MXPA06011680A - Receptor 1 sensible al frio y mentol de canino. - Google Patents

Abstract

La presente invencion provee secuencias de acido nucleico y polipeptidos que describen un receptor novedoso sensible al frio y mentol de canino, nombrado en la presente como CMR1 de canino, cCMR1; la molecula del polipeptido o acido nucleico aislada de la invencion puede usarse en pruebas de deteccion y pruebas de seleccion.

Description

RECEPTOR 1 SENSIBLE AL FRÍO Y MENTOL DE CANINO REFERENCIA RECIPROCA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama prioridad a la solicitud de E.U.A. Nos. 60/560,400, presentada en abril 8 de 2004, y 60/621 ,223, presentada en octubre 22 de 2004, cuyo contenido completo se incorpora en la presente como referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a proteínas de los canales ¡ónicos del receptor térmico. En particular, la presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas y polipéptidos de un receptor novedoso sensible al frío y mentol de canino, CMR1 , y usos de los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se han hecho esfuerzos considerables por dilucidar los mecanismos bioquímicos implicados en la detección, transducción y transmisión de sensaciones de caliente y frío en tejidos neuronales. Los estímulos térmicos activan a receptores especializados localizados en neuronas sensitivas, tales como los que se derivan del ganglio de la raíz dorsal (DRG) y el ganglio del trigémino (TG). Cuando estos estímulos están en la escala nociva (es decir, muy caliente o frío), activan un cierto subgrupo de receptores térmicos en una subpoblación de neuronas sensitivas denominadas nociceptores (neuronas que detectan el dolor). Tras la activación, los receptores térmicos (por ejemplo, canales iónicos) transducen el estímulo nocivo en una señal eléctrica que se propaga a lo largo de la neurona sensitiva hacia la médula espinal, en donde es transmitida hacia el cerebro, llevando finalmente a la percepción de dolor. Por consiguiente, estos receptores térmicos representan objetivos altamente prometedores para el desarrollo de fármacos para el tratamiento de varias condiciones dolorosas. Varios receptores activados por la temperatura han sido implicados en la detección de calor. TRPV1 (VR1 : un canal activado por capsaicina y calor) es activado cerca de 43°C, una temperatura que la mayoría de los mamíferos perciben como nociva. Otros canales de TRPV con más de 40% de identidad al nivel de aminoácidos con TRPV1 , también han sido clonados y caracterizados como termosensores. Estos canales son activados a varios umbrales de calor, que varían de 39°C (caliente) para TRPV3 a 55°C (calor nocivo de alto umbral) para TRPV2/VRL1 (véase Story et al., Cell, 2003, 112: 819-829, y referencias citadas en la misma). En contraste, TRPV4 es abierto constitutivamente a temperatura ambiente, siendo activado a temperaturas mayores de aproximadamente 27°C (Güler et al., J. Neurosci. 2002). Estos receptores activados por la temperatura pertenecen a la familia del potencial transitorio de receptores (TRP) de canales de cationes no selectivos, que en C. elegans y D. melanogaster están implicados en mecanorregulación y osmorregulación. Los canales de TRP se dividen en tres subfamilias designadas como TRPC (subfamilia canónica o capacitiva), TRPV (subfamilia vaniloide) y TRPM (subfamilia de menalostatina). Todas tienen seis dominios de transmembrana putativos con una región de poros propuesta entre los dominios de transmembrana cinco y seis. Se piensa que los canales de TRP tienen extremos N-terminal y C-terminal citoplásmicos (véase Story et al., citado anteriormente, y referencias citadas en la misma). Más recientemente, se han descubierto proteínas que se agrupan dentro de la familia de proteínas de TRP y modulan respuestas a estímulos fríos. Una proteína del CMR1 de rata (para "receptor sensible al frío y mentol"; McKemy, D. D. et al., Nature, 416: 52-58, 2002) y una proteína de TRPM8 de ratón (para "canal de potencial transitorio de receptores, subfamilia de melanostatina, tipo 8", Peier, A. M. et al., Cell 108: 705-715, 2002), parecen funcionar como canales iónicos excitatorios que son activados tras exposición a temperaturas relativamente bajas. El umbral de activación de TRPM8 es de aproximadamente 23°C. El CMR1 de rata y el TRPM8 de ratón son también sensibles a compuestos que provocan sensaciones de frío, tales como el mentol y la icilina. De modo interesante, el CMR1 de rata y el TRPM8 de ratón comparten más de 90% de identidad de secuencia sobre la longitud entera de sus secuencias de aminoácidos. Existe la necesidad de identificar receptores térmicos adicionales, ya que son objetivos potenciales para el tratamiento de dolor. Existe también la necesidad de identificar receptores térmicos en diferentes especies, ya que pueden usarse como sistemas modelo para investigar los efectos de compuestos de prueba. En particular, existe la necesidad de sistemas que puedan usarse para poner a prueba compuestos que incrementen o disminuyan potencialmente la actividad de un receptor térmico que responde a estímulos fríos. La identificación y prueba de dichos compuestos, permitiría el tratamiento de varios trastornos asociados con dolor crónico, o para usos en otras condiciones en las cuales el enfriamiento del tejido es deseable.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se ha descubierto ahora que una proteína de canino, designada en la presente como CMR1 de canino (cCMR1 ), modula respuestas a estímulos fríos, y pertenece a la familia de proteínas de TRP. En un aspecto general, la invención provee una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido capaz de detectar y transducir estímulos fríos, y que tiene por lo menos 96% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2. En una modalidad, la invención provee una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína del cCMR1 que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. La invención provee también vectores de expresión o células hospederas recombinantes que comprenden una molécula de ácido nucleico de la invención. La invención provee además una sonda de ácido nucleico que híbrida selectivamente con la molécula de ácido nucleico de la invención bajo condiciones de hibridación severa, y un equipo que comprende dicha sonda. En otro aspecto general, la invención provee un polipéptido sustancialmente purificado capaz de detectar y transducir estímulos fríos, y que tiene por lo menos 96% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2. En una modalidad, la invención provee un polipéptido sustancialmente purificado que comprende una proteína del cCMR1 que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. La invención provee también un método para expresar el polipéptido de la invención, que comprende los pasos de: a) introducir un vector de expresión capaz de codificar para un polipéptido de la invención en una célula; y b) cultivar las células bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido a partir del vector de expresión. La invención provee además un anticuerpo que se une selectivamente a un polipéptido de la invención, y un equipo que comprende dicho anticuerpo. La invención provee métodos para detectar una molécula de ácido nucleico o polipéptido de la invención, que comprenden el paso de poner en contacto la molécula de ácido nucleico o polipéptido con un agente capaz de mostrar unión específicamente a la molécula de ácido nucleico o polipéptido. La invención provee un método para identificar un compuesto que incrementa o disminuye la expresión de una proteína del cCMR1 , que comprende los pasos de: (a) poner en contacto un compuesto de prueba con una célula que comprende un mecanismo para regular la expresión del gen de cCMR; y (b) determinar si el compuesto de prueba incrementa o disminuye la expresión de un gen controlado por dicho mecanismo de la célula. La invención provee también un método para identificar un compuesto que incrementa o disminuye la conductividad de un canal ¡ónico del cCMR1 , que comprende los pasos de: (a) poner en contacto un compuesto de prueba con el canal iónico; y (b) determinar si el compuesto de prueba incrementa o disminuye la conductividad del canal iónico. Otros aspectos de la invención incluyen un método para identificar un compuesto que incrementa o disminuye la conductividad de un canal ¡ónico de CMR1 de mamífero, que comprende los pasos de: (a) incubar el canal iónico en una solución de regulador de pH que contiene una cantidad de sub-inactivación de calcio; (b) activar el canal ¡ónico; (c) poner en contacto el canal ¡ónico con un compuesto de prueba; (d) incrementar la cantidad de calcio en la solución de regulador de pH; y (e) determinar la cantidad intracelular de calcio y comparar la cantidad con la de un control, en donde el canal ¡ónico no se puso en contacto con el compuesto de prueba. Además, la invención provee un método para identificar un compuesto útil para el tratamiento de dolor, que comprende los pasos de: (a) poner en contacto un compuesto de prueba con un canal ¡ónico de cCMR1 ; y (b) determinar si el compuesto de prueba incrementa o disminuye la conductividad del canal iónico. En algunas modalidades, el método comprende además los pasos de: (a) administrar el compuesto de prueba a un animal; y (b) determinar al grado al cual el compuesto de prueba altera la respuesta nociceptiva/nocifensiva del animal. Otros aspectos, características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción, incluyendo la descripción detallada de la invención y sus modalidades preferidas, así como las reivindicaciones anexas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 ¡lustra los resultados de una prueba de influjo de calcio basada en células, en células recombinantes transfectadas establemente con un vector de expresión del CMR1 de canino. Las células mostraron un incremento en fluorescencia mediado por calcio en respuesta a 10 µM de icilina (círculo oscuro); o 100 µM de (-)-mentol (círculo claro). Los compuestos se añadieron a las células en el punto de tiempo de 200 segundos. No se observó influjo de calcio tras la adición de regulador de pH sólo a las células (triángulo claro). La figura 2 ilustra los resultados de una prueba de influjo de calcio basada en células usando un regulador de pH de carga que está sustancialmente libre de calcio. Células recombinantes transfectadas establemente con un vector de expresión del CMR1 de rata (círculo oscuro), mostraron un incremento en fluorescencia mediado por calcio tras la adición de Ca2+ a 4 mM. La célula no transformada (círculo claro), tuvo menos influjo de Ca2+ tras la adición de Ca2+ a 4 mM. El Ca2+ se añadió a las células en el punto de tiempo de 10 segundos. La figura 3 ilustra que el cCMR1 es activado por aceite de mostaza, un compuesto punzante. Células recombinantes transfectadas establemente con el cCMR1 mostraron un incremento en fluorescencia mediado por calcio, tras la adición de aceite de mostaza a 1 mM (línea de trazos) o icilina a 100 nM como el control positivo (línea continua). Se usó regulador de pH solo como el control negativo (línea punteada). La figura 4 ilustra que el cCMR1 es fuertemente rectificable hacia fuera y no selectivo para cationes. La línea continua representa el registro del cCMR1 por pinchamiento de membrana de células enteras realizado en presencia de mentol a 100 µM, mientras que la línea de trazos representa el control de regulador de pH. La figura 5 ilustra la sensibilidad del cCMR1 a la temperatura. La corriente que pasa a través de la célula fue incrementada significativamente conforme fue disminuida la temperatura de la solución que perfunde la célula que expresa al cCMR1 , demostrando un umbral de activación de aproximadamente 17°C. La figura 6 ilustra que el Ca2+ extracelular desensibiliza el canal del cCMRL El trazo más inferior representa el registro del cCMR1 por pinchamiento de membrana de células enteras en presencia de mentol a 100 µM y en ausencia de Ca2+ extracelular, mientras que el trazo oscuro más superior normalizado al trazo libre de Ca2+ para claridad de presentación visual, representa corriente activada por mentol a 100 µM en presencia de Ca2+ extracelular a 1.8 mM. La figura 7 ilustra la dependencia que tiene la inhibición, por la concentración, de la amplitud de corriente del canal del cCMR1 por el Ca2+ extracelular. El canal fue estabilizado en voltaje a -80 mV, y activado por mentol a 1 mM. La línea de trazos es una función logística que representa el mejor ajuste para los datos, con un valor de IC o de 1.6 mM. La figura 8 ¡lustra la dependencia que tiene la inhibición, por el voltaje, de la amplitud de corriente del canal del cCMR1 por el Ca2+ extracelular. El canal fue activado por mentol a 1 mM.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Todas las publicaciones citadas en la presente se incorporan en la misma como referencia. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como lo entienden comúnmente los expertos en la técnica a la cual esta invención pertenece. Como se usa en la presente, los términos "que comprende", "que contiene", "que tiene" y "que incluye", se usan en su sentido abierto no limitativo.

Las siguientes, son abreviaturas que se usan a veces en esta especificación: pb = pares de bases ADNc = ADN complementario CMR1 = receptor 1 sensible al frío y mentol cCMR1 : receptor 1 sensible al frío y mentol de canino DRG = ganglio de la raíz dorsal ELISA = prueba de inmunoabsorbente ligado a enzima FLIPR = lector de placa de formación de imágenes de fluorescencia kb = kilobase; 1000 pares de bases nt = nucleótido PAGE = electroforesis en gel de poliacrilamida PCR = reacción en cadena de polimerasa RT-PCR = transcripción inversa-reacción en cadena de polimerasa SDS = dodecil sulfato de sodio SSC = cloruro de sodio/citrato de sodio TG = ganglio del trigémino TRPM8 = canal de potencial transitorio de receptores, subfamilia de melanostatina, tipo 8 UTR = región no traducida. "Una actividad", "una actividad biológica" o "una actividad funcional" de un polipéptido o ácido nucleico, se refiere a una actividad ejercida por un polipéptido o molécula de ácido nucleico según se determina in vivo o in vitro, de acuerdo a técnicas estándar. Dichas actividades pueden ser una actividad directa, tal como una actividad de canales iónicos, una asociación con una segunda proteína o una actividad enzimática sobre la misma, o una actividad indirecta, tal como una actividad de señalización celular mediada por interacción de la proteína con una o más de una proteína adicional u otras moléculas que incluyen, pero no están limitadas a, interacciones que ocurren en una forma gradual de pasos múltiples. Una "muestra biológica", como se usa en la presente, se refiere a una muestra que contiene o que consiste de materia de célula o tejido, tales como células o fluidos biológicos aislados de un sujeto. El "sujeto" puede ser un mamífero, tal como una rata, un ratón, un mono o un humano, que haya sido el objeto de tratamiento, observación o experimento. Ejemplos de muestras biológicas incluyen, por ejemplo, esputo, sangre, células sanguíneas (por ejemplo, glóbulos blancos), fluido amniótico, plasma, semen, médula ósea, muestras de biopsia fina con aguja o de tejido, orina, fluido peritoneal, fluido pleural y cultivos de células. Las muestras biológicas pueden incluir también secciones de tejidos tales como secciones congeladas tomadas para propósitos histológicos. Una muestra biológica de prueba es la muestra biológica que ha sido el objeto de análisis, monitoreo u observación. Una muestra biológica control puede ser un control positivo o negativo para la muestra biológica de prueba. Con frecuencia, la muestra biológica control contiene el mismo tipo de tejidos, células y/o fluidos biológicos de interés que los de la muestra biológica de prueba. Una "célula" se refiere a por lo menos una célula o una pluralidad de células adecuadas para la sensibilidad del método de detección. Células adecuadas para la presente invención pueden ser células bacterianas, pero son de preferencia eucarióticas, y más preferiblemente células de mamífero. Un "clon" es una población de células derivadas de una sola célula o ancestro común por mitosis. Una "línea de células" es una célula primaria, que deriva expansión clonal de células y es capaz de mostrar crecimiento estable in vitro por muchas generaciones. Un "receptor sensible al frío y mentó!", un "CMR1", un "canal de potencial transitorio de receptores, subfamilia de melanostatina, tipo 8", o una proteína "TRPM8", se refiere a una proteína que es capaz de detectar y transducir estímulos fríos, tales como temperaturas frescas, o compuestos que provocan sensaciones de frío e incluye, pero no está limitada a, mentol e icilina. Un "CMR1" puede formar un canal iónico excitatorio, el canal del CMR1 , el cual puede ser activado por bajas temperaturas o compuestos que provocan sensaciones de frío. Un canal del CMR1 activado regula el influjo de iones Ca++ a través del canal, resultando en despolarización de la membrana. Una proteína del CMR1 puede, (1 ) tener más de aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con una proteína del CMR1 de canino (cCMR1 ) descrita en SEQ ID NO: 2, o (2) unirse a anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos policlonales o monoclonales, producidos contra una proteína del cCMR1 descrita en SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades, el CMR1 tiene más de aproximadamente 85, 90 ó 95 por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 2. Ejemplos del CMR1 incluyen el cCMR1 , que incluye polimorfismos estructurales y funcionales de la proteína del cCMR1 descrita en SEQ ID NO: 2. El término "polimorfismo" se refiere a una serie de variantes genéticas en un locus genético particular entre los individuos de una población. El CMR1 incluye también ortólogos del CMR1 de canino en otros animales que incluyen humano, rata, ratón, cerdo, perro y mono, por ejemplo, los polimorfismos estructurales y funcionales del CMR1 de rata (ID de proteína del GenBank: NP_599198), o TRPM8 de ratón (ID de proteína del GenBank NP_599013). Los genes del CMR1 se expresan naturalmente en ciertos tejidos neuronales, tales como el DRG y el TG. La "temperatura de activación del CMR1", es la temperatura a la cual un canal del CMR1 exhibe por lo menos un incremento de 10% en su conductividad en comparación con la línea de referencia. El experto en la técnica puede determinar experimentalmente la temperatura de activación para un canal del CMR1. En algunas modalidades, la "temperatura de activación del CMR1" es la temperatura a la cual un canal del CMR1 exhibe por lo menos un incremento de 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% o 50% en su conductividad, en comparación con la línea de referencia. La "temperatura de activación del CMR1" es típicamente de aproximadamente 6°C a 28°C. En algunas modalidades, la temperatura de activación del CMR1 es de aproximadamente 15°C a 28°C, 19°C a 28°C, 23°C a 28°C o 19°C a 24°C. La "temperatura no de activación del CMR1", es la temperatura que está afuera de la escala para una "temperatura de activación del CMR1". Un ejemplo de temperatura no de activación del CMR1 es 37°C. Un "gen" es un segmento de ADN implicado en la producción de un péptido, polipéptido o proteína, y el ARN mensajero que codifica para dicha especie de proteína, incluyendo la región codificante y regiones no codificantes que preceden ("UTR 5' ") y que siguen ("UTR 3' ") a la región codificante. Un "gen" puede incluir también secuencias intermedias no codificantes ("intrones") entre segmentos de codificación individuales ("exones"). "Promotor" significa una secuencia reguladora de ADN que está implicada en la unión de la ARN polimerasa para iniciar la transcripción de un gen. Los promotores están con frecuencia corriente arriba ("5' ") del sitio de inicio de la transcripción del gen. Una "secuencia reguladora", se refiere a la porción de un gen que puede controlar la expresión del gen. Una "secuencia reguladora" puede incluir promotores, intensificadores y/o elementos de control de la expresión tales como señales de poliadenilación, sitios de unión a ribosomas (para expresión bacteriana) y/o un operador. Un "intensificador" significa una secuencia reguladora de ADN que puede regular la expresión de un gen en una forma dependiente de la distancia y orientación. Una "región codificante" se refiere a la porción de un gen que codifica para aminoácidos y las señales de inicio y terminación para la traducción del polipéptido correspondiente por medio de codones basados en tripletes.

