CN101370824A - 瑞替加滨在kcnq5上的新的结合位点 - Google Patents

瑞替加滨在kcnq5上的新的结合位点 Download PDF

Info

Publication number
CN101370824A
CN101370824A CNA200780002569XA CN200780002569A CN101370824A CN 101370824 A CN101370824 A CN 101370824A CN A200780002569X A CNA200780002569X A CN A200780002569XA CN 200780002569 A CN200780002569 A CN 200780002569A CN 101370824 A CN101370824 A CN 101370824A
Authority
CN
China
Prior art keywords
kcnq5
polypeptide
polynucleotide
kcnq1
membrane spaning
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA200780002569XA
Other languages
English (en)
Inventor
K·刘
Q·王
T·M·阿尔吉蒂里
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wyeth LLC
Original Assignee
Wyeth LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wyeth LLC filed Critical Wyeth LLC
Publication of CN101370824A publication Critical patent/CN101370824A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

在此公开的是突变的KCNQ5钾通道的核酸和多肽序列，其缺少对于钾通道活化剂瑞替加滨的反应性。在此还公开的是与前述突变的KCNQ5钾通道的用途相关的方法和试剂盒。

Description

瑞替加滨在KCNQ5上的新的结合位点
发明领域
在此公开的是瑞替加滨在KCNQ5上的新的结合位点，以及基因、核酸、蛋白质、载体和使用它们的方法。
发明背景
离子通道是调节离子流动进出细胞的细胞蛋白质，所述离子包括钙、钾、钠和氯。这些通道影响这些过程，如神经传导、肌肉收缩和细胞分泌。在离子通道之中，钾通道是最普遍和多样化的，在各种动物细胞，例如神经、肌肉、腺体、免疫、生殖和上皮组织中发现。这些通道容许在一定条件下钾流入和/或流出细胞。例如，在这些通道开放时钾离子的流出使得细胞的内部更为负电性，对抗了施加到细胞的去极化电压。这些通道由例如钙敏感性、电压门、第二信使、细胞外配体和ATP敏感性调节。
钾通道是一般作用于超极化神经元和肌细胞的跨膜蛋白质。生理学研究表明，钾电流存在于大多数细胞中，并且与广泛的功能相关，包括可兴奋细胞的电性质的调节。取决于钾通道的类型，它的功能可以受到跨膜电压、不同的配体、蛋白质磷酸化或其他第二信使的控制(参见，例如，美国专利No.6,893,858)。
钾通道家族在哺乳动物组织中具有大约七十个成员。近来鉴定的KCNQ亚族(Kv7)已经显示了作为细胞应激性的决定因素起到重要的功能作用。新近的证据表明，KCNQ钾通道亚单位形成了几种组织类型中M-电流活性的分子基础。这个基因家族已经进化到含有至少五个主要亚单位，称为KCNQ1到KCNQ5(Kv7.1-7.5)。这些亚单位已经被证明共同组装来形成异聚和同聚的功能性离子通道。
电压依赖性钾通道是静止膜电位的关键调节物，调节电学活性细胞例如神经元或肌细胞的应激性(excitability)。已经克隆了几种类型的电压依赖性钾(K+)通道(参见，例如Lerche C et al.，J.Biol.Chem.275：22395-22400(2000))。
五种KCNQ钾通道基因的四种中的突变与各种疾病相关联，引起心脏的LQT综合症(KCNQ1)、癫痫症(KCNQ2和3)、先天性耳聋(KCNQ4)。由于KCNQ5在中枢神经系统(CNS)中展现的M-电流形成中的重要性，认为的是，这个基因的失效将引起神经元应激性的失调(参见，例如Lerche C et al.，J.Biol.Chem.275：22395-22400(2000)；Schroeder BC et al.，J.Biol.Chem.275：24089-95(2000))。
钾通道涉及多种生理学过程，包括心跳的调节、动脉的扩张、胰岛素的释放、神经细胞的应激性、以及肾脏电解质转运的调节。
瑞替加滨(retigabine)(N-(2-氨基-4-(4-氟苯基氨基)-苯基)氨基甲酸乙酯)已经发现打开某些类型的KCNQ通道，包括KCNQ5。然而，瑞替加滨没有增强对KCNQ1的影响，KCNQ1与KCNQ5有37％的序列同一性。瑞替加滨通过提高这些通道的开放概率发挥它们的细胞影响(Main J，Mol.Pharmacol.58：253-62(2000)；Wickenden A et al.，Mol.Pharmacol.58：591-600(2000))。在单独的KCNQ通道的开放方面的这种增加总体地引起细胞膜的超极化，特别是在去极化的细胞中，通过完整细胞KCNQ介导的导电性的显著提高来产生。
在此公开的是KCNQ5的突变体，其丧失了响应瑞替加滨的功能性质。
发明概述
一个方面是编码全部或部分KCNQ5(W270L)多肽的分离的多核苷酸。
另一个方面是包含选自以下构成的组的多核苷酸的分离的多核苷酸：
(a)包含SEQ ID NO：1的核酸序列；
(b)编码SEQ ID NO：2的多核苷酸；
(c)编码多肽的与SEQ ID NO：1具有至少约95％同源性的核酸序列，条件是在核苷酸808-810的替换是针对产生对氨基酸亮氨酸的保守性替换的密码子；
(d)能够在高度严格条件下与SEQ ID NO：1杂交的核酸分子；
(e)与(a)、(b)、(c)或(d)互补的核酸分子；和
(f)SEQ ID NO：1的变体。
另一个实施方式是编码KCNQ5多肽的分离的多核苷酸，所述KCNQ5多肽含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域.
进一步的方面是包含选自以下构成的组的多核苷酸的分离的多核苷酸：
(a)包含SEQ ID NO：3的核酸序列，其中核苷酸769-1062被SEQ IDNO：5替换；
(b)编码SEQ ID NO：4的多核苷酸，其中氨基酸257-354被来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域替换；
(c)能够在高度严格条件下与(a)或(b)的核酸序列杂交的核酸分子；和
(d)与(a)、(b)或(c)互补的核酸分子。
另一个方面是包含选自以下构成的组的多核苷酸的分离的多核苷酸：
(a)包含SEQ ID NO：3的核酸序列，其中核苷酸769-873被SEQ IDNO：5的核苷酸1-105替换；
(b)编码SEQ ID NO：4的多核苷酸，其中SEQ ID NO：4的氨基酸257-291被来自KCNQ1的S5跨膜结构域替换；
(c)能够在高度严格条件下与(a)或(b)的核酸序列杂交的核酸分子；和
(d)与(a)、(b)或(c)互补的核酸分子。
另一个实施方式是包含选自以下构成的组的氨基酸序列的分离的多肽：
(a)KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列；
(b)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(c)(a)的变体；和
(d)与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列，条件是在氨基酸270处的替换是氨基酸亮氨酸的保守性替换。
进一步的方面是包含至少一个KCNQ5亚单位的KCNQ二聚通道，所述KCNQ5亚单位是前述的分离的多肽。另一个方面是包含至少一个KCNQ5亚单位的KCNQ四聚通道，所述KCNQ5亚单位是前述的分离的多肽。
进一步的实施方式是特异性结合包含SEQ ID NO：2的KCNQ5(W270L)多肽的抗体。
另一个方面是特异性结合包含来自SEQ ID NO：2的至少8个连续氨基酸的KCNQ5(W270L)多肽片段的抗体，其中所述片段包括SEQ IDNO：2的氨基酸270。
进一步的方面是含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的分离的KCNQ5多肽。
进一步的方面是含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的分离的KCNQ5多肽。进一步的方面是包含至少一个KCNQ5亚单位的KCNQ二聚通道，所述KCNQ5亚单位是含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域或S5跨膜结构域的前述的分离的KCNQ5多肽。另一个方面是包含至少一个KCNQ5亚单位的KCNQ四聚通道，所述KCNQ5亚单位是含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域或S5跨膜结构域的前述的分离的KCNQ5多肽。
另一个方面是筛选试剂的方法，所述方法包括：
(a)用选自以下构成的组的KCNQ5分子接触试剂：
(i)编码全部或部分KCNQ5(W270L)多肽的多核苷酸；
(ii)编码含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸；
(iii)编码含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸；
(iv)包含KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列的多肽；
(v)含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽；和
(vi)含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽；以及
(b)检测所述试剂对KCNQ5活性的影响；
其中在KCNQ5活性方面的降低或提高的检出是试剂为KCNQ5的调节物的指示。
进一步的实施方式是筛选试剂的方法，所述方法包括：
(a)用试剂接触细胞；和
(b)检测选自以下构成的组的KCNQ5分子的表达水平：
(i)编码全部或部分KCNQ5(W270L)多肽的多核苷酸；
(ii)编码含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸；
(iii)编码含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸；
(iv)包含KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列的多肽；
(v)含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽；和
(vi)含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽；
其中在KCNQ5表达方面的降低或提高的检出是试剂为KCNQ5的调节物的指示。
另一个方面是哺乳动物中诱导或维持膀胱控制、尿失禁的治疗或预防、或神经性疼痛的治疗或预防的方法，所述方法包括向有需要的哺乳动物施用药理学有效量的任何上述方法鉴定的试剂。
另一个方面是鉴定能够结合KCNQ5多肽的多肽的方法，包括：
(a)应用哺乳动物双杂交操作(a mammalian two-hybrid procedure)，其中编码KCNQ5多肽的序列由一个杂交载体携带，来自cDNA或基因组DNA文库的序列由第二杂交载体携带，其中所述KCNQ5多肽选自以下构成的组：
(i)包含KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列的多肽；
(ii)含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽；和
(iii)含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽；
(b)用所述载体转化宿主细胞；
(c)分离阳性转化的细胞；和
(d)提取所述第二杂交载体来获得编码与KCNQ5多肽结合的多肽的序列。
进一步的方面是检测KCNQ5多肽的方法，包括检测选自由以下构成的组的抗体
(a)选择性地结合包含KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列的KCNQ5多肽的抗体；
(b)选择性地结合含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽的抗体；
(c)选择性地结合含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽的抗体；和
(d)选择性地结合包含来自SEQ ID NO：2的至少8个连续氨基酸的KCNQ5(W270L)多肽片段的抗体，其中所述片段包括SEQ ID NO：2的氨基酸270；
与怀疑含有KCNQ5多肽、KCNQ5(W270L)多肽或KCNQ5(W270L)多肽片段的样品中的分子的结合，其中所述抗体在一定条件下与所述样品接触，所述条件允许与样品中存在的任何KCNQ5多肽、KCNQ5(W270L)多肽或KCNQ5(W270L)多肽片段的特异性结合，所述抗体与样品中分子的结合表明KCNQ5多肽、KCNQ5(W270L)多肽或KCNQ5(W270L)多肽片段的存在。
进一步的实施方式是检测KCNQ5的表达的方法，包括检测来自怀疑表达KCNQ5的细胞或组织的样品中编码选自由以下构成的组的KCNQ5多肽的mRNA：
(i)包含KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列的多肽；
(ii)含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽；和
(iii)含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽；
，使用包含来自选自以下构成的组的多核苷酸的至少12个连续核苷酸的探针：
(i)编码全部或部分KCNQ5(W270L)多肽的多核苷酸；
(ii)编码含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸；和
(iii)编码含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸。
另一个实施方式是测定KCNQ5基因是否被突变或删除的方法，包括检测来自受试者的细胞或组织的样品中基因改变的存在或不存在，所述基因改变的特征在于影响编码KCNQ5蛋白质的基因的完整性或KCNQ5基因的错误表达的至少一个改变，其中所述检测步骤用至少一种探针或引物进行，所述探针或引物包含来自选自以下构成的组的多核苷酸的至少12个连续核苷酸：
