる。

【００２０】本発明の範囲内に入る塩基配列には、温和
な又は苛酷なストリンジェンシーの条件下で本明細書に
開示したヒトＮＢＰｈｏｘ塩基配列にハイブリダイズ
し、かつ生物学的に活性なヒトＮＢＰｈｏｘをコードす
る単離されたＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。温和なスト
リンジェンシーによるハイブリダイゼーションの条件
は、例えば、Sambrookら, Molecular Cloning: A Labor
atory Manual, 2 ed. Vol.1, pp. 1. 101-104, Cold Sp
ring Harbor Laboratory Press, (1989)に記載された条
件を意味する。Sambrookらにより定義されているよう
に、温和なストリンジェンシーの条件には、５×ＳＳ
Ｃ，0.５％ＳＤＳ，1.０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ8.０）の前
洗浄用溶液と約５５℃，５×ＳＳＣ，一晩のハイブリダ
イゼーション条件の使用が含まれる。苛酷なストリンジ
ェンシーの条件には、より高温のハイブリダイゼーショ
ンと洗浄が含まれる。その際、プローブの長さ等の各種
要因に応じて温度及び洗浄溶液の塩濃度は適宜調節され
る。

【００２１】ヒトＮＢＰｈｏｘ遺伝子の分化・発生の研
究試薬としての使用 本発明のヒトＮＢＰｈｏｘ遺伝子のＤＮＡは、ヒト臓
器、細胞における発現パターンの違いを比較するために
使用することができる。これにより、ヒト臓器、細胞の
分化、発生の研究が促進される。例えば、本発明者らは
ノーザン解析の結果からヒトＮＢＰｈｏｘはヒト肝臓癌
細胞腫株、ヒト子宮頚癌細胞株、ヒト成人の脳、膵臓、
腎臓、骨格筋、肝臓、肺、胎盤、心臓には発現しておら
ず、ヒトの神経芽腫細胞だけに発現しているという結果
を得ている。

【００２２】ヒトＮＢＰｈｏｘ遺伝子のプローブとして
の使用 本発明は、上記のようにヒトＮＢＰｈｏｘがヒトの神経
芽腫細胞にだけ発現しているという発見に基づき、ヒト
ＮＢＰｈｏｘ遺伝子の配列に特異的にハイブリダイズす
るＤＮＡ断片を適当な標識で標識して、ヒト神経芽腫細
胞を同定するためのプローブとして使用し、ヒト神経芽
腫の診断を行う技術を提供する。

【００２３】プローブは、配列番号２、３または４のい
ずれの配列に基づいて設計してもよい。その長さは少な
くとも連続する１５塩基以上であることが好ましいが、
１５塩基以上であれば、各配列番号の全長まであるいは
配列番号３、２および４の合計の全長までのいずれの長
さであってもよい。例えば、プローブとして使用可能な
ものは、配列番号５の配列を有するものである。プロー
ブは一本鎖でも二本鎖でもよいが少なくとも使用時には
一本鎖となる。さらに、上述したように塩基配列２、３
もしくは４から選定されたＤＮＡ断片プローブを、ヒト
ＮＢＰｈｏｘ遺伝子に特異的にハイブリダイズする性質
を失わないように、塩基の追加、削除、変更等により修
飾した配列も本発明に含まれる。

【００２４】限定されるわけではないが、プローブは本
明細書に開示された方法により得られた単離されたＮＢ
Ｐｈｏｘ遺伝子のｃＤＮＡ断片を、適当な制限酵素によ
って切断することにより調製できる。または、ＮＢＰｈ
ｏｘ遺伝子を含む試料を用いてＰＣＲ反応を行うことに
よって、プローブを調製することもできる。あるいは、
市販のＤＮＡ合成機（例えば、パーキンエルマー社製）
により慣用された方法により、プローブとなる一本鎖Ｄ
ＮＡを合成することもできる。

【００２５】プローブは慣用された方法により、例え
ば、放射性同位元素、検出可能な酵素等により標識でき
る。例えば³²Ｐを用いる場合、一般にＮＢＰｈｏｘ遺伝
子のｃＤＮＡ断片を使用する場合は、ランダムプライミ
ングラベルにより標識し、また、合成プライマーを使用
する場合はリン酸化酵素により５'末端標識すると都合
がよい。ＮＢＰｈｏｘを含むと予想される試料と、上記
本発明のプローブとのハイブリダイゼーションは、慣用
された方法により行うことができる。一般には、中程度
のハイブリダイゼーション強度（４２℃〜５０℃でハイ
ブリダイゼーションを行い、０.１ｘＳＳＣで洗浄）に
よって行う。

【００２６】例えば、患者の骨髄液から抽出したｍＲＮ
Ａを電気泳動し、ナイロンメンブレンにトランスファー
したものとプローブとのハイブリダイゼーションがオー
トラジオグラフ等により検出された場合、当該試料は神
経芽腫細胞を含有すると診断される。神経芽腫細胞は小
児の副腎髄質と全身の交感神経節から発生する癌であ
り、骨に転移が起こりやすいのが特徴である。小児癌の
検査は、これまで尿中に含まれる神経芽細胞の検出によ
って行っていたが、尿中に神経芽細胞が排出されない場
合もある。したがって、骨髄液中に神経芽腫細胞が含ま
れるか否かを調べることによって、小児癌発見の精度を
上げることが可能である。

【００２７】ヒトＮＢＰｈｏｘ遺伝子のＰＣＲプライマ
ーとしての使用 ヒトＮＢＰｈｏｘ遺伝子の配列又はその相補鎖の一部分
とハイブリダイズするＤＮＡ断片は、ＰＣＲのプライマ
ーとして用いることもできる。このようなＤＮＡ断片の
組をプライマーとしてＰＣＲを行い、試料中のｍＲＮＡ
から調製されたｃＤＮＡが増幅されるか否かを調べるこ
とにより、ヒト神経芽腫細胞の存在を調べることができ
る。

【００２８】本発明のプライマーは配列番号２、３また
は４から以下の条件を満たすように２つ選定することが
できる。

【００２９】１）プライマーの長さが１５−３０塩基、
好ましくは、２０−２５塩基であること； ２）プライマーの中のＧ（グアニン）＋Ｃ（シトシン）
の割合が４０−６０％、好ましくは４５−５５％、より
好ましくは約５０％であること； ３）プライマーの配列に含まれるＡ（アデニン）、Ｔ
（チミン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）の分布が
部分的に偏らないこと、例えば、ＧＴが繰り返し分布す
るような領域は特異性が低いと考えられるのでプライマ
ーとして採用できない。

