JP2008505611A - イヌ寒冷およびメントール感受性受容体１ - Google Patents

Abstract

本発明は、本明細書でイヌＣＭＲ１（ｃＣＭＲ１）と命名された新規イヌ寒冷およびメントール感受性受容体を記述する核酸およびポリペプチド配列を提供する。本発明の単離された核酸若しくはポリペプチド分子は、検出アッセイおよびスクリーニングアッセイで使用し得る。

Description

関連出願との交差引用

本出願は、２００４年４月８日出願の米国特許出願第６０／５６０，４００号および２００４年１０月２２日出願の同第６０／６２１，２２３号（それらの内容全体は引用することにより本明細書に組み込まれる）に対する優先権を主張する。

本発明は温度受容器イオンチャンネルタンパク質に関する。具体的には、本発明は、新規イヌ寒冷（ｃｏｌｄ）およびメントール感受性受容体ＣＲＭ１の単離された核酸分子およびポリペプチド、ならびにそれらの用途に関する。

神経組織中での熱および冷覚の検出、変換および伝達に関与する生化学的機構の解明に大きな努力が払われてきた。熱刺激は、後根神経節（ＤＲＧ）および三叉神経節（ＴＧ）由来のもののような知覚ニューロン上に位置する特化された受容体を活性化する。これらの刺激が有害な範囲にある（すなわち非常に熱い若しくは冷たい）場合、それらは、侵害受容器（疼痛知覚ニューロン）と呼ばれる知覚ニューロンの亜集団上の温度受容器のある種の１サブセットを活性化する。活性化に際して、温度受容器（例えばイオンチャンネル）は、侵害性刺激を電気シグナルに変換し、電気シグナルが知覚ニューロンに沿って脊髄に伝播され、そこでそれは脳に中継されて、最終的には疼痛の知覚に至る。従って、これらの温度受容器は、多様な疼痛状態の処置のための薬物を開発するための高度に有望な標的を表す。

数種の温度で活性化される受容体が熱の検知に関与している。ＴＲＰＶ１（ＶＲ１：カプサイシンおよび熱活性化型チャンネル）は４３℃（大部分の哺乳動物が侵害性と認識する温度）近くで活性化される。ＴＲＰＶ１に対する４０％以上のアミノ酸レベルの同一性をもつ他のＴＲＰＶチャンネルもまたクローン化されており、そして温度センサーとして特徴付けられている。これらのチャンネルは、ＴＲＰＶ３について３９℃（温）からＴＲＰＶ２／ＶＲＬ１について５５℃（高閾値侵害的熱）までの範囲にわたる多様な熱閾値で活性化される（非特許文献１およびその中の参考文献を参照されたい）。対照的に、ＴＲＰＶ４は室温で構成的に開放され、およそ２７℃以上の温度で活性化される（非特許文献２）。これらの温度活性化型受容体は、非選択的陽イオンチャンネルの一過性受容器電位チャンネル（ＴＲＰ）ファミリーに属し、それらはＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）およびキイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）において機械および圧調節に関与している。ＴＲＰチャンネルは、ＴＲＰＣ（限界若しくは容量性サブファミリー）、ＴＲＰＶ（バニロイドサブファミリー）およびＴＲＰＭ（メラノスタチンサブファミリー）と呼称される３種のサブファミリーに分割される。全部は、膜貫通ドメイン５と６の間に１個の提案された孔領域を伴う６個の推定の膜貫通ドメインを有する。ＴＲＰチャンネルは細胞質のＮおよびＣ末端を有すると考えられる（非特許文献１およびその中の参考文献を参照されたい）。

より最近、タンパク質のＴＲＰファミリー内にありかつ寒冷刺激に対する応答を調節するタンパク質が発見された。ラットＣＲＭ１タンパク質（「寒冷およびメントール感受性受容体」を示す；非特許文献３）およびマウスＴＲＰＭ８タンパク質（「一過性受容器電位チャンネル、メラノスタチンサブファミリー、タイプ８」を示す；非特許文献４）は、比較的低温への曝露に際して活性化される興奮性イオンチャンネルとして機能するようである。ＴＲＰＭ８活性化の閾値はおよそ約２３℃である。ラットＣＭＲ１およびマウスＴＲＰＭ８は、メントールおよびイチリンのような冷覚を惹起する化合物に対してもまた感受性である。興味深いことに、ラットＣＭＲ１およびマウスＴＲＰＭ８は、それらのアミ
ノ酸配列の長さ全体にわたり９０％超の配列の同一性を共有する。

付加的な温度受容器は疼痛の処置のための潜在的標的であるために、それらを同定する必要性が存在する。多様な種の温度受容器は試験化合物の効果を検討するためのモデル系として使用し得るために、それらを同定する必要性もまた存在する。とりわけ、寒冷刺激に応答する温度受容器の活性を潜在的に増大若しくは低下させる化合物を試験するために使用し得る系に対する必要性が存在する。こうした化合物の同定および試験は、慢性疼痛を伴う多様な障害の処置、若しくは組織冷却が望ましい他の状態での使用について可能にするとみられる。
Ｓｔｏｒｙら、Ｃｅｌｌ、２００３、１１２：８１９−８２９ Ｇｕｅｌｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００２ ＭｃＫｅｍｙ，Ｄ．Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、４１６：５２−５８、２００２ Ｐｅｉｅｒ，Ａ．Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ １０８：７０５−７１５、２００２

［発明の要約］
今や、本明細書でイヌＣＭＲ１（ｃＣＭＲ１）と呼称されるイヌタンパク質が、寒冷刺激に対する応答を調節しかつタンパク質のＴＲＰファミリーに属することが発見された。

全般的な一局面において、本発明は、寒冷刺激を検出かつ伝達することが可能でかつ配列番号２に対する最低９６％の配列の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子を提供する。一態様において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有するｃＣＭＲ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子を提供する。本発明はまた、本発明の核酸分子を含んでなる発現ベクター若しくは組換え宿主細胞も提供する。本発明はさらに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で本発明の核酸分子に選択的にハイブリダイズする核酸プローブ、およびこうしたプローブを含んでなるキットを提供する。

全般的な別の局面において、本発明は、寒冷刺激を検出かつ伝達することが可能でかつ配列番号２に対する最低９６％の配列の同一性を有する実質的に精製されたポリペプチドを提供する。一態様において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有するｃＣＭＲ１タンパク質を含んでなる実質的に精製されたポリペプチドを提供する。本発明はまた：ａ）本発明のポリペプチドをコードすることが可能な発現ベクターを細胞に導入する段階；およびｂ）該発現ベクターからのポリペプチドの発現を可能にする条件下で該細胞を培養する段階を含んでなる、本発明のポリペプチドの発現方法も提供する。本発明はさらに、本発明のポリペプチドに選択的に結合する抗体、およびこうした抗体を含んでなるキットを提供する。

本発明は、本発明の核酸分子若しくはポリペプチドを、該核酸分子若しくはポリペプチドに特異的に結合することが可能な剤と接触させる段階を含んでなる、本発明の核酸分子若しくはポリペプチドの検出方法を提供する。

本発明は：
（ａ）ｃＣＭＲ遺伝子の発現を調節するための機構を含んでなる細胞と試験化合物を接触させる段階；および（ｂ）該試験化合物が、該細胞からの前記機構により制御される遺伝子の発現を増大若しくは減少させるかどうかを決定する段階
を含んでなる、ｃＣＭＲ１タンパク質の発現を増大若しくは減少させる化合物の同定方法を提供する。

本発明はまた：（ａ）ｃＣＭＲ１イオンチャンネルと試験化合物を接触させる段階；および（ｂ）該試験化合物が該イオンチャンネルの伝導性を増大若しくは低下させるかどうかを決定する段階を含んでなる、ｃＣＭＲ１イオンチャンネルの伝導性を増大若しくは低下させる化合物の同定方法も提供する。

本発明の他の局面は：（ａ）活性化量以下のカルシウムを含有する緩衝溶液中でＣＭＲ１イオンチャンネルをインキュベートする段階；（ｂ）該イオンチャンネルを活性化する段階；（ｃ）該イオンチャンネルを試験化合物と接触させる段階；（ｄ）緩衝溶液中のカルシウムの量を増大させる段階；ならびにｃ）細胞内カルシウム量を測定する段階、およびイオンチャンネルを試験化合物と接触させなかった対照の量と該量を比較する段階を含んでなる、哺乳動物のＣＭＲ１イオンチャンネルの伝導性を増大若しくは低下させる化合物の同定方法を包含する。

加えて、本発明は；（ａ）試験化合物をｃＣＭＲ１イオンチャンネルと接触させる段階；および（ｂ）該試験化合物が該イオンチャンネルの伝導性を増大若しくは低下させるかどうかを決定する段階を含んでなる、疼痛を処置するのに有用な化合物の同定方法を提供する。いくつかの態様において、該方法はさらに：（ａ）試験化合物を動物に投与する段階；および（ｂ）試験化合物が該動物の侵害受容／侵害防御応答を変える程度を決定する段階を含んでなる。

本発明の他の局面、特徴および利点は、本発明およびその好ましい態様の詳細な記述、ならびに添付の請求の範囲を包含する以下の開示から明らかであろう。

［発明の詳細な記述］
本明細書で引用される全部の刊行物は、引用することによりここに組み込まれる。別の方法で定義されない限り、本明細書で使用される全部の技術的および科学的用語は、本発明が関する技術分野の当業者に一般に理解されると同一の意味するところを有する。

本明細書で使用されるところの「含んでなる」、「含有する」、「有する」および「包含する」は、それらの公然の制限しない意味で使用される。

以下は、本明細で時折使用される略語である。
ｂｐ＝塩基対
ｃＤＮＡ＝相補ＤＮＡ
ＣＭＲ１＝寒冷およびメントール感受性受容体１；
ｃＣＭＲ１＝イヌ寒冷およびメントール感受性受容体１；
ＤＲＧ＝後根神経節
ＥＬＩＳＡ＝酵素結合免疫測定法
ＦＬＩＰＲ＝蛍光画像化プレートリーダー
ｋｂ＝キロ塩基；１０００塩基対
ｎｔ＝ヌクレオチド
ＰＡＧＥ＝ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＰＣＲ＝ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＴ−ＰＣＲ＝逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＳＣ＝塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム
ＴＧ＝三叉神経節
ＴＲＰＭ８＝一過性受容器電位チャンネル、メラノスタチンサブファミリー、タイプ８
ＵＴＲ＝非翻訳領域

ポリペプチド若しくは核酸の「活性」、「生物学的活性」若しくは「機能的活性」は、標準的技術に従ってｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏで測定されるところのポリペプチド若しくは核酸分子により発揮される活性を指す。こうした活性は、イオンチャンネル活性、第二のタンパク質との会合若しくはそれに対する酵素活性のような直接的活性、あるいは、限定されるものでないが多段階の連続的様式で起こる相互作用を挙げることができる１種若しくは１種以上の付加的なタンパク質または他の分子（１種若しくは複数）とのタンパク質の相互作用により媒介される細胞のシグナル伝達活性のような間接的活性であり得る。

本明細書で使用されるところの「生物学的サンプル」は、被験体から単離された細胞若しくは生物学的液体のような細胞若しくは組織物質を含有する若しくはそれらよりなるサンプルを指す。「被験体」は、処置、観察若しくは実験の対象であったラット、マウス、サル若しくはヒトのような哺乳動物であり得る。生物学的サンプルの例は、例えば、唾液、血液、血液細胞（例えば白血球）、羊水、血漿、精液、骨髄、組織若しくは穿刺生検サンプル、尿、腹水、胸水および細胞培養物を包含する。生物学的サンプルは、組織学的目的上採取された凍結切片のような組織の切片もまた包含しうる。試験生物学的サンプルは、分析、監視若しくは観察の対象であった生物学的サンプルである。対照生物学的サンプルは、試験生物学的サンプルの陽性若しくは陰性いずれかの対照であり得る。しばしば、対照生物学的サンプルは、試験生物学的サンプルの型と同一の型の目的の組織、細胞および／若しくは生物学的液体を含有する。

「細胞」は、検出方法の感度に適切な最低１個の細胞若しくは複数の細胞を指す。本発明に適する細胞は細菌でありうるが、しかし好ましくは真核生物であり、そして最も好ましくは哺乳動物である。

「クローン」は、単一の細胞若しくは有糸分裂による共通の祖先に由来する細胞の一集団である。「細胞株」は、細胞のクローン増殖を導きかつ多世代の間ｉｎ ｖｉｔｒｏで安定な増殖が可能である初代細胞である。

「寒冷およびメントール感受性受容体」、「ＣＭＲ１」、「一過性受容器電位チャンネル、メラノスタチンサブファミリー、タイプ８」すなわち「ＴＲＰＭ８」タンパク質は、それぞれ低温、若しくは限定されるものでないがメントールおよびイチリンを挙げることができる冷覚を惹起する化合物のような寒冷刺激を検知かつ伝達することが可能であるタンパク質を指す。「ＣＭＲ１」は興奮性イオンチャンネルＣＭＲ１チャンネルを形成し得、これは低温若しくは冷覚を惹起する化合物により活性化され得る。活性化されたＣＭＲ１チャンネルは、該チャンネルを通るＣａ^＋＋イオンの流入をゲートして膜の脱分極をもたらす。ＣＭＲ１タンパク質は、（１）配列番号２に描かれるイヌＣＭＲ１（ｃＣＭＲ１）タンパク質に対する約８０％以上のアミノ酸配列の同一性を有し得るか；または（２）配列番号２に描かれるｃＣＭＲ１タンパク質に対し生じられた抗体、例えばポリクローナル若しくはモノクローナル抗体に結合し得る。いくつかの態様において、ＣＭＲ１は配列番号２に対する約８５、９０若しくは９５パーセント以上のアミノ酸配列の同一性を有する。例示的ＣＭＲ１は、配列番号２に描かれるｃＣＭＲ１タンパク質の構造的および機能的多形を包含するｃＣＭＲ１を包含する。「多形」は、一集団の個体間の特定の一遺伝子座の一組の遺伝子バリアントを指す。ＣＭＲ１はまた、ヒト、ラット、マウス、ブタ、イヌおよびサルを包含する他の動物におけるイヌＣＭＲ１のオルトログ、例えばラットＣＭＲ１（ＧｅｎＢａｎｋタンパク質ＩＤ：ＮＰ＿５９９１９８）若しくはマウスＴＲＰＭ８（ＧｅｎＢａｎｋタンパク質ＩＤ：ＮＰ＿５９９０１３）の構造的および機能的多形も包含する。ＣＭＲ１遺伝子は、ＤＲＧおよびＴＧのようなある種の神経組織中で天然に発現される。

「ＣＭＲ１活性化温度」は、ＣＭＲ１チャンネルが基礎に比較してその伝導性の最低１０％の増大を表す温度である。当業者は、ＣＭＲ１チャンネルの活性化温度を実験で決定し得る。いくつかの態様において、「ＣＭＲ１活性化温度」は、ＣＭＲ１チャンネルが基礎に比較してその伝導性の最低１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％若しくは５０％の増大を表す温度である。「ＣＭＲ１活性化温度」は典型的に約６℃〜２８℃のものである。いくつかの態様において、ＣＭＲ１活性化温度は、約１５℃〜２８℃、１９℃〜２８℃、２３℃〜２８℃若しくは１９℃〜２４℃である。

「ＣＭＲ１非活性化温度」は、「ＣＭＲ１活性化温度」の範囲の外側にある温度である。例示的なＣＭＲ１非活性化温度は３７℃である。

「遺伝子」は、ペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質の産生に関与するＤＮＡ、ならびに、コーディング領域、コーディング領域に先行する（「５’ＵＴＲ」）および後に続く（「３’ＵＴＲ」）非コーディング領域を包含するこうしたタンパク質種をコードするｍＲＮＡのセグメントである。「遺伝子」はまた、個々のコーディングセグメント（「エキソン」）間の介在非コーディング配列（「イントロン」）も包含しうる。「プロモーター」は、遺伝子の転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するＤＮＡの制御配列を意味している。プロモーターは、しばしば、遺伝子の転写開始部位の上流（「に対し５’」）である。「制御配列」は、遺伝子の発現を制御し得る遺伝子の部分を指す。「制御配列」は、プロモーター、エンハンサー、ならびにポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位（細菌の発現について）および／若しくはオペレーターのような他の発現調節領域を包含し得る。「エンハンサー」は、遺伝子の発現を距離および方向依存性の様式で調節し得るＤＮＡの制御配列を意味している。「コーディング領域」は、三塩基コドンを介しての対応するポリペプチドの翻訳のためのアミノ酸ならびに開始および終止シグナルをコードする遺伝子の部分を指す。

「核酸配列」若しくは「ヌクレオチド配列」は、一若しくは二本鎖いずれかの形態のポリマー中のデオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチドいずれかの残基の配置を指す。核酸配列は、以下の塩基すなわちチミジン、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシル（それぞれＴ、Ａ、Ｃ、ＧおよびＵと略記される）の天然のヌクレオチド、ならびに／若しくは合成アナログから構成され得る。

「オリゴヌクレオチド」という用語は、比較的短い長さ、例えば１００残基長未満の一本鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列を指す。多くの方法について、長さ約１６〜２５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが有用であるが、とは言え約２５ヌクレオチド以上のより長いオリゴヌクレオチドをときに利用しうる。いくつかのオリゴヌクレオチドは、相補核酸鎖の合成のための「プライマー」として使用し得る。例えば、ＤＮＡプライマーは、相補核酸配列にハイブリダイズして、ＤＮＡポリメラーゼを使用する反応で相補ＤＮＡ鎖の合成を開始し得る。オリゴヌクレオチドはまた、数種の核酸検出方法、例えばノーザンブロッティング若しくはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおけるハイブリダイゼーションにも有用である。

「ポリペプチド配列」若しくは「タンパク質配列」は、ポリマー中のアミノ酸残基の配置を指す。ポリペプチド配列は、標準的な２０種の天然に存在するアミノ酸、加えて希なアミノ酸および合成アミノ酸アナログから構成され得る。より短いポリペプチドは一般にペプチドと称される。

「単離された」核酸分子は、該核酸の天然の供給源に存在する他の核酸分子から分離されているものである。「単離された」核酸分子は、例えば、該核酸が由来する生物体のゲ
ノムＤＮＡ中でその５’および３’端で該核酸分子に天然に隣接するヌクレオチド配列の最低１種を含まない核酸分子であり得る。単離された核酸分子は、他の配列に依存しない別個の核酸分子（例えばＰＣＲ若しくは制限エンドヌクレアーゼ処理により生じられるｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡフラグメント）、ならびにベクター、自律複製プラスミド、ウイルス（例えばレトロウイルス、アデノウイルス若しくはヘルペスウイルス）、または原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれている核酸分子を制限なしに包含する。加えて、単離された核酸分子は、ハイブリッド若しくは融合核酸分子の一部である核酸分子を包含し得る。単離された核酸分子は：（ｉ）例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅される；（ｉｉ）例えば化学合成により合成される；（ｉｉｉ）クローニングにより組換え的に製造される；または（ｉｖ）切断および電気泳動若しくはクロマトグラフィー分離によるように精製される核酸配列であり得る。