(i)编码全部或部分KCNQ5(W270L)多肽的多核苷酸；
(ii)编码含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸；和
(iii)编码含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸。
进一步的方面是鉴定KCNQ5多肽的变体的方法，包括筛选包含KCNQ5突变体的组合库中的KCNQ5多肽激动剂或拮抗剂；其中所述KCNQ5多肽选自由以下构成的组：
(i)包含KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列的多肽；
(ii)含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽；和
(iii)含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽。
进一步的方面是分离KCNQ5多肽的方法，包括：
(a)用怀疑含有KCNQ5多肽的样品接触KCNQ5抗体，所述KCNQ5多肽选自由以下构成的组：
(iv)包含KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列的多肽；
(v)含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽；和
(vi)含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽；和
(b)从所述样品分离KCNQ5抗体-KCNQ5多肽复合物。
进一步的实施方式是生产KCNQ5多肽的方法，包括：
(a)在适合的培养基中培养包含表达载体的转化的宿主细胞；其中所述表达载体包含选自由以下构成的组的多核苷酸：
(i)编码全部或部分KCNQ5(W270L)多肽的多核苷酸；
(ii)编码含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸；和
(iii)编码含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸；
从而产生KCNQ5多肽；和
(b)任选的，回收步骤(a)的KCNQ5多肽。
另一个实施方式是治疗需要提高的KCNQ5活性的哺乳动物的方法，包括向所述有需要的哺乳动物施用治疗有效量的选自由以下构成的组的KCNQ5分子：
(i)编码全部或部分KCNQ5(W270L)多肽的多核苷酸；
(ii)编码含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸；
(iii)编码含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸；
(iv)包含KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列的多肽；
(v)含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽；和
(vi)含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽。
进一步的方面是治疗需要降低的KCNQ5活性的哺乳动物的方法，包括向所述有需要的哺乳动物施用治疗有效量的：
(a)KCNQ5反义多核苷酸，其反义于选自由以下构成的组的多核苷酸：
(i)编码全部或部分KCNQ5(W270L)多肽的多核苷酸；
(ii)编码含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸；和
(iii)编码含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸；或
(b)选自由以下构成的组的KCNQ5抗体：
(A)选择性地结合包含KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列的KCNQ5多肽的抗体；
(B)选择性地结合含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽的抗体；
(C)选择性地结合含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽的抗体；和
(D)选择性地结合包含来自SEQ ID NO：2的至少8个连续氨基酸的KCNQ5(W270L)多肽片段的抗体，其中所述片段包括SEQ ID NO：2的氨基酸270。
另一个方面是获得抗KCNQ5多肽抗体的方法，包括：
(a)用KCNQ5多肽独特的免疫原性KCNQ5多肽或其免疫原性部分来免疫动物，其中所述KCNQ5多肽选自由以下构成的组：
(i)包含KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列的多肽；
(ii)含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽；和
(iii)含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽；和
(b)从所述动物中分离特异性结合KCNQ5多肽的抗体。
进一步的方面是分析KCNQ5多肽编码功能性离子通道的能力的方法，包括：
(a)用编码选自由以下构成的组的KCNQ5多肽的多核苷酸转染宿主细胞：
(i)包含KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列的多肽；
(ii)含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽；和
(iii)含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽；
(b)在所述宿主细胞中表达所述KCNQ5多肽；和
(c)电生理学地测量所述KCNQ5多肽的离子电流数量(ion currentmagnitude)。
另一个实施方式是在受试者中预防疾病或状况的方法，所述疾病或状况将受益于KCNQ5活性和/或表达的调节，包括向所述受试者施用KCNQ5多肽或试剂，所述试剂调节KCNQ5表达或至少一种KCNQ5活性，其中所述KCNQ5多肽选自由以下构成的组：
(i)包含KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列的多肽；
(ii)含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽；和
(iii)含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽。
进一步的实施方式是用于检测KCNQ5多肽或多核苷酸的试剂盒，包括：
(a)能够检测生物样品中的KCNQ5多肽或多核苷酸的标记的化合物或试剂；
(b)测定样品中KCNQ5多肽或多核苷酸的数量的设施；
(c)与标准物比较所述样品中KCNQ5多肽或多核苷酸的数量的设施；和
(d)任选的，使用所述试剂盒来检测KCNQ5多肽或多核苷酸的说明书；
其中所述KCNQ5多肽或多核苷酸选自由以下构成的组：
(i)编码全部或部分KCNQ5(W270L)多肽的多核苷酸；
(ii)编码含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸；
(iii)编码含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸；
(iv)包含KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列的多肽；
(v)含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽；和
(vi)含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽。
另一个实施方式是用于鉴定KCNQ5活性的调节物的试剂盒，包括：
(a)包含KCNQ5多肽的细胞或组合物；
(b)用于测定KCNQ5多肽活性的设施；和
(c)任选的，使用所述试剂盒来鉴定KCNQ5活性的调节物的说明书；
其中所述KCNQ5多肽选自由以下构成的组：
(i)包含KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列的多肽；
(ii)含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽；和
(iii)含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽。
进一步的实施方式是用于诊断受试者中与异常的KCNQ5表达和/或活性相关的失调的试剂盒：
(a)用于测定KCNQ5多肽或多核苷酸的表达的试剂；
(b)受试者的结果与之相比较的对照物；和
(c)任选的，为诊断目的使用所述试剂盒的说明书；
其中所述KCNQ5多肽或多核苷酸选自由以下构成的组：
(i)编码全部或部分KCNQ5(W270L)多肽的多核苷酸；
(ii)编码含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸；
(iii)编码含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸；
(iv)包含KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列的多肽；
(v)含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽；和
(vi)含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽。
在参考下文的详细说明时，其他目的和益处对于本领域技术人员将变得显而易见。
序列的简要说明
SEQ ID NO：1代表KCNQ(W270L)cDNA。
SEQ ID NO：2代表KCNQ(W270L)蛋白质。
SEQ ID NO：3代表野生型人类KCNQ5 cDNA。
SEQ ID NO：4代表野生型人类KCNQ5蛋白质。
SEQ ID NO：5代表来自人类KCNQ1 cDNA的S5-S6跨膜结构域。
SEQ ID NO：6代表来自人类KCNQ1的S5-S6跨膜结构域(翻译的氨基酸序列)。
SEQ ID NO：7代表野生型人类KCNQ1 DNA。
SEQ ID NO：8代表野生型人类KCNQ1蛋白质。
附图的简要说明
附图1(A)，在缺少(左侧画面)和存在(右侧画面)50μM瑞替加滨的情况下，通过从-100 to 60mV以10mV递增(保持电位是-100mV)的一系列去极化电压脉冲引起的Q5Q1P的电流跟踪。(B)，瑞替加滨对Q5Q1P突变体的影响的时间过程。(C)，在缺少(n＝9)和存在(n＝7，施加后5分钟)50μM瑞替加滨的情况下，Q5Q1P突变体的电流(I)-电压相互关系。在任一个数据点中没有发现显著差异(p>0.05)。
附图2(A)，在缺少(左侧画面)和存在(右侧画面)50μM瑞替加滨的情况下，通过从-100到60mV以10mV递增(保持电位是-100mV)的一系列去极化电压脉冲引起的Q5Q1S5的电流跟踪。(B)，瑞替加滨对Q5Q1P突变体的影响的时间过程。(C)，在缺少(n＝7)和存在(n＝7)50μM瑞替加滨的情况下，Q5Q1S5突变体的电流(I)-电压相互关系。在这两个组之间任一个数据点中没有发现显著差异(p>0.05)。
附图3，KCNQ5中S5结构域的诱变分析。KCNQ家族中所有五个成员的序列比对在顶部显示。KCNQ1和其他成员之间最为多样化的残基以粗体字突出，KCNQ5中相应的残基分别地转变为它们在KCNQ1中的对应物。然后，用50μM瑞替加滨测试具有单个突变的每个突变体，电流振幅中的提高倍数(IΔ/I0)标绘在底部的图表中。在所有的突变体中，n等于6。
附图4(A)，在缺少(对照)和存在50μM和200μM瑞替加滨的情况下从KCNQ1野生型记录的电流跟踪。(B)，在缺少(对照)和存在50μM和200μM瑞替加滨的情况下从KCNQ1 L171W记录的电流跟踪。(C)，在缺少或存在50和200μM瑞替加滨的情况下通过电压脉冲到80mV从KCNQ1 L171W引起的叠加电流跟踪。(D)，在缺少(空心圆圈)和存在50μM(空心正方形)和200μM(空心三角形)瑞替加滨的情况下KCNQ1L171W的电流-电压相互关系。从-100到80mV以10mV递增的一系列去极化电压脉冲引起的电流的稳态振幅被标准化为对照组中80mV的膜电位引起的水平。保持电位是-100mV。数据收集自每个组中的10个卵母细胞。插图显示了在缺乏(空心圆圈)和存在200μM瑞替加滨(空心三角形)的情况下标准化到80mV下的水平(Gmax)的通道导电性(G)，来比较瑞替加滨对于通道活化的电压依赖性的影响。
发明的详细说明
申请人特别地包括在本公开中所有引用的参考文献的完整内容。进一步的，当作为范围、优选的范围或更高优选值和更低优选值的列表给出数量、浓度、或其他值或参数时，这要被理解为特别地公开了任何上界限或优选的值和任何下界限或优选的值的任何配对所形成的所有范围，不管范围是否被单独地公开。在此引述数值范围时，除非另有说明，该范围意图包括其端点，和该范围内的所有整数和分数。本发明的范围不意图受到限定范围时引述的特定数值的限制。
I.定义
在本公开的上下文中，利用了许多术语。
如在此使用的，术语“约”或“大约”是指在给定的值或范围的20％之内、优选的10％之内、更优选的5％之内。
“改变的水平”是指在有机体中基因产物的产生在数量或比例上不同于正常的或未转化的有机体。多肽的过量表达可以通过首先构建嵌合基因或嵌合构建体来实现，其中编码区可操作地连接到启动子，所述启动子能够指导基因或构建体在期望的组织中在期望的发育阶段的表达。为了方便的目的，嵌合基因或嵌合构建体可以包含来自相同基因的启动子序列和翻译前导序列。也可以提供编码转录终止信号的3′非编码序列。然后可以构建当前的嵌合基因或嵌合构建体。质粒载体的选择取决于将用于转化宿主细胞的方法。熟练的技术人员很好地了解，遗传元件必需存在于质粒载体上以成功地转化、挑选和增殖含有所述嵌合基因或嵌合构建体的宿主细胞。熟练的技术人员还将认识到，不同的独立转化事件将引起不同的表达水平和模式(参见，例如De Almedia ERP et al.，Mol.Genet.Genomics 218：78-86(1989))，因而必需筛选多个事件以获得展现了期望的表达水平和模式的细胞系。这些筛选可以通过DNA的Southern分析、mRNA表达的Northern分析、蛋白质表达的Western分析或免疫细胞化学分析、或表型分析来实现。
“抗体”包括能够结合抗原上存在的表位的免疫球蛋白分子。如在此使用的，该术语不仅涵盖完整的免疫球蛋白分子例如单克隆和多克隆抗体，还涵盖抗独特型抗体、突变体、片段、融合蛋白、双特异性抗体、人源化蛋白、以及包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的修饰体。