【００３０】４）選定される２つのプライマーに対応す
るヒトＮＢＰｈｏｘ遺伝子の塩基配列上の距離が１００
−１０００塩基、好ましくは。１５０−５００塩基、よ
り好ましくは１５−３００塩基であること；および ５）各プライマー自身の内部または２つのプライマー間
に相補的な配列部分が存在しないこと。

【００３１】好ましいプライマーの例は、以下の通りで
ある。

【００３２】５’側プライマー： ５'−ＡＴＴＣＧＣ
ＴＴＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＴＣ−３'(配列番号２の塩基
番号８５４−８７3) ３’側プライマー： ５'−ＣＧＡＧＡＣＡＣＣＣＣＴ
ＧＣＡＡＡＣＧＴ−３'（配列番号４の塩基番号１１１
８−１１３７の相補配列） これらのプライマーは、２つを組にして用いてもよく、
それぞれを別の適当なＤＮＡ断片と組にして用いてもよ
い。さらに、上述の好ましいプライマーをＮＢＰｈｏｘ
に特異的にハイブリダイズする性質を失わないように、
塩基の追加、削除、変更等により修飾した配列もＰＣＲ
プライマーとして使用可能である。

【００３３】プライマーの配列が選定されれば市販のＤ
ＮＡ合成機（例えば、パーキンエルマー社製）により慣
用された方法により、プライマーとなる一本鎖ＤＮＡを
合成できる。プライマーは一本鎖でも二本鎖でもよいが
使用時には一本鎖となる。

【００３４】さらに、上述した選定条件を満たすように
配列番号２、３または４から選択した塩基配列を、ＮＢ
Ｐｈｏｘに特異的にハイブリダイズする性質を失わない
ように、塩基の追加、削除、変更等により修飾した配列
も本発明の範囲に含まれる。

【００３５】ＰＣＲのＤＮＡ鎖合成反応に用いるポリメ
ラーゼは熱耐性ポリメラーゼ（典型的にはＴａｑポリメ
ラーゼ）を使用するのが好ましい。ＰＣＲ反応用のポリ
メラーゼ、デオキシリボ核酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、反応溶液等は必要であればキット
として市販されている。

【００３６】ＰＣＲ反応は、試料中のｍＲＮＡから調製
されたｃＤＮＡとプライマーとのアニーリング、ポリメ
ラーゼ反応および熱変性の３工程からなる一連の複製反
応を１サイクルとする。必ずしも以下の条件に拘束され
るわけではないが、本発明においては、アニーリングは
３５〜７０℃、好ましくは４５〜５５℃、より好ましく
は約５５℃で、２０秒〜２分、好ましくは約１分行う。
ポリメラーゼ反応は、６０〜８０℃、好ましくは７０〜
７５℃で、１〜３分行う。熱変性は９０〜９５℃で、３
０秒〜１分行う。サイクル数は、２５〜３５回とするの
が好ましい。ＰＣＲ反応は、市販のＰＣＲ用自動機器
（例えば、パーキンエルマー社製）を用いて行うことが
できる。

【００３７】ＰＣＲ反応の結果、例えば、患者の骨髄液
のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡの中にＮＢＰｈｏｘ遺
伝子が存在する場合、使用した２種類のプライマーがア
ニーリングした鋳型ＤＮＡの間の領域が増幅される。反
応後の溶液をアガロースやポリアクリルアミド等の媒体
中で電気泳動すると、使用したプライマーから予想され
る長さのバンドを検出することができる。このようにし
てバンドが検出される場合、試料中に神経芽腫細胞が存
在すると診断される。

【００３８】組換えＮＢＰｈｏｘポリペプチドの製造 さらに、本発明はヒトＮＢＰｈｏｘ ｃＤＮＡを含む発
現ベクター、及びこれら発現ベクターを含有する宿主細
胞をＮＢＰｈｏｘの発現に適する条件下で培養して、そ
の発現されたＮＢＰｈｏｘを回収することにより組換え
ＮＢＰｈｏｘポリペプチドを製造する方法も提供する。

【００３９】本発明の組換えＮＢＰｈｏｘポリペプチド
を製造するためには、使用する宿主細胞に応じて選ばれ
た発現ベクターに、哺乳動物、微生物、ウィルス、又は
昆虫遺伝子等から誘導された、適当な転写又は翻訳調節
ヌクレオチド配列に連結したヒトＮＢＰｈｏｘＤＮＡ配
列を挿入する。調節配列の例として、転写プロモータ
ー、オペレーター、又はエンハンサー、ｍＲＮＡリボソ
ーム結合部位、及び転写及び翻訳の開始及び終結を制御
する適切な配列が挙げられる。加えて、ヒトＮＢＰｈｏ
ｘ遺伝子に本来存在しない適切なシグナルペプチドをコ
ードする配列を発現ベクター内に組み込んでもよい。

【００４０】ヒトＮＢＰｈｏｘポリペプチドの発現に適
する宿主細胞には、原核細胞、酵母又は高等真核細胞が
含まれる。細菌、真菌、酵母、及び哺乳動物細胞宿主で
用いる適切なクローニング及び発現ベクターは、例え
ば、Pouwels ら, Cloning Vectors: A Laboratory Manu
al, Elsevier, New York, (1985)に記載されている。

【００４１】原核生物には、グラム陰性又はグラム陽性
菌、例えば、大腸菌又は枯草菌が含まれる。大腸菌のよ
うな原核細胞内では、ＮＢＰｈｏｘポリペプチドは、原
核細胞内でも組換えポリペプチドの発現を容易にするた
めにＮ末端メチオニン残基を含んでもよい。このＮ末端
Ｍｅｔは、発現後に組換えＮＢＰｈｏｘポリペプチドか
ら切り離すことができる。

【００４２】原核宿主細胞内で用いる発現ベクターは、
一般に１又は２以上の表現型選択可能マーカー遺伝子を
含む。表現型選択可能マーカー遺伝子は、例えば、抗生
物質耐性を付与するか又は独立栄養要求性を付与する遺
伝子である。原核宿主細胞に適する発現ベクターの例に
は、ｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の如き市販の
プラスミドまたはそれらから誘導されるものが含まれ
る。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン及びテトラサイクリ
ン耐性のための遺伝子を含有するので、形質転換細胞を
同定するのが簡単である。適切なプロモーターおよびＮ
ＢＰｈｏｘ ＤＮＡ配列が、このｐＢＲ３２２ベクター
内に挿入される。他の市販のベクターには、例えば、ｐ
ＫＫ２２３−３（スェーデン、ウプサラの Pharmacia F
ine Chemicals）及びｐＧＥＭ１（米国、ウィスコンシ
ン州、マジソンの Promega Biotec）が含まれる。