Los términos "secuencia de ácido nucleico" o "secuencia de nucleótidos", se refieren a la disposición de residuos de desoxirribonucleótido o ribonucleótido en un polímero en forma de cadena sencilla o de doble cadena. Las secuencias de ácido nucleico pueden formarse de nucleótidos naturales de las siguientes bases: timidina, adenina, citosina, guanina y uracilo, abreviadas como T, A, C, G y U, respectivamente, y/o análogos sintéticos. El término "oligonucleótido" se refiere a una secuencia de ADN o ARN de cadena sencilla de una longitud relativamente corta, por ejemplo, menos de 100 residuos de longitud. Para muchos métodos, son útiles oligonucleótidos de aproximadamente 16 a 25 nucleótidos de longitud, aunque pueden usarse a veces oligonucleótidos más largos de más de aproximadamente 25 nucleótidos. Algunos oligonucleótidos pueden usarse como "iniciadores" para la síntesis de cadenas de ácido nucleico complementarias. Por ejemplo, los iniciadores de ADN pueden hibridar con una secuencia de ácido nucleico complementaria para iniciar la síntesis de una cadena de ADN complementaria en reacciones que usan ADN polimerasas. Los oligonucleótidos son también útiles para hibridación en varios métodos de detección de ácidos nucleicos, por ejemplo, en Northern blotting o hibridación in situ. Los términos una "secuencia de polipéptidos" o "secuencia de proteína" se refieren a la disposición de residuos de aminoácido en un polímero. Las secuencias de polipéptidos pueden formarse de los 20 aminoácidos estándar de ocurrencia natural, además de aminoácidos raros y análogos de aminoácidos sintéticos. Los polipéptidos más cortos son referidos en general como péptidos. Una molécula de ácido nucleico "aislada", es una que está separada de otras moléculas de ácido nucleico presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Una molécula de ácido nucleico "aislada" puede ser, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que esté libre de por lo menos una de las secuencias de nucleótidos que flanquea naturalmente la molécula de ácido nucleico en sus extremos 5' y 3' en el ADN genómico del organismo del cual el ácido nucleico se deriva. Las moléculas de ácido nucleico aisladas incluyen, sin limitación, moléculas de ácido nucleico separadas (por ejemplo, ADNc o fragmentos de ADN genómico producidos por PCR o tratamiento con endonucleasas de restricción) independientes de otras secuencias, así como moléculas de ácido nucleico que se incorporan en un vector, un plásmido que se replica en forma autónoma, un virus (por ejemplo, un retrovirus, adenovirus o virus de herpes), o en el ADN genómico de un procarionte o eucarionte. Además, una molécula de ácido nucleico aislada puede incluir una molécula de ácido nucleico que sea parte de una molécula de ácido nucleico híbrida o de fusión. Una molécula de ácido nucleico aislada puede ser una secuencia de ácido nucleico que sea: (i) amplificada in vitro, por ejemplo, por reacción en cadena de polimerasa (PCR); (¡i) sintetizada, por ejemplo, por síntesis química; (iii) producida en forma recombinante por clonación; o (¡v) purificada, tal como por digestión y separación electroforética o cromatográfica.

Una proteína "aislada" o "purificada", o porción biológicamente activa de la misma, está sustancialmente libre de materia celular u otras proteínas contaminantes de la célula o fuente de tejido de la cual la proteína se deriva, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos cuando se sintetiza químicamente. El término "sustancialmente libre de materia celular", incluye preparaciones de proteína en las cuales la proteína está separada de componentes celulares de las células de las cuales se aisla o se produce en forma recombinante. De esta manera, la proteína que está sustancialmente libre de materia celular, incluye preparaciones de proteína que tienen menos aproximadamente 30%, 20%, 10% o 5% (en peso seco) de proteína heteróloga (referida también en la presente como una "proteína contaminante"). Cuando la proteína o porción biológicamente activa de la misma se produce en forma recombinante, está también de preferencia sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, 10% o 5% del volumen de la preparación de proteína. Cuando la proteína se produce por síntesis química, está de preferencia sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos, es decir, está separada de precursores químicos u otros químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. Por consiguiente, dichas preparaciones de la proteína tienen menos de aproximadamente 30%, 20%, 10% o 5% (en peso seco) de precursores químicos o compuestos diferentes del polipéptido de interés. El polipéptido biológicamente activo aislado puede tener varias formas físicas diferentes. El polipéptido aislado puede existir como un polipéptido naciente o no procesado de longitud completa, o como un polipéptido parcialmente procesado o como una combinación de polipéptidos procesados. El polipéptido naciente de longitud completa puede ser modificado post-traducción por eventos de digestión proteolítica específicos que resultan en la formación de fragmentos del polipéptido naciente de longitud completa. Un fragmento, o asociación física de fragmentos, puede tener la actividad biológica asociada con el polipéptido de longitud completa; sin embargo, el grado de actividad biológica asociado con los fragmentos individuales puede variar. Un polipéptido aislado o sustancialmente purificado puede ser un polipéptido codificado por una secuencia de ácido nucleico aislada, así como un polipéptido sintetizado, por ejemplo, por métodos de síntesis química, y un polipéptido separado de materiales biológicos, y entonces purificado, usando procedimientos convencionales analíticos o preparatorios de proteínas, a un grado que permita que se use de acuerdo a los métodos descritos en la presente. El término "recombinante" se refiere a un ácido nucleico, o proteína codificada por un ácido nucleico, una célula, o una partícula viral, que haya sido modificado usando técnicas de biología molecular para algo más que su estado natural. Por ejemplo, las células recombinantes pueden contener secuencias de nucleótidos que no se encuentren dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula, o pueden expresar genes nativos que de otra manera sean expresados anormalmente, subexpresados o no expresados en modo alguno. Las células recombinantes pueden contener también genes presentes en la forma nativa de la célula, en donde los genes son modificados y reintroducidos en la célula por medios artificiales. El término abarca también células que contienen un ácido nucleico endógeno que ha sido modificado sin que se remueva el ácido nucleico de la célula; dichas modificaciones incluyen las obtenidas, por ejemplo, por reemplazo de genes y mutación específica de sitio. Una "célula hospedera recombinante", es una célula que ha tenido introducida en la misma una secuencia de ADN recombinante. Puede introducirse una secuencia de ADN recombinante en células hospederas usando cualquier método adecuado que incluye, por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, microinyección, transformación, biolística e infección viral. ADN recombinante puede o no ser integrado (enlazado covalentemente) en ADN cromosómico que constituya el genoma de la célula. Por ejemplo, el ADN recombinante puede ser mantenido en un elemento episómico, tal como un plásmido. En forma alternativa, con respecto a una célula transformada o transfectada establemente, el ADN recombinante ha llegado a ser integrado en el cromosoma, de modo que es heredado por las células hijas a través de la replicación cromosómica. Esta estabilidad se demuestra por la capacidad de la célula establemente transformada o transfectada para establecer líneas de células o clones formados de una población de células hijas que contienen al ADN exógeno. Las células hospederas recombinantes pueden ser procarióticas o eucarióticas, e incluyen bacterias tales como E. coli, células de hongos tales como levaduras, células de mamífero tales como líneas de células de humano, bovino, porcino, mono y roedor, y células de insecto tales como Drosophila y líneas de células derivadas del gusano de la seda. Se entiende además que el término "célula hospedera recombinante" se refiere no sólo a la célula sujeto particular, sino también a la progenie o progenie potencial de dicha célula. Debido a que pueden ocurrir ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a influencias ambientales o mutación, dicha progenie puede no ser, de hecho, idéntica a la célula precursora, pero se incluye aún dentro del alcance del término como se usa en la presente. Como se usa en la presente, el término "enlazado operablemente" se refiere a una relación funcional entre dos secuencias de ácido nucleico. Por ejemplo, una secuencia de promotor que controla la expresión (por ejemplo, transcripción) de una secuencia codificante, está enlazada operablemente a esa secuencia codificante. Las secuencias de ácido nucleico enlazadas operablemente pueden ser contiguas, típicas de muchas secuencias de promotor, o no contiguas en el caso, por ejemplo, de secuencias de ácido nucleico que codifican para proteínas represoras. Dentro de un vector de expresión recombinante, el término "enlazado operablemente" se usa para indicar que la secuencia codificante de interés está enlazada a las secuencias reguladoras en una forma que permita la expresión de la secuencia codificante, por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula hospedera cuando el vector se introduce en la célula hospedera.

El término "vector" o "construcción" se refiere a una molécula de ácido nucleico en ia cual un ácido nucleico heterólogo puede ser insertado o es insertado. Algunos vectores pueden ser introducidos en una célula hospedera, permitiendo la replicación del vector o la expresión de una proteína que es codificada por el vector o construcción. Los vectores tienen típicamente marcadores seleccionables, por ejemplo, genes que codifican para proteínas que permiten resistencia a fármacos, orígenes de secuencias de replicación, y sitios de clonación múltiples que permiten la inserción de una secuencia heteróloga. Los vectores se basan típicamente en plásmidos, y se designan por medio de una letra minúscula "p" seguida de una combinación de letras y/o números. Los plásmidos de partida descritos en la presente están disponibles comercialmente, disponibles públicamente sobre una base no restringida, o pueden construirse de plásmidos disponibles por aplicación de procedimientos conocidos en la técnica. Muchos plásmidos y otros vectores de clonación y expresión que pueden usarse de conformidad con la presente invención, son bien conocidos y están fácilmente disponibles para los expertos en la técnica. Además, los expertos en la técnica pueden construir fácilmente cualquier número de otros plásmidos adecuados para su uso en la invención. Las propiedades, construcción y uso de dichos plásmidos, así como otros vectores en la presente invención, serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica a partir de la presente descripción. El término "secuencia" significa el orden lineal en el cual los monómeros ocurren en un polímero, por ejemplo, el orden de aminoácidos en un polipéptido, o el orden de nucleótidos en un polinucleótido. El término "identidad o similitud de secuencia", como se conoce en la técnica, es la relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, según se determina comparando las secuencias. Como se usa en la presente, el término "identidad" en el contexto de la relación entre dos o más secuencias de ácido nucleico o dos o más secuencias de polipéptidos, se refiere al porcentaje de residuos de nucleótidos o aminoácidos, respectivamente, que son iguales cuando las secuencias se alinean óptimamente y se analizan. Para los propósitos de comparación de una secuencia consultada con, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 2, la secuencia consultada es alineada óptimamente con SEQ ID NO 2, y se obtiene la mejor alineación local sobre la longitud completa de SEQ ID NO 2 (1104 aminoácidos). El análisis puede llevarse a cabo manualmente, o usando algoritmos de comparación de secuencias. Para comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la cual una secuencia consultada se compara. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, secuencias de prueba y de referencia se alimentan en una computadora, se designan coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan parámetros del programa del algoritmo de secuencias. La alineación óptima de secuencias para comparación puede llevarse a cabo, por ejemplo, usando el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J Mol. Biol., 48: 443 (1970). El software para la realización del análisis de Needleman y Wunsch está disponible públicamente a través del sitio web del software Biological del Instituto Pasteur (Francia): http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/needle.html. El programa NEEDLE usa el algoritmo de alineación global de Needleman-Wunsch para encontrar la alineación óptima (incluyendo espacios) de dos secuencias cuando se considera su longitud entera. La identidad se calcula junto con el porcentaje de coincidencias idénticas entre dos secuencias sobre la región alineada reportada, incluyendo cualquier espacio en la longitud. Se proveen también puntuaciones de similitud, en donde la similitud se calcula como el porcentaje de coincidencias entre las dos secuencias sobre la región alineada reportada, incluyendo cualquier espacio en la longitud. Comparaciones estándar usan la matriz EBLOSUM62 para secuencias de proteína, y la matriz EDNAFULL para secuencias de nucleótidos. La penalización por apertura de espacios es la puntuación llevada cuando se crea un espacio; el valor predeterminado que usa la penalización por apertura de espacios es de 10.0. Para la extensión de espacios, se añade una penalización a la penalización de espacios estándar para cada base o residuo en el espacio; el valor predeterminado es de 0.5. Puede usarse también la hibridación como una prueba para indicar que dos polinucleótidos son sustancialmente idénticos entre sí. Los polinucleótidos que compartan un alto grado de identidad hibridarán entre sí bajo condiciones de hibridación severa. El término "condiciones de hibridación severa" tiene el significado conocido en la técnica, como se describe en Sambrook eí al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989). Un ejemplo de condición de hibridación severa comprende hibridación en 6x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguida de uno o más lavados en 0.2x SSC y SDS a 0.1 % a 50 a 65°C, dependiendo de la longitud sobre la cual los polinucleótidos hibridantes comparten complementariedad. Un "gen reportero" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica para un producto de gen reportero. Como es sabido en la técnica, los productos de gen reportero son típicamente fácilmente detectables por medio de métodos estándar. Ejemplos de genes reporteros adecuados incluyen, pero no están limitados a, genes que codifican para luciferasa (lux), ß-galactosidasa (lacZ), proteína fluorescente verde (GFP), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), ß-glucuronidasa, neomicina fosfotransferasa y guanina xantina fosforribosil-transferasa. Un "compuesto que incrementa la conductividad de un canal del CMR1", incluye cualquier compuesto que resulte en el paso incrementado de iones a través el canal del CMR1. En una modalidad, dicho compuesto es un agonista para el canal del CMR1 que se une al canal del CMR1 para incrementar su conductividad. En otra modalidad, dicho compuesto es un modulador alostérico positivo, que interactúa con el canal del CMR1 en sitios alostéricos diferentes del sitio de unión del agonista, pero potencia la respuesta del canal a un agonista.