术语“cDNA”包括互补DNA，其是由酶例如逆转录酶制成cDNA的、在细胞或有机体中存在的mRNA分子。“cDNA文库”包括在细胞或有机体中存在的、用逆转录酶转变成cDNA分子的、然后插入载体中的mRNA分子的集合。然后文库可以被探测感兴趣的特定cDNA(和由此的mRNA)。
术语“包含”意图包括由术语“基本上由......组成”和“由......组成”所涵盖的实施方式。类似地，术语“基本上由......组成”意图包括由术语“由......组成”所涵盖的实施方式。
在此使用的“KCNQ5多肽”、“KCNQ5氨基酸序列”或“KCNQ5蛋白质”是指具有至少一个氨基酸修饰的非野生型KCNQ5多肽，所述氨基酸修饰使得所述KCNQ5多肽基本上不敏感于K+通道活化剂瑞替加滨而保持KCNQ5M-电流钾通道活性。“野生型KCNQ5”(例如，SEQ ID NO：4，其代表人类野生型KCNQ5)，另一方面，对瑞替加滨起反应(参见Wickendon AD et al.，Brit.J.Pharmacol.132：381-84(2001))。“KCNQ5(W270L)多肽”、“KCNQ5(W270L)氨基酸序列”或“KCNQ5(W270L)蛋白质”是指具有在氨基酸270处从色氨酸残基(在全长人类野生型蛋白质的氨基酸位置270处)到亮氨酸残基的点突变的人类KCNQ5多肽，其为KCNQ5(W270L)多肽赋予了瑞替加滨不敏感性。SEQ ID NO：2代表KCNQ5(W270L)多肽。
在一个实施方式中，KCNQ5多肽是人类KCNQ5多肽。在另一个实施方式中，KCNQ5多肽是非人类的、哺乳动物KCNQ5多肽。优选的非人类的哺乳动物KCNQ5多肽包括大鼠KCNQ5多肽(共同拥有的、共同待决的美国临时申请系列号NO.60/760,249)和小鼠KCNQ5多肽(GenBank
Figure A200780002569D0027093250QIETU
登记号No.NM_023872)，两者都对瑞替加滨敏感(参见，例如Jensen HS et al.，Brain Res.Mol.Brain Res.139：52-62(2005))，享有与人类野生型KCNQ5的高同源性(大鼠是94.7％，小鼠是95.2％)，并含有被认为等价于W270的氨基酸(在大鼠中为W269，在小鼠中为W271)。
如在此使用的，KCNQ5或KCNQ5(W270L)“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包括与非KCNQ5或非KCNQ5(W270L)多肽可操作连接的KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽。“非KCNQ5多肽”是指具有与如下蛋白质相应的氨基酸序列的多肽，所述蛋白质基本上不同源于KCNQ5蛋白，例如，不同于KCNQ5蛋白并且来源于相同或不同的有机体的蛋白质。“非KCNQ5(W270L)多肽”是指具有与如下蛋白质相应的氨基酸序列的多肽，所述蛋白质基本上不同源于KCNQ5(W270L)蛋白，例如，不同于KCNQ5(W270L)蛋白并且来源于相同或不同的有机体的蛋白质。在KCNQ5或KCNQ5(W270L)融合蛋白中，KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽可以相应于全部或部分KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质。在优选的实施方式中，KCNQ5或KCNQ5(W270L)融合蛋白包含KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的至少一个生物学活性部分。在所述融合蛋白中，术语“可操作连接的”意图表明所述KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽和所述非KCNQ5或非KCNQ5(W270L)多肽是相互按阅读框融合的。非KCNQ5或非KCNQ5(W270L)多肽可以融合到KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽的N-末端或C-末端。
“KCNQ5多核苷酸”或“KCNQ5核酸序列”是指编码具有至少一个氨基酸修饰的KCNQ5多肽的非野生型KCNQ5多核苷酸，所述氨基酸修饰使得所述KCNQ5多肽基本上不敏感于K+通道活化剂瑞替加滨而保持KCNQ5 M-电流钾通道活性(M-current potassium channel activity)。“野生型KCNQ5多核苷酸”或“野生型KCNQ5核酸序列”(例如，SEQ ID NO：3，其代表人类野生型KCNQ5多核苷酸)，另一方面，编码对于瑞替加滨起反应的野生型KCNQ5(参见Wickendon AD et al.，Brit.J.Pharmacol.132：381-84(2001))。
“编码序列”或“编码”表达产物例如RNA、多肽、蛋白质或酶的序列，是一种核苷酸序列，当被表达时引起所述RNA、多肽、蛋白质或酶的产生，即，所述核苷酸序列编码所述多肽、蛋白质或酶的氨基酸序列。
术语“互补”被用于描述能够相互杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于DNA，腺苷互补于胸腺嘧啶，胞嘧啶互补于鸟嘌呤。
如在此使用的术语“有效量”、“治疗有效量”和“有效剂量”是指效应分子的数量，当被施用给有需要的哺乳动物时，是有效的以至少部分地改善与例如中枢神经系统(CNS)和外周系统的有害状况相关的状况，包括各种类型的疼痛，例如，由灼伤、砸伤、擦伤、划伤、断骨、韧带撕裂、肌腱撕裂、肌肉撕裂、病毒、细菌、原生动物或真菌感染、接触性皮炎、炎症(例如，由外伤、感染、手术、灼伤或具有炎症性成分的疾病所引起的)、癌症、牙痛引起的身体的、皮肤的或内脏的疼痛；由例如由于癌症、HIV(人类免疫缺陷病毒)感染、组织外伤、感染、自体免疫疾病、糖尿病、关节炎、糖尿病性神经病变、三叉神经痛或药物施用引起的对中枢或外周神经系统的损伤所引起的神经性疼痛；治疗由例如恐慌失调、一般化焦虑失调或逆境失调(stress disorder)、特别是急性逆境失调、情感失调引起的焦虑、Alzheimer’s病、共济失调、由外伤、中风或神经变性疾病引起的CNS损伤、认识不全、强迫性行为、痴呆、忧郁症、Huntington’s病、狂躁、记忆损伤、记忆失调、记忆功能紊乱、运动失调(motion disorders)、运动失调(motor disorders)、年龄相关的记忆缺失、神经退行性疾病、Parkinson’s病和Parkinson样运动失调、恐怖症、Pick’s病、精神病、精神分裂症、脊髓损坏、颤抖、发作、惊厥、癫痫症、Stargardt样斑点性营养不良、锥体-棒斑点性营养不良、Salla病、癫痫症、肌肉松弛药、退烧药、抗焦虑药、抗偏头痛试剂、镇痛药、双极失调、单极忧郁症、功能性肠失调(例如消化不良和肠易激综合症)、腹泻、便秘、各种类型尿失禁(例如，急促性尿失禁、应激性尿失禁、溢出尿失禁或无意识的尿失禁和混合的尿失禁)、尿急、膀胱不稳定性、神经原性膀胱、听力损失、耳鸣、青光眼、认识失调、慢性炎症性和神经痛性疼痛；用于防止或降低例如癌症、炎症、眼科疾病、和各种CNS失调的治疗的药物依赖性或耐受性。
术语“表达(express)”和“表达(expression)”意思是容许或使得基因或DNA序列中的信息变得显明，例如通过激活涉及相应基因或DNA序列的转录和翻译的细胞功能产生蛋白质。DNA序列在细胞中或由细胞表达来形成“表达产物”例如蛋白质。表达产物本身，例如，产生的蛋白质，也可以称为由所述细胞“表达”。表达产物可以被表征为细胞内的、细胞外的或分泌的。术语“细胞内的”是指在细胞内部的某些东西。术语“细胞外的”是指在细胞外部的某些东西。如果以显著的数量出现在细胞外、来自细胞上或细胞内的某处，则物质被细胞“分泌”。“反义抑制”是指能够抑制目标蛋白质的表达的反义RNA转录产物的产生。“过量表达”是指在有机体中基因产物的产生超过了正常的或非转化的有机体中的表达水平。“抑制”是指抑制外源或内源基因或RNA转录产物的表达。
术语“表达系统”是指宿主细胞和相容的载体在适合的条件下，例如，用于表达由所述载体携带并导入宿主细胞的外源DNA编码的蛋白质。
术语“基因”是指DNA序列，包括在编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调节序列，所述编码序列编码或相应于包含一种或多种蛋白质或酶的全部或部分的氨基酸序列。“天然基因”是指在自然中发现具有其自身的调节序列的基因。“嵌合基因”或“嵌合构建体”是指任何基因或构建体，其不是天然基因，包含在自然中不在一起发现的调节和编码序列。因而，嵌合基因或嵌合构建体可以包含来自不同来源的调节序列和编码序列，或来自相同来源但以不同于自然中存在的方式排列的调节序列和编码序列。“内源基因”是指在有机体的基因组中在其自然位置的天然基因。“外源”基因是指通常不在宿主有机体中存在、但其通过基因转移被导入宿主有机体的基因。外源基因可以包含插入到非天然有机体中的天然基因或嵌合基因。“转基因”是已经通过转化过程导入基因组的基因。
术语“遗传修饰的”包括含有和/或表达外源基因或核酸序列的细胞，所述外源基因或核酸序列相应地修饰所述细胞或它的子代的基因型或表型。这个术语包括对细胞的内源核苷酸的任何添加、删除或破坏。
“基因产物”包括当基因被转录和翻译时产生的氨基酸(例如，肽或多肽)。
术语“异源的”是指非天然发生的元件的组合。例如，异源DNA是指非天然地位于细胞中、或细胞的染色体位置中的DNA。优选的，异源DNA包括对于细胞是外来的基因。异源表达调节元件是可操作地连接到与它天然可操作连接的基因不同的基因的元件。
在此使用的术语“同聚的”(homomeric)是指仅包含一种亚单位的离子通道。例如，同聚二聚体(“同二聚体”)KCNQ通道可以由两个相同的KCNQ5多肽亚单位组成。同聚的四聚体(“同四聚体”)可以由四个相同的KCNQ5多肽亚单位组成。在此使用的术语“异聚的”(heteromeric)是指包含至少两种不同的亚单位的离子通道。例如，异聚二聚体(“异二聚体”)KCNQ通道可以由一个KCNQ5多肽亚单位和一个KCNQ3亚单位组成，或者异二聚体KCNQ通道可以由一个KCNQ5多肽亚单位和不同的KCNQ5多肽亚单位组成。异聚四聚体(“异四聚体”)KCNQ通道可以由1、2、3或4个KCNQ5多肽亚单位组成，条件是如果所有四个亚单位都是KCNQ5多肽亚单位，则至少一个亚单位不同于另外三个。
“同源的”是指两种聚合物(即，多肽分子或核酸分子)之间的序列相似性的程度。在此所称的同源性百分比图反映了两种聚合物之间最大的同源性可能性，即，当两种聚合物被排列以具有最大数目的匹配(同源)位置时的同源性百分比。术语“同源的”和“同源性”还指具有“共同进化来源”的蛋白质之间的关系，包括来自超家族的蛋白质(例如，免疫球蛋白超家族)和来自不同物种的同源蛋白质(例如，肌球蛋白轻链，等等)(参见，例如，Reeck GR et al.，Cell 50：667(1987))。这些蛋白质(和它们的编码基因)具有序列同源性，如它们的序列相似性所反映的，无论是就相似性百分比而言还是保守位置处的特定残基或基序的存在而言。因而，术语“序列相似性”是指可能或可能不享有共同的进化来源的核酸或蛋白质的氨基酸序列之间的同一性或对应性的程度(参见，Reeck GR et al.上文)。然而，在一般使用和在本申请中，术语“同源的”，当用副词例如“高度”来修饰时，可以指序列相似性，并且可以或可以不涉及共同的进化来源。
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸的同一性百分比，根据最优的比较目的对序列进行比对(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列之一或两者中导入缺口用于最佳比对)。在优选的实施方式中，为比较目的比对的序列的长度是参考序列长度的至少30％、优选的至少40％、更优选的至少50％、再更优选的至少60％、更优选的至少70％、80％或90％。然后比较相应位置的残基，当一个序列中的位置被另一个序列中相应位置的相同残基占据时，则分子在该位置是同一的。因而，两个序列之间的同一性百分比是两个序列共有的同一的位置数目的函数(即，同一性％＝同一的位置数/总位置数×(100)。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的同一的位置的数量的函数，考虑到为了两个序列的最佳比对需要引入的缺口的数量和每个缺口的长度。
可以使用数学算法来完成两个序列之间的序列比较和同一性百分比的确定。序列比较利用的数学算法的一个非限制性实例是Karlin S和Altschul SF，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-68(1990)的算法，在Karlin S and Altschul SF，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-77(1993)中修改。这种算法被合并到Altschul SF et al.，J.Mol.Biol.215：403-10(1990)的NBLAST和XBLAST程序中(版本2.0)。可以用NBLAST程序进行BLAST核苷酸检索，分值＝100，字长＝12，来获得与核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序进行BLAST蛋白检索，分值＝50，字长＝3，来获得与蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的有缺口的对准，可以利用在Altschul SF et al.，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997)中描述的Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。为序列比较利用的另一种优选的非限制性算法是Myers EW and Miller W，Comput.Appl.Biosci.4：11-17(1988)的算法。这种算法被合并到ALIGN程序(版本2.0)中，其是GCG序列比对软件包中的一部分。当利用ALIGN程序来比较氨基酸序列时，可以使用PAM120加权残基表、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分。
为蛋白质序列的比对利用的数学算法的另一种非限制性的实例是Lipman-Pearson算法((Lipman DJ and Pearson WR，Science227：1435-41(1985))。当使用Lipman-Pearson算法时，可以使用PAM250加权残基表、12的缺口长度罚分、4的缺口罚分和2的Kutple。为比对核酸序列使用的数学算法的优选的非限制性实例是Wilbur-Lipman算法(Wilbur WJ and Lipman DJ，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：726-30(1983))。当使用Wilbur-Lipman算法时，可以使用20的窗口、3的缺口罚分、3的Ktuple。Lipman-Pearson算法和Wilbur-Lipman算法都被包括入例如MEGALIGN程序(例如，版本3.1.7)中，其是DNASTAR序列分析软件包的一部分。