【００４３】原核宿主細胞用の発現ベクターに普通に用
いられるプロモーター配列には、β−ラクタマーゼ（ペ
ニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター（Chang ら,N
ature 275:615, 1978；及び Goeddelら, Nature 281:54
4, 1979）等が含まれる。特に有用な原核宿主細胞発現
系は、ファージλＰ_Lプロモーター及びｃＩ８５７ｔｓ
不耐熱性レプレッサー配列を用いる。λＰ_Lプロモータ
ーの誘導体を取り込んでいるアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションから入手できるプラスミドベクタ
ーには、プラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌株ＪＭＢ９（Ａ
ＴＣＣ３７０９２）内に存する）及びｐＰＬｃ２８（大
腸菌ＲＰ１（ＡＴＣＣ５３０８２）内に存する）が含ま
れる。

【００４４】また、ヒトＮＢＰｈｏｘを酵母宿主細胞内
で発現させてもよい。好ましくはサッカロミセス属（例
えば、Ｓ．セレビシエ）を用いるが、ピキア (Pichia)
又はクルイベロミセス (Kluyveromyces)の如き他の酵母
の属を用いてもよい。酵母ベクターは、２μ酵母プラス
ミドからの複製起点の配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、
プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写
終結のための配列、及び選択可能なマーカー遺伝子を含
有することが多い。酵母α因子リーダー配列を用いて、
ヒトＮＢＰｈｏｘポリペプチドの分泌を行わせることも
できる。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を促
進するのに適する他のリーダー配列も知られている。酵
母を形質転換する方法は、例えば Hinnenら, Proc. Nat
l. Acad.Sci. USA 75:1929, 1978に記載されている。

【００４５】哺乳動物又は昆虫宿主細胞培養系を用い
て、組換えヒトＮＢＰｈｏｘポリペプチドを発現するこ
ともできる。哺乳動物起源の株化細胞系も用いることが
できる。哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写及
び翻訳制御配列は、ウィルスゲノムから得ることができ
る。普通に用いられるプロモーター配列及びエンハンサ
ー配列は、ポリオーマウィルス、アデノウィルス２等か
ら誘導される。ＳＶ４０ウィルスゲノム、例えば、ＳＶ
４０起点、初期及び後期プロモーター、エンハンサー、
スプライス部位、及びポリアデニル化部位から誘導され
るＤＮＡ配列を用いて、哺乳動物宿主細胞内での構造遺
伝子配列の発現のための他の遺伝子要素を与えてもよ
い。哺乳動物宿主細胞内で用いるための発現ベクター
は、例えば Okayama及び Berg（Mol. Cell. Biol. 3:28
0, 1983）の方法で構築することができる。

【００４６】本発明のヒトＮＢＰｈｏｘタンパク質を産
生する１つの方法は、ヒトＮＢＰｈｏｘをコードするＤ
ＮＡ配列を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞
を、ヒトＮＢＰｈｏｘが発現する条件下で培養すること
を含む。次いで、用いた発現系に依存して、ヒトＮＢＰ
ｈｏｘタンパク質を培養培地又は細胞抽出液から回収す
る。組換えヒトＮＢＰｈｏｘを精製する操作は、用いた
宿主細胞の型及びヒトＮＢＰｈｏｘが培養培地中に分泌
されるかどうかといった要因に従って適宜選択するであ
ろう。

【００４７】本発明のヒトＮＢＰｈｏｘタンパク質は、
ヒトの脳における組織分化過程の研究、並びにヒト神経
系における信号伝達機構の研究のための貴重な試薬にな
ると期待される。さらに、そのような研究の結果ヒトＮ
ＢＰｈｏｘタンパク質の作用が明らかになれば、ヒトＮ
ＢＰｈｏｘタンパク質自体、あるいはそのインヒビター
を神経系疾患の治療薬として利用できるものと期待され
る。

【００４８】

【実施例】以下、本発明を実施例により説明する。以下
の実施例は、配列番号２の核酸配列において、塩基番号
１の塩基に配列番号３で表される配列を有する核酸が、
また塩基番号９４５の塩基に配列番号４で表される配列
を有する核酸がそれぞれ結合した塩基配列を有するＤＮ
Ａの製造法を説明するものである。もっとも、本発明は
下記実施例に限定されるものではないことは明らかであ
る。尚、下記実施例において各操作は、特に明示がない
限り、マニアティス（Maniatis）らのモレキュラー・ク
ローニング・ラボラトリーマニュアル 第２版（198
9）、コールド・スプリング・ハーバー記載の方法によ
り行った。また、制限酵素は市販のものを使用し、その
具体的な使用法は市販品の指示書に従った。さらに、実
施例で使用した神経芽腫細胞ＣＨＰ１３４、ＬＡ−Ｎ−
１，ＬＡ−Ｎ−２、ＬＡ−Ｎ−５、ＭＣ−ＮＢ−１、Ｎ
Ｂ６９およびヒト肝臓癌細胞株ＨｅｐＧ２は、理化学研
究所細胞開発銀行より入手可能であり、ＨｅＬａ、ＩＭ
Ｒ３２は、財団法人がん研究振興財団のＪａｐａｎｅｓ
ｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃ
ｅｒｓ Ｂａｎｋより入手可能である。