Un "compuesto que disminuye la conductividad de un canal del CMR1", incluye cualquier compuesto que resulte en el paso disminuido de iones a través del canal del CMR1. En una modalidad, dicho compuesto es un antagonista para el canal del CMR que se une al canal del CMR1 para contrarrestar, disminuir o limitar la acción de un agonista en una forma competitiva o no competitiva. En otra modalidad, dicho compuesto es un modulador alostérico negativo, que ¡nteractúa con el canal del CMR1 en sitios alostéricos diferentes del sitio de unión del agonista o antagonista, y disminuye la respuesta del canal a un agonista. En otra modalidad, dicho compuesto es un agonista inverso que se une al canal del CMR1 y disminuye la conductividad del canal en ausencia de algún otro compuesto, tal como un agonista. Los términos "potencial de membrana", "potencial de transmembrana" o "diferencia de potencial de transmembrana", como se usan en la presente, se refieren cada uno a la diferencia de potencial eléctrico a través de la membrana plasmática, la membrana de la bicapa lipídica limitativa externa de las células. Casi todas las células animales son negativas en su interior, con potenciales de reposo en la escala de -20 a -100 mV. El término "potencial de reposo", como se usa en la presente, se refiere al potencial eléctrico del interior de una célula respecto a sus alrededores cuando la célula está en reposo. El término "despolarización", como se usa en la presente, se refiere a la tendencia del potencial de la membrana celular para llegar a ser más positivo, por ejemplo, de -90 mV a -50 mV. El término "hiperpolarización", como se usa en la presente, se refiere a la tendencia del potencial de la membrana celular, para llegar a ser más negativo, por ejemplo, de -50 mV a -90 mV. En la práctica de la presente invención, se usan muchas técnicas convencionales de biología molecular, microbiología y ADN recombinante. Estas técnicas son bien conocidas y se explican, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology, Vols. I, II y lll, F. M. Ausubel, ed. (1997); y Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001 ). En un aspecto, la presente invención se refiere a ácidos nucleicos del cCMR1 novedosos (cCMR1 ), polipéptidos codificados por estos ácidos nucleicos, materiales del cCMR1 recombinantes, y métodos que implican la producción, detección y uso de estos materiales. La nomenclatura del CMR1 fue establecida por McKemy, D. D. et al. (Nature, 416: 52-58, 2002), y se usó para describir un receptor sensible al frío y mentol expresado en neuronas del DRG y el TG de ratas. El CMR1 de humano (conocido también como TRPM8 de humano) es 92% idéntico a la secuencia de aminoácidos del CMR1 de rata, y fue identificado previamente como un transcrito específico de la próstata, y se ha encontrado también que es expresado en varios tejidos tumorales, que incluyen próstata, melanoma y carcinoma colorrectal y de mama (Tsavaler, L., et al., Cáncer Res. 61 : 3760-3769, 2002). El CMR1 de ratón (conocido también como TRPM8 de ratón) fue clonado de una preparación de ADNc del DRG de ratón, y se mostró que es 93% idéntico a la secuencia de aminoácidos del CMR1 de humano (Peier, A. M. et al., Cell 108: 705-715, 2002). En la presente invención, el gen del cCMR1 de canino fue clonado de una colección de ADNc preparada de tejido del DRG de canino. El ADNc del cCMR1 fue secuenciado, incluyendo el marco de lectura abierto (ORF) del cCMR1 y las regiones no traducidas 5' y 3', del ARN mensajero correspondiente. La secuencia de ADNc del cCMR1 se muestra como SEQ ID NO: 1 (cuadro 1 ). SEQ ID NO: 1 codifica para un polipéptido de 1104 residuos (SEQ ID NO: 2), mostrado también en el cuadro 1 , que está alineado con las secuencias de proteína del CMR1 de humano, ratón y rata (véase cuadro 2). Con base en esta alineación, el polipéptido del cCMR1 comparte la identidad más grande de aminoácidos con el CMR1 de humano en 95.23%. En la presente invención, el ácido nucleico del cCMR1 fue subclonado también en un vector de expresión, y transformado en una célula hospedera para expresión de la proteína del cCMR1. Se mostró que este sistema de células del cCMR1 recombinante expresa una proteína del cCMR1 funcional que permitió el influjo de iones Ca++ cuando las células del cCMR1 recombinante fueron incubadas a bajas temperaturas o fueron expuestas a mentol o icilina. El sistema del cCMR1 recombinante es útil para la selección y para la identificación de compuestos que modulan la función o expresión del cCMRL Compuestos que modulen la función o expresión del CMR1 pueden ser terapéuticamente útiles. Estos compuestos pueden identificarse usando, por ejemplo, un sistema recombinante que exprese la proteína del cCMR1 , y entonces puestos a prueba in vivo en perros o cualquier otro mamífero adecuado, para establecer parámetros de dosificación que puedan usarse en humanos. La modulación de la función o expresión de proteínas del CMR1 puede ser ventajosa para el tratamiento de varias condiciones dolorosas. Puesto que el receptor del CMR1 es sensible al frío y compuestos tales como mentol e icilina que imitan una sensación tipo frío, se anticipa que la modulación de la actividad del cCMR1 es también relevante para aplicaciones terapéuticas en donde el tratamiento con frío o mentol se usa como un método de alivio del dolor u otro alivio, tal como en rinitis congestiva, tos o bronquitis asmática. Por ejemplo, la modulación de la función o expresión de proteínas del CMR1 puede ser útil para pacientes que tienen condiciones de membrana mucosa o dérmica, tales como inflamación de la piel y quemaduras dérmicas, que incluyen eritema solar y quemadura o ardor por hoja de rasurar, o dolor de garganta. La modulación de la actividad del CMR1 puede ser también relevante en pacientes que sufren de hipersensibilidad al frío que causa alodinia por frío. La modulación de la actividad del CMR1 puede ser también relevante para el tratamiento de dolor agudo, por ejemplo, dolor dental (odontalgia) y otros dolores distribuidos trigéminamente, tales como neuralgia de trigémino (tic doloroso) y dolor de articulación temperomandibular. Además, puesto que el CMR1 de humano se ha identificado como un marcador que se asocia con el crecimiento de tumores (Tsavaler, L., et al., Cáncer Res. 61 : 3760-3769, 2002), el cCMR1 puede usarse también para el diagnóstico de varios trastornos de proliferación celular en perros. En intentos por clonar el homólogo del cCMR1 , se usó una estrategia basada en PCR. Se sintetizaron oligonucleótidos iniciadores de acuerdo a las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 3 (cmr1-23) y SEQ ID NO: 4 (cmr1-26). Estos iniciadores fueron capaces de amplificar exitosamente una porción de la secuencia del cCMR1 de la posición 1761 a la posición 2886 de SEQ ID NO: 1. El producto de PCR, el cual tenía un tamaño de aproximadamente 1.1 kb, fue purificado y entonces subclonado en un vector de secuenciación. Con base en la secuencia del fragmento del cCMR1 de 1.1 kb se desarrollaron nuevos iniciadores, y se usaron en reacciones de PCR separadas con ADNc del DRG de canino modificado con RACE (amplificación rápida de extremos de ADNc). Se obtuvo la secuencia completa del ADNc del cCMR1 , incluyendo las regiones no traducidas 5' y 3' (SEQ ID NO: 1 ). El marco de lectura abierto del cCMR1 codifica para un polipéptido de 1104 residuos (SEQ ID NO: 2), como se muestra en el cuadro 1. Por lo tanto, en una modalidad, la invención provee una secuencia de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de la posición 69 a 3380 de SEQ ID NO: 1. La posición 69 a 3380 de SEQ ID NO: 1 es una secuencia del marco de lectura abierto (región codificante), que puede codificar para un polípéptido del CMR1 de acuerdo con SEQ ID NO: 2. La invención provee también secuencias de ácido nucleico aisladas que corresponden a la región corriente arriba del marco de lectura abierto del cCMR1 , por ejemplo, de la posición 1 a 69 de SEQ ID NO: 1 , y secuencias de ácido nucleico aisladas que corresponden a la región corriente abajo del marco de lectura abierto del cCMR1 , por ejemplo, de la posición 3380 a 3815 de SEQ ID NO: 1. Por lo tanto, en otra modalidad, la invención provee una secuencia de ácido nucleico aislada que incluye una secuencia de la posición 1 a 69 de SEQ ID NO: 1 , y en otra modalidad, de la posición 3380 a 3815 de SEQ ID NO: 1. Ácidos nucleicos aislados que comprendan fragmentos de SEQ ID NO: 1 son útiles para una variedad de propósitos. Por ejemplo, estas secuencias pueden usarse como sondas de oligonucleótidos para la detección de ácidos nucleicos del CMR1 , o para la detección de secuencias que flanquean ácidos nucleicos del CMR?. Pueden usarse como oligonucleótidos iniciadores para la amplificación de ácidos nucleicos del CMR1. Pueden usarse también para la preparación de ácidos nucleicos quiméricos que codifiquen para el polipéptido del cCMR1 entero o una porción del mismo fusionado a otra secuencia de polipéptidos, por ejemplo, uno o más motivos o dominios de la secuencia del cCMR1 recombinados con uno o más motivos o dominios de una o más secuencias heterólogas. Además, pueden usarse para manipular la estructura del gen del cCMR1. En otra modalidad, la invención provee un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 2. Debido a la degeneración del código genético, más de un codón puede usarse para codificar para un aminoácido particular y, por lo tanto, una secuencia de aminoácidos del cCMR1 (por ejemplo, SEQ ID NO: 2) puede ser codificada por cualquiera de una pluralidad de secuencias de ácido nucleico. El ácido nucleico aislado incluye secuencias en donde uno o más codones en la secuencia son reemplazados por codones de una secuencia diferente, pero que codifican para el mismo residuo de aminoácido, las cuales son referidas en la presente como "sustituciones conservativas de codones". Por lo tanto, la invención abarca secuencias de ácido nucleico que codifican para SEQ ID NO: 2 que tienen una o más de una sustitución conservativa de codones. El experto en la técnica sería capaz de determinar una secuencia de ácido nucleico particular que tenga una o más de una sustitución conservativa de codones y que codifique para SEQ ID NO: 2, con base en la información de secuencia provista en la presente. Pueden hacerse sustituciones conservativas de codones en la secuencia de ácido nucleico que codifique para el polipéptido del CMR1 , por ejemplo, los codones TTT y TTC (referidos en conjunto como TTT/C) pueden codificar para un residuo de Phe (fenilalanina); otras sustituciones de codones son las siguientes: TTA/G y CTT/C/A/G: Leu; ATT/C: lie; ATG: Met; GTT/C/A/G: Val; TCT/C/A/G: Ser; CCT/C/A/G: Pro; ACT/C/A/G: Thr; GCT/C/A/G: Ala; TAT/C: Tyr; CAT/C: His; CAA/G: Gln; AAT/C: Asn; AAA/G: Lys; GAT/C: Asp; GAA/G: Glu; TGT/C: Cys; CGT/C/A/G: Arg; AGT/C: Ser; AGA/G; Arg; GGT/C/A/G: Gly. Pueden hacerse sustituciones conservativas de codones en cualquier posición en la secuencia de ácido nucleico que codifique para el polipéptido del cCMRL Como se muestra en la presente, la posición 69 a la posición 3380 de SEQ ID NO: 1 codifica para un polipéptido de 1104 residuos de aminoácido (SEQ ID NO: 2), que es la secuencia predicha del CMR1 de canino como se expresa en forma natural. Como se muestra en el cuadro 2, SEQ ID NO: 2 fue alineada con las secuencias de proteína del CMR1 de humano, ratón y rata. Por medio de alineación, la secuencia de polipéptidos del cCMR1 (SEQ ID NO: 2) es más idéntica a la secuencia de proteína del CMR1 de humano, compartiendo 1052 de 1104 residuos (95.23% de identidad). La secuencia de la proteína del cCMR1 comparte un menor grado de identidad con las secuencias de polipéptidos del CMR1 de ratón (1042/1104: 94.38% de identidad) y rata (1043/1104: 94.47% de identidad). Como se indica, las secuencias del CMR1 de perro, humano, ratón y rata, como se muestran en el cuadro 2, comparten en general más de 90% de identidad de aminoácidos. Sin embargo, en ciertas posiciones de aminoácido, la secuencia de canino difiere de una o más de las secuencias de humano, ratón o rata. Las posiciones de aminoácido en donde el residuo de canino difiere de una o más de alguna otra especie, son más variables en comparación con posiciones en donde el residuo es idéntico en las secuencias de humano, perro, ratón y rata. Por ejemplo, con base en la alineación de secuencias, los residuos de aminoácido en las posiciones 1 , 2 y 3 de SEQ ID NO: 2 son idénticas a las de la secuencia de humano, ratón y rata. Sin embargo, los residuos de aminoácido en la posición 4 y 5 de SEQ ID NO: 2 varían con respecto a la secuencia de humano, y el residuo de aminoácido en la posición 28 de SEQ ID NO: 2 varía con respecto a las secuencias de humano, ratón y rata. Las posiciones de aminoácido en donde exista por lo menos una diferencia entre la secuencia de canino y cualquiera de las secuencias del CMR1 de humano, ratón o rata, son referidas en la presente como "posiciones variantes de la familia del CMR". Una lista de posiciones variantes de la familia del CMR se da en el cuadro 3. Con base en este análisis, se anticipa que un polipéptido del cCMR1 que tenga una sustitución de uno o más aminoácidos variantes de la familia del CMR, tiene actividad biológica de CMR1. Es decir, SEQ ID NO: 2 puede ser sustituida en una o más posiciones de aminoácido variantes de la familia del CMR con un aminoácido seleccionado de residuos de aminoácido presentes en las secuencias de humano, ratón o rata, o un aminoácido equivalente, en esa misma posición. El aminoácido que reemplace un aminoácido del cCMR1 es referido en la presente como "un aminoácido variante de la familia del CMR". Un "aminoácido variante de la familia del CMR" consiste de un aminoácido que difiere del aminoácido del cCMR1 , y que es el aminoácido presente en la secuencia del CMR1 de otros mamíferos, tales como humano, ratón o rata. Una lista de aminoácidos variantes de la familia del CMR1 adecuados, cualquiera de los cuales puede usarse para reemplazar un residuo de aminoácido del cCMR1 original, puede encontrarse también en el cuadro 3. Por ejemplo, un aminoácido variante de la familia del CMR en la posición 4 adecuado para el reemplazo del ácido gluíámico (E) de SEQ ID NO: 2, es arginina (R, como ocurre en el CMR1 de humano).

En algunas de las posiciones de aminoácido variantes de la familia del CMR, los residuos de aminoácido de canino, humano, ratón y rata comparten una propiedad química común. Por ejemplo, los aminoácidos variantes de la familia del CMR en las posiciones 18 y 34 de SEQ ID NO: 2 pueden incluir un residuo de aminoácido hidrofóbico, por ejemplo, metionina (M) o leucina (L). Otros aminoácidos hidrofóbicos incluyen glicina, valina, isoleucina y prolina. Otros grupos de aminoácidos incluyen "aminoácidos básicos", que incluyen histidina, lisina y arginina; "aminoácidos ácidos", que incluyen ácido glutámico y ácido aspártico; "aminoácidos aromáticos", que incluyen fenilalanina, triptófano y tirosina; "pequeños aminoácidos", que incluyen glicina y alanina; "aminoácidos nucleófilos", que incluyen serina, treonina y cisteína; y "aminoácidos de amida", que incluyen asparagina y glutamina. Por lo tanto, en otro aspecto, la invención provee un ácido nucleico que codifica para un polipéptido del CMR1 de acuerdo a SEQ ID NO: 2, que incluye un aminoácido variante de la familia del CMR. En algunas modalidades, los polipéptidos del cCMR1 incluyen aminoácidos variantes de la familia del CMR en menos de 4% de los residuos de aminoácido del cCMR1 originales. De preferencia, los polipéptidos del cCMR1 incluyen variantes de la familia del CMR en menos de aproximadamente 2% de los residuos de aminoácido del cCMR1 originales, y más preferiblemente menos de aproximadamente 1 % de los residuos de aminoácido del cCMR1 originales. La invención provee también moléculas de ácido nucleico aisladas que son complementarias a cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aisladas, como se describen en la presente. El ácido nucleico aislado de la invención puede incluir también secuencias de ácido nucleico que codifican para el polipéptido del cCMR1 con residuos de aminoácido adicionales. En algunas modalidades, los aminoácidos adicionales están presentes en el extremo amino terminal, el extremo carboxilo terminal, dentro de la secuencia del cCMR1 , o combinaciones de estas posiciones. Los polipéptidos del cCMR1 con estos tipos de secuencias de aminoácido adicionales, pueden ser referidos como "proteínas de fusión del cCMR1". En algunos casos, puede ser más apropiado referirse a los mismos de otra manera como proteínas del cCMR1 "quiméricas" o "marcadas", o similares, dependiendo de la naturaleza de las secuencias de aminoácido adicionales. No obstante, se podrá discernir un polipéptido del CMR1 que tenga secuencias de aminoácido adicionales, dada la información de secuencias provista en la presente. Los residuos de aminoácido adicionales pueden ser cortos, por ejemplo, de uno a aproximadamente 20 residuos de aminoácido adicionales, o más largos, por ejemplo, más de aproximadamente 20 residuos de aminoácido adicionales. Los residuos de aminoácido adicionales pueden cumplir una o más funciones o propósitos que incluyen, por ejemplo, funcionando como epítopes para unión a proteína (por ejemplo, anticuerpo) o pequeña molécula; funcionando como marcadores para tráfico intracelular y extracelular; proveyendo actividad enzimática adicional u otro tipo de actividad; o proveyendo una señal detectable. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico puede codificar para una proteína de fusión del cCMR1 , que puede incluir residuos de aminoácido adicionales que provean coordenadas para unión (tales como unión iónica, covalente, coordinada, por puentes de hidrógeno o fuerzas de Van der Waals, o combinaciones de las mismas) con compuestos orgánicos o inorgánicos. Secuencias de aminoácidos adicionales útiles incluyen, por ejemplo, residuos de polihistidina útiles para purificación de proteínas por medio de residuos acoplado a Ni+, dominios constantes de inmunoglobulinas (IgA, IgE, IgG, IgM) o porciones de las mismas (CH1 , CH2, CH3), albúmina, hemaglutinina (HA) o marcadores de epítopes de afinidad por myc útiles para la formación de inmunocomplejos para detección o purificación (pueden obtenerse comercialmente anticuerpos contra estas porciones), polipéptidos útiles para detección, tales como proteína fluorescente verde (GFP), enzimas tales como beta-galactosidasa (B-Gal) cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), luciferasa y fosfatasa alcalina (A), secuencias de señal para tráfico de proteínas, y secuencias de digestión por proteasa útiles para la separación de secuencias de aminoácidos adicionales de la secuencia del cCMR1 , si se desea. En otro aspecto, se proveen pruebas de diagnóstico que son capaces de detectar la expresión del cCMR1 , tales como una proteína o ácido nucleico del cCMR1. La expresión de las proteínas del cCMR1 puede ser detectada por una sonda, la cual es marcada detectablemente, o la cual puede marcarse subsiguientemente. Típicamente, la sonda es un anticuerpo que reconoce a ia proteína expresada, como se describió anteriormente, especialmente un anticuerpo monoclonal. Por consiguiente, en una modalidad, una prueba capaz de detectar la expresión de la proteína del cCMR1 comprende poner en contacto una muestra de tejido de canino con uno o más de un anticuerpo monoclonal y/o policlonal que se una al cCMR1. Ácidos nucleicos y proteínas del cCMR1 , anticuerpos dirigidos contra el CMR1 , y sistemas biológicos que contengan cualquiera de estos componentes, pueden ser marcados con un reactivo detectable, o un compuesto que tenga carácter específico por el cCMR1 puede ser marcado con un reactivo detectable, y puede usarse para detectar la entidad del cCMRL Reactivos detectables incluyen compuestos y composiciones que pueden detectarse por medio de técnicas espectroscópicas, bioquímicas, fotoquímicas, bioelectrónicas, inmunoquímicas, eléctricas, ópticas o químicas. Ejemplos de porciones detectables incluyen, pero no están limitados a, radioisótopos (por ejemplo, 32P 33P, 35S), compuestos quimioluminiscentes, proteínas de unión marcadas, átomos de metales pesados, marcadores espectroscópicos, tales como colorantes y marcadores fluorescentes, enzimas ligadas, marcadores de espectrometría de masa y marcas magnéticas. Métodos de inmunoensayo que usan anticuerpos incluyen, pero no están limitados a, dot blotting, Western blotting, pruebas de unión a proteína competitivas y no competitivas, pruebas de inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), ¡nmunohistoquímica, distribución de células activada por fluorescencia (FACS), inmuno-PCR, inmunoprecipitación, y otras que se usan comúnmente. El nivel de expresión de ARN mensajero que corresponda al gen del cCMR1 puede detectarse usando métodos de biología molecular usados comúnmente, por ejemplo, Northern blotting, hibridación in situ, pruebas de protección a nucleasa, RT-PCR (incluyendo PCR cuantitativa en tiempo real), disposiciones de alta densidad, y otros métodos de hibridación. Por consiguiente, en otra modalidad, se provee una prueba capaz de detectar la expresión de un gen o más de un gen del cCMR1 en una muestra de tejido de canino, que comprende poner en contacto una muestra de tejido de canino con un oligonucleótido capaz de hibridar con un ácido nucleico del'cCMRL El oligonucleótido iniciador tiene en general de 10 a 20 nucleótidos de longitud para experimentos de extensión del iniciador/PCR. Se usan más regularmente oligonucleótidos más largos de aproximadamente 40 a 50 nucleótidos, para hibridaciones in situ o blot. Pueden usarse también secuencias incluso más largas de 50 nucleótidos para el experimento de detección. Puede aislarse ARN de la muestra de tejido por medio de métodos bien conocidos por los expertos en la técnica como se describe, por ejemplo, en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1996). Un método preferido para la detección del nivel de ARN mensajero transcrito de los genes del cCMR1 , es por RT-PCR. Los detalles de las técnicas de RT-PCR son bien conocidos y se describen también en la presente. Otro método preferido para la detección del nivel de transcritos de ARN mensajero obtenidos de más de uno de los genes descritos, implica hibridación de ARN mensajero marcado con una disposición ordenada de oligonucleótidos o tejido. Dicho método permite que el nivel de transcripción de una pluralidad de estos genes se determine simultáneamente para generar perfiles o patrones de expresión génica. Los oligonucleótidos usados en este método de hibridación son unidos típicamente a un soporte sólido. Ejemplos de soportes sólidos incluyen, pero no están limitados a, membranas, filtros, portaobjetos, papel, nylon, obleas, fibras, perlas magnéticas o no magnéticas, geles, tubos, polímeros, platos de cloruro de polivinilo, etc. Puede usarse cualquier superficie sólida con la cual los oligonucleótidos pueden unirse, ya sea directamente o indirectamente, ya sea covalentemente o no covalentemente. Un substrato sólido particularmente preferido, es una disposición de alta densidad o chip de ADN. Estas disposiciones de alta densidad contienen una sonda de oligonucleótidos particular en un sitio preseleccionado en la disposición. Cada sitio preseleccionado puede contener más de una molécula de la sonda particular. Debido a que los oligonucleótidos están en sitios específicos sobre el substrato, los patrones e intensidades de hibridación (que en conjunto resultan en un perfil o patrón de expresión único) pueden interpretarse en términos de niveles de expresión de genes particulares. Las sondas de oligonucleótidos son de preferencia de longitud suficiente para hibridar específicamente sólo con transcritos complementarios de los genes de interés identificados anteriormente.