序列分析的其他算法是本领域已知的，包括ADVANCE和ADAM，在Torelli A and Robotti CA，Comput.Appl.Biosci.10：3-5(1994)中描述；和FASTA，在Pearson WR and Lipman DJ，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444-48(1988)中描述。
在优选的实施方式中，两个氨基酸序列之间的同一性百分比使用GCG软件包中的GAP程序来确定，利用Blosum 62矩阵或PAM250矩阵，16、14、12、10、8、6或4的缺口加权和1、2、3、4、5或6的长度加权。在又一个优选的实施方式中，两个核苷酸序列之间的百分比同一性使用GCG软件包中的GAP程序确定，利用NWSgapdna，CMP矩阵和40、50、60、70或80的缺口加权和1、2、3、4、5或6的长度加权。
蛋白质比对也可以使用Geneworks全局蛋白质比对程序(例如，版本2.5.1)来进行，开放缺口的代价设为5、延伸缺口的代价设为5、最小对角线长度设为4、最大对角线偏移量设为130、共有截断设为50％，并利用Pam 250矩阵。
核酸和蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”来相对于公众数据库进行检索，例如，来鉴定其他家族成员或相关的序列。这些检索可以使用Altschul SF et al.，J.Mol.Biol.215：403-10(1990)的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)来进行。可以用NBLAST程序进行BLAST核苷酸检索，分值＝100，字长＝12，来获得与KCNQ5或KCNQ5(W270L)核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序进行BLAST蛋白检索，分值＝50，字长＝3，来获得与KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的有缺口的对准，可以利用在Altschul SF et al.，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997)中描述的Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。例如，可以使用默认的Blastn矩阵1-3、缺口罚分设置在：存在11和延长1来分析核苷酸序列。例如，可以使用默认设置：Blosum62矩阵，缺口罚分设置为存在11和延长1，来分析氨基酸序列。
术语“宿主细胞”是指任何有机体的任何细胞，其按任何方式被选择、修饰、转化、生长或使用或操作，用于通过该细胞产生物质，例如，通过细胞表达基因、DNA或RNA序列、蛋白质或酶。
当核酸分子的单链形式可以在适合的温度和溶液离子强度条件(Sambrook J et al.(eds.)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d Ed.1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY.Vols.1-3(ISBN0-87969-309-6))下与另一个核酸分子退火时，核酸分子是与另一个核酸分子，例如cDNA、基因组DNA或RNA分子是“可杂交的”。温度和离子强度条件决定了杂交的“严格度”。对于同源核酸的初步筛选，可以使用低严格杂交条件，相应于55℃的Tm，例如，5×SSC、0.1％ SDS、0.25％牛奶以及没有甲酰胺；或30％甲酰胺、5×SSC、0.5％ SDS)。中度严格杂交条件相应于更高的Tm，例如40％甲酰胺、5×或6×SSC。高严格杂交条件相应于最高的Tm，例如50％甲酰胺、5×或6×SSC。杂交需要两个核酸含有互补序列，然而取决于杂交的严格度，碱基之间的错配是可能性。杂交核酸的合适的严格度取决于核酸的长度和互补的程度，变量是本领域公知的。两个核苷酸序列之间的相似性或同源性的程度越高，具有这些序列的核酸的杂交的Tm的值越大。核酸杂交的相对稳定性(与更高的Tm相应)按照以下顺序降低:RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。对于长度超过100个核苷酸的杂交，已经得出了计算Tm的方程式((Sambrook et al.，上文)。
包含KCNQ亚单位(subunit)的电压门控的钾通道的“抑制物”、“活化物”、“开放物”或“调节物”是指使用体外和体内分析鉴定的、KCNQ通道功能的抑制性或活化性分子。特别是，抑制物、活化物和调节物是指提高KCNQ通道功能的化合物，从而降低受试者中的疼痛。“抑制物”是降低、阻断、阻止、延迟活化、钝化、脱敏或减量调节通道，或者加速或增强钝化的化合物。“活化物”是提高、开放、活化、促进、增强活化、敏化或增量调节通道活性，或者延迟或减缓钝化的化合物。抑制物和活化物的这些分析还包括，例如，在细胞或细胞膜中表达重组KCNQ，然后直接或间接地测量通过通道的离子的流动。
术语“分离的”是指材料从它的原始或天然环境(例如，如果它是天然发生的，指自然环境)移出。因而，在活的动物中存在的天然发生的多核苷酸或多肽不是分离的，但是通过人的干预从自然系统中的某些或全部共存材料中分离或修饰的相同的多核苷酸或多肽是分离的。例如，“分离的核酸片段”是RNA或DNA的聚合物，其是单链或双链的，任选地含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离的核酸片段可以由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一种或多种片段组成。这些多核苷酸可以是载体的部分，和/或这些多核苷酸或多肽可以是组合物的部分，并且仍然是分离的，因为这样的载体或组合物不是它们天然存在的环境的一部分。类似地，术语“基本上纯化的”是指一种物质，其已经通过人的干预从它天然存在的紧邻的化学环境中被分离或者移出。基本上纯化的多肽或核酸可以通过本领域一般已知的任何的许多技术和操作来获得或生产。(参见，例如Scopes R(1987)In：Proteinpurification：principles and practice，Springer-Verlag，NY.General proteinand DNA/RNA purification references：Current protocols in molecularbiology，Green publishing associates and John Wiley & Sons)。
术语“哺乳动物”是指人类、非人灵长类、犬、猫、牛、羊、猪、鼠、或其他兽医的或实验室哺乳动物。本领域技术人员认识到，在一个哺乳动物物种中降低病理的严重度的治疗对于在另一个物种的哺乳动物上的治疗效果是预示性的。
术语“调节”是指功能的抑制、增强或诱导。例如，基因表达的“调节”或“调控”是指基因的活性方面的改变。表达的调节可以包括但不限于基因活化和基因抑制。“调节”或“调控”还指方法、条件或试剂，其提高或降低蛋白质、酶、抑制物、信号转导物、受体、转录活化物、辅助因子等等的生物学活性。在活性方面的这种改变可以是mRNA翻译、DNA转录、和/或mRNA或蛋白质降解的提高或降低，其随后可以对应于生物学活性的提高或降低。这种增强或抑制可以随特定事件的发生而确定，例如，信号转导途径的活化，和/或可以仅在特定的细胞类型中是明显的。
“调节的活性”是指被生物学活性形式的蛋白质调节的任何活性、状况、疾病或表型。调节可以通过影响生物学活性蛋白质的浓度，例如，通过调节表达或降解，或通过直接的拮抗或对抗效果，例如通过已知、活化、结合或底物的释放、化学地或结构地修饰，或通过可能涉及其他因素的直接或间接相互作用来实现。
如在此使用的，“天然发生的”核酸分子是指具有在自然中发生的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如，编码天然蛋白)。
如在此使用的，“核酸分子”是指核糖核苷(腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、尿嘧啶核苷或胞嘧啶核苷；“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸腺嘧啶核苷或脱氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯多聚形式，或任何其磷酸酯类似物，例如硫代磷酸酯和硫酯，以单链或双链螺旋的形式。双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。术语核酸分子，特别是DNA或RNA分子，仅指分子的一级和二级结构，并不将它限制到任何特定的三级形式。因而，这个术语包括特别是在线性(例如，限制性片断)或环状DNA分子、质粒以及染色体中存在的双链DNA。在讨论特定双链DNA分子的结构时，在此序列可以根据仅给出沿DNA的非转录链(即，具有与mRNA相同序列的链)的5′到3′方向上的序列的正常惯例来描述。
术语“可操作连接的”是指，核酸分子，即DNA，以及一种或多种调节序列(例如，启动子或其部分)按这样的方式连接，以当合适的分子结合于调节序列时允许mRNA从核酸分子转录或允许核酸分子的产物(即，多肽)的表达。在融合构建体中，术语“可操作连接的”意图表明KCNQ5或KCNQ5(W270L)多核苷酸和非KCNQ5或非KCNQ5(W270L)多核苷酸是相互按阅读框融合的。非KCNQ5或非KCNQ5(W270L)多核苷酸可以融合到KCNQ5或KCNQ5(W270L)多核苷酸的3′或5′。
术语“同源性百分比”是指多核苷酸或多肽之间氨基酸序列同一性的程度。任何两个多核苷酸或多肽之间的同源性是在任一序列中给定位置匹配的核苷酸或氨基酸的总数的正函数，即，如果在任一序列中核苷酸的总数的一半是相同的，则称两个序列展现了50％的同源性。
“多核苷酸”或“核苷酸序列”是在核酸中的一系列核苷酸碱基(也称为“核苷”)，例如DNA或RNA，是指两个或多个核苷酸的任何链。核苷酸序列一般携带遗传信息，包括由细胞机制使用来产生蛋白质和酶的信息。这些术语包括双链或单链的基因组和cDNA、RNA，任何合成的和遗传操作的多核苷酸，以及正义和反义多核苷酸。这包括单链和双链分子，即，DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-DNA杂交体，以及通过将碱基结合到氨基酸主干形成的“蛋白核酸”(PNA)。这还包括含有修饰的碱基，例如，硫代尿嘧啶、硫代鸟嘌呤和氟-尿嘧啶的核酸。
期待的是，当核酸分子是RNA时，在此提供的非RNA序列中的T(胸腺嘧啶)用U(尿嘧啶)替换。例如，SEQ ID NO：1在此作为cDNA序列公开。因而，对于本领域普通技术人员明显的是，例如，包含来自这个序列的序列的RNA分子的T将被U替换。
术语“多肽”包括两个或多个亚单位氨基酸、氨基酸类似物或拟肽的化合物。亚单位可以通过肽键连接。在另一个实施方式中，所述亚单位可以通过其他键，例如酯、醚等等来连接。如在此使用的，术语“氨基酸”包括天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D或L光学异构体，以及氨基酸类似物和拟肽。三个或更多个氨基酸的肽通常被称为寡肽。大于三个或更多个氨基酸的肽链被称为多肽或蛋白质。
“引物”包括短的多核苷酸，一般具有游离的3′-OH基团，其通过与目标杂交来与感兴趣的样品中存在的目标或“模板”结合，此后促进与目标互补的多核苷酸的聚合化。“聚合酶链式反应”(“PCR”)是一种反应，其中复制的拷贝使用由“上游”和“下游”引物构成的“引物对”或“引物集”(set of primers)、以及聚合作用的催化物，例如DNA聚合酶，一般是热稳定的聚合酶，从目标多核苷酸制成。PCR的方法是本领域公知的，例如，在MacPherson et al.，IRL Press at Oxford University Press(1991)中有教导。产生多核苷酸的复制拷贝的所有过程，例如PCR或基因克隆，在此总称“复制”。引物也可以用作杂交反应例如Southern或Northern印迹分析中的探针(参见，例如Sambrook J et al.，上文)。
当在多核苷酸操作的上下文中使用时，“探针”包括寡核苷酸，其作为试剂提供以通过与目标杂交来检测感兴趣的样品中存在的目标。通常，探针将包含标记物，或者在杂交反应之前或之后标记可以通过其进行附着的设施(means)。适合的标记物包括，但不限于，放射性同位素、荧光染料、化学发光化合物、染料和蛋白质，包括酶。
“启动子序列”是能够结合细胞中的RNA聚合酶并启动下游(3′方向)的编码序列的转录的DNA调节区域。为此，启动子序列在它的3′末端的边界是转录起始位点，并向上游(5′方向)延伸来包括以高于背景的可检测水平启动转录所必需的最小数量的碱基或元件。在启动子序列内将发现转录起始位点(例如，通过用核酸酶S1绘图来方便地定义)，以及对于RNA聚合酶的结合负责的蛋白结合结构域(共有序列)。
如在此使用的术语“纯化的”是指已经在降低或消除无关材料存在的情况下分离的材料，所述无关材料也就是杂质，包括从中获得材料的天然材料。例如，纯化的蛋白质优选的基本上没有在细胞中与之相关的其他蛋白质或核酸；纯化的核酸分子优选的基本上没有在细胞内与之一起存在的蛋白质或其他不相关的核酸分子。如在此使用的，术语“基本上没有”在材料的分析测试的上下文中操作上地使用。优选的，基本上没有杂质的纯化的材料是至少50％纯的；更优选的，至少90％纯的；再更优选的至少99％纯的。可以通过层析、凝胶电泳、免疫测定、组成分析、生物测定、和本领域已知的其他方法评估纯度。
纯化方法是本领域公知的。例如，核酸可以通过沉淀、层析(包括制备固相层析、寡核苷酸杂交以及三螺旋层析)、超速离心和其他方式来纯化。可以通过各种方法，包括而不限于，制备圆盘-凝胶电泳、等电点聚焦、HPLC、反相HPLC、凝胶过滤、离子交换和分配层析、沉淀和盐析层析、萃取和逆流分布，来纯化多肽和蛋白质。对于某些目的，优选的是在重组系统中生产多肽，其中蛋白质含有便于纯化的额外序列，例如，但不限于，聚组氨酸序列或与抗体例如FLAG和GST特异性结合的序列。然后可以在适合的固相基质上通过层析从宿主细胞的粗溶胞产物中纯化多肽。做为选择，针对蛋白质或针对由此衍生的肽产生的抗体可以用作纯化试剂。细胞可以通过各种技术来纯化，包括，例如，离心、矩阵分离(例如，尼龙绒毛分离)、淘洗和其他免疫选择技术、耗尽(例如，污染细胞的互补耗尽)以及细胞分选(例如，荧光活化的细胞分选(FACS))。其他纯化方法是可能的。纯化的材料可含有少于约50％，优选的少于约75％，最优选的少于约90％的最初与之相关的细胞成分。“基本上纯的”表明最高的纯度，其可以使用本领域已知的标准纯化技术来实现。