【００４９】（１）ヒト神経芽腫細胞ＣＨＰ１３４のｍ
ＲＮＡの調製 約１０⁷個のヒト神経芽腫細胞ＣＨＰ１３４（由来 ま
たは入手可能先）に、１８ｍｌのＤ溶液（４Ｍグアニジ
ンチオシアネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、０.
５％ザルコシル、０.１Ｍ ２−メルカプトエタノー
ル）を加え、ラバーポリスマンで細胞をはがし溶解させ
た後、素早くホモジェナイズした。得られたホモジェネ
ートを５０ｍｌの遠心管に移し、２Ｍ酢酸ナトリウム
（ｐＨ４）を２ｍｌ加え、混和した。次に、水飽和フェ
ノールを２０ｍｌ加え、混和した。そして最後にクロロ
ホルムを５ｍｌ加え混和した後、１５分氷冷した。その
後、４℃で４０００×ｇ、１時間遠心した。遠心後、水
層を別の遠心管に移し、その水層に３２ｍｌのエタノー
ルを加え、混和した。−２０℃に１時間置くことにより
ＲＮＡを沈殿させた。遠心分離により回収したＲＮＡ
は、８０％エタノールで洗浄後、真空乾燥させ、滅菌蒸
留水に溶解した。次に得られたＲＮＡ水溶液を以下の手
順で処理してポリ（Ａ）を有するｍＲＮＡを分離した。
即ち、滅菌蒸留水に溶解したＲＮＡに２×抽出バッファ
ー（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ、０.
２％ ＳＤＳ）と宝酒造株式会社から市販されているＯ
ｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０溶液を２倍量加え、撹拌し
た。撹拌後、６５℃で５分間熱処理を施し、３分間氷冷
した。氷冷後、５Ｍ ＮａＣｌ溶液を１／１０量加え、
３７℃で１０分間放置し、遠心分離によりｍＲＮＡと結
合しているＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０を回収した。回
収したＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０は、洗浄バッファー
（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、０.１
％ＳＤＳ、０.１ＭＮａＣｌ）により洗浄した。洗浄
後、滅菌蒸留水を加え、６５℃で５分間熱処理を施し、
ｍＲＮＡを溶出した。遠心分離により、溶出したｍＲＮ
Ａを単離し、エタノール沈殿により回収した。回収した
ｍＲＮＡを８０％エタノールで洗浄後、真空乾燥させ、
滅菌蒸留水に溶解した。このｍＲＮＡを用いて以下のｃ
ＤＮＡ合成を行った。

【００５０】（２） ３’ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃＤＮＡ
ライブラリーの作製 大久保らの方法（Dna Seq. 2 (1991) 137-144）によ
り、上記ヒト神経芽腫細胞ＣＨＰ１３４のｍＲＮＡを用
いて、ｐＵＣ１１９をベクターとする３’ｄｉｒｅｃｔ
ｅｄ ｃＤＮＡライブラリーを作製した。この方法によ
り、ｐＵＣ１１９のＢａｍＨＩ部位とＰｓｔＩ部位の間
に、ｃＤＮＡの３’末端の配列が挿入したプラスミドラ
イブラリーを作製した。

【００５１】このライブラリーより無作為に約１３００
クローンのｃＤＮＡ塩基配列を解析した。この解析した
クローンの中から、ヒト神経芽腫細胞ＣＨＰ１３４にお
いて特異的に発現していると考えられるクローンを選択
した。選択に際しては、大阪大学細胞生体工学センター
の松原謙一教授の研究室において作製された（Gene 135
(1993) 265-274）遺伝子発現情報データバンク（Body
expression map of human genes）を利用した。

【００５２】（３） ヒト細胞株およびヒト各臓器にお
けるＧＳ008886遺伝子の発現の確認 ヒト神経芽腫細胞ＣＨＰ１３４において特異的に発現し
ていると考えられるクローンの一つとして、ＧＳ008886
遺伝子を選択した。ＧＳ008886遺伝子の塩基配列を後述
の配列表において配列番号５として示す。ノーザン解析
法を利用してＧＳ008886遺伝子のヒト細胞株およびヒト
各臓器における発現を解析した。ヒト細胞株の解析とし
て、ヒト神経芽腫細胞株ＣＨＰ１３４、ＬＡ−Ｎ−１、
ＬＡ−Ｎ−２、ＬＡ−Ｎ−５、ＭＣ−ＮＢ−１、ＮＢ６
９、ＩＭＲ３２、ヒト肝臓癌細胞腫ＨｅｐＧ２、ヒト子
宮頚癌細胞株ＨｅＬａ由来の全ＲＮＡ３０μｇをアガロ
ースで電気泳動後、トランスファーしたナイロンメンブ
レンを作製した。また、ヒト脳、膵臓、腎臓、骨格筋、
肝臓、肺、胎盤、心臓由来のｍＲＮＡを各２μｇをアガ
ロースで電気泳動後、トランスファーしたナイロンメン
ブレン（クローンテック社製）を購入して解析に利用し
た。これらのナイロンメンブレンをハイブリパックに入
れ、１０ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液（５×Ｓ
ＳＰＥ、５０％ホルムアミド、５×Denhardt's、０.５
％ドデシル硫酸ナトリウム、４０μｇ/ｍｌサケ精子Ｄ
ＮＡ）を加えて４２℃、１時間反応させた。

【００５３】プローブの³²Ｐ標識は、ｐＵＣ１１９のＢ
ａｍＨＩ部位とＰｓｔＩ部位の間に挿入されたＧＳ0088
86遺伝子のＰＣＲ断片を鋳型として、マルチプライマー
キット（アマシャム社製）を用いて行った。この³²Ｐ標
識したプローブを上記反応液に加えてさらに１４時間以
上ハイブリダイゼーション反応を行った。その後、フィ
ルターを０.１％ドデシル硫酸ナトリウムを含む５００
ｍｌの２×ＳＳＣにより５０℃で２回、２０分間ずつ洗
い、さらに０.１％ドデシル硫酸ナトリウムを含む５０
０ｍｌの０.１×ＳＳＣにより５０℃で２回、２０分間
ずつ洗った。その後、−７０℃でインテンシファイスク
リーンを用いて２日間オートラジオグラフィーを行っ
た。結果は図１に示す。なお、上記ＰＣＲにおいて使用
したプライマーの塩基配列は以下の通りである。

【００５４】5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3' 5'-ACCATGATTACGCCAAGCTTG-3' ＧＳ008886遺伝子はヒト肝臓癌細胞腫株、ヒト子宮頚癌
細胞株、ヒト成人の脳、膵臓、腎臓、骨格筋、肝臓、
肺、胎盤、心臓には発現しておらず、ヒトの神経芽腫細
胞だけに発現していることがわかる。ＧＳ008886遺伝子
はヒト神経芽腫細胞の遺伝子マーカーとして利用するこ
とが考えられる。