Opcionalmente, la secuencia de ácido nucleico del cCMR1 completa, o una porción de la misma, puede usarse para sondear preparaciones de ácido nucleico de otras especies para determinar la presencia de secuencias similares. Por ejemplo, el ácido nucleico del cCMR1 completo o una porción del mismo, puede usarse como una sonda para identificar secuencias de ácido nucleico genómico o ADNc de otras especies que sean similares a la secuencia del cCMRL Pueden identificarse clones positivos como los que hibridan con la sonda del cCMRL Además, la secuencia de polipéptidos o de ácido nucleico completa o una porción de la misma del cCMR1 , provista por la invención, puede usarse en programas asistidos por computadora para identificar otra información útil, por ejemplo, proteínas que tengan homología con la secuencia del cCMR1 , o moléculas que se unan a la secuencia del cCMR1. Por ejemplo, puede usarse la secuencia del cCMR1 completa o porciones de la misma, para seleccionar varias bases de datos electrónicas para determinar si un miembro de la base de datos electrónica tiene homología con la secuencia del cCMRL Numerosas bases de datos genéticas que son específicas de especie, pueden consultarse usando cualquier porción de las secuencias de polipéptidos o ácido nucleico de canino como se expone en la presente. Pueden realizarse búsquedas de ácidos nucleicos y proteínas, o de cualquiera de los mismos. En otro aspecto, puede determinarse y usarse un modelo tridimensional del polipéptido del cCMR1 para identificar moléculas que se unen a varias porciones de la estructura de la proteína. Por ejemplo, mediante el uso de un ácido nucleico del cCMR1 aislado como se describe en la presente, la proteína del cCMR1 puede ser expresada en un sistema de células, purificada y entonces cristalizada, para obtener información respecto a la estructura de la proteína. Puede obtenerse información de la estructura realizando, por ejemplo, espectroscopia de resonancia magnética nuclear o difracción de rayos X. El sitio de los residuos de aminoácido y sus cadenas laterales, puede expresarse como coordenadas en un modelo tridimensional. Esta información puede proveerse entonces a un programa de cómputo. Pueden usarse programas de elaboración de modelos moleculares para determinar si una molécula pequeña puede adaptarse en una porción funcionalmente relevante, por ejemplo, un sitio activo, del polipéptido del cCMRL Información básica sobre la elaboración de modelos moleculares se provee, por ejemplo, en M. Schiecht, Molecular Modeling on the PC, 1998, John Wiley & Sons; Gans et al., Fundamental Principáis of Molecular Modeling, 1996, Plenum Pub. Corp.; N. C. Cohén (editor), Guidebook on Molecular Modeling ¡n Drug Design, 1996, Academic Press; y W. B. Smith, Introduction to Theoretical Organic Chemistry and Molecular Modeling, 1996. Patentes de E.U.A. que proveen información detallada sobre la elaboración de modelos moleculares, incluyen las patentes de E.U.A. Nos. 6,093,573; 6,080,576; 5,612,894; y 5,583,973. Programas que pueden ser útiles para estudios de elaboración de modelos moleculares incluyen, por ejemplo, GRID (Goodford, P. J., "A Computational Procedure for Determining Energetically Favorable Binding Sites on Biologically Important Macromolecules". J. Med. Chem., 28, pp. 849-857, 1985), disponible de Oxford University, Oxford, Reino Unido; MCSS (Miranker, A. y M. Karplus, "Functionality Maps of Binding Sites: A Múltiple Copy Simultaneous Search Method". Proteins: Structure, Function and Genetics, 11 , pp. 29-34, 1991 ), disponible de Molecular Simulations, Burlington, Mass.; AUTODOCK (Goodsell, D. S. y A. J. Olsen, "Automated Docking of Substrates to Proteins by Simulated Annealing". Proteins: Structure. Function, and Genetics, 8, pp. 195-202, 1990); disponible de Scripps Research Institute, La Jolla, Calif.; y DOCK (Kuntz, I. D. eí al., "A Geometric Approach to Macromolecule-Ligand Interactions". J. Mol. Biol., 161 , pp. 269-288, 1982), disponible de University of California, San Francisco, CA. Además de secuencias de ácido nucleico que codifican para polipéptidos del cCMR1 , la invención incluye también polipéptidos del cCMR1 , variantes de polipéptidos del cCMR1 , fragmentos de polipéptidos del cCMR1 y polipéptidos del cCMR1 que tengan aminoácidos adicionales. Aspectos de polipéptidos del cCMR1 codificados por ácidos nucleicos se describen en la presente, y estos aspectos pueden aplicarse también a polipéptidos del cCMRL En una modalidad, la invención provee un polipéptido aislado que incluye la secuencia de SEQ ID NO: 2. En otra modalidad, la invención provee un polipéptido aislado que incluye la secuencia de SEQ ID NO: 2 que tiene aminoácidos variantes de la familia del CMR en menos de 4% de los residuos de aminoácido del cCMR1 originales. De preferencia, los polipéptidos del cCMR1 incluyen variantes de la familia del CMR en menos de aproximadamente 2% de los residuos de aminoácido del cCMR1 originales, y más preferiblemente menos de aproximadamente 1 % de los residuos de aminoácido del cCMR1 originales. Como se describe en la presente, el polipéptido del cCMR1 puede tener también residuos de aminoácido adicionales en su extremo amino, su extremo carboxilo, o ambos. Dichos residuos adicionales son útiles para una variedad de propósitos que incluyen, por ejemplo, inmunodetección, purificación, tráfico celular, actividad enzimática, etc. La invención provee también fragmentos del polipéptido del cCMR1. Fragmentos del polipéptido del cCMR1 pueden ser útiles para muchos propósitos que incluyen, por ejemplo, producción de anticuerpos. Pueden usarse porciones de la secuencia de polipéptidos del cCMR1 , o la secuencia entera misma, para generar anticuerpos anti-CMR1. En otro aspecto, la presente invención se refiere a anticuerpos que reconocen específicamente epítopes dentro de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Anticuerpos útiles incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados o quiméricos, y fragmentos de anticuerpo biológicamente funcionales que sean capaces de unirse a una porción de la proteína del cCMRL Anticuerpos específicos para proteínas codificadas por las secuencias mencionadas anteriormente, tienen utilidades en varios tipos de aplicaciones. Estos anticuerpos pueden usarse en equipos de diagnóstico, por ejemplo, para cualquier tipo de prueba en donde se desee la detección del cCMRL Pueden usarse también en la preparación de agentes terapéuticos, por ejemplo, en donde el anticuerpo anti-cCMR1 mismo sea terapéutico, o en donde el anticuerpo anti-cCMR1 sea acoplado a un agente terapéutico. Se anticipa que los anticuerpos anti-cCMR1 podrían usarse para el tratamiento del dolor. En estos casos, un anticuerpo anti-cCMR1 podría modular la actividad del cCMR1 , por ejemplo, proveyendo una actividad agonista (por ejemplo, catalítica) o antagonista. La invención provee también métodos para la producción de anticuerpos anti-cCMR1 monoclonales específicos de canino. Para la producción de estos anticuerpos monoclonales, pueden usarse péptidos que provean determinantes anti-cCMR1 únicos. Los anticuerpos monoclonales son poblaciones clónales homogéneas de anticuerpos que son dirigidos hacia un antígeno específico (es decir, epítope). Para preparar anticuerpos monoclonales anti-cCMR1 , se usa un péptido que tenga una secuencia específica del cCMR1 o un "epítope del cCMR1". Una secuencia del cCMR1 es una que es diferente en una o más posiciones respecto a las secuencias del CMR1 de perro, ratón y rata. Para determinar una secuencia específica del cCMR1 , puede hacerse referencia al cuadro 2 provisto en la presente. Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales (mAbs) por cualquier técnica que provea la producción de moléculas de anticuerpo por líneas de células continuas en cultivo. Estas incluyen, por ejemplo, la técnica de hibridomas (Kohler y Milstein, Nature, 256: 495-497, 1975); la técnica de hibridomas de células B humanas (Kosbor eí al., Immunology Today, 4: 72, 1983); y la técnica de hibridomas de EBV (Colé eí al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1985). Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina que incluya IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, o cualquier subclase de las mismas. El hibridoma que produzca el mAb de esta invención, puede cultivarse in vitro o in vivo. Para la producción de anticuerpos para la proteína del CMR1 , varios animales hospederos pueden ser inmunizados por inyección con el polipéptido del cCMR1 , o una porción del mismo. Si se usa el polipéptido del cCMR1 entero, pueden generarse anticuerpos específicos para el cCMR1 junto con anticuerpos anti-cCMR1 que reaccionen en forma cruzada con otras proteínas del CMR1 de diferente especie. Por ejemplo, las preparaciones de anticuerpos policlonales son una población heterogénea de moléculas de anticuerpo derivadas de los sueros de animales inmunizados con un antígeno, tal como el polipéptido del CMR1. En esta población policlonal, los anticuerpos reaccionarán en forma cruzada con diferentes porciones del polipéptido del CMR1 , siendo específicamente reactivos algunos de esos anticuerpos con el cCMR1 , y otros reaccionando en forma cruzada con polipéptidos del CMR1 de otra especie. Para la producción de anticuerpos policlonales, animales hospederos son inmunizados con la proteína del cCMR1 , o una porción de la misma, típicamente en forma repetida para reforzar el título del anticuerpo en el animal, y complementado típicamente con adyuvantes como se describe en la presente. Animales hospederos usados comúnmente para la producción de anticuerpos anti-cCMR1 incluyen conejos, ratones y ratas; sin embargo, pueden usarse otros animales si se desea. Pueden usarse varios adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie del hospedero, por ejemplo, adyuvante de Freund (completo e incompleto) y geles minerales tales como hidróxido de aluminio. Pueden incluirse también conjugados (por ejemplo, KLH) para la inmunización, especialmente en casos en donde se usen péptidos del cCMR1 más cortos para los propósitos de inmunización y producción de anticuerpos. Pueden generarse polipéptidos del cCMR1 o fragmentos de polipéptidos del cCMR1 , usando cualquier tipo de técnica de biología molecular o de síntesis. Pueden usarse técnicas estándar de síntesis de péptidos para generar fragmentos de polipéptidos del cCMR1 más cortos, por ejemplo, fragmentos de péptidos que tengan 30 aminoácidos de longitud, o más cortos. Técnicas para la síntesis de fragmentos de péptidos son bien conocidas y se describen, por ejemplo, en Barany y Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis; pp. 3-284 en The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods ¡n Peptide Synthesis, Parte A., Merrifield, et al., J. Am. Chem. Soc, 85: 2149-2156 (1963), y Stewart eí al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2a. ed. Pierce Chem. Co., Rockford, lll. (1984). Pueden usarse técnicas recombinantes para la expresión del cCMR1 que incluya, por ejemplo, porciones del cCMR1 , variantes y fusiones de células hospederas procarióticas o eucarióticas transformadas con un ácido nucleico del cCMR1. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro y recombinación genética in vivo (véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook eí al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a. edición, Cold Spring Harbor Press, NY (2001 ); y Ausubel eí al., eds., Short Protocols in Molecular Biology, 4a. edición, John Wiley & Sons, Inc., NY (1999)). Por lo tanto, puede producirse el cCMR1 , (a) proveyendo un ácido nucleico que comprenda una secuencia del cCMR1 , (b) insertando el ácido nucleico en una célula hospedera, y (c) manteniendo la célula hospedera bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido del cCMRL Cuando se desee un polipéptido del cCMR1 purificado, puede llevarse a cabo también un paso para aislar y, si se desea, purificar el polipéptido del cCMRL En otra modalidad, la invención provee una construcción de ácido nucleico heterólogo que incluye la secuencia codificante del cCMR1 entera o una porción de la misma, enlazada operablemente a una secuencia reguladora. Estas construcciones de ácido nucleico heterólogas incluyen vectores de expresión recombinantes adecuados para la expresión del ácido nucleico del cCMR1 en una célula hospedera. Los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, que pueden seleccionarse con base en el tipo de células hospederas usadas para la expresión del cCMR1 , enlazadas operablemente a la secuencia de ácido nucleico del cCMR1. Secuencias reguladoras incluyen promotores, intensificadores y otros elementos de control de la expresión, por ejemplo, secuencias de poli (A)+. Las secuencias reguladoras pueden ser específicas de células procarióticas, por ejemplo, células bacterianas tales como E. coli, o de células eucarióticas, tales como células de levadura, células de insecto o células de mamífero (por ejemplo, células HEK, CHO o COS). Las secuencias reguladoras pueden localizarse cis o trans respecto a la secuencia de ácido nucleico del cCMR1. Las secuencias reguladoras pueden incluir secuencias de expresión constitutivas que dirijan típicamente la expresión del ácido nucleico bajo una amplia variedad de condiciones de crecimiento y en una amplia variedad de células hospederas, secuencias reguladoras específicas de tejido que dirijan la expresión en células hospederas o tejidos particulares, y secuencias reguladoras inducibles que dirijan la expresión en respuesta a un factor secundario. La elección y el diseño del vector de expresión pueden depender de factores tales como la célula hospedera particular usada y los niveles deseados de expresión del polipéptido. Otros componentes del vector de expresión pueden incluir, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes de selección y una secuencia de terminación de la transcripción. Los genes de selección codifican para proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) proveen nutrientes críticos no disponibles de medios complejos. Las construcciones de ácido nucleico heterólogas usadas para la expresión del polipéptido del cCMR1 pueden incluir también construcciones que puedan ser transcritas y traducidas in vitro, por ejemplo, construcciones que tengan una secuencia reguladora del promotor T7. Vectores adecuados para la expresión del cCMR1 se conocen en la técnica y están disponibles comercialmente. Vectores adecuados incluyen, por ejemplo, pET-14b, pCDNAIAmp y pVL1392, que están disponibles de Novagen e Invitrogen y pueden usarse para expresión en E. coli, células COS y células de insecto infectadas con baculovirus, respectivamente. En otra modalidad, la invención provee una célula recombinante que incluye un ácido nucleico del cCMRL Células recombinantes incluyen aquellas en donde una secuencia de ácido nucleico ha sido introducida. Típicamente, se crean células recombinantes introduciendo un ácido nucleico particular en células usando técnicas de biología molecular. Sin embargo, las células recombinantes incluyen también células que hayan sido manipuladas de otras formas para promover la expresión de una secuencia de ácido nucleico deseada. Por ejemplo, regiones que estén próximas a una secuencia de ácido nucleico objetivo pueden ser alteradas para promover la expresión del ácido nucleico objetivo, o genes que actúen para regular la expresión de un ácido nucleico objetivo pueden introducirse en una célula. Las células recombinantes, después de periodos de crecimiento y división, pueden no ser idénticas a la célula precursora de partida; sin embargo, estas células son referidas aún como células recombinantes, y se incluyen dentro del alcance del término como se usa en la presente. Células hospederas adecuadas para albergar y proveer la maquinaria para la expresión del cCMR1 , incluyen células procarióticas y eucarióticas. Ejemplos de células hospederas procarióticas adecuadas, son eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, así como bacilos tales como B. subtilis, Pseudomonas y Streptomyces. Células eucarióticas, tales como hongos filamentosos o levaduras, son hospederos de clonación o expresión adecuados para vectores de expresión del cCMR1. Saccharomyces cerevisiae, conocida también como levadura de panificación, es un sistema de expresión que se usa comúnmente y ofrece una variedad de secuencias de promotor y de marcador seleccionables. Otros hongos o levaduras útiles como células hospederas incluyen Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Pichia pastoris, Candida, Neurospora crassa y Aspergillus nidulans. Pueden usarse muchas células hospederas eucarióticas superiores, que incluyen células de insecto, tales como células S2 de Drosophila y células Sf9 de Spodoptera, células de mamífero, tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñon de mono (COS), células de riñon de canino (MDCK), células de carcinoma cervical humano (HeLa) y células de riñon embrionario humano (HEK), así como células vegetales.

