JP2009525024A - Ｋｃｎｑ５上の新規なレチガビン結合部位 - Google Patents

Ｋｃｎｑ５上の新規なレチガビン結合部位 Download PDF

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Abstract

本明細書では、カリウムチャネルアクチベーターレチガビンに対する応答性を欠いた突然変異型ＫＣＮＱ５カリウムチャネルの核酸配列およびポリペプチド配列が開示される。また、本明細書では、前述の突然変異型ＫＣＮＱ５カリウムチャネルの使用に関する方法およびキットも開示される。

Description

本明細書は、ＫＣＮＱ５上の新規なレチガビン結合部位、その遺伝子、核酸、タンパク質、ベクター、および使用方法が開示される。
イオンチャネルは、カルシウム、カリウム、ナトリウムおよび塩化物を含むイオンの、細胞内外への流れを調節する細胞タンパク質である。これらのチャネルは神経伝達、筋収縮および細胞分泌などのプロセスに影響を及ぼす。イオンチャネルの中でも、カリウムチャネルは最も偏在しており、神経、筋肉、腺、免疫組織、生殖組織および上皮組織などの様々な動物細胞に見られる。これらのチャネルはある条件下でカリウム流を細胞内および／または細胞外へ向かわせる。例えば、これらのチャネルの開口時に外向きのカリウムイオン流は、細胞内部をより陰性とし、細胞にかかる脱分極性電圧を打ち消す。これらのチャネルは、例えば、カルシウム感受性、電圧依存性ゲーティング、セカンドメッセンジャー、細胞外リガンドおよびＡＴＰ感受性によって調節される。
カリウムチャネルは、一般にニューロンおよび筋肉細胞を過分極する働きをする膜貫通タンパク質である。生理学的研究では、カリウム電流はほとんどの細胞に見られ、興奮性細胞の電気特性の調節をはじめ、広範な機能に関連していることが示されている。カリウムチャネルの種類により、その機能活性は膜電圧、種々のリガンド、タンパク質リン酸化、または他のセカンドメッセンジャーにより制御されている可能性がある（例えば、米国特許第６，８９３，８５８号）。
カリウムチャネルファミリーは、哺乳動物組織においておよそ７０のメンバーを有する。最近同定されたＫＣＮＱサブファミリー（Ｋｖ７）は、細胞の興奮性の決定因子として重要な機能的役割を果たしていることが示された。最近の証拠は、ＫＣＮＱカリウムチャネルサブユニットが数種の組織におけるＭ電流活動の分子的基礎をなしていることを示す。この遺伝子ファミリーはＫＣＮＱ１〜ＫＣＮＱ５（Ｋｖ７．１〜７．５）と呼ばれる少なくとも５つの主要サブユニットを含むまでに進化した。これらのサブユニットは同時に組み立てられ、ヘテロメリックおよびホモメリック双方の機能的イオンチャネルを形成することが示されている。
電圧依存性カリウムチャネルは膜電位の重要なレギュレーターであり、ニューロンまたは心筋細胞などの電気的に活性な細胞の興奮性を変調する。電圧依存性カリウム（Ｋ＋）チャネルの数種のクラスがクローニングされている（例えば、Lerche C et al., J. Biol. Chem. 275:22395-22400 (2000)参照）。
５つのＫＣＮＱカリウムチャネル遺伝子のうち４つの突然変異が、心臓ＬＱＴ症候群（ＫＣＮＱ１）、癲癇（ＫＣＮＱ２および３）、先天性難聴（ＫＣＮＱ４）を招く多様な疾病に関連づけられている。中枢神経系（ＣＮＳ）で実証されたＭ電流の形成におけるＫＣＮＱ５の重要性のために、この遺伝子の不全はニューロンの興奮性の障害をもたらすと予測される（例えば、Lerche C et al., J. Biol. Chem. 275:22395-22400 (2000); Schroeder BC et al., J. Biol. Chem. 275:24089-95 (2000)参照）。
カリウムチャネルは、心拍、動脈拡張、インスリン放出、神経細胞の興奮性の調節および腎臓電解質輸送の調節を含む、多くの生理学的プロセスに関与している。
レチガビン（Ｎ−（２−アミノ−４−（４−フルオロベンジルアミノ）−フェニル）カルバミン酸エチルエステル）は、ＫＣＮＱ５を含む、ある種のＫＣＮＱチャネルを開口することが分かっている。しかしながら、レチガビンは、３７％配列同一性までＫＣＮＱ５と相同なＫＣＮＱ１に対して増強作用は持たない。レチガビンは、これらのチャネルの開口確率を高めることによりその細胞作用を発揮する(Main J, Mol. Pharmacol. 58:253-62 (2000); Wickenden A et al., Mol. Pharmacol. 58:591-600 (2000))。この個々のＫＣＮＱチャネルの増強はまとまって、全細胞ＫＣＮＱにより媒介されるコンダクタンスの有意な増大により作り出された、特に脱分極細胞における細胞膜の過分極をもたらす。
本明細書では、レチガビンに応答する機能的特性を失ったＫＣＮＱ５の突然変異体を開示する。
一態様は、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドの全部または一部をコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
別の態様は、
（ａ）配列番号１を含む核酸配列；
（ｂ）配列番号２をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１と少なくとも約９５％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸配列（ただし、ヌクレオチド８０８〜８１０における置換は、アミノ酸ロイシンの保存的置換をもたらすコドンに対するものである）；
（ｄ）高ストリンジェント条件下で配列番号１とハイブリダイズし得る核酸分子；
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に相補的な核酸分子；および
（ｆ）配列番号１の変異体
からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドに関する。
別の実施形態は、ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドである。
さらなる態様は、
（ａ）ヌクレオチド７６９〜１０６２が配列番号５で置換されている、配列番号３を含む核酸配列；
（ｂ）アミノ酸２５７〜３５４がＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインで置換されている、配列番号４をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）高ストリンジェント条件下で（ａ）または（ｂ）の核酸配列とハイブリダイズし得る核酸分子；および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に相補的な核酸分子
からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドに関する。
別の態様は、
（ａ）ヌクレオチド７６９〜８７３が配列番号５のヌクレオチド１〜１０５で置換されている、配列番号３を含む核酸配列；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸２５７〜２９１がＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインで置換されている、配列番号４をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）高ストリンジェント条件下で（ａ）または（ｂ）の核酸配列とハイブリダイズし得る核酸分子；および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に相補的な核酸分子
からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドに関する。
別の実施形態は、
（ａ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２を含むアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）の変異体；および
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列（ただし、アミノ酸２７０における置換はアミノ酸ロイシンに対する保存的置換である）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドである。
さらなる態様は、前述の単離されたポリペプチドである少なくとも１つのＫＣＮＱ５サブユニットを含むＫＣＮＱ二量体チャネルに関する。別の態様は、前述の単離されたポリペプチドである少なくとも１つのＫＣＮＱ５サブユニットを含むＫＣＮＱ四量体チャネルに関する。
さらなる実施形態は、配列番号２を含むＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドと特異的に結合する抗体である。
別の態様は、配列番号２由来の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含むＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチド断片（該断片は配列番号２のアミノ酸２７０を含む）と特異的に結合する抗体に関する。
さらなる態様は、ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含む単離されたＫＣＮＱ５ポリペプチドに関する。
さらなる態様は、ＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含む単離されたＫＣＮＱ５ポリペプチドに関する。さらなる態様は、ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインまたはＳ５トランスメンブランドメインを含む前述の単離されたＫＣＮＱ５ポリペプチドである少なくとも１つのＫＣＮＱ５サブユニットを含むＫＣＮＱ二量体チャネルに関する。別の態様は、ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインまたはＳ５トランスメンブランドメインを含む前述の単離されたＫＣＮＱ５ポリペプチドである少なくとも１つのＫＣＮＱ５サブユニットを含むＫＣＮＱ四量体チャネルに関する。
別の態様は、薬剤のスクリーニング方法に関し、その方法は、
（ａ）薬剤と、
（ｉ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドの全部または一部をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｖ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｖ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチド；および
（ｖｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチド
からなる群から選択されるＫＣＮＱ５分子
を接触させること；および
（ｂ）ＫＣＮＱ５活性に対する該薬剤の作用を検出すること
を含み、ＫＣＮＱ５活性の低下または増強の検出が、薬剤がＫＣＮＱ５のモジュレーターであることを示す。
さらなる実施形態は、薬剤のスクリーニング方法であり、その方法は、
（ａ）細胞と薬剤を接触させること；および
（ｂ）（ｉ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドの全部または一部をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｖ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｖ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチド；および
（ｖｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチド
からなる群から選択されるＫＣＮＱ５分子の発現レベルを測定すること
を含み、
ＫＣＮＱ５発現の低下または増強の検出が、薬剤がＫＣＮＱ５のモジュレーターであることを示す。
別の態様は、哺乳動物における膀胱制御の誘導もしくは維持、尿失禁の治療もしくは予防、または神経因性疼痛の治療もしくは予防の方法に関し、その方法は、前述の方法のいずれかにより同定された薬剤の薬理学的有効量を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む。
別の態様は、ＫＣＮＱ５ポリペプチドと結合し得るポリペプチドを同定する方法に関し、その方法は、
（ａ）ＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードする配列が１つのハイブリッドベクターに保持され、かつ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリー由来の配列が第二のハイブリッドベクターに保持されている二ハイブリッド法を哺乳動物に適用すること［なお、該ＫＣＮＱ５ポリペプチドは、
（ｉ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｉｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチド；および
（ｉｉｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチド
からなる群から選択される］；
（ｂ）宿主細胞を前記ベクターで形質転換すること；
（ｃ）陽性形質転換細胞を単離すること；および
（ｄ）前記第二のハイブリッドベクターを抽出して、ＫＣＮＱ５ポリペプチドと結合するポリペプチドをコードする配列を得ること
を含む。
さらなる態様は、ＫＣＮＱ５ポリペプチドを検出する方法に関し、その方法は、
（ａ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含むＫＣＮＱ５ポリペプチドと選択的に結合する抗体；
（ｂ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドと選択的に結合する抗体；
（ｃ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドと選択的に結合する抗体；および
（ｄ）配列番号２由来の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含むＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチド断片と選択的に結合する抗体（この断片は配列番号２由来のアミノ酸２７０を含む）
からなる群から選択される抗体と、ＫＣＮＱ５ポリペプチド、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドまたはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチド断片を含むと思われるサンプル中の分子との結合を検出することを含み、ここで、該抗体は、サンプル中に存在するＫＣＮＱ５ポリペプチド、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドまたはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチド断片との特異的結合を可能とする条件下でサンプルと接触され、抗体とサンプル中の分子の結合が、ＫＣＮＱ５ポリペプチド、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドまたはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチド断片の存在を示す。
さらなる実施形態は、ＫＣＮＱ５の発現を検出する方法であり、その方法は、
ＫＣＮＱ５を発現すると思われる細胞または組織に由来するサンプルにおいて、
（ｉ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｉｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチド；および
（ｉｉｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチド
からなる群から選択されるＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを、
（ｉ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドの全部または一部をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
（ｉｉｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチドから由来の少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含むプローブで検出することを含む。
別の実施形態は、ＫＣＮＱ５遺伝子が突然変異または欠失しているかどうかを判定する方法であり、その方法は、対象に由来する細胞または組織のサンプルにおいて、ＫＣＮＱ５タンパク質をコードする遺伝子の完全性に影響を及ぼす少なくとも１つの変異またはＫＣＮＱ５遺伝子の異所性発現を特徴とする遺伝的変異の存在または不在を検出することを含み、この検出工程は、
（ｉ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドの全部または一部をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
（ｉｉｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチド由来の少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブまたはプライマーを用いて行われる。
さらなる態様は、ＫＣＮＱ５ポリペプチドの変異体を同定する方法に関し、その方法は、ＫＣＮＱ５突然変異体を含むコンビナトリアルライブラリーをＫＣＮＱ５ポリペプチドアゴニストまたはアンタゴニストに関してスクリーニングすることを含み、該ＫＣＮＱ５ポリペプチドは、
（ｉ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｉｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチド；および
（ｉｉｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチド
からなる群から選択される。
さらなる態様は、ＫＣＮＱ５ポリペプチドを単離する方法に関し、その方法は、
（ａ）ＫＣＮＱ５抗体を、
（ｉｖ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｖ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチド；および
（ｖｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチド
からなる群から選択されるＫＣＮＱ５ポリペプチドを含むと思われるサンプルと接触させること；および
（ｂ）そのサンプルからＫＣＮＱ５抗体−ＫＣＮＱ５ポリペプチド複合体を単離すること
を含む。
さらなる実施形態は、ＫＣＮＱ５ポリペプチドを産生する方法であり、その方法は、
（ａ）発現ベクターを含む形質転換宿主細胞を、ＫＣＮＱ５ポリペプチドが産生されるような適切な培地で培養すること［該発現ベクターは、
（ｉ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドの全部または一部をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
（ｉｉｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む］；および
（ｂ）所望により工程（ａ）のＫＣＮＱ５ポリペプチドを回収すること
を含む。
別の実施形態は、ＫＣＮＱ５活性の亢進を必要とする哺乳動物の処置方法であり、その方法は、それを必要とする哺乳動物に、
（ｉ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドの全部または一部をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｖ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｖ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチド；および
（ｖｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチド
からなる群から選択される、治療有効量のＫＣＮＱ５分子を投与することを含む。
さらなる態様は、ＫＣＮＱ５活性の低下を必要とする哺乳動物の処置方法に関し、その方法は、それを必要とする哺乳動物に治療有効量の、
（ａ）（ｉ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドの全部または一部をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
（ｉｉｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチドに対してアンチセンスであるＫＣＮＱ５アンチセンスポリヌクレオチド；または
（ｂ）（Ａ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含むＫＣＮＱ５ポリペプチドと選択的に結合する抗体；
（Ｂ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドと選択的に結合する抗体；
（Ｃ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドと選択的に結合する抗体；および
（Ｄ）配列番号２由来の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含むＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチド断片と選択的に結合する抗体（該断片は配列番号２由来のアミノ酸２７０を含む）
からなる群から選択されるＫＣＮＱ５抗体
を投与することを含む。
別の態様は、抗ＫＣＮＱ５ポリペプチド抗体を得る方法に関し、その方法は、
（ａ）免疫原性ＫＣＮＱ５ポリペプチドまたはＫＣＮＱ５ポリペプチドに独特なその免疫原性部分で動物を免疫処理すること［該ＫＣＮＱ５ポリペプチドは、
（ｉ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｉｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチド；および
（ｉｉｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチド
からなる群から選択される］；および
（ｂ）その動物からＫＣＮＱ５ポリペプチドと特異的に結合する抗体を単離すること
を含む。
さらなる態様は、ＫＣＮＱ５ポリペプチドの機能的イオンチャネルをコードする能力を評価する方法に関し、その方法は、
（ａ）宿主細胞を、
（ｉ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｉｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチド；および
（ｉｉｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチド
からなる群から選択されるＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトすること；
（ｂ）その宿主細胞においてＫＣＮＱ５ポリペプチドを発現させること；および
（ｃ）ＫＣＮＱ５ポリペプチドのイオン電流の大きさを電気生理学的に測定すること
を含む。
別の実施形態は、対象において、ＫＣＮＱ５活性および／または発現の調節から利益を得る疾病または症状を予防する方法であり、その方法は、その対象に、ＫＣＮＱ５ポリペプチドまたはＫＣＮＱ５発現もしくは少なくとも１つのＫＣＮＱ５活性を調節する薬剤を投与することを含み、該ＫＣＮＱ５ポリペプチドは、
（ｉ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｉｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチド；および
（ｉｉｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチド
からなる群から選択される。
さらなる実施形態は、ＫＣＮＱ５ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを検出するためのキットであり、そのキットは、
（ａ）標識化合物または生体サンプル中のＫＣＮＱ５ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを検出し得る薬剤；
（ｂ）そのサンプル中のＫＣＮＱ５ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの量を測定するための手段；
（ｃ）そのサンプル中のＫＣＮＱ５ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの量を標体と比較するための手段；および
（ｄ）所望により、ＫＣＮＱ５ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを検出するためのキットの使用説明書
を含み、該ＫＣＮＱ５ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、
（ｉ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドの全部または一部をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｖ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｖ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチド；および
（ｖｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチド
からなる群から選択される。
別の実施形態はは、ＫＣＮＱ５活性のモジュレーターを同定するためのキットであり、該キットは、
（ａ）ＫＣＮＱ５ポリペプチドを含む細胞または組成物；
（ｂ）ＫＣＮＱ５ポリペプチド活性を測定するための手段；および
（ｃ）所望により、ＫＣＮＱ５活性のモジュレーターを同定するためのキットの使用説明書
を含み、該ＫＣＮＱ５ポリペプチドは、
（ｉ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｉｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチド；および
（ｉｉｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチド
からなる群から選択される。
さらなる実施形態は、対象において、異常なＫＣＮＱ５発現および／または活性に付随する障害を診断するためのキットであり、該キットは、
（ａ）ＫＣＮＱ５ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現を測定するための試薬；
（ｂ）対象の結果を比較する対照；および
（ｃ）所望により、診断目的でのキットの使用説明書
を含み、
該ＫＣＮＱ５ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、
（ｉ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドの全部または一部をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｖ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｖ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチド；および
（ｖｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチド
からなる群から選択される。
他の目的および利点は、当業者には、以下に続く詳細な説明を参照すれば明らかになる。
配列の簡単な説明
配列番号１は、ＫＣＮＱ（Ｗ２７０Ｌ）ｃＤＮＡを表す。
配列番号２は、ＫＣＮＱ（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質を表す。
配列番号３は、野生型ヒトＫＣＮＱ５ ｃＤＮＡを表す。
配列番号４は、野生型ヒトＫＣＮＱ５タンパク質を表す。
配列番号５は、ヒトＫＣＮＱ１ ｃＤＮＡ由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを表す。
配列番号６は、ヒトＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを表す（翻訳されたアミノ酸配列）。
配列番号７は、野生型ヒトＫＣＮＱ１ ＤＮＡを表す。
配列番号８は、野生型ヒトＫＣＮＱ１タンパク質を表す。
出願人らは、本開示に引用されている全ての参照文献の全内容を明示して組み入れる。さらに、量、濃度または他の値またはパラメーターが範囲、好ましい範囲、または好ましい上方値と好ましい下方値の一覧のいずれかで示されている場合、範囲が別に開示されているとしても、いずれかの上方の範囲限界または好ましい値と下方の範囲限界または好ましい値の対から形成される全範囲を具体的に開示するものと理解される。本明細書において数値の範囲が記載されている場合、特に断りがない限り、その範囲はその終点ならびにその範囲内の全ての整数および分数を含むものとする。本発明の範囲は、範囲を定義する場合に挙げられている特定の値に限定されるものではない。
Ｉ．定義
本開示では、いくつかの用語が使用される。
本明細書において「約」または「およそ」とは、示されている値または範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内を意味する。
「変化レベル」とは、正常または非形質転換生物のものとは異なる量または割合での、生物における遺伝子産物の産生を指す。ポリペプチドの過剰発現は、まず、コード領域が、所望の発達段階の所望の組織において遺伝子または構築物の発現を指示することができるプロモーターと作動可能なように連結されているキメラ遺伝子またはキメラ構築物を構築することにより達成することができる。便宜であることから、このキメラ遺伝子またはキメラ構築物は同じ遺伝子に由来するプロモーター配列と翻訳リーダー配列を含み得る。転写終結シグナルをコードする３’非コード配列も提供することができる。その後、本キメラ遺伝子またはキメラ構築物が構築可能である。プラスミドベクターの選択は、宿主細胞を形質転換するのに用いる方法によって異なる。当業者ならば、キメラ遺伝子またはキメラ構築物を含む宿主細胞を首尾よく形質転換し、選択し、増殖させるためにプラスミドベクター上に存在しなければならない遺伝エレメントについてよく知っている。また、当業者ならば、種々の独立した形質転換事象がレベルやパターンの異なる発現をもたらすこと（例えば、De Almedia ERP et al., Mol. Genet. Genomics 218:78-86 (1989)）、従って、所望の発現レベルおよびパターンを提示する系統を得るためには、複数の事象をスクリーニングしなければならないことが分かるであろう。このようなスクリーニングはＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡのノーザン分析、タンパク質発現のウエスタンもしくは免疫組織化学分析、または表現型分析により行うことができる。
「抗体」は、抗原上に存在するエピトープと結合し得る免疫グロブリン分子を含む。本明細書において、この用語はモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体などの完全な免疫グロブリン分子だけでなく、抗イディオタイプ抗体、突然変異体、断片、融合タンパク質、二重特性抗体、ヒト化タンパク質、および必要な特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の修飾物も包含する。
「ｃＤＮＡ」とは、細胞または生物体内に存在するｍＲＮＡ分子が逆転写酵素などの酵素を用いてｃＤＮＡとなった相補的ＤＮＡを含む。「ｃＤＮＡライブラリー」は、細胞または生物体内に存在するｍＲＮＡ分子が逆転写酵素を用いてｃＤＮＡ分子とされ、その後、ベクターに挿入されたものの集合体を含む。その後、このライブラリーを目的の特定のｃＤＮＡ（および従ってｍＲＮＡ）に対してプロービングすることができる。
「含む」とは、「〜本質的になる」および「〜からなる」という用語により包含される具体例を含むものとする。同様に、「〜本質的になる」とは、「〜からなる」という用語により包含される具体例を含むものとする。
本明細書において「ＫＣＮＱ５ポリペプチド」、「ＫＣＮＱ５アミノ酸配列」または「ＫＣＮＱ５タンパク質」とは、ＫＣＮＱ５Ｍ電流カリウムチャネル活性を保持しつつ、ＫＣＮＱ５ポリペプチドを実質的にＫ＋チャネルアクチベーターレチガビンに対して非感受性とする少なくとも１つのアミノ酸修飾を有する非野生型ＫＣ５ポリペプチドを指す。他方、「野生型ＫＣＮＱ５」（例えば、ヒト野生型ＫＣＮＱ５を表す配列番号４）はレチガビン応答性である（Wickendon AD et al., Brit. J. Pharmacol. 132:381-84 (2001)参照）。「ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチド」、「ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）アミノ酸配列」または「ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質」とは、アミノ酸２７０においてトリプトファン残基（全長ヒト野生型タンパク質の２７０番のアミノ酸）からロイシン残基への点突然変異を有するヒトＫＣＮＱ５ポリペプチドを指し、これはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドにレチガビン非感受性を付与する。配列番号２はＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドを表す。
一実施形態において、ＫＣＮＱ５ポリペプチドはヒトＫＣＮＱ５ポリペプチドである。別の実施形態では、ＫＣＮＱ５ポリペプチドは非ヒト哺乳動物ＫＣＮＱ５ポリペプチドである。好ましい非ヒト哺乳動物ＫＣＮＱ５ポリペプチドとしては、ラットＫＣＮＱ５ポリペプチド（同一所有者の同時係属中米国仮出願第６０／７６０，２４９号）およびマウスＫＣＮＱ５ポリペプチド（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＭ＿０２３８７２）が挙げられ、双方ともレチガビン感受性であり（例えば、Jensen HS et al., Brain Res. Mol. Brain Res. 139:52-62 (2005)参照）、ヒト野生型ＫＣＮＱ５と高い相同性を有し（ラットでは９４．７％、マウスでは９５．２％）、かつ、Ｗ２７０と同等であると考えられるアミノ酸（ラットではＷ２６９、マウスではＷ２７１）を含む。
本明細書において、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」とは、非ＫＣＮＱ５または非ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドと作動可能なように連結されたＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドを含む。「非ＫＣＮＱ５ポリペプチド」とは、ＫＣＮＱ５タンパク質と実質的に相同でないタンパク質、例えば、ＫＣＮＱ５タンパク質とは異なり、同じまたは異なる生物に由来するタンパク質に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。「非ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチド」とは、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質とは実質的に相同でないタンパク質、例えば、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質とは異なり、同じまたは異なる生物に由来するタンパク質に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）融合タンパク質の中で、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドはＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の全部または一部に相当し得る。好ましい実施形態では、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）融合タンパク質は、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。この融合タンパク質内で、「作動可能なように連結される」とは、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドと非ＫＣＮＱ５または非ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドが互いにインフレームで融合していることを示すものとする。この非ＫＣＮＱ５または非ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドは、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合させることができきる。
「ＫＣＮＱ５ポリヌクレオチド」または「ＫＣＮＱ５核酸配列」とは、ＫＣＮＱ５Ｍ電流カリウムチャネル活性を保持しつつ、ＫＣＮＱ５ポリペプチドを実質的にＫ＋チャネルアクチベーターレチガビンに対して非感受性とする少なくとも１つのアミノ酸修飾を有するＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードする非野生型ＫＣＮＱ５ポリヌクレオチドを指す。他方、「野生型ＫＣＮＱ５ポリヌクレオチド」または「野生型ＫＣＮＱ５核酸配列」（例えば、ヒト野生型ＫＣＮＱ５ポリヌクレオチドを表す配列番号３）は、レチガビン応答性の野生型ＫＣＮＱ５をコードする（Wickendon AD et al., Brit. J. Pharmacol. 132:381-84 (2001)参照）。
「コード配列」またはＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質もしくは酵素などの発現産物「をコードする」配列とは、発現した際にそのＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または酵素の産生をもたらすヌクレオチド配列、すなわち、そのポリペプチド、タンパク質または酵素のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
「相補的」とは、互いにハイブリダイズし得るヌクレオチド塩基間の関係を表すために用いる。例えば、ＤＮＡに関しては、アデノシンはチミジンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。
本明細書において、「有効量」、「治療有効量」、および「有効用量」とは、必要とする哺乳動物に投与した際に、例えば、火傷、挫傷、擦傷、裂傷、骨折、靱帯断裂、腱断裂、筋断裂、ウイルス感染、細菌感染、原虫感染または真菌感染、接触性皮膚炎、炎症（例えば、外傷、感染、外科術、火傷または炎症成分を有する疾病により起こるもの）、癌などにより引き起こされる体性痛、皮膚痛もしくは内臓痛、または歯痛；例えば、癌、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）感染、組織外傷、感染、自己免疫疾患、糖尿病、関節炎、糖尿病性神経障害、三叉神経痛または薬物投与による中枢神経系または末梢神経系への傷害により引き起こされる神経因性疼痛などの各種疼痛を含む、中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経系に関連する症状またはそれらの有害な症状の少なくとも部分的な改善；例えば、例えば、パニック障害、全身性不安障害またはストレス障害、特に、急性ストレス障害、情動障害、アルツハイマー病、運動失調、外傷または脳卒中または神経変性疾患により引き起こされるＣＮＳ損傷、認識欠陥、強迫行動、痴呆、うつ病、ハンチントン病、躁病、記憶欠陥(memory inpairment)、記憶障害(memory disorder)、記憶不全(memory dysfunction)、動作障害(motion disorder)、運動障害(motor disorder)、加齢性記憶喪失、神経変性疾患、パーキンソン病およびパーキンソン様運動障害、恐怖症、ピック病、精神病、統合失調症、脊髄損傷、振戦、発作、痙攣、癲癇、シュタルガルト様黄斑ジストロフィー、錐体桿体黄斑ジストロフィー、サラ病、癲癇、筋弛緩薬、解熱薬、抗不安薬、抗片頭痛薬、鎮痛薬、双極性障害、単極性うつ病、機能的腸疾患（例えば、消化不良および過敏性腸症候群）、下痢、便秘、各種尿失禁（例えば、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、溢出性尿失禁または無意識性尿失禁および混合型尿失禁）、尿意切迫、不安定膀胱、神経因性膀胱、聴力損失、耳鳴、緑内障、認知障害、慢性炎症性および神経因性疼痛の処置；例えば、癌、炎症、眼病および種々のＣＮＳ障害の処置に関する薬物依存性または薬物耐性の予防および軽減に有効なエフェクター分子の量を指す。
「発現する」および「発現」とは、遺伝子またはＤＮＡ配列中の情報を顕現可能とする、または顕現させること、例えば、対応する遺伝子またはＤＮＡ配列の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化させることによりタンパク質を産生することを意味する。ＤＮＡ配列は細胞内で、または細胞によって発現され、タンパク質などの「発現産物」を形成する。発現産物はそれ自体、例えば、生じたタンパク質は、細胞によって「発現」されたとも言うことができる。発現産物は細胞内、細胞外または分泌型として特徴付けることができる。「細胞内」とは、細胞の内部であるものを意味する。「細胞外」とは、細胞の外部であるものを意味する。ある物質が細胞上または細胞内のいずれかの場所から細胞外に有意な程度で見られる場合には、その物質は細胞によって「分泌される」。「アンチセンス阻害」とは、標的タンパク質の発現を抑制し得るアンチセンスＲＮＡ転写物の産生を指す。「過剰発現」とは、生物体における、正常または非形質転換生物における産生レベルを超える遺伝子産物の産生を指す。「抑制」とは、外来または内因性の遺伝子またはＲＮＡ転写物の発現を抑制することを指す。
「発現系」とは、例えば、ベクターに保持されている、または宿主細胞に導入された外来ＤＮＡによりコードされているタンパク質の発現のための、好適な条件下にある宿主細胞および適合ベクターを意味する。
「遺伝子」とは、１以上のタンパク質または酵素の全部または一部を含む特定のアミノ酸配列をコードする、または特定のアミノ酸配列に相当するコード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）に調節配列を含むＤＮＡ配列を意味する。「天然遺伝子」とは、自然界でその固有の調節配列とともに見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」または「キメラ構築物」とは、自然界ではともに見られない調節配列とコード配列を含む、天然でない遺伝子または構築物のいずれかを指す。よって、キメラ遺伝子またはキメラ構築物は、異なる起源に由来する調節配列とコード配列、または同じ起源に由来するが、自然界で見られるものとは異なる様式で配置されている調節配列とコード配列を含み得る。「内因性遺伝子」とは、ある生物のゲノム内のその本来の位置にある天然遺伝子を指す。「外来」遺伝子とは、その宿主生物には通常見られないが、遺伝子導入により宿主生物に導入された遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子またはキメラ遺伝子を含み得る。「導入遺伝子」は、形質転換法によってゲノムに導入された遺伝子である。
「遺伝子的に修飾される」とは、外来遺伝子または核酸配列を含む、かつ／または発現する細胞を含み、これは次に細胞またはその後代の遺伝子型または表現型を改変する。この用語は、細胞の内因性ヌクレオチドに対する付加、欠失または破壊を含む。
「遺伝子産物」とは、遺伝子が転写および翻訳された際に生成するアミノ酸（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）を含む。
「異種」とは、天然には存在しないエレメントの組合せを指す。例えば、異種ＤＮＡは、その細胞、またはその細胞の染色体部位には本来存在しないＤＮＡを指す。好ましくは、異種ＤＮＡは、その細胞に対して外来の遺伝子を含む。異種発現調節エレメントは、自然界でそれが作動可能なように連結されているものとは異なる遺伝子と作動可能なように連結されているエレメントである。
本明細書において「ホモメリック」とは、１種類のサブユニットだけを含むイオンチャネルを指す。例えば、ホモメリック二量体（「ホモ二量体」）ＫＣＮＱチャネルは、２つの同一のＫＣＮＱ５ポリペプチドサブユニットからなり得る。ホモメリック四量体（「ホモ四量体」）は、４つの同一のＫＣＮＱ５ポリペプチドサブユニットからなり得る。本明細書において「ヘテロメリック」とは、少なくとも２つの異なるサブユニットを含むイオンチャネルを指す。例えば、ヘテロメリック二量体（「ヘテロ二量体」）ＫＣＮＱチャネルは、１つのＫＣＮＱ５ポリペプチドサブユニットと１つのＫＣＮＱ３サブユニットからなり、またはヘテロ二量体ＫＣＮＱチャネルは、１つのＫＣＮＱ５ポリペプチドサブユニットと異なる１つのＫＣＮＱ５ポリペプチドサブユニットからなり得る。ヘテロメリック四量体（「ヘテロ四量体」）ＫＣＮＱチャネルは、１、２、３または４つのＫＣＮＱ５ポリペプチドサブユニットからなり得る（ただし、４つ全てのサブユニットがＫＣＮＱ５ポリペプチドサブユニットである場合には、それらのサブユニットの少なくとも１つが他の３つとは異なる）。
「相同」とは、２つのポリマー（すなわち、ポリペプチド分子または核酸分子）間の配列類似性の程度を指す。本明細書で示される相同性％の数値は、２つのポリマー間で可能な最大相同性、すなわち、２つのポリマーが一致する（相同な）位置の数が最大となるようにアラインされた場合の相同性％を表す。「相同」および「相同性」はまた、スーパーファミリー（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー）由来のタンパク質および異種由来の相同タンパク質（例えば、ミオシン軽鎖など）をはじめとする「共通の進化起源」を有するタンパク質間の関係を指す（例えば、Reeck GR et al., Cell 50:667 (1987)参照）。このようなタンパク質（およびそれらのコード遺伝子）は、類似性％に関してであれ、または保存された位置における特定の残基もしくはモチーフの存在に関してであれ、それらの配列類似性によって表されるような配列相同性を有する。よって、「配列類似性」とは、共通の進化起源を有しても有さなくてもよいタンパク質の核酸またはアミノ酸配列の間の同一性または一致の程度を指す（Reeck GR et al.,前掲参照）。しかしながら、一般的な使用において、また、本願において、「高度に」などの副詞で修飾される場合の「相同」とは配列類似性を指すことがあり、共通の進化起源に関連するか関連しないかは問わない。
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性％を決定するためには、これらの配列を最適な比較のためにアラインする（例えば、最適なアライメントのために第一および代にのアミノ酸配列または核酸配列の一方または双方にギャップを導入することができる）。好ましい実施形態では、比較のためにアラインされた参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、いっそうより好ましくは少なくとも６０％、いっそうより好ましくは少なくとも７０％、８０％または９０％である。次に、対応する位置の残基を比較し、一方の配列のある位置が他方の配列の対応する位置と同じ残基で占められていれば、それらの分子はその位置において同一である。従って、２配列間の同一性％は、２配列が共有している同一の位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。２配列間の同一性％は、２配列の最適なアライメントのために導入されるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、それらの配列が共有している同一の位置の数の関数である。
２排列間の配列比較および同一性％の決定は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。配列比較に使用される数学的アルゴリズムの非限定例として、Karlin S and Altschul SF, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77 (1993)の場合のように改変されたKarlin S and Altschul SF, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68 (1990)がある。このようなアルゴリズムはAltschul SF et al., J. Mol. Biol. 215:403-10 (1990)のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム スコア＝１００、ワードレングス＝１２を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、タンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワードレングス＝３を用いて行うことができる。比較のためのギャップ挿入アライメントを得るためには、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを、Altschul SF et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997）に記載されているように使用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合、個々のプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。もう１つの好ましい、配列比較に用いられる非限定的アルゴリズムとして、Myers EW and Miller W, Comput. Appl. Biosci. 4:11-17 (1988)のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウエアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列の比較にＡＬＩＧＮプログラムを用いる場合には、ＰＡＭ１２０ウエイト・レシジュ・テーブル、ギャップレングスペナルティー１２、およびギャップペナルティー４を使用することができる。