【００５５】（４） ヒト神経芽腫細胞ＩＭＲ３２のｍ
ＲＮＡの調製 ＧＳ008886遺伝子の全長ｃＤＮＡを得るために、ｃＤＮ
Ａライブラリーを作製した。まず、ヒト神経芽腫細胞Ｉ
ＭＲ３２のｍＲＮＡの調製を行った。約１０⁷個のヒト
神経芽腫細胞ＩＭＲ３２に、１８ｍｌのＤ溶液（４Ｍグ
アニジンチオシアネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウ
ム、０.５％サルコシル、０.１Ｍ ２−メルカプトエタ
ノール）を加え、ラバーポリスマンで細胞をはがし溶解
させた後、素早くホモジナイズした。得られたホモジネ
ートを５０ｍｌの遠心管に移し、２Ｍ酢酸ナトリウム
（ｐＨ４）を２ｍｌ加え、混和した。次に、水飽和フェ
ノールを２０ｍｌ加え、混和した。そして最後にクロロ
ホルムを５ｍｌ加え混和した後、１５分氷冷した。その
後、４℃で４０００×ｇ、１時間遠心した。遠心後、水
層を別の遠心管に移し、その水層に３２ｍｌのエタノー
ルを加え、混和した。−２０℃に１時間置くことにより
ＲＮＡを沈殿させた。遠心分離により回収したＲＮＡ
は、８０％エタノールで洗浄後、真空乾燥させ、滅菌蒸
留水に溶解した。次に得られたＲＮＡ水溶液を以下の手
順で処理してポリ（Ａ）を有するｍＲＮＡを分離した。
即ち、滅菌蒸留水に溶解したＲＮＡに等量の２×抽出バ
ッファー（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭＥＤＴ
Ａ、０.２％ ＳＤＳ）と宝酒造株式会社から市販され
ているＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０溶液を２倍量加え、
撹拌した。撹拌後、６５℃で５分間熱処理を施し、３分
間氷冷した。氷冷後、５Ｍ ＮａＣｌ溶液を１／１０量
加え、３７℃で１０分間放置し、遠心分離によりｍＲＮ
Ａと結合しているＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０を回収し
た。回収したＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０は、洗浄バッ
ファー（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、
０.１％ＳＤＳ、０.１ＭＮａＣｌ）により洗浄した。洗
浄後、滅菌蒸留水を加え、６５℃で５分間熱処理を施
し、ｍＲＮＡを溶出した。遠心分離により、溶出したｍ
ＲＮＡを単離し、エタノール沈殿により回収した。回収
したｍＲＮＡを８０％エタノールで洗浄後、真空乾燥さ
せ、滅菌蒸留水に溶解した。このｍＲＮＡを用いて以下
のｃＤＮＡ合成を行った． （５） ｃＤＮＡライブラリーの作製 調製したｍＲＮＡからのｃＤＮＡ合成は、ＧＩＢＣＯ
ＢＲＬ社から市販されている逆転写酵素ＳＵＰＥＲ Ｓ
ＣＲＩＰＴ ＩＩを用い、製品に添付されているプロト
コールに従って行った。逆転写酵素により、ｍＲＮＡに
相補的なｃＤＮＡを合成した後、リボヌクレアーゼＨ
で、ＲＮＡ鎖にニックとギャップを入れ、これを大腸菌
ＤＮＡリガーゼを用いて修復合成することにより、ＲＮ
Ａ鎖をｃＤＮＡに置換した。最後に、Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼにより、ｃＤＮＡ鎖の両端を平滑化した。続い
て、アマシャム社から市販されているλＭＯＳＳｌｏｘ
ライブラリーシステムを用いて、ｃＤＮＡライブラリー
を作製した。方法は、すべて製品に添付されているプロ
トコールに従って行った。即ち、まず、合成ｃＤＮＡの
両端にＥｃｏＲＩアダプターを付加し、これと予めＥｃ
ｏＲＩで切断処理が施されているλＭＯＳＳｌｏｘアー
ムとを連結した。その後、インビトロパッケージングを
行い、大腸菌ＥＲ株（製品に付属）に感染させることに
より、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。

【００５６】（６） ＧＳ008886遺伝子の全長ｃＤＮＡ
クローンの選抜 上記（５）に従って調製したｃＤＮＡライブラリーのう
ち、約１０万個のファージ群を大腸菌ＥＲ株に吸収させ
て寒天プレートにまき、３７℃で１２時間培養した。そ
の寒天上にナイロンメンブレンフィルターを置き、１分
間放置してファージをフィルターに吸着させた後、フィ
ルターを寒天から剥がし、変性液（０.５ＭＮａＯＨ、
１.５ＭＮａＣｌ）中で５分間変性処理を行った。ペー
パータオル上で十分変性液を除いた後、中和液（３Ｍ酢
酸ナトリウムｐＨ５.５）中で５分間中和反応をし、紫
外線照射を行い、続いて２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、
０.１５Ｍ塩化ナトリウムを含む１５ｍＭクエン酸ナト
リウム塩酸緩衝液、ｐＨ７）中で３０分間洗浄した。こ
のフィルターをハイブリダイゼーション液（７％ポリエ
チレングリコール6000、１０％ドデシル硫酸ナトリウ
ム）に浸し、６５℃にて１時間反応させた。

【００５７】プローブの³²Ｐ標識は、上記（３）におい
て調製したＧＳ008886遺伝子のＰＣＲ断片を鋳型とし
て、マルチプライマーキット（アマシャム社製）を用い
て行った。この³²Ｐ標識したプローブを上記反応液に加
えてさらに１４時間以上ハイブリダイゼーション反応を
行った。その後、フィルターを０.１％ドデシル硫酸ナ
トリウムを含む５００ｍｌの２×ＳＳＣにより６５℃で
２回、２０分間ずつ洗い、さらに０.１％ドデシル硫酸
ナトリウムを含む５００ｍｌの０.１×ＳＳＣにより６
５℃で２回、２０分間ずつ洗った。その後、−７０℃で
インテンシファイスクリーンを用いて２日間オートラジ
オグラフィーを行った。

【００５８】プローブとして用いたＧＳ008886遺伝子の
配列を含むｃＤＮＡが挿入されているファージＤＮＡに
は、³²Ｐで標識したＤＮＡプローブが結合する。従っ
て、ナイロンメンブレンフィルターに吸着されたファー
ジＤＮＡのプラークに相当する部分はＸ線フィルムに黒
点を生じる。この黒点を生じたプラークのファージを寒
天プレートから単離し、約３.０ｋｂｐの長さのｃＤＮ
Ａが挿入されているクローンを得た。

【００５９】得られたファージクローンから大腸菌ＢＭ
株（アマシャム社製品に付属）を用いた方法により、挿
入断片を含むプラスミドを回収した。この際の詳細な方
法は全てアマシャム社のプロトコールに従った。

【００６０】（７） ｃＤＮＡ挿入断片の全塩基配列の
決定 ｃＤＮＡ挿入断片の全塩基配列をダイデオキシターミネ
ーターキット（ＡＢＩ社製）を用いてプライマーウォー
キング法により決定した。決定した全塩基配列を配列番
号２、３および４として示す。ここで配列番号３で表さ
れる配列は配列番号２で表される配列の塩基番号１の塩
基に結合しており、配列番号４で表される配列は配列番
号２で表される配列の塩基番号９４５の塩基に結合して
いる。クローンｐＨＮＢＰｈｏｘは、３０７４塩基対を
挿入ＤＮＡ断片として含み、翻訳開始遺伝暗号ＡＴＧか
ら翻訳停止遺伝暗号ＴＡＧまでの９４５塩基対を連続し
た最も大きなオープンリーディングフレームとして持っ
ていた。配列番号２で表されるＤＮＡ塩基配列から誘導
されるアミノ酸配列を配列番号１として配列表に示し
た。