El crecimiento de las células hospederas transformadas, puede ocurrir bajo condiciones que se conocen en la técnica. Las condiciones dependerán en general de la célula hospedera y el tipo de vector usado. Condiciones adecuadas de inducción, tales como temperatura y químicos, pueden usarse y dependerán del tipo de promotor usado. Ejemplos de medios adecuados incluyen medio esencial mínimo ((MEM), RPMI-1640 y medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM). Pueden introducirse ácidos nucleicos, incluyendo construcciones de expresión, en células procarióticas o eucarióticas por medio de técnicas convencionales de transfección o transformación. Como se usa en la presente, se pretende que los términos "transformación" y "transfección" se refieran a una variedad de técnicas reconocidas en la materia para la introducción de una molécula de ácido nucleico extraña (por ejemplo, ADN) en una célula hospedera, que incluyen, co-precipitación con cloruro de calcio o fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrán, lipofección, biolística o electroporación. Métodos adecuados para la transformación o transfección de células hospederas pueden encontrarse en Sambrook, eí al. (citado anteriormente), y otros manuales de laboratorio. Las células de mamífero pueden ser transfectadas establemente con una construcción de expresión que tenga un marcador seleccionable y con el gen de interés. Típicamente, marcadores seleccionables para células de mamífero incluyen genes de resistencia a antibióticos, por ejemplo, genes que permitan que la célula transformada crezca en presencia de compuestos tales como G418, higromicina o metotrexato. Las células recombinantes pueden ser útiles para la producción de un polipéptido del cCMR1 para propósitos de purificación, o para estudios funcionales que incluyan al polipéptido del cCMR1. Por ejemplo, puede usarse una célula del cCMR1 recombinante para poner a prueba muchos compuestos para su capacidad para alterar la actividad del polipéptido del cCMR1. La célula del cCMR1 recombinante puede usarse también para probar cómo la alteración de varias propiedades del polipéptido del cCMR1 , por ejemplo, alterando la secuencia de aminoácidos del polipéptido del cCMR1 , afecta la actividad del cCMR1. Las células recombinantes que tengan una secuencia de ácido nucleico del cCMR1 , pueden usarse también para producir animales transgénicos no humanos. Un transgen es ADN exógeno que se integra en el genoma de una célula de la cual un animal transgénico se desarrolla, y que permanece en el genoma del animal maduro, dirigiendo de esta manera la expresión de un producto génico codificado en uno o más tipos de células o tejidos del animal transgénico. Por ejemplo, puede introducirse un ácido nucleico que contenga una secuencia de ácido nucleico del cCMR1 en una célula hospedera tal como un oocito fecundado o una célula madre embrionaria, usando una técnica adecuada, tal como microinyección. Estas células hospederas que contienen al cCMR1 pueden usarse entonces para crear animales transgénicos no humanos. Animales particularmente útiles incluyen ratones o ratas transgénicos que tengan un gen del cCMR1 , los cuales pueden tener también características físicas o genéticas que los hacen útiles para estudio como, por ejemplo, un modelo del dolor. Pueden usarse animales transgénicos del cCMR1 para identificar, seleccionar o poner a prueba compuestos potencialmente útiles, o compuestos conocidos que modulen la función o expresión del cCMRL Estos animales transgénicos pueden usarse también para estudiar la función del polipéptido del cCMR1 , alterando su secuencia de aminoácidos. Métodos para la generación de animales transgénicos por medio de manipulación de embriones y microinyección, en particular animales tales como ratones, han llegado a ser convencionales en la técnica y se describen, por ejemplo, en las patentes de E.U.A. Nos. 4,736,866 y 4,870,009, patente de E.U.A. No. 4,873,191 , y en Hogan, Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1986). Métodos para la construcción de vectores de recombinación homólogos y animales recombinantes homólogos, se describen además en Bradley (Current Opinión in Bio/Technology, 2: 823-829, 1991 ), y en la publicación del PCT Nos. WO 90/11354, WO 91/01140, WO 92/0968 y WO 93/04169. Pueden producirse también clones de los animales transgénicos no humanos descritos en la presente, de acuerdo a los métodos descritos en Wilmut eí al. (Nature, 385: 810-813, 1997), y en la publicación del PCT Nos. WO 97/07668 y WO 97/07669. En algunos casos, puede ser deseable reducir la cantidad del CMR1 presente en un sistema, por ejemplo, para poner a prueba el carácter específico de los compuestos que se sospecha son moduladores del CMR1. Los animales transgénicos o células recombinantes, como se describen en la presente, pueden manipularse para reducir la cantidad del CMR1 expresado o presente sobre su superficie. Por ejemplo, la célula puede incluir moléculas que reducen la cantidad de ARN del cCMR1 presente en la célula, reduciendo de esta manera la expresión de la proteína del cCMRL Moléculas adecuadas incluyen nucleótidos antisentido, ribozimas, moléculas de ARN de doble cadena, ARN de interferencia (ARNi) y agonistas o antagonistas. Puede usarse una variedad de métodos para la purificación del polipéptido del cCMRL Por ejemplo, puede llevarse a cabo purificación en crudo usando precipitación con sulfato de amonio, centrifugación u otras técnicas conocidas. Puede lograrse un grado de purificación mayor por medio de técnicas cromatográf icas adecuadas que incluyen, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de líquidos de alto rendimiento (CLAR), cromatografía de filtración en gel, cromatografía de interacción hidrofóbica y cromatografía de afinidad, por ejemplo, cromatografía de inmunoafinidad usando anticuerpos dirigidos contra la proteína del cCMR1. Si es necesario, pueden usarse pasos para el re-plegamiento de las proteínas del cCMR1 para obtener la conformación activa de la proteína cuando la proteína es desnaturalizada durante la síntesis intracelular, el aislamiento o la purificación. La invención abarca también equipos para la detección de la presencia de un polipéptido o ácido nucleico de la invención, en una muestra biológica (una muestra de prueba). Dicho equipo comprende de preferencia un vehículo compartimentado adecuado para contener en confinamiento estrecho por lo menos un contenedor. El vehículo puede contener medios de detección, tales como un antígeno marcado o substratos de enzima, o similares. Por ejemplo, el equipo puede comprender un compuesto marcado o agente capaz de detectar el polipéptido o ARN mensajero que codifique para el polipéptido, y medios para determinar la cantidad del polipéptido o ARN mensajero en una muestra (por ejemplo, un anticuerpo que se una al polipéptido o una sonda de oligonucleótidos que se una a ADN o ARN mensajero que codifique para el polipéptido). Los equipos pueden incluir también instrucciones para determinar si un sujeto de prueba está sufriendo de un trastorno asociado con la expresión aberrante del polipéptido, o está en riesgo de desarrollar el mismo, si la cantidad del polipéptido o ARN mensajero que codifica para el polipéptido está arriba o abajo de un nivel normal. Para equipos basados en anticuerpos, el equipo puede comprender, por ejemplo: (1) un primer anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo unido a un soporte sólido), que se una selectivamente a un polipéptido que comprenda una secuencia de aminoácidos que tenga por lo menos 96% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2 y, opcionalmente, (2) un segundo anticuerpo que se una al primer anticuerpo o el polipéptido al que el primer anticuerpo se une, pero en un epítope diferente, y el cual se conjuga con un agente detectable, y (3) una proteína del cCMR1 recombinante purificada como control positivo. De preferencia, el primer anticuerpo se une sólo a un cCMR1 , pero no a un CMR1 de otra especie, tal como humano, rata o ratón. Para equipos basados en oligonucleótidos, el equipo puede comprender, por ejemplo: (1 ) un oligonucleótido, por ejemplo, un oligonucleótido marcado detectablemente, que híbrida bajo condiciones severas con SEQ ID NO: 1 , o (2) un par de iniciadores útiles para amplificar una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene por lo menos 96% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2. El equipo puede comprender también, por ejemplo, un agente regulador de pH, un conservador o un agente estabilizador de proteínas. El equipo puede comprender también componentes necesarios para la detección del agente detectable (por ejemplo, una enzima o un substrato). El equipo puede contener también una muestra control o una serie de muestras control que puedan ponerse a prueba y compararse con la muestra de prueba. Cada componente del equipo está encerrado usualmente dentro de un contenedor individual, y todos los varios contenedores están contenidos de preferencia dentro de un sólo empaque. Debido a que el CMR1 es activado a temperaturas frescas a frías, y es expresado en tejido nervioso, este gen puede servir como un objetivo terapéutico para la identificación de fármacos útiles en el tratamiento de dolor, inflamación y trastornos de la piel, por ejemplo, los asociados con eritema solar y otros estados sensibilizados. Por lo tanto, en otro aspecto general, la presente invención se refiere al uso de ácidos nucleicos y proteínas del cCMR1 en métodos para la identificación de compuestos terapéuticos, por ejemplo, compuestos útiles en el tratamiento del dolor, modulando respuestas a temperaturas frías, y compuestos que provean una sensación fresca a la piel. Estos tipos de compuestos pueden identificarse usando un sistema que incluya un polipéptido del cCMR1 o un ácido nucleico del cCMRL Pueden ponerse a prueba también directamente in vivo compuestos en un sistema modelo animal, por ejemplo, un sistema modelo de rata, ratón o canino. Sistemas particularmente útiles incluyen modelos animales de dolor. Estos métodos comprenden poner a prueba la capacidad de varios compuestos para incrementar o disminuir la expresión de la proteína del cCMR1 , la conductividad del canal del cCMR1 , o las reacciones nociceptivas de un animal. Los métodos de identificación de los compuestos pueden llevarse a cabo usando formatos de laboratorio convencionales o en pruebas adaptadas para alto rendimiento. El término "alto rendimiento" se refiere a un diseño de prueba que permite la selección fácil de muestras múltiples simultáneamente y/o en sucesión rápida, y puede incluir la capacidad para manipulación robótica. Otro rasgo deseado de pruebas de alto rendimiento, es un diseño de prueba que sea optimizado para reducir el uso de reactivos, o que reduzca al mínimo el número de manipulaciones para lograr el análisis deseado. Ejemplos de formatos de prueba incluyen placas de 96 cavidades o de 384 cavidades, gotas levitantes, y chips de microcanales de "laboratorio en un chip" usados para experimentos de manejo de líquidos. Es bien sabido por los expertos en la técnica que conforme avancen la miniaturización de los moldes de plástico y los dispositivos para el manejo de líquidos, o conforme se diseñen dispositivos de prueba mejorados, pueden procesarse mayores números de muestras usando el diseño de la presente invención. Compuestos candidatos abarcan numerosas ciases de químicos que incluyen, pero no están limitadas a, pequeños compuestos orgánicos o inorgánicos, moléculas naturales o sintéticas tales como anticuerpos, proteínas o fragmentos de las mismas, nucleótidos antisentido, ARN de interferencia (ARNi) y ribozimas. De preferencia, son pequeños compuestos orgánicos, es decir, los que tienen un peso molecular mayor de 50, y sin embargo menor de aproximadamente 2500. Compuestos candidatos comprenden grupos químicos funcionales necesarios para interacciones estructurales con polipéptidos, e incluyen típicamente por lo menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, de preferencia por lo menos dos de los grupos químicos funcionales, y más preferiblemente por lo menos tres de los grupos químicos funcionales. Los compuestos candidatos pueden comprender estructuras heterocíclicas o de carbono cíclicas, y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales identificados anteriormente. Compuestos candidatos pueden ser también biomoléculas tales como péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteróles, isoprenoides, purinas, pirimidinas, derivados o análogos estructurales de los anteriores, o combinaciones de los mismos, y similares. En donde el compuesto sea un ácido nucleico, el compuesto es típicamente una molécula de ADN o ARN, aunque se contemplan también ácidos nucleicos modificados que tengan subunidades o enlaces no naturales.

Se obtienen compuestos candidatos de una amplia variedad de fuentes que incluyen colecciones de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, están disponibles numerosos medios para la síntesis aleatoria y dirigida de una amplia variedad de compuestos orgánicos y biomoléculas, que incluyen expresión de oligonucleótidos aleatorizados, colecciones combinatorias de moléculas orgánicas sintéticas, colecciones de exhibición de péptidos aleatorios de fagos, y similares. Pueden obtenerse también compuestos candidatos usando cualquiera de los numerosos procedimientos en métodos de colección combinatoria conocidos en la técnica, que incluyen colecciones biológicas; colecciones de fase en solución o fase sólida paralelas espacialmente dirigibles; métodos de colección de síntesis que requieren desconvolución, el método de colección "una perla, un compuesto"; y métodos de colección de síntesis que usan selección por cromatografía de afinidad (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145). En forma alternativa, colecciones de compuestos naturales en la forma de extractos de bacterias, hongos, plantas y animales, están disponibles o pueden producirse fácilmente. Además, pueden modificarse fácilmente compuestos y colecciones producidos en forma natural y sintéticamente a través de medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales. Además, pueden someterse agentes farmacológicos conocidos a modificaciones aleatorias o químicas dirigidas, tales como acilación, alquilación, esterificación, amidación, etc., para producir análogos estructurales de los agentes. Pueden seleccionarse aleatoriamente compuestos candidatos, o pueden basarse en compuestos existentes que se unen al CMR1 y/o que modulan la función de la actividad del mismo. Por lo tanto, una fuente de agentes candidatos es una o más de una colección de moléculas basadas en uno o más de un compuesto conocido que incrementa o disminuye la conductividad del canal del CMR1 , en donde la estructura del compuesto es cambiada en una o más posiciones de la molécula para que contenga más o menos porciones químicas o diferentes porciones químicas. Los cambios estructurales hechos a las moléculas en la creación de las colecciones de inhibidores/activadores análogos pueden ser dirigidos, aleatorios, o una combinación de sustituciones y/o adiciones dirigidas y aleatorias. El experto en la técnica de preparación de colecciones combinatorias, puede preparar fácilmente dichas colecciones con base en los compuestos existentes. Una variedad de otros reactivos puede incluirse también en la mezcla. Estos incluyen reactivos tales como sales, reguladores de pH, proteínas neutras (por ejemplo, albúmina), detergentes, etc., que pueden usarse para facilitar la unión óptima de proteína-proteína y/o proteína-ácido nucleico. Dicho reactivo puede reducir también interacciones no específicas o de base de los componentes de reacción. Pueden usarse también otros reactivos que mejoren la eficiencia de la prueba, tales como inhibidores de nucleasa, agentes antimicrobianos, y similares. Ejemplos de métodos para la síntesis de colecciones moleculares pueden encontrarse en la técnica, por ejemplo, en: Zuckermann eí al. (1994). J Med. Chem. 37: 2678. Colecciones de compuestos pueden presentarse en solución (por ejemplo, Houghten (1992) Biotechniques 13: 412-421 ), o sobre perlas (Lam (1991 ) Nature 354: 82-84), chips (Fodor (1993) Nature 364: 555-556), bacterias (patente de E.U.A. No. 5,223,409), esporas (patente No. 5,571 ,698), plásmidos (Culi eí al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sel. USA 89: 1865-1869) o fagos (véase, por ejemplo, Scott y Smith (1990) Science 249: 386-390). En un aspecto, la invención provee un método para identificar un compuesto que incrementa o disminuye la expresión de una proteína del cCMR1 , que comprende los pasos de: (a) poner en contacto un compuesto de prueba con una célula que comprende un mecanismo para regular la expresión de un gen del cCMR1 ; y (b) determinar si el compuesto de prueba incrementa o disminuye la expresión de un gen controlado por dicho mecanismo de la célula. El mecanismo para regular la expresión de un gen del cCMR1 incluye el mecanismo por el cual factores nucleares, citoplásmicos o intracelulares influyen sobre el control de la acción de los genes al nivel de transcripción o traducción. Por ejemplo, el mecanismo incluye activación génica o represión génica. La célula que comprende un mecanismo para regular la expresión de un gen del cCMR1 puede ser una célula hospedera nativa que exprese endógenamente el cCMR1 , tal como una célula del DRG de canino. La célula puede ser también una célula recombinante que contenga una secuencia de ADN recombinante que tenga una secuencia reguladora para un gen del cCMR1 , y la secuencia reguladora está enlazada operablemente a un gen, de preferencia un gen reportero. El efecto del compuesto sobre la expresión de un gen controlado por la secuencia reguladora del CMR1 , puede medirse a través de una variedad de medios. Por ejemplo, el efecto puede medirse por medio de la cantidad de ARN mensajero o proteína del gen de la célula, o por medio de la actividad del producto génico de la célula. Cuando se usa un gen reportero, el efecto puede medirse como el nivel de producto del gen reportero de la célula. Por ejemplo, cuando la secuencia reguladora del CMR1 está enlazada operablemente a un gen de GFP, el efecto del compuesto sobre la expresión génica puede medirse como el efecto del compuesto sobre emisiones de fluorescencia verde de la célula usando un fluorómetro. Cuando se usa una célula del cCMR1 endógena, el efecto del compuesto sobre la expresión génica puede medirse por medio de la cantidad de ARN mensajero o proteína del cCMR1 dentro de la célula, usando los métodos que se describen más adelante (es decir, Northern Blot, RT-PCR, SDS-PAGE, Western Blot, ¡nmunohistoquímica o inmunocitoquímica, unión de ligando a radiorreceptor, etc.). En forma alternativa, la conductividad del canal del cCMR1 puede usarse para medir el efecto del compuesto sobre la expresión de la proteína del cCMRL El método basado en células que se describe en la presente, no sólo identifica compuestos que regulan directamente la expresión del cCMR1 por medio de unión a una o más de una secuencia reguladora del gen del cCMR1 , sino identifica también compuestos que regulan indirectamente la expresión del cCMR1 por medio de unión a otros componentes celulares cuyas actividades influyen sobre la expresión del cCMR1 o la estabilidad de la proteína. Por ejemplo, pueden identificarse compuestos que regulen la actividad de un activador o inhibidor de la transcripción para genes del cCMR1 , usando el método descrito en la presente. Pueden identificarse también compuestos que regulen la actividad de una proteasa que degrade la proteína del cCMR1 in vivo. La invención provee también un método para identificar un compuesto que incrementa o disminuye la conductividad de un canal iónico del cCMR1 , que comprende los pasos de: (a) poner en contacto un compuesto de prueba con el canal ¡ónico; y (b) determinar si el compuesto de prueba incrementa o disminuye la conductividad del canal ¡ónico. En algunas modalidades, el canal ¡ónico del cCMR1 se expresa sobre la superficie de la célula hospedera. La célula puede ser una célula hospedera nativa para el cCMR1 que exprese endógenamente el cCMR1 , por ejemplo, una célula del DRG o el TG de perro. La célula puede ser también una célula hospedera recombinante para el cCMR1 , por ejemplo, una célula CHO o COS que exprese un cCMR1 en forma recombinante. En algunas otras modalidades, el canal iónico del cCMR1 se asocia con una preparación de membrana aislada. La preparación de membrana puede aislarse de una célula hospedera nativa que exprese el cCMR1 sobre su superficie celular, o de una célula hospedera recombinante que exprese el cCMR1 sobre su superficie celular. Puede prepararse también de membranas biológicas, tales como la membrana tisular, membrana plasmática, membrana celular o membrana de organelo interno que comprenda el canal del cCMRL Los expertos en la técnica conocen métodos para el aislamiento y preparación de preparaciones de membranas biológicas. Por ejemplo, dicho método puede incluir los pasos de disolución mecánica o enzimática del tejido o las células, centrifugación para separar las membranas de otros componentes, y resuspensión de las vesículas o fragmentos de membrana en una solución de regulador de pH adecuada. En forma alternativa, la preparación que contiene membrana puede derivarse también de membranas artificiales. Puede reconstituirse una proteína del cCMR1 purificada en bicapas lipídicas para formar las vesículas de membrana artificial (véase Chen eí al., 1996, J. Gen. Physiol. 108: 237-250). Dicho tipo de vesícula de membrana puede ser muy específico para el canal de interés, evitando el problema de contaminación con otros canales. Los expertos en la técnica conocen métodos para preparar vesículas de membrana artificiales. En algunas modalidades, vesículas de membrana que comprendan el cCMR1 pueden proveer un formato más fácil para las pruebas y métodos de la invención, debido a que la lisis de células y/o el esfuerzo cortante no son nada menos que un problema durante la prueba. Sin embargo, en otras modalidades, se prefieren células que expresen el cCMR1 , por ejemplo, cuando el procedimiento de preparación de la membrana celular destruye o inactiva el canal de interés. El compuesto de prueba puede evaluarse para su capacidad para incrementar o disminuir la conductividad de iones de un canal del cCMRL Los expertos en la técnica conocen métodos para medir la conductividad de un canal del CMR1 , por ejemplo, por medio de estimulación de la despolarización celular o un incremento en los niveles de ion calcio intracelular. El nivel de calcio intracelular puede evaluarse usando un indicador fluorescente sensible al ion calcio, tal como un colorante fluorescente sensible al ion calcio. Colorantes fluorescentes sensibles al ion calcio adecuados incluyen, por ejemplo, quin-2 (véase, por ejemplo, Tsien eí al., J Cell Biol, 94: 325, 1982), fura-2 (véase, por ejemplo, Grynkiewicz et al., J Biol Chem., 260: 3440, 1985), fluo-3 (véase, por ejemplo, Kao eí al., J Biol. 43 Chem., 264: 8179, 1989) y rhod-2 (véase, por ejemplo, Tsien eí al., J Biol. Chem., Abstract 89a, 1987). Colorantes fluorescentes sensibles al ion calcio adecuados están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Molecular Probes (Eugene, OR). Puede monitorearse también la fluorescencia celular usando un fluorómetro o un citómetro de flujo que tenga una lámpara y detector de fluorescencia. Los canales de cationes del cCMR1 funcionan para transportar no sólo cationes divalentes, por ejemplo, Ca++, sino también cationes monovalentes, por ejemplo, Na+ o K+. Por lo tanto, pueden llevarse a cabo también pruebas para determinar cambios en el transporte de cationes monovalentes para medir la conductividad de un canal del cCMR1. Colorantes sensibles a Na+ y K+ se conocen en la técnica y están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Molecular Probes (Eugene, OR).