タンパク質配列のアライメントに用いられるもう１つの非限定例として、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎアルゴリズム（Lipman DJ and Pearson WR, Science 227:1435-41 (1985)）がある。Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎアルゴリズムを用いる場合には、ＰＡＭ２５０ウエイト・レシジュ・テーブル、ギャップレングスペナルティー１２、ギャップペナルティー４、およびＫｕｔｐｌｅ ２を使用することができる。核酸配列のアライメントに用いられる数学的アルゴリズムの好ましい非限定例として、Ｗｉｌｂｕｒ−Ｌｉｐｍａｎアルゴリズム(Wilbur WJ and Lipman DJ, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-30 (1983))がある。Ｗｉｌｂｕｒ−Ｌｉｐｍａｎアルゴリズムを用いる場合には、ウィンドウ２０、ギャップペナルティー３、Ｋｔｕｐｌｅ ３を使用することができる。Ｌｉｐｍａｎ−ＰｅａｒｓｏｎアルゴリズムおよびＷｉｌｂｕｒ−Ｌｉｐｍａｎアルゴリズムは双方とも、例えば、ＤＮＡＳＴＡＲ配列解析ソフトウエアパッケージの一部であるＭＥＧＡＬＩＧＮプログラム（例えば、バージョン３．１．７）に組み込まれる。
配列解析用のその他のアルゴリズムも当技術分野で公知であり、Torelli A and Robotti CA, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5 (1994)に記載されているＡＤＶＡＮＣＥおよびＡＤＡＭ；ならびに; Pearson WR and Lipman DJ, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-48 (1988)に記載されているＦＡＳＴＡが挙げられる。
好ましい実施形態では、２つのアミノ酸配列間の同一性％は、ＧＣＧソフトウエアパッケージのＧＡＰプログラムで、Ｂｌｏｓｕｍ ６２マトリックスかＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかと、ギャップウェイト１６、１４、１２、１０、８、６または４およびウェイトレングス１、２、３、４、５または６を用いて決定される。さらにもう１つの好ましい実施形態では、２つのヌクレオチド配列間の同一性％は、ＧＣＧソフトウエアパッケージのＧＡＰプログラムで、ＮＷＳｇａｐｄｎａ、ＣＭＰマトリックス、ギャップウェイト４０、５０、６０、７０または８０およびウェイトレングス１、２、３、４、５または６を用いて決定される。
タンパク質アライメントはまた、Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓグローバルタンパク質アライメントプログラム（例えば、バージョン２．５．１）で、コスト／オープンギャップセット(cost to open gep set)５、コスト／レングセンギャップセット(cost to lengthen gap set)５、ミニマム・ダイアゴナル・レングス・セット(minimum diagonal length set)４、マキシマム・ダイアゴナル・オフセット・セット(maximum diagonal offset set)１３０、コンセンサス・カットオフ・セット(consensus cutoff set)５０％およびＰａｍ ２５０マトリックスを用いて行うことができる。
これらの核酸配列およびタンパク質配列はさらに、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定すべく公開データベースの検索を行うために「クエリー配列」として使用することができる。このような検索はAltschul SF et al., J. Mol. Biol. 215:403-10 (1990)のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るためには、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワードレングス＝１２を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るためには、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワードレングス＝３を用いて行うことができる。比較のためのギャップ挿入アライメントを得るためには、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを、Altschul SF et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997）に記載されているように使用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合、個々のプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。例えば、ヌクレオチド配列は、デフォルトＢｌａｓｔｎマトリックス１−３で、ギャップペナルティーセット：エグジステンス１１およびエクステンション１を用いて分析することができる。アミノ酸配列は、デフォルト設定：Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックス、ギャップペナルティーセット：エグジステンス１１およびエクステンション１を用いて分析することができる。
「宿主細胞」とは、例えば、細胞による遺伝子、ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列、タンパク質または酵素の発現など、ある物質を細胞によって産生させるために何らかの方法で選択、修飾、形質転換、増殖または使用もしくは操作される任意の生物の任意の細胞を意味する。
核酸分子は、その核酸分子の一本鎖型が適当な温度および溶液イオン強度の条件下で他の核酸分子とアニーリング可能な場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡなどの別の核酸分子と「ハイブリダイズ可能」である(Sambrook J et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d Ed. 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. Vols. 1-3 (ISBN 0-87969-309-6))。温度およびイオン強度条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。相同核酸の予備スクリーニングのためには、Ｔｍが５５℃相当の低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、例えば、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％ミルク、およびホルムアミド不含；または３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを使用することができる。より高いＴｍに相当する中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、例えば、４０％ホルムアミド、５×または６×ＳＣＣである。最高Ｔｍに相当する高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、例えば、５０％ホルムアミド、５×または６×ＳＣＣである。ハイブリダイゼーションには、２つの核酸が相補的配列を含む必要があるが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチが起こり得る。核酸をハイブリダイズさせるのに適当なストリンジェンシーは、当技術分野で周知の変数である核酸の長さと相補性の程度によって異なる。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、その配列を含む核酸のハイブリッドのＴｍ値が大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いＴｍに相当）は、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡの順に低下する。１００ヌクレオチド長より長いハイブリッドについて、Ｔｍを算出する方程式が導き出されている（Sambrook et al.,前掲）。
ＫＣＮＱサブユニットを含む電圧依存性カリウムチャネルの「インヒビター」、「アクチベーター」、「開口薬」または「モジュレーター」とは、ＫＣＮＱチャネル機能に関するin vitroおよびin vivoアッセイを用いて同定された阻害分子または活性化分子を指す。特に、インヒビター、アクチベーター、およびモジュレーターとは、ＫＣＮＱチャネル機能を増強し、それにより対象の疼痛を軽減する化合物を指す。「インヒビター」は、チャネルまたはスピードの低下、遮断、回避、活性化の遅延、不活性化、脱感作、またはダウンレギュレーション、または脱活性化の促進を果たす化合物である。「アクチベーター」は、チャネル活性の増強、開口、活性化、補助、活性化の促進、感作、またはアップレギュレーション、または不活性化の遅延もしくは緩慢化を果たす化合物である。このようなインヒビターおよびアクチベーターに関するアッセイには、例えば、細胞または細胞膜で組換えＫＣＮＱを発現させ、その後、チャネルを通るイオン流を直接的または間接的に測定することを含む。
「単離された」とは、その物質がその元の、または天然の環境（例えば、天然物の場合には天然環境）から取り出されていることを意味する。従って、生きている動物中に存在する天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されているとは言えないが、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドでも、天然系で共存している物質のいくらかまたは全てからヒトの介入によって分離または改変されていれば、単離されていると言える。例えば、「単離された核酸断片」は、場合により合成の、非天然の、または改変されたヌクレオチド塩基を含んでいてもよい一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡポリマーの形態の単離された核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１以上のセグメントからなり得る。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であってもよいし、かつ／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であってもよく、このようなベクターまたは組成物は、それが天然に見られる環境の一部ではないことからやはり単離されていると言える。同様に、「実質的に精製された」とは、天然に見られる隣接化学環境からヒトの介入によって分離、またはそうでなければ取り出されている物質を指す。実質的に精製されたポリペプチドまたは核酸は、当技術分野で一般に知られているいくつかの技術および手順のいずれかにより取得または産生することができる（例えば、Scopes R (1987) In: Protein purification: principle and practice, Springer-Verlag, NY. General protein and DNA/RNA purificartion references: Current protocols in Molecular biology, Green publishing associates and John Wiley & Sons参照）。
「哺乳動物」とは、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミまたは他の家畜または実験室哺乳動物を指す。当業者ならば、ある１種の哺乳動物において病態の重篤度を軽減する療法は、別種の哺乳動物に対するその療法の効果を予測するものとなることが分かるであろう。
「変調する」とは、ある機能の抑制、増強または誘導を指す。例えば、遺伝子発現の「変調」または「調節」とは、遺伝子の活性の変化を指す。発現の変調とは、限定されるものではないが、遺伝子の活性化と遺伝子の抑制を含み得る。「変調する」または「調節する」とはまた、タンパク質、酵素、インヒビター、シグナルトランスデューサー、受容体、転写アクチベーター、補因子などの生物活性を増加または低下させる方法、条件または薬剤も指す。この活性の変化はｍＲＮＡ翻訳、ＤＮＡ転写、および／またはｍＲＮＡもしくはタンパク質分解の増加または低下であり得、これは生物活性の増加または低下に対応し得る。このような増強または阻害はシグナル伝達経路の活性化などの特定の事象の発生に依存している場合があり、かつ／または特定の細胞種だけで顕現する場合もある。
「変調された活性」とは、タンパク質の生物学的に活性な形態により変調された活性、症状、疾病または表現型のいずれかを指す。変調は生物学的に活性なタンパク質の濃度に影響を及ぼすことにより、例えば、発現または分解を調節することによって、例えば、基質の阻害、活性化、結合または放出を通じ、化学的または構造的のいずれかの修飾としての直接的なアゴニスト的作用またはアンタゴニスト的作用によって、または付加的因子を含み得る直接的または間接的作用によって影響を受け得る。
本明細書において「天然」核酸分子とは、天然に存在するヌクレオチド配列を有する（例えば、天然タンパク質をコードする）ＲＮＡまたはＤＮＡ分子を指す。
本明細書において「核酸分子」とは、一本鎖型または二本鎖らせんのいずれかの、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルポリマー形態、またはホスホロチオエートおよびチオエステルなどのそのいずれかのホスホエステル類似体を指す。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、およびＲＮＡ−ＲＮＡらせんがあり得る。核酸分子、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子とは、その分子の一次構造および二次構造のみを言い、特定の三次形態に限定されるものではない。よって、この用語には、とりわけ、直鎖（例えば、制限断片）または環状ＤＮＡ分子、プラスミドおよび染色体に見られる二本鎖ＤＮＡが含まれる。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を述べる際に、本発明では、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡと相同な配列を有する鎖）に沿った５’から３’方向の配列だけを示す慣例に従って記載することができる。
「作動可能なように連結される」とは、核酸分子、すなわちＤＮＡと１以上の調節配列（例えば、プロモーターまたはその一部）が、その核酸分子からのｍＲＮＡの転写が可能なように、または適当な分子がその調節配列に結合されている場合に、その核酸分子の産物（すなわち、ポリペプチド）発現が可能なように接続されることを意味する。融合構築物内で、「作動可能なように連結される」とは、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリヌクレオチドと非ＫＣＮＱ５または非ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリヌクレオチドが互いにインフレームで融合されていることを示すものとする。非ＫＣＮＱ５または非ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリヌクレオチドは、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリヌクレオチドの３’側または５’側に融合させることができる。
「相同性％」とは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド間のアミノ酸配列の同一性の程度を指す。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の相同性は、いずれかの配列のある位置においてヌクレオチドまたはアミノ酸が一致する総数の直接的関数であり、例えば、それらの配列のいずれかのヌクレオチド総数の半分が同じであれば、その２配列は５０％の相同性を示すと言える。
「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸中の一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオチド」とも呼ばれる）であり、２以上のヌクレオチドのいずれの鎖も意味する。ヌクレオチド配列は一般に、タンパク質および酵素を製造するために細胞機構が用いている情報を含む遺伝情報を有する。これらの用語には、二本鎖または一本鎖ゲノムおよびｃＤＮＡ、ＲＮＡ、合成および遺伝子操作ポリヌクレオチド、ならびにセンスおよびアンチセンス双方のポリヌクレオチドが含まれる。これには一本鎖および二本鎖分子、すなわち、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、およびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ならびにアミノ酸主鎖に塩基をコンジュゲートすることにより形成された「タンパク質核酸」（ＰＮＡ）が含まれる。これにはまた、例えば、チオ−ウラシル、チオ−グアニン、およびフルオロ−ウラシルなど、修飾塩基を含む核酸も含まれる。
核酸分子がＲＮＡである場合、本明細書に示される非ＲＮＡ配列のＴ（チミン）はＵ（ウラシル）に置き換わっていると考えられる。例えば、配列番号１はｃＤＮＡ配列として本明細書に開示されている。従って、当業者には、この配列に由来する配列を含むＲＮＡ分子は例えばＴがＵに置換されているということが明白である。
「ポリペプチド」とは、２以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体またはペプチドミメティクスの化合物を含む。これらのサブユニットはペプチド結合により連結することができる。別の実施形態では、サブユニットは、例えばエステル、エーテルなどの他の結合によって連結することができる。本明細書において「アミノ酸」とは、グリシンおよびＤ型またはＬ型双方の光学異性体を含む、天然および／または非天然または合成アミノ酸、ならびにアミノ酸類似体およびペプチドミメティクスを含む。３以上のアミノ酸からなるペプチドは一般にオリゴペプチドと呼ばれる。３より多くのアミノ酸からなるペプチドはポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。
「プライマー」には、一般に、標的とハイブリダイズした後、その標的に相補的なポリヌクレオチドの重合を促進することにより、対象とするサンプル中に存在する標的または「鋳型」と結合する遊離の３’−ＯＨを有する短いポリヌクレオチドが含まれる。「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）は、「上流」および「下流」プライマーからなる「プライマー対」または「プライマーセット」と、ＤＮＡポリメラーゼ、一般に、熱安定性のあるポリメラーゼ酵素などの重合触媒を用いて標的ポリヌクレオチドの複製コピーが作製される反応である。ＰＣＲのための方法は当技術分野で周知であり、例えば、MacPherson et al., IRL Press at Oxford University Press (1991)に教示されている。ＰＣＲまたは遺伝子クローニングなど、ポリヌクレオチドの複製コピーを産生する全てのプロセスを本明細書では「複製」と総称する。プライマーはまた、サザンまたはノーザンブロット分析などのハイブリダイゼーション反応でプローブとして使用することもできる（例えば、Sambrook J et al.,前掲参照）。
ポリヌクレオチド操作に関して用いる場合の「プローブ」は、標的とハイブリダイズすることにより、対象とするサンプル中に存在する標的を検出する試薬として提供されるオリゴヌクレオチドを含む。通常、プローブは、標識またはハイブリダイゼーション反応の前または後のいずれかに標識を付着させ得る手段を含む。好適な標識としては、限定されるものではないが、放射性同位元素、蛍光色素、化学発光化合物、色素、および酵素を含むタンパク質が挙げられる。
「プロモーター配列」は、細胞内のＲＮＡポリメラーゼと結合して下流（３’方向）コード配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域である。本明細書の目的では、このプロモーター配列は、その３’末端に転写開始部位が接し、バックグラウンドを超える検出可能なレベルの転写を開始させるのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含むように上流（５’方向）へ延長される。このプロモーター配列内には、転写開始部位（便宜にはヌクレアーゼＳ１を用いたマッピングにより定義される）ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見られる。
本明細書において「精製された」とは、無関連の材料、すなわち、その材料が得られた天然材料を含む夾雑物の存在を低減または排除する条件下で単離された材料について言う。例えば、精製されたタンパク質は、好ましくは、細胞内で会合している他のタンパク質または核酸を実質的に含まず、精製された核酸分子は、好ましくは、細胞内で一緒に見られたタンパク質または他の無関連の核酸分子を実質的に含まない。本明細書において「実質的に含まない」とは、その材料の分析試験に関して操作上用いる。好ましくは、夾雑物を実質的に含まない精製された材料は純度が少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも９０％、よりいっそう好ましくは少なくとも９９％である。純度はクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、イムノアッセイ、組成物分析、生物アッセイ、および当技術分野で公知の他の方法により評価することができる。
精製のための方法は当技術分野で周知である。例えば、核酸は沈殿、クロマトグラフィー（分取固相クロマトグラフィー、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、および三重らせんクロマトグラフィーを含む）、超遠心分離、および他の手段により精製することができる。ポリペプチドおよびタンパク質は、限定されるものではないが、分取ディスクゲル電気泳動、等電点電気泳動、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、ゲル濾過、イオン交換および分配クロマトグラフィー、沈殿および塩析クロマトグラフィー、抽出および向流分配法により精製することができる。目的によっては、タンパク質が、限定されるものではないが、ポリヒスチジン配列、または抗体と特異的に結合するＦＬＡＧおよびＧＳＴのような配列など、精製を容易にする付加的な配列タグを含む、組換え系でポリペプチドを産生することが好ましい。次に、このポリペプチドは、宿主細胞の粗細胞溶解液から、適当な固相マトリックス上でのクロマトグラフィーにより精製することができる。あるいは、タンパク質に対して、またはそれに由来するペプチドに対して作製した抗体を精製試薬として使用することもできる。細胞は、例えば、遠心分離、マトリックス分離（例えば、ナイロンウール分離）、パンニングおよび他の免疫選択技術、枯渇法（例えば、夾雑細胞の補体枯渇）、およびセルソーティング（例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ））をはじめとする種々の技術によって精製することができる。他の精製法も可能である。精製された材料は、それが元々会合していた細胞成分の約５０％未満、好ましくは約７５％未満、最も好ましくは約９０％未満を含み得る。「実質的に純粋」とは、当技術分野で公知の標準的な精製技術を用いて達成可能な最高純度を示す。
「試験化合物」とは、既知の化学構造を有するが、既知の機能または生物活性を有する必要はない化合物を含む。試験化合物はまた未同定の構造を有していてもよく、または例えば植物抽出物などの粗生体サンプル由来の未知の化合物の混合物であってもよい。精製された化学化合物の集合体または種々の起源の粗抽出物の集合体を指す「化学ライブラリー」から多数の化合物を無作為にスクリーニングすることができる。これらの化学ライブラリーは化学的に合成された化合物、または天然産物から精製された化合物を含み得る。これらの化合物は、例えば、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、ステロイド、脂質、リン脂質、核酸およびリポタンパク質などの無機もしくは有機小分子または大型の有機化合物を含み得る。化合物の供試量は化学ライブラリーによって異なるが、精製された（均質な）化合物ライブラリーでは、１０μＭが一般に最高の初期供試用量である。細胞に試験化合物を導入する方法は当技術分野で周知である。
「トランスフェクション」とは、外来核酸を細胞へ導入することを意味する。「形質転換」とは、「外来」（すなわち、外因性または細胞外）遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を宿主細胞へ導入することを意味し、その結果、宿主細胞は導入された遺伝子または配列を発現し、所望の物質、一般には、導入された遺伝子または配列によりコードされているタンパク質または酵素を産生する。導入された遺伝子または配列はまた「クローニングされた」または「外来の」遺伝子または配列とも呼ばれることがあり、開始、停止、プロモーター、シグナル、分泌または細胞の遺伝子機構に用いられる他の配列などの調節または制御配列を含み得る。この遺伝子または配列は非機能的配列または既知の機能を持たない配列を含み得る。導入ＤＮＡまたはＲＮＡを受容し、発現する宿主細胞は、「形質転換された」ものであり、「形質転換体」または「クローン」である。宿主細胞に導入されるＤＮＡまたはＲＮＡは、宿主細胞と同じ属もしくは種の細胞、または異なる属もしくは種の細胞を含め、いずれに起源するものでもよい。よって、さらなる実施形態は、上記のベクターで形質転換された宿主細胞に関する。一実施形態では、宿主細胞は原核細胞である。さらなる実施形態では、宿主細胞は真核細胞である。好ましい実施形態では、宿主細胞はエシェリヒア・コリ(E. coli)細胞である。
「変異体」とは、修飾または改変された遺伝子、ＤＮＡ配列、酵素、細胞などを示すためにも用いることができる。ヌクレオチドおよびアミノ酸置換、付加または欠失がこの「変異体」という用語に含まれる。また、化学的に修飾された天然および合成ＫＣＮＱ５分子もこの「変異体」という用語に含まれる。例えば、変異体は、参照ポリペプチドとは異なるポリペプチドも指す場合がある。一般に、参照ポリペプチドと、参照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なるポリペプチドとの間の違いは、参照と変異体のアミノ酸配列が全体的に密接に類似しており、いくつかの領域が同一である。変異体と参照ポリペプチドは１以上の置換、欠失、付加、融合および末端切断によってアミノ酸配列が異なり、それは保存的であっても非保存的であってもよく、いずれの組合せで存在してもよい。例えば、変異体は、いくつかの、例えば５０〜３０、３０〜２０、２０〜１０、１０〜５、５〜３、３〜２、２〜１のアミノ酸が任意の組合せで挿入、置換または欠失されているものであり得る。さらに、変異体は、末端または内部欠失によるなど、参照配列よりも短くなることにより参照ポリペプチド配列とは異なるポリペプチドの断片であってもよい。ポリペプチドの変異体はまた、例えば、前駆体部分の切断によって活性化されて活性な成熟ポリペプチドを産生し得る前駆体タンパク質など、このようなタンパク質と実質的に同じ生物学的機能を保持するポリペプチドを含む。これらの変異体は、タンパク質をコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列の違いにより特徴付けられる対立遺伝子変異体であり得るし、あるいは異なるスプライシングまたは翻訳後修飾を含み得る。変異体はまた、実質的に同じ生物活性を有するが、異なる種から得られた関連タンパク質も含む。当業者ならば、単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加または交換を有する変異体を作出することができる。これらの変異体としてはとりわけ、（ｉ）１以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸残基（好ましくは、保存的アミノ酸残基）で置換され、このような置換アミノ酸残基が遺伝コードによりコードされていてもいなくてもよいもの、または（ｉｉ）そのペプチドまたはタンパク質から１以上のアミノ酸が欠失されているもの、または（ｉｉｉ）そのポリペプチドまたはタンパク質に１以上のアミノ酸が付加されているもの、または（ｉｖ）１以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または（ｖ）成熟ポリペプチドが、そのポリペプチドの半減期を高めるための化合物などの別の化合物（例えば、ポリエチレングリコール）と融合されているもの、または（ｖｉ）リーダー配列または分泌配列または成熟ポリペプチドもしくは前駆体タンパク質配列の精製のために使用される配列など、付加的なアミノ酸が成熟ポリペプチドに融合されているものが挙げられる。ポリペプチドの変異体はまた、天然の対立遺伝子変異体などの天然変異体であってもよいし、あるいは天然に存在することが知られていない変異体であってもよい。上記で定義されたような変異体は全て、当技術分野の教示の範囲内にあると思われる。
「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」とは、ＤＮＡを宿主細胞に導入して、導入された配列の発現をもたらし得るビヒクルを指す。「属間ベクター」は、属間のコンジュゲーションを可能とする、すなわち、エシェリヒア・コリから別の細胞系統へとＤＮＡを直接渡す系を用いるベクターである。属間コンジュゲーションは形質転換よりも操作が少ない。
ベクターは一般に、外来ＤＮＡが挿入された伝達可能な因子のＤＮＡを含む。あるＤＮＡセグメントを別のＤＮＡセグメントへ挿入する一般的な方法は、制限部位と呼ばれる特定の部位（ヌクレオチドの特定の基）でＤＮＡを切断する制限酵素と呼ばれる酵素の使用を含む。「カセット」とは、ベクターの定義された制限部位に挿入することができる発現産物をコードするＤＮＡコード配列またはＤＮＡセグメントを指す。これらのカセット制限部位は適切なリーディングフレームにカセットが確実に挿入されるように設計される。一般に、外来ＤＮＡはベクターＤＮＡの１以上の制限部位に挿入され、その後、そのベクターによって伝達可能なベクターＤＮＡとともに宿主細胞に運ばれる。発現ベクターなどの挿入ＤＮＡまたは付加ＤＮＡを有するＤＮＡのセグメントまたは配列は「ＤＮＡ構築物」とも呼ばれる。一般的なベクター種は「プラスミド」であり、プラスミドは通常細菌起源の、一般に二本鎖ＤＮＡの自律型分子であり、付加的（外来）ＤＮＡを容易に受容することができ、好適な宿主細胞に容易に導入することができる。プラスミドベクターは多くの場合、コードＤＮＡとプロモーターＤＮＡを含み、外来ＤＮＡの挿入に好適な１以上の制限部位を有する。コードＤＮＡは、特定のタンパク質または酵素に対する特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡは、そのコードＤＮＡの配列を誘導、調節またはそうでなければ媒介するＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡとコードＤＮＡは同じ遺伝子に由来していてもよいし、あるいは異なる遺伝子に由来していてもよく、同じまたは異なる生物に由来するものでもよい。組換えクローニングベクターは多くの場合、クローニングまたは発現のための１以上の複製系と、宿主における選択のための１以上のマーカー、例えば、抗生物質耐性と、１以上の発現カセットを含む。ベクター構築物は、当業者の範囲内である標準的な分子生物学的技術および組換えＤＮＡ技術を用いて作製することができる。このような技術は文献に十分説明されている。例えば、Sambrook J et al.,前掲； DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Ausubel FM et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)参照。汎用され、市販されているベクターとして、例えば、Invitrogen (Carlsbad, Calif.)製のｐｃＤＮＡ３およびｐＣＲベクター、ならびにPromega (Madison, Wis.)製のｐＧＥＭベクターが挙げられる。
「電圧依存性」活性(“Voltage-gated” activity or “voltage-gating” or “voltage dependence”)とは、個々のポリペプチドモノマーまたはサブユニットからなるカリウムチャネルの特徴を指す。一般に、細胞が脱分極すると、電圧依存性カリウムチャネル開口の確率が高まる。電圧依存性カリウムチャネルは基本的に、典型的な細胞におけるカリウムの逆転電位（ＥＫ）よりもプラス側の膜電位でカリウムの流出を可能とするが、これはこのチャネルがこのような電圧で開口する確率が高いからである。カリウム流出を駆動する電気的ポテンシャル（すなわち、電位）はカリウムの濃度勾配によってバランスが取られていることから、ＥＫは、正味のカリウムイオン流が無い膜電位である。細胞の膜電位は主としてそれらのカリウムチャネルによって異なり、一般に哺乳動物細胞では−６０〜−１００ｍＶの間である。この値はカリウムの逆転電位」または「ネルンスト(Nernst)」電位としても知られる。いくつかの電圧依存性カリウムチャネルは不活性化を受け、より高い膜電位においてカリウム流出を低減することができる。カリウムチャネルはまた、ＥＫに対してマイナスの膜電位で開口を維持する場合にはカリウム流入も可能となる（例えば、Adams and Nonner, in Potassium Channels, pp. 40-60 (Cook, ed., 1990)参照）。この電圧依存性の特徴は、例えば、外部溶液の［Ｋ＋］を変化させ、チャネル電流の活性化電位を測定すること（例えば、米国特許第５，６７０，３３５号参照）、種々の条件下でパッチクランプ技術または電圧クランプを用いて電流を測定すること、また、種々の条件下で放射性標識トレーサーまたは電圧感受性色素を用いてイオン流を測定することなどにより、チャネルを通る電流およびイオン流の変化を測定する様々な技術によって測定することができる。
ＩＩ．ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）またはその一部をコードする単離されたポリヌクレオチド
本明細書に開示されている方法を実施するにあたって、細胞におけるＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）の活性および／または発現を変調するために種々の薬剤を使用することができる。一実施形態において、薬剤はＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドまたはその一部をコードする核酸分子である。このような核酸分子を以下にさらに詳細に記載する。
遺伝コードにより定義されるように、特定のタンパク質のアミノ酸配列とそのタンパク質をコードし得るヌクレオチド配列との間には既知かつ明確な一致が存在する（下記参照）。同様に、遺伝コードにより定義されるように、特定の核酸分子のヌクレオチド配列とその核酸分子によりコードされているアミノ酸配列との間にも既知かつ明確な一致が存在する。
遺伝コード
アラニン (Ala, A) GCA, GCC, GCG, GCT
アルギニン (Arg, R) AGA, ACG, CGA, CGC, CGG, CGT
アスパラギン (Asn, N) AAC, AAT
アスパラギン酸 (Asp, D) GAC, GAT
システイン (Cys, C) TGC, TGT
グルタミン酸 (Glu, E) GAA, GAG
グルタミン (Gln, Q) CAA, CAG
グリシン (Gly, G) GGA, GGC, GGG, GGT
ヒスチジン (His, H) CAC, CAT
イソロイシン (Ile, I) ATA, ATC, ATT
ロイシン (Leu, L) CTA, CTC, CTG, CTT, TTA, TTG
リシン (Lys, K) AAA, AAG
メチオニン (Met, M) ATG
フェニルアラニン (Phe, F) TTC, TTT
プロリン (Pro, P) CCA, CCC, CCG, CCT
セリン (Ser, S) AGC, AGT, TCA, TCC, TCG, TCT
トレオニン (Thr, T) ACA, ACC, ACG, ACT
トリプトファン (Trp, W) TGG
チロシン (Tyr, Y) TAC, TAT
バリン (Val, V) GTA, GTC, GTG, GTT
終結シグナル (end) TAA, TAG, TGA
遺伝コードの重要かつ周知の特徴はその冗長性であり、これによりタンパク質を産生するのに用いられるほとんどのアミノ酸では、１を超えるコードヌクレオチドトリプレットが使用可能である（上記に示す）。よって、いくつかの異なるヌクレオチド配列が所定のアミノ酸配列をコードし得る。このようなヌクレオチド配列は、全ての生物において同じアミノ酸配列の産生をもたらすことから（ある生物はいくつかの配列を他の配列よりも効率的に翻訳する場合があるが）、機能的に等価であるとみなされる。さらに、場合によっては、プリンまたはピリミジンのメチル化変異体が所定のヌクレオチド配列に見られることがある。このようなメチル化はトリヌクレオチドコドンと対応するアミノ酸との間のコード関係には影響しない。
以上のことを鑑みれば、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチド（またはその一部）をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ分子のヌクレオチド配列を用いれば、そのＤＮＡまたはＲＮＡ分子をアミノ酸配列へと翻訳するための遺伝コードを用い、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）アミノ酸配列を誘導することができる。同様に、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）アミノ酸配列のいずれについても、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質をコードし得る対応するポリヌクレオチド配列をその遺伝コードから推定することができる（その冗長性のために、あるアミノ酸配列に対して複数のポリヌクレオチド配列が生じする）。よって、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリヌクレオチド配列のについての本発明の記載および／または開示は、そのポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列の記載および／または開示も含むものと考えるべきである。同様に、本明細書におけるＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）アミノ酸配列の記載および／または開示は、そのアミノ酸配列をコードし得る可能性のある全てのポリヌクレオチド配列の記載および／または開示を含むと考えるべきである。
一態様は、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質またはその生物学的に活性な部分をコードする単離された核酸分子、ならびにＫＣＮＱ５−またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ｍＲＮＡ）を同定するためにハイブリダイゼーションプローブとして用いるのに十分な核酸断片およびＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリヌクレオチドの増幅または突然変異のためにＰＣＲプライマーとして使用するための断片に関する。ＫＣＮＱ５タンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、６つのトランスメンブランドメイン、孔領域、および保存されたＣ末端領域を含む。ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）核酸分子の使用を述べる場合、このようなポリヌクレオチドの断片ならびに全長ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリヌクレオチドが使用可能である。
本明細書で開示されるポリヌクレオチド、例えば、配列番号１またはその一部は、標準的な分子生物学的技術および本明細書で示される配列情報を用いて単離することができる。例えば、配列番号１のポリヌクレオチド配列の全部または一部をハイブリダイゼーションプローブとして用い、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリヌクレオチドを標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技術（例えば、Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989に記載の通り)を用いて単離することができる。
さらに、配列番号１の全部または一部を含むポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１の配列に基づいて設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを用い、ＰＣＲにより単離することができる。
ポリヌクレオチドは、鋳型としてのｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと標準的なＰＣＲ増幅技術に従うオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することができる。このようにして増幅されたポリヌクレオチドを適当なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列解析により特性決定することができる。さらに、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを標準的な合成技術により、例えば自動化ＤＮＡ合成装置を用いて作製することができる。
好ましい実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１で示されるポリヌクレオチド配列を含む。
別の好ましい実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１で示されるポリヌクレオチド配列またはこのポリヌクレオチド配列の一部の相補物であるポリヌクレオチドを含む。配列番号１で示されるポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチドは、配列番号１で示されるポリヌクレオチド配列とハイブリダイズして安定な二重らせんを形成し得るに十分に、配列番号１で示されるポリヌクレオチド配列と相補的なものである。
さらに別の好ましい実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１で示されるポリヌクレオチド配列（例えば、ヌクレオチド配列の全長に対して）またはこのヌクレオチド配列の一部と少なくとも約９５％、９８％またはそれを超える相同性のあるポリヌクレオチド配列を含む。
さらに、ポリヌクレオチドは、配列番号１のポリヌクレオチド配列の一部のみ、例えば、プローブもしくはプライマーとして使用可能な断片またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の生物学的に活性な部分をコードする断片を含み得る（ただし、この断片は配列番号１のヌクレオチド８０８〜８１０を含む）。このプローブ／プライマーは一般に、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。一実施形態において、このオリゴヌクレオチドは、ストリンジェント条件下で、配列番号１のセンス配列の少なくとも約１２または１５、好ましくは約２０または２５、より好ましくは約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７５または１００の連続するポリヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００または７００ヌクレオチド長であって、かつ、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で配列番号１のポリヌクレオチド配列またはその相補物とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。
別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１の少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００またはそれを超える連続するヌクレオチドを含む（ただし、この断片は配列番号１のヌクレオチド８０８〜８１０を含む。
他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００またはそれを超える配列番号１のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドと少なくとも９５％の同一性、より好ましくは９８％の同一性を有し、ただし、ヌクレオチド８０８〜８１０における置換は、アミノ酸ロイシンに対する保存的置換をもたらすコドンのものである（例えば、アラニン、グリシン、イソロイシンまたはバリンをコードする置換）。
別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＫＣＮＱ５の野生型Ｓ５−Ｓ６トランスメンブランドメインの代わりにＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードする。このヒトＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインは、そのアミノ酸配列の疎水性に基づいたＧＣＧプログラムを用いた二次構造推定により決定されたものである。Ｓ５はアミノ酸Ｌ２６６〜Ｖ２８７を含み、Ｓ６はアミノ酸Ｌ３２６〜Ｌ３５２を含む。ＫＣＮＱ５の結晶構造の欠如のために、配列番号６は推定Ｓ４−Ｓ５リンカーへの延長領域を含む。よって、一実施形態において、ＫＣＮＱ５のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインは、配列番号４のアミノ酸２５７〜３５４に相当する配列番号３のヌクレオチド７６９〜１０６２を含む。好ましくは、このＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインはヒトＫＣＮＱ１に由来し、より好ましくは、配列番号５によりコードされるＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインである。一実施形態において、このポリヌクレオチドは、ヌクレオチド７６９〜１０６２が配列番号５で置換されている配列番号３を含む核酸配列である。別の実施形態では、このポリヌクレオチドは、アミノ酸２５７〜３５４がＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメイン、好ましくは、配列番号６で表されるＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインで置換されている配列番号４をコードする。
別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＫＣＮＱ５の野生型Ｓ５トランスメンブランドメインの代わりにＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードする。ヒトＫＣＮＱ５のＳ５トランスメンブランドメインは、配列番号４のアミノ酸Ｓ２５７〜Ａ２９１をコードする配列番号３のポリヌクレオチド７６９〜８７３に相当する。好ましくは、このＳ５トランスメンブランドメインはヒトＫＣＮＱ１に由来し、より好ましくは、配列番号５のヌクレオチド１〜１０５によりコードされるＳ５トランスメンブランドメインである。一実施形態において、このポリヌクレオチドは、ヌクレオチド７６９〜８７３が配列番号５のヌクレオチド１〜１０５で置換されている配列番号３を含む核酸配列である。別の実施形態では、このポリヌクレオチドは、アミノ酸２５７〜２９１がＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメイン、好ましくは、配列番号６のアミノ酸１〜３５で表されるＳ５トランスメンブランドメインで置換されている配列番号４をコードする。
ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリヌクレオチド配列に基づくプローブを用い、同一または相同なタンパク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出することができる。好ましい実施形態では、このプローブはさらにそれに結合されている標識基を含み、例えば、この標識基は放射性同位元素、蛍光化合物、酵素または酵素補因子であり得る。このようなプローブは、対象に由来する細胞のサンプル中のＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）をコードするポリヌクレオチドのレベルを測定すること、例えば、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ｍＲＮＡレベルを検出するか、または野生型ＫＣＮＱ５遺伝子が突然変異しているかどうか、もしくは欠失しているかどうかを決定することなどにより、野生型ＫＣＮＱ５タンパク質を異所発現する細胞または組織、特に、脳、骨格筋および膀胱を同定するための診断試験キットの一部として使用することができる。
「ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の生物学的に活性な部分」をコードする核酸断片は、配列番号１のポリヌクレオチド配列の一部（ただし、この断片は配列番号１のヌクレオチド８０８〜８１０を含み、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）生物活性（すなわち、Ｋ＋チャネル遮断薬ＴＥＡに非感受性である、電圧非依存性の、ゆっくり活性化するＫ＋選択性電流の形成およびプラスの膜電圧において顕著な内向きの整流の提示）を有するポリペプチドをコードする）を単離し、このＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質のコード部分を発現させ（例えば、in vitro組換え発現による）、このＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質のコード部分の活性を評価することにより調製することができる。