术语“测试化合物”包括具有已知的化学结构但不一定具有已知功能或生物学活性的化合物。测试化合物也可以具有未鉴定的结构或可以是未知的化合物的混合物，例如，来自粗的生物样品，例如植物提取物。大量的化合物可以从“化学物质库”中随机地筛选，“化学物质库”是指纯化的化合物的集合或者来自各种来源的粗提取物的集合。化学物质库可以含有化学上合成的或从天然产物纯化的化合物。化合物可以包含无机的或有机的小分子，或更大的有机化合物，例如，蛋白质、肽、糖蛋白、类固醇、脂质、磷脂、核酸和脂蛋白。测试的化合物的数量可以取决于化学物质库而变化，但是，对于纯化的(匀质的)化合物库，10μM一般是测试的最高初始剂量。将测试化合物导入细胞的方法是本领域公知的。
术语“转染”是指外源核酸导入细胞中。术语“转化”是指向宿主细胞导入“外来”(即，外在的或细胞外的)基因、DNA或RNA序列，从而所述宿主细胞将表达所述导入的基因或序列来产生期望的物质，一般是由所述导入的基因或序列编码的蛋白质或酶。导入的基因或序列也可以称为“克隆的”或“外来的”基因或序列，可以包括调节或控制序列，例如，细胞的遗传机制使用的启动、停止、启动子、信号、分泌或其他序列。基因或序列可以包括非功能性序列或没有已知功能的序列。接受并表达导入的DNA或RNA的宿主细胞已经被“转化”，并且是“转化体”或“克隆”。导入宿主细胞的DNA或RNA可以来自任何来源，包括与宿主细胞相同的属或物种的细胞，或不同属或物种的细胞。因而，进一步的实施方式是用如上所述的载体转化的宿主细胞。在一个实施方式中，所述宿主细胞是原核细胞。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞优选的是真核细胞。在优选的实施方式中，所述宿主细胞是E.coli细胞。
术语“变体”(variant)还被用于表明修饰的或改变的基因、DNA序列、酶、细胞，等等。涵盖在术语“变体”内的是核苷酸和氨基酸替换、添加或删除。并且，涵盖在术语“变体”内的是化学上修饰的天然和合成KCNQ5分子。例如，变体可以指不同于参考多肽的多肽。一般地，在参考多肽和在氨基酸序列上与参考多肽不同的多肽之间的差异是有限的，从而参考和变体的氨基酸序列总体上是紧密相似的，在某些区域是相同的。变体和参考多肽可以在氨基酸序列上有一个或多个替换、删除、添加、融合和截断的不同，其可以是保守的或非保守的，并且可以以任何组合存在。例如，变体可以是其中几个、例如从50到30个、从30到20个、从20到10个、从10到5个、从5到3个、从3到2个、从2到1个氨基酸被以任意组合插入、替换或删除的那些。此外，变体可以是多肽的片段，其不同于参考多肽序列之处在于比参考序列更短，例如，末端或内部删除。多肽的变体还包括基本上保持与多肽相同的生物学功能或活性的多肽，例如，可以通过裂解前体部分被活化以产生活性的成熟多肽的前体蛋白质。这些变体可以是等位变体，其特征在于编码蛋白质的结构基因的核苷酸序列中的差异，或者可以涉及差异剪接或翻译后修饰。变体还包括基本上具有相同的生物学活性、但从不同的物种获得的相关的蛋白质。熟练的技术人员可以产生具有单个或多个氨基酸替换、删除、添加或替代的变体。这些变体可以包括，特别地：(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守的或非保守的氨基酸残基(优选的，保守的氨基酸残基)替换的变体，这样替换的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码编码的，或(ii)其中一个或多个氨基酸从肽或蛋白质上删除的变体，或(iii)其中一个或多个氨基酸被添加到多肽或蛋白质的变体，或(iv)其中一个或多个氨基酸残基包括取代的基团的变体，或(v)其中成熟的多肽与另一种化合物融合的变体，所述化合物例如提高多肽的半衰期的化合物(例如，聚乙二醇)，或(vi)其中额外的氨基酸被融合到成熟多肽的变体，例如前导区或分泌序列，或被采用用于成熟多肽或前体蛋白序列的纯化的序列。多肽的变体也可以是天然发生的变体，例如天然发生的等位变体，或它可以是未知天然发生的变体。以上定义的所有这些变体被认为处于本领域的教导的范围之内。
术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”是指媒介物，DNA可以通过它被导入宿主细胞，引起导入的序列的表达。“属间载体”(intergenericvector)是一种载体，其允许属间的结合(conjugation)，即，利用直接地将DNA从E.coli传递到另一个细胞系的系统。属间的结合与转化相比具有更少的操作。
载体一般包括可传播试剂的DNA，其中插入了外源DNA。将DNA的一个片段插入另一个DNA片段的常见的途径涉及利用称为限制性内切酶的酶，其在称为限制性位点的特定位点(核苷酸的特定组)处裂解DNA。“表达盒”是指编码序列的DNA或编码表达产物的DNA片段，其可以在限定的限制性位点插入载体中。盒限制性位点被设计以确保盒在适当的阅读框中的插入。一般地，外源DNA被插入载体DNA的一个或多个限制性位点，然后与可传播的载体DNA一起被载体携带入宿主细胞。具有插入的或添加的DNA的DNA的片段或序列，例如表达载体，可以被称为“DNA构建体”。载体的常见类型是“质粒”，其一般是自我包含的(self-contained)、通常为细菌来源的双链DNA分子，可以容易地接受其他(外源的)DNA，并可以容易地导入适合的宿主细胞中。质粒载体常常含有编码DNA和启动子DNA，并且具有适合于插入外源DNA的一个或多个限制性位点。编码DNA是编码特定蛋白质或酶的特定氨基酸序列的DNA序列。启动子DNA是DNA序列，其启动、调节或者介导或控制编码DNA的表达。启动子DNA和编码DNA可以来自相同的基因或来自不同的基因，并且可以来自相同的或不同的有机体。重组克隆载体通常将包括一个或多个复制系统用于克隆或表达，一个或多个标记物用于在宿主中选择，例如抗生素抗性，以及一个或多个表达盒。载体构建体可以使用本领域技术人员能力之内的标准分子生物学以及重组DNA技术来产生。这些技术已经在文献中完整地说明了。参见，例如Sambrook J et al.，supra；DNA Cloning：A Practical Approach，Volumes I and II(D.N.Glover ed.1985)；Ausubel FM et al.(eds.)，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.(1994)。通常使用的、商业上可获得的载体包括，例如，来自Invitrogen(Carlsbad，Calif.)的pcDNA3和pCR载体，以及来自Promega(Madison，Wis.)的pGEM载体。
“电压-门控的”活性或“电压-门控”或“电压依赖性”是指由单独的多肽单体或亚单位组成的钾通道的特征。一般地，电压门控的钾通道开放的概率随着细胞被去极化而提高。电压门控的钾通道主要允许在比典型细胞中钾的逆转电位(EK)更为正电性的膜电位下钾的流出，因为它们在这种电压下具有更高的开放概率。EK是一种膜电位，在此处由于驱动钾流出的电势(即，电压电位)被钾的浓度梯度平衡了，没有钾离子的净流动。细胞的膜电位主要取决于它们的钾通道，对于哺乳动物细胞一般在-60和-100mV之间。这个值也被称为钾的“逆转电位”或“Nernst”电位。某些电压门控的钾通道经历钝化，其可以在更高的膜电位下降低钾流出。在某些情况下，钾通道也可以容许钾流入，此时它们在低于EK的膜电位下保持开放(参见，例如Adams and Nonner，in Potassium Channels，pp.40-60(Cook，ed.，1990))。电压门控的特征可以由用于测量通过通道的电流和离子流动的改变的各种技术来测量，例如，通过改变外部溶液的[K+]并测量通道电流的活化电势(参见，例如，美国专利NO.5,670,335)、通过在不同的条件下用膜片钳技术或电压钳来测量电流，以及通过在不同的条件下用放射性标记的跟踪物或电压敏感性染料来测量离子流动。
II.编码KCNQ5或KCNQ5(W270L)或其部分的分离的多核苷酸
在实践在此公开的方法时，各种试剂可以用于调节细胞中KCNQ5或KCNQ5(W270L)的活性和/或表达。在一个实施方式中，试剂是编码KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽或其部分的核酸分子。这些核酸分子以下更详细地描述。
在特定蛋白质的氨基酸序列和编码该蛋白质的核苷酸序列之间存在着已知的和明确的相应性，如遗传密码所限定的(显示如下)。同样地，在特定核酸分子的核苷酸序列和该核酸分子编码的氨基酸序列之间存在着已知的和明确的相应性，如遗传密码所限定的。
遗传密码
丙氨酸(Ala、A)         GCA、GCC、GCG、GCT
精氨酸(Arg、R)         AGA、ACG、CGA、CGC、CGG、CGT
天冬酰胺(Asn、N)       AAC、AAT
天冬氨酸(Asp、D)       GAC、GAT
半胱氨酸(Cys、C)       TGC、TGT
谷氨酸(Glu、E)         GAA、GAG
谷氨酰胺(Gln、Q)       CAA、CAG
甘氨酸(Gly、G)         GGA、GGC、GGG、GGT
组氨酸(His、H)         CAC、CAT
异亮氨酸(Ile、I)          ATA、ATC、ATT
亮氨酸(Leu、L)            CTA、CTC、CTG、CTT、TTA、TTG
赖氨酸(Lys、K)            AAA、AAG
甲硫氨酸(Met、M)          ATG
苯丙氨酸(Phe、F)          TTC、TTT
脯氨酸(Pro、P)            CCA、CCC、CCG、CCT
丝氨酸(Ser、S)            AGC、AGT、TCA、TCC、TCG、TCT
苏氨酸(Thr、T)            ACA、ACC、ACG、ACT
色氨酸(Trp、W)            TGG
酪氨酸(Tyr、Y)            TAC、TAT
缬氨酸(Val、V)            GTA、GTC、GTG、GTT
终止信号(end)             TAA、TAG、TGA
遗传密码的重要的和公知的特征是它的冗余性，因而，对于大多数用于制造蛋白质的氨基酸来说，可以采用超过一个编码核苷酸三联体(以上例示的)。因而，许多不同的核苷酸序列可以编码给定的氨基酸序列。这种核苷酸序列被认为是功能上等效的，因为它们引起在所有有机体中相同氨基酸序列的产生(虽然某些有机体可以比其他有机体更有效地翻译某些序列)。此外，偶尔地，嘌呤或嘧啶的甲基化的变体可以在给定的核苷酸序列中发现。这种甲基化不影响三核苷酸密码子和相应的氨基酸之间的编码关系。
鉴于上述的，编码KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽(或其部分)的DNA或RNA分子的核苷酸序列可以用于衍生KCNQ5或KCNQ5(W270L)氨基酸序列，利用遗传密码来将所述DNA或RNA分子翻译成氨基酸序列。同样地，对于任何KCNQ5或KCNQ5(W270L)氨基酸序列，可以编码KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的相应多核苷酸序列可以从遗传密码推出(由于它的冗余性，对于任何给定的氨基酸序列，其将产生多种多核苷酸序列)。因而，KCNQ5或KCNQ5(W270L)多核苷酸序列的此处的描述和/或公开应当被认为还包括由所述多核苷酸序列编码的氨基酸序列的描述和/或公开。类似地，在此KCNQ5或KCNQ5(W270L)氨基酸序列的描述和/或公开应当被认为还包括可以编码所述氨基酸序列的所有可能的多核苷酸序列的描述和/或公开。
一个方面涉及编码KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质或其生物学活性部分的分离的核酸分子，以及足以用作杂交探针来鉴定KCNQ5或KCNQ5(W270L)编码多核苷酸(例如，KCNQ5或KCNQ5(W270L)mRNA)的核酸片段，和用作PCR引物用于KCNQ5或KCNQ5(W270L)多核苷酸的扩增或突变的片段。KCNQ5蛋白质的生物学活性部分包括，例如，六个跨膜结构域、孔洞区域和保守的C-末端区域。要理解的是，在讨论KCNQ5或KCNQ5(W270L)核酸分子的用途时，可以使用这种多核苷酸的片段以及全长的KCNQ5或KCNQ5(W270L)多核苷酸。
在此公开的多核苷酸，例如SEQ ID NO：1或其部分，可以使用标准的分子生物学技术和在此提供的序列信息来分离。例如，使用SEQ IDNO：1的多核苷酸序列的全部或部分作为杂交探针，利用标准的杂交和克隆技术(例如，在Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，and Maniatis，T.MolecularCloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989中描述的)可以分离KCNQ5(W270L)多核苷酸。
此外，包括SEQ ID NO：1的全部或部分的多核苷酸可以使用根据例如SEQ ID NO：1的序列设计的合成寡核苷酸引物通过PCR来分离。
多核苷酸可以使用cDNA、mRNA或可选择地使用基因组DNA作为模板和合适的寡核苷酸引物根据标准PCR扩增技术来扩增。这样扩增的多核苷酸可以被克隆到合适的载体中并通过DNA序列分析来表征。此外，可以通过标准的合成技术，例如，使用自动化DNA合成仪来制备相应于KCNQ5或KCNQ5(W270L)多核苷酸序列的寡核苷酸。
在优选的实施方式中，分离的多核苷酸包含SEQ ID NO：1中所示的多核苷酸序列。
在另一个优选的实施方式中，分离的多核苷酸包含是SEQ ID NO：1所示多核苷酸序列或这个多核苷酸序列的一部分的互补物的多核苷酸。与SEQ ID NO：1所示多核苷酸序列互补的多核苷酸是与SEQ IDNO：1所示多核苷酸序列足够互补的，从而它可以杂交于SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列，从而形成稳定的双链体。
在再另一个优选的实施方式中，分离的多核苷酸包含与SEQ IDNO：1所示多核苷酸序列(例如，达到核苷酸序列的完整长度)或这个核苷酸序列的一部分有至少约95％、98％或更高同源性的多核苷酸序列。
此外，多核苷酸可以仅包含SEQ ID NO：1的多核苷酸序列的一部分；例如，可以用作探针或引物的片段或编码KCNQ5(W270L)蛋白质的生物学活性部分的片段，条件是所述片段包括SEQ ID NO：1的核苷酸808-810。所述探针/引物包含基本上纯化的寡核苷酸。在一个实施方式中，所述寡核苷酸包含在严格条件下与SEQ ID NO：1的有义序列的至少约12或15个、优选的约20或25个、更优选的约30、35、40、45、50、55、60、65或100个连续多核苷酸杂交的多核苷酸序列的区域。在另一个实施方式中，多核苷酸包含长度至少约100、200、300、400、500、600或700个核苷酸、并在严格杂交条件下与SEQ ID NO：1的多核苷酸序列或其互补物杂交的多核苷酸序列。