【００６１】クローンｐＨＮＢＰｈｏｘに挿入されたＤ
ＮＡ断片の塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、マ
ウスＰｈｏｘ２のアミノ酸配列と一部相同性を示した。
最も相同性の高かった領域はマウスＰｈｏｘ２のホメオ
ドメインであり、この領域において、アミノ酸配列は１
００％一致した。この領域は転写因子がＤＮＡと直接結
合するのに最も重要な領域である。またマウスＰｈｏｘ
２のアミノ末端領域の酸性領域においても高い相同性を
示した。この領域は基本転写因子との相互作用において
最も重要な領域である。

【００６２】Ｐｈｏｘ２は、１９９３年マウスの神経芽
腫細胞のｃＤＮＡライブラリーから単離同定された２８
０個のアミノ酸をコードする遺伝子で、神経系特異的に
発現している細胞接着分子 neural cell adhesion mole
cule（ＮＣＡＭ）遺伝子の転写を正に制御する転写因子
である。成体マウスでのＰｈｏｘ２の発現は、末梢神経
系では自律神経系の神経節において強く発現し、脳では
後脳において発現している。脳の発生過程におけるＰｈ
ｏｘ２の発現は、（ノル）アドレナリン系神経細胞およ
びその前駆細胞において発現している（Development 11
9巻 881頁 (1993)）。このことからＰｈｏｘ２は、ＮＣ
ＡＭ遺伝子の転写制御のみならず、神経細胞の神経伝達
物質に関する表現型への分化を調節している因子の一員
であると考えられている。

【００６３】クローンｐＨＮＢＰｈｏｘにコードされて
いるアミノ酸配列に、転写因子のＤＮＡ結合領域である
ホメオドメインが含まれており、しかもその配列がＰｈ
ｏｘ２のホメオドメインの配列と一致することから、ク
ローンｐＨＮＢＰｈｏｘにコードされるタンパク質もＰ
ｈｏｘ２と同様に細胞接着分子ＮＣＡＭ遺伝子の転写を
制御し、かつ神経細胞の分化を調節している因子の一員
であると考えられる。

【００６４】

【発明の効果】以上述べたように、本発明によれば、ヒ
トＮＢＰｈｏｘをコードする遺伝子が提供された。この
遺伝子はヒト神経芽腫細胞を同定するためのプローブま
たはプライマーとして利用することできる、すなわち本
発明によりヒト神経芽腫同定するためのプローブまたは
プライマーとして利用可能なＤＮＡ断片が提供された。

【００６５】

【配列表】

【００６６】配列番号：１ 配列の長さ：３１４アミノ酸残基 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：タンパク質 配列： Met Tyr Lys Met Glu Tyr Ser Tyr Leu Asn Ser Ser Ala Tyr Glu Ser 1 5 10 15 Cys Met Ala Gly Met Asp Thr Ser Ser Leu Ala Ser Ala Tyr Ala Asp 20 25 30 Phe Ser Ser Cys Ser Gln Ala Ser Gly Phe Gln Tyr Asn Pro Ile Arg 35 40 45 Thr Thr Phe Gly Ala Thr Ser Gly Cys Pro Ser Leu Thr Pro Gly Ser 50 55 60 Cys Ser Leu Gly Thr Leu Arg Asp His Gln Ser Ser Pro Tyr Ala Ala 65 70 75 80 Val Pro Tyr Lys Leu Phe Thr Asp His Gly Gly Leu Asn Glu Lys Arg 85 90 95 Lys Gln Arg Arg Ile Arg Thr Thr Phe Thr Ser Ala Gln Leu Lys Glu 100 105 110 Leu Glu Arg Val Phe Ala Glu Thr His Tyr Pro Asp Ile Tyr Thr Arg 115 120 125 Glu Glu Leu Ala Leu Lys Ile Asp Leu Thr Glu Ala Arg Val Gln Val 130 135 140 Trp Phe Gln Asn Arg Arg Ala Lys Phe Arg Lys Gln Glu Arg Ala Ala 145 150 155 160 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Asn Gly Ser Ser Gly Lys Lys Ser 165 170 175 Asp Ser Ser Arg Asp Asp Glu Ser Lys Glu Ala Lys Ser Thr Asp Pro 180 185 190 Asp Ser Thr Gly Gly Pro Gly Pro Asn Pro Asn Pro Thr Pro Ser Cys 195 200 205 Gly Ala Asn Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro Ser Pro Ala Gly Ala Pro 210 215 220 Gly Ala Ala Gly Pro Gly Gly Pro Gly Gly Glu Pro Gly Lys Gly Gly 225 230 235 240 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 245 250 255 Ala Ala Ala Ala Gly Gly Leu Ala Ala Ala Gly Gly Pro Gly Gln Gly 260 265 270 Trp Ala Pro Gly Pro Gly Pro Ile Thr Ser Ile Pro Asp Ser Leu Gly 275 280 285 Gly Pro Phe Gly Ser Val Leu Ser Ser Leu Gln Arg Pro Asn Gly Ala 290 295 300 Lys Ala Ala Leu Val Lys Ser Ser Met Phe 305 310