La conductividad de un canal del cCMR1 puede medirse también por medio de técnicas electrofisiológicas tales como pinchamiento de membrana. Las técnicas de pinchamiento de membrana se usan habitualmente para el estudio de las actividades eléctricas en células, membranas celulares y tejidos aislados. Implican la formación de un sello de alta resistencia eléctricamente hermético entre una micropipeta y la membrana plasmática. La corriente que fluye a través de los canales iónicos individuales dentro de la membrana plasmática puede medirse entonces. Diferentes variantes de las técnicas permiten que diferentes superficies de la membrana plasmática sean expuestas al medio de inmersión. Las cuatro variantes más comunes incluyen pinchamiento en la célula, pinchamiento de adentro hacia fuera, pinchamiento de extremo afuera y sujeción de célula entera. Se usa comúnmente un método de pinchamiento de membrana con una fijación de voltaje que controla el voltaje a través de la membrana y mide el flujo de corriente. Durante el procedimiento de fijación de voltaje, se inserta un microelectrodo en una célula, y se inyecta corriente a través del electrodo para mantener el potencial de la membrana celular a cierto nivel predefinido. Puede usarse también un método de pinchamiento de membrana con métodos de fijación de corriente, en los cuales la corriente es controlada y se mide el voltaje. Las pruebas para identificar un compuesto que disminuye la conductividad del canal del cCMR1 se (levan a cabo de preferencia bajo condiciones en las cuales el canal iónico particular es activado. Por ejemplo, dichas pruebas pueden llevarse a cabo a una temperatura a la cual el CMR1 es activado. Estudios de registros de pinchamiento de membrana de células enteras, indicaron que el cCMR1 es activado a temperaturas frescas a aproximadamente 17°C (ejemplo 7, más adelante), o abajo de esta temperatura. En forma alternativa, dichas pruebas pueden llevarse a cabo en presencia de un compuesto que active el cCMR1 , tal como el compuesto refrescante mentol o icilina, o el compuesto punzante aceite de mostaza. Además, dicha prueba puede llevarse a cabo en condiciones cuando el canal del cCMR1 es despolarizado, tal como sujetando el canal en un potencial despolarizado. A la inversa, cuando se busca identificar un compuesto que incremente la conductividad del canal del cCMR1 , se ajustan de preferencia las condiciones de prueba en donde el canal del cCMR1 no sea activo o de otra manera sea bloqueado. Por ejemplo, dichas pruebas pueden llevarse a cabo a una temperatura no de activación del CMR1. A diferencia del CMR1 de rata que es aún activo a temperatura ambiente, el cCMR1 es inactivado a temperatura ambiente (ejemplo 7 más adelante). En forma alternativa, dichas pruebas pueden llevarse a cabo en presencia de un compuesto que disminuya la conductividad del canal del cCMRL Además, dichas pruebas pueden llevarse a cabo en presencia de Ca2+ extracelular que sea suficiente para desensibilizar el canal del cCMRL El experto en la técnica es capaz de determinar la concentración adecuada de Ca2+ extracelular que sea suficiente para desensibilizar el canal del cCMR1 por medio de experimentación de rutina. Además, dichas pruebas pueden llevarse a cabo en condiciones cuando el canal del cCMR1 sea hiperpolarizado, tal como sujetando el canal a un potencial hiperpolarizado. Las pruebas para la identificación de moduladores del cCMR1 pueden llevarse a cabo manualmente o usando un sistema automatizado. Se prefieren sistemas automatizados si se llevan a cabo selecciones de alto rendimiento. Por ejemplo, un tipo de sistema automatizado usa placas de cultivo de cavidades múltiples, por ejemplo, placas de cultivo de 96 cavidades, 384 cavidades o 1536 cavidades, en donde cada cavidad contiene células recombinantes que tienen un ácido nucleico que codifica para la proteína del cCMRL La placa es cargada en un fluorómetro, por ejemplo, el FlexStation™ (de Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA), que puede medir el flujo de calcio y/o el potencial de membrana de las células en cada una de las cavidades. Soluciones que contengan el colorante indicador fluorescente sensible al ion calcio o compuestos de prueba, pueden añadirse automáticamente a cada una de las cavidades. La temperatura en el fluorómetro puede controlarse de acuerdo al tipo de prueba que se esté realizando, por ejemplo, pueden ajustarse las temperaturas a una temperatura arriba de la temperatura de activación del CMR1 , por ejemplo, arriba de 28°C, para poner a prueba compuestos que se sospecha son agonistas del CMR1. Asimismo, pueden ajustarse las temperaturas a una temperatura de activación del CMR, por ejemplo, a 28°C o debajo de esta temperatura, para poner a prueba compuestos que se sospecha son antagonistas del CMR1. Después de que el canal del CMR1 ha sido activado y permite el influjo de cationes (tales como iones Ca++), la acumulación intracelular de iones Ca++ promueve una realimentación negativa e inactivación del canal del CMR1. El CMR1 llega a ser reactivado después de que los niveles del Ca++ intracelular disminuyen, por ejemplo, siendo expulsado el Ca++ de la célula o absorbido en organelos intracelulares. Aunque el canal del CMR1 puede permitir el influjo de iones Ca++ en respuesta a temperaturas frescas a frías, es en cierto modo un canal iónico permeable. Algunos canales del CMR1 permitirán el influjo de iones Ca++ incluso a temperaturas no de activación, por ejemplo, a arriba de 28°C. En sistemas de prueba convencionales, se usan típicamente concentraciones de Ca++ extracelulares en la escala de mM, lo cual puede llevar a la acumulación intracelular de calcio incluso a temperaturas no de activación, causando la inactivación del CMR1 por realimentación negativa. Por lo tanto, otro aspecto de la invención es un método para identificar un compuesto que incrementa o disminuye la conductividad de un canal iónico del CMR1 de mamífero, que comprende los pasos de: (a) incubar el canal iónico en una solución de regulador de pH que contenga una cantidad de sub-inactivación de calcio; (b) activar el canal iónico; (c) poner en contacto el canal iónico con un compuesto de prueba; (d) incrementar la cantidad de calcio en la solución de regulador de pH; y (e) determinar la cantidad de calcio intracelular, y comparar la cantidad con la de un control, en donde el canal iónico no fue puesto en contacto con el compuesto de prueba. Una "cantidad de sub-inactivación de calcio", es la cantidad de Ca++ extracelular que no causaría la acumulación intracelular de iones Ca++ a un grado que promueva una realimentación negativa e inactivación del canal del CMR1. El experto en la técnica puede determinar experimentalmente la "cantidad de sub-inactivación de calcio" para un canal del CMR1 particular. En algunas modalidades, la "cantidad de sub-inactivación de calcio" es esencialmente 0 calcio en la solución de regulador de pH. En otras modalidades, la "cantidad de sub-inactivación de calcio" está en la escala de µM de calcio en la solución de regulador de pH. El método de la invención incluye un método, que comprende los pasos (a) a (e) como se describe en la presente, en donde el paso (c) precede al paso (b). Después de que se ha identificado un compuesto que satisface los criterios deseados para la modulación de la actividad o expresión del CMR1 , el compuesto puede administrarse entonces a animales vivos. Esto puede ser útil para establecer toxicidad y otros parámetros farmacológicos importantes para el establecimiento de regímenes de dosificación. Por ejemplo, después de que se identifica un compuesto usando un sistema ex vivo que contiene un polipéptido del cCMR1 , el compuesto puede administrarse a un perro para examinar varios aspectos farmacológicos del compuesto en el perro. Los sistemas del cCMR1 , como se describen en la presente, son particularmente ventajosos para la identificación y el establecimiento de regímenes de dosificación en humanos, debido a que perros, particularmente de razas grandes, tienen un peso más aproximado al de los humanos en comparación con ratas o ratones, y proveen por lo tanto un modelo animal más adecuado para la estimación de la dosificación en humanos. El compuesto puede administrarse también a animales para evaluar la capacidad del compuesto para alterar procesos nociceptivos. Existen varios modelos animales de dolor, por ejemplo, el modelo de ligación de nervio espinal (SNL) de lesión nerviosa, que es un modelo de dolor neuropático en ratas, desarrollado por Kim y Chung (Pain, 50: 355-363, 1992). Otros modelos animales adecuados de dolor pueden usarse con relación a las enseñanzas de la presente. Modelos de dolor neuropático en roedores estudiados comúnmente, incluyen el modelo de lesión por constricción crónica (CCI) o de Bennett; modelo de neuroma o axotomía; y el modelo de transección ciática parcial o modelo de Seltzer (Shir eí al., Neurosci. Lett., 115: 62-67, 1990). Ejemplos de modelos de dolor neuropátíco incluyen varias preparaciones de lesión nerviosa traumática (Bennett eí al., Pain 33: 87-107, 1988; Decosterd et al, Pain 87: 149-58, 2000; Kim et al, Pain 50: 355-363, 1992; Shir eí al, Neurosci Lett 115: 62-7, 1990), modelos de neuroinflamación (Chacur eí al, Pain 94: 231-44, 2001 ; Milligan eí al, Brain Res 861 : 105-16, 2000), neuropatía diabética (Calcutt eí al, Br J Pharmacol 122: 1478-82, 1997), neuropatía inducida por virus (Fleetwood-Walker eí al, J Gen Virol 80: 2433-6, 1999), neuropatía por vincristina (Aley et ai, Neuroscience 73: 259-65, 1996; Nozaki-Taguchi et al, Pain 93: 69-76, 2001 ), y neuropatía por paclitaxel (Cavaletti eí al, Exp Neurol 133: 64-72, 1995), así como modelos de pruebas nociceptivas agudas y modelos de inflamación (Brennan, TJ. eí al. Pain 64: 493, 1996; D'Amour, F. E. y Smith, D. L. J Pharmacol: 74-79, 1941 ; Eddy, N. B. eí al. J Pharmacol Exp Ther 98: 121 , 1950; Haffner, F. Dtsch Med Wochenschr 55: 731 , 1929; Hargreaves, K. eí al. Pain 32: 77-88, 1988; Hunskaar, S. eí al. J Neurosci Meth 14: 69, 1985; Randall, L. O. y Selitto, J. J. Arch. Int. Pharmacodyn 111 : 409-419, 1957; Siegmund, E. eí al. Proc Soc Exp Bio Med 95: 729, 1957). Por lo tanto, en otra modalidad, la invención provee un método para identificar un compuesto útil para el tratamiento de dolor, el cual comprende los pasos de: (a) poner en contacto un compuesto de prueba con un canal iónico del cCMR1 ; y (b) determinar si el compuesto de prueba incrementa o disminuye la conductividad del canal iónico. En algunas modalidades, el método comprende además los pasos de: (a) administrar el compuesto de prueba a un animal; y (b) determinar el grado al cual el compuesto de prueba altera la respuesta nociceptiva/nocifensiva del animal. En algunas modalidades, el modelo animal de dolor implica un roedor, por ejemplo, una rata o ratón; en otro aspecto, el modelo animal de dolor implica un perro, por ejemplo, la prueba de sacudida de la piel (Kameriing eí al. Pharmacol Biochem. Behav. 17: 733-740, 1982; véase también Burns JC et al. Perspect Biol Med. Autumn; 35(1 ): 68-73, 1991). La eficacia terapéutica y la toxicidad pueden determinarse por medio de procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos de células o animales experimentales calculando, por ejemplo, la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población) y la LD50 (la dosis letal para 50% de la población). La relación de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, y puede expresarse como la relación LD50/ED50. Los datos obtenidos de pruebas del cultivo de células usando estudios en animales y del CMR1 recombinante, tales como estudios en caninos, se usan en la formulación de una escala de dosificación para uso en humanos. La dosificación contenida en dichas composiciones da lugar de preferencia a una escala de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación varía dentro de esta escala, dependiendo de la forma de dosificación usada, la sensibilidad del paciente y la vía de administración. La dosificación exacta será determinada por quien administre la dosis, a la luz de factores relacionados con el sujeto que requiere tratamiento. La dosificación y administración se ajustan para proveer niveles suficientes del agente activo, o para mantener el efecto deseado, por ejemplo, alivio efectivo del dolor. Factores que pueden tomarse en cuenta incluyen la severidad del dolor y otros factores, que incluyen la salud general del sujeto, la edad, peso y género del sujeto, dieta, hora y frecuencia de administración, combinaciones de fármacos, sensibilidades de reacción y respuesta/tolerancia a la terapia. Las composiciones farmacéuticas que contienen un compuesto que se ha identificado modula la actividad del CMR1 , pueden administrarse por cualquier número de vías que incluyen, pero no están limitadas a, las vías oral, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intraarterial, intramedular, intratecal, epidural, intraventricular, transdérmica, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, entérica, tópica, sublingual, por inhalación, intraocular, intraaural o rectal. Además de estos ingredientes activos, estas composiciones farmacéuticas pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados que comprendan excipientes y auxiliares que faciliten el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que puedan usarse farmacéuticamente, o que faciliten la absorción o distribución de los compuestos activos. Más detalles sobre técnicas para formulación y administración pueden encontrarse en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA. Pueden formularse composiciones farmacéuticas para administración oral usando vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica, en dosificaciones adecuadas para administración oral. Dichos vehículos permiten que las composiciones farmacéuticas sean formuladas como tabletas, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones acuosas espesas, suspensiones, y similares, para ingestión por el paciente.

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En resumen, se añadieron 150 µl de agua libre de ribonucleasa, 250 µl de regulador de pH OBB [Tris a 20 mM, pH 7.5, NaCI a 1 M, EDTA a 2 mM y SDS a 0.2%] y 15 µl de una suspensión de perlas Oligotex, a 100 µl de solución de ARN total (1 µg/µl). La mezcla de ARN/perlas Oligotex se calentó entonces a 70°C por 3 minutos para disolver cualquier estructura secundaria del ARN, seguido de incubación a temperatura ambiente por 10 minutos. El complejo de ARN de poli(A+)/partículas Oligotex se centrifugó y se lavó dos veces con 400 µl de regulador de pH OW2 [Tris a 10 mM, pH 7.5, NaCI a 150 mM y EDTA a 1 mM], y se transfirió entonces a una columna de centrifugación para el paso de elución. El ARN de poli(A+) se eluyó de las perlas Oligotex usando 200 µl de regulador de pH OEB precalentado (70°C) [Tris a 5 mM, pH 7.5]. Por último, se precipitó ARN de poli(A+) del DRG de canino usando etanol en presencia de 20 µg de glucógeno y acetato de sodio a 150 mM, y se resuspendió en 10 µl de agua libre de ribonucleasa.