遺伝コードの縮重により配列番号１と異なるが、配列番号１によりコードされているものと同じＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドが本開示に包含される。よって、別の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有する。
ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）分子の天然対立遺伝子変異体およびホモログに相当する核酸分子は、例えば、標準的なハイブリダイゼーション技術に従い、ハイブリダイゼーションプローブとして本明細書に開示されるｃＤＮＡまたはその一部を用い、本明細書に開示されるＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリヌクレオチドに対するそれらの相同性に基づいて単離することができる。例えば、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ＤＮＡは、ハイブリダイゼーションプローブとしての配列番号１の全部または一部と標準的なハイブリダイゼーション技術（例えば、Sambrook J et al.,前掲に記載の通り）を用い、ゲノムＤＮＡライブラリーから単離することができる。さらに、ＫＣＮＱ５遺伝子の全部または一部えを包含するポリヌクレオチドは、配列番号１の配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用い、ポリメラーゼ連鎖反応により単離することができる。例えば、細胞からｍＲＮＡを単離することができ（例えば、Chirgwin et al., Biochemistry 18: 5294-99 (1979)のチオシアン酸グアニジニウム抽出法による）、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを調製することができる（例えば、Gibco/BRL, Bethesda, Md.から入手可能なＭｏｌｏｎｅｙ ＭＬＶ逆転写酵素；またはSeikagaku America, Inc., St. Petersburg, Fla.から入手可能なＡＭＶ逆転写酵素）。ＰＣＲ増幅のための合成オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１で示されるポリヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。鋳型としてのｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡと標準的なＰＣＲ増幅技術に従う適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用いてポリヌクレオチドを増幅することができる。このようにして増幅したポリヌクレオチドを適当なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列解析により特性決定することができる。さらに、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリヌクレオチド配列に相当するオリゴヌクレオチドを、標準的な合成技術により、例えば、自動化ＤＮＡ合成装置を用いて作製することができる。
別の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、数学的アルゴリズムを用い、共有されるヌクレオチド配列の属性に基づいて同定することができる。このようなアルゴリズムは上記に詳しく述べられている（例えば、前記の第Ｉ節）。
別の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは少なくとも１５、２０、２５、３０またはそれを超えるポリヌクレオチド長であり、ストリンジェント条件下で配列番号１のヌクレオチド配列またはその相補物を含む核酸分子とハイブリダイズする。別の実施形態では、このポリヌクレオチドは少なくとも３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０または６００のヌクレオチド長である。好ましくは、これらの条件は、互いに少なくとも９５％、好ましくは少なくとも約９８％相同な配列が一般にと互いにハイブリダイゼーションを維持するような条件である。好ましくは、ストリンジェント条件下で配列番号１の配列またはその相補物とハイブリダイズする単離された核酸分子は天然核酸分子に相当する。
別の実施形態では、例えば配列番号１のポリヌクレオチド配列に対する突然変異により微細な変異を導入し、それにより、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の機能活性を変化させずに、コードされているタンパク質のアミノ酸配列に変異をもたらすことができる。例えば、配列番号１の配列において、「非必須」アミノ酸残基においてアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換を行うことができる。「非必須」アミノ酸残基は、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）分子の機能活性を変化させずに、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリヌクレオチド（例えば、配列番号１の配列）から変異させることができる残基である。従って、当業者ならば、非必須であり、従って、置換されてもよい残基の例を、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）関連分子のアミノ酸アライメントを行い、保存されていない残基を判定することにより特定することができる。このような残基は、保存されていないことから、置換されてもよい可能性が高い。
よって、別の態様は、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）活性に必須でないアミノ酸残基に変異を含むＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。このようなＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質は、例えば、配列番号２とアミノ酸配列が異なるが、なお、固有のＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）活性を保持している。例えば、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の非天然変異体をコードする単離されたポリヌクレオチドは、コードされているタンパク質に１以上のアミノ酸置換、付加または欠失が導入されるように、配列番号１のポリヌクレオチド配列に１以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することにより作出することができる。（ただし、ヌクレオチド８０８〜８１０における置換はアミノ酸ロイシンに対する保存的置換をもたらすコドンに対するものである）。突然変異は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの標準的な技術により配列番号１に導入することができる。好ましくは、保存的アミノ酸置換は１以上の非必須アミノ酸残基においてなされる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基は当技術分野で定義されており、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）がある。よって、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドの非必須アミノ酸残基は好ましくは、同じ側鎖ファミリーに由来する別のアミノ酸残基で置換される。
あるいは、別の実施形態では、突然変異は飽和突然変異誘発によるなどしてＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）コード配列の全域または一部に沿って無作為に導入することができ、得られた突然変異体を、例えば、それらの転写活性化能または機能活性を保持する突然変異体の特定能に関してスクリーニングすることができる。突然変異誘発後、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）突然変異体タンパク質は宿主細胞で組換え発現させることができ、その突然変異体タンパク質の機能活性を、ＫＣＮＱ５活性の評価のために当技術分野で利用可能なアッセイを用いて判定することができる。これらのアッセイとしては、限定されるものではないが、宿主として哺乳動物細胞を用いるパッチクランプ全細胞記録または宿主としてアフリカツメガエル(Xenopus laevis)卵母細胞を用いる双極電圧クランプ法が挙げられる。
さらに別の態様は、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。全長ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）活性を有するポリペプチドまたはペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド配列が、非ＫＣＮＱ５または非ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド配列と作動可能なように連結されたものを少なくとも含む、このようなポリヌクレオチドは、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製することができる。
好ましい実施形態では、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質は、例えば、宿主として哺乳動物細胞を用いるパッチクランプ全細胞記録または宿主としてアフリカツメガエル(Xenopus laevis)卵母細胞を用いる双極電圧クランプ法などの上記のような電気生理学的方法を用いて、機能的イオンチャネルをコードする能力に関してアッセイすることができる。一態様では、ＫＣＮＱ５ポリペプチドはＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含む。別の態様では、ＫＣＮＱ５ポリペプチドはＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含む。
上記のＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドの他、別の態様は、それに対してアンチセンスである単離されたポリヌクレオチドに関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的な、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的な、またはｍＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。よって、アンチセンス核酸はセンス核酸と水素結合可能である。アンチセンス核酸は全ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）コード鎖またはその一部のみに相補的であり得る。一実施形態において、アンチセンス核酸分子は、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。「コード領域」とは、アミノ酸残基へ翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指す。「非コード領域」とは、アミノ酸へ翻訳されない、コード領域をフランキングしている５’および３’配列を指す（すなわち、５’および３’非翻訳領域とも呼ばれる）。
本明細書に開示されているＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）をコードするコード鎖配列が与えられれば、ワトソンとクリックの塩基対形成の法則に従ってアンチセンス核酸を結成することができる。このアンチセンスポリヌクレオチドは、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ｍＲＮＡの全コード領域に相補的であってよいが、より好ましくは、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部に対してだけアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、このアンチセンスオリゴヌクレオチドはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ｍＲＮＡの翻訳開始部位前後の領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチド長であり得る。アンチセンスポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の手順を用い、化学合成および酵素的連結反応を用いて構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然ヌクレオチドまたはそれらの分子の生体安定性を高めるよう、またはアンチセンス核酸とセンス核酸の間で形成される二重らせんの物理的安定性を高めるよう設計された様々に修飾されたヌクレオチドを用いて化学的に合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用可能である。アンチセンス核酸を作出するのに使用可能な修飾ヌクレオチドの例としては、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンが挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス配向でサブクローニングされている発現ベクターを用いて生物学的に作製することができる（すなわち、この挿入された核酸から転写されたＲＮＡは対象とする標的核酸に対してアンチセンス配向にある、以下のサブセクションでさらに記載）。
これらのアンチセンスポリヌクレオチドは一般に、対象に投与されるか、またはin situで生成され、その結果、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか、もしくはそれと結合し、それにより、例えば転写および／または翻訳を阻害することによりその部分の発現を阻害する。このハイブリダイゼーションは、安定な二重らせん形成するための従来のヌクレオチド相補性によるものであってもよいし、あるいは例えばＤＮＡ二重らせんと結合するアンチセンスポリヌクレオチドの場合には、二重らせんの主溝における特異的相互作用を介するものでもよい。アンチセンスポリヌクレオチドの投与経路の例には、組織部位における直接注射が含まれる。あるいは、アンチセンスポリヌクレオチドは選択された細胞を標的とするように修飾した後、全身投与することもできる。アンチセンス分子は、例えば、全身投与では、例えば、そのアンチセンスポリヌクレオチドを細胞表面受容体または抗原と結合するペプチドまたは抗体と連結することにより、選択された細胞表面上で発現される受容体または抗原と特異的に結合するように修飾することができる。これらのアンチセンスポリヌクレオチドはまた、本明細書に記載のベクターを用い、細胞に送達することもできる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンスポリヌクレオチドが強力なｐｏｌ ＩＩまたはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれているベクター構築物が好ましい。
さらに別の実施形態では、アンチセンスポリヌクレオチドはα−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、通常のβ−ユニットとは対照的に鎖が互いに平行に走る相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する(Gaultier C et al., Nuleic Acids Res. 15:6625-41 (1987))。アンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド(Inoue H et al., Nuleic Acids Res. 15:6131-48 (1987))またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体(Inoue H et al., FEBS Lett. 215:327-30 (1987))を含んでもよい。
さらに別の実施形態では、アンチセンスポリヌクレオチドはリボザイムである。リボザイムは、リボザイムが相補的領域を有する、ｍＲＮＡなどの一本鎖核酸を切断し得るリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子である。よって、リボザイム（例えば、ハンマーヘッドリボザイム（Haselhoff J and Gerlach WL, Nature 334:585-91(1988))に記載）を、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それにより、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ｍＲＮＡの翻訳を阻害するために使用可能である。配列番号１のヌクレオチド配列に基づき、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）コード核酸に対して特異性を有するリボザイムを設計することができる。例えば、活性部位のヌクレオチド配列がＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）コードｍＲＮＡ内の被切断ヌクレオチド配列に相補的であるテトラヒメナＬ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築することができる（例えば、米国特許第４，９８７，０７１号および同第５，１１６，７４２号参照）。あるいは、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ｍＲＮＡは、ＲＮＡ分子のプールから特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択するためにも使用可能である（例えば、Bartel D and Szostak JW, Science 261:1411-18 (1993)参照）。
あるいは、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）の調節領域（例えば、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的化し、標的細胞においてＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成させることにより、遺伝子発現を阻害することもできる（一般に、Helene C, Anticancer Drug Des. 6:569-84 (1991); Helene C et al., Ann. N. Y. Acad Sci. 660:27-36 (1992); Maher LJ, Bioassays 14:807-15 (1992)参照）。
さらに別の実施形態では、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリヌクレオチドは、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解度を改良するために、塩基部分、糖部分またはリン酸主鎖で修飾することができる。例えば、これらのポリヌクレオチドのリン酸デオキシリボース主鎖をペプチド核酸を生じるように修飾することができる（Hyrup B et al., Bioorg. Med. Chem. 4:5-23 (1996)参照）。本明細書において、「ペプチド核酸」および「ＰＮＡ」とは、核酸ミミック、例えば、リン酸デオキシリボース主鎖がシュードペプチド主鎖に置換され、４つの天然核酸塩基だけが保持されているＤＮＡミミックを指す。ＰＮＡの天然主鎖は、低イオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡとの特異的ハイブリダイゼーションが可能であることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Hyrup B et al., 前掲；Perry-O’Keefe H et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670-75 (1996)に記載されているような標準的固相ペプチド合成プロトコールを用いて行うことができる。
ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリヌクレオチドのＰＮＡは、治療適用および診断適用に使用可能である。例えば、ＰＮＡは、例えば、転写もしくは翻訳の休止を誘導すること、または複製を阻害することにより、遺伝子発現の配列特異的変調のためのアンチセンスまたは抗原因子として使用することができる。ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）核酸分子のＰＮＡは、遺伝子内の一塩基対突然変異の分析において（例えば、ＰＮＡ指示ＰＣＲクランピングによる）、他の酵素と併用する場合に「人工制限酵素」として（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ（Hyrup B et al., 前掲）、またはＤＮＡシーケンシングまたはハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして(Hyrup B et al., 前掲; Perry-O’Keefe H et al., 前掲)使用することもできる。
別の実施形態では、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリヌクレオチドのＰＮＡは、ＰＮＡに親油性基または他の補助基を付着させることにより、またはＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成により、またはリポソームもしくは当技術分野で公知の薬物送達の他の技術の使用によって修飾することができる（例えば、それらの安定性または細胞取り込みを増強するため）。例えば、ＰＮＡとＤＮＡの有利な特性を併せ持ち得るＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリヌクレオチドのＰＮＡ−ＤＮＡキメラが作出できる。このようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮアーゼ ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）をＤＮＡ部分と相互作用させ、同時に、ＰＮＡ部分は結合親和性および特異性を提供する。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基スタッキング、核酸塩基間の結合の数、および配向に関して選択された適当な長さのリンカーを用いて連結することができる(Hyrup B et al., 前掲)。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Hyrup B et al., 前掲およびFinn PJ et al., Nucleic AcidZ Res. 24:3357-63 (1996)に記載のようにして行うことができる。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホスホルアミダイトカップリング化学を用いて固相支持体上で合成することができ、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端の間に例えば５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイトなどの修飾ヌクレオシド類似体を使用することができる(Mag M et al., Nucleic Acid Res. 17: 5973-88 (1989))。次に、ＰＮＡモノマーを段階的にカップリングして、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントとのキメラ分子を作出する(Finn PJ et al., 前掲)。あるいは、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを用いてキメラ分子を合成することもできる(Petersen KH et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 5:1119-24 (1995))。
他の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば、in vivoにおいて宿主細胞受容体を標的とするため）または細胞膜（例えば、Letsinger RL et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-56 (1989); Lemaitre M et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-52 (1987)；ＰＣＴ公報ＷＯ８８／０９８１０参照）または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ８９／１０１３４参照）を渡る輸送を補助する薬剤などの他の付加基を含んでもよい。さらに、オリゴヌクレオチドはハイブリゼーション誘発型切断剤（例えば、van der Krol AR et al., Biotechniques 6:958-76 (1988)参照）またはインターカレート剤（例えば、Zon G, Pharm. Res. 5:539-49 (1988)参照）を用いて修飾することもできる。このため、オリゴヌクレオチドを別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発型架橋剤、輸送剤またはハイブリダイゼーション誘発型切断剤）とコンジュゲートさせてもよい。
一実施形態において、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリヌクレオチド発現は、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により阻害することができる。ｓｉＲＮＡは１９〜２５のヌクレオチドを有するｄｓＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒと呼ばれるＲＮアーゼＩＩＩ関連ヌクレアーゼによってより長いｄｓＲＮＡ分子を分解することにより内部生成させることができる。ｓｉＲＮＡは外から細胞に導入することもできるし、あるいは発現構築物の転写により導入することもできる。ひと度生成されると、ｓｉＲＮＡはタンパク質成分と会合して、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られるエンドリボヌクレアーゼ含有複合体となる。ＡＴＰにより生成された、ほどかれたｓｉＲＮＡはＲＩＳＣを活性化し、そして、ワトソン−クリック塩基対合により相補的ｍＲＮＡ転写物を標的とし、それにより、このｍＲＮＡを切断および破壊する。ｍＲＮＡの切断はｓｉＲＮＡ鎖が接している領域の中央付近で起こる。この配列特異的ｍＲＮＡ分解の結果、遺伝子サイレンシングが生じる。
ｓｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングを達成するには、少なくとも２つの方法を使用することができる。まず、ｓｉＲＮＡをin vitroで合成し、細胞の導入して遺伝子発現を一時的に抑制することができる。合成ｓｉＲＮＡはＲＮＡｉを得る容易かつ効率的な方法を提供する。ｓｉＲＮＡは、例えば、対照的な二ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する１９ＲＮＡヌクレオチドを含み得る短い混合型オリゴヌクレオチドの二重らせんである。合成２１ｂｐ ｓｉＲＮＡ二重らせん（例えば、１９ＲＮＡ塩基の後にＵＵまたはｄＴｄＴ ３’オーバーハングが続く）を用い、哺乳動物細胞において配列特異的遺伝子サイレンシングを達成することができる。これらのｓｉＲＮＡは哺乳動物細胞において、多くのタンパク質の翻訳の非特異的抑制を生じ得るより長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によるＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）を活性化させることなく、標的とする遺伝子の翻訳を特異的に抑制することができる。
次に、ｓｉＲＮＡをベクターからin vivoで発現させることができる。このアプローチを用いて、細胞またはトランスジェニック動物でｓｉＲＮＡを安定発現させることができる。一実施形態において、ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、ポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ）転写単位からのｓｉＲＮＡ転写を駆動するように操作されている。Ｐｏｌ ＩＩＩ転写単位は、短いＡＴ豊富転写終結単位を開き、２ｂｐのオーバーハング（例えば、ＵＵ）〜ヘアピンｓｉＲＮＡの付加に至る（ｓｉＲＮＡ機能に有用な特徴）ことから、ヘアピンｓｉＲＮＡの発現に好適である。Ｐｏｌ ＩＩＩ発現ベクターはｓｉＲＮＡを発現するトランスジェニックマウスを作出するためにも使用可能である。
別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは組織特異的に発現させることができる。このアプローチでは、まず、選択された細胞系統またはトランスジェニックマウスの核内でプロモーター（ＣＭＶ（ｐｏｌ ＩＩ）など）から長いｄｓＲＮＡを発現させる。この長いｄｓＲＮＡは核内でｓｉＲＮＡへとプロセシングされる（例えばＤｉｃｅｒによる）。このｓｉＲＮＡは核から出て、遺伝子特異的サイレンシングを媒介する。同様のアプローチが、組織特異的ノックダウンマウスを作出するための組織特異的（ｐｏｌ ＩＩ）プロモーターとのコンジュゲーションにも使用可能である。
ＵＵなどの３’二ヌクレオチドオーバーハングは、ｓｉＲＮＡの設計に使用することができる。場合によっては、このオーバーハングのＧ残基は、ｓｉＲＮＡが一本鎖Ｇ残基においてＲＮアーゼにより切断される可能性があるので避けられる。
ｓｉＲＮＡ配列自体に関しては、ＧＣ含量が３０〜５０％のｓｉＲＮＡがある特定の場合におけるよりＧ／Ｃ含量のより高いものよりも有効であり得ることが分かっている。さらに、４〜６ヌクレオチドのポリ（Ｔ）トラックはＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩの終結シグナルとして働き得ることから、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターから発現される配列を設計する特定の場合には、標的配列中の４を超えるＴまたはＡのストレッチは避けられることがある。さらに、ｍＲＮＡのいくつかの領域は、高度な構造を有するか、または調節タンパク質が接しているかのいずれかであり得る。よって、これは遺伝子配列の長さに沿った種々の位置においてｓｉＲＮＡ標的部位を選択するのに役立ち得る。最後に、この可能性ある標的部位を適当なゲノムデータベース（ヒト、マウス、ラットなど）と比較することができる。他のコード配列に相同な、１６〜１７を超える連続する塩基対を有する標的配列も場合によっては考慮から除外されることがある。
一実施形態において、ｓｉＲＮＡは、短いスペーサー配列によって隔てられた２つの逆転リピートを含み、終結部位として働く一連なりのＴで終わるように設計することができる。このデザインは、短いヘアピンｓｉＲＮＡ中に保持されていると推定されるＲＮＡ転写物を産生する。ｓｉＲＮＡ標的配列の選択、推定ヘアピンのステムをコードする逆転リピートの長さ、逆転リピートの順序、ヘアピンのループをコードするスペーサー配列の長さおよび組成、ならびに、５’−オーバーハングの存在または不在は所望の結果を達成するために変更可能である。
これらのｓｉＲＮＡ標的は、ｍＲＮＡ配列をＡＡ二ヌクレオチドに関してスキャンし、そのＡＡのすぐ下流の１９ヌクレオチドを記録することにより選択することができる。その他の方法を用いてｓｉＲＮＡ標的を選択することもできる。一例では、ｓｉＲＮＡ標的配列の選択は、その標的配列がＧＧで始まり、かつ、ＢＬＡＳＴ検索により分析されるように他の遺伝子との有意な配列相同性を持たない限り、単に経験的に決定される（例えば、Sui G et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5515-20 (2002)参照）。別の例では、より精巧な方法を用いてｓｉＲＮＡ標的配列を選択する。この手順では、内在するｍＲＮＡの接近可能ないずれかの部位を合成オリゴデオキシリボヌクレオチド／ＲＮアーゼＨ法による分解の標的とすることができる（例えば、Lee NS et al., Nature Biotechnol. 20:500-05 (2002)参照）。
別の実施形態では、このヘアピンｓｉＲＮＡ発現カセットは、標的のセンス鎖の後に、短いスペーサー、標的のアンチセンス鎖および転写ターミネーターとしての５〜６個のＴを含むように構築される。ｓｉＲＮＡ発現構築物内のセンス鎖およびアンチセンス鎖の順序は、ヘアピンｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング活性に影響を与えずに変更することができる。ある場合では、順序の逆転が遺伝子サイレンシング活性の部分的低下をもたらす場合がある。
ｓｉＲＮＡ発現カセットのステムとして使用されるヌクレオチド配列の長さは例えば１９〜２９の範囲であり得る。ループサイズは３〜２３ヌクレオチドの範囲であり得る。他のおよび／またはループサイズも使用可能である。
さらに別の実施形態では、ヘアピンｓｉＲＮＡが遺伝子サイレンシングに機能的である限り、ヘアピンｓｉＲＮＡ構築物において５’オーバーハングを使用することができる。ある特定の例では、この５’オーバーハングは約６個のヌクレオチド残基を含む。
なおさらに別の実施形態では、ＲＮＡｉの標的配列は、好ましくは配列番号１のヌクレオチド８０８〜８１０を含む配列番号１の２１マーの配列断片である。この標的配列の５’末端は二ヌクレオチド「ＮＡ」（ここで、「Ｎ」はいずれの塩基であってもよく、「Ａ」はアデニンを表す）を含む。残りの１９マー配列のＧＣ含量は３５％〜５５％の間である。さらに、この残りの１９マー配列は４つの連続するＡまたはＴ（すなわち、ＡＡＡＡまたはＴＴＴＴ）、３つの連続するＧまたはＣ（すなわち、ＧＧＧまたはＣＣＣ）、または７つの一連なりの「ＧＣ」を含まない。
ＲＮＡｉ標的配列を選択するために、さらなる判定基準を使用することもできる。例えば、残りの１９マー配列のＧＣ含量を４５％〜５５％の間に限定することもできる。さらに、３つの連続する同一塩基（すなわち、ＧＧＧ、ＣＣＣ、ＴＴＴまたはＡＡＡ）または５以上の塩基の塩基パリンドローム配列を有する１９マー配列を除外する。さらに、残りの１９マー配列を、他の遺伝子との配列相同性が低いように選択することができる。ある特定の例では、可能性のある標的配列を、ＮＣＢＩのヒトＵｎｉＧｅｎｅクラスター配列データベースに対してＢＬＡＳＴＮ検索する。このヒトＵｎｉＧｅｎｅデータベースは遺伝子により方向付けられたクラスター(gene-oriented cluster)の非冗長セットを含む。各ＵｎｉＧｅｎｅクラスターはユニークな遺伝子を表す配列を含む。ＢＬＡＳＴＮ検索で他のヒト遺伝子がヒットしない１９マーの配列を選択することができる。検索中、ｅ値はストリンジェント値（「１」など）に設定することができる。
ｓｉＲＮＡ配列ならびに他のいずれかの誘導ＲＮＡｉ配列の有効性は、当技術分野で公知の種々の方法を用いて評価することができる。例えば、ｓｉＲＮＡ配列を、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）を発現する細胞に導入することができる。細胞内のＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）のポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルを検出することができる。ｓｉＲＮＡ配列の導入前と後のＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）の発現レベルの実質的な差が、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）の発現を抑制する上でのｓｉＲＮＡ配列の有効性の指標となる。ある特定の例では、他の遺伝子の発現レベルもまた、ｓｉＲＮＡ配列の導入の前後でモニタリングされる。ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）発現に対して阻害作用を有するが、他の遺伝子の発現には有意な影響を及ぼさないｓｉＲＮＡ配列を選択することができる。別の特定の例では、複数のｓｉＲＮＡまたは他のＲＮＡｉ配列を同じ標的細胞に導入することができる。これらのｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ配列はＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）発現を特異的に阻害するが、他の遺伝子の発現は阻害しない。さらに別の特定の例では、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）と他の遺伝子の発現を阻害するｓｉＲＮＡまたは他のＲＮＡｉ配列を選択することができる。
アンチセンスポリヌクレオチドは、形質転換細胞またはトランスジェニック細胞内で異種発現カセットから産生することができる。あるいは、アンチセンスポリヌクレオチドは、in vitro培養培地、またはin vivo循環系もしくは間質液のいずれかで、外部環境に投与される可溶性オリゴヌクレオチドを含み得る。外部環境に存在する可溶性アンチセンスポリヌクレオチドは細胞質への接近を果たし、特定のｍＲＮＡ種の翻訳を阻害することが示されている。
ＩＩＩ．単離されたＫＣＮＱ５およびＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質、その断片、ならびに抗ＫＣＮＱ５および抗ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）抗体
別の態様は、抗ＫＣＮＱ５または抗ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）抗体を作製するために免疫原として用いるのに好適な単離されたＫＣＮＱ５およびＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質、およびその生物学的に活性な部分、ならびにポリペプチド断片に関する。一実施形態において、ＫＣＮＱ５およびＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を用いた適当な精製スキームによって細胞または組織源から単離することができる。別の実施形態では、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質は、組換えＤＮＡ技術により産生される。組換え発現の代わりに、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドを、標準的なペプチド合成技術を用いて化学的に合成することもできる。例えば配列番号２に示されているようにＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の使用を論じる上で、全長ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドではないこのようなタンパク質の断片ならびに全長ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質が使用可能であると理解される。
別の態様は、単離されたＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質に関する。好ましくは、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質は、配列番号１によりコードされるアミノ酸配列またはその一部を含む。別の好ましい実施形態では、このタンパク質は配列番号２のアミノ酸配列またはその一部を含む。他の実施形態では、このタンパク質は、アミノ酸２７０における置換はＫＣＮＱ５ポリペプチドに対してレチガビン感受性を再確立しないかぎり、配列番号２で示されるアミノ酸配列またはその一部と少なくとも９０％、より好ましくは９５％、いっそうより好ましくは９８％のアミノ酸同一性を有する。ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチド分子の好ましい部分は生物学的に活性であり、例えば、哺乳動物細胞系統またはアフリカツメガエル(Xenopus laevis)卵母細胞などの宿主系において機能的カリウム選択性イオンチャネルをコードする能力を有するＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドの一部などである。
ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の生物学的に活性な部分としては、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質のアミノ酸配列と十分相同な、またはそれに由来するアミノ酸配列を含むペプチドがあり、全長ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質よりも少ないアミノ酸を含み、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の少なくとも１つの活性を示す。
別の態様は、ＫＣＮＱ５の野生型トランスメンブランドメインの代わりにＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドに関する。好ましくは、このＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインはヒトＫＣＮＱ１由来のものである。一実施形態において、ＫＣＮＱ５ポリペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸２５７〜３５４がＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインで置換されている配列番号４を含む。好ましくは、配列番号４のアミノ酸２５７〜３５４は配列番号６で置換されている。
別の態様は、ＫＣＮＱ５の野生型トランスメンブランドメインの代わりにＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドに関する。好ましくは、このＳ５トランスメンブランドメインはヒトＫＣＮＱ１由来のものである。一実施形態において、ＫＣＮＱ５ポリペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸２５７〜２９１がＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインで置換されている配列番号４を含む。好ましくは、配列番号４のアミノ酸２５７〜２９１は配列番号６の１〜３５で置換されている。
また、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）キメラまたは融合タンパク質も提供される。例えば、一実施形態において、融合タンパク質は、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）メンバー配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合されているＧＳＴ−ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）メンバー融合タンパク質である。別の実施形態では、この融合タンパク質は、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）メンバーヌクレオチド配列が、ｐＣＥＰ４−ＨＡベクター(Herrscher RF et al., Genes Dev. 9:3067-82 (1995))などのベクターに、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）メンバー配列がインフルエンザ血球凝集素エピトープタグにインフレームで融合されるように挿入されているＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）−ＨＡ融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、組換えＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）メンバーの精製を補助することができる。
組換え技術により産生された融合タンパク質およびペプチドは、このタンパク質またはペプチドを含む細胞の混合物および培地から分泌および単離することができる。あるいは、このタンパク質またはペプチドは細胞質に保持され、細胞を採取し、溶解し、タンパク質を単離することができる。細胞培養は一般に、宿主細胞、培地およびその他の副産物を含む。細胞培養に好適な培地は当技術分野で周知である。タンパク質およびペプチドは、タンパク質およびペプチドを精製するために当技術分野で公知の技術を用いて、細胞培養培地、宿主細胞またはその双方から単離することができる。宿主細胞をトランスフェクトし、タンパク質およびペプチドを精製するための技術は当技術分野で公知である。
好ましくは、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術によって産生される。例えば、種々のポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片を、例えば、平滑末端またはジグザグ(stagger)末端、適当な末端を提供する制限酵素消化、適当であれば付着末端の充填、望ましくない連結を回避するためのアルカリ性ホスファターゼ処理、および酵素的連結などの標準的な技術に従い、インフレームでともに連結する。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成装置を含む標準的な技術により合成することができる。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、２つの連続する遺伝子断片（その後、アニーリングされ、再増幅されてキメラ遺伝子配列を生じ得る）の間に相補的オーバーハングを生じるアンカープライマーを用いて行うことができる（例えば、Current Protocolｓ in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992参照）。さらに、融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチドまたはＨＡエピトープタグ）を予めコードしている多くの発現ベクターが市販されている。ＫＣＮＱ５をコードする、またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）をコードする核酸をこのような発現ベクターに、その融合部分がＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質にインフレームで連結されるようにクローニングすることができる。
別の実施形態では、この融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含むＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質である。ある特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）では、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）の発現および／または分泌は異種シグナル配列に使用により増強することができる。このＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）融合タンパク質を医薬組成物に組み込み、in vivoにおいて対象に投与することができる。ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）融合タンパク質の使用は、例えば、尿失禁または神経因性疼痛に関連する症状などの障害の処置に治療上有用であり得る。さらに、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）融合タンパク質は、対象において抗ＫＣＮＱ５または抗ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）抗体を産生するために免疫原として使用することもできる。
同様に、本明細書では、機能的チャネルの少なくとも１つのサブユニットが本明細書に記載のＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質またはポリペプチドである機能的カリウムチャネルも提供される。ＫＣＮＱチャネルは、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ四量体およびヘテロ四量体を形成することが知られている。例えば、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質はそれ自体とともにホモ二量体を、別種由来のＫＣＮＱ５タンパク質とヘテロ二量体を、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質変異体とともにヘテロ二量体を、ＫＣＮＱ３とともにヘテロ二量体を、３つの同じＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）サブユニットとともにホモ四量体を、少なくとも１つの異なるＫＣＮＱ５サブユニットとともにヘテロ四量体を、または少なくとも１つの異なるＫＣＮＱタンパク質、例えば、ＫＣＮＱ３とともにヘテロ四量体を形成することができる。
別の態様は、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）アゴニスト（ミメティクス）またはＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）アンタゴニストのいずれかとして機能するＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の変異体に関する。ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の変異体は、例えば、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の個々の点突然変異または末端切断などの突然変異誘発により作出することができる。ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質のアゴニストは、天然型のＫＣＮＱ５タンパク質と実質的に同じ生物活性、またはそのサブセットを保持できる。ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質のアンタゴニストは、例えば、野生型ＫＣＮＱ５タンパク質の細胞活性を競合的に変調することにより、天然型のＫＣＮＱ５タンパク質の１以上の活性を阻害することができる。よって、機能の限定された変異体で処置することにより、特定の生物作用を惹起することができる。一実施形態において、天然型のタンパク質の生物活性のサブセットを有する変異体で対象を処置すると、天然型のＫＣＮＱ５タンパク質による処置に比べて、対象における副作用が少なくなる。