「単離された」若しくは「精製された」タンパク質またはその生物学的に活性の部分は、細胞、または該タンパク質が由来する組織供給源からの細胞性物質若しくは他の汚染するタンパク質を実質的に含まないか、または、化学的に合成される場合は化学物質前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まない。「細胞性物質を実質的に含まない」という言語は、該タンパク質が単離若しくは組換えで製造される細胞の細胞成分から該タンパク質が分離されている、タンパク質の調製物を包含する。従って、細胞性物質を実質的に含まないタンパク質は、約３０％、２０％、１０％若しくは５％（乾燥重量）未満の異種タンパク質（本明細書で「汚染するタンパク質」ともまた称される）を有するタンパク質の調製物を包含する。タンパク質若しくはその生物学的に活性の部分が組換えで製造される場合、それはまた、好ましくは培地を実質的に含まない。すなわち、培地はタンパク質調製物の容量の約２０％、１０％若しくは５％未満を表す。タンパク質が化学合成により製造される場合は、それは、好ましくは化学物質前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まない。すなわち、それは、化学物質前駆体若しくはタンパク質の合成に関与する他の化学物質から分離されている。従って、タンパク質のこうした調製物は、約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量）未満の化学物質前駆体若しくは目的のポリペプチド以外の化合物を有する。単離された生物学的に活性のポリペプチドはいくつかの異なる物理的形態を有し得る。単離されたポリペプチドは、完全長の生来のすなわちプロセシングされていないポリペプチドとして、または部分的にプロセシングされたポリペプチドとして、若しくはプロセシングされたポリペプチドの組合せとして存在し得る。完全長の新生ポリペプチドは、該完全長の新生ポリペプチドのフラグメントの形成をもたらす特異的タンパク質分解的切断事象により、翻訳後に修飾され得る。フラグメント若しくはフラグメントの物理的会合は、完全長のポリペプチドと関連する生物学的活性を有し得るが；しかしながら、個々のフラグメントに関連する生物学的活性の程度は変動し得る。単離されたすなわち実質的に精製されたポリペプチドは、単離された核酸配列によりコードされるポリペプチド、ならびに、例えば化学合成法により合成されたポリペプチド、および生物学的材料から分離されかつその後慣習的タンパク質分析若しくは調製手順を使用して本明細書に記述される方法に従ってそれが使用されることを可能にする程度まで精製されたポリペプチドであり得る。

「組換え」は、分子生物学技術を使用してその天然の状態以外の何かに改変された、核酸、核酸によりコードされるタンパク質、細胞若しくはウイルス粒子を指す。例えば、組換え細胞は、天然の（非組換え）形態の細胞内で見出されないヌクレオチド配列を含有し得るか、または、そうでなければ異常に発現されるか、過小発現されるか、若しくは全く発現されない天然の遺伝子を発現し得る。組換え細胞は、遺伝子が人工的手段により改変されかつ細胞中に再導入されている天然の形態の細胞中で見出される遺伝子もまた含有し得る。該用語はまた、細胞から核酸を取り出すことなく修飾された内因性の核酸を含有する細胞も包含し；こうした改変は、例えば遺伝子置換および部位特異的突然変異誘発により得られるものを包含する。

「組換え宿主細胞」は、それ中に組換えＤＮＡ配列を導入した細胞である。組換えＤＮＡ配列は、例えば電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿、微小注入法、形質転換、遺伝子銃およびウイルス感染を包含するいずれかの適する方法を使用して宿主細胞に導入し得る。組換えＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組込まれ（共有結合され）ても組込まれなくてもよい。例えば、組換えＤＮＡはプラスミドのようなエピソーム要素上で維持され得る。あるいは、安定に形質転換若しくはトランスフェクトされた細胞に関して、組換えＤＮＡは、それが染色体の複製により娘細胞により受け継がれるように染色体に組み込まれている。この安定性は、外因性ＤＮＡを含有する娘細胞の一集団から構成される細胞株すなわちクローンを樹立する、安定に形質転換若しくはトランスフェクトされた細胞の能力により示される。組換え宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌、酵母のような真菌細胞、ヒト、ウシ、ブタ、サルおよびげっ歯類起源の細胞株のような哺乳動物細胞、ならびにドロソフィラ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）およびカイコ由来の細胞株のような昆虫細胞を包含する原核生物若しくは真核生物でありうる。「組換え宿主細胞」という用語が、特定の被験体細胞のみならず、しかしまたこうした細胞の子孫若しくは潜在的な子孫も指すことがさらに理解される。ある種の改変が、突然変異若しくは環境の影響のいずれかにより後継世代で起こり得るため、こうした子孫は事実上親細胞に同一でないことがあるが、しかしなお本明細書で使用されるところの該用語の範囲内に包含される。

本明細書で使用されるところの「操作可能に連結される」は、２種の核酸配列間の機能的関係を指す。例えば、コーディング配列の発現（例えば転写）を制御するプロモーター配列は、そのコーディング配列に操作可能に連結されている。操作可能に連結された核酸配列は、連続的（多くのプロモーター配列に典型的）、若しくは非連続的（例えばリプレッサータンパク質をコードする核酸配列の場合）であり得る。組換え発現ベクター内で、「操作可能に連結される」は、目的のコーディング配列が、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系、若しくはベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞中での該コーディング配列の発現を見込む様式で、制御配列（１種若しくは複数）に連結されていることを意味することを意図している。

「ベクター」若しくは「構築物」は、異種核酸が挿入され得るか若しくは挿入されている核酸分子を指す。数種のベクターは、該ベクターの複製、または該ベクター若しくは構築物によりコードされるタンパク質の発現を見込んで宿主細胞に導入し得る。ベクターは、典型的には選択可能なマーカー、例えば、薬剤耐性を見込むタンパク質をコードする遺伝子、複製起点配列、および異種配列の挿入を見込むマルチクローニング部位を有する。ベクターは、典型的にはプラスミドに基づき、そして、小文字の「ｐ」、次いで文字および／若しくは数字の組合せにより呼称される。本明細書で開示される出発プラスミドは、商業的に入手可能、制限されずに公的に入手可能のいずれかであるか、若しくは当該技術分野で既知の手順の応用により、入手可能なプラスミドから構築し得る。本発明により使用し得る多くのプラスミドならびに他のクローニングおよび発現ベクターは公知であり、そして当業者に容易に入手可能である。さらに、当業者は、本発明での使用に適するいかなる数の他のプラスミドも構築しうる。こうしたプラスミド、ならびに本発明中の他のベクターの特性、構築および使用は、本開示から当業者に容易に明らかであろう。

「配列」は、単量体がポリマー中に存在する直線的順序、例えばポリペプチド中のアミノ酸の順序若しくはポリヌクレオチド中のヌクレオチドの順序を意味している。

当該技術分野で既知のところの「配列の同一性若しくは類似性」は、配列を比較することにより決定されるところの２種若しくはそれ以上のポリペプチド配列または２種若しくはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。２種若しくはそれ以上の核酸配列ま
たは２種若しくはそれ以上のポリペプチド配列間の関係の文脈で本明細書で使用されるところの「同一性」は、配列を最適に整列かつ分析する場合に同一であるそれぞれヌクレオチド若しくはアミノ酸残基の比率を指す。例えばアミノ酸配列、配列番号２に対して問い合わせ配列を比較する目的上、問い合わせ配列を配列番号２と最適に整列し、そして配列番号２の長さ（１１０４アミノ酸）全体にわたる最良の局所的アライメントを得る。

分析は、人的に、若しくは配列比較アルゴリズムを使用して実施し得る。配列の比較のため、典型的には１配列が参照配列として作用し、それと問い合わせ配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列をコンピュータに入力し、必要な場合は下位配列の座標を指定し、そして配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。

比較のための配列の最適のアライメントは、例えば、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ、Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムを使用することにより実施し得る。ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈの分析を実施するためのソフトウェアは、パスツール研究所（フランス）の生物学的ソフトウェアのウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｗｅｂ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ｓｅｑａｎａｌ／ ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ／ｎｅｅｄｌｅ．ｈｔｍｌにより公的に入手可能である。ＮＥＥＤＬＥプログラムは、それらの長さ全体を考慮する場合に２配列の（ギャップを包含する）最適のアライメントを見出すために、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈの包括的アライメントアルゴリズムを使用する。同一性は、長さ中のいかなるギャップも包含する報告された整列させた領域にわたる２配列間の同一の一致の比率と一緒に計算される。長さ中のいかなるギャップも包含する報告された整列させた領域にわたる２配列間の一致の比率として類似性が計算される、類似性スコアもまた提供される。標準的比較は、タンパク質配列についてＥＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、およびヌクレオチド配列についてＥＤＮＡＦＵＬＬマトリックスを利用する。ギャップオープンペナルティは、ギャップが創製される場合に減じられるスコアであり；ギャップオープンペナルティを使用するデフォルト設定は１０．０である。ギャップ伸長については、ギャップ中の各塩基若しくは残基について標準的ギャップペナルティにペナルティを加算し；デフォルト設定は０．５である。

ハイブリダイゼーションは、２種のポリヌクレオチドが相互に実質的に同一であることを示すための試験としてもまた使用し得る。高程度の同一性を共有するポリヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で相互にハイブリダイズすることができる。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、（１９８９）に記述されるとおり当該技術分野で既知の意味するところを有する。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、次いでハイブリダイズするポリヌクレオチドが相補性を共有する長さに依存して５０〜６５℃で０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中での１回若しくはそれ以上の洗浄を含んでなる。

「レポーター遺伝子」は、レポーター遺伝子産物をコードする核酸配列を指す。当該技術分野で既知であるとおり、レポーター遺伝子産物は典型的に標準的方法により容易に検出可能である。例示的な適するレポーター遺伝子は、限定されるものでないが、ルシフェラーゼ（ｌｕｘ）、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−グルクロニダーゼ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、およびグアニンキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。

「ＣＭＲ１チャンネルの伝導性を増大させる化合物」は、ＣＭＲ１チャンネルを通るイオンの増大された通過をもたらすいかなる化合物も包含する。一態様において、こうした化合物は、ＣＭＲ１チャンネルに結合してその伝導性を増大させるＣＭＲチャンネルのアゴニストである。別の態様において、こうした化合物は、アゴニスト結合部位と異なるアロステリック部位でＣＭＲ１チャンネルと相互作用するがしかしアゴニストに対する該チャンネルの応答を増強する、正のアロステリック調節物質である。

「ＣＭＲ１チャンネルの伝導性を低下させる化合物」は、ＣＭＲ１チャンネルを通るイオンの低下された通過をもたらすいかなる化合物も包含する。一態様において、こうした化合物は、ＣＭＲ１チャンネルに結合して、競合的若しくは非競合的いずれかの様式でアゴニストの作用を打ち消す、低下させる若しくは制限する、ＣＭＲチャンネルのアンタゴニストである。別の態様において、こうした化合物は、アゴニスト若しくはアンタゴニスト結合部位と異なるアロステリック部位でＣＭＲ１チャンネルと相互作用しかつアゴニストに対する該チャンネルの応答を低下させる、負のアロステリック調節物質である。なお別の態様において、こうした化合物は、アゴニストのようないずれかの他の化合物の非存在下でＣＭＲ１チャンネルに結合しかつ該チャンネルの伝導性を低下させる、インバースアゴニストである。

本明細書で使用されるところの「膜電位」、「膜貫通電位」若しくは「膜貫通電位差」は、それぞれ、細胞の原形質膜、外側の、限界脂質二重層膜を横断する電位差を指す。ほぼ全部の動物細胞は、−２０ないし−１００ｍＶの範囲の静止電位を伴い、内側で負である。本明細書で使用されるところの「静止電位」は、細胞が静止している場合にその周囲に関する細胞の内側の電位を指す。

本明細書で使用されるところの「脱分極」は、より正に（例えば−９０ｍＶから−５０ｍＶに）なる細胞膜電位の傾向を指す。

本明細書で使用されるところの「過分極」は、より負に（例えば−５０ｍＶから−９０ｍＶに）なる細胞膜電位の傾向を指す。本発明の実施において、分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡにおける多くの慣習的技術を使用する。これらの技術は公知であり、そして例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ編（１９９７）；ならびにＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（２００１）に説明されている。

一局面において、本発明は、新規ｃＣＭＲ１（ｃＣＭＲ１）核酸、これらの核酸によりコードされるポリペプチド、組換えｃＣＭＲ１物質、ならびにこれらの物質の製造、検出および利用を伴う方法に関する。

ＣＭＲ１の命名法はＭｃＫｅｍｙ，Ｄ．Ｄ．ら（Ｎａｔｕｒｅ、４１６：５２−５８、２００２）により確立され、そしてラットのＤＲＧおよびＴＧニューロン中で発現される寒冷およびメントール感受性受容体を記述するのに使用された。ヒトＣＭＲ１（ヒトＴＲＰＭ８としてもまた知られる）は、ラットＣＭＲ１のアミノ酸配列に９２％同一であり、そして、前立腺特異的転写物として以前に同定され、かつ、前立腺、黒色腫、結腸直腸および乳癌を包含する多様な腫瘍組織中で発現されることもまた見出されている（Ｔｓａｖａｌｅｒ，Ｌ．ら Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１：３７６０−３７６２、２００２）。マウスＣＭＲ１（マウスＴＲＰＭ８としてもまた知られる）は、マウスのＤＲＧ ｃＤＮＡ調製物からクローン化され、そしてヒトＣＭＲ１アミノ酸配列に９３％同一であることが
示された（Ｐｅｉｅｒ，Ａ．Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ １０８：７０５−７１５、２００２）。

本発明において、イヌｃＣＭＲ１遺伝子はイヌＤＲＧ組織から調製したｃＤＮＡライブラリーからクローン化した。ｃＣＭＲ１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）ならびに対応するｍＲＮＡの５’および３’非翻訳領域を包含するｃＣＲＭ１ ｃＤＮＡが配列決定された。ｃＣＭＲ１のｃＤＮＡ配列を配列番号１（表１）として示す。配列番号１は、また表１に示される１１０４残基のポリペプチド（配列番号２）をコードし、ヒト、マウスおよびラットからのＣＭＲ１タンパク質配列と整列されている（表２を参照されたい）。このアライメントに基づけば、ｃＣＭＲ１ポリペプチドは、９５．２３％のヒトＣＭＲ１と最大のアミノ酸同一性を共有する。

本発明において、ｃＣＭＲ１核酸を発現ベクターにもまたサブクローニングし、そしてｃＣＭＲ１タンパク質の発現のため宿主細胞に形質転換した。この組換えｃＣＭＲ１細胞系は、該組換えｃＣＭＲ１細胞を低温でインキュベートしたか、またはメントール若しくはイチリンに曝露させた場合に、Ｃａ^＋＋イオンの流入を可能にした機能的ｃＣＭＲ１タンパク質を発現することが示された。該組換えｃＣＭＲ１系はｃＣＲＭ１の機能若しくは発現を調節する化合物をスクリーニングかつ同定するのに有用である。ＣＭＲ１の機能若しくは発現を調節する化合物は治療上有用であり得る。これらの化合物は、例えばｃＣＭＲ１タンパク質を発現する組換え系を使用して同定し得、そしてその後、ヒトで有用であり得る投薬パラメータを確立するためにイヌ若しくはいずれかの他の適する哺乳動物でｉｎ ｖｉｖｏで試験し得る。

ＣＭＲ１タンパク質の機能若しくは発現の調節は、多様な疼痛状態の処置に有利であり得る。ＣＭＲ１受容体は、寒冷、ならびに寒冷様感覚を模倣するメントールおよびイチリンのような化合物に応答性であるため、ｃＣＭＲ１活性の調節は、鎮痛またはうっ血性鼻炎、咳若しくは喘息性気管支炎のような他の解消の方法として寒冷若しくはメントール処置を使用する治療的応用にもまた適切であることが予期される。例えば、ＣＭＲ１タンパク質の機能若しくは発現の調節は、皮膚の炎症、ならびに日焼けおよびかみそり負けを包含する皮膚の火傷、若しくは咽頭痛のような皮膚若しくは粘膜の状態を有する患者に有用であり得る。ＣＭＲ１活性の調節は、冷感異痛を引き起こす寒冷に対する過敏症に罹っている患者でもまた適切であり得る。ＣＭＲ１活性の調節は、急性疼痛、例えば歯痛（ｔｏｏｔｈａｃｈｅ）（歯痛（ｏｄｏｎｔａｌｇｉａ））、ならびに三叉神経痛（疼痛性チック）および顎関節痛のような他の三叉で分散される疼痛を処置するためにもまた適切であり得る。

加えて、ヒトＣＭＲ１は腫瘍増殖と関連するマーカーとして同定されている（Ｔｓａｖａｌｅｒ，Ｌ．ら Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１：３７６０−３７６９、２００２）ため、ｃＣＭＲ１もまたイヌの多様な細胞増殖障害の診断に有用であり得る。

ｃＣＭＲ１ホモログをクローン化するための試みにおいて、ＰＣＲに基づく戦略を使用した。オリゴヌクレオチドプライマーを、配列番号３（ｃｍｒ１−２３）および配列番号４（ｃｍｒ１−２６）に示される配列に従って合成した。これらのプライマーは、配列番号１の位置１７６１から位置２８８６までのｃＣＭＲ１配列の一部分を成功裏に増幅することが可能であった。大きさがおよそ１．１ｋｂであったＰＣＲ産物を精製し、そしてその後配列決定ベクターにサブクローニングした。１．１ｋｂのｃＣＭＲ１フラグメントの配列に基づいて新たなプライマーを開発し、そして、ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ端の迅速増幅）で改変したイヌＤＲＧ ｃＤＮＡを用いる別個のＰＣＲ反応で使用した。５’および３’双方の非翻訳領域を包含するｃＣＭＲ１ ｃＤＮＡの完全な配列が得られた（配列番号１）。ｃＣＭＲ１のオープンリーディングフレームは、表１に示されるところの１１０４残基のポリペプチド（配列番号２）をコードする。