【００６７】配列番号：２ 配列の長さ：９４５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列： ATG TAT AAA ATG GAA TAT TCT TAC CTC AAT TCC TCT GCC TAC GAG TCC 48 Met Tyr Lys Met Glu Tyr Ser Tyr Leu Asn Ser Ser Ala Tyr Glu Ser 1 5 10 15 TGT ATG GCT GGG ATG GAC ACC TCG AGC CTG GCT TCA GCC TAT GCT GAC 96 Cys Met Ala Gly Met Asp Thr Ser Ser Leu Ala Ser Ala Tyr Ala Asp 20 25 30 TTC AGT TCC TGC AGC CAG GCC AGT GGC TTC CAG TAT AAC CCG ATA AGG 144 Phe Ser Ser Cys Ser Gln Ala Ser Gly Phe Gln Tyr Asn Pro Ile Arg 35 40 45 ACC ACT TTT GGG GCC ACG TCC GGC TGC CCT TCC CTC ACG CCG GGA TCC 192 Thr Thr Phe Gly Ala Thr Ser Gly Cys Pro Ser Leu Thr Pro Gly Ser 50 55 60 TGC AGC CTG GGC ACC CTC AGG GAC CAC CAG AGC AGT CCG TAC GCC GCA 240 Cys Ser Leu Gly Thr Leu Arg Asp His Gln Ser Ser Pro Tyr Ala Ala 65 70 75 80 GTT CCT TAC AAA CTC TTC ACG GAC CAC GGC GGC CTC AAC GAG AAG CGC 288 Val Pro Tyr Lys Leu Phe Thr Asp His Gly Gly Leu Asn Glu Lys Arg 85 90 95 AAG CAG CGG CGC ATC CGC ACC ACT TTC ACC AGT GCC CAG CTC AAA GAG 336 Lys Gln Arg Arg Ile Arg Thr Thr Phe Thr Ser Ala Gln Leu Lys Glu 100 105 110 CTG GAA AGG GTC TTC GCG GAG ACT CAC TAC CCC GAC ATC TAC ACT CGG 384 Leu Glu Arg Val Phe Ala Glu Thr His Tyr Pro Asp Ile Tyr Thr Arg 115 120 125 GAG GAG CTG GCC CTG AAG ATC GAC CTC ACA GAG GCG CGA GTC CAG GTG 432 Glu Glu Leu Ala Leu Lys Ile Asp Leu Thr Glu Ala Arg Val Gln Val 130 135 140 TGG TTC CAG AAC CGC CGC GCC AAG TTT CGC AAG CAG GAG CGC GCA GCG 480 Trp Phe Gln Asn Arg Arg Ala Lys Phe Arg Lys Gln Glu Arg Ala Ala 145 150 155 160 GCA GCC GCA GCG GCC GCG GCC AAG AAC GGC TCC TCG GGC AAA AAG TCT 528 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Asn Gly Ser Ser Gly Lys Lys Ser 165 170 175 GAC TCT TCC AGG GAC GAC GAG AGC AAA GAG GCC AAG AGC ACT GAC CCG 576 Asp Ser Ser Arg Asp Asp Glu Ser Lys Glu Ala Lys Ser Thr Asp Pro 180 185 190 GAC AGC ACT GGG GGC CCA GGT CCC AAT CCC AAC CCC ACC CCC AGC TGC 624 Asp Ser Thr Gly Gly Pro Gly Pro Asn Pro Asn Pro Thr Pro Ser Cys 195 200 205 GGG GCG AAT GGA GGC GGC GGC GGC GGG CCC AGC CCG GCT GGA GCT CCG 672 Gly Ala Asn Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro Ser Pro Ala Gly Ala Pro 210 215 220 GGG GCG GCG GGG CCC GGG GGC CCG GGA GGC GAA CCC GGC AAG GGC GGC 720 Gly Ala Ala Gly Pro Gly Gly Pro Gly Gly Glu Pro Gly Lys Gly Gly 225 230 235 240 GCA GCA GCA GCG GCG GCG GCC GCG GCA GCG GCG GCG GCG GCA GCG GCA 768 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 245 250 255 GCG GCG GCA GCT GGA GGC CTG GCT GCG GCT GGG GGC CCT GGA CAA GGC 816 Ala Ala Ala Ala Gly Gly Leu Ala Ala Ala Gly Gly Pro Gly Gln Gly 260 265 270 TGG GCT CCC GGC CCC GGC CCC ATC ACC TCC ATC CCG GAT TCG CTT GGG 864 Trp Ala Pro Gly Pro Gly Pro Ile Thr Ser Ile Pro Asp Ser Leu Gly 275 280 285 GGT CCC TTC GGC AGC GTC CTA TCT TCG CTC CAA AGA CCC AAC GGT GCC 912 Gly Pro Phe Gly Ser Val Leu Ser Ser Leu Gln Arg Pro Asn Gly Ala 290 295 300 AAA GCC GCC TTA GTG AAG AGC AGT ATG TTC TGA 945 Lys Ala Ala Leu Val Lys Ser Ser Met Phe *** 305 310

【００６８】配列番号３： 配列の長さ：３６０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ TTAAATTCTA ATTAGAGATG CAGGAATCAA TGATAGGGAG GTTGGACAGC TCAGTTCCCC 60 AGTGCCAGCC CAATAGACGG ATGAGTTATT GTCATGTAAA AAGCGCCAGC AATAAGACCA 120 ACCGCTTTGC TATTGTCCAA GTGGAAAGAG CCAAGTTTAT TATGAGGACT ATATGCTCTA 180 GAGACCTCAG ACAAGGCATC TCATAGGAGG CTTTTTCATA AAACTAGGCT CTGCTGGTAG 240 TAAGGAGGCC AGTTTGGAGG CAGGCGTTGA GCTGTGCACA TCTCCCCACT CCAGCCACCT 300 TCTCCATATC CATCTTTTAT TTCATTTTTC CACTTGGCTG AGCCATCCAG AACCTTTTCA 360