B. Síntesis de ADNc de doble cadena 4 µl (1 µg) de ARN de poli(A+) del DRG de canino y 1 µl de iniciador de síntesis de ADNc, un oligómero de 52 elementos con secuencia 5'-TTCTAGAATTCAGCGGCGC(T)3oN-?N-3\ N.1 = G, A o C; y N = G, A, C o T (Clontech, CA SEQ ID NO: 10), se mezclaron, se incubaron a 70°C por 2 minutos, y se enfriaron entonces sobre hielo por 2 minutos. La síntesis de ADNc de la primera cadena (transcripción inversa) se llevó a cabo a 42°C por 1 hora usando 20 unidades de transcriptasa inversa AMV en presencia de mezcla de dNTP a 1 mM y regulador de pH de síntesis de la primera cadena (Tris a 50 mM, pH 8.5, MgCI2 a 8 mM, KCl a 30 mM y DTT a 1 mM) en 10 µl. La síntesis de ADNc de la segunda cadena se llevó a cabo añadiendo un coctel de enzimas que consistía de 24 unidades de ADN polimerasa I de £. coli, 5 unidades de ADN ligasa de E. coli, 1 unidad de ribonucleasa H de E. coli, 0.25 mM de mezcla de dNTP (0.25 mM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP), y regulador de pH de la segunda cadena (KCl a 100 mM, sulfato de amonio a 10 mM, MgCI2 a 5 mM, ß-NAD a 0.15 mM, Tris a 20 mM, pH 7.5 y 50 µM/ml de albúmina de suero de bovino) en 80 µl. La reacción se llevó a cabo primero a 16°C por 90 minutos, seguida de la adición de 20 unidades de ADN polimerasa T4 con incubación continua, a la misma temperatura por 45 minutos. La reacción concluyó añadiendo EDTA a 10 mM y 8 µg de glucógeno. Se realizaron extracciones de fenol y cloroformo, seguidas de precipitación con etanol. Se suspendió entonces ADNc de doble cadena en 200 µl de regulador de pH de TE, y se almacenó a -20°C.

C. Amplificación por PCR del extremo carboxilo cercano del CMR1 de perro Una porción de la secuencia del cCMR1 se amplificó exitosamente por PCR usando dos iniciadores designados como cmr1-23 (51-ttcatctgggccattcttcag-3' (SEQ ID NO: 3), que híbrida con los nucleótidos 1761-1781 de SEQ ID NO 1 y cmr1-26 (5'-cacagtggcttggactcatt-3' (SEQ ID NO: 4), que híbrida con los nucleótidos 2868-2886 de SEQ ID NO 1. La reacción de PCR se llevó a cabo en un volumen final de 50 µl, que contenía 5 µl de ADNc de doble cadena del DRG de canino, 5 µl de 10X regulador de pH de reacción provisto con ADN polimerasa Advantage2, dNTPs a 200 µM, iniciador delantero cmr1-23 a 200 nM, iniciador inverso cmr1-26 a 200 nM y 1 µl de 50X de mezcla de ADN polimerasa Advantage™ HF2 (Clontech, CA). Se llevó a cabo PCR por medio de un paso de desnaturalización inicial a 94°C por 1 minuto, seguido de 3 ciclos de: (a) desnaturalización a 94°C por 30 segundos, (b) unión a 55°C por 30 segundos y (c) extensión a 72°C por 60 segundos. Se llevó a cabo electroforesis en gel de agarosa, que reveló que el producto de PCR tenía aproximadamente 1.1 kb. Después de la PCR, el fragmento de PCR de 1.1 kb fue purificado y subclonado con pPCRscript (Stratagene), siguiendo el protocolo del vendedor. Dos clones independientes se seleccionaron y se sometieron a análisis de secuenciación de ADN. Los resultados de secuencia revelaron que el fragmento amplificado por PCR era 83%, 84% y 87% idéntico a los extremos carboxilo cercanos del CMR1 de ratón, rata y humano, respectivamente.

D. RACE-PCR de extremos 5' y 3' de la secuencia del cCMR1 Para obtener las secuencias de ADNc 5' y 3' completas del gen del C-CMR1 , se llevó a cabo tecnología de RACE-PCR. Primero, se sintetizaron por separado moléculas de ADNc RACE-Ready 5' y 3' con equipo de amplificación de ADN de RACE SMART™ (BD Clontech, CA), de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Para preparar ADNc para RACE 5', en un tubo de 0.5 ml se mezclaron 3 µl de ARN de poli(A+) del DRG de perro obtenido en A. con 1 µl de iniciador de CDS 5' y 1 ml de oligómero SMART II A. Para preparar ADNc para RACE 3', se mezclaron 3 µl de ARN de poli(A+) del DRG de perro con 1 µl de iniciador CDS 3' y 1 µl de agua libre de ribonucleasa en otro tubo de 0.5 ml, y se incubaron entonces a 70°C por 2 minutos, seguido de enfriamiento sobre hielo por 2 minutos. Después, se añadieron a cada tubo 2 µl de 5X regulador de pH de la primera cadena, 1 µl de DTT a 20 mM, 1 µí de mezcla de dNTP a 10 mM y 1 µl de transcriptasa inversa PowerScript, y la síntesis se llevó a cabo a 42°C por 90 minutos. Las reacciones se interrumpieron añadiendo 200 µl de regulador de pH de TE, y calentando la muestra a 72°C por 7 minutos. Los productos de reacción se almacenaron a -20°C. Para RACE-PCR, se sintetizaron dos iniciadores basados en la secuencia de ADNc de 1.1 kb proximal a la porción 5' del ADNc del cCMRL El iniciador delantero para RACE 3'-PCR fue nombrado como dcmr1-3, y tuvo la siguiente secuencia: 5'-GCCCATCGACAAGCACAAGAAGATC-3' (SEQ ID NO: 5), que híbrida con los nucleótidos 2213-2237 de SEQ ID NO: 1 (cadena complementaria); el iniciador inverso para RACE 5'-PCR fue nombrado como dcmr-1 , y tuvo la siguiente secuencia: d'-GATCTTCTTGTGCTTGTCGATGGG C-3' (SEQ ID NO: 6), que híbrida con los nucleótidos 2213-2237 de SEQ ID NO: 1. Ambas PCRs RACE 5' y 3' se llevaron a cabo en un volumen final de 50 µl que contenía 5 µl de molde de ADNc (ADNc RACE 5' o 3' -Ready, como se describió anteriormente), 5 µl de 10X regulador de pH de reacción, dNTPs a 200 µM, mezcla de iniciadores universales a 200 nM (UPM) (Cíontech), SEQ ID NO: 7 (5'-CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC-3'), iniciador específico del cCMR1 a 200 nM (dcmr1-1 para PCR RACE 5' o dcmr1-3 para PCR RACE 5') y 1 µl de 50X de mezcla de ADN polimerasa Advantage™-HF2 (Clontech). Los parámetros del ciclizador térmico para la RACE-PCR fueron: a) desnaturalización inicial a 94°C por 2 minutos; b) 5 ciclos de: 94°C por 30 segundos, 72°C por 3 minutos; c) 5 ciclos de: 94°C por 30 segundos, 70°C por 30 segundos, 72°C por 3 minutos; y d) 25 ciclos de 94°C por 5 segundos, 68°C por 30 segundos, 72°C por 3 minutos. Después de la reacción, los productos de RACE-PCR fueron purificados, pulidos y subclonados directamente en pPCRscript. Se seleccionaron cuatro clones independientes de RACE 5' o RACE 3', y se sometieron a análisis de secuenciación de ADN.

Secuencia de ADNc del cCMR1 de longitud completa La secuencia de ADNc del CMR1 de canino de longitud completa, se confirmó sintetizando iniciadores de PCR basados en la secuencia de los extremos 5' y 3' obtenidos por RACE-PCR. Se amplificó ADNc del cCMR1 de longitud completa a partir de moléculas de ADNc de doble cadena del DRG de canino preparadas en B. por ADN polimerasa de alta fidelidad con el iniciador delantero dcmr1-7, el cual tenía la siguiente secuencia 5'-AAGCTTCAT ATG TCC TTC GAG GGG GCC AGG CTC AGC ATG AGG AA-3' (SEQ ID NO: 8) y el iniciador inverso dcmr1-7, el cual tenía la siguiente secuencia: 5'-CTCGAG CTA TTT GAT TTT ATT AGC GAT CTC TTT CAG AAG GCCC-3' (SEQ ID NO: 9). La PCR se llevó a cabo en un volumen final de 50 µl que contenía 5 µl de moléculas de ADNc de doble cadena del DRG de perro, 5 µl de 10x regulador de pH de reacción, dNTP a 200 µM, iniciador delantero dcmr1-7 a 200 nM, iniciador inverso dcmr1-8 a 200 nM y 1 µl de 50x de mezcla de ADN polimerasa Advantage™-HF2 (Clontech, CA).

Los parámetros de la reacción de PCR fueron: 1 ciclo: desnaturalización inicial a 94°C por 2 minutos; 35 ciclos: a) desnaturalización a 94°C por 30 segundos, b) unión y extensión a 70°C por 5 minutos. Después de la PCR, el fragmento de PCR de 3.4 kb fue purificado y subclonado en pPCRscript siguiendo el mismo protocolo de clonación como en C. Se seleccionaron cuatro clones independientes y se sometieron a análisis de secuenciacíón de ADN. El clon NQC562 se usó para más subclonación y realización de estudios. Los resultados de secuencia revelaron que la secuencia de ácido nucleico del ADNc del cCMR1 (nucleótidos 69-3380 de SEQ ID NO: 1 ) fue 86.2%, 86.6% y 90.9% idéntica a las secuencias de ADNc del CMR1 de ratón (número de acceso: AY095352), rata (número de acceso: AY072788) y humano (número de acceso: NM_024080), respectivamente.

F. Análisis de secuencia La RACE 5' y 3'-PCR permitió la determinación de la secuencia de 68 nucleótidos de la región no traducida 5'; la RACE 3'-PCR permitió la determinación de los 431 pb de la región no traducida 3', incluyendo la cola de poli(A+) de 37 elementos. No se identificó codón de detención alguno en el marco de lectura. El marco de lectura abierto del cCMR1 predicho consiste de una secuencia de 3315 pb que se predice codifica para un polipéptido de 1104 aminoácidos (SEQ ID NO: 2) que tiene una masa molecular calculada de 127.6 kDa (véase cuadro 1 ). El análisis del carácter hidrofílico de Kyte-Doolitle (no mostrado) de la secuencia primaria, predice la presencia de ocho dominios hidrofóbicos putativos agrupados cerca del extremo carboxilo. Se identificó una alta probabilidad del dominio doblemente enrollado localizado en el extremo carboxilo terminal del residuo 1070 hacia el extremo, el cual puede estar implicado en la oligomerización del canal. Además, el análisis de la secuencia primaria con GCG SeqWeb reveló que el cCMR1 contenía sitios de N-glucosilacíón múltiples localizados en los residuos 15, 256, 317, 812, 934, 1050 y 1072, respectivamente. El cCMR1 contiene también un sitio de fosforilación de PKA (proteína cínasa A) putativo en el residuo 92, tres sitios de fosforilación de tirosina en los residuos 30,228 y 288, y 17 sitios de fosforilación de PKC (proteína cinasa C). La secuencia de aminoácidos del cCMR1 fue alineada con las secuencias de humano (No. de acceso del GenBank: NP_076985), rata (No. de acceso del GenBank: NP_599198) y ratón (No. de acceso del GenBank: AAM23261 ), que revelaron una identidad de 95.1 %, 94.1 % y 93.9%, respectivamente, usando el programa Gap de Seqweb versión 2 de Accelrys. El programa Gap usa el algoritmo de Needleman y Wunsch (J Mol Biol., 48: 443 (1970)) para encontrar la alineación de dos secuencias completas. Aumenta al máximo el número de coincidencias, y reduce al mínimo el número de espacios.

EJEMPLO 2 Expresión recombinante del CMR1 A. Clonación del cCMR1 en un vector de expresión de mamífero Para la expresión del cCMR1 en líneas de células de mamífero, el ADNc de longitud completa del cCMR1 fue subclonado en pCDNA3.1 realizando una ligación tridireccíonal. Primero, el clon del cCMR1 NQC562 de longitud completa fue digerido con Hindlll y Ncol, para dar un fragmento 5' de 0.8 kb. Después, en una reacción de restricción independíente, NQC562 fue digerido con Ncol y Salí para dar un fragmento 3' de 2.5 kb. Los fragmentos del cCMR1 5' de 0.8 kb y 3' de 2.5 kb fueron purificados y ligados con pcDNA3.1 que fue predigerido con Hindlll y Salí, creando el vector pcDNA3.1-cCMRL Para análisis de traducción in vitro, el ADNc del cCMR1 de longitud completa fue subclonado en vectores pAGA4 (modificado de pGEM3 de Promega, Sanford 1991 y Qin, et al. 1997). En resumen, se obtuvo un fragmento N-terminal de 0.8 kb por digestión de NQC562 con Ndel y Ncol, y se obtuvo un fragmento C-terminal de 2.5 kb por digestión de NQC562 con Ncol y Xhol. Los dos fragmentos purificados fueron ligados junto con el vector pAGA4 predigerido con Ndel y Salí, creando la construcción cCMR1/pAGA4. Todas las construcciones finales se confirmaron por secuenciación de ADN.

B. Traducción del cCMR1 in vitro La traducción in vitro del cCMR1 de canino, se llevó a cabo con el sistema de traducción/transcripción acoplado TnT™ T7 Quick (Promega), de acuerdo al protocolo recomendado por el vendedor. En resumen, se añadió 1 µl de 0.1 µg/µl de cCMR1/pAGA4 a 9 µl de mezcla maestra TNT Quíck con 0.2 µl de [35S]-metionina (1000 Ci/mmol a 10 mCi/ml). La mezcla de reacción se incubó a 30°C por 90 minutos. La reacción se detuvo añadiendo un volumen igual de 2XSDS/regulador de pH de carga para PAGE, y entonces las muestras se sometieron a análisis de SDS-PAGE con gradiente de 4 a 20%. Después de electroforesis, el gel se tiñó con azul R250 de Coomassie, se secó y se expuso a película de rayos X. El cCMR1 traducido in vitro emigró hacia un peso molecular aproximado de 135 kDa, según se predijo por la traducción fiel de las secuencias de aminoácidos de las secuencias de ácido nucleico correspondientes. La proteína del cCMR1 traducida in vitro, se analizó también por Western blot. 5 µl de la proteína del cCMR1 traducida in vitro se sometieron a SDS-PAGE con gradiente de 4 a 20%. Las proteínas sobre el gel fueron transferidas entonces a nitrocelulosa. El blot fue bloqueado entonces con leche deshidratada a 5% en TTBS (Tween 20 a 0.5%, Tris-HCl a 100 mM y NaCI a 0.9% a pH = 7.5) a temperatura ambiente por 1 hora, y se incubó entonces con anticuerpo policlonal anti-cCMR1 (1 :500) a 4°C durante la noche. Al día siguiente, el blot se lavó tres veces con 100 ml de TTBS, y se incubó con anticuerpo IgG anti-conejo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (Pierce) a temperatura ambiente por 1 hora. El blot se lavó tres veces con 100 ml de TTBS, y se visualizó con reactivos luminiscentes ECL-Plus (Amersham-Pharmacial Biotech) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La construcción pcDNA3.1-cCMR1 fue transfectada en células de riñon embrionario humano HEK293 (ATCC CRL-1573) usando el equipo GeneJammer™ (Stratagene, CA), de acuerdo al protocolo del fabricante. Se seleccionaron clones de células estables por crecimiento en presencia de G418. Se aislaron y purificaron clones resistentes a G418 individuales. Los clones que contenían al ADNc del cCMR1 se analizaron usando una prueba de influjo de calcio.

EJEMPLO 3 Prueba funcional del cCMR1 por influjo de calcio Se llevó a cabo prueba de FLIPR para estudiar las propiedades de los canales del cCMR1 dentro de una población de células. Para demostrar la funcionalidad del cCMR1 expresado en células recombinantes, se sembraron células CMR1/HEK293 transfectadas establemente en una placa de 384 cavidades a una concentración de 6.7 X 105 células/cavidad, y se incubaron durante la noche a 37°C. Al día siguiente, las células se cargaron con regulador de pH y colorante de calcio (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) en un volumen final de 40 µl, y se incubaron por 30 minutos a temperatura ambiente. Se midió la intensidad de fluorescencia por FLIPR antes y después de la adición de mentol o icilina, los cuales se añadieron a las células a una concentración de 100 µM o 10 µM cada uno, respectivamente. Los resultados se muestran en la figura 1.

EJEMPLO 4 Prueba funcional del CMR1 con concentraciones de carga de Ca++ reducidas El CMR1 se abre en respuesta a agonistas tales como mentol e icilina, y también a temperaturas moderadamente frías (15°C a 25°C). Por lo tanto, a temperatura ambiente (22-24°C), el CMR1 podría ser activo e inducir el influjo de Ca2+. Sin embargo, el influjo de Ca2+ inducirá también inactivación dependiente de Ca2+, resultando en regulación del CMR1 por realimentación negativa. En este caso, el CMR1 será inactivado después de la activación por temperatura ambiente, y no será reactivado hasta que la temperatura sea incrementada arriba de aproximadamente 25°C. Por lo tanto, bajo condiciones de prueba normales (temperatura ambiente y en presencia de regulador de pH que contiene Ca2+ a 2 mM), el CMR1 de ciertas especies, tales como el CMR1 de rata, no es sensible a agonista alguno. Para preparar un sistema en donde se usaría el CMR1 para seleccionar antagonistas a temperatura ambiente, se desarrolló una prueba de influjo de Ca2+ removiendo Ca2+ del regulador de pH de carga de colorante, y desafiando entonces el sistema que contiene al CMR1 con Ca2+ a 4 mM. Bajo esta condición, aunque el CMR1 es activo (a temperatura ambiente), no entrará calcio en la célula a través del canal, y no ocurrirá inactivación. Bajo estas condiciones de prueba, el CMR1 es constitutivamente activo e cebado para permitir el influjo de Ca2+ tan pronto como se añade Ca2+ en la solución extracelular. Se sembraron células de riñon embrionario humano (HEK293) transfectadas con CMR1 de rata, en una placa de 384 cavidades (6.7 X 105 células/cavidad). Al día siguiente, el medio de cultivo se removió, y las células se enjuagaron con regulador de pH de Hank completo. Las células se cargaron entonces con reguladores de pH y colorante de calcio (Molecular Devices) en un volumen final de 40 µl, y se incubaron por 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se transfirieron entonces a un aparato de FLIPR, en donde compuestos puestos a prueba para actividad agonista se añadieron a una concentración final de 4.2 µM en tiempo cero. Se añadió calcio a una concentración final de 4 mM a casi tiempo 10 segundos, y se midió la intensidad de fluorescencia por FLIPR. Un resultado representativo se muestra en la figura 2, en donde no se añadió compuesto de prueba en el tiempo cero.