従って、一態様において、本発明は、配列番号１の位置６９から３３８０までの配列を含んでなる単離された核酸配列を提供する。配列番号１の位置６９ないし３３８０は１個のオープンリーディングフレーム配列（コーディング領域）であり、配列番号２のＣＭＲ１ポリペプチドをコードし得る。本発明はまた、例えば配列番号１の位置１から６９までのｃＣＭＲ１のオープンリーディングフレームから上流の領域に対応する単離された核酸配列、および例えば配列番号１の位置３３８０から３８１５までのｃＣＭＲ１のオープンリーディングフレームから下流の領域に対応する単離された核酸配列も提供する。従って、別の態様において、本発明は、配列番号１の位置１から６９まで、および別の態様において配列番号１の位置３３８０から３８１５までの配列を包含する単離された核酸配列を提供する。

配列番号１のフラグメントを含んでなる単離された核酸は多様な目的上有用である。例えば、これらの配列は、ＣＭＲ１核酸の検出若しくはＣＭＲ１核酸に隣接する配列の検出のためのオリゴヌクレオチドプローブとして使用し得る。それらはＣＭＲ１核酸の増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーとして使用し得る。それらはまた、別のポリペプチド配列に融合されたｃＣＭＲ１ポリペプチドの一部分若しくは全部、例えば１種若しくはそれ以上の異種配列からの１個若しくはそれ以上のモチーフ若しくはドメインで組換えられたｃＣＭＲ１配列の１個若しくはそれ以上のモチーフ若しくはドメインをコードするキメラ核酸の製造にも使用し得る。

なお別の態様において、本発明は、配列番号２を含んでなるポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる単離された核酸を提供する。遺伝暗号の縮重により、１種以上のコドンが特定の１アミノ酸をコードするのに使用されることがあり、そして従って、ｃＣＭＲ１アミノ酸配列（例えば配列番号２）は複数の核酸配列のいずれか１つによりコードされ得る。単離された核酸は、配列中の１個若しくはそれ以上のコドンが、異なる配列のコドンにより置換されているがしかし同一アミノ酸残基をコードする配列を包含するは、本明細書で「保存的コドン置換」と称される。従って、本発明は、１種若しくは１種以上の保存的コドン置換を有する配列番号２をコードする核酸配列を包含する。当業者は、本明細書に提供される配列情報に基づき、１個若しくは１個以上の保存的コドン置換を有しかつ配列番号２をコードする特定の核酸配列を決定することが可能であろう。保存的コドン置換はＣＭＲ１ポリペプチドをコードする核酸配列中で行うことができ、例えば、コドンＴＴＴおよびＴＴＣ（集合的にＴＴＴ／Ｃと称される）はＰｈｅ（フェニルアラニン）残基をコードし得；他のコドン置換は後に続くとおりである：ＴＴＡ／ＧおよびＣＴＴ／Ｃ／Ａ／Ｇ：Ｌｅｕ；ＡＴＴ／Ｃ：Ｉｌｅ；ＡＴＧ：Ｍｅｔ；ＧＴＴ／Ｃ／Ａ／Ｇ：Ｖａｌ；ＴＣＴ／Ｃ／Ａ／Ｇ：Ｓｅｒ；ＣＣＴ／Ｃ／Ａ／Ｇ：Ｐｒｏ；ＡＣＴ／Ｃ／Ａ／Ｇ：Ｔｈｒ；ＧＣＴ／Ｃ／Ａ／Ｇ：Ａｌａ；ＴＡＴ／Ｃ：Ｔｙｒ；ＣＡＴ／Ｃ：Ｈｉｓ；ＣＡＡ／Ｇ：Ｇｌｎ；ＡＡＴ／Ｃ：Ａｓｎ；ＡＡＡ／Ｇ：Ｌｙｓ；ＧＡＴ／Ｃ：Ａｓｐ；ＧＡＡ／Ｇ Ｇｌｕ；ＴＧＴ／Ｃ：Ｃｙｓ；ＣＧＴ／Ｃ／Ａ／Ｇ：Ａｒｇ；ＡＧＴ／Ｃ：Ｓｅｒ；ＡＧＡ／Ｇ；Ａｒｇ；ＧＧＴ／Ｃ／Ａ／Ｇ：Ｇｌｙ。保存的コドン置換は、ｃＣＭＲ１ポリペプチドをコードする核酸配列中のいずれの位置でも行い得る。

本明細書に示されるとおり、配列番号１の位置６９ないし位置３３８０は、天然に発現されるところのイヌＣＭＲ１の予測された配列である１１０４アミノ酸残基のポリペプチド（配列番号２）をコードする。表２に示されるとおり、配列番号２をヒト、マウスおよびラットＣＭＲ１のタンパク質配列と整列した。アライメントにより、ｃＣＭＲ１ポリペプチド配列（配列番号２）は、ヒトＣＭＲ１タンパク質配列に最も同一であり、１１０４残基のうち１０５２を共有する（９５．２３％の同一性）。ｃＣＭＲ１タンパク質配列は、マウス（１０４２／１１４０：９４．３８％の同一性）およびラット（１０４３／１１４０：９４．４７％の同一性）ＣＭＲ１ポリペプチド配列とのより低い程度の同一性を共有する。

示されるとおり、表２に示されるところのイヌ、ヒト、マウスおよびラットＣＭＲ１配列は、全般として９０％以上のアミノ酸の同一性を共有する。しかしながら、あるアミノ酸位置で、イヌ配列はヒト、マウス若しくはラット配列の１種若しくはそれ以上と異なる。イヌ残基が１種若しくは１種以上の他の種と異なるアミノ酸位置は、該残基がヒト、イヌ、マウスおよびラット配列中で同一である位置に比較してより変動性である。例えば、配列のアライメントに基づけば、配列番号２の位置１、２および３のアミノ酸残基はヒト、マウスおよびラット配列のものに同一である。しかしながら、配列番号２の位置４および５のアミノ酸残基はヒト配列に関して変動し、また、配列番号２の位置２８のアミノ酸残基はヒト、マウスおよびラット配列に関して変動する。イヌ配列と、ヒト、マウス若しくはラットＣＭＲ１配列のいずれか１種との間に最低１個の差違が存在するアミノ酸位置は、本明細書で「ＣＭＲファミリーのバリアント位置」と称される。ＣＭＲファミリーのバリアント位置の一覧を表３に提供する。

この分析に基づけば、１個若しくはそれ以上のＣＭＲファミリーのバリアントアミノ酸の１個の置換を有するｃＣＭＲ１ポリペプチドは、ＣＭＲ１の生物学的活性を有することが予期される。すなわち、配列番号２は、１個若しくはそれ以上のＣＭＲファミリーのバリアントアミノ酸位置にて、その同一位置でヒト、マウス若しくはラット配列中で見出されるアミノ酸残基から選択される１アミノ酸、または同等な１アミノ酸で置換され得る。ｃＣＭＲ１のアミノ酸を置換するアミノ酸は本明細書で「ＣＭＲファミリーのバリアントアミノ酸」と称される。「ＣＭＲファミリーのバリアントアミノ酸」は、ｃＣＭＲ１アミノ酸と異なりかつヒト、マウス若しくはラットのような他の哺乳動物のＣＭＲ１配列中に存在するアミノ酸であるアミノ酸よりなる。そのいずれも元のｃＣＭＲ１アミノ酸残基を置換するのに使用し得る、適するＣＭＲファミリーのバリアントアミノ酸の一覧もまた表３に見出し得る。例えば、配列番号２のグルタミン酸（Ｅ）の置換に適する位置４のＣＭＲファミリーのバリアントアミノ酸はアルギニン（Ｒ、ヒトＣＭＲ１中に存在するところの）である。

いくつかのＣＭＲファミリーバリアントアミノ酸位置で、イヌ、ヒト、マウスおよびラットアミノ酸残基は共通の化学特性を共有する。例えば、配列番号２の位置１８および３４のＣＭＲファミリーバリアントアミノ酸は、疎水性アミノ酸残基、例えばメチオニン（Ｍ）若しくはロイシン（Ｌ）を包含し得る。他の疎水性アミノ酸はグリシン、バリン、イソロイシンおよびプロリンを包含する。他のアミノ酸群は、ヒスチジン、リシンおよびアルギニンを包含する「塩基性アミノ酸」；グルタミン酸およびアスパラギン酸を包含する「酸性アミノ酸」；フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンを包含する「芳香族アミノ酸」；グリシンおよびアラニンを包含する「小型アミノ酸」；セリン、トレオニンおよびシステインを包含する「求核アミノ酸」；ならびにアパラギンおよびグルタミンを包含する「アミドアミノ酸」を包含する。

従って、別の局面において、本発明は、ＣＭＲファミリーバリアントアミノ酸を包含する配列番号２のＣＭＲ１ポリペプチドをコードする核酸を提供する。いくつかの態様において、ｃＣＭＲ１ポリペプチドは、元のｃＣＭＲ１アミノ酸残基の４％未満のＣＭＲファミリーバリアントアミノ酸を包含する。好ましくは、ｃＣＭＲ１ポリペプチドは、元のｃＣＭＲ１アミノ酸残基の約２％未満、および、最も好ましくは元のｃＣＭＲ１アミノ酸残基の約１％未満のＣＭＲファミリーバリアントを包含する。

本発明はまた、本明細書に記述されるところのいずれかの単離された核酸分子に相補的である単離された核酸分子も提供する。

本発明の単離された核酸は、付加的なアミノ酸残基を有するｃＣＭＲ１ポリペプチドをコードする核酸配列もまた包含し得る。いくつかの態様において、該付加的なアミノ酸は、アミノ末端、カルボキシル末端に、ｃＣＭＲ１配列内、若しくはこれらの位置の組合せに存在する。これらの型の付加的なアミノ酸配列を有するｃＣＭＲ１ポリペプチドは、「ｃＣＭＲ１融合タンパク質」と称され得る。いくつかの場合において、付加的なアミノ酸配列の性質に依存して、それらをそうでなければ「キメラ」若しくは「標識」ｃＣＭＲ１タンパク質と称することがより適切でありうる。にもかかわらず、本明細書に提供される配列情報を考えれば、付加的なアミノ酸配列を有するＣＭＲ１ポリペプチドを識別することが可能であろう。付加的なアミノ酸残基は、短い（例えば１から約２０までの付加的なアミノ酸残基）、若しくはより長い（例えば約２０以上の付加的なアミノ酸残基）ことができる。付加的なアミノ酸残基は、例えばタンパク質（例えば抗体）若しくは小分子の結合のためのエピトープとしてはたらくこと；細胞内および細胞外輸送のための標識としてはたらくこと；付加的な酵素若しくは他の活性を提供すること；または検出可能なシグナルを提供することを包含する、１種若しくはそれ以上の機能若しくは目的を供し得る。

例えば、核酸配列は、有機若しくは無機化合物との（イオン、共有、配位、水素若しくはファンデルワールス結合のような結合、またはそれらの組合せのための座標（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）を提供する付加的なアミノ酸残基を包含し得るｃＣＭＲ１融合タンパク質をコードし得る。有用な付加的なアミノ酸配列は、例えば、Ｎｉ^＋結合した残基を介するタンパク質の精製に有用なポリヒスチジン残基、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメイン若しくはそれらの部分（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、アルブミン、検出若しくは精製のための免疫複合体の形成に有用なヘマグルチニン（ＨＡ）若しくはｍｙｃ親和性エピトープ標識（これらの部分に対する抗体は商業的に得ることができる）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような検出に有用なポリペプチド、β−ガラクトシダーゼ（Ｂ−Ｇａｌ）クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼおよびアルカリホスファターゼ（Ａ）のような酵素、タンパク質輸送のためのシグナル配列、ならびに所望の場合はｃＣＭＲ１配列から付加的なアミノ酸配列を分離するのに有用なプロテアーゼ切断配列を包含する。

別の局面において、ｃＣＭＲ１タンパク質若しくは核酸のようなｃＣＭＲ１の発現を検出することが可能である診断アッセイが提供される。ｃＣＭＲ１タンパク質の発現は、検出可能に標識されているか若しくは後に標識され得るプローブにより検出し得る。典型的には、プローブは上述されたところの発現されたタンパク質を認識する抗体、とりわけモノクローナル抗体である。従って、一態様において、ｃＣＭＲ１タンパク質の発現を検出することが可能なアッセイは、ｃＣＭＲ１に結合する１種若しくは１種以上のモノクローナルおよび／若しくはポリクローナル抗体とイヌ組織サンプルを接触させることを含んでなる。

ｃＣＭＲ１核酸およびタンパク質、ＣＭＲ１に向けられた抗体、ならびにこれらの成分のいずれかを含有する生物学的系は、検出可能な試薬で標識し得るか、若しくは、ｃＣＭＲ１に対する特異性を有する化合物を検出可能な試薬で標識し得、そしてｃＣＭＲ１の実体を検出するために使用し得る。検出可能な試薬は、分光学的、生化学的、光化学的、生体電子工学的、免疫化学的、電気的、光学的若しくは化学的技術により検出され得る化合物および組成物を包含する。検出可能な部分の例は、限定されるものでないが、放射性同位元素（例えば^３２Ｐ ^３３Ｐ、^３５Ｓ）、化学発光化合物、標識結合タンパク質、重金属原子、蛍光マーカーおよび色素のような分光学的マーカー、結合された酵素、質量分析標識ならびに磁性標識を挙げることができる。

抗体を利用するイムノアッセイ法は、限定されるものでないがドットブロッティング、ウエスタンブロッティング、競合的および非競合的タンパク質結合アッセイ、酵素結合免
疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）、イムノＰＣＲ、免疫沈降および一般に使用される他者を挙げることができる。

ｃＣＭＲ１遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現のレベルは、一般に使用される分子生物学的方法、例えばノーザンブロッティング、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護アッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ（リアルタイム、定量的ＰＣＲを包含する）、高密度アレイおよび他のハイブリダイゼーション法を利用して検出し得る。従って、別の態様において、ｃＣＭＲ１核酸にハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドとイヌ組織サンプルを接触させることを含んでなる、イヌ組織のサンプル中の１種若しくは１種以上のｃＣＭＲ１遺伝子の発現を検出することが可能なアッセイが提供される。オリゴヌクレオチドプライマーは、一般に、ＰＣＲ／プライマー伸長実験のため長さが１０〜２０ヌクレオチドからである。およそ４０〜５０ヌクレオチドのより長いオリゴヌクレオチドが、ｉｎ ｓｉｔｕ若しくはブロットハイブリダイゼーションにより恒常的に利用される。５０ヌクレオチドより長い配列さえ、検出実験にもまた使用され得る。ＲＮＡは、例えばＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９６）に記述されるところの当業者に公知の方法により、組織サンプルから単離し得る。ｃＣＭＲ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡのレベルの好ましい一検出方法はＲＴ−ＰＣＲによる。ＲＴ−ＰＣＲ技術の詳細は公知であり、かつ、本明細書にもまた記述される。

開示される遺伝子の１種以上から得られるｍＲＮＡ転写物のレベルの別の好ましい検出方法は、オリゴヌクレオチド若しくは組織の秩序正しいアレイへの標識ｍＲＮＡのハイブリダイゼーションを必要とする。こうした方法は、複数のこれらの遺伝子の転写のレベルを同時に測定して遺伝子発現プロファイル若しくはパターンを生成させることを可能にする。

本ハイブリダイゼーション法で利用されるオリゴヌクレオチドは、典型的には固体支持体に結合される。固体支持体の例は、限定されるものでないが、膜、フィルター、スライドガラス、紙、ナイロン、ウエハー、ファイバー、磁性若しくは非磁性ビーズ、ゲル、管、ポリマー、ポリ塩化ビニル皿などを挙げることができる。オリゴヌクレオチドを、直接若しくは間接的のいずれかで共有若しくは非共有いずれかで結合させ得るいかなる固体表面も使用し得る。とりわけ好ましい固体支持体は高密度アレイすなわちＤＮＡチップである。これらの高密度アレイは、特定のオリゴヌクレオチドプローブをアレイ上の予め選択された場所に含有する。各予め選択された場所は１分子以上の特定のプローブを含有し得る。該オリゴヌクレオチドは支持体上の指定された場所にあるため、ハイブリダイゼーションパターンおよび強度（一緒に独特の発現プロファイル若しくはパターンをもたらす）を、特定の遺伝子の発現レベルに関して解釈し得る。

オリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは、目的の上で同定された遺伝子（１種若しくは複数）の相補的転写物にのみ特異的にハイブリダイズするのに十分な長さのものである。

場合によっては、ｃＣＭＲ１核酸配列の全部若しくは一部分を、他の種からの核酸調製物をプロービングして類似の配列の存在を決定するのに使用し得る。例えば、ｃＣＭＲ１核酸の全部若しくは一部分を、ｃＣＭＲ１配列に類似である他の種からのｃＤＮＡ若しくはゲノム核酸配列を同定するのに、プロービングされたとして使用し得る。陽性のクローンを、ｃＣＭＲ１プローブにハイブリダイズするものと同定し得る。

加えて、本発明により提供されるところのｃＣＭＲ１核酸若しくはポリペプチド配列の全部若しくは一部分を、他の有用な情報、例えばｃＣＭＲ１配列に対する相同性を有する
タンパク質若しくはｃＣＭＲ１配列に結合する分子を同定するためにコンピュータ支援プログラムで使用し得る。例えば、ｃＣＭＲ１配列の全部若しくは部分を使用して多様な電子的データベースをスクリーニングして、該電子的データベースのメンバーがｃＣＭＲ１配列に対する相同性を有するかどうかを決定し得る。種特異的である多数の遺伝子データベースを、本明細書に示されるところのイヌ核酸若しくはポリペプチド配列のいずれかの部分を使用して問い合わせ得る。核酸およびタンパク質のいずれか若しくは双方の検索を実施し得る。

別の局面において、ｃＣＭＲ１ポリペプチドの三次元モデルを決定し得、そして、該タンパク質構造の多様な部分に結合する分子を同定するのに使用し得る。例えば、本明細書に記述されるところの単離されたｃＣＭＲ１核酸を使用して、ｃＣＭＲ１タンパク質を細胞系にて発現、精製し、そしてその後該タンパク質の構造に関する情報を得るために結晶化し得る。構造の情報は、例えばＸ線回折若しくは核磁気共鳴分光法を実施することにより得ることができる。アミノ酸残基およびそれらの側鎖の位置は、三次元モデル中の座標として表し得る。この情報をその後、コンピュータプログラムに提供し得る。

分子モデル化プログラムを使用して、小分子がｃＣＭＲ１ポリペプチドの機能上適切な部分、例えば活性部位に適合し得るかどうかを決定し得る。分子モデル化に関する基礎的な情報は、例えば、Ｍ．Ｓｃｈｌｅｃｈｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ＰＣ、１９９８、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；Ｇａｎｓら、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ、１９９６、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂ．Ｃｏｒｐ．；Ｎ．Ｃ．Ｃｏｈｅｎ（編者）、Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ ｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ、１９９６、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；およびＷ．Ｂ．Ｓｍｉｔｈ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ、１９９６に提供される。分子モデル化に関する詳細な情報を提供する米国特許は、米国特許第６，０９３，５７３号；同第６，０８０，５７６号；同第５，６１２，８９４号；および同第５，５８３，９７３号を包含する。