在另一个实施方式中，多核苷酸包含SEQ ID NO：1的至少约100、200、300、400、500、600、700或更多个连续核苷酸，只要所述片段包括SEQ ID NO：1的核苷酸808-810。
在其他实施方式中，多核苷酸与包含SEQ ID NO：1的至少约100、200、300、400、500、600、700或更多个核苷酸的多核苷酸具有至少95％的同一性、更优选的98％的同一性，只要在核苷酸808-810处的替换是产生氨基酸亮氨基酸的保守性替换的密码子(例如，编码丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或缬氨酸的替换)。
在另一个实施方式中，多核苷酸编码含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域代替KCNQ5的野生型S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽。人类S5-S6跨膜结构域根据氨基酸序列的疏水性使用GCG程序通过二级结构预测来确定。S5含有氨基酸L266到V287，S6含有氨基酸L326到L352。由于缺乏KCNQ5的晶体结构，SEQ ID NO：6包括进入推定的S4-S5接头的扩大的区域。因而，在一个实施方式中，KCNQ5的S5-S6跨膜结构域包括SEQ ID NO：3的核苷酸769-1062，相应于SEQ ID NO：4的氨基酸257-354。优选的，所述S5-S6跨膜结构域来自人类KCNQ1，更优选的所述S5-S6跨膜结构域由SEQ ID NO：5编码。在一个实施方式中，所述多核苷酸是包含SEQ ID NO：3的核酸序列，其中核苷酸769-1062被SEQ ID NO：5替换。在另一个实施方式中，所述多核苷酸编码SEQ ID NO：4，其中氨基酸257-354被来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域、优选的被SEQ ID NO：6代表的S5-S6跨膜结构域替换。
在另一个实施方式中，多核苷酸编码含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域代替KCNQ5的野生型S5跨膜结构域的KCNQ5多肽。在人类KCNQ5中S5跨膜结构域相应于SEQ ID NO：3的多核苷酸769-873，编码SEQ ID NO：4的氨基酸S257-A291。优选的，所述S5跨膜结构域来自人类KCNQ1，更优选的所述S5跨膜结构域由SEQ ID NO：5的核苷酸1-105编码。在一个实施方式中，所述多核苷酸是包含SEQ ID NO：3的核酸序列，其中核苷酸769-873被SEQ ID NO：5的核苷酸1-105替换。在另一个实施方式中，所述多核苷酸编码SEQ ID NO：4，其中氨基酸257-291被来自KCNQ1的S5跨膜结构域、优选的被SEQ ID NO：6的氨基酸1-35代表的S5跨膜结构域替换。
根据KCNQ5或KCNQ5(W270L)多核苷酸序列的探针可以用于检测编码相同的或同源的蛋白质的转录产物或基因组序列。在优选的实施方式中，所述探针进一步包含与之连接的标记物基团，例如，标记物基团可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅助因子。这种探针可以用作诊断测试试剂盒的一部分用于鉴定细胞或组织，特别是脑、骨骼肌和膀胱，其错误地表达野生型KCNQ5蛋白质，例如，通过测量来自受试者的细胞的样品中KCNQ5或KCNQ5(W270L)编码多核苷酸的水平，例如，检测KCNQ5或KCNQ5(W270L)mRNA水平，或测定野生型KCNQ5基因是否被突变或删除。
编码“KCNQ5(W270L)蛋白质的生物学活性部分”的核酸片段可以通过以下来制备：分离SEQ ID NO：1的多核苷酸序列的一部分，只要所述片段包括SEQ ID NO：1的核苷酸808-810，其编码具有KCNQ5(W270L)生物学活性(即，电压依赖性的、慢慢地活化的K+选择性电流的产生，其对于K+通道阻断剂TEA不敏感，并且在正膜电压下显示显著的向内整流(inward rectification))的多肽，表达所述KCNQ5(W270L)蛋白质的编码的部分(例如，通过体外重组表达)，以及评估KCNQ5(W270L)蛋白质的所述编码的部分的活性。
由于遗传密码的简并性，不同于SEQ ID NO：1、因而编码与SEQ IDNO：1编码的蛋白质相同的KCNQ5(W270L)蛋白质的多核苷酸被当前的公开所涵盖。从而，在另一个实施方式中，分离的多核苷酸具有编码蛋白质的多核苷酸序列，所述蛋白质具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
相应于KCNQ5或KCNQ5(W270L)分子的天然等位变体和同源物的核酸分子，可以根据它们与在此公开的KCNQ5或KCNQ5(W270L)多核苷酸的同源性使用在此公开的cDNA或其部分作为杂交探针根据标准杂交技术来分离。例如，KCNQ5(W270L)DNA可以使用SEQ ID NO：1的全部或部分作为杂交探针和标准的杂交技术(例如上文Sambrook J etal.中描述的)从基因组DNA文库来分离。此外，包括KCNQ5基因的全部或部分的多核苷酸可以使用根据SEQ ID NO：1的序列设计的寡核苷酸引物通过聚合酶链式反应来分离。例如，mRNA可以从细胞分离(例如，通过Chirgwin et al.，Biochemistry 18：5294-99(1979)的胍盐-硫代氰酸盐提取操作)，cDNA可以使用逆转录酶来制备(例如，Moloney MLV逆转录酶，可以从Gibco/BRL，Bethesda，Md.获得；或者AMV逆转录酶，可以从Seikagaku America，Inc.，St.Petersburg，Fla.获得)。PCR扩增的合成的寡核苷酸引物可以基于SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列来设计。多核苷酸可以使用cDNA、或做为选择使用基因组DNA作为模板和合适的寡核苷酸引物根据标准PCR扩增技术来扩增。这样扩增的多核苷酸可以被克隆到合适的载体中并通过DNA序列分析来表征。此外，可以通过标准的合成技术，例如，使用自动化DNA合成仪来制备相应于KCNQ5或KCNQ5(W270L)多核苷酸序列的寡核苷酸。
在另一个实施方式中，分离的多核苷酸可以使用数学算法根据共有的核苷酸序列同一性来鉴定。这种算法在上文更详细地说明了(参见，例如，小节I，以下)。
在另一个实施方式中，分离的多核苷酸长度是至少15、20、25、30或更多个多核苷酸，并在严格条件下与包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的核酸分子或其互补物杂交。在另一个实施方式中，，所述多核苷酸长度是至少30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550或600个核苷酸。优选的，条件使得相互至少95％、优选的至少约98％同源的序列一般地维持相互杂交。优选的，在严格条件下与SEQ IDNO：1的序列或其互补物杂交的分离的核酸分子相应于天然发生的核酸分子。
在另一个实施方式中，微小的改变可以通过突变导入例如SEQ IDNO：1的多核苷酸序列，从而引起编码的蛋白质的氨基酸序列方面的改变，而不改变KCNQ5(W270L)蛋白质的功能活性。例如，可以在SEQ IDNO：1的序列中进行引起在“非关键”氨基酸残基处的氨基酸替换的核苷酸替换。“非关键”氨基酸残基是可以从KCNQ5(W270L)多核苷酸的序列(例如，SEQ ID NO：1的序列)改变、而不改变KCNQ5(W270L)分子的功能活性的残基。非关键的、并因而可以替换的示范性的残基可以由本领域普通技术人员通过进行KCNQ5(W270L)相关分子的氨基酸比对并确定不保守的残基来鉴定。这些残基由于它们不是保守的，因而更可能可以替换。
因此，另一个方面涉及编码KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的多核苷酸，所述KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质含有对于活性不关键的氨基酸残基的变化。例如，这种KCNQ5(W270L)蛋白质在氨基酸序列上不同于SEQ ID NO：2而保持了固有的KCNQ5(W270L)活性。编码例如KCNQ5(W270L)蛋白质的非天然变体的分离的多核苷酸可以通过向SEQ ID NO：1的多核苷酸序列中导入一个或多个核苷酸替换、添加或删除，从而将一个或多个氨基酸替换、添加或删除导入编码的蛋白质中来创建，只要在核苷酸808-810处的替换是针对产生氨基酸亮氨酸的保守性替换的密码子。可以通过标准技术，例如定点诱变和PCR介导的诱变来向SEQ ID NO：1中导入突变。优选的，可以在一个或多个非关键氨基酸残基处进行保守性氨基酸替换。＂保守性氨基酸替换＂是在其中氨基酸残基被替换为具有相似侧链的氨基酸残基的一种替换。具有相似的侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中被定义，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、beta-分支的侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。由此，在KCNQ5(W270L)多肽中的非关键氨基酸残基优选的被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替换。
做为选择，在另一个实施方式中，突变可以沿着KCNQ5或KCNQ5(W270L)编码序列的全部或部分随机地导入，例如，通过饱和诱变，产生的突变体可以被筛选，例如，针对它们活化转录的能力，或者来鉴定保持了功能活性的突变体。在诱变之后，KCNQ5或KCNQ5(W270L)突变体蛋白质可以在宿主细胞中重组地表达，突变体蛋白质的功能活性可以使用本领域可获得的用于评估KCNQ5活性的分析来测定。所述分析包括，但不限于，使用哺乳动物细胞作为宿主的膜片钳完整细胞记录，或使用爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞作为宿主的双电极电压钳。
又一个方面涉及编码KCNQ5或KCNQ5(W270L)融合蛋白的分离的多核苷酸。这样的多核苷酸，至少包含与编码非KCNQ5或非KCNQ5(W270L)蛋白质、多肽或肽的第二多核苷酸可操作连接的、编码全长KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质、多肽或具有KCNQ5或KCNQ5(W270L)活性的肽的第一多核苷酸，可以通过标准的重组DNA技术来制备。
在优选的实施方式中，KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质可以利用如上所述的电生理学方法分析编码功能性离子通道的能力，利用哺乳动物细胞作为宿主的膜片钳完整细胞记录或利用爪蟾卵母细胞作为宿主的双电极电压钳。在一个方面，KCNQ5多肽含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域。在另一个方面，KCNQ5多肽含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域。
除了编码如上所述的KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的多核苷酸之外，另一个方面涉及与之反义的分离的多核苷酸。“反义”核酸包含与编码蛋白质的“正义”核酸互补的核苷酸序列，例如，与双链cDNA分子的编码链互补，或与mRNA序列互补。因此，反义核酸可以与有义核酸氢键结合(hydrogen bond)。反义核酸可以与整个KCNQ5或KCNQ5(W270L)编码链互补，或仅与其一部分互补。在一个实施方式中，反义核酸分子与编码KCNQ5或KCNQ5(W270L)的核苷酸序列的编码链的“编码区”反义。术语“编码区”是指包含被翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列的区域。术语“非编码区””是指侧翼于编码区、不被翻译成氨基酸的5′和3′序列(即，也称为5′和3′非翻译区)。
给出在此公开的编码KCNQ5或KCNQ5(W270L)的编码链序列，本发明的反义核酸可以根据Watson和Crick碱基配对的规则来设计。反义多核苷酸可以与KCNQ5或KCNQ5(W270L)mRNA的完整编码区互补，但更优选的是与KCNQ5或KCNQ5(W270L)mRNA的编码或非编码区的仅一部分反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸可以与围绕着KCNQ5(W270L)mRNA的翻译起始位点的区域互补。反义寡核苷酸的长度可以是，例如，约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸。反义多核苷酸可以使用化学合成和酶连接反应使用本领域已知的方法来构建。例如，可以使用天然发生的核苷酸或不同地修改的核苷酸来化学合成反义核酸(例如，反义寡核苷酸)，目的是提高分子的生物学稳定性或提高反义和正义核酸之间形成的双链体的物理稳定性，例如，可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于产生反义核酸的修饰的核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿核苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-galactosylqueosine、次黄苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-mannosylqueosine、5′-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、wybutoxosine、伪尿嘧啶、queosine、2-巯基胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。做为选择，可以使用表达载体生物学地产生反义核酸，在所述表达载体中已经按反义方向亚克隆了核酸(即，从该插入的核酸转录的RNA将是感兴趣的目标核酸的反义方向的，在以下小节中进一步描述了)。
一般地将反义多核苷酸施用给受试者或在原位产生，从而它们与编码KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合，从而抑制该蛋白的表达，例如，通过抑制转录和/或翻译。根据常规的核苷酸互补性进行杂交来形成稳定的双链体，或，例如，对于与DNA双链体结合的反义多核苷酸来说，通过双螺旋的大沟中的特异性相互作用来杂交。反义多核苷酸的施用途径的实例包括在组织部位直接注射。做为选择，可以修改反义多核苷酸以靶向选定的细胞，然后全身地施用。例如，对于全身性施用，可以修改反义分子使得它们特异性结合选定细胞表面表达的受体或抗原，例如，通过将反义多核苷酸连接到与细胞表面受体或抗原结合的肽或抗体上。也可以施用在此描述的载体将反义多核苷酸递送给细胞。为了达到反义分子的足够的细胞内浓度，优选的是载体构建体，在其中反义多核苷酸被置于强pol II或pol III启动子的控制下。