一実施形態は、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）の少なくとも１つのアミノ酸残基を酸化、還元または当技術分野で公知の他の誘導体化法によって修飾することにより形成され得るＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）の誘導体に関する。
一実施形態において、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）アゴニスト（ミメティクス）またはＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）アンタゴニストのいずれかとして機能するＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の変異体は、例えば、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の末端切断型突然変異体などの突然変異体のコンビナトリアルライブラリーを、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質のアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性に関してスクリーニングすることにより同定することができる。このＫＣＮＱ５ポリペプチドはＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含み得る。あるいは、ＫＣＮＱ５ポリペプチドは、ＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含み得る。一実施形態において、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）変異体の変化に富んだライブラリーは核酸レベルにおけるコンビナトリアル突然変異誘発により作出され、変化に富んだ遺伝子ライブラリーによりコードされる。ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）変異体の変化に富んだライブラリーは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に、可能性のあるＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）配列の縮重セットが個々のポリペプチドとして、あるいはまたその中にＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）配列のセットを含むより大きな融合タンパク質セット（例えば、ファージディスプレーのため）として発現可能なように、酵素的に連結することによって作製することができる。
縮重オリゴヌクレオチド配列から可能性のあるＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）変異体のライブラリーを作製するために使用可能な様々な方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成は自動ＤＮＡ合成装置で行うことができ、この合成遺伝子を次に適当な発現ベクターに連結することができる。遺伝子の縮重セットを用いることで、１つの混合物で、可能性のあるＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）配列の所望のセットをコードするあらゆる配列の提供が可能となる。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法は当技術分野で公知である（例えば、Narang SA, Tetrahedron 39:3-22 (1983); Itakura K et al., Annu. Rev. Biochem. 53:323-56 (1984); Itakura K et al., Science 198:1056-63 (1977); Ike Y et al., Nucleic Acids Res. 11:477-88 (1983)参照)。
さらに、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質コード配列の断片のライブラリーを用いて、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の変異体のスクリーニングとその後の選択のために、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）断片の変化に富んだ集団を作製することもできる。一実施形態において、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）コード配列の二本鎖ＰＣＲ断片を、１分子当たり約１回だけニッキングが起こる条件下でヌクレアーゼで処理し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、このＤＮＡを復元して、種々のニック産物からセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成し、ＳＩヌクレアーゼ処理により再形成された二重らせんから一本鎖部分を除去し、得られた断片ライブラリーを発現ベクターに連結することにより、コード配列断片のライブラリーを作製することができる。この方法により、種々のサイズのＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質のＮ末端、Ｃ末端および内部断片をコードする発現ライブラリーを誘導することができる。
点突然変異または末端切断技術により作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選択された特性を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技術が当技術分野で知られている。このような技術は、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質のコンビナトリアル突然変異誘発により作製された遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適合可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広く用いられている、ハイスループット分析に従う技術は、一般に、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングすること、得られたベクターライブラリーで適当な細胞を形質転換すること、および所望の活性の検出が、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を助ける条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。ライブラリーにおける機能的突然変異体の頻度を高める技術である帰納的集合突然変異誘発（ＲＥＭ）は、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）変異体を同定するためのスクリーニングアッセイと併用することができる(Arkin AP and Youvan DC, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-15 (1992); Delgrave S et al., Protein Eng. 6:327-31 (1993))。
一実施形態において、細胞に基づくアッセイを用いて変化に富んだＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ライブラリーを分析することができる。例えば、発現ベクターのライブラリーを、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）を合成する細胞系統にトランスフェクトすることができる。次に、これらのトランスフェクト細胞を培養すると、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）および特定の突然変異体ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）が合成され、細胞上清中のＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）活性に対する突然変異体の発現の作用を、例えば、いくつかの酵素的アッセイのいずれかにより検出することができる。次に、それらの細胞からプラスミドＤＮＡを回収し、そのＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）活性の阻害、あるいはまた増強のスコア、および個々のクローンをさらに特性決定することができる。
天然アミノ酸のみからなるＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドに加え、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ペプチドミメティクスも提供される。ペプチド類似体は医薬産業で鋳型ペプチドと類似の特性を有する非ペプチド薬剤として汎用されている。これらの種の非ペプチド化合物は「ペプチドミメティクス」または「ペプチドミメティクス」と呼ばれ(Fauchere J, Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber DF and Freidinger RM, Trends Neurosci. 8:392-96 (1985); Evans BE et al., J. Med. Chem 30:1229-39 (1987))、通常、コンピューター分子モデリングの助けで開発される。治療上有用なペプチドと構造的に類似するペプチドミメティクスを使用すれば、同等の治療作用または予防作用を得ることができる。一般に、ペプチドミメティクスは、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）などのパラダイムポリペプチド（すなわち、生物活性または薬理活性を有するポリペプチド）に構造上類似しているが、当技術分野で公知であり、以下の参照文献：Spatola AF in “Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins,” B. Weinstein, ed., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983); Spatola, AF, Vega Data (March 1983), Vol. 1, Issue 3,“Peptide Backbone Modifications” (general review); Morley JS, Trends Pharmcol. Sci. 1:463-68 (1980) (general review); Hudson D et al., Int. J. Pept. Prot. Res. 14:177-85 (1979)（−ＣＨ２ＮＨ−、ＣＨ２ＣＨ２−）； Spatola AF et al., Life Sci. 38:1243-49 (1986)（−ＣＨ２−Ｓ）； Hann MM, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 307-314 (1982) （−ＣＨ−ＣＨ−，シスおよびトランス）; Almquist RG et al., J. Med. Chem. 23:1392-98 (1980)（−ＣＯＣＨ２−）； Jennings-White C et al., Tetrahedron Lett. 23:2533-34 (1982)（−ＣＯＣＨ２−）； EP 0 045 665（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−）； Holladay MW et al., Tetrahedron Lett., 24:4401-04 (1983)（−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−）； Hruby VJ, Life Sci. 31:189-99 (1982)（−ＣＨ２−Ｓ−）にさらに記載されている方法により、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、およびＣＨ２ＳＯ−からなる群より選択される結合によって任意に置換される１以上のペプチド結合を有する。特定の好ましい非ペプチド結合は−ＣＨ２ＮＨ−である。このようなペプチドミメティクスは、例えば、より経済的な産生、より大きな化学安定性、薬理特性の増強（半減期、吸収、効力、有効性など）、特異性の変更（例えば、生物活性の広域性）、抗原性の低減、その他を含むポリペプチドの具体例を超える有意な利点を持ち得る。ペプチドミメティクスの標識は通常、質的構造活性データおよび／または分子モデリングにより推定されるペプチドミメティック上の非干渉位置への１以上の標識の直接的またはスペーサー（例えば、アミド基）を介した共有結合を含む。このような非干渉位置は一般に、治療作用をもたらすべくペプチドミメティックが結合する高分子と直接的接触を形成しない位置である。ペプチドミメティクスの誘導体化（例えば、標識）は、ペプチドミメティックの所望の生物活性または薬理活性と実質的に干渉すべきでない。
ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）アミノ酸配列の１以上のアミノ酸の、同じ種類のＤ−アミノ酸（例えば、Ｌ−リシンの代わりにＤ−リシン）での体系的置換を用い、より安定なペプチドを作製することができる。さらに、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）アミノ酸配列または実質的に同一の配列変異体を含む抑制ペプチドは、当技術分野で公知の方法により、例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド橋を形成し得る内部システイン残基を付加することによって作製することができきる(Rizo J and Gierasch LM, Ann. Rev. Biochem. 61:387-416 (1992))。
本明細書で同定されているＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列により、当業者は、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ペプチド配列およびその配列変異体に相当するポリペプチドを作製することができる。このようなポリペプチドは、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ペプチド配列を、しばしばより大きなポリペプチドの一部としてコードするポリヌクレオチドの発現により、原核宿主細胞または真核宿主細胞で産生することができる。あるいは、このようなペプチドは化学法によって合成することもできる。組換え宿主における異種タンパク質の発現、ポリペプチドの化学合成、およびin vitro翻訳は当技術分野で周知であり、Sambrook J et al., 前掲; Berger and Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Gutte B and Merrifield RB, J. Am. Chem. Soc. 91:501-02 (1969); Chaiken IM, CRC Crit. Rev. Biochem. 11:255-301 (1981); Kaiser ET et al., Science 243:187-92 (1989); Merrifield B, Science 232:341-47 (1986); Kent SBH, Ann. Rev. Biochem. 57:957-89 (1988); Offord, R. E. (1980) Semisynthetic Proteins, Wiley Publishingにさらに記載されている。
ペプチドは一般に直接的化学合成により産生することができる。ペプチドは、Ｎ末端および／またはＣ末端に共有結合により結合された非ペプチド部分を有する修飾ペプチドとして産生することができる。ある特定の好ましい実施形態では、カルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかまたは双方が化学的に修飾される。末端アミノ基およびカルボキシル基の最も一般的な修飾はそれぞれアセチル化およびアミド化である。アシル化（例えば、アセチル化）またはアルキル化（例えば、メチル化）などのアミノ末端修飾およびアミド化などのカルボキシ末端修飾、ならびに環化を含む他の末端修飾を様々な実施形態に組み込むことができる。ある種のアミノ末端および／またはカルボキシ末端修飾および／または核配列へのペプチド延長は、安定性の増強、効力および／または有効性の増大、血清プロテアーゼ耐性、望ましい薬物動態特性その他などの有利な物理的、化学的、生化学的および薬理学的特性をもたらす場合がある。
単離されたＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質またはその一部もしくは断片はまた、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体製造の標準的な技術を用い、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）と結合する抗体を作製するために免疫原として使用することもできる。全長ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質が使用可能であり、あるいはまた、別の態様は免疫原として用いるためのＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）の抗原性ペプチド断片を提供する。ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）の抗原性ペプチドは少なくとも８個のアミノ酸残基を含み、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）のエピトープを包含し、これにより、このペプチドに対して生じた抗体はＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）との特定の免疫複合体を形成する。好ましくは、抗原性ペプチドは少なくとも１０個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１５個のアミノ酸残基、いっそうより好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸残基、最も好ましくは少なくとも３０個のアミノ酸残基を含む。一実施形態において、抗原性ペプチドは配列番号２のアミノ酸２７０を含む。
抗原性ペプチドに包含される好ましいエピトープは、タンパク質表面にあり、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドに独特である、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドの領域、例えば、親水性領域である。一実施形態において、このようなエピトープは、ヒトなどのある種に由来するＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質に特異的なものである（すなわち、種間で保存されていないＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドの領域にわたる抗原性ペプチドが免疫原として用いられ、このような非保存的残基は本明細書に示されているものなどのアライメントを用いて判定することができる）。親水性の領域を特定するためには、このタンパク質の標準的な疎水性分析を行うことができる。
ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）免疫原は一般に、好適な対象（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳動物）を免疫原で免疫化することにより抗体を作製するために使用される。適当な免疫原性調製物は例えば、組換え発現されたＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質または化学的に合成されたＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ペプチドを含むことができる。この調製物は、フロイントの完全もしくは不完全アジュバントまたは同等の免疫刺激薬などのアジュバントをさらに含むことができる。好適な対象を免疫原性ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）調製物で免疫化することにより、ポリクローナル抗ＫＣＮＱ５または抗ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）抗体応答が誘発される。
よって、別の態様は抗ＫＣＮＱ５または抗ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）抗体の使用に関する。ポリクローナル抗ＫＣＮＱ５または抗ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）抗体は上記のように、好適な対象をＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）免疫原で免疫化することにより作製することができる。免疫対象の抗ＫＣＮＱ５または抗ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）抗体力価は、固定化ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドを用いる酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などの標準的な技術により、経時的にモノタリングすることができる。所望により、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドに対する抗体分子を哺乳動物から（例えば、血液から）単離し、ＩｇＧ画分を得るためのタンパク質Ａクロマトグラフィーなどの周知の技術によりさらに精製することができる。免疫化後の適当な時点、例えば、抗ＫＣＮＱ５または抗ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）抗体力価が最高になった際に、抗体産生細胞を対象から得、Kohler G and Milstein C, Nature 256:495-97 (1975)（また、Brown JP et al., J. Immunol. 127:539-46 (1981); Brown JP et al., J. Biol. Chem. 255:4980-83 (1980); Yeh MY et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:2927-31 (1979); Yeh MY et al., Int. J. Cancer 29:269-75 (1982)も参照）により最初に記載されたハイブリドーマ技術、より最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor D and Roder JC, Immunol. Today 4:72-79 (1983))、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)、またはトリオーマ技術などの標準的な技術によりモノクローナル抗体を作製するために使用することができる。モノクローナル抗体ハイブリドーマを作製するための技術は周知である（一般に、Kenneth RH, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, N.Y. (1980); Lerner EA, Yale J. Biol. Med., 54:387-402 (1981); Gefter ML et al., Somatic Cell Genet. 3:231-36 (1977)参照）。要するに、上記のように、不死細胞系統（一般に、骨髄腫）を、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）免疫原で免疫化した哺乳動物由来のリンパ球（一般に、脾細胞）と融合させ、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドと特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定するために、得られたハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングする。
リンパ球と不死化細胞系統を融合させるために用いられる多くの周知のプロトコールのいずれかを、抗ＫＣＮＱ５または抗ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）モノクローナル抗体を作製する目的で適用することができる（例えば、Galfre G et al., Nature 266:550-52 (1977); Geifer ML et al., 前掲; Lerner EA, 前掲; Kenneth RH, 前掲参照）。さらに、当業者ならば、このような方法の多くの変形形態があり、それらもまた有用であることが分かるであろう。一般に、不死細胞系統（例えば、骨髄腫細胞系統）は、リンパ球と同じ哺乳動物種に由来する。例えば、ネズミハイブリドーマは、免疫原性調製物で免疫化したマウスに由来するリンパ球を不死化マウス細胞系統と融合させることにより作製することができる。好ましい不死細胞系統は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培養培地（「ＨＡＴ培地」）に感受性のあるマウス骨髄腫細胞系統である。例えば、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫系統など、いくつかの骨髄腫細胞系統はいずれも、標準的な技術に従って融合相手として使用可能である。これらの骨髄腫系統はAmerican Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Mdから入手可能である。一般に、ＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を用いてマウス脾細胞に融合させる。この融合から得られたハイブリドーマ細胞を次に、融合していない骨髄腫細胞および非産生的に融合した骨髄腫細胞を死滅させる（融合していない脾細胞は形質転換されていないことから、数日後に死に至る）ＨＡＴ培地を用いて選択する。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを用い、ハイブリドーマ培養上清をＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）分子と結合する抗体に関してスクリーニングすることにより検出する。
モノクローナル抗体選択ハイブリドーマを作製するための別法として、モノクローナル抗ＫＣＮＱ５または抗ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）抗体は、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレーライブラリー）をＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）でスクリーニングし、それにより、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドと結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離することにより、同定および単離することができる。ファージディスプレーライブラリーを作製およびスクリーニングするためのキットが市販されている（例えば、GE Healthcare Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01）。さらに、抗体ディスプレーライブラリーの作製およびスクリーニングにおける使用に特に従う方法および試薬の例は、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９１／１７２７１；ＷＯ９２／２０７９１；ＷＯ９２／１５６７９；ＷＯ９３／０１２８８；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／０９６９０；ＷＯ９０／０２８０９；Fuchs P et al., Biotechnology (N.Y.) 9:1370-72 (1991); Hay BN et al., Hum. Antibodies Hybrydomas 3:81-85 (1992); Huse WD et al., Science 246:1275-81 (1989); Griffiths AD et al., EMBO J. 12:725-34 (1993); Hawkins RE et al., J. Mol. Biol. 226:889-96 (1992); Clarkson T et al., Nature 352:624-28 (1991); Gram H et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-80 (1992); Garrard LJ et al., Biotechnology (N.Y.) 9:1373-77 (1991); Hoogenboom HR et al., Nucleic Acids Res. 19:4133-37 (1991); Barbas CF et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-82 (1991);およびMcCafferty J et al., Nature 348:552-54 (1990)に見出すことができる。
さらに、ヒト部分と非ヒト部分の双方を含む、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製することができるキメラおよびヒト化モノクローナル抗体などの組換え抗ＫＣＮＱ５または抗ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）抗体も本開示の範囲内にある。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当技術分野で公知の組換えＤＮＡ技術により、例えば、ＷＯ８７／０２６７１；ＥＰ０１８４１８７；ＥＰ０１７１４９６；ＥＰ０１７３４９４；ＷＯ８６／０１５３３；米国特許第４，８１６，５６７号；ＥＰ０１２５０２３；Better M et al., Science 240:1041-43 (1988); Liu AY et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-43 (1987); Liu AY et al., J. Immunol. 139:3521-26 (1987); Sun LK et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-18 (1987); Nishimura Y et al., Cancer Res. 47:999-1005 (1987); Wood CR et al., Nature 314:446-49 (1985); Shaw DR et al., J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-59 (1988); Morrison SL, Science 229:1202-07 (1985)；米国特許第５，２２５，５３９号；Verhocyan M et al., Science 239:1534-36 (1988);およびBeidler CB et al., J. Immunol. 141:4053-60 (1988)に記載の方法を用いて作製することができる。
さらに、ヒト化抗体は、米国特許第５，５６５，３３２号に開示されているものなどの標準的なプロトコールに従って作製することができる。別の実施形態では、抗体鎖または特異的結合対メンバーは、例えば、米国特許第５，５６５，３３２号、同第５，８７１，９０７号または同第５，７３３，７４３号に記載のものなど、当技術分野で公知の技術を用い、特異的結合対メンバーのポリペプチド鎖と複製可能な遺伝ディスプレーパッケージの成分との融合物をコードする核酸分子を含むベクターと、１つの結合対メンバーの第二のポリペプチド鎖をコードする核酸分子を含むベクターの間の組換えにより作製することができる。
抗ＫＣＮＱ５または抗ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降などの標準的な技術によりＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドを単離するために使用可能である。ＫＣＮＱ５ポリペプチドはＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含み得る。あるいは、ＫＣＮＱ５ポリペプチドはＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含み得る。抗ＫＣＮＱ５または抗ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）抗体は、細胞由来の天然ＫＣＮＱ５ポリペプチドの精製および宿主細胞で発現される組換え産生ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドの精製を容易にすることができる。さらに、抗ＫＣＮＱ５または抗ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）抗体は、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質（例えば、細胞溶解液または細胞上清において）を検出するためにも使用可能である。ＫＣＮＱ５ポリペプチドはＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含み得る。あるいは、ＫＣＮＱ５ポリペプチドはＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含み得る。検出は、抗体と検出可能な物質を結合させる（すなわち、物理的に連結する）ことにより容易にすることができる。よって、一実施形態では、抗ＫＣＮＱ５または抗ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）抗体を検出可能な物質で標識する。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質および放射性物質が挙げられる。好適な酵素の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ、好適な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられ、発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ、好適な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
抗ＫＣＮＱ５または抗ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）抗体はまた、
（ａ）動物を免疫原性ＫＣＮＱ５ポリペプチドまたはＫＣＮＱ５ポリペプチドに独特なその免疫原性部分で免疫化すること；および
（ｂ）その動物からＫＣＮＱ５ポリペプチドと特異的に結合する抗体を単離すること
を含むプロセスにより得ることができる。
好ましくは、ＫＣＮＱ５ポリペプチドは、（ｉ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｉｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチド；および（ｉｉｉ）ＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドからなる群から選択される。より好ましくは、免疫原性ＫＣＮＱ５ポリペプチドは配列番号２である。
よって、一実施形態において、抗ＫＣＮＱ５または抗ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）抗体は、タンパク質活性を阻害するために例えば細胞内で使用することができる。細胞内のタンパク質機能を阻害するための細胞内抗体の使用は当技術分野で公知である（例えば、Carlson JR, Mol. Cell. Biol. 8:2638-46 (1988); Biocca S et al., EMBO J. 9:101-08 (1990); Werge TM et al., FEBS Lett. 274:193-98 (1990); Carlson JR, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7427-28 (1993); Marasco WA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-93 (1993); Biocca S et al., Biotechnology (N.Y.) 12:396-99 (1994); Chen S-Y et al., Hum. Gene Ther. 5:595-601 (1994); Duan L et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5075-79 (1994); Chen S-Y et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5932-36 (1994); Beerli RR et al., J. Biol. Chem. 269:23931-36 (1994); Beerli RR et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 204:666-72 (1994); Mhashilkar AM et al., EMBO J. 14:1542-51 (1995); Richardson JH et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3137-41 (1995)；ＷＯ９４／０２６１０；およびＷＯ９５／０３８３２参照）。
一実施形態において、そのベクターを細胞に導入した際に、細胞の細胞内コンパートメントで機能的抗体として発現されるような形態で抗体鎖をコードする組換え発現ベクターを作製する。本明細書に開示されている阻害法に従うＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）活性の阻害のためには、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質と特異的に結合する細胞内抗体を細胞の細胞質内または細胞外で発現させる。細胞内抗体発現ベクターを作製するため、対象とする標的タンパク質、例えば、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）に特異的な抗体鎖をコードする抗体軽鎖および重鎖ｃＤＮＡを、一般に、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマから単離する。抗ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）モノクローナル抗体または組換え抗ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマは上記のように作製することができる。ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質に特異的なモノクローナル抗体が同定されれば（例えば、ハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体またはコンビナトリアルライブラリー由来の組換え抗体のいずれか）、そのモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを、標準的な分子生物学技術によって単離する。ハイブリドーマ由来抗体については、軽鎖および重鎖ｃＤＮＡを、例えば、ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡライブラリースクリーニングにより得ることができる。ファージディスプレーライブラリー由来のものなどの組換え抗体については、ライブラリースクリーニング過程で単離されたディスプレーパッケージ（例えば、ファージ）から軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡを単離する。それからＰＣＲプライマーまたはｃＤＮＡライブラリープローブが作製可能な抗体軽鎖および重鎖遺伝子のヌクレオチド配列は当技術分野で公知である。例えば、多くのこのような配列がKabat EA et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242および「Ｖｂａｓｅ」ヒト生殖細胞系配列データベースに開示されている。
抗体軽鎖および重鎖配列が得られたら、標準的な方法を用い、これらを組換え発現ベクターにクローニングする。軽鎖および重鎖の細胞質発現を可能とするため、軽鎖および重鎖の疎水性リーダーをコードするヌクレオチド配列を除去する。細胞内抗体発現ベクターは、いくつかの異なる形態の１つに細胞内抗体をコードすることができる。例えば、一実施形態において、このベクターは全長抗体軽鎖および重鎖をコードし、その結果、全長抗体が細胞内で発現される。別の実施形態では、このベクターは全長軽鎖をコードするが、重鎖のＶＨ／ＣＨ１領域のみをコードするので、細胞内でＦａｂ断片が発現される。最も好ましい実施形態では、ベクターは、軽鎖および重鎖の可変領域がフレキシブルペプチドリンカー（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３）により連結されている単鎖抗体（ｓｃＦｖ）をコードし、単鎖分子として発現される。細胞においてＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）活性を阻害するためには、抗ＫＣＮＱ５または抗ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）細胞内抗体をコードする発現ベクターを、本明細書に述べられている標準的なトランスフェクション法により細胞に導入される。
ＩＶ．組換え発現ベクターおよび宿主細胞
別の態様は、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質（またはその一部）をコードする核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクターに関する。この核酸はＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードする。あるいは、この核酸はＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードする。これらの組換え発現ベクターは宿主細胞において核酸の発現に好適な形態で核酸を含み、これはこれらの組換え発現ベクターが、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択され、発現させる核酸配列に作動可能なように連結された１以上の調節配列を含むことを意味する。「調節配列」とは、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むものとする。このような調節配列は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。調節配列としては、多くの宿主細胞種でヌクレオチド配列の構成的発現を指示するものと、ある特定の宿主細胞でのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば、組織特異的調節配列）を含む。当業者ならば、発現ベクターのデザインが、形質転換される宿主細胞の選択肢と同じ因子、所望のタンパク質の発現レベルなどによって異なり得ることが分かるであろう。これらの発現ベクターを宿主細胞に導入することで、本明細書に記載の核酸によりコードされている、融合タンパク質またはペプチド（例えば、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の突然変異型、融合タンパク質など）をはじめとするタンパク質またはペプチドを産生することができる。
組換え発現ベクターは、原核生物または真核細胞におけるＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質またはタンパク質断片の発現のために設計することができる。例えば、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質は、エシェリヒア・コリ(E. coli)などの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクター）、酵母細胞、両生類細胞または哺乳動物細胞で発現させることができる。好適な宿主細胞はGoeddel, 前掲にさらに詳しく記載されている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列とＴ７ポリメラーゼを用い、in vitroで転写および翻訳可能である。
原核生物におけるタンパク質の発現は、ほとんどの場合、エシェリヒア・コリで、融合タンパク質か非融合タンパク質のいずれかの発現を指示する構成プロモーターまたは誘導プロモーターを含むベクターを用いて行われる。融合ベクターは、そこにコードされているタンパク質に、通常はその組換えタンパク質のアミノ末端に、いくつかのアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは一般に、１）組換えタンパク質の発現の増強、２）組換えタンパク質の溶解度の向上、および３）アフィニティー精製におけるリガンドとしての働きによる組換えタンパク質の精製の補助、の３つの目的に役立つ。多くの場合、融合タンパク質の精製後の融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能とするため、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解切断部位は融合部分と組換えタンパク質の接合部に導入される。このような酵素およびそれらのコグネイト認識配列としては、Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。典型的な融合発現ベクターとしては、例えば、それぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはマルトースＥ結合タンパク質を標的組換えタンパク質に融合させるｐＧＥＸ(Pharmacia Biotech Inc; Smith DB and Johnson KS, Gene 67:31-40 (1988)）およびｐＭＡＬ(New England Biolabs, Beverly, Mass.)が挙げられる。
精製された融合タンパク質は例えば、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）活性アッセイ（例えば、以下に詳細に記載される直接アッセイまたは競合アッセイ）で用い、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質に特異的な抗体を作製することができる。
好適な誘導性非融合エシェリヒア・コリ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ(Amann E et al., Gene 69:301-15 (1988))およびｐＥＴ １１ｄ(Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) pp. 60-89)が挙げられる。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写によるものである。ｐＥＴ １１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、同時発現されるウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ ｇｎ１）によって媒介されるＴ７ ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写によるものである。このウイルスポリメラーゼは、宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により、ｌａｃＵＶ ５プロモーターの転写制御下にＴ７ ｇｎ１遺伝子を担持する定着プロファージから供給される。
エシェリヒア・コリにおいて組換えタンパク質の発現を最大にする１つの方法論は、組換えタンパク質のタンパク質分解切断能が損なわれている宿主細菌中でタンパク質を発現させることである(Gottesman S, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) pp. 119-28）。別法として、各アミノ酸の個々のコドンがエシェリヒア・コリで優先的に利用されるように、発現ベクターに挿入する核酸の核酸配列を変化させることである(Wada K et al., Nucleic Acids Res. 20(Suppl.):2111-18 (1992))。このような核酸配列の変更は、標準的なＤＮＡ合成技術により行うことができる。
別の実施形態では、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母菌Ｓ．セレビシエ(S. cerevisiae)での発現のためのベクターとしては、ｐＹｅｐＳｅｃ１(Baldari C et al., EMBO J. 6:229-34 (1987))、ｐＭＦａ(Kurjan J and Herskowitz I, Cell 30:933-43 (1982))、ｐＪＲＹ８８(Schultz LD et al., Gene 54:113-23 (1987))、ｐＹＥＳ２(Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.)、およびｐｉｃＺ(Invitrogen Corp, San Diego, Calif.)が挙げられる。