分子モデル化研究に有用であり得るプログラムは、例えば、オックスフォード大学、英国オックスフォードから入手可能なＧＲＩＤ（Ｇｏｏｄｆｏｒｄ，Ｐ．Ｊ．、“Ａ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃａｌｌｙ Ｆａｖｏｒａｂｌｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅｓ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２８、ｐｐ．８４９−８５７、１９８５）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ、マサチューセッツ州バーリントンから入手可能なＭＣＳＳ（Ｍｉｒａｎｋｅｒ，Ａ．とＭ．Ｋａｒｐｌｕｓ、“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ Ｍａｐｓ ｏｆ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅｓ：Ａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｏｐｙ Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｓｅａｒｃｈ Ｍｅｔｈｏｄ．”Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１１、ｐｐ．２９−３４、１９９１）；Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、カリフォルニア州ラホヤから入手可能なＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｇｏｏｄｓｅｌｌ，Ｄ．Ｓ．とＡ．Ｊ．Ｏｌｓｅｎ、“Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｄｏｃｋｉｎｇ ｏｆ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ａｎｎｅａｌｉｎｇ”Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８、ｐｐ．１９５−２０２、１９９０）；およびカリフォルニア大学、カリフォルニア州サンフランシスコから入手可能なＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｚ，Ｉ．Ｄ．ら、“Ａ Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈ
ｔｏ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ−Ｌｉｇａｎｄ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６１、ｐｐ．２６９−２８８、１９８２）を包含する。

ｃＣＭＲ１ポリペプチドをコードする核酸配列に加え、本発明はまた、ｃＣＭＲ１ポリペプチド、ｃＣＭＲ１ポリペプチドバリアント、ｃＣＭＲ１ポリペプチドのフラグメント、および付加的なアミノ酸を有するｃＣＭＲ１ポリペプチドも包含する。核酸によりコードされるｃＣＭＲ１ポリペプチドの局面が本明細書に記述され、そしてこれらの局面はｃＣＭＲ１ポリペプチドにもまた当てはまり得る。

一態様において、本発明は、配列番号２の配列を包含する単離されたポリペプチドを提供する。

別の態様において、本発明は、元のｃＣＭＲ１アミノ酸残基の４％未満のＣＭＲファミリーバリアントアミノ酸を有する配列番号２の配列を包含する単離されたポリペプチドを提供する。好ましくは、ｃＣＭＲ１ポリペプチドは、元のｃＣＭＲ１アミノ酸残基の約２％未満、および最も好ましくは元のｃＣＭＲ１アミノ酸残基の約１％未満のＣＭＲファミリーバリアントを包含する。

本明細書に記述されるところのｃＣＭＲ１ポリペプチドは、そのアミノ末端、そのカルボキシル末端若しくは双方に付加的なアミノ酸残基もまた有し得る。こうした付加的な残基は、例えば免疫検出、精製、細胞輸送、酵素活性などを包含する多様性若しくは目的上有用である。

本発明はまたｃＣＭＲ１ポリペプチドのフラグメントも提供する。ｃＣＭＲ１ポリペプチドのフラグメントは、例えば抗体製造を包含する多数の目的上有用であり得る。ｃＣＭＲ１ポリペプチド配列の部分若しくは配列それ自身全体を、抗ＣＭＲ１抗体を生成させるのに使用し得る。

別の局面において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列内のエピトープを特異的に認識する抗体に関する。有用な抗体は、限定されるものでないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化若しくはキメラ抗体、およびｃＣＭＲ１タンパク質の一部分に結合することが可能である生物学的に機能的な抗体フラグメントを挙げることができる。前述の配列によりコードされるタンパク質に特異的な抗体は、いくつかの型の応用で有用性を有する。これらの抗体は、例えばｃＣＭＲ１の検出が望ましいいかなる種類のアッセイのための診断キットでも使用し得る。それらはまた、例えば抗ｃＣＭＲ１抗体それ自身が治療的であるか、若しくは抗ｃＣＭＲ１抗体が治療薬に結合されている治療薬の製造でも使用し得る。抗ｃＣＭＲ１抗体を疼痛を処置するために使用し得ることが予期される。これらの場合には、抗ｃＣＭＲ１抗体は、例えばアゴニスト（例えば触媒）若しくは拮抗活性のいずれかを提供してｃＣＭＲ１の活性を調節し得る。

本発明はまた、イヌ特異的モノクローナル抗ＣＭＲ１抗体の製造方法も提供する。これらのモノクローナル抗体の製造のため、独特の抗ｃＣＭＲ１決定子を提供するペプチドを使用し得る。モノクローナル抗体は、特異的抗原（すなわちエピトープ）に向けられる抗体の均質なクローン集団である。抗ｃＣＭＲ１モノクローナル抗体を製造するため、ｃＣＭＲ１特異的配列すなわち「ｃＣＭＲ１エピトープ」を有するペプチドを使用する。ｃＣＭＲ１配列は、イヌ、マウスおよびラットＣＭＲ１配列に関して１個若しくはそれ以上の位置で異なるものである。ｃＣＭＲ１特異的配列を決定するために、本明細書に提供される表２を参照し得る。

モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、培養物中の連続継代細胞株による抗体分子の産生を提供するいかなる技術によっても得ることができる。これらは、例えば、ハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５−４９７、１９
７５）；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、４：７２、１９８３）；およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、ｐｐ．７７−９６、１９８５）を包含する。こうした抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤを包含するいずれの免疫グロブリンのクラス若しくはそれらのいずれのサブクラスのものであってもよい。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマはｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏで培養しうる。

ＣＭＲ１タンパク質に対する抗体の製造のため、多様な宿主動物を、ｃＣＭＲ１ポリペプチド若しくはその一部分での注入により免疫し得る。ｃＣＭＲ１ポリペプチド全体を使用する場合、ｃＣＭＲ１に特異的な抗体が、異なる種からの他のＣＭＲ１タンパク質と交差反応性である抗ＣＭＲ抗体と一緒に生成されうる。例えば、ポリクローナル抗体調製物は、ＣＭＲ１ポリペプチドのような抗原で免疫した動物の血清由来の抗体分子の不均質な集団である。このポリクローナル集団中で、抗体はＣＭＲ１ポリペプチドの多様な部分と交差反応することができ、それらの抗体のいくつかはｃＣＭＲ１と特異的に反応性であり、また、他者は他の種のＣＭＲ１ポリペプチドと交差反応性である。ポリクローナル抗体の製造のため、ｃＣＭＲ１タンパク質若しくはその一部分で、典型的には該動物中での抗体力価を引き上げるために反復して、また、典型的には本明細書に記述されるところのアジュバントを補充して、宿主動物を免疫する。抗ＣＭＲ１抗体の製造に一般に使用される宿主動物はウサギ、マウスおよびラットを包含するが；しかしながら所望の場合は他の動物を使用し得る。多様なアジュバント、例えばフロイントの（完全および不完全）アジュバント、ならびに水酸化アルミニウムのような鉱物ゲルを、宿主種に依存して免疫学的応答を増大させるために使用しうる。とりわけ免疫化および抗体産生の目的上より短いｃＣＭＲ１ペプチドを使用する場合に、免疫化のため複合物（例えばＫＬＨ）もまた包含し得る。

ｃＣＭＲ１ポリペプチド若しくはｃＣＭＲ１ポリペプチドフラグメントは、いずれの種類の合成若しくは分子生物学的技術を使用しても生成させ得る。標準的な合成ペプチド技術を使用して、より小さいｃＣＭＲ１ポリペプチドフラグメント、例えば長さが３０アミノ酸若しくはより短いペプチドフラグメントを生成し得る。ペプチドフラグメントの合成技術は公知であり、そして例えばＴｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ．２：Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ Ａ．中、ＢａｒａｎｙとＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；ｐｐ．３−２８４、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５：２１４９−２１５６（１９６３）、およびＳｔｅｗａｒｔら、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版 Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、イリノイ州ロックフォード（１９８４）に記述されている。

組換え技術を、例えばｃＣＭＲ１核酸で形質転換した原核生物若しくは真核生物宿主細胞からのｃＣＭＲ１の部分、バリアントおよび融合物を包含するｃＣＭＲ１の発現に使用し得る。これらの方法は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換えを包含する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（２００１）；およびＡｕｓｕｂｅｌら編、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク（１９９９）に記述される技術を参照されたい）。

従って、ｃＣＭＲ１は、（ａ）ｃＣＭＲ１配列を含んでなる核酸を提供すること、（ｂ
）宿主細胞に該核酸を挿入すること、および（ｃ）ｃＣＭＲ１ポリペプチドの発現を見込む条件下で該宿主細胞を維持することにより製造し得る。精製されたｃＣＭＲ１ポリペプチドが望ましい場合は、ｃＣＭＲ１ポリペプチドを単離および所望の場合は精製する段階もまた実施し得る。

別の態様において、本発明は、制御配列に操作可能に連結されたｃＣＭＲ１コーディング配列全体若しくはその一部分を包含する異種核酸構築物を提供する。これらの異種核酸構築物は、宿主細胞中でのｃＣＭＲ１核酸の発現に適する組換え発現ベクターを包含する。組換え発現ベクターは、ｃＣＭＲ１核酸配列に操作可能に連結された、ｃＣＭＲ１発現に使用される宿主細胞の型に基づき選択され得る１個若しくはそれ以上の制御配列を包含する。制御配列は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現調節領域、例えばポリ（Ａ）＋配列を包含する。制御配列は、原核生物細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌細胞、あるいは酵母細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞（例えばＨＥＫ、ＣＨＯ若しくはＣＯＳ細胞）のような真核生物細胞に特異的であり得る。制御配列は、ｃＣＭＲ１核酸配列に関してｃｉｓ若しくはｔｒａｎｓに配置され得る。制御配列は、多様な増殖条件下および多様な宿主細胞中での核酸の発現を典型的に駆動する構成的発現配列、特定の宿主細胞若しくは組織中での発現を駆動する組織特異的制御配列、および二次因子に応答して発現を駆動する誘導可能な制御配列を包含し得る。発現ベクターの選択および設計は、利用される特定の宿主細胞、およびポリペプチド発現の所望のレベルのような因子に依存し得る。他の発現ベクター成分は、限定されるものでないが以下、すなわちシグナル配列、複製起点、１種若しくはそれ以上の選択遺伝子および転写終止配列の１種若しくはそれ以上を挙げることができる。選択遺伝子は、（ａ）抗生物質若しくは他のトキシン、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート若しくはテトラサイクリンに対する耐性を与える、（ｂ）栄養要求欠損を補足する、または（ｃ）複合培地から利用可能でない決定的な栄養素を補充するタンパク質をコードする。

ｃＣＭＲ１ポリペプチドの発現に使用される異種核酸構築物はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写かつ翻訳され得る構築物、例えばＴ７プロモーター制御配列を有する構築物も包含し得る。

ｃＣＭＲ１の発現に適するベクターは当該技術分野で既知であり、そして商業的に入手可能である。適するベクターは、例えば、それぞれＮｏｖａｇｅｎおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能でありかつ大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）、ＣＯＳ細胞およびバキュロウイルスに感染させた昆虫細胞中での発現に使用し得る、ｐＥＴ−１４ｂ、ｐＣＤＮＡ１ＡｍｐおよびｐＶＬ１３９２を包含する。

別の態様において、本発明はｃＣＭＲ１核酸を包含する組換え細胞を提供する。組換え細胞は核酸配列が導入されたものを包含する。典型的には、組換え細胞は、分子生物学的技術を使用して特定の核酸を細胞に導入することにより創製する。しかしながら、組換え細胞は、所望の核酸配列の発現を促進するための他の方法で操作された細胞もまた包含する。例えば、標的核酸配列の近位にある領域を、標的核酸の発現を促進するように変えることができるか、若しくは、標的核酸の発現を調節するように作用する遺伝子を細胞に導入し得る。

組換え細胞は、増殖および分割の期間の後に出発親細胞に同一でないことがあるが；しかしながら、これらの細胞はなお組換え細胞と称され、そして本明細書で使用されるところの該用語の範囲内に包含される。

ｃＣＭＲ１発現の機構をもちかつ提供するのに適する宿主細胞は、原核生物および真核生物双方の細胞を包含する。適する原核生物宿主細胞の例は、グラム陰性若しくはグラム
陽性生物体のような真正細菌、例えば、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような腸内細菌科、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えばネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ならびに枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のようなバチリ属（Ｂａｃｉｌｌｉ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）およびストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）である。

糸状菌若しくは酵母のような真核生物細胞はｃＣＭＲ１発現ベクターの適するクローニング若しくは発現宿主である。パン酵母としてもまた知られるサッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は一般に使用される発現系であり、そして多様なプロモーターおよび選択可能なマーカー配列を提供する。宿主細胞として有用な他の真菌若しくは酵母は、スキゾサッカロミセス ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）およびアスペルギルス ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）を包含する。

ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、サル腎（ＣＯＳ）細胞、イヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞、ヒト子宮頚癌（ＨｅＬａ）細胞、およびヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞のような哺乳動物細胞、ならびに植物細胞を包含する多くの高等真核生物宿主細胞を使用し得る。

形質転換した宿主細胞の増殖は当該技術分野で既知である条件下で起こり得る。該条件は、一般に、使用される宿主細胞およびベクターの型に依存する。温度および化学物質のような適する誘導条件を使用することができ、そして利用されるプロモーターの型に依存することができる。適する培地の例は、最小必須培地（（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０およびダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を包含する。

発現構築物を包含する核酸は、慣習的な形質転換若しくはトランスフェクション技術を介して原核生物若しくは真核生物細胞に導入し得る。本明細書で使用されるところの「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウム若しくは塩化カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、遺伝子銃若しくは電気穿孔法を包含する、宿主細胞中に外来核酸分子（例えばＤＮＡ）を導入するための多様な技術に認識された技術を指すことを意図している。宿主細胞の適する形質転換若しくはトランスフェクション方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）および他の実験室手引書に見出し得る。

哺乳動物細胞は、選択可能なマーカー遺伝子を有する発現構築物および目的の遺伝子で安定にトランスフェクトし得る。典型的には、哺乳動物細胞の選択可能なマーカーは、抗生物質耐性遺伝子、例えば形質転換された細胞をＧ４１８、ハイグロマイシン若しくはメトトレキセートのような化合物の存在下で増殖させる遺伝子を包含する。

組換え細胞は、精製の目的上、若しくはｃＣＭＲ１ポリペプチドを伴う機能研究のためのｃＣＭＲ１ポリペプチドの製造に有用であり得る。例えば、組換えｃＣＭＲ１細胞を使用して、多数の化合物を、ｃＣＭＲ１ポリペプチドの活性を変えるそれらの能力について試験し得る。組換えｃＣＭＲ１細胞はまた、ｃＣＭＲ１ポリペプチドの多様な特性を変えること、例えばｃＣＭＲ１ポリペプチドのアミノ酸配列を変えることがｃＣＭＲ１活性にどのように影響を及ぼすかを試験するのにも使用し得る。

ｃＣＭＲ１核酸配列を有する組換え細胞は、ヒト以外のトランスジェニック動物を製造するのにもまた使用し得る。導入遺伝子は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム中に組込まれかつ成熟動物のゲノム中に留まってそれによりトランスジェニック動物の１種若しくはそれ以上の細胞型若しくは組織中でのコードされる遺伝子産物の発現を指図する、外因性ＤＮＡである。例えば、ｃＣＭＲ１核酸配列を含有する核酸は、微小注入法のような適する技術を使用して、受精卵母細胞若しくは胚性幹細胞のような宿主細胞中に導入し得る。これらのｃＣＭＲ１を含有する宿主細胞をその後、ヒト以外のトランスジェニック動物を創製するのに使用し得る。とりわけ有用な動物は、ｃＣＭＲ１遺伝子を有するトランスジェニックマウス若しくはラットを包含し、それらはまた、例えば疼痛モデルのような研究にそれらを有用にする身体的若しくは遺伝的特徴も有し得る。

ｃＣＭＲ１トランスジェニック動物を使用して、潜在的に有用な化合物、またはｃＣＭＲ１の機能若しくは発現を調節する既知化合物を同定、スクリーニング若しくは試験し得る。これらのトランスジェニック動物は、そのアミノ酸配列を変えることにより、ｃＣＭＲ１ポリペプチドの機能を研究するのにもまた使用し得る。

胚の操作および微小注入を介するトランスジェニック動物、とりわけマウスのような動物の生成方法は、当該技術分野で慣習的になっており、そして例えば米国特許第４，７３６，８６６号および同第４，８７０，００９号、米国特許第４，８７３，１９１号明細書、ならびにＨｏｇａｎ、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８６）に記述されている。相同的組換えベクターおよび相同的組換え動物の構築方法は、Ｂｒａｄｌｅｙ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２：８２３−８２９、１９９１）ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ ９０／１１３５４号、同第ＷＯ ９１／０１１４０号、同第ＷＯ ９２／０９６８号および同第ＷＯ ９３／０４１６９号明細書にさらに記述されている。本明細書に記述されるヒト以外のトランスジェニック動物のクローンは、Ｗｉｌｍｕｔら（Ｎａｔｕｒｅ、３８５：８１０−８１３、１９９７）ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ ９７／０７６６８号および同第ＷＯ ９７／０７６６９号明細書に記述される方法に従ってもまた製造し得る。

いくつかの場合には、例えばＣＭＲ１調節物質であることが疑われる化合物の特異性を試験するために、系に存在するＣＭＲ１の量を減少させることが望ましいことができる。本明細書に記述されるところの組換え細胞若しくはトランスジェニック動物を、その表面上で発現される若しくは存在するＣＭＲ１の量を減少させるために操作し得る。例えば、細胞は、細胞中に存在するｃＣＭＲ１ ＲＮＡの量を減少させてそれによりｃＣＭＲ１タンパク質発現を低下させる分子を包含し得る。適する分子は、アンチセンスヌクレオチド、リボザイム、二本鎖ＲＮＡ、干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）およびアンタゴニスト若しくはアゴニストを包含する。