在又一个实施方式中，反义多核苷酸是α-异头(α-anomeric)核酸分子。α-异头核酸分子与互补RNA形成特殊的双链杂交物，其中，与普通的β单元相反，链是相互平行的(Gaultier C et al.，Nucleic Acids Res.15：6625-41(1987))。反义核酸分子也可以包含2′-o-甲基核糖核苷酸(InoueH et al.，Nucleic Acids Res.15：6131-48(1987))或嵌合的RNA-DNA类似物(Inoue H et al.，FEBS Lett.215：327-30(1987))。
在再另一个实施方式中，反义多核苷酸是核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，其能够裂解含有与它们互补的区域的单链的核酸，例如，mRNA。因而，核酶(例如，锤头核酶(描述于HaselhoffJ and Gerlach WL，Nature 334：585-91(1988))可用于催化性裂解KCNQ5或KCNQ5(W270L)mRNA转录产物从而抑制KCNQ5或KCNQ5(W270L)mRNA的翻译。可以根据SEQ ID NO：1的核苷酸序列设计具有对KCNQ5(W270L)编码核酸的特异性的核酶。例如，可以构建四膜虫L-19IVS RNA的衍生物，其中活性部位的核苷酸序列与KCNQ5(W270L)编码mRNA中要裂解的核苷酸序列互补(参见，例如，美国专利NO.4,987,071和5,116,742)。做为选择，KCNQ5(W270L)可用于从RNA分子库中挑选具有特异性核糖核酸酶活性的催化性RNA(参见，例如Bartel D andSzostak JW，Science 261：1411-18(1993))。
做为选择，基因表达可以通过靶向与KCNQ5或KCNQ5(W270L)的调节区域(例如，KCNQ5(W270L)启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列来形成防止KCNQ5或KCNQ5(W270L)基因在目标细胞中转录的三螺旋结构(一般地参见Helene C，Anticancer Drug Des.6：569-84(1991)；Helene C et al.，Ann.N.Y.Acad Sci.660：27-36(1992)；Maher LJ，Bioassays 14：807-15(1992))。
在又一个实施方式中，KCNQ5或KCNQ5(W270L)多核苷酸可以在碱基部分、糖部分或磷酸主干进行修改来改善，例如，分子的稳定性、杂交性、或溶解性。例如，可以修饰多核苷酸分子的脱氧核糖磷酸主干来产生肽核酸(参见Hyrup B et al.，Bioorg.Med.Chem.4：5-23(1996))。如在此使用的，术语“肽核酸”或“PNA”是指核酸模拟物例如DNA模拟物，在其中脱氧核糖磷酸酯主干被伪肽主干替代，仅保留四种天然的核碱基。已经显示了PNA的中性主干允许在低离子强度的条件下与DNA和RNA特异性杂交。可以使用标准的固相肽合成方案，例如在Hyrup B etal.，supra；Perry-O’Keefe H et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：14670-75(1996)中描述的，来进行PNA寡聚物的合成。
KCNQ5或KCNQ5(W270L)多核苷酸的PNA可以用于治疗和诊断应用。例如，PNA可以用作反义或抗基因(antigene)试剂，用于通过例如诱导转录或翻译延滞或抑制复制来序列特异性地调节基因表达。KCNQ5或KCNQ5(W270L)核酸分子的PNA也可以用于基因中的单碱基对突变分析，(例如，通过PNA指导的PCR钳)；当与其他酶组合使用时作为“人工限制性内切酶”，(例如，S1核酶(Hyrup Bb，同上))；或作为探针或引物用于DNA测序或杂交(Hyrup B et al.，同上；Perry-O’Keefe H et al.，同上)。
在另一个实施方式中，通过给PNA连接亲油性的或其他辅助基团，通过PNA-DNA嵌合体的形成、或通过使用脂质体或本领域已知的其他药物递送技术，可以修饰KCNQ5或KCNQ5(W270L)多核苷酸的PNA(例如，来增强它们的稳定性或细胞摄取)。例如，可以产生KCNQ5或KCNQ5(W270L)多核苷酸的PNA-DNA嵌合体，其可以组合PNA和DNA的有益性质。这种嵌合体容许DNA识别酶(例如RNAse H和DNA聚合酶)与DNA部分相互作用，而PNA部分将提供高结合亲和性和特异性。PNA-DNA嵌合体可以利用根据碱基堆积、核碱基之间的键的数量、以及取向所选择的合适长度的接头来连接(Hyrup B et al.，同上)。PNA-DNA嵌合体的合成可以如Hyrup B et al.，上文和Finn PJ et al.，Nucleic AcidsRes.24：3357-63(1996)中描述的进行。例如，可以使用标准的亚磷酰胺联结化学作用在固相支持物上合成DNA链，和修饰的核苷类似物，例如5′-(4-甲氧基三苯基)氨基-5′-脱氧-胸腺嘧啶亚磷酰胺，可以用于PNA和DNA的5′末端之间(Mag M et al.，Nucleic Acid Res.17：5973-88(1989))。然后以逐步地方式连接PNA单体以产生具有5′PNA片段和3′DNA片段的嵌合分子(Finn PJ et al.，同上)。做为选择，嵌合分子可以用5′DNA片段和3′PNA片段来合成(Petersen KH et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.5：1119-24(1995))。
在其他实施方式中，寡核苷酸可以包括其他附加的基团，例如肽(例如，用于体内靶向宿主细胞受体)，或促进跨细胞膜转运(参见，例如Letsinger RL et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6553-56(1989)；Lemaitre M et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：648-52(1987)；PCT公开No.WO88/09810))或跨血脑屏障转运(参见，例如，PCT公开No.WO89/10134)的试剂。此外，可以用杂交触发的裂解试剂(参见，例如，van der Krol AR et al.，Biotechniques 6：958-76(1988))或插入试剂(参见，例如Zon G，Pharm.Res.5：539-49(1988))来修饰寡核苷酸。为此，寡核苷酸可以与另一个分子结合(例如，肽、杂交触发的交联剂、转运试剂、或杂交触发的裂解试剂)。
在一个实施方式中，KCNQ5或KCNQ5(W270L)多核苷酸可以通过短干扰RNA(siRNA)来抑制。siRNA可以是具有19-25个核苷酸的dsRNA。siRNA可以通过由称为Dicer的RNase III-相关的核酸酶降解更长的dsRNA分子来内源地产生。siRNA也可以外源地导入细胞，或通过表达构建体的转录产生。一旦形式，siRNA与蛋白质成分组装成含有核糖核酸内切酶的复合物，称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)。siRNA的ATP产生的展开活化了RISC，其随后通过Watson-Crick碱基配对靶向互补的mRNA转录产物，从而裂解和破坏所述mRNA。mRNA的裂解在靠近siRNA链结合的区域的中部发生。这种序列特异性mRNA降解引起基因沉默。
可以采用至少两种途径来实现siRNA介导的基因沉默。首先，siRNA可以体外合成并导入细胞来短暂地抑制基因表达。合成的siRNA提供了简单而有效的方法来实现RNAi。siRNA是短的混合的寡核苷酸的双链体，其可以包括，例如，具有对称的二核苷酸3′突出的19RNA核苷酸。使用合成的21 bp siRNA双链体(例如，19RNA碱基随后是UU或dTdT3′突出)，可以在哺乳动物细胞中实现序列特异性基因沉默。这些siRNA可以特异性地抑制哺乳动物细胞中的目标基因翻译而没有更长的双链RNA(dsRNA)的DNA依赖性蛋白激酶(PKR)的活化，其可能引起许多蛋白质的翻译的非特异性抑制。
第二，siRNA可以在体内从载体表达。这种方法可以用于在细胞或转基因动物中稳定地表达siRNA。在一个实施方式中，siRNA表达载体被工程化来驱动从聚合酶III(pol III)转录单位的siRNA转录。Pol III转录单位适合于发夹siRNA表达，因为它们配备了短的富AT转录终止位点，其引起向发夹siRNA添加2bp突出(例如，UU)，是一种对于siRNA功能有帮助的特征。Pol III表达载体也可以用于创建表达siRNA的转基因小鼠。
在另一个实施方式中，siRNA可以以组织特异性的方式表达。在这种方法中，长的dsRNA首先在选定的细胞系或转基因小鼠的核中从启动子(例如，CMV(pol II))表达。长的dsRNA在所述核中被加工成siRNA(例如，通过Dicer)。siRNA从核中出来，并介导基因特异性沉默。类似的方法可以用于与组织特异性(pol II)启动子连接来创建组织特异性敲除小鼠。
任何3′二核苷酸突出，例如UU，可以用于siRNA设计。在某些情况下，由于siRNA在单链的G残基处被RNase裂解的可能性，在突出中的G残基被避免。
对于siRNA序列本身，已经发现，具有30-50％GC含量的siRNA在某些情况下与具有更高G/C含量的那些相比是更有活性的。此外，由于4-6核苷酸聚(T)段可以作为RNA pol III的终止信号，在设计要从RNApol III启动子表达的序列的情况下，在目标序列中>4个T或A的延伸应当被避免。此外，mRNA的某些区域可以是高度结构化的或被调节蛋白结合。因而，有帮助的是沿着基因序列的长度在不同的位置选择siRNA目标位点。最后，潜在的目标位点可以与合适的基因组数据库(人类、小鼠、大鼠，等等)比较。具有与其他编码序列同源的超过16-17个连续碱基对的任何目标序列可以根据在某些情况中的考虑被排除。
在一个实施方式中，siRNA可以被设计以具有由短的序列分隔的两个反向重复，并以充当转录终止位点的一串T结束。这些设计生产了预测折叠成短的发夹siRNA的RNA转录产物。siRNA目标序列的选择、编码推定的发夹的茎的反向重复的长度、反向重复的顺序、编码发夹的环体的间隔序列的长度和组成、5′突出物的存在或不存在，可以变化来实现期望的结果。
siRNA目标可以通过扫描mRNA的AA二核苷酸并记录紧靠AA下游的19个核苷酸来选择。也可以使用其他方法来选择siRNA目标。在一个实例中，siRNA目标序列的选择是纯粹经验性地确定的(参见，例如Sui G et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：5515-20(2002))，只要目标序列从GG开始并且如BLAST检索所分析的与其他基因没有显著的序列同源性。在另一个实例中，采用更详细描述的方法来选择siRNA目标序列。这种过程采用了一观察结果，在内源mRNA中任何可接近的位点可以被靶向用于通过合成的寡脱氧核糖核苷酸/RNase H方法降解(参见，例如Lee NS et al.，Nature Biotechnol.20：500-05(2002))。
在另一个实施方式中，发夹siRNA表达盒被构建以含有目标的有义链，随后是短的间隔区、目标的反义链、和作为转录终止子的5-6个T。siRNA表达构建体内的正义和反义链的顺序可以改变而不影响发夹siRNA的基因沉默活性。在某些情况下，顺序的颠倒可以引起基因沉默活性的部分降低。
用作siRNA表达盒的茎的核苷酸序列的长度可以是，例如从19到29。环体大小可以从3到23个核苷酸。也可以使用其他的长度和/或环体大小。
在又一个实施方式中，可以使用发夹siRNA构建体中的5′突出，只要发夹siRNA在基因沉默中是有功能的。在一个特定的实例中，5′突出包括约6个核苷酸残基。
在再另一个实施方式中，RNAi的目标序列是SEQ ID NO：1的21-mer序列片段，优选的包括SEQ ID NO：1的核苷酸808-810。目标序列的5′末端具有二核苷酸“NA”，其中“N”可以是任何碱基，“A”代表腺嘌呤。其余的19-mer序列具有约35％和55％之间的GC含量。此外，其余19-mer序列不包括任何四个连续的A或T(即，AAAA或TTTT)，三个连续的G或C(即，GGG或CCC)或一排七个“GC”。
其他指标也可以用于选择RNAi目标序列。例如，其余19mer序列的GC含量可以限于45％和55％之间。此外，排除了具有三个连续的相同碱基(即，GGG、CCC、TTT或AAA)或具有5个或更多碱基的回文序列的任何19-mer序列。此外，其余的19-mer序列可以被选择以具有与其他基因的低序列同源性。在一个特定的实例中，通过BLASTN相对于NCBI的人类UniGene簇序列数据库检索可能的目标序列。人类UniGene数据库含有基因定向族的非冗余的集合。每个UniGene簇包括代表唯一基因的序列。可以选择在BLASTN检索中不产生对其他人类基因的命中的19-mer序列。在检索期间，e值可以设置在严格的值(例如“1”)。
siRNA序列以及任何其他衍生的RNAi序列的有效性，可以使用本领域已知的各种方法来评估。例如，siRNA序列可以被导入表达KCNQ5或KCNQ5(W270L)的细胞。可以检测在细胞中KCNQ5或KCNQ5(W270L)的多肽或mRNA水平。在引入siRNA序列之前或之后KCNQ5或KCNQ5(W270L)的表达水平的实质改变是siRNA序列在抑制KCNQ5或KCNQ5(W270L)的表达方面的有效性的表现。在一个特定的实例中，在导入siRNA序列之前和之后还监视其他基因的表达水平。可以选择对于KCNQ5或KCNQ5(W270L)表达有抑制效果但不显著地影响其他基因的表达的siRNA序列。在另一个特定的实例中，多个siRNA或其他RNAi序列可以被导入同一目标细胞。这些siRNA或RNAi序列特异性地抑制KCNQ5或KCNQ5(W270L)表达而不抑制其他基因的表达。在又一个特定的实例中，可以使用抑制KCNQ5或KCNQ5(W270L)和其他基因的表达的siRNA或其他RNAi序列。
反义多核苷酸可以在转染细胞或转基因细胞中从异源表达盒产生。做为选择，反义多核苷酸可以包含向外部环境，在体外的培养基中、或在循环系统中、或在体内的组织间隙液中施用的可溶的寡核苷酸。在外部环境中存在的可溶的反义多核苷酸已经显示了进入细胞质并抑制特定mRNA种类的翻译。
III.分离的KCNQ5和KCNQ5(W270L)蛋白质、其片段，以及抗KCNQ5和抗KCNQ5(W270L)抗体