EJEMPLO 5 Prueba de selección para un desensibilizador o inactivador de un canal del CMR1 En general, tras la exposición prolongada de un canal iónico a un estímulo de activación (por ejemplo, un agonista) o en respuesta a un estímulo de desensibilización o inactivación directa, el canal puede asumir conformaciones alternas que son variablemente menos activables en respuesta a un estímulo de activación. Estas conformaciones menos activables o inactivables pueden ser referidas funcionalmente como desensibilizadas o inactivadas, y compuestos que producen estos estados como desensibilizadores o inactivadores, respectivamente. Dichas conformaciones pueden ser inducidas o estabilizadas por estos denominados desensibilizadores o inactivadores, o en presencia de los mismos, y pueden surgir por la acción preferencial del desensíbilizador o inactívador tras un canal abierto o tras un canal cerrado. Además, dichas conformaciones pueden ser reversibles, a través de cursos y condiciones de tiempo variables, o pueden ser irreversibles, durante la síntesis de novo de canales nacientes. Compuestos que sean identificados como desensibilizadores o inactivadores, siendo reversibles o irreversibles, pueden ser útiles en el tratamiento de ciertas condiciones que incluyen condiciones de dolor, en las cuales sería terapéutica la actividad disminuida del CMR1. Por lo tanto, en otra modalidad, la invención provee un método para identificar desensibilizadores o inactivadores reversibles e irreversibles de la actividad del CMR1. El primer método está diseñado para identificar compuestos que inducen y/o estabilizan el canal en un estado desensibilizado o ¡nactivado desde un estado cerrado, y comprende los pasos de: (a) proveer una célula recombinante que comprenda un ácido nucleico que codifique para una proteína del cCMR1 , (b) poner en contacto la célula recombinante a una temperatura arriba del umbral para activación (típicamente arriba de aproximadamente 28°C) con un compuesto de prueba por duraciones de tiempo variables, (c) lavar extensivamente el compuesto de prueba, y (d) en puntos de tiempo variables, determinar el grado al cual el compuesto de prueba disminuye la actividad del CMR1 en respuesta a una exposición subsiguiente a un estímulo de activación del CMR1. El segundo método está diseñado para identificar compuestos que induzcan y/o estabilicen el canal en un estado desensibilizado o inactivado desde un estado abierto, y comprende cualquiera de los pasos de: (a) proveer una célula recombinante que comprenda un ácido nucleico que codifique para una proteína del cCMR1 , (b) poner en contacto la célula recombinante a una temperatura arriba del umbral para activación (típicamente arriba de aproximadamente 28°C con un agonista del CMR1 , (c) poner en contacto la célula recombinante con un compuesto de prueba para duraciones de tiempo variables, (d) lavar extensivamente el compuesto de prueba y el agonista, y (e) en puntos de tiempo variables, determinar el grado al cual el compuesto de prueba disminuye la actividad del CMR1 en respuesta a una exposición subsiguiente a un estímulo de activación del CMR1 , o los pasos de: (a) proveer una célula recombinante que comprenda un ácido nucleico que codifique para una proteína del cCMR1 , (b) incubar la célula recombinante a una temperatura abajo del umbral para activación (típicamente abajo de aproximadamente 28°C, (c) poner en contacto la célula recombínante con un compuesto de prueba por duraciones de tiempo variables, (d) lavar extensivamente el compuesto de prueba, y (e) en puntos de tiempo variables, determinar el grado al cual el compuesto de prueba disminuye la actividad del CMR1 en respuesta a una exposición subsiguiente a un estímulo de activación del CMR1.

EJEMPLO 6 Activación del cCMR1 por aceite de mostaza El aceite de mostaza es un producto natural que induce dolor e inflamación cuando se aplica a la piel. Recientemente, se ha propuesto a TRPA1 , un miembro novedoso de la familia de TRP, como uno de los objetivos celulares y moleculares para la acción punzante de los aceites de mostaza (Jordt, et al. 2004, Nature, 427: 260-265). Los presentes inventores demostraron que el aceite de mostaza activa también al cCMR1. Células HEK293 transfectadas establemente con el cCMR1 , se sembraron en una placa de 384 cavidades a una concentración de 6.7 x 105 células/cavidad, y se incubaron durante la noche a 37°C/CO2 a 5%. Al día siguiente, las células se cargaron con colorante de calcio, y se incubaron por 30 minutos a temperatura ambiente. Se midió la intensidad de fluorescencia mediada por calcio por medio de FLIPR antes y después de que se administrara el compuesto a las células. Como se muestra en la figura 3, el cCMR1 no sólo es sensible a compuestos refrescantes tales como icilina a 100 nM (línea continua), sino también es activado por el compuesto punzante, aceite de mostaza a 1 mM (línea de trazos).

EJEMPLO 7 Estudios de pinchamiento de membrana de células enteras Se realizaron experimentos de pinchamíento de membrana para estudiar las propiedades de los canales del cCMR1 expresados en una sola célula. Se cultivaron células HEK293 transfectadas establemente con el cCMR1 de canino en DMEM complementado con suero de bovino fetal a 10%, 100 unidades/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina y 1 mg/ml de G418. Las células se mantuvieron a 37°C y en CO2 a 5%. A menos que se indique de otra manera, la solución extracelular estándar usada para el registro contenía (en mM): NaCI, 132; EGTA, 1 ; KCl, 5.4; MgCI2, 0.8; HEPES, 10; glucosa, 10; pH = 7.4. En experimentos en donde la solución extracelular contenía Ca2+, la solución extracelular usada era una de las siguientes (en mM), dependiendo de la concentración de Ca2+ usada: (1 ) NaCI, 132; CaCI2, 0.1 o 1.8; KCl, 5.4; MgCI2, 0.8; HEPES, 10; glucosa, 10; pH = 7.4; (2) NaCI, 116; CaCI2, 10; KCl, 5.4; MgCI2, 0.8; HEPES, 10; glucosa, 10; pH = 7.4. La solución intracelular usada para llenar las pipetas de registro contenía (en mM): CsCI, 145; EGTA, 5; HEPES, 10; glucosa, 5; pH = 7.4. Se hicieron registros usando la técnica convencional de pinchamiento de membrana de células enteras, 1 a 2 días después de la siembra de las células sobre cubreobjetos de vidrio a densidades adecuadas para el registro de células individuales. Las corrientes fueron amplificadas por un amplificador de pinchamiento de membrana y filtradas a 2 kHz (Axopatch 200B, Axon Instruments). Se aplicó mentol (100 µM) o icilina (1 µM) a la célula a 0.5 ml/min por medio de un sistema de perfusión alimentado por gravedad. Se llevaron a cabo a 22°C registros que implicaban estimulaciones por agonistas. En experimentos en donde se hicieron variar las temperaturas, se generaron rampas de temperatura calentando/enfriando el perfusato en un enfriador/calentador en línea doble (modelo SC-20, Warner Instruments, Hamden, CT) controlado por un controlador de temperatura bipolar (modelo CL-100, Warner Instruments). La temperatura en la vecindad de la célula registrada se midió con una termomicrosonda en miniatura hecha a la medida conectada a un termómetro de monitoreo (modelo TH-8, Physitemp, Clifton, NJ), y se muestreó usando Digidata 1322A y pClamp 9.0 (Axon Instruments, Union City, CA), como fueron las corrientes medidas concurrentemente en el modo de pinchamiento de membrana de células enteras. Se usaron dos protocolos de voltaje en estos estudios. El primero incluyó una rampa de voltaje de 600 ms de -100 mV a +60 mV a un índice de muestreo de 10 kHz. Este impulso de voltaje se repitió una vez cada cinco segundos. La célula se mantuvo a -100 mV entre los impulsos de voltaje. En el segundo protocolo, la célula se mantuvo a -80 mV, y la corriente se muestreó continuamente (a 100 Hz) a este potencial de retención. La figura 4 ilustra que el cCMR1 es fuertemente rectificable hacia fuera y no selectivo para cationes. Se hizo el registro del cCMR1 por medio de pinchamiento de membrana de células enteras usando el protocolo de rampa de voltaje descrito anteriormente. Tras la aplicación de mentol a 100 µM, un agente refrescante, hubo un gran incremento en la amplitud de la corriente de células enteras (línea continua) en comparación con el control (línea de trazos) en los potenciales de membrana hiperpolarizado y despolarizado. Este incremento fue mucho más pronunciado a potencíales despolarizados que a potenciales hiperpolarizados. Por consiguiente, el canal es fuertemente rectificable hacia fuera. Además, la corriente activada por mentol tuvo un potencial invertido cerca de 0 mV, que indica la naturaleza relativamente no selectiva (por lo menos hacia los cationes usados en estos experimentos) del canal. Se han obtenido también resultados cualitativamente similares para otro agente refrescante, la icilina. La sensibilidad del cCMR1 a la temperatura se ilustra en la figura 5. Conforme se disminuyó la temperatura de la solución que perfunde la célula que expresa el cCMR1 , la corriente que pasa a través de la célula a +60 mV fue incrementada significativamente con un umbral de activación de aproximadamente 17°C. El canal del cCMR1 no fue abierto a temperatura ambiente, pero fue activado por temperaturas frescas abajo de aproximadamente 17°C. La figura 6 demuestra que el Ca2+ extracelular desensibiliza el canal del cCMRL El mentol a 100 µM activó una corriente no de sensibilización en ausencia de Ca2+ extracelular (-80 mV; trazo gris). En contraste, ocurrió fácilmente desensibilización en presencia de Ca2+ extracelular a 1.8 mM bajo condiciones de registro de otra manera idénticas (trazo negro; normalizada al trazo libre de Ca2+ para claridad de presentación visual). El Ca2+ extracelular disminuyó la amplitud de la corriente del cCMR1 cuando el canal fue activado por mentol, por ejemplo a 1 mM. Esta inhibición aparente por el Ca2+ extracelular dependió de la concentración (figura 7). Cuanto mayor es la concentración de Ca2+ extracelular, más fuerte es la inhibición de la amplitud de la corriente. La línea de trazos de la figura 7 es una función logística que representa el mejor ajuste para los datos. Se derivó un valor de IC50 de Ca2+ extracelular a 1.6 M a partir de los análisis del mejor ajuste. Además, la inhibición aparente por el Ca2+ extracelular dependió del voltaje (figura 8). El Ca2+ extracelular (10 mM) inhibió fuertemente la amplitud de la corriente a potenciales hiperpolarizados. La inhibición disminuyó a potenciales más despolarizados.

Claims (49)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido capaz de detectar y transducir estímulos de frío, y que tiene por lo menos 96% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2. 2.- La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque codifica para un polipéptido que tiene por lo menos 98% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:

2.

3.- La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque codifica para un polipéptido de SEQ ID NO: 2.

4.- La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende los nucleótidos 69 a 3380 de SEQ ID NO: 1.

5.- Un vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 1.

6.- Una célula hospedera recombinante que comprende la secuencia de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 1.

7.- Un polipéptído sustancíalmente purificado capaz de detectar y transducir estímulos de frío, y que tiene por lo menos 96% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2.

8.- El polipéptído sustancialmente purificado de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque tiene 98% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2.

9.- El polipéptido sustancialmente purificado de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque comprende SEQ ID NO: 2.

10.- Un método para la expresión de un polipéptido de conformidad con la reivindicación 7, que comprende los pasos de: (a) introducir un vector de expresión capaz de codificar para un polipéptído de conformidad con la reivindicación 7 en una célula; y (b) cultivar la célula bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido a partir del vector de expresión.

11.- Una sonda de ácido nucleico que híbrida selectivamente con la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 , bajo condiciones de hibridación severa.

12.- Un anticuerpo que se une selectivamente a un polipéptido de conformidad con la reivindicación 7.

13.- Un equipo que comprende una sonda de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 11.

14.- Un equipo que comprende un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 12.

15.- Un método para detectar una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 , que comprende el paso de poner en contacto la molécula de ácido nucleico con una sonda de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 11.

16.- Un método para detectar un polipéptido de conformidad con la reivindicación 7, que comprende el paso de poner en contacto el polipéptido con un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 12.

17.- Un método para identificar un compuesto que incrementa o disminuye la expresión de una proteína del cCMR1 , que comprende los pasos de: (a) poner en contacto un compuesto de prueba con una célula que comprende un mecanismo para regular la expresión de un gen del cCMR1 ; y (b) determinar si el compuesto de prueba incrementa o disminuye la expresión de un gen controlado por dicho mecanismo de la célula.

18.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el gen cuya expresión es controlada por el mecanismo, es un gen reportero.

19.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el gen cuya expresión es controlada por el mecanismo, es un gen del cCMRL

20.- Un método para identificar un compuesto que incrementa o disminuye la conductividad de un canal ¡ónico del cCMR1 , que comprende los pasos de: (a) poner en contacto un compuesto de prueba con el canal ¡ónico del cCMR1 ; y (b) determinar si el compuesto de prueba incrementa o disminuye la conductividad del canal iónico.

21.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el canal iónico del cCMR1 comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

22.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el canal iónico del cCMR1 se asocia con una célula hospedera.

23.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque la célula hospedera es una célula hospedera recombínante para el canal iónico del cCMR1.

24.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque la célula hospedera es una célula hospedera endógena para el canal iónico del cCMRL

25.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el cCMR1 se asocia con una preparación de membrana aislada.

26.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el paso (b) comprende determinar una cantidad de niveles de calcio intracelular.

27.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque comprende un paso de incrementar la conductividad del canal iónico antes del paso de poner en contacto el compuesto de prueba con el canal iónico.

28.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque el paso de incrementar la conductividad del canal iónico comprende incubar el canal iónico en una solución de regulador de pH que contiene un compuesto capaz de incrementar la conductividad del canal.

29.- El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el compuesto capaz de incrementar la conductividad del canal se selecciona del grupo que consiste de mentol, icilina y aceite de mostaza.

30.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque el paso de incrementar la conductividad del canal iónico comprende incubar el canal iónico a una temperatura de activación del canal del cCMRL

31.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque la temperatura de activación del canal del cCMR1 está dentro de la escala de 4 a 17°C.

32.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque el paso de incrementar la conductividad del canal iónico comprende despolarizar el canal ¡ónico.

33.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque comprende un paso de incrementar la conductividad del canal ¡ónico antes del paso de poner en contacto el compuesto de prueba con el canal iónico.

34.- El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque el paso de disminuir la conductividad del canal iónico comprende incubar el canal iónico en una solución de regulador de pH que contiene un compuesto capaz de disminuir la conductividad del canal.

35.- El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque el paso de disminuir la conductividad del canal iónico comprende incubar el canal iónico a una temperatura no de activación del canal del cCMR1.

36.- El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque la temperatura no de activación del canal del cCMR1 es la temperatura ambiente.

37.- El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque el paso de disminuir la conductividad del canal iónico comprende ¡ncubar el canal iónico en una solución de regulador de pH que contiene Ca2+ extracelular a una concentración que sea suficiente para disminuir la conductividad del canal.

38.- El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque el paso de disminuir la conductividad del canal iónico comprende hiperpolarizar el canal ¡ónico.

39.- Un método para identificar un compuesto que incrementa o disminuye la conductividad de un canal iónico del CMR1 de mamífero, que comprende los pasos de: (a) ¡ncubar el canal iónico en una solución de regulador de pH que contiene una cantidad de sub-inactivación de calcio; (b) activar el canal iónico; (c) poner en contacto el canal iónico con un compuesto de prueba; (d) incrementar la cantidad de calcio en la solución de regulador de pH; y (e) determinar si el compuesto de prueba incrementa o disminuye la conductividad del canal ¡ónico.

40.- El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque el paso de activar el canal iónico comprende incubar el canal iónico en una solución de regulador de pH que contiene un compuesto que incrementa la conductividad del canal.

41.- El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque el paso de activar el canal iónico comprende incubar el canal ¡ónico a una temperatura de activación del canal del CMR1 de mamífero.

42.- El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque el paso de activar el canal iónico comprende despolarizar el canal iónico.

43.- El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque la proteína del CMR1 de mamífero se origina de humano, rata, ratón o canino.

44.- El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque el paso de determinar si el compuesto de prueba incrementa o disminuye la conductividad del canal iónico, comprende medir la cantidad de calcio ¡ntracelular.

45.- El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado además porque la cantidad de calcio intracelular se determina usando una prueba de FLIPR.

46.- El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque el paso de determinar si el compuesto de prueba incrementa o disminuye la conductividad del canal iónico, comprende medir la corriente conducida por el canal iónico.

47.- El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado además porque la corriente conducida por el canal iónico se mide usando una técnica de pínchamiento de membrana.

48.- Un método para identificar un compuesto útil en el tratamiento de dolor, que comprende los, pasos de: (a) poner en contacto un compuesto de prueba con un canal iónico formado de un cCMR1 ; y (b) determinar si el compuesto de prueba incrementa o disminuye la conductividad del canal iónico.

49.- El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque comprende los pasos de: (a) administrar el compuesto de prueba a un animal; y (b) determinar el grado al cual el compuesto de prueba altera la respuesta nociceptiva/nocifensiva del animal.