多様な方法をｃＣＭＲ１ポリペプチドの精製に使用し得る。例えば、粗精製は、硫酸アンモニウム沈殿、遠心分離若しくは他の既知技術を使用して実施し得る。より高程度の精製は、例えば陰イオン交換、陽イオン交換、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ゲル濾過、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィー、例えばｃＣＭＲ１タンパク質に向けられた抗体を使用するイムノアフィニティークロマトグラフィーを包含する適するクロマトグラフィー技術により達成し得る。必要とされる場合は、該タンパク質をリフォールディングするための段階を使用して、ｃＣＭＲ１タンパク質が細胞内の合成、単離若しくは精製の間に変性される場合に該タンパク質の活性のコンホメーションを得ることができる。

本発明はまた、生物学的サンプル（試験サンプル）中の本発明のポリペプチド若しくは核酸の存在を検出するためのキットも包含する。こうしたキットは、好ましくは、緊密な閉じこめの最低１個の容器中に保持するのに適する区画化された容器を含んでなる。担体は、標識抗原若しくは酵素基質などのような検出のための手段を含有し得る。例えば、キットは、該ポリペプチド若しくは該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出することが可能な標識化合物若しくは剤、およびサンプル中の該ポリペプチド若しくはｍＲＮＡの量を測定するための手段（例えば、該ポリペプチドを結合する抗体、または該ポリペプチドをコードするＤＮＡ若しくはｍＲＮＡに結合するオリゴヌクレオチドプローブ）を含み得る。キットはまた、該ポリペプチド若しくは該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの量が正常レベルより上若しくは下である場合に、試験被験体が該ポリペプチドの異常な発現を伴う障害に罹っているか若しくはそれを発症する危険にさらされているかどうかを決定するための説明書も包含し得る。

抗体に基づくキットについては、該キットは、例えば：（１）配列番号２に対する最低９６％の配列の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドに選択的に結合する第一の抗体（例えば固体支持体に結合された抗体）；および、場合によっては；（２）第一の抗体、若しくは、第一の抗体がしかし異なるエピトープで結合するポリペプチドのいずれかに結合しかつ検出可能な剤に結合されている第二の抗体；ならびに（３）陽性対照としての精製された組換えｃＣＭＲ１タンパク質を含み得る。好ましくは、第一の抗体は、ｃＣＭＲ１にのみ結合するが、しかしヒト、ラット若しくはマウスのような他の種からのＣＭＲ１に結合しない。

オリゴヌクレオチドに基づくキットについては、該キットは、例えば：（１）緊縮性条件下で配列番号１にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、例えば検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド、若しくは（２）配列番号２に対する最低９６％の配列の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子を増幅するのに有用な一対のプライマーを含み得る。該キットはまた、例えば緩衝剤、保存剤若しくはタンパク質安定剤も含み得る。該キットはまた、検出可能な剤を検出するために必要な成分（例えば酵素若しくは基質）も含み得る。該キットはまた、アッセイしかつ試験サンプルと比較し得る１個の対照サンプル若しくは一連の対照サンプルも含有し得る。該キットの各成分は、通常、個別の容器内に封入され、そして多様な容器の全部が、好ましくは単一の包装内に含有される。

ＣＭＲ１は冷（ｃｏｏｌ）ないし寒（ｃｏｌｄ）温で活性化されかつ神経組織中で発現されるため、この遺伝子は、疼痛、炎症および皮膚障害、例えば日焼けおよび他の感作状態を伴うものの処置において有用な薬物の同定のための治療標的としてはたらき得る。従って、別の一般的局面において、本発明は、治療的化合物、例えば疼痛の処置、低温に対する応答の調節において有用な化合物、および皮膚に冷覚を提供する化合物の同定方法におけるｃＣＭＲ１核酸およびタンパク質の使用に関する。これらの型の化合物は、ｃＣＭＲ１ポリペプチド若しくはｃＣＭＲ１核酸を包含する系を使用して同定し得る。化合物はまた、動物モデル系、例えばラット、マウス若しくはイヌモデル系においてｉｎ ｖｉｖｏでも直接試験し得る。とりわけ有用な系は疼痛の動物モデルを包含する。これらの方法は、ｃＣＭＲ１タンパク質の発現、ｃＣＭＲ１チャンネルの伝導性、若しくは動物の侵害受容挙動を増大若しくは低下させる多様な化合物の能力についてアッセイすることを含んでなる。

化合物の同定方法は、慣習的な実験室の形式を使用して、若しくはハイスループットに適合されたアッセイで実施し得る。「ハイスループット」という用語は、同時のかつ／若しくは迅速な連続での複数のサンプルの容易なスクリーニングを可能にするアッセイデザインを指し、そしてロボット操作の能力を包含し得る。ハイスループットアッセイの別の
所望の特徴は、試薬の使用を低減させるか若しくは所望の分析を達成するための操作の数を最小限にするように最適化されているアッセイデザインである。アッセイ形式の例は、９６ウェル若しくは３８４ウェルプレート、浮遊液滴、および液体取扱い実験に使用される「実験室チップ（ｌａｂ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ）」マイクロチャンネルチップを包含する。プラスチック型および液体取扱い装置の小型化が進んだため、若しくは改良されたアッセイ装置が設計されるため、本発明の設計を使用してより多数のサンプルが処理され得ることが当業者により公知である。

候補化合物は、限定されるものでないが小型の有機若しくは無機化合物、抗体、タンパク質若しくはそのフラグメント、アンチセンスヌクレオチド、干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）およびリボザイムのような天然若しくは合成分子を挙げることができる、多数の化学的分類を包含する。好ましくは、それらは小型有機化合物、すなわち５０以上だがなお約２５００未満の分子量を有するものである。候補化合物は、ポリペプチドとの構造的相互作用に必要な官能性化学基を含んでなり、かつ、典型的には最低１個のアミン、カルボニル、ヒドロキシル若しくはカルボキシル基、好ましくは官能性化学基の最低２個、およびより好ましくは官能性化学基の最低３個を包含する。候補化合物は、上で同定された官能基の１個若しくはそれ以上で置換された炭素環若しくは複素環構造および／または芳香族若しくは多環芳香族構造を含み得る。候補化合物はまた、ペプチド、糖、脂肪酸、ステロール、イソプレノイド、プリン、ピリミジンのような生体分子、上の誘導体若しくは構造的アナログ、またはそれらの組合せなどでもあり得る。化合物が核酸である場合、該化合物は典型的にＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子であるが、とは言え非天然の結合若しくはサブユニットを有する修飾核酸もまた企図している。

候補化合物は、合成若しくは天然の化合物のライブラリーを包含する多様な供給源から得られる。例えば、多数の手段が、無作為化オリゴヌクレオチドの発現、合成有機コンビナトリアルライブラリー、ランダムペプチドのファージディスプレイライブラリーなどを包含する多様な有機化合物および生体分子の無作為および指向性合成に利用可能である。候補化合物はまた、生物学的ライブラリー；空間的に接近可能な平行固相若しくは溶液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物（ｏｎｅ−ｂｅａｄ ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５）を包含する当該技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチのいずれを使用しても得ることができる。あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然の化合物のライブラリーが利用可能であるか、若しくは容易に製造される。加えて、天然のおよび合成で製造されるライブラリーおよび化合物は、慣習的な化学的、物理的および生化学的手段により容易に改変し得る。

さらに、既知の薬理学的剤を、該剤の構造的アナログを製造するために、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などのような指向された若しくは無作為の化学修飾にかけることができる。候補化合物は無作為に選択し得るか、またはＣＭＲ１に結合かつ／若しくはＣＭＲ１活性の機能を調節する既存の化合物に基づくことができる。従って、候補の剤の供給源は、より多い若しくはより少ない化学的部分または異なる化学的部分を含有するように分子の１個若しくはそれ以上の位置で化合物の構造が変えられている、ＣＭＲ１チャンネルの伝導性を増大若しくは低下させる１種若しくは１種以上の既知化合物に基づく分子の１種若しくは１種以上のライブラリーである。類似の活性化物質／阻害剤のライブラリーの創製において分子になされる構造的変化は、指向され得るか、無作為であり得るか、または指向性および無作為化双方の置換および／若しくは付加の組合せであり得る。コンビナトリアルライブラリーの製造の当業者は、既存の化合物に基づき、こうしたライブラリーを容易に製造し得る。

多様な他の試薬もまた混合物中に包含され得る。これらは、最適なタンパク質−タンパク質および／若しくはタンパク質−核酸結合を助長するのに使用し得る塩、緩衝剤、中性タンパク質（例えばアルブミン）、洗剤などのような試薬を包含する。こうした試薬はまた、反応成分の非特異的すなわちバックグラウンドの相互作用も低下させ得る。ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤などのようなアッセイの効率を向上させる他の試薬もまた使用し得る。

分子ライブラリーの合成方法の例は、当該技術分野で、例えば：Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）．Ｊ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８に見出され得る。化合物のライブラリーは、溶液中で（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２−４２１）、またはビーズ（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号明細書）、胞子（特許第５，５７１，６９８号明細書）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８６５−１８６９）若しくはファージ（例えばＳｃｏｔｔとＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０を参照されたい）上に提示され得る。

一局面において、本発明は：（ａ）ｃＣＭＲ遺伝子の発現を調節するための機構を含んでなる細胞と試験化合物を接触させる段階；および（ｂ）該試験化合物が、該細胞からの前記機構により制御される遺伝子の発現を増大若しくは減少させるかどうかを決定する段階を含んでなる、ｃＣＭＲ１タンパク質の発現を増大若しくは減少させる化合物の同定方法を提供する。ｃＣＭＲ遺伝子の発現を調節するための機構は、核、細胞質若しくは細胞内因子が転写若しくは翻訳のレベルで遺伝子の作用の制御に影響する機構を包含する。例えば、該機構は遺伝子活性化若しくは遺伝子抑制を包含する。ｃＣＭＲ遺伝子の発現を調節するための機構を含んでなる細胞は、イヌＤＲＧ細胞のようなｃＣＭＲを内因性に発現する天然の宿主細胞であり得る。該細胞はまた、ｃＣＭＲ遺伝子の制御配列を有する組換えＤＮＡ配列を含有する組換え細胞でもあり得、そして該制御配列は遺伝子、好ましくはレポーター遺伝子に操作可能に連結されている。

ＣＭＲ１の制御配列により制御される遺伝子の発現に対する化合物の影響は、多様な手段により測定し得る。例えば、該影響は、細胞からの遺伝子のｍＲＮＡ若しくはタンパク質の量により、または細胞からの遺伝子産物の活性により測定し得る。レポーター遺伝子を使用する場合、該影響は細胞からのレポーター遺伝子産物のレベルとして測定し得る。例えば、ＣＭＲ１の制御配列がＧＦＰ遺伝子に操作可能に連結されている場合、遺伝子発現に対する化合物の影響は、蛍光計を使用して、細胞からの緑色蛍光の発射に対する化合物の影響として測定し得る。内因性のｃＣＭＲ１細胞を使用する場合、遺伝子発現に対する化合物の影響は、下述される方法（すなわちノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、免疫組織若しくは免疫細胞化学、放射受容体リガンド結合など）を使用して、細胞の内側のｃＣＭＲ１のｍＲＮＡ若しくはタンパク質の量により測定し得る。あるいは、ｃＣＭＲ１チャンネルの伝導性を使用して、ｃＣＭＲ１タンパク質の発現に対する化合物の影響を測定し得る。

本明細書に記述される細胞に基づく方法は、ｃＣＭＲ１遺伝子の１種若しくは１種以上の制御配列への結合を介してｃＣＭＲ１発現を直接調節する化合物を同定するのみならず、しかしまた、その活性がｃＣＭＲ１の発現若しくはタンパク質の安定性に影響する他の細胞成分への結合を介してｃＣＭＲ１発現を間接的に調節する化合物も同定する。例えば、ｃＣＭＲ１遺伝子の転写活性化物質若しくは阻害剤の活性を調節する化合物を、本明細書に記述される方法を使用して同定し得る。ｃＣＭＲ１タンパク質をｉｎ ｖｉｖｏで分解するプロテアーゼの活性を調節する化合物もまた同定し得る。

本発明はまた：（ａ）試験化合物をイオンチャンネルと接触させる段階；および（ｂ）試験化合物がイオンチャンネルの伝導性を増大若しくは低下させるかどうかを決定する段階を含んでなる、ｃＣＭＲ１イオンチャンネルの伝導性を増大若しくは低下させる化合物の同定方法も提供する。いくつかの態様において、ｃＣＭＲ１イオンチャンネルは宿主細胞の表面上で発現される。細胞は、ｃＣＭＲ１を内因性に発現するｃＣＭＲ１の天然の宿主細胞、例えばイヌＤＲＧ若しくはＴＧ細胞であり得る。細胞はまた、ｃＣＭＲ１の組換え宿主細胞、例えばｃＣＭＲ１を組換え的に発現するＣＨＯ若しくはＣＯＳ細胞でもあり得る。

いくつかの他の態様において、ｃＣＭＲ１イオンチャンネルは単離された膜調製物を伴う。膜調製物は、その細胞表面上にｃＣＭＲ１を発現する天然の宿主細胞、若しくはその細胞表面上にｃＣＭＲ１を発現する組換え宿主細胞から単離し得る。それはまた、組織膜、原形質膜、細胞膜、若しくはｃＣＭＲ１チャンネルを含んでなる内的オルガネラ膜のような生物学的膜からも調製し得る。生物学的膜調製物の単離および調製方法は当業者に既知である。例えば、こうした方法は、組織若しくは細胞の機械的若しくは酵素的破壊、他の成分から膜を分離するための遠心分離、および適する緩衝溶液に膜断片若しくは小胞を再懸濁することの段階を包含し得る。あるいは、膜を含有する調製物は人工膜にもまた由来し得る。精製したｃＣＭＲ１タンパク質を脂質二重層に再構成して人工膜小胞を形成させ得る（Ｃｈｅｎら、１９９６、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０８：２３７−２５０を参照されたい）。こうした型の膜小胞は目的のチャンネルに対し非常に特異的であり得、他のチャンネルでの汚染の問題を回避する。人工膜小胞の製造方法は当業者に既知である。

いくつかの態様において、ｃＣＭＲ１を含んでなる膜小胞は発明のアッセイおよび方法のためのより容易な形式を提供し得る。細胞の溶解および／若しくは剪断がアッセイの間のそれほど大きな問題でないからである。他の態様において、しかしながら、ｃＣＭＲ１を発現する細胞は、例えば細胞膜調製処置が目的のチャンネルを破壊若しくは不活性化する場合に、好ましい。

試験化合物を、ｃＣＭＲ１チャンネルのイオン伝導性を増大若しくは低下させるその能力について評価し得る。例えば細胞の脱分極の刺激若しくは細胞内カルシウムイオンレベルの増大を介するＣＭＲ１チャンネルの伝導性の測定方法は当業者に既知である。細胞内カルシウムのレベルは、カルシウムイオン感受性の蛍光色素のようなカルシウムイオン感受性の蛍光指示薬を使用して評価し得る。適するカルシウムイオン感受性蛍光色素は、例えば、ｑｕｉｎ−２（例えばＴｓｉｅｎら、Ｊ Ｃｅｌｌ ＢｉｏＬ、９４：３２５、１９８２を参照されたい）、ｆｕｒａ−２（例えばＧｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚら、Ｊ ＢｉｏＬ Ｃｈｅｍ．、２６０：３４４０、１９８５を参照されたい）、ｆｌｕｏ−３（例えばＫａｏら、Ｊ ＢｉｏＬ−４３ Ｃｈｅｍ．、２６４：８１７９、１９８９を参照されたい）、およびｒｈｏｄ−２（例えばＴｓｉｅｎら、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、Ａｂｓｔｒａｃｔ ８９ａ、１９８７を参照されたい）を包含する。適するカルシウムイオン感受性の蛍光色素は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州ユージーン）から商業的に入手可能である。細胞の蛍光はまた、蛍光計、若しくは蛍光ランプおよび検出器を有するフローサイトメーターを使用してもモニターし得る。

ｃＣＭＲ１陽イオンチャンネルは、二価の陽イオン例えばＣａ^＋＋のみならず、しかし一価の陽イオン例えばＮａ^＋若しくはＫ^＋もまた輸送するよう機能する。従って、一価の陽イオンの輸送の変化を測定するためのアッセイもまた、ｃＣＭＲ１チャンネルの伝導性を測定するために実施し得る。Ｎａ^＋およびＫ^＋感受性色素は当該技術分野で既知であり
、そして例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州ユージーン）から商業的に入手可能である。

ｃＣＭＲ１チャンネルの伝導性はまた、パッチクランプのような電気生理学的技術によっても測定し得る。パッチクランプ技術は、細胞、細胞膜および単離された組織中の電気的活動を研究するのに慣例に使用される。それは、マイクロピペットと原形質膜の間に電気的に密な高抵抗のシールを形成することを必要とする。原形質膜内の個々のイオンチャンネルを流れる電流をその後測定し得る。該技術に対する多様な変型が、原形質膜の多様な表面が浸積媒体に露出されることを可能にする。４種の最も一般的な変型は、オンセル（ｏｎ−ｃｅｌｌ）パッチ、インサイドアウト（ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ）パッチ、アウトサイドアウト（ｏｕｔｓｉｄｅ−ｏｕｔ）パッチおよび全細胞クランプを包含する。

パッチクランプ法は、膜を横切る電圧を制御しかつ電流を測定する電圧クランプとともに一般に使用される。電圧クランプ過程の間に、微小電極を細胞中に挿入し、そして、いずれかの予め定義されたレベルで細胞膜電位を保持するように電極を通して電流を注入する。パッチクランプ法はまた、電流を制御しかつ電圧を測定する電流クランプ法とともにも使用し得る。

ｃＣＭＲ１チャンネルの伝導性を低下させる化合物を同定するためのアッセイは、好ましくは、特定のイオンチャンネルが活性化される条件下で実施する。例えば、こうしたアッセイは、ＣＭＲ１が活性化される温度で実施し得る。全細胞パッチクランプ記録からの研究は、ｃＣＭＲ１が約１７℃若しくはより下の低温で活性化されることを示した（下の実施例７）。あるいは、こうしたアッセイは、寒冷化合物（ｃｏｏｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）メントール若しくはイチリン、または辛味化合物からし油のような、ｃＣＭＲ１を活性化する化合物の存在下で実施し得る。加えて、こうしたアッセイは、脱分極した電位でチャンネルをクランプすることによるような、ｃＣＭＲ１チャンネルが脱分極される条件で実施し得る。