あるいは、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質またはポリペプチド、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞で発現させることもできる。培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）におけるタンパク質発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃ系(Smith GE et al., Mol. Cell. Biol. 3:2156-65 (1983))およびｐＶＬ系(Lucklow VA and Summers MD, Virology 170:31-39 (1989))が挙げられる。
さらに別の実施形態は、哺乳動物発現ベクターを用い、哺乳動物細胞において核酸を発現させる。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８(Seed B, Nature 329:840-41 (1987))およびｐＭＴ２ＰＣ(Kaufman RJ et al., EMBO J. 6:187-95 (1987))が挙げられる。哺乳動物細胞において用いる場合、発現ベクターの制御機能はウイルス調節エレメントにより提供される場合が多い。例えば、慣用のプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０に由来するものである。原核細胞および真核細胞双方のための他の好適な発現系としては、Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989の第16章および第17章を参照。
別の実施形態では、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞種で優先的に核酸の発現を指示することができる（例えば、核酸を発現させるために組織特異的調節エレメントが用いられる）。組織特異的調節エレメントは当技術分野で公知である。好適な組織特異的プロモーターの非限定例として、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Pinkert CA et al., Genes Dev. 1:268-77 (1987)）、リンパ特異的プロモーター(Calame K and Eaton S, Adv. Immunol. 43:235-75 (1988))、特にＴ細胞受容体のプロモーター(Winoto A and Baltimore D, EMBO J. 8:729-33 (1989))および免疫グロブリンのプロモーター(Banerji J et al., Cell 33:729-40 (1983); Queen C and Baltimore D, Cell 33:741-48 (1983))、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経線維プロモーター; Byrne GW and Ruddle FH, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-77 (1989))、膵臓特異的プロモーター(Edlund T et al., Science 230:912-16 (1985))、および乳腺特異的プロモーター（例えば、乳漿プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号およびＥＰ０２６４１６６）が挙げられる。例えば、ネズミｈｏｘプロモーター(Kessel M and Gruss P, Science 249:374-79 (1990))およびα−フェトタンパク質プロモーター(Camper SA and Tilghman SM, Genes Dev. 3:537-46 (1989))などの発達段階的に調節されるプロモーターも包含される。
さらに、遺伝子発現が重金属イオン（例えば、Mayo KE et al., Cell 29:99-108 (1982); Brinster RL et al., Nature 296:39-42 (1982); Searle PF et al., Mol. Cell. Biol. 5:1480-89 (1985)参照)、熱ショック（例えば、Nouer L et al. (1991) in Heat Shock Response, ed. Nouer L, CRC, Boca Raton, Fla., pp. 167-220参照)、ホルモン（例えば、Lee F et al., Nature 294:228-32 (1981); Hynes NE et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2038-42 (1981); Klock G et al., Nature 329:734-36 (1987); Israel DI and Kaufman RJ, Nucleic Acids Res. 17:2589-2604 (1989)；ＷＯ９３／２３４３１参照）、ＦＫ５０６関連分子（例えば、ＷＯ９４／１８３１７参照）またはテトラサイクリン(Gossen M and Bujard H, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-51 (1992); Gossen M et al., Science 268:1766-69 (1995)；ＷＯ９４／２９４４２；ＷＯ９６／０１３１３参照)により調節される系など、哺乳動物細胞に用いるための誘導調節系も当技術分野で公知である。よって、別の実施形態は、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ＤＮＡが誘導真核生物プロモーターと作動可能なように連結されている組換え発現ベクターを提供し、それにより真核細胞におけるＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の誘導発現を可能とする。
また、単腕相同組換え(one-arm homologous recombination)を用いて内因性タンパク質を発現させる方法も当技術分野で公知である（例えば、米国公開特許出願第２００５／０００３３６７号；Zeh et al., Assay Drug Dev. Technol. 1:755-65 (2003); Qureshi et al., Assay Drug Dev. Technol. 1:767-76 (2003)参照）。要するに、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）標的配列と作動可能なように連結されたプロモーターを含む単離されたゲノム構築物を均質な細胞集団（例えば、ヒト細胞系統の均質集団またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の均質集団に導入する。このプロモーターはＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）標的遺伝子に対して異種である。組換えの後、このプロモーターはＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの転写を制御する。次に、これらの細胞集団を、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドを発現させる条件下でインキュベートする。
さらなる態様は、アンチセンス配向で発現ベクターにクローニングされているＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、このＤＮＡ分子は、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写による）を可能とする様式で、調節配列と作動可能なように連結される。アンチセンス配向でクローニングされた核酸と作動可能なように連結された調節配列は、例えばウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの様々な細胞種でアンチセンスＲＮＡ分子の連続的発現を指示するものを選択することもできるし、あるいは調節配列は、アンチセンスＲＮＡの構成的発現、組織特異的発現または細胞種特異的発現を指示するものを選択することもできる。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が高効率調節領域の制御下で産生される組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒ウイルスの形態であってよく、この活性はベクターが導入される細胞種により決定することができる。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節の考察としては、Weintraub H et al., Trends Genet. 1:22-25 (1985)を参照。
別の態様は、組換え発現ベクターが導入されている宿主細胞に関する。例えば、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質は細菌細胞（例えば、エシェリヒア・コリなど）、昆虫細胞、酵母細胞、両生類細胞（例えば、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)卵母細胞など）または哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＣＯＳ細胞など）で発現させることができる。他の好適な宿主細胞も当業者に公知である。
ベクターＤＮＡは標準的な形質転換またはトランスフェクション技術によって原核細胞または真核細胞に導入することができる。本明細書において、「形質転換」および「トランスフェクション」は、例えば、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションをはじめ、外来核酸（例えばＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための当技術分野で認知されている種々の技術を指すものとする。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするのに好適な方法は、Sambrook J et al.（前掲）および他の実験手引書に見出すことができる。
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションについては、用いる発現ベクターおよびトランスフェクションによって、外来遺伝子をそれらのゲノムに組み込むことができるのは細胞の一部だけであることが知られている。これらの組み込み体を同定および選択するためには、一般に、目的の遺伝子とともに選択マーカー（例えば、抗生物質耐性）をコードする遺伝子を宿主細胞に導入する。好ましい選択マーカーとしては、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートなどの薬剤耐性を付与するものが挙げられる。選択マーカーをコードする核酸は、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質をコードするものと同じベクターで宿主細胞に導入することもできるし、あるいは別のベクターで導入することもできる。導入した核酸細胞で安定的にトランスフェクトされた細胞は、薬剤選択により同定することができる（例えば、選択マーカー遺伝子が組み込まれている細胞は生残し、他の細胞は死滅する）。
ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）で安定的にトランスフェクトされたエシェリヒア・コリの場合、このような系統はＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）遺伝子が誘導可能なように作製することができる。例えば、発現された遺伝子の調節は、テトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）を含むプロモーター配列の制御下に、ｔｅｔ制御型トランスアクチベーター（ｔＴＡ）を含む第一の「レギュレーター」プラスミドと、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）を含む第二の「応答」プラスミドの二重の安定発現により行うことができる。市販されているレギュレータープラスミドはネオマイシン選択用に操作されたベクター中にあり、応答ベクターを第二の選択マーカーを含むように構築する必要がある。このようなマーカーを用い、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）発現を、例えば、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン関連化合物（例えば、ドキシサイクリン）などの薬剤の存在下でオフとし、例えばテトラサイクリンなどの薬剤が培養培地に加えられない場合にはオンとすることができる。この種の細胞系統に構築により、それが通常毒性である細胞においてＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）の安定発現を可能となる。
培養原核または真核宿主細胞などの宿主細胞を用い、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質を産生（すなわち発現）されることができる。よって、さらなる態様は、宿主細胞を用い、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質を産生する方法を提供する。一実施形態において、この方法は、宿主細胞（ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入される）を、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質が産生されるような好適な培地で培養することを含む。別の実施形態では、この方法はさらに、培地または宿主細胞からＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質を単離することを含む。
また、ある特定の宿主細胞を用い、非ヒトトランスジェニック動物を作出することもできる。例えば、一実施形態において、宿主細胞は、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）コード配列が導入されている受精卵母細胞または胚幹細胞である。次に、このような宿主細胞を用い、外因性のＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）配列がそれらのゲノムに導入されている非ヒトトランスジェニック動物、または内因性のＫＣＮＱ５配列が変更されている相同組換え動物を作出することができる。このような動物はＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドの機能および／または活性の研究のため、また、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）活性のモジュレーターを同定および／または評価するために有用である。本明細書において「トランスジェニック動物」とは、その動物の１以上の細胞が導入遺伝子を含む非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはラットまたはマウスなどの齧歯類である。トランスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などがある。導入遺伝子は、トランスジェニック動物が発達する細胞のゲノムに組み込まれ、成熟した動物のゲノムに留まり、それにより、トランスジェニック動物の１以上の細胞種または組織で、コードされている遺伝子産物の発現を指示する外因性のＤＮＡである。本明細書において「相同組換え動物」とは、内因性のＫＣＮＱ５遺伝子が、内因性の遺伝子と、動物の細胞、例えば、動物の発達前の動物の胚細胞に導入された外因性のＤＮＡ分子との間の相同組換えにより変更されている非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスである。
トランスジェニック動物は、ＫＣＮＱ５−またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）をコードする核酸を、例えば、マイクロインジェクションまたはレトロウイルス感染により受精卵母細胞の雄性前核に導入し、その卵母細胞を偽妊娠雌代理母動物内で発達させることにより作出することができる。配列番号１またはその一部のＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）配列は、非ヒト動物のゲノムに導入遺伝子として導入することができる。あるいは、別のＫＣＮＱファミリーメンバーなどのＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）遺伝子ホモログを、配列番号１のＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ファミリーｃＤＮＡ配列とのハイブリダイゼーション（上記にさらに詳しく記載されている）に基づいて単離し、導入遺伝子として使用することもできる。
また、導入遺伝子の発現効率を高めるため、イントロン配列およびポリアデニル化シグナルを導入遺伝子に含めることもできる。特定の細胞に対してＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）導入遺伝子の発現を指示するために、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質組織に特異的調節配列を作動可能なように連結することができる。胚操作およびマイクロインジェクションによってトランスジェニック動物、特にマウスなどの動物を作出する方法は当技術分野の標準となっており、例えば、米国特許第４，７３６，８６６号；同第４，８７０，００９号；同第４，８７３，１９１号；およびHogan B, Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986）に記載されている。他のトランスジェニック動物の作出にも同様の方法が使用される。トランスジェニック創始動物は、そのゲノムにおけるＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）導入遺伝子の存在および／またはそれらの動物の組織または細胞におけるＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ｍＲＮＡの発現に基づいて同定することができる。次に、トランスジェニック創始動物を用いて、導入遺伝子を有するさらなる動物を繁殖させる。さらに、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質をコードする導入遺伝子を有するトランスジェニック動物を、他の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物とさらに交配することもできる。
相同組換え動物を作出するため、欠失、付加または置換が導入され、それにより、ＫＣＮＱ５遺伝子を変更する、例えば機能的に破壊する、ＫＣＮＱ５遺伝子の少なくとも一部を含むベクターを作製する。好ましい実施形態では、このベクターは、相同組換え時に内因性のＫＣＮＱ５遺伝子が機能的に破壊される（すなわち、もはや機能的タンパク質をコードしない；「ノックアウト」ベクターとも呼ばれる）ように設計する。あるいは、このベクターは、相同組換え時に内因性のＫＣＮＱ５遺伝子が突然変異またはそうでなければ変更され、しかしながらやはり機能的タンパク質をコードするように設計することができる（例えば、配列番号１のヌクレオチド８０８〜８１０はそれにより内因性のＫＣＮＱ５タンパク質のアミノ酸２７０が変更されるように変更することができる）。相同組換えベクターでは、ＫＣＮＱ５遺伝子の変更部分はその５’および３’末端においてＫＣＮＱ５遺伝子のさらなる核酸配列がフランキングしており、ベクターが保持している外因性のＫＣＮＱ５遺伝子と胚幹細胞内の内因性のＫＣＮＱ５遺伝子との間での相同組換えの発生を可能とする。この付加的なフランキングＫＣＮＱ５核酸配列は内因性遺伝子との相同組換えを成功するに十分な長さである。一般に、数キロベースのフランキングＤＮＡ（５’および３’の両末端）がベクターに含まれる（例えば、相同組換えベクターに関する記載はThomas KR and Capecchi MR, Cell 51:503-12 (1987)参照）。このベクターを胚幹細胞に導入し（例えば、エレクトロポレーションによる）、導入されたＫＣＮＱ５遺伝子が内因性のＫＣＮＱ５遺伝子と相同組換えされている細胞を選択する（例えば、Li E et al., Cell 69:915-26 (1992)参照）。次に、これらの選択細胞を動物（例えばマウス）の胚盤胞に注入し、集合キメラを形成させる（例えば、Bradley A, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Robertson EJ, ed. (IRL, Oxford, 1987) pp. 113-152参照)。その後、キメラ胚を好適な偽妊娠雌代理母動物に移植し、胚を分娩させる。それらの生殖細胞に相同組換えされたＤＮＡを保持する後代を用い、導入遺伝子の生殖細胞系伝達により動物の全細胞が相同組換えされたＤＮＡを含む動物を繁殖させる。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築するための方法は、例えば、Bradley A, Curr. Opin. Biotechnol. 2:823-29 (1991)；ＷＯ９０／１１３５４；ＷＯ９１／０１１４０；およびＷＯ９３／０４１６９にさらに詳しく記載されている。
以上に加え、当業者ならば、相同組換えのための当技術分野で公知の他のアプローチも本明細書の開示に当てはまることが分かるであろう。酵素支援部位特異的組込み系が当技術分野で公知であり、第二の標的ＤＮＡ分子内の所定の位置にＤＮＡ分子を組み込むために適用可能である。このような酵素支援組込み系の例として、Ｃｒｅレコンビナーゼ−ｌｏｘ標的系（例えば、Baubonis W and Sauer B, Nucleic Acids Res. 21:2025-29 (1993)；およびFukushige S and Sauer B, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7905-09 (1992)に記載のとおり)およびＦＬＰレコンビナーゼ−ＦＲＴ標的系（例えば、Dang DT and Perrimon N, Dev. Genet. 13:367-75 (1992)；およびFiering S et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8469-73 (1993)に記載のとおり)が挙げられる。また、ＷＯ９４／２９４４２およびＷＯ９６／０１３１３に記載されているものなどのテトラサイクリンにより調節される誘導性相同組換え系も使用可能である。
例えば、別の実施形態では、導入遺伝子の調節発現を可能とする選択された系を含むトランスジェニック非ヒト動物を作出することができる。このような系の一例として、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰレコンビナーゼ系がある。ｃｒｅ／ｌｏｘＰレコンビナーゼ系の記載に関しては、例えば、Lakso M et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-36 (1992)を参照。レコンビナーゼ系の別の例として、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のＦＬＰレコンビナーゼ系がある(O’Gorman S et al., Science 251:1351-55 (1991))。ｃｒｅ／ｌｏｘＰレコンビナーゼ系を用いて導入遺伝子の発現を調節する場合、Ｃｒｅレコンビナーゼと選択されたタンパク質の双方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要である。このような動物は、例えば、一方は選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、他方はレコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む、２匹のトランスジェニック動物を交配させることによる「二重」のトランスジェニック動物の構築により提供することができる。
本明細書に記載の非ヒトトランスジェニック動物のクローンもまた、例えば、Wilmut I et al., Nature 385:810-13 (1997)；ＷＯ９７／０７６６８；およびＷＯ９７／０７６６９に記載の方法に従って作出することができる。要するに、トランスジェニック動物に由来する細胞、例えば、体細胞を単離し、増殖期を脱してＧＯ期に入らせる。次に、この静止細胞を、例えば、電気パルスの使用により、その静止細胞が単離されたものと同種の動物からの除核した卵母細胞と融合させることができる。その後、この再構成卵母細胞を、桑実胚または胚盤胞へと発達するように培養した後、偽妊娠雌代理母に移植する。この雌代理母動物から産まれた後代は、その細胞、例えば体細胞が単離された動物のクローンである。
Ｖ．本発明の使用および方法
イオンチャネルは薬剤の優れた標的である。本明細書に開示されているポリヌクレオチドは、突然変異型電圧依存性カリウムチャネルをコードし、そのモジュレーターは、例えば、火傷、挫傷、擦傷、裂傷、骨折、靱帯断裂、腱断裂、筋断裂、ウイルス感染、細菌感染、原虫感染または真菌感染、接触性皮膚炎、炎症（例えば、外傷、感染、外科術、火傷または炎症成分を有する疾病により起こるもの）、癌などにより引き起こされる体性痛、皮膚痛もしくは内臓痛、または歯痛；例えば、癌、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）感染、組織外傷、感染、自己免疫疾患、糖尿病、関節炎、糖尿病性神経障害、三叉神経痛または薬物投与による中枢神経系または末梢神経系への傷害により引き起こされる神経因性疼痛などの各種疼痛を含む、中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経系に関連する症状またはそれらの有害な症状の診断、処置、予防または改善；例えば、例えば、パニック障害、全身性不安障害またはストレス障害、特に、急性ストレス障害、情動障害、アルツハイマー病、運動失調、外傷または脳卒中または神経変性疾患により引き起こされるＣＮＳ損傷、認識欠陥、強迫行動、痴呆、うつ病、ハンチントン病、躁病、記憶欠陥(memory inpairment)、記憶障害(memory disorder)、記憶不全(memory dysfunction)、動作障害(motion disorder)、運動障害(motor disorder)、加齢性記憶喪失、神経変性疾患、パーキンソン病およびパーキンソン様運動障害、恐怖症、ピック病、精神病、統合失調症、脊髄損傷、振戦、発作、痙攣、癲癇、シュタルガルト様黄斑ジストロフィー、錐体桿体黄斑ジストロフィー、サラ病、癲癇、筋弛緩薬、解熱薬、抗不安薬、抗片頭痛薬、鎮痛薬、双極性障害、単極性うつ病、機能的腸疾患（例えば、消化不良および過敏性腸症候群）、下痢、便秘、各種尿失禁（例えば、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、溢出性尿失禁または無意識性尿失禁および混合型尿失禁）、尿意切迫、不安定膀胱、神経因性膀胱、聴力損失、耳鳴、緑内障、認知障害、慢性炎症性および神経因性疼痛の処置；例えば、癌、炎症、眼病および種々のＣＮＳ障害の処置に関する薬物依存性または薬物耐性の予防および軽減に有用である。
本明細書に記載の核酸分子、タンパク質、タンパク質ホモログおよび抗体は、次の方法：ａ）好ましくは脳、骨格筋または膀胱の処置方法；ｂ）スクリーニングアッセイ；ｃ）推定医学（例えば、診断アッセイ、予後アッセイ、臨床試験のモニタリングまたは薬理遺伝学）の１以上で使用可能である。単離された核酸分子は、例えば、下記でさらに詳しく記載されるように、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質を発現させるため（例えば、遺伝子療法適用において宿主細胞で組換え発現ベクターにより）、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ｍＲＮＡ（例えば、生体サンプルで）またはＫＣＮＱ５遺伝子の遺伝的変異を検出するため、また、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）活性を変調するために使用可能である。さらに、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質は、天然ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）結合タンパク質をスクリーニングするため、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）活性を変調する薬剤または化合物をスクリーニングするため、ならびに例えば、ＫＣＮＱ５タンパク質の産生不足もしくは過剰産生、またはＫＣＮＱ５野生型タンパク質に比べて低いまたは異常な活性を有するＫＣＮＱ５タンパク質形態の産生を特徴とする、ＫＣＮＱ５の変調から利益を受ける障害を処置するために使用することができる。さらに、抗ＫＣＮＱ５または抗ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）抗体は、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質を検出および単離するため、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質のバイオアベイラビリティを調節するため、また、ＫＣＮＱ５活性を変調する（例えば、脳においてＫＣＮＱ５活性を低下させると、ＣＮＳにおけるニューロンの興奮性が高まる）ために使用することができる。好ましい実施形態では、本明細書に開示されている方法、例えば、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）の検出、変調などは、ＣＮＳ、骨格筋または膀胱平滑筋で行われる。
Ａ．ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）を変調する方法
一態様では、例えば、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）の発現および／または活性を変調する薬剤を同定する目的で細胞においてＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）を変調する方法、ならびに異常なＫＣＮＱ５発現もしくは活性に付随する障害、またはＫＣＮＱ５活性の変調から利益を受ける障害のリスクのある（もしくは罹患しやすい）、またはその障害を有する対象を処置する予防法および治療法の双方を提供する。
さらに別の態様は、細胞においてＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）発現および／または活性を変調する方法に関する。これらの変調方法は、細胞を、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）発現および／または活性を変調する薬剤と接触させることを含み、その結果、細胞のＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）発現および／または活性は変調される。この薬剤は細胞におけるＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の活性を変調することによるか、またはＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）遺伝子の転写もしくはＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ｍＲＮＡの翻訳を変調することにより働き得る。
よって、一実施形態において、この薬剤はＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）活性を阻害する。阻害剤は、例えば、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）活性を直接阻害することにより、またはＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）に負の調節を行うシグナル伝達経路経路を変調することにより機能し得る。別の実施形態では、この薬剤はＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）活性を刺激する。刺激剤は、例えば、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）活性を直接刺激することにより、またはＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）活性の刺激をもたらすシグナル伝達経路を変調することにより機能し得る。阻害剤の例としては、アンチセンスＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）核酸分子（例えば、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ｍＲＮＡの翻訳を阻害するため）、細胞内抗ＫＣＮＱ５または抗ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）抗体（例えば、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の活性を阻害するため）、およびＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質のドミナントネガティブ突然変異体が挙げられる。ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の活性を阻害するために使用可能な他の阻害剤としては、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）活性を阻害する化学化合物がある。このような化合物は本明細書に記載されているように、このような化合物を選択するスクリーニングアッセイを用いて同定することができる。その上、またはその代わりに、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）活性を阻害する化合物を当技術分野で公知のアプローチを用いて設計することができる。
別の変調方法によれば、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）活性は、細胞を刺激剤と接触させることにより細胞において刺激される。このような刺激剤の例としては、活性ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質および細胞のＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）活性を増強するために細胞に導入されたＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）をコードする核酸分子が挙げられる。好ましい刺激剤はＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質をコードする核酸分子であり、この核酸分子は細胞内での活性ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の発現に好適な形態で細胞に導入される。細胞内でＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質を発現させるためには、一般に、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ｃＤＮＡをまず、本明細書に記載されているように、標準的な分子生物学的技術を用い、組換え発現ベクターに導入する。ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ｃＤＮＡは、例えば、本明細書に記載されているように、ＰＣＲを用いた増幅により、または適当なｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ｃＤＮＡを単離および増幅した後、そのＤＮＡ断片を発現ベクターに導入し、本明細書に記載されているように、標準的な方法により標的細胞へトランスフェクトする。ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の活性および／または発現を刺激するために使用可能な他の刺激剤としては、ＫＣＮＱ５活性を増強する化合物など、細胞におけるＫＣＮＱ５活性および／または発現を刺激する化学化合物がある。このような化合物は、本明細書に詳しく記載されているように、このような化合物を選択するスクリーニングアッセイを用いて同定することができる。
これらの変調方法は、in vitro（例えば、細胞を薬剤とともに培養することによるか、または薬剤を培養細胞に導入することによる）、あるいはまた、in vivo（例えば、薬剤を対象に投与することによるか、または遺伝子療法によるなど、薬剤を対象の細胞に導入することによる）で行うことができる。in vitro変調法を行うためには、標準的な方法により対象から細胞を得、in vitroで変調剤とともにインキュベート（すなわち培養）し、細胞におけるＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）活性を変調させることができる。
核酸（ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質をコードする組換え発現ベクター、アンチセンスＲＮＡ、細胞内抗体またはドミナントネガティブインヒビターを含む）を含む刺激剤または阻害剤に関しては、in vivoにおいて核酸（例えばＤＮＡ）を細胞に導入するための当技術分野で公知の方法を用い、薬剤を対象の細胞に導入することができる。このような方法の例としては、次のものを含む非ウイルス法およびウイルス法の双方を含む。
直接注入：裸のＤＮＡを、ＤＮＡを細胞に直接注入することにより、in vivoにおいて細胞に導入することができる（例えば、Acsadi G et al., Nature 332:815-18 (1991); Wolff JA et al., Science 247:1465-68 (1990)参照）。例えば、in vivoにおいてＤＮＡを細胞に注入するための送達装置（例えば、「遺伝子銃」）が使用可能である。このような装置は市販されている（例えば、Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.から）。
陽イオン脂質：裸のＤＮＡをin vivoにおいて、ＤＮＡと陽イオン脂質を複合化することによるか、またはＤＮＡを陽イオンリポソームに封入することにより、細胞に導入することができる。好適な陽イオン脂質製剤の例としては、Ｎ−［−１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）および１：１モル比の１，２−ジミリスチルオキシ−プロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）とジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる（例えば、Logan JJ et al., Gene Ther. 2:38-49 (1995); San H et al., Hum. Gene Ther. 4:781-88 (1993)参照)。
受容体媒介ＤＮＡ取り込み：裸のＤＮＡはまた、ポリリジンなど、細胞表面受容体のリガンドと結合される陽イオンとＤＮＡを複合化することにより、in vivoにおいて細胞に導入することもできる（例えば、Wu GY and Wu CH, J. Biol. Chem. 263:14621-24 (1988); Wilson JM et al., J. Biol. Chem. 267:963-67 (1992)；米国特許第５，１６６，３２０号参照）。ＤＮＡ−リガンド複合体と受容体の結合は、受容体により媒介されるエンドサイトーシスによりＤＮＡの取り込みを促進する。細胞内リソソームによる複合体の分解を避けるには、自然状態でエンドソームを破壊し、それにより細胞質中に物質を放出するアデノウイルスキャプシッドと結合されたＤＮＡ−リガンド複合体を使用することができる（例えば、Curiel DT et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8850-54 (1991); Cristiano RJ et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2122-26 (1993)参照）。
レトロウイルス：欠陥レトロウイルスは、遺伝子療法の目的で遺伝子導入に使用するために十分特性決定されている（総説としては、Miller AD, Blood 76:271-78 (1990)参照）。組換えレトロウイルスは、レトロウイルスゲノムに目的のヌクレオチド配列が組み込まれているように構築することができる。さらに、レトロウイルスを複製欠陥とするためにレトロウイルスゲノムの一部を除去することができる。次に、複製欠陥レトロウイルスを、標準的な技術によりヘルパーウイルスの使用によって標的細胞の感染に使用可能なビリオンへとパッケージングする。組換えレトロウイルスを産生するプロトコールおよびin vitroまたはin vivoにおいてこのようなウイルスを細胞に感染させるプロトコールは、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel FM et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9.10-9.14および他の標準的な実験手引書に見出すことができる。好適なレトロウイルスの例としては、当業者に周知のｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭが挙げられる。好適なパッケージングウイルス系統としては、ψＣｒｉｐ、ψＣｒｅ、ψ２、およびψＡｍが挙げられる。レトロウイルスは、in vitroおよび／またはin vivoにおいて種々の遺伝子を上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞をはじめとする多くの異なる細胞種に導入するために用いられている（例えば、Eglitis MA et al., Science 230:1395-98 (1985); Danos O and Mulligan RC, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-64 (1988); Wilson JM et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-18 (1988); Armentano D et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6141-45 (1990); Huber BE et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-43 (1991); Ferry N et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-81 (1991); Chowdhury JR et al., Science 254:1802-05 (1991); van Beusechem VW et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-44 (1992); Kay MA et al., Hum. Gene Ther. 3:641-47 (1992); Dai Y et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-95 (1992); Hwu P et al., J. Immunol. 150:4104-15 (1993)；米国特許第４，８６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；ＷＯ８９／０７１３６；ＷＯ８９／０２４６８；ＷＯ８９／０５３４５；およびＷＯ９２／０７５７３参照）。レトロウイルスベクターは、レトロウイルスゲノム（およびそれに挿入されている外来核酸）が宿主ゲノムに組み込まれ、その細胞に核酸を安定導入するためには標的細胞の分裂が必要である。よって、標的細胞の複製を刺激することが必要であり得る。
アデノウイルス：アデノウイルスのゲノムは、それが目的の遺伝子産物をコードおよび発現するが、通常の溶菌ウイルスの生活環におけるその複製能に関して不活性化されるように操作することができる（例えば、Berkner KL, Biotechniques 6:616-29 (1988); Rosenfeld MA et al., Science 252:431-34 (1991);およびRosenfeld MA et al., Cell 68:143-55 (1992)参照）。アデノウイルス株Ａｄタイプ５ ｄ１３２４または他のアデノウイルス株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）に由来する好適なアデノウイルスベクターは当業者によく知られている。組換えアデノウイルスは、有効な遺伝子送達ビヒクルとするのに分裂細胞を必要とせず、さらに、気道上皮(Rosenfeld MA et al., Cell 68:143-55 (1992))、内皮細胞(Lemarchand P et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6482-86 (1992))、肝細胞(Herz J and Gerard RD, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2812-16 (1993))および筋肉細胞(Quantin B et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2581-84 (1992))をはじめとする多様な細胞種の感染に使用可能であるという点で有利である。さらに、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（およびそこに含まれている外来ＤＮＡ）は宿主細胞のゲノムに組み込まれず、エピソームで維持され、これにより、導入されたＤＮＡが、宿主ゲノム（例えば、レトロウイルスＤＮＡ）が導入されるようになる状況で挿入突然変異誘発の結果として起こり得る潜在的問題を回避する。さらに、アデノウイルスゲノムの外来ＤＮＡ保持能は他の遺伝子送達ベクターよりも大きい（最大８キロベース）(Berkner KL et al., 前掲; Haj-Ahmad Y and Graham FL, J. Virol. 57:267-74 (1986))。現在使用されているほとんどの複製欠陥アデノウイルスベクターは、ウイルスＥ１およびＥ３遺伝子の全部または一部を欠損しているが、８０％といった多くのアデノウイルス遺伝物質を保持している。
アデノ随伴ウイルス：アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、効率的複製および産生的生活環のためのヘルパーウイルスとしての、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどの別のウイルスを必要とする天然の欠陥ウイルスである（総説としては、Muzyczka N, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158:97-129 (1992)参照）。それはまた、そのＤＮＡが非分裂細胞に組み込むことができ、高頻度の安定な組み込みを示す数少ないウイルスの１つである（例えば、Flotte TR et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-56 (1992); Samulski RJ et al., J. Virol. 63:3822-28 (1989);およびMcLaughlin SK et al., J. Virol. 62:1963-73 (1988)参照）。３００塩基対といった小さなＡＡＶを含むベクターをパッケージングすることができ、組み込むことができる。外因性のＤＮＡのためのスペースは約約４．５ｋｂに制限される。Tratschin JD et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-60 (1985)に記載されているようなＡＡＶベクターは細胞にＤＮＡを導入するために使用することができる。種々の核酸がＡＡＶベクターを用いて種々の細胞種に導入されている（例えば、Hermonat PL and Muzyczka N, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-70 (1984); Tratschin JD et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-81 (1985); Wondisford FE et al., Mol. Endocrinol. 2:32-39 (1988); Tratschin JD et al., J. Virol. 51:611-19 (1984);およびFlotte TR et al., J. Biol. Chem. 268:3781-90 (1993)参照）。
特定の発現ベクター系および核酸を細胞に導入する方法の有効性は当技術分野で慣例的に用いられている標準的なアプローチにより評価することができる。例えば、細胞に導入されたＤＮＡはフィルターハイブリダイゼーション技術（例えば、サザンブロット法）により検出することができ、導入されたＤＮＡの転写により産生されたＲＮＡは例えばノーザンブロット法、ＲＮアーゼ保護または逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により検出することができる。遺伝子産物は、例えば、特異的抗体を用いるなど、産生されたタンパク質の免疫検出、または遺伝子産物の機能活性を検出するための機能的アッセイによるなどの適当なアッセイにより検出することができる。
ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）変調剤が処置に使用できる様々な病態がある（例えば、本明細書の第Ｖ節参照）。
１．予防方法