【００６９】配列番号４： 配列の長さ：１７６９塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ TCTGGAATCC TGCGGCGGCG GCGGCGGCGG CGACAGCGGG CGAGCCAGGG CCCGGGCGGG 60 CGAGTGGGCG AGCGGGTAGG CCCAAGGCTA TTGTCGTCGC TGCTGCCATG GCTTTTTCAT 120 TGAGGGCCTA AAGTAATCGC GCTAAGAATA AAGGGAAAAC GGCGTCGCCC TCATTTCAAC 180 CCCACTCCTA CCCCCTTCCT CAACCCCCAA ACAAAACAAA CAAACTTCCC TGGCTTCGCA 240 CCTGCCTGGG GCCTCGCAGC GGGGCCAGGG CTCCGCCTGC TGATCGGGGG TTGTGAGCAG 300 CGCGGCCTGG ACGCGGGGCA CTCTCAGGGG GCTGTGTCTG CGTGTCAGTT TGTGTCTGTC 360 TCGGGGAATG TGTGTCTGTG GCCCAAGCAG GTGACAGGAA GAGATGGGGG GCCTCAACCA 420 ACTTAGTGAC TTGTTTAGAA AAAAAAGACA AAAAAGTAAA AATAAAAACA AAAAAGTTGG 480 AAGGCAGAAA CCATTAAAAA ACAAAAAGCC AACAACCCAG AAAGGTTTAA AAAACATAAG 540 GAAAAAAAAG ACAAATTAAA GGAGGGGCTA GGGGAGAAGC TGCAGCTGGA GCTGAAGGCT 600 CGATCTTGTG AACCCCTAAA TCCGCTCCCT CCTAACAGCA CGGATTCTCT TGGGGCTCTT 660 CTTCAGGGAA GAGTAGGGAC GCCGTTCCAG CCCCCCTTCC TATCGTGTCC TTGGGTTCGG 720 GTCACTGCGG CGACGACTTG CTCAGACTGT CCCGGCGGCC GGAGTGACTT TCTCGCACCC 780 CCTTGCCTGT CCCACCTCGC TGAACACCAT CCCGCCATTA GCGCATCGGA ACCCCACACA 840 GTTGCAACTC CCAACCCCGA ATCTTTGCAG CCGTTCGGCC CTGAAAGATG CCCTATCCAT 900 GAGATGCCTT TTCATCTGCA AACTCTGCAA AATGTGTCTC ATGTTTCGCA ACTCTTTTTT 960 TCCCCCTCGC TCCCGCCTAC CCCGTCGGCA TTTTCTTCTT CCACCAGCTT TTACTGAACT 1020 TTTTGGCACT GCTTTGGATT GGGGTCAATT GCAGTCCACG TAACTGGCTG CAGAGAAATC 1080 TACCGAGCAA GGAAAAGGCA CACACACACG TTTGCAGGGG TGTCTCGGTT TGCATTTCTG 1140 TTGGAATGAT CCGAACTGGA CTCACATCCT GTATGGTGGA TGGACTGTAT ATTGAGGGTT 1200 CCATTCTTCG CGCAGTTTAG ACATCTCTGT TTTGATTCTT TGTTGTTGTT TTTATTTTAA 1260 AAGGCACAAA CTCTAGATAT TAGTTGAATG TTGAGGCTTT AACTTTTTCG GTGTCTTTCT 1320 ACAACTGTGT TCTGTGACTC AATTGTATCG TGTTAATATC AGTGCAGACT GTCTCCTCTA 1380 CGTGACCGTA TAATGTTTTT CTCGTCTTGT AGTCTCTATG GCGTGTCTTT ATGGTGTAAT 1440 AAGGTTCTCA CGGGGTCAAT CTTTTGTGTT TAGAGAGGCC ACGGTTCAGA CAATGGTATA 1500 TATTTTTGTT ATCAGGTGCA TGTCTGTCTG ATTTCTTTTT TTTTCCTGTT GGACTATGTT 1560 TGTGAACATA ATTGTCATAA GTTATGTTTC AGATTTTTGA ATTTATTTAT ATGTGTTATA 1620 ATGAATGCTT CTATTTAAAA GGGAAATATT TCTACATGTG CTTATAGTTT TCCAAGAGTG 1680 TACCATTAAC TTGATTGTTG ATAATAAAAA CCAAAAGCAA GTCTAAAAAA AAAAAAAAAA 1740 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAA 1769

【００７０】配列番号５： 配列の長さ：６２２塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ GATCCGAACT GGACTCACAT CCTGTATGGT GGATGGACTG TATATTGAGG GTTCCATTCT 60 TCGCGCAGTT TAGACATCTC TGTTTTGATT CTTTGTTGTT GTTTTTATTT TAAAAGGCAC 120 AAACTCTAGA TATTAGTTGA ATGTTGAGGC TTTAACTTTT TCGGTGTCTT TCTACAACTG 180 TGTTCTGTGA CTCAATTGTA TCGTGTTAAT ATCAGTGCAG ACTGTCTCCT CTACGTGACC 240 GTATAATGTT TTTCTCGTCT TGTAGTCTCT ATGGCGTGTC TTTATGGTGT AATAAGGTTC 300 TCACGGGGTC AATCTTTTGT GTTTAGAGAG GCCACGGTTC AGACAATGGT ATATATTTTT 360 GTTATCAGGT GCATGTCTGT CTGATTTCTT TTTTTTTCCT GTTGGACTAT GTTTGTGAAC 420 ATAATTGTCA TAAGTTATGT TTCAGATTTT TGAATTTATT TATATGTGTT ATAATGAATG 480 CTTCTATTTA AAAGGGAAAT ATTTCTACAT GTGCTTATAG TTTTCCAAGA GTGTACCATT 540 AACTTGATTG TTGATAATAA AAACCAAAAG CAAGTCTAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 600 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AA 622

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ＧＳ００８８８６遺伝子のヒト細胞
株およびヒト各臓器における発現を調べるためのノーザ
ン分析の結果を示す図である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成８年４月２４日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＧＳ００８８８６遺伝子のヒト細胞株
およびヒト各臓器における発現を調べるためのノーザン
分析の結果を示す電気泳動写真である。

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 大久保 公策 大阪府吹田市山田丘１−３ 大阪大学 細 胞生体工学センター内

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に記載するアミノ酸配列を有
   するタンパク質をコードするＤＮＡ。
2. 【請求項２】 配列番号２に記載する塩基配列を有す
   る、請求項１に記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 配列番号２、３もしくは４に記載する塩
   基配列、またはそれらに相補的な塩基配列中の、少なく
   とも連続する１５塩基の配列を有するＤＮＡ断片よりな
   る、神経芽腫診断用のプローブ。
4. 【請求項４】 配列番号５に記載する塩基配列を有する
   ＤＮＡ断片よりなる、請求項３に記載のプローブ。
5. 【請求項５】 神経芽腫瘍診断のための複製連鎖反応
   （ＰＣＲ）に用いるプライマーであって、配列番号２、
   ３若しくは４に記載されたＮＢＰｈｏｘ塩基配列から以
   下の条件を満たす２つの領域を選択し： １）各領域の長さが１５−３０塩基であること； ２）各領域中のＧ＋Ｃの割合が４０−６０％であるこ
   と； ３）各領域中のＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの分布が部分的に偏らな
   いこと； ４）各領域間の距離が１００−１０００塩基であるこ
   と； ５）各領域自身の中または２つの領域間に相補的な配列
   部分が存在しないこと；そして上記領域と同じ塩基配列
   若しくは上記領域に相補的な塩基配列を有する一本鎖Ｄ
   ＮＡを製造し、さらに必要であれば上記ＮＢＰｈｏｘ塩
   基配列に対する結合性を失わないように修飾した上記一
   本鎖ＤＮＡを製造することからなる方法によって製造さ
   れた、上記プライマー。
6. 【請求項６】以下の塩基配列：５’−ＡＴＴＣＧＣＴＴ
   ＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＴＣ−３’（配列番号２の塩基番
   号８５４−８７３）および５’−ＣＧＡＧＡＣＡＣＣＣ
   ＣＴＧＣＡＡＡＣＧＴ−３’（配列番号４の塩基番号１
   １１８−１１３７の相補配列）を有するＤＮＡ断片の組
   よりなる、請求項５に記載のプライマー。