逆に、ｃＣＭＲ１チャンネルの伝導性を増大させる化合物を同定することを探求する場合、好ましくは、ｃＣＭＲ１チャンネルが活性でないか若しくはそうでなければ遮断されている試験条件が調節される。例えば、こうしたアッセイはＣＭＲ１の非活性化温度で実施し得る。室温でなお活性であるラットＣＭＲ１と異なり、ｃＣＭＲ１は室温で不活性化されている（下の実施例７）。あるいは、こうしたアッセイは、ｃＣＭＲ１チャンネルの伝導性を低下させる化合物の存在下で実施し得る。加えて、こうしたアッセイは、ｃＣＭＲ１チャンネルを脱感作するのに十分である細胞外Ｃａ^２＋の存在下で実施し得る。当業者は、慣例の実験により、ｃＣＭＲ１チャンネルを脱感作するのに十分である細胞外Ｃａ^２＋の適切な濃度を決定することが可能である。さらに、こうしたアッセイは、過分極電位でチャンネルをクランプすることによるような、ｃＣＭＲ１チャンネルが過分極される条件で実施し得る。

ｃＣＭＲ１調節物質の同定のためのアッセイは、人的に若しくは自動化装置を使用して実施し得る。自動化装置はハイスループットスクリーニングを実施する場合に好ましい。例えば、１つの型の自動化装置は多ウェル培養プレート、例えば９６ウェル、３８４ウェル若しくは１５３６ウェルの培養プレートを利用し、ここで各ウェルはｃＣＭＲ１タンパク質をコードする核酸を有する組換え細胞を含有する。該プレートを、ウェルのそれぞれ中の細胞のカルシウムの流れおよび／若しくは膜電位を測定し得る蛍光計、例えばＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ^ＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州サニーベールから）に負荷する。カルシウムイオン感受性の蛍光指示薬色素若しくは試験化合物を含有する溶液を、ウェルのそれぞれに自動的に添加し得る。蛍光計中の温度は実施するアッセイの型に従って制御し得、例えば、温度は、ＣＭＲ１アゴニストであ
ることが疑われる試験化合物に対してＣＭＲを活性化する温度より上、例えば２８℃より上の温度に調節し得る。同様に、温度は、ＣＭＲ１アンタゴニストであることが疑われる試験化合物に対して、ＣＭＲを活性化する温度、例えば２８℃もしくはより下に調節し得る。

ＣＭＲ１チャンネルが活性化され、そして（Ｃａ^＋＋イオンのような）陽イオンの流入を可能にした後、Ｃａ^＋＋イオンの細胞内蓄積は、負のフィードバックおよびＣＭＲ１チャンネルの不活性化を促進する。ＣＭＲ１は、例えば細胞からポンプでくみ出されるかまたは細胞内オルガネラに取り込まれるＣａ^＋＋により細胞内Ｃａ^＋＋レベルが低下した後に再活性化される。

ＣＭＲ１チャンネルは、冷ないし寒温度に応答してのＣａ^＋＋イオンの流入を可能にし得るとは言え、それはいくぶん漏れやすいイオンチャンネルのものである。数種のＣＭＲ１チャンネルは、活性化しない温度、例えば２８℃より上でさえＣａ^＋＋イオンの流入を可能にすることができる。慣習的なアッセイ系では、ｍＭ範囲の細胞外Ｃａ^＋＋濃度を典型的に使用し、それは、活性化しない温度でさえカルシウムの細胞内蓄積につながり、ＣＭＲ１の負のフィードバックの不活性化を引き起こし得る。

従って、本発明の別の局面は：（ａ）不活性化量以下のカルシウムを含有する緩衝溶液中でイオンチャンネルをインキュベートする段階；（ｂ）イオンチャンネルを活性化する段階；（ｃ）イオンチャンネルを試験化合物と接触させる段階；（ｄ）緩衝溶液中のカルシウムの量を増大させる段階；ならびにｅ）細胞内カルシウム量を測定する段階、およびイオンチャンネルが試験化合物と接触されなかった対照の量と該量を比較する段階を含んでなる、哺乳動物のＣＭＲ１イオンチャンネルの伝導性を増大若しくは低下させる化合物の同定方法である。「不活性化量以下のカルシウム」は、ＣＭＲ１チャンネルの負のフィードバックおよび不活性化を促進する程度までのＣａ^＋＋イオンの細胞内蓄積を引き起こさないとみられる細胞外Ｃａ^＋＋の量である。当業者は、特定のＣＭＲ１チャンネルの「不活性量以下のカルシウム」を実験で決定し得る。いくつかの態様において、「不活性量以下のカルシウム」は緩衝溶液中で本質的に０のカルシウムである。他の態様において、「不活性量以下のカルシウム」は、緩衝溶液中のカルシウムのμＭ範囲にある。本発明の方法は、段階（ｃ）が段階（ｂ）に先行する、本明細書に記述されるところの段階（ａ）ないし（ｅ）を含んでなる方法を包含する。

ＣＭＲ１の活性若しくは発現を調節するための所望の基準に合致する化合物が同定された後、該化合物をその後生存動物に投与し得る。これは、投薬レジメンを確立するために重要な毒性および他の薬理学的パラメータを確立するために有用であり得る。例えば、ｃＣＭＲ１ポリペプチドを含有するｅｘ ｖｉｖｏ系を使用して化合物を同定した後、該化合物をイヌに投与して、イヌにおける該化合物の多様な薬理学的局面を検査し得る。本明細書に記述されるところのｃＣＭＲ１系は、ヒトにおける投薬レジメンを同定かつ確立するためにとりわけ有利である。イヌ、とりわけ大型の品種はラット若しくはマウスに比較してヒトに体重がより近く、そして従ってヒトの投薬を推定するためのより適する動物モデルを提供するからである。

化合物はまた、侵害受容過程を変える化合物の能力を評価するためにも動物に投与し得る。疼痛の多様な動物モデル、例えば、ＫｉｍとＣｈｕｎｇ（Ｐａｉｎ、５０：３５５−３６３、１９９２）により開発されたラットにおける神経因性疼痛モデルである、神経傷害の脊髄神経結紮（ＳＮＬ）モデルが存在する。

疼痛の他の適する動物モデルを本明細書の教示とともに利用し得る。神経因性疼痛の一般に研究されるげっ歯類モデルは、慢性絞扼性神経傷害（ＣＣＩ）すなわちＢｅｎｎｅｔ
ｔモデル；神経腫若しくは軸索切断モデル；および部分的座骨神経離断モデルすなわちＳｅｌｔｚｅｒモデル（Ｓｈｉｒら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．、１１５：６２−６７、１９９０）を包含する。例示的神経因性疼痛モデルは、数種の外傷性神経傷害調製物（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｐａｉｎ ３３：８７−１０７、１９８８；Ｄｅｃｏｓｔｅｒｄら、Ｐａｉｎ ８７：１４９−５８、２０００；Ｋｉｍら、Ｐａｉｎ ５０：３５５−３６３、１９９２；Ｓｈｉｒら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ １１５：６２−７、１９９０）、神経炎症モデル（Ｃｈａｃｕｒら、Ｐａｉｎ ９４：２３１−４４、２００１；Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ ８６１：１０５−１６、２０００）糖尿病性ニューロパシー（Ｃａｌｃｕｔｔら、Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １２２：１４７８−８２、１９９７）、ウイルス誘発性ニューロパシー（Ｆｌｅｅｔｗｏｏｄ−Ｗａｌｋｅｒら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ８０：２４３３−６、１９９９）、ビンクリスチンニューロパシー（Ａｌｅｙら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ７３：２５９−６５、１９９６；Ｎｏｚａｋｉ−Ｔａｇｕｃｈｉら、Ｐａｉｎ ９３：６９−７６、２００１）、およびパクリタキセルニューロパシー（Ｃａｖａｌｅｔｔｉら、Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ １３３：６４−７２、１９９５）、ならびに急性侵害受容試験モデルおよび炎症性モデル（Ｂｒｅｎｎａｎｎ，Ｔ．Ｊ．ら Ｐａｉｎ ６４：４９３、１９９６；Ｄ’Ａｍｏｕｒ，Ｆ．Ｅ．およびＳｍｉｔｈ，Ｄ．Ｌ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ７２：７４−７９、１９４１；Ｅｄｄｙ，Ｎ．Ｂ．ら Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ９８：１２１、１９５０；Ｈａｆｆｎｅｒ，Ｆ．Ｄｔｓｃｈ Ｍｅｄ Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ ５５：７３１、１９２９；Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ，Ｋ．ら Ｐａｉｎ ３２：７７−８８、１９８８；Ｈｕｎｓｋａａｒ，Ｓ．ら Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈ １４：６９、１９８５；Ｒａｎｄａｌｌ，Ｌ．Ｏ．とＳｅｌｉｔｔｏ，Ｊ．Ｊ．Ａｒｃｈ．Ｉｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ １１１：４０９−４１９、１９５７；Ｓｉｅｇｍｕｎｄ，Ｅ．ら Ｐｒｏｃ Ｓｏｃ Ｅｘｐ Ｂｉｏ Ｍｅｄ ９５：７２９、１９５７）を包含する。

従って、別の態様において、本発明は：（ａ）試験化合物をｃＣＭＲ１イオンチャンネルと接触させる段階；および（ｂ）該試験化合物がイオンチャンネルの伝導性を増大若しくは低下させるかどうかを決定する段階を含んでなる、疼痛を処置するのに有用な化合物の同定方法を提供する。いくつかの態様において、該方法は：（ａ）試験化合物を動物に投与する段階；および（ｂ）該試験化合物が動物の侵害受容／侵害防御応答を変える程度を決定する段階をさらに含んでなる。

いくつかの態様において、疼痛の動物モデルはげっ歯類、例えばラット若しくはマウスを伴い；別の局面において、疼痛の動物モデルはイヌ、例えば皮膚攣縮試験（Ｋａｍｅｒｌｉｎｇら Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｈａｖ．１７：７３３−７４９、１９８２；Ｂｕｒｎｓ ＪＣら Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．Ａｕｔｕｍｎ；３５（１）：６８−７３、１９９１もまた参照されたい）を伴う。

治療的有効性および毒性は、例えばＥＤ_５０（集団の５０％で治療上有効な用量）およびＬＤ_５０（集団の５０％に対し致死的な用量）を計算することにより、細胞培養物若しくは実験動物での標準的製薬学的処置により決定しうる。毒性効果と治療効果の間の用量比が治療指数であり、そしてそれは比ＬＤ_５０／ＥＤ_５０として表し得る。組換えＣＭＲ１を使用する細胞培養物アッセイおよびイヌ試験のような動物試験から得られるデータを、ヒトの使用のための投薬量の範囲の規定において使用する。こうした組成物に含有される投薬量は、好ましくは、毒性をほとんど若しくは全く伴わないＥＤ_５０を包含する循環濃度の範囲を生じさせる。投薬量は、使用される投薬形態物、患者の感受性および投与経路に依存してこの範囲内で変動する。正確な投薬量は、処置を必要とする被験体に関する因子に照らして、用量を投与する者により決定することができる。投薬量および投与は、十分なレベルの有効成分を提供するように、若しくは所望の効果、例えば効果的な鎮痛を維持するように調節する。考慮に入れられうる因子は、疼痛の重症度、ならびに、被験体
の全般的健康状態、被験体の齢、重量および性別、食餌、投与の時間および頻度、薬物の組合せ（１種若しくは複数）、反応の感受性ならびに治療に対する忍容性／応答を包含する他の因子を包含する。

ＣＭＲ１活性を調節するとして同定された化合物を含有する製薬学的組成物は、限定されるものでないが、経口、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、髄内、クモ膜下、硬膜外、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻内、腸内、局所、舌下、吸入、眼内、耳内若しくは直腸の手段を挙げることができるいずれかの数の経路により投与し得る。

有効成分に加え、これらの製薬学的組成物は、製薬学的に使用し得る製剤中への有効成分の加工を助長するかまたは有効成分の吸収若しくは分布を助長する賦形剤および補助物質を含んでなる適する製薬学的に許容できる担体を含有しうる。処方および投与のための技術に関するさらなる詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、ペンシルバニア州イーストンに見出しうる。

経口投与のための製薬学的組成物は、当該技術分野で公知の製薬学的に許容できる担体を使用して、経口投与に適する投薬量に処方し得る。こうした担体は、製薬学的組成物が患者による摂取のために錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして処方されることを可能にする。

実施例

イヌＤＲＧニューロンからのＣＭＲ１のクローニング
Ａ．ポリ（Ａ^＋）ＲＮＡの単離
ｃＣＭＲ１のクローニングにおける第一段階として、ポリ（Ａ^＋）ＲＮＡを、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ^ＴＭスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州）を使用してイヌＤＲＧからの全ＲＮＡ［（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｉｎｃ．デラウェア州による特注）］１００μｇから単離した。簡潔には、１５０μｌのＲＮアーゼを含まない水、２５０μｌの緩衝液ＯＢＢ［２０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．２％ ＳＤＳ］ならびに１５μｌのＯｌｉｇｏｔｅｘビーズの懸濁液を、１００μｌの全ＲＮＡ溶液（１μｇ／μｌ）に添加した。ＲＮＡ／Ｏｌｉｇｏｔｅｘビーズ混合物をその後７０℃で３分間加熱して、ＲＮＡのいかなる二次構造も破壊し、次いで室温で１０分間インキュベートした。ポリ（Ａ^＋）ＲＮＡ／Ｏｌｉｇｏｔｅｘ粒子複合体を遠心分離し、そして４００μｌの緩衝液ＯＷ２［１０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡ］で２回洗浄し、そしてその後溶出段階のためスピンカラムに移した。ポリ（Ａ^＋）ＲＮＡを、２００μｌの予め加温した（７０℃）緩衝液ＯＥＢ［５ｍＭトリス、ｐＨ７．５］を使用してＯｌｉｇｏｔｅｘビーズから溶出した。最後に、イヌＤＲＧポリ（Ａ^＋）ＲＮＡを、２０μｇのグリコーゲンおよび１５０ｍＭの酢酸ナトリウムの存在下でエタノールにより沈殿させ、そして１０μｌのＲＮアーゼを含まない水に再懸濁した。

Ｂ．二本鎖ｃＤＮＡの合成
４μｌ（１μｇ）のイヌＤＲＧポリ（Ａ^＋）ＲＮＡおよび１μｌのｃＤＮＡ合成プライ
マー（５’−ＴＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣＡＧＣＧＧＣＧＣ（Ｔ）_３０Ｎ_−１Ｎ−３’の配列を伴う５２ｍｅｒオリゴ、Ｎ_−１＝Ｇ、Ａ若しくはＣ；およびＮ＝Ｇ、Ａ、Ｃ若しくはＴ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州 配列番号１０））を混合し、７０℃で２分間インキュベートし、そしてその後氷上で２分間冷却した。第一鎖のｃＤＮＡ合成（逆転写）を、１０μｌ中１ｍＭ ｄＮＴＰ混合物ならびに第一鎖合成緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５、８ｍＭ ＭｇＣｌ_２、３０ｍＭ ＫＣｌおよび１ｍＭ ＤＴＴ）の存在下に２０単位のＡＭＶ逆転写酵素を使用して４２℃で１時間実施した。第二鎖のｃＤＮＡ合成は、８０μｌ中２４単位の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、５単位の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼＩ単位の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮアーゼＨ、０．２５ｍＭのｄＮＴＰ混合物（０．２５ｍＭのそれぞれｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）、ならびに第二鎖緩衝液（１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１５ｍＭ β−ＮＡＤ、２０ｍＭトリス ｐＨ７．５および５０μＭ／ｍｌウシ血清アルブミン）よりなる酵素カクテルを添加することにより実施した。反応は最初に１６℃で９０分間実施し、次いで同一温度で４５分間の継続したインキュベーションを伴い２０単位のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを添加した。反応を、１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび８μｇのグリコーゲンを添加することにより停止した。フェノールおよびクロロホルム抽出を実施し、次いでエタノール沈殿した。二本鎖ｃＤＮＡをその後、２００μｌのＴＥ緩衝液に懸濁しかつ−２０℃で保存した。

Ｃ．イヌＣＭＲ１のカルボキシル末端近くのＰＣＲ増幅
ｃＣＭＲ１配列の一部分を、配列番号１のヌクレオチド１７６１−１７８１にハイブリダイズするｃｍｒ１−２３（５’−ｔｔｃａｔｃｔｇｇｇｃｃａｔｔｃｔｔｃａｇ−３’（配列番号３）、および配列番号１のヌクレオチド２８６８−２８８６にハイブリダイズするｃｍｒ１−２６（５’−ｃａｃａｇｔｇｇｃｔｔｇｇａｃｔｃａｔｔ−３’（配列番号４）と呼称される２種のプライマーを使用するＰＣＲにより成功裏に増幅した。ＰＣＲ反応は、５μｌのイヌＤＲＧ二本鎖ｃＤＮＡ、５μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅ２ ＤＮＡポリメラーゼとともに提供された１０×反応緩衝液、２００μＭ ｄＮＴＰ、２００ｎＭのフォワードプライマーｃｍｒ１−２３、２００ｎＭのリバースプライマーｃｍｒ１−２６および１μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ^ＴＭ−ＨＦ２ ＤＮＡポリメラーゼ混合物（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州）を含有する５０μｌの最終容量中で実施した。ＰＣＲは、９４℃で１分間の初期変性段階、次いで３０周期の：（ａ）９４℃で３０秒間の変性、（ｂ）５５℃で３０秒間のアニーリングおよび（ｃ）７２℃で６０秒間の伸長により実施した。

アガロースゲル電気泳動を実施し、それはＰＣＲ産物がおよそ１．１ｋｂであったことを示した。ＰＣＲ後に１．１ｋｂのＰＣＲフラグメントを精製し、そして供給元のプロトコルに従いｐＰＣＲｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングした。２個の独立したクローンを拾い、そしてＤＮＡ配列決定分析にかけた。

配列の結果は、ＰＣＲ増幅したフラグメントが、マウス、ラットおよびヒトＣＭＲ１のカルボキシル末端近くにそれぞれ８３％ ８４％および８７％同一であったことを示した。

Ｄ．ｃＣＭＲ１配列の５’および３’端のＲＡＣＥ−ＰＣＲ
ｃＣＭＲ１遺伝子の完全な５’および３’ｃＤＮＡ配列を得るために、ＲＡＣＥ−ＰＣＲ技術を実施した。最初に、５’−および３’−双方のＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡを、製造元の説明書に従ってＳＭＡＲＴ^ＴＭ ＲＡＣＥ ＤＮＡ増幅キット（ＢＤ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州）を用いて個別に合成した。５’ＲＡＣＥのためのｃＤＮＡを調製するため、１本の０．５ｍｌチューブ中で、３μｌのＡ．で得られたイヌＤＲＧポリ（Ａ^＋）ＲＮＡを１μｌの５’−ＣＤＳプライマーおよび１ｍｌのＳＭＡＲＴ Ｉ
Ｉ Ａオリゴと混合した。３’−ＲＡＣＥのためのｃＤＮＡを調製するため、３μｌのイヌＤＲＧポリ（Ａ^＋）ＲＮＡを、別の０．５ｍｌチューブ中で１μｌの３’−ＣＤＳプライマーおよび１μｌのＲＮアーゼを含まない水と混合し、そしてその後７０℃で２分間インキュベートし、次いで氷上で２分間冷却した。次に、２μｌの５×第一鎖緩衝液、１μｌの２０ｍＭ ＤＴＴ、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物および１μｌのＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素を各チューブに添加し、そして合成を４２℃で９０分間実施した。２００μｌのＴＥ緩衝液を添加することおよびサンプルを７２℃に７分間加熱することにより反応を停止した。反応生成物を−２０℃で保存した。