一態様は、対象において、対象にＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドまたはＫＣＮＱ５ポリペプチド発現もしくは少なくとも１つのＫＣＮＱ５活性を変調する薬剤を投与することにより、ＫＣＮＱ５活性および／または発現の変調から利益を受ける疾病または症状、例えば、異常なＫＣＮＱ５発現または活性に付随する障害（例えば、尿失禁および神経因性疼痛など）を予防する方法を提供する。一態様において、ＫＣＮＱ５ポリペプチドはＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含み得る。あるいは、ＫＣＮＱ５ポリペプチドはＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含み得る。異常なＫＣＮＱ５発現または活性により引き起こされる、またはその一因となる疾病のリスクのある対象は、例えば、本明細書に記載されているような診断アッセイまたは予後アッセイのいずれかまたは組合せにより同定することができる。予防薬の投与は、疾病または障害が予防されるように、またはそうでなければその進行が遅延されるように、ＫＣＮＱ５異常に特徴的な徴候の発現前に行うことができる。ＫＣＮＱ５異常または症状のタイプに応じて、例えば、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチド、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）アゴニストまたはＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）アンタゴニスト剤が対象の処置に使用可能である。適当な薬剤は本明細書に記載のスクリーニングアッセイに基づいて決定することができる。
２．治療方法
別の態様は、治療目的でＫＣＮＱ５の発現または活性を変調する方法に関する。よって、一例としての実施形態では、変調方法は、細胞と、細胞に会合しているＫＣＮＱ５タンパク質の１以上の活性を変調するＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドまたは薬剤を接触させることを含む。ＫＣＮＱ５タンパク質活性を変調する薬剤は、核酸もしくはタンパク質などの本明細書に記載されているような薬剤、ＫＣＮＱ５タンパク質の天然標的分子（例えば、ＫＣＮＱ５結合タンパク質）、ＫＣＮＱ５またははＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）抗体、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）アゴニストもしくはアンタゴニスト、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）アゴニストもしくはアンタゴニストのペプチドミメティック、または他の小分子であり得る。一実施形態において、この薬剤は１以上のＫＣＮＱ５活性を刺激する。このような刺激剤の例としては、活性ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質およびその細胞に導入されているＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドをコードする核酸分子が挙げられる。別の実施形態では、この薬剤は１以上のＫＣＮＱ５活性を阻害する。このような阻害剤の例としては、アンチセンスＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）核酸分子、抗ＫＣＮＱ５または抗ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）抗体、およびＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）インヒビターが挙げられる。これらの変調方法はin vitroで（例えば、細胞を薬剤とともに培養することによる）、あるいはまたin vivoで（例えば、対象に薬剤を投与することによる）行うことができる。さらなる態様はそれ自体、ＫＣＮＱ５タンパク質の変調から利益を受ける（例えば、本明細書の第Ｖ節に記載のとおり）か、またはＫＣＮＱ５タンパク質もしくは核酸分子の異常な発現もしくは活性を特徴とする疾病または障害に罹患している個体を処置する方法を提供する。一実施形態において、この方法は、ＫＣＮＱ５発現または活性を変調する（例えば、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションする）薬剤（例えば、本明細書に記載のスクリーニングアッセイにより同定された薬剤）または薬剤の組合せを投与することを含む。別の実施形態では、この方法は、低下したまたは異常なＫＣＮＱ５発現または活性を補うための療法としてＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質または核酸分子を投与することを含む。
ＫＣＮＱ５活性の刺激は、ＫＣＮＱ５が異常にダウンレギュレーションされている、および／またはＫＣＮＱ５活性の亢進が有益な作用を有する可能性のある状況で望ましい。同様に、ＫＣＮＱ５活性の阻害は、ＫＣＮＱ５が異常にアップレギュレーションされている、および／またはＫＣＮＱ５活性の低下が有益な作用を有する可能性のある状況で望ましい。ＫＣＮＱ５の変調が望ましい状況の例としては、ＫＣＮＱ５関連障害の処置である（例えば、本明細書の第Ｖ節参照）。
本明細書に開示されている方法により同定された薬剤は、不安定膀胱または尿失禁を受けている、または受けやすい哺乳動物において望ましい膀胱制御を誘導、補助または維持するのに有用である。これらの方法は、特発性不安定膀胱、夜尿症、夜間頻尿、排尿不全、および尿失禁をはじめとする膀胱関連の排尿状態および不安定膀胱の予防、処置または抑制を含む。また、本発明の方法で前立腺肥大に続発する不安定膀胱も治療または予防可能である。本明細書に開示されている方法によって同定された薬剤はまた、いつでも望む時に排尿の一時的遅延をもたらすのにも有用である。これらの薬剤はまた、膀胱を安定化し、切迫尿失禁、腹圧性尿失禁または切迫性と腹圧性尿失禁の組合せ（切迫性腹圧性混合尿失禁とも呼ばれる）を治療または予防するのに利用することができる。これらの方法は、前立腺肥大などの続発症状に関連する尿失禁の予防または治療の補助を含む。
これらの方法は、レシピエントに排尿の切迫性および頻度を制御させるために利用可能である。本発明のこの方法は、不安定膀胱、神経陰性膀胱、排尿不全、活動亢進膀胱、排尿筋活動亢進、排尿筋過剰弛緩または無抑制膀胱としても知られる切迫尿失禁の治療、予防、抑制および改善を含む。
上記のように、有用な方法としては、活動亢進または不安定膀胱、神経陰性膀胱、感覚性膀胱切迫または過剰弛緩膀胱の治療、予防、抑制または改善を含む。これらの使用は、限定されるものではないが、前立腺炎、前立腺肥大、間質性膀胱炎、尿路感染または膣炎に排尿切迫が伴っている膀胱活動および不安定に対するものが挙げられる。これらの薬剤はまた、頻尿尿意切迫症候群および排尿回数減少症候群としても知られる機能低下膀胱(lazy bladder)の症状の抑制または矯正を補助するためにも使用可能である。
これらの薬剤はまた、利尿剤、バソプレシンアンタゴニスト、抗コリン作用薬、鎮静薬または催眠薬、麻薬、α−アドレナリン作動性のアゴニスト、α−アドレナリン作動性アンタゴニストまたはカルシウムチャネル遮断薬をはじめとする他の薬剤の投与に伴う、またはその投与の結果としての尿失禁、排尿不安定またはまたは排尿切迫の治療、予防、抑制または制限にも使用可能である。
本明細書に開示されている方法によって同定された薬剤は、膀胱制御の誘導もしくは補助、または成人使用および小児使用を含む、このような軽減を必要とするヒトにおいて、本明細書に記載の疾患の予防もしくは治療に有用であり得る。しかしながら、それらはまた、特にイヌおよびネコの膀胱制御法を含む獣医学的適用にも利用可能であり得る。所望により、本明細書の方法はまた、ヒツジ、ウシ、ブタおよびウマ種などの農場動物とともに使用することもできる。
Ｂ．スクリーニングアッセイ：
一態様は、モジュレーター、すなわち、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質と結合する候補またはまたは試験化合物または薬剤（例えば、ペプチド、ペプチドミメティクス、小分子または他の薬剤）を同定するための方法（本明細書では「スクリーニングアッセイ」としても呼ばれる）は、例えば、ＫＣＮＱ５もしくはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）発現またはＫＣＮＱ５もしくはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）活性に対して刺激作用または阻害作用を有する。
これらの試験化合物は、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な平行固相または液相ライブラリー；デコンヴォルーションを必要とする合成ライブラリー法；「一ビーズ一化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法を含む、当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における多くのアプローチのいずれかを用いて得ることができる。この生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは小分子ライブラリーに適用可能である(Lam KS, Anticancer Drug Des. 12:145-67 (1997))。
分子ライブラリー合成方法の例は例えば、DeWitt SH et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909-13 (1993); Erb E et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-26 (1994); Zuckermann RN et al., J. Med. Chem. 37:2678-85 (1994); Cho CY et al., Science 261:1303-05 (1993); Carrell T et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059-61 (1994); Carrell T et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061-64 (1994);およびGallop MA et al., J. Med. Chem. 37:1233-51 (1994)など、当技術分野で見出すことができる。
化合物のライブラリーは、例えば、溶液中（例えば、Houghten RA et al., Biotechniques 13:412-21 (1992)）またはビーズ上(Lam KS et al., Nature 354:82-84 (1991))、チップ(Fodor SPA et al., Nature 364:555-56 (1993))、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド(Cull MG et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-69 (1992))またはファージ上(Scott JK and Smith GP, Science 249:386-90 (1990); Devlin JJ et al., Science 249:404-06 (1990); Cwirla SE et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-82 (1990); Felici F et al., J. Mol. Biol. 222:301-10 (1991)；米国特許第５，２２３，４０９号）に提供することができる。
変調剤および天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬剤スクリーニングプログラムにおいては、所定の時間内に検査される変調剤の数を最大にするために、ハイスループットアッセイが望ましい。精製または半精製タンパク質に由来し得るものなど、無細胞系で実施されるアッセイは、試験変調剤によって媒介される分子標的における変更の迅速な発達および比較的容易な検出を可能とするために作出できるという点でしばしば「一次」スクリーニングと呼ばれる。さらに、試験変調剤の細胞毒性および／またはバイオアベイラビリティの影響は、in vitro系では一般に無視することができ、その代わりにこのアッセイは主として分子標的に対する薬剤の作用に着目し、これは上流エレメントまたは下流エレメントとの結合親和性の変更に表れるためである。
一態様では、薬剤をＫＣＮＱ５分子と接触させ、ＫＣＮＱ５活性に対するその薬剤の作用を検出することにより、薬剤をスクリーニングする。ＫＣＮＱ５活性の増加または低下の検出は、薬剤がＫＣＮＱ５のモジュレーターであることを示す。ＫＣＮＱ５分子は、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドの全部または一部をコードするポリヌクレオチド、ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。あるいは、ＫＣＮＱ５分子はＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド、ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドまたはＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドであり得る。
別の態様では、薬剤は、細胞と薬剤を接触させ、ＫＣＮＱ５分子の発現レベルを測定することによりスクリーニングされる。ＫＣＮＱ５発現の低下または増加の検出は、薬剤がＫＣＮＱ５のモジュレーターであることを示す。ＫＣＮＱ５分子は、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドの全部または一部をコードするポリヌクレオチド、ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。あるいは、このＫＣＮＱ５分子は、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド、ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドまたはＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドであり得る。
一実施形態は、ＫＣＮＱ５タンパク質またはポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分と結合する、またはその活性を変調する、例えば、ＫＣＮＱ５ポリペプチドの、不安および／または神経因性疼痛に対するニューロンの興奮性を軽減する能力、または尿失禁に対して膀胱平滑筋活動を「鎮静化する」能力を変調する候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。「鎮静化」とは、失禁患者の膀胱平滑筋細胞の異常な収縮を抑制することを意味する。
対象ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドの正常な細胞機能のアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかである、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ホモログを含む変調剤をスクリーニングするためのアッセイを用いることができる。例えば、一態様は、ＫＣＮＱ５活性を有するＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質を有する指標組成物が提供される方法を提供する。この指標組成物を試験化合物と接触させることができる。次に、指標組成物の変化によって測定されるＫＣＮＱ５活性に対する試験化合物の作用を測定し、それにより、ＫＣＮＱ５タンパク質の活性を変調する化合物を同定することができる。試験化合物の存在下でのＫＣＮＱ５活性のレベルにおける増加または低下などの統計学的に有意な変化（試験化合物の不在下で検出されたものと比較）は、試験化合物がＫＣＮＱ５変調剤であることを示す。指標組成物は例えば、細胞または細胞抽出物であり得る。
変調剤の有効性は、種々の濃度の試験変調剤を用いて得られたデータから用量応答曲線を作製することにより評価することができる。さらに、比較のためのベースラインを得るために対照アッセイも行うことができる。対照アッセイでは、ＫＣＮＱ５結合エレメントを含む組成に単離および精製されたＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質を加え、変調剤の不在下で複合体の形成を定量する。
さらに別の実施形態では、アッセイは無細胞アッセイであり、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させ、その試験化合物の、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質またはその生物学的に活性な部分と結合する能力を測定する。試験化合物とＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の結合は上記のように直接的または間接的のいずれかで測定することができる。一実施形態において、このアッセイはＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質または生物学的に活性な部分を、野生型ＫＣＮＱ５と結合する既知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成すること、このアッセイ混合物を試験化合物と接触させること、および試験化合物の、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質と相互作用する能力を測定することを含み、試験化合物の、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質と相互作用する能力の測定は、試験化合物の、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分と優先的に結合する能力を既知の化合物と比較して測定することを含む。
ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質は、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）を発現する細胞の溶解液として、精製もしくは半精製ポリペプチドとして、または組換え発現ポリペプチドとして提供することができる。一実施形態において、無細胞アッセイ系はさらに、細胞抽出物、またはミトコンドリアなどの単離された細胞成分を含む。このような細胞成分は、当技術分野で公知の技術を用いて単離することができる。好ましくは、無細胞アッセイ系はさらに、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）が相互作用する少なくとも１つの標的分子を含み、ここで、試験化合物の、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）と標的分子の相互作用を変調する能力がモニタリングされ、それにより、試験化合物がＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）活性のモジュレーターと同定する。試験化合物の、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の活性を変調する能力の測定は、例えば、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）標的分子と結合する能力を、直接的結合を測定するための上記の方法の１つにより測定することによって達成することができる。ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）標的分子と結合する能力の測定はまた、リアルタイム生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）（例えば、Sjolander S and Urbaniczky C, Anal. Chem. 63:2338-45 (1991)およびSzabo A et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705 (1995)参照）などの技術を用いて行うことができる。本明細書において「ＢＩＡ」は、相互作用物（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）を標識せずに、リアルタイムで生物特異的な相互作用を研究する技術である。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象の変化を、生体分子間のリアルタイム反応の指標として用いることができる。
さらに別の実施形態では、無細胞アッセイは、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質またはその生物学的に活性な部分を、野生型ＫＣＮＱ５タンパク質と結合する既知の化合物と接触させて、アッセイ混合物を形成すること、そのアッセイ混合物を試験化合物と接触させること、および試験化合物の、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質と相互作用する能力を測定することを含み、ここで、試験化合物の、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質と相互作用する能力の測定は、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）標的分子と優先的に結合するか、またはその活性を変調する能力を測定することを含む。
これらの無細胞アッセイは、可溶性および／または膜結合型タンパク質の双方に従う。膜結合型タンパク質（例えば、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質）が使用される無細胞アッセイの場合、膜結合型のタンパク質が溶液中で維持されるように可溶化剤を利用することが望ましい。このような可溶化剤の例としては、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、トリトン（登録商標）Ｘ−１００、トリトン（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアミニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアミニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）またはＮ−ドデシル＝Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートなどの非イオン性洗剤が挙げられる。
ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）標的分子は、例えば、タンパク質であり得る。タンパク質−タンパク質相互作用の検出を可能とする好適なアッセイ（例えば、免疫沈降、ツーハイブリッドアッセイなど）は当技術分野で公知である。試験化合物の存在下および不在下でこのようなアッセイを実施することにより、これらのアッセイを用いて、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）と標的分子の相互作用を変調する（例えば、阻害または促進する）化合物を同定することができる。
ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）分子のリガンドと結合または相互作用する能力の測定は、例えば、直接的結合により行うことができる。直接的結合アッセイでは、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質は放射性同位元素または酵素標識と結合させることができ、その結果、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質とＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）標的分子の結合が、複合体における標識ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の検出により測定することができる。例えば、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）分子、例えば、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質は、例えば、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐまたは３Ｈで直接的または間接的のいずれかで標識することができ、この放射性同位元素は、放射の直接的計数またはシンチレーション計数により検出される。あるいは、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）分子を、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼまたはルシフェラーゼなどで酵素標識することができ、この酵素標識は適当な基質から生成物への変換の測定により検出される。
一般に、これらのタンパク質の一方または双方の非複合体形態からの複合体の分離を容易にするため、ならびにアッセイの自動化を図るためにＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）またはその結合タンパク質を固定化することが望ましい。ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）と上流または下流結合エレメントとの結合を、候補薬剤の存在下および不在下で、反応物を含むのに好適な容器を達成することができる。例としては、マイクロタイタープレート、試験管およびマイクロ遠沈管が挙げられる。一実施形態において、融合タンパク質は、タンパク質がマトリックスと結合できるようにするドメインを付加する融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）（ＧＳＴ／ ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ））融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ(Sigma Chemical, St. Louis, Mo.)またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートへ吸着させることができ、次に、これを細胞溶解液および試験変調剤と合わせ、例えば塩およびｐＨの生理学的条件からやや高いストリンジェント条件などの複合体形成に資する条件下でインキュベートした混合物が望ましい。インキュベーション後、これらのビーズを洗浄して結合していない標識を除去し、マトリックスに固定化して放射性標識を直接（例えば、シンチラントの代わりにビーズ）、または続いて複合体を解離した後の上清で測定する。あるいは、マトリックスから複合体を解離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ビーズ画分中に見られるＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）−結合タンパク質のレベルを標準的な電気泳動技術を用いてゲルから定量することもできる。
タンパク質をマトリックス上に固定化する他の技術も、対象アッセイに用いるために使用可能である。例えば、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）またはそのコグネイト結合タンパク質は、ビオチンとストレプトアビジンのコンジュゲーションを利用して固定化することができる。例えば、ビオチン化ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）分子は、当技術分野で周知の技術（例えば、ビオチン化キット、Pierce Biotechnology, Rockford, III.）を用い、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から作製し、ストレプトアビジンでコーティングされた９６ウェルプレート(Pierce Biotechnology)に固定化することができる。あるいは、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）と反応性があるが、上流エレメントまたは下流エレメントの結合とは干渉しない抗体をプレートのウェルに誘導体化し、抗体とのコンジュゲーションによりＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）をウェルに捕捉することができる。上記のように、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）結合タンパク質（ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）−ＢＰ）と試験変調剤の調製物をプレートのＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）提示ウェル中でインキュベートし、ウェルに捕捉された複合体の量を定量することができる。ＧＳＴ固定化複合体に関して上記したものの他、このような複合体を検出するための方法の例としては、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）結合エレメントと反応性があるか、またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質と反応性があり、結合エレメントと競合する抗体を用いる複合体の免疫検出；ならびに内因性活性または外因性活性いずれかの、結合エレメントに関連する酵素活性を検出することによる酵素結合アッセイが挙げられる。後者の場合、酵素は化学的にコンジュゲートさせることもできるし、あるいはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）結合タンパク質との融合タンパク質として提供することもできる。例示のため、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）結合タンパク質は、セイヨウワサビペルオキシダーゼと化学的に架橋することもできるし、あるいはセイヨウワサビペルオキシダーゼと遺伝的に融合させることもでき、複合体中に捕捉されたタンパク質の量は酵素の発色基質、例えば、３，３’−ジアミノ−ベンザジンテトラヒドロクロリド(terahydrochloride)または４−クロロ−１−ナフトールを用いて評価することができる。同様に、このタンパク質とグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを含む融合タンパク質を提供することもでき、複合体の形成は、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンを用いてＧＳＴ活性を検出することにより定量される(Habig WH et al., J. Biol. Chem. 249:7130-39 (1974))。
複合体中に捕捉されたタンパク質の１つを定量するための免疫検出による方法では、抗ＫＣＮＱ５または抗ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）抗体などの、タンパク質に対する抗体を使用することができる。あるいは、複合体において検出されるタンパク質は、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）配列の他に、抗体が容易に得られる（例えば、商業的供給源から）第二のタンパク質を含む融合タンパク質の形態で「エピトープタグ」を付けることができる。例えば、上記のＧＳＴ融合タンパク質はまた、ＧＳＴ部分に対する抗体を用い、結合の定量に使用することもできる。他の有用なエピトープタグとしては、ｃ−ｍｙｃ由来の１０残基配列を含むｍｙｃ−エピトープ（例えば、Ellison MJ and Hochstrasser M, J. Biol. Chem. 266:21150-57 (1991)参照）、ならびにｐＦＬＡＧ（登録商標）系(SigmaAldrich, St. Louis, Mo.)またはｐＥＺＺ−Ａタンパク質系(GE Healthcare, Piscataway, NJ)が挙げられる。
化合物の、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）とそれらの個々の標的分子の間の相互作用を変調する能力を、相互作用物のいずれも標識せずに測定することも、本開示の範囲内ある。例えば、ＫＣＮＱ５、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）または標的分子の標識を行わずに、マイクロフィジオメーター(microphysiometer)を用いて、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）とそれらの個々の標的分子との相互作用を検出することができる（例えば、McConnell HM et al., Science 257:1906-12 (1992)参照）。本明細書において「マイクロフィジオメーター」（例えば、サイトセンサー(Cytosensor)）は、光アドレス電位応答センサー(light-addressable potentiometric sensor)（ＬＡＰＳ）を用い、細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。この酸性化速度の変化は、化合物と受容体の間の相互作用の指標として使用可能である。
無細胞アッセイの他、ＫＣＮＱ５およびＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質に関する本明細書の開示は、小分子アゴニスト／アンタゴニストなどを同定するための細胞に基づくアッセイの作出を容易にする。例えば、細胞は、試験薬剤により媒介される標的細胞によるＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）応答の変調をスコアリングするアッセイを用い、目的の試験変調剤の存在下および不在下で組換えＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質を発現または過剰発現させることができる。例えば、無細胞アッセイの場合と同様、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）依存性応答に統計学的に有意な変化（増加または低下のいずれか）をもたらす変調剤を同定することができる。
ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）の発現のために使用可能な組換え発現ベクターは当技術分野で公知だえる（前記の考察を参照）。一実施形態において、発現ベクター内で、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）コード配列は、指標細胞においてＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）の構成発現または誘導発現を可能とする調節配列と作動可能なように連結されている。細胞においてＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）の構成発現または誘導発現を可能とする組換え発現ベクターの使用は、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）の活性を増強または阻害する化合物の同定に好ましい。別の実施形態では、発現ベクター内で、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）コード配列は、内因性のＫＣＮＱ５遺伝子の調節配列（すなわち、内因性遺伝子に由来するプロモーター調節領域）と作動可能なように連結されている。ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）の発現が内因性調節配列により制御される組換え発現ベクターの使用が好ましい。一実施形態において、アッセイは、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）標的分子（例えば、ＫＣＮＱ５細胞内相互作用分子）を発現する細胞を試験化合物と発現させること、および試験化合物の、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）標的分子の活性を変調する（例えば、刺激または阻害する）能力を測定することを含む細胞に基づくアッセイである。試験化合物の、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）標的分子の活性を変調する能力の測定は、例えば、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の、ＫＣＮＱ５もしくはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）標的分子またはそのリガンドと結合する能力を測定することにより行うことができる。
例示的な実施形態では、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）の発現または活性が細胞内で変調され、目的の読み取り値に対する目的の変調剤の作用を測定することができる（例えば、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）チャネルを発現するアフリカツメガエル(Xenopus laevis)卵母細胞からイオン電流の大きさを電気生理学的に測定することができる）。
別の実施形態では、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）発現のモジュレーターは、細胞が候補化合物と接触され、細胞におけるＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が測定される方法で同定される。候補化合物の存在下でのＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを、候補化合物の不在下でのＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較する。次に、この候補化合物を、この比較に基づくＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）発現のモジュレーターとして同定することができる。例えば、候補化合物の存在下でのＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、その不在下よりも高い（例えば、統計学的に有意に高い）場合、その候補化合物はＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の刺激剤と同定される。あるいは、候補化合物の存在下でのＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、その不在下よりも低い（例えば、統計学的に有意に低い）場合、その候補化合物はＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ｍＲＮＡまたはタンパク質発現のインヒビターと同定される。細胞におけるＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するための本明細書に記載の方法によって測定することができる。
好ましい実施形態では、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）標的分子と結合する、またはそれと相互作用する能力の測定は、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）または標的分子の活性の読み取り値を評価することにより行うことができる。例えば、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）または標的分子の活性は、標的の細胞セカンドメッセンジャーの誘導を検出すること、適当な基質の標的の触媒／酵素活性を検出すること、リポーター遺伝子（検出可能なマーカー、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする核酸と作動可能なように連結された標的応答調節エレメントを含む）の誘導を検出すること、または例えば、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）チャネルの遮断により誘導されるＣａ２＋流入などの標的により調節される細胞応答を検出することにより判定することができる。
さらに別の態様では、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質またはその一部は、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイ（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Zervos AS et al., Cell 72:223-32 (1993); Madura K et al., J. Biol. Chem. 268:12046-54 (1993); Bartel P et al., Biotechniques 14:920-24 (1993); Iwabuchi K et al., Oncogene 8:1693-96 (1993)；およびＷＯ９４／１０３００参照）において「おとり(bait)タンパク質」として用い、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）と結合する、またはそれと相互作用し、かつ／またはＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）活性に関与する他のタンパク質を同定することができる。このようなＫＣＮＱ５結合タンパク質はまた、例えば、ＫＣＮＱ５媒介シグナル伝達経路の下流エレメントとしてのＫＣＮＱ５タンパク質またはＫＣＮＱ５標的によるシグナルの増幅に関与している可能性もある。あるいは、このようなＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）結合タンパク質はＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）インヒビターであり得る。
ツーハイブリッド系は、分離可能なＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインからなるほとんどの転写因子のモジュラー特性に基づく。要するに、このアッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を用いる。１つの構築物では、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質をコードする遺伝子を、既知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合する。このＫＣＮＱ５タンパク質は、ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドであってもよい。あるいは、ＫＣＮＱ５タンパク質は、ＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドであり得る。他の構築物において、ＤＮＡ配列ライブラリーからの、未同定のタンパク質（「餌(prey)」または「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列を、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合する。この「おとり」タンパク質と「餌」タンパク質がin vivoで相互作用してＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）依存性複合体を形成し得る場合、その転写因子のＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインは近接されている。この近接により、転写因子に応答性のある転写調節部位と作動可能なように連結されたリポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写が可能となる。リポーター遺伝子の発現を検出し、機能的転写因子を含む細胞コロニーを単離し、これを用い、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質と相互作用するタンパク質をコードするクローン遺伝子を得ることができる。
一態様では、同定された薬剤は既知のＫＣＮＱチャネル遮断薬またはアクチベーターの新規な類似体である。例えば、一実施形態において、同定された薬剤はレチガビン類似体である。別の例の実施形態では、同定された薬剤はＸＥ９９１の新規な類似体である。さらなる例としての実施形態では。これらの薬剤は式：
Figure 2009525024
［式中、
Ｒ１は、水素、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ２−Ｃ６−アルカノイルまたはＡｒ基から選択され；
Ｒ２は、水素またはＣ１−Ｃ６−アルキルから選択され；
Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ、ＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６−アルキルアミノ、Ｃ１−Ｃ６−ジアルキルアミノ、Ａｒ基により置換されたアミノ、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ２−Ｃ６−アルケニル、Ｃ２−Ｃ６−アルキニル、Ａｒ基またはＡｒＯ−基から選択され；
Ｒ４は、水素、Ｃ１−Ｃ６−アルキルまたはＡｒ基から選択され；
Ｒ５は、水素またはＣ１−Ｃ６−アルキルまたはＡｒ基から選択される；
Ａｌｋは、Ａｒ基により置換されていてもよい１〜９個の炭素原子を有する直鎖または分枝アルキレン基であり；
Ａｒは、基Ｒ６、Ｒ７および／またはＲ８で置換されているフェニルであり、これらの基Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は同一であるか、または異なり、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ３−Ｃ７−シクロアルキル、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ、Ｃ２−Ｃ６−アルカノイルオキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ６−ハロゲノアルキル、−ＣＮ、−ＮＨ２、−ＮＨ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ６−アルキル）２、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル、−ＣＯ−Ｏ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル、−ＣＯＡｒ、−ＣＯ−ＯＡｒ、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル、−ＣＯＮ（Ｃ１−Ｃ６−アルキル）２、−ＣＯＮＨＡｒ、−ＮＨ−ＣＯ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル、−ＮＨＣＯ−Ａｒ、−ＮＨＣＯ−Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ、−Ｎ−Ｈ−ＣＯ−Ａｒ、−ＮＨＣＯ−ＮＨ２、−ＮＨＣＯ−Ｎ（−Ｃ１−Ｃ６−アルキル）２、−ＮＨＣＯ−ＮＨＡｒ、−ＮＨ−ＳＯ２−Ｃ１−Ｃ６−アルキル、−ＮＨ−ＳＯ２Ａｒ、−ＮＨ−ＳＯ２−ニトロフェニル、−ＳＯ２−ＯＨ、−ＳＯ２−Ｃ１−Ｃ６−アルキル、−ＳＯ２−Ａｒ、−ＳＯ２−Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ、−ＳＯ２−ＯＡｒ、−−Ｏ２−ＮＨ２、−ＳＯ２−ＮＨ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル、−ＳＯ２−Ｎ（Ｃ１−Ｃ６−アルキル）２、−ＳＯ２−ＮＨＡｒ、−ＳＯ２−Ｃ２−Ｃ６−アルコキシを表し；
ｎは０または１である］
の化合物の類似体である。
さらなる態様は、上記のスクリーニングアッセイにより同定された新規な薬剤に関する。よって、適当な動物モデルにおいて本明細書に記載のように同定された薬剤をさらに使用することは本開示の範囲内である。例えば、本明細書に記載のように同定された薬剤（例えば、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）変調剤、アンチセンスＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリヌクレオチド、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）特異的抗体またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）結合相手）は、このような薬剤を用いた処置の有効性、毒性または副作用を決定するために動物モデルで使用可能である。あるいは、本明細書に記載のように同定された薬剤は、このような薬剤の作用機序を決定するために動物モデルで使用可能である。さらに、別の態様は、本明細書に記載の処置のための、上記のスクリーニングアッセイにより同定された新規な薬剤の使用に関する。
Ｃ．合理的創薬の方法
ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）およびＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）結合ポリペプチドは、候補ＫＣＮＱ５変調剤の合理的創薬に使用することができる。ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドは、タンパク質Ｘ線結晶学または他の構造解析法、例えば、ＤＯＣＫプログラム（例えば、Kuntz ID et al., J. Mol. Biol. 161: 269-88 (1982); Kuntz ID, Science 257:1078-82 (1992)参照）およびその変形形態に使用可能である。このようにして得られた構造情報に基づき、可能性のある治療薬を合理的に設計することができる。
Ｄ．検出アッセイ
本明細書で同定されたｃＤＮＡ配列の一部または断片（および対応する完全遺伝子配列）はポリヌクレオチド試薬として多くの方法で使用可能である。例えば、これらの配列は、（ｉ）それらの個々の遺伝子を染色体上にマッピングし、従って、遺伝病に関連する遺伝子領域を位置決定するため；（ｉｉ）微量の生体サンプルから個体を特定するため（組織タイピング）；および（ｉｉｉ）生体サンプルの法医学的同定に使用可能である。
Ｅ．予測医学
別の態様は、診断アッセイ、予後アッセイおよび臨床試験のモニタリングが予後（予測）目的に用いられる予測医学の分野、それにより、個体を予防的に処置することに関する。よって、一態様は、生体サンプル（例えば、血液、血清、細胞、組織（好ましくは、脳、骨格筋または膀胱））に関して、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質および／または核酸の発現ならびにＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）の活性を測定し、それにより、ある個体が異常なＫＣＮＱ５発現または活性に関連する疾病または障害に罹患しているかどうか、または障害を発症するリスクがあるかどうかを判定するための診断アッセイに関する。さらなる態様は、ある個体がＫＣＮＱ５タンパク質、核酸発現または活性に付随する障害を発症するリスクがあるかどうかを判定するための予後（または予測）アッセイを提供する。例えば、生体サンプルにおいてＫＣＮＱ５遺伝子における突然変異をアッセイすることができる。このようなアッセイは予後または予測目的で、それにより、ＫＣＮＱ５タンパク質、核酸の発現または活性を特徴とする、または関連する障害の発生前に個体を予防的に処置するために使用可能である。