ＲＡＣＥ−ＰＣＲのため、ｃＣＭＲ１ ｃＤＮＡの５’部分に近接した１．１ｋｂのｃＤＮＡ配列に基づき２種のプライマーを合成した。３’ＲＡＣＥ−ＰＣＲのためのフォワードプライマーはｄｃｍｒ１−３と命名され、そして以下の配列：５’−ＧＣＣＣＡＴＣＧＡＣＡＡＧ ＣＡＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣ−３’（配列番号５）を有し、配列番号１（相補鎖）のヌクレオチド２２１３−２２３７にハイブリダイズし；５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲのためのリバースプライマーはｄｃｍｒ１−１と命名され、そして以下の配列：５’−ＧＡＴＣＴＴＣＴＴＧＴＧＣＴＴＧＴＣＧＡＴＧＧＧ Ｃ−３’（配列番号６）を有し、配列番号１のヌクレオチド２２１３−２２３７にハイブリダイズする。５’および３’双方のＲＡＣＥ ＰＣＲを、５μｌのｃＤＮＡ鋳型（上述されたところの５’−若しくは３’−いずれかのＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ）、５μｌの１０×反応緩衝液、２００μＭのｄＮＴＰ、２００ｎＭのユニバーサルプライマーミックス（ＵＰＭ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、配列番号７（５’−ＣＣＡ ＴＣＣ ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ ＧＧＣ−３’）、２００ｎＭ ｃＣＭＲ１特異的プライマー（５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲのためｄｃｍｒ１−１若しくは３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲのためｄｃｍｒ１−３）、および１μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ^ＴＭ−ＨＦ２ ＤＮＡポリメラーゼ混合物（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含有する５０μｌの最終容量中で実施した。ＲＡＣＥ−ＰＣＲのためのサーマルサイクラーのパラメータは：ａ）９４℃で２分間の初期変性；ｂ）５周期の：９４℃３０秒間、７２℃３分間；ｃ）５周期の：９４℃３０秒間、７０℃３０秒間、７２℃３分間；およびｄ）２５周期の９４℃５秒間、６８℃３０秒間、７２℃３分間であった。反応後にＲＡＣＥ−ＰＣＲ産物を精製し、研磨し（ｐｏｌｉｓｈ）、そしてｐＰＣＲｓｃｒｉｐｔに直接サブクローニングした。５’−ＲＡＣＥ若しくは３’−ＲＡＣＥいずれかからの４個の独立したクローンを拾い、そしてＤＮＡ配列決定分析にかけた。

Ｅ．完全長のｃＣＭＲ１ ｃＤＮＡの配列：
完全長のイヌＣＭＲ１ ｃＤＮＡの配列を、ＲＡＣＥ−ＰＣＲにより得た５’および３’端の配列に基づくＰＣＲプライマーを合成することにより確認した。完全長のｃＣＭＲ１ ｃＤＮＡを、以下の配列：５’−ＡＡＧＣＴＴＣＡＴ ＡＴＧ ＴＣＣ ＴＴＣ ＧＡＧ ＧＧＧ ＧＣＣ ＡＧＧ ＣＴＣ ＡＧＣ ＡＴＧ ＡＧＧ ＡＡ−３’（配列番号８）を有したフォワードプライマーｄｃｍｒ１−７、および以下の配列：５’−ＣＴＣＧＡＧ ＣＴＡ ＴＴＴ ＧＡＴ ＴＴＴ ＡＴＴ ＡＧＣ ＧＡＴ ＣＴＣ ＴＴＴ ＣＡＧ ＡＡＧ ＧＣＣＣ−３’（配列番号９）を有したリバースプライマーｄｃｍｒ１−８を用いる高正確度（ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ）ＤＮＡポリメラーゼにより、Ｂ．で調製したイヌＤＲＧ二本鎖ｃＤＮＡから増幅した。ＰＣＲは、５μｌの上のイヌＤＲＧ二本鎖ｃＤＮＡ、５μｌの１０×反応緩衝液、２００μＭのｄＮＴＰ、２００ｎＭのフォワードプライマーｄｃｍｒ１−７、２００ｎＭのリバースプライマーｄｃｍｒ１−８、および１μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ^ＴＭ−ＨＦ２ ＤＮＡポリメラーゼ混合物（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州）を含有する５０μｌの最終容量中で実施した。ＰＣＲ反応のパラメータは：１周期：９４℃で２分間の初期変性；３５周期：ａ）９４℃で３０秒間の変性、ｂ）７０℃で５分間のアニーリングおよび伸長であった。ＰＣＲ後に３．４ｋｂのＰＣＲフラグメントを精製し、そしてＣ．でと同一のクローニングプロトコルに従ってｐＰＣＲｓｃｒｉｐｔにサブクローニングした。４個の独立したクローンを拾い、そしてＤＮＡ配列決定分析にかけた。クローンＮＱＣ５６２をさらなるサブクローニングおよび研究に使用した。配列の結果は、ｃＣＭＲ１ ｃＤＮＡの核酸配列（配列番号１のヌクレオチド６９−３３８０）が、マウス（受託番号：ＡＹ０９５３５２）、ラット（受託番号：ＡＹ０７２７８８）およびヒト（受託番号：ＮＭ＿０２４０８０）のＣＭＲ１のｃＤＮＡ配列にそれぞれ８６．２％、８６．６％および９０．９％同一であったことを示した。

Ｆ．配列分析
５’−および３’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲは５’非翻訳領域の６８ヌクレオチドの配列の決定を見込み；３’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲは３７−ｍｅｒのポリ（Ａ^＋）尾部を包含する３’非翻訳領域の４３１ｂｐの決定を見込んだ。インフレームの終止コドンは同定されなかった。

予測されたｃＣＭＲ１のオープンリーディングフレームは、１２７．６ｋＤａの計算される分子量を有する１１０４アミノ酸のポリペプチド（配列番号２）をコードすることが予測される３３１５ｂｐの配列よりなる（表１を参照されたい）。一次配列のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｌｅの親水性分析（示されない）は、カルボキシル末端近くに群集した８個の推定の疎水性ドメインの存在を予測する。チャンネルのオリゴマー化に関与しているとみられる、残基１０７０から最後までの非常にカルボキシル末端に位置するコイルドコイルドメインの高い確率が同定された。さらに、ＧＣＧ ＳｅｑＷｅｂを用いる一次配列解析は、ｃＣＭＲ１がそれぞれ残基１５、２５６、３１７、８１２、９３４、１０５０および１０７２に位置する複数のＮ−グリコシル化部位を含有したことを示した。ｃＣＭＲ１はまた、残基９２に１個の推定のＰＫＡ（タンパク質キナーゼＡ）リン酸化部位、残基３０、２２８および２８８に３個のチロシンリン酸化部位、ならびに１７個のＰＫＣ（タンパク質キナーゼＣ）リン酸化部位も含有する。

ｃＣＭＲ１アミノ酸配列を、ＡｃｃｅｌｒｙｓのＳｅｑｗｅｂ ｖｅｒｓｉｏｎ ２からのＧａｐプログラムを使用して、ヒト（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿０７６９８５）、ラット（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿５９９１９８）およびマウス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＡＭ２３２６１）配列と整列し、それぞれ９５．１％、９４．１％および９３．９％の同一性を示した。Ｇａｐプログラムは２個の完全な配列のアライメントを見出すのにＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ（Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：４４３（１９７０））のアルゴリズムを使用する。それは一致の数を最大にしかつギャップの数を最少にする。

ＣＭＲ１の組換え発現
Ａ．哺乳動物発現ベクターへのｃＣＭＲ１のクローニング
哺乳動物細胞株中でのｃＣＭＲ１の発現のため、ｃＣＭＲ１の完全長ｃＤＮＡを、３方向ライゲーションを実施することによりｐｃＤＮＡ３．１にサブクローニングした。最初に、完全長のｃＣＭＲ１クローンＮＱＣ５６２をＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｃｏＩで消化して、０．８ｋｂの５’フラグメントを生じた。次に、独立した制限反応で、ＮＱＣ５６２をＮｃｏＩおよびＳａｌＩで消化して２．５ｋｂの３’フラグメントを生じた。該０．８ｋｂの５’および２．５ｋｂの３’ｃＣＭＲ１フラグメントを精製し、そして、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩで予め消化したｐｃＤＮＡ３．１と連結して、ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ｃＣＭＲ１を創製した。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳分析のため、完全長のｃＣＭＲ１ ｃＤＮＡをｐＡＧＡ４ベクター（ＰｒｏｍｅｇａのｐＧＥＭ３から改変した、Ｓａｎｆｏｒｄ １９９１およびＱｉｎら １９９７）にサブクローニングした。簡潔には、０．８ｋｂのＮ末端フラグメントをＮＱＣ５６２のＮｄｅＩおよびＮｃｏＩでの消化により得、また、２．５ｋｂのＣ末端フラグメントをＮＱＣ５６２のＮｃｏＩおよびＸｈｏＩでの消化により得た。該２種の精製したフラグメントを、ＮｄｅＩおよびＳａｌＩで予め消化したベクターｐＡＧＡ４と一緒に連結して、構築物ｃＣＭＲ１／ｐＡＧＡ４を創製した。全部の最終構築物をＤＮＡ配列決定により確認した。

Ｂ．ｃＣＭＲ１のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳
イヌＣＭＲ１のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を、供給元の推奨するプロトコルに従い、ＴｎＴ^ＴＭ Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ転写／翻訳系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行った。簡潔には、１μｌの０．１μｇ／μｌのｃＣＭＲ１／ｐＡＧＡ４を、０．２μｌの［^３５Ｓ］−メチオニン（１０ｍＣｉ／ｍｌで１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含む９μｌのＴＮＴ Ｑｕｉｃｋマスターミックスに添加した。反応混合物を３０℃で９０分間インキュベートした。等容量の２×ＳＤＳ／ＰＡＧＥ負荷緩衝液を添加することにより反応を停止し、そしてその後、サンプルを４〜２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析にかけた。電気泳動後に、ゲルをクマシーブルーＲ２５０で染色し、乾燥しかつＸ線フィルムに露出した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳したｃＣＭＲ１は、対応する核酸配列からのアミノ酸配列の誠実な翻訳により予測されるところの１３５ｋＤａの近似分子量に移動した。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳したｃＣＭＲ１タンパク質をウエスタンブロットによってもまた分析した。５μｌのｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳したｃＣＭＲ１タンパク質を４〜２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ゲル上のタンパク質をその後ニトロセルロースに転写した。ブロットをその後、ＴＴＢＳ（ｐＨ＝７．５の０．５％Ｔｗｅｅｎ ２０、１００ｍＭトリス−ＨＣｌおよび０．９％ＮａＣｌ）中５％粉乳で室温で１時間ブロッキングし、そしてその後、抗ｃＣＭＲ１ポリクローナル抗体（５００倍希釈）と４℃で一夜インキュベートした。翌日、ブロットを１００ｍｌのＴＴＢＳで３回洗浄し、そしてワサビペルオキシダーゼで複合したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）と室温で１時間インキュベートした。ブロットを１００ｍｌのＴＴＢＳで３回洗浄し、そして製造元の説明書に従って、ＥＣＬ−Ｐｌｕｓ発光試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒａｍａｃｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で可視化した。

ｐｃＤＮＡ３．１−ｃＣＭＲ１構築物を、製造元のプロトコルに従い、ＧｅｎｅＪａｍｍｅｒ^ＴＭキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州）を使用してＨＥＫ２９３（ヒト胎児由来腎臓細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）にトランスフェクトした。Ｇ４１８の存在下での増殖により安定な細胞クローンを選択した。単一のＧ４１８耐性クローンを単離かつ精製した。ｃＣＭＲ１ ｃＤＮＡを含有するクローンを、カルシウム流入アッセイを使用して分析した。

ｃＣＭＲ１のカルシウム流入機能アッセイ
ＦＬＩＰＲアッセイを実施して、細胞の一集団内のｃＣＭＲ１チャンネルの特性を研究した。

組換え細胞中で発現されるｃＣＭＲ１の機能性を示すため、ＣＭＲ１／ＨＥＫ２９３の安定にトランスフェクトされた細胞を、６．７×１０^５細胞／ウェルの濃度で３８４ウェルプレートに接種し、そして３７℃で一夜インキュベートした。翌日、細胞に、４０μｌの最終容量中の緩衝液およびカルシウム色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州サニーベール）を負荷し、そして室温で３０分間インキュベートした。それぞれ１００μＭ若しくは１０μＭの濃度で細胞に添加したメントール若しくはイチリンの添加の前および後にそれぞれ、蛍光強度をＦＬＩＰＲにより測定した。結果を図１に示す。

低下されたＣａ^＋＋負荷濃度でのＣＭＲ１機能アッセイ
ＣＭＲ１は、メントール若しくはイチリンのようなアゴニストに、およびまた穏やかな低温（１５℃ないし２５℃）に応答して開放する。従って、室温（２２〜２４℃）では、ＣＭＲ１は活性でありかつＣａ^２＋流入を誘発し得る。しかしながら、Ｃａ^２＋流入はまたＣａ^２＋依存性の不活性化も誘導することができ、ＣＭＲ１の負のフィードバック調節をもたらす。この場合、ＣＭＲ１は室温により活性化後に不活性化されることができ、そして、温度を約２５℃より上に増大させるまで再活性化されないことができる。従って、通常の試験条件（室温および２ｍＭ Ｃａ^２＋を含有する緩衝液の存在下）では、ラットＣＭＲ１のようなある種からのＣＭＲ１はいかなるアゴニストに対しても応答性でない。室温でアンタゴニストをスクリーニングするのにＣＭＲ１を使用しうる系を調製するため、色素負荷緩衝液からＣａ^２＋を除去すること、およびその後ＣＭＲ１を含有する系を４ｍＭ Ｃａ^２＋で攻撃することによりＣａ^２＋流入アッセイを開発した。この条件下で、ＣＭＲ１は（室温で）活性であるとは言え、カルシウムは該チャンネルを通って細胞に進入しないことができ、そして不活性化が起こらないことができる。これらのアッセイ条件下でＣＭＲ１は構成的に活性であり、そしてＣａ^２＋が細胞外溶液に添加されるや否やＣａ^２＋流入を可能にするようプライミングされる。

ラットＣＭＲ１でトランスフェクトしたヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）を３８４ウェルプレートに接種した（６．７×１０^５細胞／ウェル）。翌日、培地を除去し、そして細胞を完全ハンクス液ですすいだ。細胞にその後、４０μｌの最終容量中の緩衝液およびカルシウム色素（Ｍｏｌ．Ｄｅｖ．）を負荷し、そして室温で３０分間インキュベートした。プレートをその後ＦＬＩＰＲ装置に移し、ここで、アンタゴニスト活性について試験する化合物を時間ゼロに４．２μＭの最終濃度まで添加した。カルシウムを約時間１０秒に４ｍＭの最終濃度まで添加し、そして蛍光強度をＦＬＩＰＲにより測定した。試験化合物を時間ゼロに添加しなかった代表的結果を図２に示す。

ＣＭＲ１チャンネルの脱感作物質若しくは不活性化物質のスクリーニングアッセイ
一般に、イオンチャンネルの活性化する刺激（例えばアゴニスト）への長時間の曝露に際して、または直接脱感作若しくは不活性化する刺激に応答して、チャンネルは、活性化する刺激に応答して変動してより少なく活性化可能である代替のコンホメーションをとりうる。これらのより少なく活性化可能な若しくは不活性化可能なコンホメーションは、機能的に脱感作若しくは不活性化されると、また、これらの状態を生じる化合物はそれぞれ脱感作物質若しくは不活性化物質であると称されうる。こうしたコンホメーションは、これらのいわゆる脱感作物質若しくは不活性化物質により若しくはそれらの存在下で誘導若しくは安定化されることができ、そして、開放若しくは閉鎖したチャンネルに対する脱感作物質若しくは不活性化物質の優先的作用により生じうる。加えて、こうしたコンホメーションは変動する時間経過および条件にわたり可逆的でありうるか、若しくは新生チャンネルの不可逆的な未決のデノボ合成でありうる。可逆的若しくは不可逆的いずれかである脱感作物質若しくは不活性化物質と同定される化合物は、低下されたＣＭＲ１活性が治療的でありうる疼痛状態を包含するある種の状態の処置において有用でありうる。

従って、別の態様において、本発明は、ＣＭＲ１活性の可逆的および不可逆的脱感作物質若しくは不活性化物質の同定方法を提供する。第一の方法は、閉鎖状態から脱感作若しくは不活性化状態のチャンネルを誘導かつ／若しくは安定化する化合物を同定するよう設計され、そして：（ａ）ｃＣＭＲ１タンパク質をコードする核酸を含んでなる組換え細胞を提供する段階、（ｂ）該組換え細胞を、活性化の閾値より上の温度（典型的には約２８℃より上）で変動する長さの時間、試験化合物と接触させる段階、（ｃ）試験化合物を徹底的に洗い流す段階、および（ｄ）変動する時間点で、ＣＭＲ１を活性化する刺激へのその後の曝露に応答して該試験化合物がＣＭＲ１活性を低下させる程度を測定する段階を含んでなる。第二の方法は、開放状態から脱感作若しくは不活性化状態のチャンネルを誘導かつ／若しくは安定化する化合物を同定するよう設計され、そして：（ａ）ｃＣＭＲ１タンパク質をコードする核酸を含んでなる組換え細胞を提供する段階、（ｂ）活性化の閾値より上の温度（典型的には約２８℃より上）でＣＭＲ１アゴニストと該組換え細胞を接触させる段階、（ｃ）該組換え細胞を、変動する長さの時間、試験化合物と接触させる段階、（ｄ）試験化合物およびアゴニストを徹底的に洗い流す段階、ならびに（ｅ）変動する時間点で、ＣＭＲ１を活性化する刺激へのその後の曝露に応答して該試験化合物がＣＭＲ１活性を低下させる程度を測定する段階、若しくは：（ａ）ｃＣＭＲ１タンパク質をコードする核酸を含んでなる組換え細胞を提供する段階、（ｂ）活性化の閾値より下の温度（典型的には約２８℃より下）で該組換え細胞をインキュベートする段階、（ｃ）該組換え細胞を、変動する長さの時間、試験化合物と接触させる段階、（ｄ）試験化合物を徹底的に洗い流す段階、および（ｅ）変動する時間点で、ＣＭＲ１を活性化する刺激へのその後の曝露に応答して該試験化合物がＣＭＲ１活性を低下させる程度を測定する段階、のいずれかを含んでなる。

からし油によるｃＣＭＲ１の活性化
からし油は皮膚に適用される場合に疼痛および炎症を導き出す天然の生成物である。最近、ＴＲＰファミリーの新規１メンバーＴＲＰＡ１が、からし油の辛味作用の細胞および分子標的の１つとして提案された（Ｊｏｒｄｔら ２００４、Ｎａｔｕｒｅ、４２７：２６０−２６５）。われわれはからし油もまたｃＣＭＲ１を活性化することを示した。

ｃＣＭＲ１で安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、６．７×１０^５細胞／ウェルの濃度で３８４ウェルプレートに接種し、そして３７℃／５％ＣＯ_２で一夜インキュベートした。翌日、細胞にカルシウム色素を負荷し、そして室温で３０分間インキュベートした。化合物を細胞に投与する前および後に、カルシウム媒介性の蛍光強度をＦＬＩＰＲにより測定した。図３に示されるとおり、ｃＣＭＲ１は１００ｎＭイチリン（実線）のような冷却化合物に感受性であるのみならず、しかしまた辛味化合物（１ｍＭからし油）（点線）によっても活性化される。

全細胞パッチクランプ研究
パッチクランプ実験を実施して、単一細胞中で発現されるｃＣＭＲ１チャンネルの特性を研究した。

イヌｃＣＭＲ１で安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎児血清、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を補充したＤＭＥＭ中で培養した。細胞は３７℃でかつ５％ＣＯ_２中で維持した。

別の方法で示されない限り、記録に使用した標準細胞外溶液は（ｍＭで）：ＮａＣｌ、１３２、ＥＧＴＡ、１；ＫＣｌ、５．４；ＭｇＣｌ_２、０．８；ＨＥＰＥＳ、１０；ブドウ糖、１０；ｐＨ＝７．４を含有した。細胞外溶液がＣａ^２＋を含有した実験において、使用した細胞外溶液は、使用されたＣａ^２＋濃度に依存して、以下（ｍＭで）：（１）ＮａＣｌ、１３２；ＣａＣｌ_２、０．１若しくは１．８；ＫＣｌ、５．４；ＭｇＣｌ_２、０．８；ＨＥＰＥＳ、１０；ブドウ糖、１０；ｐＨ＝７．４；（２）ＮａＣｌ、１１６；ＣａＣｌ_２、１０；ＫＣｌ、５．４；ＭｇＣｌ_２、０．８；ＨＥＰＥＳ、１０；ブドウ糖、１０；ｐＨ＝７．４の一方であった。記録ピペットを満たすのに使用した細胞内溶液は（ｍＭで）：ＣｓＣｌ、１４５；ＥＧＴＡ、５；ＨＥＰＥＳ、１０；ブドウ糖、５；ｐＨ＝７．４を含有した。

記録は、単一細胞記録に適切な密度で細胞をガラス製カバーガラス上にプレーティングした１〜２日後に、慣習的全細胞パッチクランプ技術を使用して実施した。電流をパッチクランプ増幅器により増幅し、そして２ｋＨｚでフィルタリングした（Ａｘｏｐａｔｃｈ
２００Ｂ、Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。メントール（１００μＭ）若しくはイチリン（１μＭ）を、重力供給式灌流装置を介して０．５ｍｌ／分で細胞に適用した。アゴニスト刺激を伴う記録を２２℃で実施した。

温度を変動させた実験において、温度傾斜は、双極温度制御装置（型式ＣＬ−１００、Ｗａｒｎｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、コネチカット州ハムデン）により制御される二重インラインヒーター／クーラー（型式ＳＣ−２０、Ｗａｒｎｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）中で灌流液を加熱／冷却することにより生成させた。記録される細胞付近の温度は、モニタリング温度計（型式ＴＨ−８、Ｐｈｙｓｉｔｅｍｐ、ニュージャージー州クリフトン）に接続した特注の小型温度マイクロプローブで測定し、そして、全細胞パッチクランプモードで同時に電流が測定されたように、Ｄｉｇｉｄａｔａ １３２２ＡおよびｐＣｌａｍｐ ９．０（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、カリフォルニア州ユニオンシティ）を使用してサンプリングした。２種の電圧プロトコルをこれらの研究で使用した。第一のものは１０ｋＨｚのサンプリングレートで、−１００ｍＶから＋６０ｍＶまでの６００ｍｓの電圧傾斜を伴った。この電圧パルスを５秒ごとに１回反復した。細胞は、電圧パルスの間、−１００ｍＶで保持した。第二のプロトコルにおいて、細胞は−８０ｍＶで保持し、そして電流をこの保持電位で連続的に（１００Ｈｚで）サンプリングした。

図４は、ｃＣＭＲ１が強く外側に整流しておりかつ陽イオンに対し非選択的であることを具体的に説明する。ｃＣＭＲ１の全細胞パッチクランプ記録を、上述された電圧傾斜プロトコルを使用して実施した。冷却剤１００μＭメントールの適用に際して、過分極および脱分極双方の膜電位で、対照（点線）に比較して全細胞電流振幅（実線）の大きな増大が存在した。この増大は、過分極電位でよりも脱分極電位ではるかにより顕著であった。これゆえに、該チャンネルは強く外側に整流している。加えて、メントールで活性化された電流は０ｍＶ近くで逆転電位を有し、該チャンネルの比較的非選択的（少なくともこれらの実験で使用した陽イオンに対して）の性質を示す。定性的に類似の結果が、別の冷却剤イチリンについてもまた得られた。

ｃＣＭＲ１の温度感受性を図５に具体的に説明する。ｃＣＭＲ１を発現する細胞を灌流する溶液の温度が低下された際に、＋６０ｍＶで該細胞を通過する電流は、約１７℃の活性化閾値で有意に増大された。ｃＣＭＲ１チャンネルは室温で開放でなかったが、しかし約１７℃より下の低温により活性化された。

図６は、細胞外Ｃａ^２＋がｃＣＭＲ１チャンネルを脱感作することを示す。１００μＭのメントールは細胞外Ｃａ^２＋の非存在下で非脱感作電流を活性化した（−８０ｍＶ；灰色の軌跡）。対照的に、脱感作は、それ以外は同一の記録条件下で、１．８ｍＭの細胞外Ｃａ^２＋の存在下で容易に発生した（黒色の軌跡；表示の明快さのためＣａ^２＋を含まない軌跡に対し正規化した）。

細胞外Ｃａ^２＋は、該チャンネルが例えば１ｍＭのメントールにより活性化された場合にｃＣＭＲ１の電流の振幅を減少させた。細胞外Ｃａ^２＋によるこの見かけの阻害は濃度依存性であった（図７）。細胞外Ｃａ^２＋の濃度が高くなるほど、電流の振幅の阻害が大きくなる。図７中の点線は、該データへの最良適合を表すロジスティック関数である。１．６ｍＭの細胞外Ｃａ^２＋のＩＣ_５０値が最良適合解析から得られた。加えて、細胞外Ｃａ^２＋による見かけの阻害は電圧依存性であった（図８）。細胞外Ｃａ^２＋（１０ｍＭ）は、過分極電位で電流の振幅を強く阻害した。該阻害はより脱分極した電位で減少された。

イヌＣＭＲ１発現ベクターで安定にトランスフェクトされた組換え細胞での細胞に基づくカルシウム流入アッセイの結果を具体的に説明する。細胞は、１０μＭのイチリン（黒丸）；若しくは１００μＭの（−）−メントール（白丸）に応答するカルシウム媒介性の蛍光の増大を示した。化合物は時間点２００秒で細胞に添加した。細胞への緩衝剤のみの添加（白三角）に際して、カルシウムの流入は観察されなかった。 実質的にカルシウムを含まない負荷緩衝液を使用する細胞に基づくカルシウム流入アッセイの結果を具体的に説明する。ラットＣＲＭ１発現ベクターで安定にトランスフェクトされた組換え細胞（黒丸）は、４ｍＭ Ｃａ^２＋の添加に際してカルシウム媒介性の蛍光の増大を示した。非形質転換細胞（白丸）は４ｍＭ Ｃａ^２＋の添加に際してより少ないＣａ^２＋流入を有した。Ｃａ^２＋は時間点１０秒で細胞に添加した。 ｃＣＭＲ１がからし油（辛味化合物）により活性化されることを具体的に説明する。ｃＣＭＲ１で安定にトランスフェクトされた組換え細胞は、１ｍＭからし油（点線）若しくは陽性対照としての１００ｎＭイチリン（実線）の添加に際して、カルシウム媒介性の蛍光の増大を示した。緩衝液単独を陰性対照（点線）として使用した。 ｃＣＭＲ１は強く外側に整流しておりかつ陽イオンに対し非選択的であることを具体的に説明する。実線は、１００μＭメントールの存在下で実施したｃＣＭＲ１の全細胞パッチクランプ記録を表す一方、点線は緩衝液対照を表す。 ｃＣＭＲ１の温度感受性を具体的に説明する。細胞を通過する電流は、ｃＣＭＲ１を発現する細胞を灌流する溶液の温度を低下させた際に有意に増大し、約１７℃の活性化閾値を示す。 細胞外Ｃａ^２＋がｃＣＭＲ１チャンネルを脱感作することを具体的に説明する。最も下の軌跡は、１００μＭメントールの存在下かつ細胞外Ｃａ^２＋の非存在下でのｃＣＭＲ１の全細胞パッチクランプ記録を表す一方、表示の明快さのためＣａ^２＋を含まない軌跡に対し正規化した最も上の黒色の軌跡は、１．８ｍＭの細胞外Ｃａ^２＋の存在下で１００μＭメントールにより活性化された電流を表す。 細胞外Ｃａ^２＋によるｃＣＭＲ１チャンネルの電流の増幅の阻害の濃度依存性を具体的に説明する。チャンネルを−８０ｍＶで電圧クランプし、そして１ｍＭメントールにより活性化した。点線は、１．６ｍＭというＩＣ_５０値を伴う、該データへの最良適合を表すロジスティック関数である。 細胞外Ｃａ^２＋によるｃＣＭＲ１チャンネルの電流の増幅の阻害の電圧依存性を具体的に説明する。チャンネルは１ｍＭメントールにより活性化した。

Claims (49)

1. 寒冷刺激を検出かつ伝達することが可能でかつ配列番号２に対する最低９６％の配列の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子。
2. 配列番号２に対する最低９８％の配列の同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項１に記載の単離された核酸分子。
3. 配列番号２のポリペプチドをコードする、請求項１に記載の単離された核酸分子。
4. 配列番号１のヌクレオチド６９ないし３３８０を含んでなる、配列番号１に記載の単離された核酸分子。
5. 請求項１に記載の単離された核酸配列を含んでなる発現ベクター。
6. 請求項１に記載の単離された核酸配列を含んでなる組換え宿主細胞。
7. 寒冷刺激を検出かつ伝達することが可能でかつ配列番号２に対する最低９６％の配列の同一性を有する、実質的に精製されたポリペプチド。
8. 配列番号２に対する最低９８％の配列の同一性を有する、請求項７に記載の実質的に精製されたポリペプチド。
9. 配列番号２を含んでなる、請求項７に記載の実質的に精製されたポリペプチド。
10. （ａ）請求項７に記載のポリペプチドをコードすることが可能な発現ベクターを細胞に導入する段階；および
    （ｂ）該発現ベクターからのポリペプチドの発現を可能にする条件下で細胞を培養する段階
    を含んでなる、請求項７に記載のポリペプチドの発現方法。
11. ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で請求項１に記載の核酸分子に選択的にハイブリダイズする核酸プローブ。
12. 請求項７に記載のポリペプチドに選択的に結合する抗体。
13. 請求項１１に記載の核酸プローブを含んでなるキット。
14. 請求項１２に記載の抗体を含んでなるキット。
15. 請求項１１に記載の核酸プローブと核酸分子を接触させる段階を含んでなる、請求項１に記載の核酸分子の検出方法。
16. 請求項１２に記載の抗体とポリペプチドを接触させる段階を含んでなる、請求項７に記載のポリペプチドの検出方法。
17. （ａ）ｃＣＭＲ１遺伝子の発現を調節するための機構を含んでなる細胞と試験化合物を接触させる段階；および
    （ｂ）該試験化合物が、該細胞からの前記機構により制御される遺伝子の発現を増大若し
    くは減少させるかどうかを決定する段階
    を含んでなる、ｃＣＭＲ１タンパク質の発現を増大若しくは減少させる化合物の同定方法。
18. その発現が該機構により制御される遺伝子がレポーター遺伝子である、請求項１７に記載の方法。
19. その発現が該機構により制御される遺伝子がｃＣＭＲ１遺伝子である、請求項１７に記載の方法。
20. （ａ）試験化合物をｃＣＭＲ１イオンチャンネルと接触させる段階；および
    （ｂ）該試験化合物がイオンチャンネルの伝導性を増大若しくは低下させるかどうかを決定する段階
    を含んでなる、ｃＣＭＲ１イオンチャンネルの伝導性を増大若しくは低下させる化合物の同定方法。
21. ｃＣＭＲ１イオンチャンネルが、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなる、請求項２０に記載の方法。
22. ｃＣＭＲ１イオンチャンネルが宿主細胞と会合される、請求項２０に記載の方法。
23. 宿主細胞が、ｃＣＭＲ１イオンチャンネルの組換え宿主細胞である、請求項２２に記載の方法。
24. 宿主細胞が、ｃＣＭＲ１イオンチャンネルの内因性宿主細胞である、請求項２２に記載の方法。
25. ｃＣＭＲ１が、単離された膜調製物と会合される、請求項２０に記載の方法。
26. 段階（ｂ）が、細胞内カルシウムレベルの量を測定することを含んでなる、請求項２０に記載の方法。
27. 試験化合物をイオンチャンネルと接触させる段階の前に、イオンチャンネルの伝導性を増大させる段階をさらに含んでなる、請求項２０に記載の方法。
28. イオンチャンネルの伝導性を増大させる段階が、イオンチャンネルの伝導性を増大させることが可能な化合物を含有する緩衝溶液中で該チャンネルをインキュベートすることを含んでなる、請求項２７に記載の方法。
29. チャンネルの伝導性を増大させることが可能な化合物が、メントール、イチリンおよびｍｕｓｔｅｒオイルよりなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
30. イオンチャンネルの伝導性を増大させる段階が、ｃＣＭＲ１チャンネル活性化温度でイオンチャンネルをインキュベートすることを含んでなる、請求項２７に記載の方法。
31. ｃＣＭＲ１チャンネル活性化温度が４〜１７℃の範囲内にある、請求項３０に記載の方法。
32. イオンチャンネルの伝導性を増大させる段階が、イオンチャンネルを脱分極させることを含んでなる、請求項２７に記載の方法。
33. 試験化合物をイオンチャンネルと接触させる段階の前に、イオンチャンネルの伝導性を低下させる段階をさらに含んでなる、請求項２０に記載の方法。
34. イオンチャンネルの伝導性を低下させる段階が、イオンチャンネルの伝導性を低下させることが可能な化合物を含有する緩衝溶液中で該チャンネルをインキュベートすることを含んでなる、請求項３３に記載の方法。
35. イオンチャンネルの伝導性を低下させる段階が、ｃＣＭＲ１チャンネルを活性化しない温度でイオンチャンネルをインキュベートすることを含んでなる、請求項３３に記載の方法。
36. ｃＣＭＲ１チャンネルを活性化しない温度が室温である、請求項３５に記載の方法。
37. イオンチャンネルの伝導性を低下させる段階が、イオンチャンネルの伝導性を低下させるのに十分である濃度の細胞外Ｃａ^２＋を含有する緩衝溶液中で該チャンネルをインキュベートすることを含んでなる、請求項３３に記載の方法。
38. イオンチャンネルの伝導性を低下させる段階が、イオンチャンネルを過分極させることを含んでなる、請求項３３に記載の方法。
39. （ａ）不活性化量以下のカルシウムを含有する緩衝溶液中でイオンチャンネルをインキュベートする段階；
    （ｂ）イオンチャンネルを活性化する段階；
    （ｃ）イオンチャンネルを試験化合物と接触させる段階；
    （ｄ）緩衝溶液中のカルシウムの量を増大させる段階；および
    （ｅ）該試験化合物がイオンチャンネルの伝導性を増大若しくは低下させるかどうかを決定する段階
    を含んでなる、哺乳動物のＣＭＲ１イオンチャンネルの伝導性を増大若しくは低下させる化合物の同定方法。
40. イオンチャンネルを活性化する段階が、イオンチャンネルの伝導性を増大させる化合物を含有する緩衝溶液中で該チャンネルをインキュベートすることを含んでなる、請求項３９に記載の方法。
41. イオンチャンネルを活性化する段階が、哺乳動物のＣＭＲ１チャンネルの活性化温度でイオンチャンネルをインキュベートすることを含んでなる、請求項３９に記載の方法。
42. イオンチャンネルを活性化する段階が、イオンチャンネルを脱分極することを含んでなる、請求項３９に記載の方法。
43. 哺乳動物のＣＭＲ１タンパク質が、ヒト、ラット、マウス若しくはイヌの起源のものである、請求項３９に記載の方法。
44. 試験化合物がイオンチャンネルの伝導性を増大若しくは低下させるかどうかを決定する段階が、細胞内カルシウム量を測定することを含んでなる、請求項３９に記載の方法。
45. 細胞内カルシウム量がＦＬＩＰＲアッセイを使用して測定される、請求項４４に記載の方法。
46. 試験化合物がイオンチャンネルの伝導性を増大若しくは低下させるかどうかを決定する段階が、該イオンチャンネルにより伝導される電流を測定することを含んでなる、請求項３９に記載の方法。
47. イオンチャンネルにより伝導される電流が、パッチクランプ技術を使用して測定される、請求項４６に記載の方法。
48. （ａ）ｃＣＭＲ１から構成されるイオンチャンネルと試験化合物を接触させる段階；および
    （ｂ）該試験化合物がイオンチャンネルの伝導性を増大若しくは低下させるかどうかを決定する段階
    を含んでなる、疼痛を処置するのに有用な化合物の同定方法。
49. （ａ）試験化合物を動物に投与する段階；および
    （ｂ）該試験化合物が該動物の侵害受容／侵害防御応答を変える程度を決定する段階
    をさらに含んでなる、請求項４８に記載の方法。

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