別の態様は、臨床試験においてＫＣＮＱ５の発現または活性に対する薬剤（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングすることに関する。
これらおよび他の薬剤は、以下の節でさらに詳しく記載する。
１．診断アッセイ
生体サンプル中のＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質または核酸の有無を検出するための方法例としては、試験対象から生体サンプルを得、その生体サンプルを、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質をコードするＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質または核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出し得る化合物または薬剤と接触させることを含み、その結果、生体サンプルにおいてＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質または核酸の有無が検出される。ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの検出に好ましい薬剤は、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡとハイブリダイズし得る標識された核酸プローブである。この核酸プローブは、例えば、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）核酸、例えば、配列番号１の核酸またはその一部、例えば、少なくとも１２、１５、３０、５０、１００、２５０、５００またはそれを超えるヌクレオチド長であり、かつ、ストリンジェント条件下でＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズするに十分なオリゴヌクレオチドであり得る。本診断アッセイに用いるための他の好適なプローブも本明細書に記載されている。
ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質を検出するための好ましい薬剤は、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質と結合し得る抗体、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。抗体はポリクローナルであるか、またはより好ましくはモノクローナルである。完全な抗体またはその断片（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）も使用可能である。プローブまたは抗体に関して「標識されている」とは、検出可能な物質とプローブまたは抗体を結合（すなわち、物理的結合）させることによるプローブまたは抗体の直接的標識、ならびに別の試薬との反応性（すなわち、直接的標識）によるプローブまたは抗体の間接的標識を含むものとする。間接的標識の例としては、蛍光標識二次抗体を用いた一次抗体の検出、およびビオチンによるＤＮＡプローブの末端標識（蛍光標識ストレプトアビジンで検出することができる）が挙げられる。「生体サンプル」とは、対象から単離された組織、細胞、および体液、ならびに対象内にある組織、細胞（好ましくは、脳、骨格筋または膀胱）および体液を含むものとし、すなわち、本検出法はin vitroならびにin vivoの生体サンプルにおいてＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡを検出するために使用可能である。例えば、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ｍＲＮＡの検出のためのin vitro技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびin situハイブリダイゼーションが挙げられる。ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の検出のためのin vitro技術としては、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光が挙げられる。ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ゲノムＤＮＡの検出のためのin vitro技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。さらに、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の検出のためのin vivo技術としては、対象への標識抗ＫＣＮＱ５または抗ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）抗体の導入が含まれる。例えば、抗体を放射性マーカーで標識することができ、対象におけるその存在および位置は標準的な画像技術によって検出することができる。
一実施形態において、生体サンプルは試験対象由来のタンパク質分子を含む。あるいは、生体サンプルは試験対象由来のｍＲＮＡ分子または試験対象由来のゲノムＤＮＡ分子を含み得る。好ましい生体サンプルは、対象から標準的な手段で単離された脳または膀胱サンプルである。
別の実施形態では、これらの方法はさらに、対照とする対象から対照生体サンプルを得ること、その対照サンプルを、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出し得る化合物または薬剤と接触させ、それにより、その生体サンプルにおいてＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在が検出されること、および対照サンプル中のＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を試験サンプル中のＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在と比較することを含む。
一態様はまた、生体サンプルにおいてＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）の存在を検出するためのキットを包含する。例えば、このキットは、生体サンプル中のＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質またはｍＲＮＡを検出し得る標識化合物または薬剤；サンプル中のＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）の量を測定するための手段；およびサンプル中のＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）の量を標準と比較するための手段を含み得る。この化合物または薬剤は好適な容器にパッケーングすることができる。このキットはさらに、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質または核酸を検出するためにこのキットを用いることに関する使用説明書を含み得る。
２．予後アッセイ
本明細書に記載の診断法は、異常なＫＣＮＱ５発現または活性に関連する疾患または障害に罹患しているか、または発症するリスクのある対象を特定するためにさらに利用することができる。例えば、前述の診断アッセイまたは以下のアッセイのような本明細書に記載のアッセイは、ＫＣＮＱ５タンパク質、核酸の発現または活性に付随する障害に罹患しているか、または発症するリスクのある対象を特定するために利用することができる。よって、さらなる態様は、異常なＫＣＮＱ５発現または活性に関連する疾患または障害を特定するための方法を提供し、その方法では、試験サンプルが対象から得られ、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質または核酸（例えばｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）が検出され、この場合、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質または核酸が存在することが異常なＫＣＮＱ５発現または活性に関連する疾患または障害に罹患しているか、または発症するリスクのある対象の特徴である。本明細書において、「試験サンプル」とは、目的の対象から得られる生体サンプルを指す。例えば、試験サンプルは体液（例えば血清）、細胞サンプルまたは組織であり得る。
さらに、本明細書に記載の予後アッセイは、異常なＫＣＮＱ５発現または活性に関連する疾患または障害を治療するための薬剤（例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣薬、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子または他の薬剤候補）を対象に投与することができるかどうかを判定するために用いることができる。よって、別の態様は、異常なＫＣＮＱ５発現または活性に付随する障害のための薬剤で対象を効果的に治療することができるかどうかを判定するための方法を提供し、その方法では、試験サンプルが得られ、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質または核酸の発現または活性が検出される（例えば、この場合、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質または核酸の発現または活性が豊富であることが異常なＫＣＮＱ５発現または活性に付随する障害を治療するための薬剤を投与することができる対象の特徴である）。
前記の方法はＫＣＮＱ５遺伝子における遺伝的変異を検出し、それによって、変異遺伝子を有する対象がＫＣＮＱ５遺伝子に付随する障害のリスクがあるかどうかを判定するためにも使用することができる。好ましい実施形態では、前記方法は、対象に由来する細胞のサンプルにおいて、ＫＣＮＱ５タンパク質をコードする遺伝子の完全性に影響を及ぼす少なくとも１つの変異またはＫＣＮＱ５遺伝子の異所性発現を特徴とする遺伝的変異の存在または不在を検出することを含む。例えば、このような遺伝的変異は、１）ＫＣＮＱ５遺伝子からの１以上のヌクレオチドの欠失；２）ＫＣＮＱ５遺伝子への１以上のヌクレオチドの付加；３）ＫＣＮＱ５遺伝子の１以上のヌクレオチドの置換；４）ＫＣＮＱ５遺伝子の染色体再配列；５）ＫＣＮＱ５遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルにおける変異；６）ＫＣＮＱ５遺伝子の異常な修飾、例えばゲノムＤＮＡのメチル化パターン；７）ＫＣＮＱ５遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在；８）ＫＣＮＱ５タンパク質の非野生型レベル；９）ＫＣＮＱ５遺伝子の対立遺伝子欠失；および１０）ＫＣＮＱ５タンパク質の不適切な翻訳後修飾の少なくとも１つが存在することを確認することによって検出することができる。本明細書に記載のとおり、ＫＣＮＱ５遺伝子における変異を検出するために用いることができる数多くの、当技術分野で公知のアッセイ技術が存在する。好ましい生体サンプルは標準的な手段によって対象から単離された組織サンプル、例えば、脳または膀胱サンプルである。前記検出は、ＫＣＮＱ５ポリヌクレオチドに由来する少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む、少なくとも１つのプローブまたはプライマーを用いて行うことができる。好ましくは、前記ＫＣＮＱ５ポリヌクレオチドはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドの全部または一部をコードし、ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドコードし、またはＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードする。より好ましくは、前記プローブまたはプライマーはヌクレオチド８０８〜８１０を含む、配列番号１に由来する少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む。
ある特定の実施形態では、変異の検出には、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲなどのＰＣＲ（例えば米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号参照）において、あるいは、連結連鎖反応（ＬＣＲ）（例えばLandegren U et al., Science 241:1077-80 (1988); Nakazawa H et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:360-64 (1994)参照）においてプローブ／プライマーを使用することを必要とし、これらのうちの後者はＫＣＮＱ５遺伝子における点突然変異を検出するのに特に有用であり得る（例えば、Abravaya K et al., Nucleic Acids Res. 23:675-82 (1995)参照）。この方法は、患者から細胞サンプルを採取する工程と、該サンプルの細胞から核酸（例えばゲノム性、ｍＲＮＡまたはそれらの両方）を単離する工程と、該核酸サンプルを、ＫＣＮＱ５遺伝子（存在する場合には）のハイブリダイゼーションおよび増幅が起こるような条件下でＫＣＮＱ５遺伝子と特異的にハイブリダイズする１以上のプライマーと接触させる工程と、増幅産物の存在または不在を検出する工程、または増幅産物の大きさを検出し、その長さを対照サンプルと比較する工程とを含み得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書に記載の、突然変異を検出するために用いられる任意の技術とともに予備的増幅工程として用いることが望ましいと思われる。
代替的な増幅方法には、例えば、自律的配列複製(Guatelli JC et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-78 (1990))、転写増幅系(Kwoh DY et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-77 (1989))、Ｑ−βレプリカーゼ(Lizardi PM et al., Biotechnology (N.Y.) 6:1197 (1988))またはその他の任意の核酸増幅法が含まれ、その後に、当業者に周知の技術を用いて増幅された分子の検出を行う。これらの検出スキームは、核酸分子が極めて少数しか存在しない場合、該分子の検出に特に有用である。
代替的な実施形態では、サンプル細胞に由来するＫＣＮＱ５遺伝子における突然変異は、制限酵素切断パターンの変化によって同定することができる。例えば、サンプルＤＮＡおよび対照ＤＮＡを単離し、増幅し（所望により）、１種以上の制限エンドヌクレアーゼで消化し、ゲル電気泳動によって断片長サイズを決定し、比較する。サンプルＤＮＡと対照ＤＮＡとの間の断片長サイズの違いはサンプルＤＮＡにおける突然変異の存在を示す。さらに、配列特異的リボザイムの使用（例えば、米国特許第５，４９８，５３１号参照）を用いて、リボザイム切断部位の発生または消失によって特異的突然変異の存在について評価することができる。
他の実施形態では、ＫＣＮＱ５における遺伝子突然変異は、サンプル核酸および対照核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイとハイブリダイズさせることによって同定することができる(Cronin MT et al., Hum. Mutat. 7: 244-55 (1996); Kozal MJ et al., Nat. Med. 2:753-59 (1996))。例えば、ＫＣＮＱ５における遺伝子突然変異は、Cronin MT et al. （前掲）に記載のとおり、光発生ＤＮＡプローブを含む二次元アレイにおいて同定することができる。簡潔には、プローブの第１のハイブリダイゼーションアレイを、連続重複プローブの線形アレイを作成することによって配列間の塩基変化を同定する目的で、サンプルおよび対照における長いＤＮＡストレッチを走査するために使用することができる。この工程は点突然変異の同定を可能にする。この工程に続いて、検出された全ての変異体または突然変異に相補的なより小規模の特化したプローブアレイを使用することによって特異的突然変異の特徴付けを可能にする第２のハイブリダイゼーションアレイを行う。それぞれの突然変異アレイは、一方が野生型遺伝子に相補的であって、他方が突然変異遺伝子に相補的である並列プローブセットで構成される。
さらに別の実施形態では、当技術分野で公知の種々の配列決定反応のうち任意のものを、ＫＣＮＱ５遺伝子を直接配列決定し、サンプルＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）の配列を対応する野生型（対照）配列と比較することによって突然変異を検出するために用いることができる。配列決定反応の例には、Maxam AM and Gilbert W, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560-64 (1977) or Sanger F et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-67 (1977)によって開発された技術に基づくものが含まれる。診断アッセイ（例えば、Naeve CW et al., Biotechniques 19:448-53 (1995)参照）を行う際には、質量分析による配列決定（例えばＷＯ９４／１６１０１；Cohen AS et al., Adv. Chromatogr. 36:127-62 (1996);およびGriffin HG and Griffin AM, Appl. Biochem. Biotechnol. 38:147-59 (1993)参照）を含む、種々の自動配列決定手順の任意のものを利用することができることも意図される。
ＫＣＮＱ５遺伝子における突然変異を検出するための他の方法には、ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖におけるミスマッチ塩基を検出するために切断剤からの保護が用いられる方法が含まれる(Myers RM et al., Science 230:1242-46 (1985))。一般に、「ミスマッチ切断」の技術は、野生型ＫＣＮＱ５配列を含む（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織サンプルから得られた突然変異している可能性のあるＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせることによって形成されたヘテロ二本鎖を提供することによって開始される。この二本鎖を、対照鎖およびサンプル鎖間の塩基対ミスマッチのために存在することになるような二本鎖の一本鎖領域を切断する薬剤によって処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖は、ＲＮアーゼで処理して、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはＳ１ヌクレアーゼで処理して、ミスマッチ領域を酵素消化することができる。他の実施形態では、ＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖またはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖をヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウム、およびピペリジンで処理して、ミスマッチ領域を消化することができる。ミスマッチ領域の消化後、突然変異部位を決定するために、得られた材料を変性ポリアクリルアミドゲルにより大きさで分離する（例えば、Cotton RGH et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4397-4401 (1988); Saleeba JA and Cotton RGH, Meth. Enzymol. 217:286-95 (1993)参照）。好ましい実施形態では、前記対照ＤＮＡまたはＲＮＡは検出のために標識することができる。さらに別の実施形態では、前記ミスマッチ切断反応で、細胞のサンプルから得られたＫＣＮＱ５における点突然変異を検出し、マッピングするための定義されたシステムにおいて二本鎖ＤＮＡにおけるミスマッチ塩基対を認識する１以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を使用する。例えば、大腸菌のｍｕｔＹ酵素はＧ／ＡミスマッチのＡを切断し、ＨｅＬａ細胞由来のチミジンＤＮＡグリコシラーゼはＧ／ＴミスマッチのＴを切断する(Hsu IC et al., Carcinogenesis 15:1657-62 (1994))。典型的な実施形態によれば、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）配列、例えば、配列番号１に基づくプローブを試験細胞からのｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物とハイブリダイズさせる。この二本鎖をＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理し、切断産物が生じていれば、電気泳動プロトコールなどによって検出することができる（例えば米国特許第５，４５９，０３９号参照）。
他の実施形態では、ＫＣＮＱ５遺伝子における突然変異を同定するために電気泳動移動度の変化が用いられる。例えば、突然変異核酸と野生型核酸との間の電気泳動移動度の違いを検出するために、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）を用いてよい（Orita M et al., Proc Natl. Acad. Sci USA: 86:2766-70 (1989)；Cotton RGH, Mutat. Res. 285:125-44 (1993); Hayashi K, Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79 (1992)も参照）。サンプルＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）核酸および対照ＫＣＮＱ５核酸の一本鎖ＤＮＡ断片は変性させ、再生させることが可能である。一本鎖核酸の二次構造は配列によって異なり；電気泳動移動度に生じた変化から単一塩基の変化の検出も可能になる。前記ＤＮＡ断片は標識プローブで標識または検出してよい。アッセイの感受性は、配列の変化に対する二次構造の感受性がより高いＲＮＡ（ＤＮＡよりむしろ）を用いることによって高め得る。好ましい実施形態では、本方法は、電気泳動移動度の変化に基づいてヘテロ二本鎖分子を分離するためにヘテロ二本鎖分析を利用する(Keen J et al., Trends Genet. 7:5 (1991))。
さらに別の実施形態では、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を用いて、変性剤の勾配を含むポリアクリルアミドゲルにおける突然変異断片または野生型断片の移動をアッセイする(Myers RM et al., Nature 313:495-98 (1985))。分析方法としてＤＧＧＥを用いる場合には、例えばおよそ４０ｂｐの高融点ＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプを付加することによって、確実に、ＰＣＲによってＤＮＡが完全には変性しないようにＤＮＡを修飾する。さらなる実施形態では、対照ＤＮＡおよびサンプルＤＮＡの移動度の違いを確認するために、変性勾配の代わりに温度勾配を用いる(Rosenbaum V and Riesner D, Biophys. Chem. 26:235-46 (1987))。
点突然変異を検出するための他の技術の例には、限定されるものではないが、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長が含まれる。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーを調製してよく、そのオリゴヌクレオチドプライマーでは既知の突然変異を中央に配置し、続いて完全なマッチが認められた場合にのみハイブリダイゼーションを可能にする条件下で標的ＤＮＡとハイブリダイズさせる(Saiki RK et al., Nature 324:163-66 (1986); Saiki RK et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230-34 (1989))。このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション用メンブランに結合し、標識標的ＤＮＡとハイブリダイズさせると、ＰＣＲにより増幅された標的ＤＮＡまたは多数の異なる突然変異とハイブリダイズする。
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術を、開示した組成物および方法とともに用いてもよい。特異的増幅のためのプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、（増幅がディファレンシャルハイブリダイゼーションに依存するように）該分子の中心に(Gibbs RA et al., Nucleic Acids Res. 17:2437-48 (1989))または一方のプライマーの３’末端に目的の突然変異を有していてよく、その場合、適切な条件下では、ミスマッチによりポリメラーゼ伸長が防止または低減され得る(Prosser J, Trends Biotechnol. 11:238-46 (1993))。さらに、切断に基づく検出をもたらすために突然変異の領域に新規制限部位を導入することが望ましい場合もある(Gasparini P et al., Mol. Cell
. Probs 6:1-7 (1992))。ある特定の実施形態では、増幅のためにＴａｑリガーゼを用いて増幅を行ってもよいと考えられる(Barany F, Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:189-93 (1991))。このような場合では、５’配列の３’末端で完全なマッチが存在する場合にのみ連結が起こり、増幅の存在または不在を探すことによって特異的部位での既知の突然変異の存在を検出することが可能になる。
本明細書に記載の方法は、例えば、本明細書に記載の少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含む、予めパッケージングされた診断キットを利用することによって行ってよく、このキットは、例えば、ＫＣＮＱ５遺伝子が関与する疾患または疾病の症状または家族歴を示す患者を診断する臨床設定において便宜に使用し得る。
さらに、ＫＣＮＱ５が発現される任意の細胞種または組織を本明細書に記載の予後アッセイに用いてよい。
ＶＩ．ＫＣＮＱ５変調薬の投与
ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）変調薬は、例えば、第Ｖ章、前掲に記載した状態を治療するためにin vivoでの医薬投与に適した生物学的に適合した形態で対象に投与される。「in vivoでの投与に適した生物学的に適合した形態」とは、タンパク質の治療作用がいかなる毒性作用をも上回っている、投与されるタンパク質の形態を意味する。「対象」とは、免疫応答が引き起こされ得る生物、例えば、哺乳動物を含むものとする。本明細書に記載の薬剤の投与は、治療上活性な量の薬剤単独または医薬上許容される担体と組み合わせて含む任意の薬理学的形態によってよい。
治療組成物の治療上活性な量の投与は、所望の結果を得るのに必要な投与量および期間において量効果があるものとして定義される。例えば、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）変調薬の治療上活性な量は個体の病状、年齢、性別、および体重などの因子、ならびに個体において所望の応答を引き起こすペプチドの能力に応じて異なることがある。最適な治療応答をもたらすように投与計画(Dosage regima)を調整してよい。例えば、１日数回に分けて毎日投与してよく、または治療状況の緊急性によって示されるように比例的に用量を低減してよい。
治療組成物または医薬組成物は、当技術分野で公知の任意の好適な経路（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、経皮的、くも膜下腔内または大脳内を含む）またはex vivo処置プロトコールでの細胞への投与によって投与することができる。投与は、注射によるように急速であってよくまたは緩慢な注入もしくは徐放性処方物の投与によるように長期間にわたってよい。
ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）はまた、所望の製薬学的または薬力学的特性を与える薬剤と連結またはコンジュゲートすることもできる。例えば、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）は、血液脳関門を横断しての浸透または輸送を促進する当技術分野で公知の任意の物質、例えばトランスフェリン受容体に対する抗体とカップリングし、静脈内注射により投与することができる（例えば、Friden PM et al., Science 259:373-77 (1993)参照）。さらに、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）は、溶解度、安定性、半減期、および他の医薬上有利な特性についての所望の特性を得るために、ポリエチレングリコールなどのポリマーと安定的に連結することができる（例えばDavis et al., Enzyme Eng. 4:169-73 (1978); Burnham NL, Am. J. Hosp. Pharm. 51:210-18 (1994)参照）。
さらに、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドは、細胞のサイトゾルへの送達を助ける組成物に含めることができる。例えば、前記ペプチドを、前記ペプチドを細胞のサイトゾルへ送達することができるリポソームなどの担体部分とコンジュゲートしてよい。このような方法は当技術分野で周知である（例えば、Amselem S et al., Chem. Phys. Lipids 64:219-37 (1993)参照）。あるいは、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドを、特異的輸送ペプチドを含むように修飾してもよく、またはＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドを細胞へ送達することができるこのような輸送ペプチドと融合してもよい。さらに、前記ポリペプチドをマイクロインジェクションによって直接細胞へ送達してもよい。
前記組成物は医薬調製物の形態で通常使用される。このような調製物は製剤分野において周知の方法によって作製される。１つの好ましい調製物では生理食塩水のビヒクルを利用するが、他の医薬上許容される担体例えば生理学的濃度の他の無毒の塩、５％グルコース水溶液、滅菌水なども用いてよいものとする。本明細書において、「医薬上許容される担体」とは、あらゆる溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤および吸収遅延薬などを含む。医薬上活性な物質に関するこのような媒質および薬剤の使用は当技術分野で周知である。任意の標準的な媒質または薬剤が前記活性化合物と不適合である場合を除いて、治療組成物におけるその使用が意図される。補助活性化合物もまた、前記組成物に組み込むことができる。好適なバッファーが前記組成物中に含まれていることが望ましい場合もある。このような溶液は、必要に応じて、凍結乾燥し、注射用滅菌水の添加により再構成することができる滅菌アンプルで保存することができる。一次溶媒は水性あるいは非水性であってよい。ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）はまた、処置を必要とする組織に埋め込むことができる固体または半固体の生物学的に適合したマトリックスに組み込むこともできる。
前記担体はまた、前記処方物のｐＨ、浸透圧、粘性、透明度、色、無菌性、安定性、溶解速度または臭気を改変または維持するための他の医薬上許容される賦形剤も含み得る。同様に、前記担体は、放出または血液脳関門を横断しての吸収もしくは浸透を改変または維持するためのさらに他の医薬上許容される賦形剤も含んでよい。このような賦形剤は、単位投与形もしくは複数回投与形のいずれかでの非経口投与用または持続注入もしくは周期的注入による直接注入用の投与量を処方するために通常習慣的に使用される物質である。
用量投与は、投与形の薬物動態パラメーターおよび用いる投与経路によって繰り返すことがある。
また、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドまたはその断片を含むある特定の処方物が経口投与されるということも提供される。このような処方物は、好ましくは、封入され、好適な担体とともに固体投与形に処方される。好適な担体、賦形剤、および希釈剤のいくつかの例には、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアガム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ケイ酸カルシウム、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、ゼラチン、糖蜜、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチルおよびヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、マグネシウム、ステアリン酸塩、水、鉱油などが含まれる。前記処方物は、滑沢剤、湿潤剤、乳化剤および沈殿防止剤、防腐剤、甘味剤または香味剤をさらに含み得る。前記組成物は、当技術分野で周知の手法を使用することによっての患者への投与後に有効成分の急速放出、持続放出または遅延放出をもたらすように処方してもよい。前記処方物はまた、タンパク質分解を減少させる物質および／または例えば、界面活性剤などの吸収を促進する物質も含み得る。
投与を容易にし、投与量を均一にするために、非経口用組成物を投与量単位形に処方することが特に有利である。本明細書において投与量単位形は、治療する哺乳動物対象に関する単位投与量として適した物理的に独立した単位を指し；各単位には必要な医薬担体と関連して所望の治療作用をもたらすように算出された所定量の活性化合物が含まれる。投与量単位形に関する詳細は、（ａ）活性化合物の特有の性質および得られる特定の治療作用ならびに（ｂ）個体における感受性の処置のためのこのような活性化合物の配合分野にある制限によって決定され、直接依存する。具体的な用量は、当業者ならば、例えば患者の近似体重もしくは体表面積または身体空間の占有体積によって容易に算出することができる。この用量は選択した特定投与経路に応じて算出されもする。処置のための近似投与量を決定するのに必要な計算のさらなる微調整が当業者によって通常行われる。当業者ならば必要以上に実験を行うことなく、標的細胞のアッセイ調製物における本明細書において開示した活性に照らしてこのような計算を行うことができる。正確な投与量は、標準的な用量−応答研究を併用して決定される。実際に投与される組成物の量は、治療する１以上の状態；投与する組成物の選択；個々の患者の年齢、体重、および応答；患者の症状の重篤度；ならびに選択された投与経路を含む関連状況に照らして医師によって決定されることは理解されるであろう。
このような化合物の毒性および治療効力は、細胞培養物または実験動物において、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するための、標準的な製薬学的手順によって決定することができる。毒性作用と治療作用との間の用量比が治療係数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。有害な副作用を示す化合物を使用してよいが、このような化合物を罹患組織の部位に向ける送達系を設計する際に、非感染細胞(uninfected cells)に起こり得る損傷を最小限に抑え、それによって、副作用を低減するように注意を払う必要がある。
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトで使用するための投与量の範囲を計画するために用いることができる。このような化合物の投与量は、ほとんどまたは全く毒性のない、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、使用する投与形および用いる投与経路に応じてこの範囲内で変更してよい。本明細書において開示した方法において使用するいかなる化合物においても、治療上有効な用量は細胞培養アッセイから最初に推定することができる。用量は、細胞培養物において決定されるようなＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の５０％を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて計画し得る。このような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定し得る。
一実施形態において、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドは、患者に、生物学的に活性な形態のＫＣＮＱ５もしくはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）またはＫＣＮＱ５もしくはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）の前駆体、すなわち、体内ですぐに生物学的活性形態のＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）へと変換され得る分子を産生することができるベクターまたは細胞を埋め込むことによって治療上投与され得る。
１つのアプローチでは、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）を分泌する細胞を患者への埋め込みのために半透膜内に封入し得る。前記細胞はＫＣＮＱ５もしくはその前駆体を正常に発現する細胞であり得、または前記細胞はＫＣＮＱ５もしくはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）もしくはその生物学的に活性な断片もしくはその前駆体を発現するように形質転換し得る。前記細胞はヒト起源のものであることことが好ましい。しかしながら、本明細書における処方物および方法は、ヒトへの適用だけでなく獣医学的適用にも用いることができ、本明細書において「患者」または「対象」とは、ヒト患者および獣医学的患者を含むものとする。
薬剤（例えば薬物または化合物）がＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の発現または活性に及ぼす影響のモニタリングは、基本的な薬物スクリーニングにおいてだけでなく、臨床試験においても適用することができる。例えば、ＫＣＮＱ５遺伝子発現、タンパク質レベルの低下またはＫＣＮＱ５活性のダウンレギュレーションを示す対象の臨床試験において、本明細書に記載のスクリーニングアッセイによってＫＣＮＱ５遺伝子発現、タンパク質レベルを上昇させるまたはＫＣＮＱ５活性をアップレギュレートすると決定される薬剤の有効性をモニタリングすることができる。あるいは、ＫＣＮＱ５遺伝子発現、タンパク質レベルの上昇またはＫＣＮＱ５活性のアップレギュレーションを示す対象の臨床試験において、スクリーニングアッセイによってＫＣＮＱ５遺伝子発現、タンパク質レベルを低下させるまたはＫＣＮＱ５活性をダウンレギュレートすると決定される薬剤の有効性をモニタリングすることができる。このような臨床試験では、ＫＣＮＱ５遺伝子と、好ましくは、障害に関係していた他の遺伝子の発現または活性を、特定の細胞の表現型の「リードアウト」またはマーカーとして用いることができる。
例えば、限定されるものではないが、ＫＣＮＱ５をはじめとする、（例えば本明細書に記載のとおりスクリーニングアッセイによって確認された）ＫＣＮＱ５活性を変調する薬剤（例えば化合物、薬物または小分子）での処置によって細胞において変調される遺伝子を同定することができる。よって、ＫＣＮＱ５関連障害への薬剤の作用を、例えば、臨床試験において研究するために、細胞を単離し、ＲＮＡを調製し、ＫＣＮＱ５関連障害に関係しているＫＣＮＱ５および他の遺伝子それぞれの発現レベルについて解析することができる。遺伝子発現のレベル（すなわち、遺伝子発現パターン）は、本明細書に記載のとおりノーザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲによって、あるいは産生したタンパク質の量を測定することによって、本明細書に記載の方法のうちの１つによって、またはＫＣＮＱ５もしくは他の遺伝子の活性レベルを測定することによって定量することができる。このように、遺伝子発現パターンは、薬剤に対する細胞の生理学的応答を示すマーカーとしての機能を果たし得る。従って、この応答状態は、薬剤での個体の処置前、および処置中の様々な時点で判定され得る。
好ましい実施形態は、薬剤（例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣薬、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子または本明細書に記載のスクリーニングアッセイによって同定された他の薬物候補）での対象の処置の有効性をモニタリングするための方法を提供し、その方法は、（ｉ）薬剤の投与前に対象に由来する投与前サンプルを得る工程と；（ｉｉ）該投与前サンプルにおいてＫＣＮＱ５もしくはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出する工程と；（ｉｉｉ）該対象から１以上の投与後サンプルを得る工程と；（ｉｖ）該投与後サンプルにおいてＫＣＮＱ５もしくはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを検出する工程と；（ｖ）該投与前サンプルにおけるＫＣＮＱ５もしくはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを、１以上の該投与後サンプルにおけるＫＣＮＱ５もしくはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡと比較する工程と；（ｖｉ）それに応じて該対象への該薬剤の投与を変更する工程とを含む。例えば、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）の発現または活性を検出されたレベルよりも高いレベルまで上昇させるため、すなわち、前記薬剤の有効性を高めるためには、前記薬剤の投与の増加が望ましいかもしれない。また、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）の発現または活性を検出されたレベルよりも低いレベルまで低下させるため、すなわち、前記薬剤の有効性を低下させるためには、前記薬剤の投与の減少が望ましいかもしれない。このような実施形態によれば、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）の発現または活性は、観察可能な表現型応答の不在下でさえも薬剤の有効性の指標として用い得る。
好ましい実施形態では、例えば、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）の発現および／または活性の変調によって利益を得るであろう対象において第Ｖ章（前掲）に記載した状態を変調するＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）変調薬の能力を、該薬剤の投与後に患者の状態の改善を検出することによって測定することができる。当業者ならば患者の特定の状態に適した指標を用いてこのような改善を容易に測定することができる。生検材料採取の患者に対する危険性および／または損害が高い状況では、患者の状態の変化を測定することによって患者の応答をモニタリングすることが好ましい。
ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）のレベルは種々の状態によって変化する可能性があり、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）レベルの定量によって臨床的に有用な情報がもたらされると思われる。
さらに、病状の処置において、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）を含む組成物を体外から投与することができ、血清において、任意の所望の組織コンパートメントにおいて、または罹患組織においてＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのある特定の目標レベルを実現することが望ましいであろう。それゆえ、患者においてまたは患者から得られた組織生検サンプルを含む生体サンプルにおいてＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのレベルをモニタリングし得ること、場合によっては、天然ＫＣＮＱ５のレベルをモニタリングすることも有利であろう。従って、別の態様では、患者に由来するサンプルにおいてＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）の存在を検出するための方法を提供する。
ＶＩＩ．本発明のキット
別の態様は、スクリーニングアッセイ、変調法、または診断アッセイを実施するためのキットに関する。例えば、スクリーニングアッセイを実施するためのキットは、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドを含む細胞と、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチド活性を決定するための手段と、所望により、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）活性のモジュレーターを同定するためのキットの使用説明書とを含み得る。もう１つの実施形態では、スクリーニングアッセイを実施するためのキットは、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドを含む組成物と、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）活性を決定するための手段と、所望により、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）活性のモジュレーターを同定するためのキットの使用説明書とを含み得る。
別の実施形態は、変調法を実施するためのキットを提供する。このキットは、例えば、好適な担体中の、好適な容器に、所望により、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）活性を変調するためのモジュレーターの使用説明書とともにパッケージングされる変調薬（例えばＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）阻害薬または刺激薬）を含み得る。
別の態様は、対象における異常なＫＣＮＱ５発現および／または活性に付随する障害を診断するためのキットに関する。このキットは、ＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）の発現を判定するための試薬（例えばＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ｍＲＮＡの検出のための核酸プローブあるいはＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）タンパク質の検出のための１以上の抗体）と、対象の結果を比較する対照と、所望により、診断用キットの使用説明書とを含み得る。
本明細書において開示した方法の実施では、特に断りのない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の標準的な技術を使用し、そのような技術は当技術分野の技術の範囲内である。このような技術は文献において十分に説明されている。例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); U.S. Patent No. 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)参照。
本明細書における開示内容を次の実施例においてさらに定義する。これらの実施例では、好ましい実施形態を示しているが、これらの実施例は単に例示するために記載されているということは理解すべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は好ましい特徴を確認することができ、その精神および範囲を逸脱することなく、様々な用途および条件に適合させるために様々な変更および修飾を加えることができる。
一般的手順
ＫＣＮＱ５およびＫＣＮＱ１チャネルのアフリカツメガエル卵母細胞への発現−ヒトＫＣＮＱ５およびＫＣＮＱ１遺伝子を、卵母細胞発現用に特別に操作されたｐＫＳＭベクターにクローニングした。これらの遺伝子配列はＤＮＡ塩基配列決定法によって確認された。ｇｅｎｅ ｂａｎｋ受託番号は：ＫＣＮＱ５、ＮＭ＿０１９８４２（配列番号３）；ＫＣＮＱ１、Ｕ８９３６４．１（配列番号７）である。これらの構築物をＸｂａＩ制限酵素(NEB, Beverly, MA)によって線状化した。in vitro転写はｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標）キット(Ambion, Austin, TX)を使用して行い、ｃＲＮＡをフェノール抽出によって精製した。アフリカツメガエル卵母細胞にはＤｒｕｍｏｎｄ Ｎａｎｏｊｅｔ卵母細胞注入装置(a Drumond Nanoject oocyte injector)(Drummond Scientific Co., Broomall, PA)を使用しておよそ９．２ｎｇ ｃＲＮＡを含有する４６ｎｌ溶液を注入した。注射の３〜７日後に電気生理学的記録を行った。
電気生理学−全ての試験を室温（２２〜２３℃）で従来の卵母細胞双極電圧クランプ記録（ＴＥＶＣ）を用いて行った。記録用電極を、Sutter社製Ｐ−９７ピペットプラー(Sutter Instrument, Novato, CA)を使用して１．５ｍｍガラスピペットから引き出し、３Ｍ ＫＣｌを充填した。そのピペット先端を慎重に折り取って、０．５〜１Ｍオームの電極抵抗を得た。Dagan社製ＣＡ−１増幅器(Dagan Corporation, Minneapolis MN)を使用し、保持電位を−１００ｍＶに固定した。チャネル活性化の電位依存を試験するために、一連の脱分極電位パルスを印加した。レチガビンの作用の経時的推移を観察するために、４０ｍＶの単一（３秒）電位パルスを１５秒間隔で繰り返し印加した。Ｐｕｌｓｅ ８．５ソフトウエアのHEKA社製コンピューターインターフェース(HEKA Elektronik, Lambrecht, Germany)を使用して、増幅器を制御し、分析用データをデジタル化した。
溶液および薬品−卵母細胞のインキュベーションおよび記録のために、（単位ｍＭ）ＮａＣｌ、９６、ＫＣｌ、２、ＣａＣｌ２、１．８、ＭｇＣｌ２、１、ＨＥＰＥＳ、１０を含有するＮＤ９６溶液を使用した。レチガビンをＤＭＳＯ中５０ｍＭの保存溶液として作製し、試験に使用する直前に所望の濃度に希釈した。ＫＣＮＱ５チャネルについてＤＭＳＯを試験し、１％まで作用は認められなかった。全ての試験において、０．４％未満のＤＭＳＯを使用した。
高速浴灌流システム(ALA Scientific Instruments, Westbury, NY)によって細胞に化合物を適用し、浴溶液交換は１０秒以内に終えた。
データ分析−電流振幅を、HEKA社製Ｐｕｌｓｅｆｉｔ ８．５ソフトウエアを使用してオンラインで測定した。巨視的電流からチャネルコンダクタンスを得るために、Ｋ＋逆転電位がＮＤ９６溶液中で−８０ｍＶであるように近づけ、次の式を適用した：Ｇ＝Ｉ／（Ｖ＋８０）、式中、Ｇは全卵母細胞コンダクタンスであり、Ｉは全卵母細胞電流であり、Ｖは電流の誘導に使用した電位である。データを平均±ＳＥとして表し、対応のあるスチューデントｔ検定を行った。差はＰ＜０．０５において有意であると考えられた。
実施例１
ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６領域を含むＫＣＮＱ５ポリヌクレオチド（配列番号６をコードする、配列番号８のアミノ酸Ｓ２５３−Ｖ３５５）を作製するために、ＫＣＮＱ１遺伝子のＳ５−Ｓ６領域にフランキングする１対のオリゴプライマーを使用して、ＫＣＮＱ１由来のＤＮＡ断片を得た。両方のプライマーは、Ｓ５の上流およびＳ６の下流の対応するジャンクション領域においてＫＣＮＱ５遺伝子配列を重複する各末端に導入ＤＮＡ配列を含む。これらのプライマーと、鋳型としてＫＣＮＱ１構築物を使用したＰＣＲ産物を精製し、鋳型としてＫＣＮＱ５構築物を使用する２回目のＰＣＲのために部位特異的突然変異誘発プライマーとして使用した。次いで、QuickChangeプロトコールを用いた部位特異的突然変異誘発を適用した(Stratagene, La Jolla, CA)。全ての突然変異をＤＮＡ塩基配列決定法によって確認した。
機能的キメラ（ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５）へのレチガビンの作用を試験した。図１Ａおよび図１Ｂにて示されるように、５０μＭレチガビンはもはやチャネル活性を増大しなかった。５分の適用期間中、電流振幅も電位依存性活性化も大きく変化しなかった（図１Ｃ）。このキメラチャネルへのレチガビン作用の劇的な崩壊により、ＫＣＮＱ５におけるレチガビンの作用部位がＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインの領域に位置する可能性が最も高いことが示唆された。
実施例２
レチガビンの作用部位をさらに詳細に分析するために、ＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを二つの部分、Ｓ５トランスメンブランドメインおよびＳ６トランスメンブランドメイン（リンカーを含む）に分け、それらの対応するＫＣＮＱ５キメラチャネルにＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインまたはＳ６トランスメンブランドメインを含めた。スワップされたＳ６トランスメンブランドメインを含むキメラチャネルは−１００〜１００ｍＶの膜電位において電流を示さなかった。ＫＣＮＱ１由来のＳ５ドメインを含むもう一方のキメラは極めて独特な活性化特性を有する外向き整流として機能した。図２Ａ、左のパネルにて示されるように、この突然変異体は膜電位が２０ｍＶより高い場合に不活性化するように思われる。チャネルを膜脱分極によって活性化させた場合には、一過性外向き電流（１５０〜２００ｍ秒）が可視化され、チャネル活性化がはっきりと一様に二成分となった。膜電位が２０ｍＶより低い場合には、チャネル活性化パターンは野生型に類似しており、はっきりとした不活性化は認められなかった。
次に、ＫＣＮＱ１由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５へのレチガビンの作用を試験した。定常電流の振幅を最大レベルで安定させたＫＣＮＱ１発現卵母細胞由来のＳ５トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５にレチガビンを適用した。図２Ｂにて示されるように、５０μＭレチガビンはもはやこの突然変異体に作用しなかった。浴適用５分で、４０ｍＶへの脱分極によって誘導されたチャネル電流は一定であった。図２Ｃはレチガビン処置前後のＩ〜Ｖ曲線を示している。電流振幅も電流の電位依存もレチガビンによって修飾されなかった（図２Ａの右のパネル、図２Ｃ）。この発見はレチガビン作用の分子依存性がＳ５ドメイン内に存することを示している。
実施例３
５種のＫＣＮＱメンバー全てのＳ５ドメインは、レチガビンに対するＫＣＮＱ１の無応答の主な原因となった可能性がある独特のアミノ酸残基に関してアライメントし、検索した配列であった。図３、上のパネルにて示されるように、ＫＣＮＱ１とＫＣＮＱ５との間に１０個の不適合残基が存在する。図３で強調した、それらのうちの７個はＫＣＮＱ１に独特であり得る。そのため、ＫＣＮＱ５における突然変異は、ＫＣＮＱ１における対応物に対して個々に修飾される７個の残基のそれぞれについて起こした。１つの突然変異体、ＫＣＮＱ５（Ｆ２８２Ｙ）は、卵母細胞で発現されるときにその機能性を失った。その他の６つの突然変異体は機能的であり、試験範囲の膜電位において十分なレベルの電流を示した。次に、これらの突然変異体の各々へのレチガビンの作用を試験した。図３の下のパネルにて示されるように、２つの突然変異体、ＫＣＮＱ５（Ａ２６９Ｔ）およびＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）（配列番号１、配列番号２をコードする）はレチガビンに対して著しく低い応答を示した。実施例２におけるＳ５ドメインスワップ突然変異体と同様に、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）はレチガビンに対する応答を完全に失い、このトリプトファン残基がレチガビンの作用に重要であることを示唆する。
実施例４
Ｓ５におけるこの特定のトリプトファン残基へのレチガビン作用の機能的依存をさらに調査するために、ＫＣＮＱ１のＳ５ドメインにおける対応する残基の逆突然変異を起こし、この突然変異がレチガビンによって活性化され得るＫＣＮＱ１をもたらす可能性があると推測した。驚くべきことに、この突然変異体、ＫＣＮＱ１（Ｌ１７１Ｗ）は、実際にはレチガビン感受性となった。しかしながら、ＫＣＮＱ１（Ｌ１７１Ｗ）は、活性化される代わりに、レチガビンによって遮断された。図４Ａにて示されるように、野生型ＫＣＮＱ１チャネルは５０μＭレチガビンに対してわずかな応答を示したが、２００μＭレチガビンに対して若干の阻害応答を示した。対照的に、５０μＭレチガビンはＫＣＮＱ１（Ｌ１７１Ｗ）の定常状態の電流振幅を明らかに減少させ、２００μＭレチガビンは８０ｍＶにおいて定常電流を６２．５％阻害した（図４Ｂ）。おそらく、レチガビンによって誘導された最も大きな変化はチャネル活性化に対するものであったであろう。図４Ｃにて示されるように、レチガビンは８０ｍＶで誘発される電流の活性化速度論を単一指数関数的活性化経時的推移から二重指数関数的活性化経時的推移に修飾し、これは不活性化速度論の修飾によって説明することができる。レチガビンは、ＫＣＮＱ１（Ｌ１７１Ｗ）の定常電流レベルを低下させただけでなく、チャネル活性化の電位依存を修飾もした（図４Ｄおよびその挿入図）。レチガビンに対する高度に増強された感受性は、レチガビン分子がＫＣＮＱ５またはＫＣＮＱ１（Ｌ１７１Ｗ）のＳ５ドメインにおけるトリプトファン残基に接近することができ、その結果として、電位依存性活性化のアップまたはダウンレギュレーションが起こることを強く示唆する。
実施例１〜４は、ＫＣＮＱ５チャンネル開閉におけるＳ５ヘリックスの重要性を強調し、ＫＣＮＱカリウムチャネルへのレチガビンの作用についての分子的解釈を与える。
（Ａ）５０μＭレチガビンの不在下（左のパネル）および存在下（右のパネル）での、−１００から６０ｍＶまで増分１０ｍＶ（保持電圧は−１００ｍＶ）の一連の脱分極電圧パルスによって誘発されたＱ５Ｑ１Ｐの電流トレース。（Ｂ）Ｑ５Ｑ１Ｐ突然変異体に対するレチガビン作用の経時的推移。（Ｃ）５０μＭレチガビンの不在下（ｎ＝９）および存在下（ｎ＝７、適用５分後）での、Ｑ５Ｑ１Ｐ突然変異体の電流（Ｉ）−電圧関係。各データ点のいずれにも有意差は見られない（ｐ＞０．０５）。 （Ａ）５０μＭレチガビンの不在下（左のパネル）および存在下（右のパネル）での、−１００から６０ｍＶまで増分１０ｍＶ（保持電圧は−１００ｍＶ）の一連の脱分極電圧パルスによって誘発されたＱ５Ｑ１Ｓ５の電流トレース。（Ｂ）Ｑ５Ｑ１Ｐ突然変異体に対するレチガビン作用の経時的推移。（Ｃ）５０μＭレチガビンの不在下（ｎ＝７）および存在下（ｎ＝７）での、Ｑ５Ｑ１Ｓ５突然変異体の電流（Ｉ）−電圧関係。各データ点のいずれにも有意差は見られない（ｐ＞０．０５）。 ＫＣＮＱ５におけるＳ５ドメインの突然変異誘発分析。ＫＣＮＱファミリーの５つのメンバー全ての配列アラインメントを上に示す。ＫＣＮＱ１と他のメンバーの間で最も多様性の高い残基を太字で強調し、ＫＣＮＱ５の対応する残基をそれぞれＫＣＮＱ１のそれらの対応物に突然変異させた。その後、単一の突然変異を有する各突然変異体を５０μＭレチガビンで試験し、電流振幅の保持増分（ＩA／Ｉ０）を下のグラフにプロットした。全ての突然変異体で、ｎは６に相当する。 （Ａ）レチガビンの不在下（対照）ならびに５０μＭおよび２００μＭレチガビンの存在下でＫＣＮＱ１野生型から記録した電流トレース。（Ｂ）レチガビンの不在下（対照）ならびに５０μＭおよび２００μＭレチガビンの存在下でＫＣＮＱ１ Ｌ１７１Ｗから記録した電流トレース。（Ｃ）レチガビンの不在下（対照）ならびに５０μＭおよび２００μＭレチガビンの存在下でＫＣＮＱ１ Ｌ１７１Ｗから、８０ｍＶまでの電圧パルスにより誘発された多重電流トレース。（Ｄ）レチガビンの不在下（○）ならびに５０μＭ（□）および２００μＭ（△）レチガビンの存在でのＫＣＮＱ１ Ｌ１７１Ｗの電流−電位関係。−１００から８０ｍＶまで増分１０ｍＶの一連の脱分極電圧パルスによって誘発された定常状態の電流振幅を、対照群において膜電位８０ｍＶによって誘発されたレベルに対してノーマライズした。保持電位は−１００ｍＶであった。各群１０個の卵母細胞からデータを取った。レチガビンの不在下（○）および２００μＭレチガビンの存在下（△）において８０ｍＶレベル（Ｇｍａｘ）に対してノーマライズされたチャネルコンダクタンス（Ｇ）を、チャネル活性化の電位依存性に対するレチガビンの作用と比較して示す。

Claims (100)

  1. ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドの全部または一部をコードする単離されたポリヌクレオチド。
  2. （ａ）配列番号１を含む核酸配列；
    （ｂ）配列番号２をコードするポリヌクレオチド；
    （ｃ）配列番号１と少なくとも約９５％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸配列（ただし、ヌクレオチド８０８〜８１０における置換は、アミノ酸ロイシンの保存的置換をもたらすコドンに対するものである）；
    （ｄ）高ストリンジェント条件下で配列番号１とハイブリダイズし得る核酸分子；
    （ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に相補的な核酸分子；および
    （ｆ）配列番号１の変異体
    からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチド。
  3. 単離されたポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１または２記載の単離されたポリヌクレオチド。
  4. 単離されたポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１または２記載の単離されたポリヌクレオチド。
  5. 請求項２に記載の単離されたポリヌクレオチドのセンス配列の少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７５、１００、２００、３００、４００、６００または７００個の連続するヌクレオチドを含み、かつ配列番号１のヌクレオチド８０８−８１０を含む、単離されたポリヌクレオチド断片。
  6. 請求項５に記載の単離されたポリヌクレオチド断片を含む、プライマーまたはプローブ。
  7. （ｄ）の核酸分子を以下の条件下：６ｘＳＳＣ、４５℃で配列番号１とハイブリダイズさせ、０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃で少なくとも１回洗浄される、請求項２記載の単離されたポリヌクレオチド。
  8. （ｄ）の核酸分子を以下の条件下：６ｘＳＳＣ、４５℃で配列番号１とハイブリダイズさせ、０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５５℃で少なくとも１回洗浄される、請求項７記載の単離されたポリヌクレオチド。
  9. （ｄ）の核酸分子を以下の条件下：６ｘＳＳＣ、４５℃で配列番号１とハイブリダイズさせ、０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で少なくとも１回洗浄される、請求項８記載の単離されたポリヌクレオチド。
  10. 請求項２に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  11. ベクターがプラスミドである、請求項１０記載のベクター。
  12. ベクターが発現ベクターである、請求項１０記載のベクター。
  13. 請求項１０−１２のいずれか一項に記載のベクターで形質転換される宿主細胞。
  14. 原核細胞である、請求項１３記載の宿主細胞。
  15. 原核細胞がエシェリヒア・コリ細胞である、請求項１４記載の宿主細胞。
  16. 真核細胞である、請求項１３記載の宿主細胞。
  17. 真核細胞が昆虫細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞またはアフリカツメガエル卵母細胞である、請求項１６記載の宿主細胞。
  18. 請求項２に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むヒト以外のトランスジェニック動物。
  19. 請求項２に記載の単離されたポリヌクレオチドに対してアンチセンスである、単離されたアンチセンスポリヌクレオチド。
  20. アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたはｓｉＲＮＡである、請求項１９記載の単離されたアンチセンスポリヌクレオチド。
  21. ＫＣＮＱ１から由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
  22. Ｓ５−Ｓ６トランスメンブランドメインがヒトＫＣＮＱ１から由来する、請求項２１記載の単離されたポリヌクレオチド。
  23. （ａ）配列番号３を含む核酸配列であって、ヌクレオチド７６９〜１０６２が配列番号５で置換されている、核酸配列；
    （ｂ）配列番号４をコードするポリヌクレオチドであって、アミノ酸２５７〜３５４がＫＣＮＱ１由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインで置換されている、ポリヌクレオチド；
    （ｃ）高ストリンジェント条件下で（ａ）または（ｂ）の核酸配列とハイブリダイズする能力を有する核酸分子；および
    （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に相補的な核酸分子
    からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチド。
  24. （ｂ）のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインが配列番号６である、請求項２３記載の単離されたポリヌクレオチド。
  25. ＫＣＮＱ１から由来のＳ５トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
  26. Ｓ５トランスメンブランドメインがヒトＫＣＮＱ１から由来する、請求項２５記載の単離されたポリヌクレオチド。
  27. （ａ）ヌクレオチド７６９〜８７３が配列番号５のヌクレオチド１〜１０５で置換されている、配列番号３を含む核酸配列；
    （ｂ）配列番号４のアミノ酸２５７〜２９１がＫＣＮＱ１から由来のＳ５トランスメンブランドメインで置換されている、配列番号４をコードするポリヌクレオチド；
    （ｃ）高ストリンジェント条件下で（ａ）または（ｂ）の核酸配列とハイブリダイズする能力を有する核酸分子；および
    （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に相補的な核酸分子
    からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチド。
  28. （ｂ）のＳ５トランスメンブランドメインが配列番号６のアミノ酸１〜３５である、請求項２７記載の単離されたポリヌクレオチド。
  29. （ａ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列；
    （ｂ）配列番号２を含むアミノ酸配列；
    （ｃ）（ａ）の変異体；および
    （ｄ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列（ただし、アミノ酸２７０における置換はアミノ酸ロイシンに対する保存的置換である）
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
  30. 第２の非ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドに作動可能なように連結されている請求項２９に記載の単離されたポリペプチドからなる第１のポリペプチドを含む、融合タンパク質。
  31. 請求項３０に記載の融合タンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
  32. 少なくとも一つのペプチド結合が、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、シス−ＣＨ＝ＣＨ−、トランス−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、およびＣＨ２ＳＯ−からなる群より選択される結合によって置換されている、請求項２９に記載の単離されたポリペプチドを含む、ペプチドミメティクス。
  33. 請求項２９に記載の単離されたポリペプチドの少なくとも８個の連続したアミノ酸を含む単離されたペプチド断片であって、該断片が配列番号２のアミノ酸２７０を含む、単離されたペプチド断片。
  34. 請求項２９に記載の単離されたポリペプチドの少なくとも１０個の連続したアミノ酸を含む単離されたペプチド断片であって、該断片が配列番号２のアミノ酸２７０を含む、単離されたペプチド断片。
  35. 請求項２９に記載の単離されたポリペプチドの少なくとも１５個の連続したアミノ酸を含む単離されたペプチド断片であって、該断片が配列番号２のアミノ酸２７０を含む、単離されたペプチド断片。
  36. 請求項２９に記載の単離されたポリペプチドの少なくとも２０個の連続したアミノ酸を含む単離されたペプチド断片であって、該断片が配列番号２のアミノ酸２７０を含む、単離されたペプチド断片。
  37. 請求項２９に記載の単離されたポリペプチドの少なくとも３０個の連続したアミノ酸を含む単離されたペプチド断片であって、該断片が配列番号２のアミノ酸２７０を含む、単離されたペプチド断片。
  38. 配列番号２を含むＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドに特異的に結合する、抗体。
  39. 抗体がモノクローナル抗体である、請求項３８記載の抗体。
  40. 抗体がポリクローナル抗体である、請求項３８記載の抗体。
  41. 配列番号２から由来の少なくとも８個の連続したアミノ酸を含むＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチド断片に特異的に結合する抗体であって、該断片が配列番号２のアミノ酸２７０を含む、抗体。
  42. ＫＣＮＱ１から由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含有する、単離されたＫＣＮＱ５ポリペプチド。
  43. Ｓ５−Ｓ６トランスメンブランドメインがヒトＫＣＮＱ１から由来する、請求項４２記載の単離されたＫＣＮＱ５ポリペプチド。
  44. ＫＣＮＱ５ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸２５７−３５４がＫＣＮＱ１から由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインで置換されている配列番号４を含む、請求項４２記載の単離されたＫＣＮＱ５ポリペプチド。
  45. 配列番号４のアミノ酸２５７−３５４が配列番号６で置換されている、請求項４４記載の単離されたＫＣＮＱ５ポリペプチド。
  46. ＫＣＮＱ１から由来のＳ５トランスメンブランドメインを含有する、単離されたＫＣＮＱ５ポリペプチド。
  47. Ｓ５トランスメンブランドメインがヒトＫＣＮＱ１から由来する、請求項４６記載の単離されたＫＣＮＱ５ポリペプチド。
  48. ＫＣＮＱ５ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸２５７−２９１がＫＣＮＱ１から由来のＳ５トランスメンブランドメインで置換されている配列番号４を含む、請求項４６記載の単離されたＫＣＮＱ５ポリペプチド。
  49. 配列番号４のアミノ酸２５７−２９１が配列番号６のアミノ酸１−３５で置換されている、請求項４８記載の単離されたＫＣＮＱ５ポリペプチド。
  50. 請求項２９、４２または４６の単離されたポリペプチドである、少なくとも１個のＫＣＮＱ５サブユニットを含む、ＫＣＮＱ二量体チャネル。
  51. チャネルサブユニットが共に請求項２９、４２または４６の単離されたポリペプチドである、請求項５０記載のＫＣＮＱ二量体チャネル。
  52. 一のサブユニットがＫＣＮＱ３である、請求項５０記載のＫＣＮＱ二量体チャネル。
  53. ＫＣＮＱ３サブユニットがヒトＫＣＮＱ３である、請求項５２記載のＫＣＮＱ二量体チャネル。
  54. 請求項２９、４２または４６の単離されたポリペプチドである、少なくとも１個のＫＣＮＱ５サブユニットを含む、ＫＣＮＱ四量体チャネル。
  55. ４チャネルサブユニットの２つが請求項２９、４２または４６の単離されたポリペプチドである、請求項５４記載のＫＣＮＱ四量体チャネル。
  56. ４チャネルサブユニットの３つが請求項２９、４２または４６の単離されたポリペプチドである、請求項５５記載のＫＣＮＱ四量体チャネル。
  57. チャネルサブユニットの４つすべてが請求項２９、４２または４６の単離されたポリペプチドである、請求項５６記載のＫＣＮＱ四量体チャネル。
  58. 少なくとも１つのサブユニットがＫＣＮＱ３である、請求項５４記載のＫＣＮＱ四量体チャネル。
  59. ＫＣＮＱ３サブユニットがヒトＫＣＮＱ３である、請求項５８記載のＫＣＮＱ四量体チャネル。
  60. 薬剤のスクリーニング方法であって、
    （ａ）薬剤と、
    （ｉ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドの全部または一部をコードするポリヌクレオチド；
    （ｉｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    （ｉｉｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    （ｉｖ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
    （ｖ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチド；および
    （ｖｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチド
    からなる群から選択されるＫＣＮＱ５分子とを接触させること；および
    （ｂ）該薬剤のＫＣＮＱ５活性に対する作用を検出すること
    を含み、ここでＫＣＮＱ５活性の低下または増強の検出が、薬剤がＫＣＮＱ５のモジュレーターであることを示す、方法。
  61. ＫＣＮＱ５活性がニューロンの興奮性を低下させるか、膀胱平滑筋を鎮静化する、請求項６０記載の方法。
  62. ＫＣＮＱ５活性がＫＣＮＱ５チャネルのイオン電流の大きさを電気生理学的に測定することで検出される、請求項６０記載の方法。
  63. 無細胞アッセイによりなされる、請求項６０記載の方法。
  64. 薬剤のスクリーニング方法であり、
    （ａ）細胞と薬剤を接触させること；および
    （ｂ）（ｉ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドの全部または一部をコードするポリヌクレオチド；
    （ｉｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    （ｉｉｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    （ｉｖ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
    （ｖ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチド；および
    （ｖｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチド
    からなる群から選択されるＫＣＮＱ５分子の発現レベルを測定すること
    を含み、
    ここで、ＫＣＮＱ５発現の低下または増強の検出が、薬剤がＫＣＮＱ５のモジュレーターであることを示す、方法。
  65. 請求項６０−６４に記載のいずれかの方法により同定される薬剤。
  66. 薬剤がレチガビン類似体である、請求項６５記載の薬剤。
  67. 式：
    Figure 2009525024
     ［式中、
    Ｒ１は、水素、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ２−Ｃ６−アルカノイルまたはＡｒ基から選択され；
    Ｒ２は、水素またはＣ１−Ｃ６−アルキルから選択され；
    Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ、ＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６−アルキルアミノ、Ｃ１−Ｃ６−ジアルキルアミノ、Ａｒ基により置換されたアミノ、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ２−Ｃ６−アルケニル、Ｃ２−Ｃ６−アルキニル、Ａｒ基またはＡｒＯ−基から選択され；
    Ｒ４は、水素、Ｃ１−Ｃ６−アルキルまたはＡｒ基から選択され；
    Ｒ５は、水素またはＣ１−Ｃ６−アルキルまたはＡｒ基から選択される；
    Ａｌｋは、Ａｒ基により置換されていてもよい１〜９個の炭素原子を有する直鎖または分枝アルキレン基であり；
    Ａｒは、基Ｒ６、Ｒ７および／またはＲ８で置換されているフェニル基であり、これらの基Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は同一であるか、または異なり、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ３−Ｃ７−シクロアルキル、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ、Ｃ２−Ｃ６−アルカノイルオキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ６−ハロゲノアルキル、−ＣＮ、−ＮＨ２、−ＮＨ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ６−アルキル）２、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル、−ＣＯ−Ｏ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル、−ＣＯＡｒ、−ＣＯ−ＯＡｒ、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル、−ＣＯＮ（Ｃ１−Ｃ６−アルキル）２、−ＣＯＮＨＡｒ、−ＮＨ−ＣＯ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル、−ＮＨＣＯ−Ａｒ、−ＮＨＣＯ−Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ、−Ｎ−Ｈ−ＣＯ−Ａｒ、−ＮＨＣＯ−ＮＨ２、−ＮＨＣＯ−Ｎ（−Ｃ１−Ｃ６−アルキル）２、−ＮＨＣＯ−ＮＨＡｒ、−ＮＨ−ＳＯ２−Ｃ１−Ｃ６−アルキル、−ＮＨ−ＳＯ２Ａｒ、−ＮＨ−ＳＯ２−ニトロフェニル、−ＳＯ２−ＯＨ、−ＳＯ２−Ｃ１−Ｃ６−アルキル、−ＳＯ２−Ａｒ、−ＳＯ２−Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ、−ＳＯ２−ＯＡｒ、−Ｏ２−ＮＨ２、−ＳＯ２−ＮＨ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル、−ＳＯ２−Ｎ（Ｃ１−Ｃ６−アルキル）２、−ＳＯ２−ＮＨＡｒ、−ＳＯ２−Ｃ２−Ｃ６−アルコキシを表し；
    ｎは０または１を意味する］
    で示される化合物の類似体である、請求項６５記載の薬剤。
  68. 哺乳動物における膀胱制御を誘導または維持する方法であって、その必要とする哺乳動物に、請求項６０−６４に記載のいずれかの方法により同定された治療有効量の薬剤を投与することを含む、方法。
  69. 哺乳動物における尿失禁を治療または予防する方法であって、その必要とする哺乳動物に、請求項６０−６４に記載のいずれかの方法により同定された治療有効量の薬剤を投与することを含む、方法。
  70. 哺乳動物における神経因性疼痛を治療または予防する方法であって、その必要とする哺乳動物に、請求項６０−６４に記載のいずれかの方法により同定された治療有効量の薬剤を投与することを含む、方法。
  71. ＫＣＮＱ５ポリペプチドとの結合能を有するポリペプチドを同定する方法であって、
    （ａ）ＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードする配列が１つのハイブリッドベクターに保持され、かつ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーから由来の配列が第二のハイブリッドベクターに保持されている二ハイブリッド法を哺乳動物に適用すること、ここで、該ＫＣＮＱ５ポリペプチドは、
    （ｉ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
    （ｉｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチド；および
    （ｉｉｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチド
    からなる群から選択される；
    （ｂ）宿主細胞を該ベクターで形質転換すること；
    （ｃ）陽性形質転換細胞を単離すること；および
    （ｄ）第二のハイブリッドベクターを抽出して、ＫＣＮＱ５ポリペプチドと結合するポリペプチドをコードする配列を得ること
    を含む、同定方法。
  72. ＫＣＮＱ５ポリペプチドを検出する方法であって、
    （ａ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含むＫＣＮＱ５ポリペプチドと選択的に結合する抗体；
    （ｂ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチドと選択的に結合する抗体；
    （ｃ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチドと選択的に結合する抗体；および
    （ｄ）配列番号２から由来の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含むＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチド断片と選択的に結合する抗体、ここで該断片は配列番号２から由来のアミノ酸２７０を含む；
    からなる群から選択される抗体と、ＫＣＮＱ５ポリペプチド、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドまたはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチド断片を含有すると思われるサンプル中の分子との結合を検出することを含み、ここで、該抗体を、サンプル中に存在するＫＣＮＱ５ポリペプチド、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドまたはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチド断片との特異的結合を可能とする条件下でサンプルと接触させ、抗体とサンプル中の分子の結合が、ＫＣＮＱ５ポリペプチド、ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドまたはＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチド断片の存在を示すところの、方法。
  73. サンプルが中枢神経系、骨格筋または膀胱平滑筋から由来する、請求項７２記載の方法。
  74. 中枢神経系サンプルが脳から由来する、請求項７３記載の方法。
  75. ＫＣＮＱ５の発現を検出する方法であって、
    ＫＣＮＱ５を発現すると思われる細胞または組織に由来するサンプルにおいて、
    （ｉ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
    （ｉｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチド；および
    （ｉｉｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチド
    からなる群から選択されるＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを、
    （ｉ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドの全部または一部をコードするポリヌクレオチド；
    （ｉｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
    （ｉｉｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
    からなる群から選択されるポリヌクレオチドから由来の少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含むプローブで検出することを含む、検出方法。
  76. プローブが、ヌクレオチド８０８−８１０を含め、配列番号１から由来の少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む、請求項７５記載の方法。
  77. 組織が脳、骨格筋または膀胱である、請求項７５記載の方法。
  78. ＫＣＮＱ５遺伝子が突然変異または欠失しているかどうかを判定する方法であって、対象から由来する細胞または組織のサンプルにおいて、ＫＣＮＱ５タンパク質をコードする遺伝子の完全性に影響を及ぼす少なくとも１つの変異またはＫＣＮＱ５遺伝子の異所性発現を特徴とする遺伝的変異の存在または不在を検出することを含み、ここで該検出工程は、
    （ｉ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドの全部または一部をコードするポリヌクレオチド；
    （ｉｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
    （ｉｉｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
    からなる群から選択されるポリヌクレオチドから由来の少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブまたはプライマーを用いて行われる、検出方法。
  79. プローブまたはプライマーが、ヌクレオチド８０８−８１０を含め、配列番号１から由来の少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む、請求項７８記載の方法。
  80. 組織が脳、骨格筋または膀胱である、請求項７８記載の方法。
  81. ＫＣＮＱ５ポリペプチドの変異体を同定する方法であって、ＫＣＮＱ５突然変異体を含むコンビナトリアルライブラリーをＫＣＮＱ５ポリペプチドアゴニストまたはアンタゴニストについてスクリーニングすることを含み、ここで該ＫＣＮＱ５ポリペプチドが、
    （ｉ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
    （ｉｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチド；および
    （ｉｉｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチド
    からなる群から選択される、同定方法。
  82. 請求項８１に記載の方法により同定されるＫＣＮＱ５変異体。
  83. ＫＣＮＱ５ポリペプチドを単離する方法であって、
    （ａ）ＫＣＮＱ５抗体を、
    （ｉｖ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
    （ｖ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチド；および
    （ｖｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチド
    からなる群から選択されるＫＣＮＱ５ポリペプチドを含有すると思われるサンプルと接触させること；および
    （ｂ）そのサンプルからＫＣＮＱ５抗体−ＫＣＮＱ５ポリペプチド複合体を単離することを含む、単離方法。
  84. 抗体が、
    （ａ）配列番号２を含むＫＣＮＱ５ポリペプチドと特異的に結合する抗体；および
    （ｂ）配列番号２から由来の少なくとも８個の連続したアミノ酸を含むＫＣＮＱ５ポリペプチド断片と特異的に結合する抗体、ここで該断片は配列番号２から由来のアミノ酸２７０を包含する
    からなる群より選択される、請求項８３記載の方法。
  85. ＫＣＮＱ５ポリペプチドを産生する方法であって、
    （ａ）発現ベクターを含む形質転換宿主細胞を、ＫＣＮＱ５ポリペプチドが産生されるような適当な培地で培養すること；ここで該発現ベクターは、
    （ｉ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドの全部または一部をコードするポリヌクレオチド；
    （ｉｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
    （ｉｉｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
    からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含み；および
    （ｂ）工程（ａ）のＫＣＮＱ５ポリペプチドを回収してもよいこと
    を含む、産生方法。
  86. ＫＣＮＱ５活性の亢進を必要とする哺乳動物の処置方法であり、その必要とする哺乳動物に、
    （ｉ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドの全部または一部をコードするポリヌクレオチド；
    （ｉｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    （ｉｉｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    （ｉｖ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
    （ｖ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチド；および
    （ｖｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチド
    からなる群から選択される、治療有効量のＫＣＮＱ５分子を投与することを含む、治療方法。
  87. 治療が尿失禁または神経因性疼痛に対するものである、請求項８６記載の方法
  88. ＫＣＮＱ５活性の低下を必要とする哺乳動物の処置方法であって、その必要とする哺乳動物に、治療有効量の、
    （ａ）（ｉ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドの全部または一部をコードするポリヌクレオチド；
    （ｉｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
    （ｉｉｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
    からなる群から選択されるポリヌクレオチドに対してアンチセンスであるＫＣＮＱ５アンチセンスポリヌクレオチド；または
    （ｂ）（Ａ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含むＫＣＮＱ５ポリペプチドと選択的に結合する抗体；
    （Ｂ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチドと選択的に結合する抗体；
    （Ｃ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチドと選択的に結合する抗体；および
    （Ｄ）配列番号２から由来の少なくとも８個の連続するアミノ酸を含むＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチド断片と選択的に結合する抗体、ここで該断片は配列番号２から由来のアミノ酸２７０を含む；
    からなる群から選択されるＫＣＮＱ５抗体
    を投与することを含む、方法。
  89. ＫＣＮＱ５アンチセンスポリヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたはｓｉＲＮＡである、請求項８８記載の方法。
  90. 抗ＫＣＮＱ５ポリペプチド抗体を得る方法であって、
    （ａ）免疫原性ＫＣＮＱ５ポリペプチドまたはＫＣＮＱ５ポリペプチドに独特なその免疫原性部分で動物を免疫処理すること、ここで該ＫＣＮＱ５ポリペプチドは、
    （ｉ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
    （ｉｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含むＫＣＮＱ５ポリペプチド；および
    （ｉｉｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチド
    からなる群から選択される；および
    （ｂ）その動物からＫＣＮＱ５ポリペプチドと特異的に結合する抗体を単離すること
    を含む、方法。
  91. 免疫原性ＫＣＮＱ５ポリペプチドが配列番号２である、請求項９０記載の方法。
  92. ＫＣＮＱ５ポリペプチドの機能的イオンチャネルをコードする能力をアッセイする方法であって、
    （ａ）宿主細胞を、
    （ｉ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
    （ｉｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチド；および
    （ｉｉｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチド
    からなる群から選択されるＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトすること；
    （ｂ）その宿主細胞においてＫＣＮＱ５ポリペプチドを発現させること；および
    （ｃ）ＫＣＮＱ５ポリペプチドのイオン電流の大きさを電気生理学的に測定すること
    を含む、方法。
  93. 工程（ｃ）が全細胞を記録するか、または双極電圧クランプ法によりなされる、請求項９２記載の方法。
  94. 全細胞を記録することにおいて、宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項９３記載の方法。
  95. 双極電圧クランプ法において、宿主細胞がアフリカツメガエル卵母細胞である、請求項９３記載の方法。
  96. 対象において、ＫＣＮＱ５活性および／または発現の調節から利益を得る疾患または症状を予防する方法であって、該対象に、ＫＣＮＱ５ポリペプチドまたはＫＣＮＱ５発現もしくは少なくとも１つのＫＣＮＱ５活性を調節する薬剤を投与することを含み、ここで該ＫＣＮＱ５ポリペプチドが、
    （ｉ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
    （ｉｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチド；および
    （ｉｉｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチド
    からなる群から選択される、方法。
  97. 症状が尿失禁または神経因性疼痛である、請求項９６記載の方法。
  98. ＫＣＮＱ５ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを検出するためのキットであって、
    （ａ）標識化合物または生体サンプル中のＫＣＮＱ５ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの検出能を有する薬剤；
    （ｂ）そのサンプル中のＫＣＮＱ５ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの量を測定するための手段；
    （ｃ）そのサンプル中のＫＣＮＱ５ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの量を標体と比較するための手段；および
    （ｄ）ＫＣＮＱ５ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを検出するためのキットの任意の使用説明書
    を含み、ここで該ＫＣＮＱ５ポリペプチドまたはポリヌクレオチドが、
    （ｉ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドの全部または一部をコードするポリヌクレオチド；
    （ｉｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    （ｉｉｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    （ｉｖ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
    （ｖ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチド；および
    （ｖｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチド
    からなる群から選択されるところの、検出用キット。
  99. ＫＣＮＱ５活性のモジュレーターを同定するためのキットであって、
    （ａ）ＫＣＮＱ５ポリペプチドを含む細胞または組成物；
    （ｂ）ＫＣＮＱ５ポリペプチド活性を測定するための手段；および
    （ｃ）ＫＣＮＱ５活性のモジュレーターを同定するためのキットの任意の使用説明書
    を含み、ここで該ＫＣＮＱ５ポリペプチドが、
    （ｉ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
    （ｉｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチド；および
    （ｉｉｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチド
    からなる群から選択されるところの、同定用キット。
  100. 対象において、異常なＫＣＮＱ５発現および／または活性に付随する障害を診断するためのキットであって、
    （ａ）ＫＣＮＱ５ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現を測定するための試薬；
    （ｂ）対象の結果を比較する対照；および
    （ｃ）診断目的での任意のキットの使用説明書
    を含み、
    ここで該ＫＣＮＱ５ポリペプチドまたはポリヌクレオチドが、
    （ｉ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドの全部または一部をコードするポリヌクレオチド；
    （ｉｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    （ｉｉｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    （ｉｖ）ＫＣＮＱ５（Ｗ２７０Ｌ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
    （ｖ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５−Ｓ６トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチド；および
    （ｖｉ）ＫＣＮＱ１から由来のＳ５トランスメンブランドメインを含有するＫＣＮＱ５ポリペプチド
    からなる群から選択される、診断用キット。
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