另一个方面涉及分离的KCNQ5和KCNQ5(W270L)和其生物学活性部分，以及适合用作免疫原来产生抗KCNQ5或抗KCNQ5(W270L)抗体的多肽片段。在一个实施方式中，可以使用标准的蛋白纯化技术通过合适的纯化方案从细胞或组织来源分离天然KCNQ5和KCNQ5(W270L)蛋白。在另一个实施方式中，通过重组DNA技术产生KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质。作为对重组表达的替代，可以使用标准的肽合成技术来化学地合成KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽。要理解的是，在讨论KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的用途时，例如SEQ ID NO：2中所示的，可以使用不是全长KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽的这些蛋白质的片段以及全长的KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质。
另一个方面涉及分离的KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质。优选的，KCNQ5(W270L)蛋白质包含由SEQ ID NO：1编码的氨基酸序列或其部分。在另一个优选的实施方式中，所述蛋白质包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其部分。在其他实施方式中，所述蛋白质具有与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列或其部分具有至少90％、更优选的95％、再更优选的98％的氨基酸同一性，只要在氨基酸270的替换不为KCNQ5多肽重建瑞替加滨敏感性。KCNQ5(W270L)多肽分子的优选的部分是生物学活性的，例如，具有在宿主系统例如哺乳动物细胞系或爪蟾卵母细胞中编码功能性钾选择性离子通道的能力的KCNQ5(W270L)多肽的一部分。
KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的生物学活性部分包括包含以下氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列足够地同源于或者来源于KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的氨基酸序列，其包括比全长KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质更少的氨基酸，并且展现KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的至少一种活性。
另一个方面是含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域代替KCNQ5的野生型跨膜结构域的KCNQ5多肽。优选的，所述S5-S6跨膜结构域来自人类KCNQ1。在一个实施方式中，KCNQ5多肽的氨基酸序列包含具有用来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域替换的氨基酸257-354的SEQID NO：4。优选的，SEQ ID NO：4的氨基酸257-354被SEQ ID NO：6替换。
另一个方面是含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域代替KCNQ5的野生型跨膜结构域的KCNQ5多肽。优选的，所述S5跨膜结构域来自人类KCNQ1。在一个实施方式中，KCNQ5多肽的氨基酸序列包含具有用来自KCNQ1的S5跨膜结构域替换的氨基酸257-291的SEQ ID NO：4。优选的，SEQ ID NO：4的氨基酸257-291被1-35SEQ ID NO：6替换。
还提供的是KCNQ5或KCNQ5(W270L)嵌合或融合蛋白。例如，在一个实施方式中，所述融合蛋白是GST-KCNQ5(W270L)成员融合蛋白，其中KCNQ5(W270L)成员序列被融合到GST序列的C-末端。在另一个实施方式中，融合蛋白是KCNQ5(W270L)-HA融合蛋白，其中KCNQ5(W270L)成员核苷酸序列被插入载体中，例如pCEP4-HA载体(Herrscher RF et al.，Genes Dev.9：3067-82(1995))，从而KCNQ5(W270L)成员序列按阅读框融合到流感血球凝集素表位标签。这种融合蛋白可以便于重组的KCNQ5(W270L)成员的纯化。
通过重组技术产生的融合蛋白和肽可以被分泌并从含有蛋白质或肽的细胞和培养基的混合物中分离。做为选择，所述蛋白质或肽可以在细胞质中保持，收获、裂解细胞，分离蛋白质。细胞培养物一般包括宿主细胞、培养基和其他副产物。用于细胞培养的适合的培养基是本领域公知的。蛋白质和肽可以使用用于纯化蛋白质和多肽的本领域已知的技术分离自细胞培养介质、宿主细胞或两者。转染宿主细胞和纯化蛋白质和肽的技术是本领域已知的。
优选的，通过标准的重组DNA技术产生KCNQ5或KCNQ5(W270L)融合蛋白。例如，根据标准技术将编码不同多肽序列的DNA片段按阅读框连接在一起，例如，通过使用平端的或交错端的末端用于连接，限制性内切酶消化以提供合适的末端，视情况填补粘性末端，碱性磷酸酶处理以避免不希望的接合，和酶连接。在另一个实施方式中，融合基因可以通过标准技术，包括自动的DNA合成仪来合成。做为选择，可以使用锚引物来进行基因片段的PCR扩增，所述锚引物产生两个连续基因片段之间的互补的突出，其随后可以退火和再扩增以产生嵌合基因序列(参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology，eds.Ausubel et al.，John Wiley & Sons：1992)。此外许多已经编码融合部分的表达载体(例如，GST多肽或HA表位标签)是商业上可获得的。KCNQ5编码核酸或KCNQ5(W270L)编码核酸被克隆到这样的表达载体中，从而融合部分按阅读框连接到KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质。
在另一个实施方式中，所述融合蛋白是在其N-末端含有异源信号序列的KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质。在某些宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)中，KCNQ5或KCNQ5(W270L)的表达和/或分泌可以通过使用异源信号序列来提高。KCNQ5或KCNQ5(W270L)融合蛋白可以掺入药物组合物并体内施用给受试者。KCNQ5或KCNQ5(W270L)融合蛋白的用途可以是对于失调例如与尿失禁或神经性疼痛有关的状况的治疗在治疗上有用的。此外，KCNQ5或KCNQ5(W270L)融合蛋白可以用作免疫原来在受试者中产生抗KCNQ5或抗KCNQ5(W270L)抗体。
在此提供的是功能性的钾通道，其中所述功能性通道的至少一个亚单位是在此描述的KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质或多肽。KCNQ通道已知形成同二聚体、异二聚体、同四聚体和异四聚体。例如，KCNQ5(W270L)蛋白质可以与自身形成同二聚体，与来自另一个物种的KCNQ5蛋白质形成异二聚体，与KCNQ5(W270L)蛋白质受体形成异二聚体，与KCNQ3形成异二聚体，与3个相同的KCNQ5(W270L)亚单位形成同四聚体，与至少一个不同的KCNQ5亚单位形成异四聚体，或与至少一种不同的KCNQ蛋白质例如KCNQ3形成异四聚体。
另一个方面涉及KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的变体，其作为KCNQ5或KCNQ5(W270L)激动剂(模拟物)或作为KCNQ5或KCNQ5(W270L)拮抗剂起作用。KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的变体可以通过诱变，例如，离散点突变体或KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的截短来产生。KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的激动剂可以基本上保持KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的天然发生形式的相同的生物学活性，或其生物学的活性的子集。KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白的拮抗剂可以通过例如竞争调节野生型KCNQ5蛋白质的细胞活性，来抑制KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白的天然发生的形式的一种或多种活性。因而，通过用有限功能的变体处理可以引发特定的生物学效果。在一个实施方式中，用具有所述蛋白的天然发生形式的生物学活性子集的变体治疗受试者，相对于用KCNQ5蛋白的天然发生形式治疗，在受试者中有较少的副作用。
一个实施方式涉及KCNQ5或KCNQ5(W270L)的衍生物，其可以通过氧化、还原或本领域已知的其他衍生过程通过修饰KCNQ5或KCNQ5(W270L)的至少一个氨基酸残基来形成。
在一个实施方式中，作为KCNQ5或KCNQ5(W270L)激动剂(模拟物)或作为KCNQ5或KCNQ5(W270L)拮抗剂起作用的KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白变体可以通过筛选KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的突变体的组合库，例如截短突变体中的KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质激动剂或拮抗剂活性来鉴定。KCNQ5多肽可以含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域。做为选择，KCNQ5多肽可以含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域。在一个实施方式中，KCNQ5或KCNQ5(W270L)变体的多样化的文库通过核酸水平的组合诱变来产生，并由多样化的基因文库编码。可以通过例如，将合成寡核苷酸的混合物通过酶学手段连接到基因序列中，从而作为单独的多肽或作为其中含有KCNQ5或KCNQ5(W270L)序列集的更大的融合蛋白的集合(例如，对于噬菌体展示)，可能的KCNQ5或KCNQ5(W270L)序列的简并集合是可表达的，来产生KCNQ5或KCNQ5(W270L)变体的多样化库。
存在着可用于从简并寡核苷酸序列产生可能的KCNQ5或KCNQ5(W270L)变体的库的各种方法。可以在自动DNA合成仪中进行简并基因序列的化学合成，合成基因然后可以连接到适合的表达载体中。使用基因的简并组允许在混合物中提供编码期望的、可能的KCNQ5或KCNQ5(W270L)序列组的所有序列。用于合成简并寡核苷酸的方法是本领域已知的(参见，例如Narang SA，Tetrahedron 39：3-22(1983)；ItakuraK et al.，Annu.Rev.Biochem.53：323-56(1984)；Itakura K et al.，Science198：1056-63(1977)；Ike Y et al.，Nucleic Acids Res.11：477-88(1983))。
此外，KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白编码序列的片段的库可以用来产生KCNQ5或KCNQ5(W270L)片段的多样化群体，用于KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白变体的筛选和随后的选择。在一个实施方式中，通过用核酸酶在每分子仅发生一次断开的条件下处理KCNQ5或KCNQ5(W270L)编码序列的双链PCR片段、使双链DNA变性、还原DNA来形成包括来自不同的断口产物的正义/反义配对的双链DNA、通过用SI核酸酶处理从形成的双链体除去单链的部分、并连接产生的片段库到表达载体中，可以产生编码序列片段的库。通过这种方法，可以得到表达库，其编码KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的各种大小的N-末端、C-末端和内部片段。
用于筛选由点突变或截短产生的组合库的基因产物，以及用于筛选cDNA库中具有选定性质的基因产物的几种技术是本领域已知的。这些技术适合于通过KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的组合诱变产生的基因库的快速筛选。可以经受高通量分析、用于筛选大的基因库的最广泛使用的技术一般包括将基因文库克隆到可复制的表达载体中，用产生的载体库转化合适的细胞，并在一定条件下表达组合的基因，在所述条件中期望的活性的检测便于分离编码被检出产物的基因的载体。一种提高库中功能性突变体的频率的技术循环群体诱变(recursive ensemblemutagenesis，REM)可以与所述筛选分析组合使用来鉴定KCNQ5或KCNQ5(W270L)变体(Arkin AP and Youvan DC，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7811-15(1992)；Delgrave S et al.，Protein Eng.6：327-31(1993))。
在一个实施方式中，可以采用基于细胞的分析来分析多样化的KCNQ5或KCNQ5(W270L)库。例如，表达载体的库可以被转染到合成KCNQ5(W270L)的细胞系中。然后培养转染的细胞，从而合成KCNQ5(W270L)和特定的突变体KCNQ5(W270L)，在细胞上清液中突变体的表达对于KCNQ5(W270L)活性的影响可以通过例如任何的多种酶学分析来检测。然后可以从记录了KCNQ5(W270L)活性的抑制、或作为选择KCNQ5(W270L)活性的增强的细胞回收质粒DNA，进一步表征单独的克隆。
除了仅由天然发生的氨基酸组成的KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽之外，还提供了KCNQ5或KCNQ5(W270L)拟肽。肽类似物通常用于制药工业，作为具有类似于模板肽的性质的非肽药物。这些类型的非肽化合物被称为“肽模拟物(peptide mimetics)”或“拟肽(peptidomimetics)”(Fauchere J，Adv.Drug Res.15：29(1986)；Veber DF andFreidinger RM，Trends Neurosci.8：392-96(1985)；Evans BE et al.，J.Med.Chem 30：1229-39(1987))，通常借助于计算机化的分子建模来开发。结构上类似于治疗上有用的肽的肽模拟物可被用于产生相等的治疗或预防效果。一般地，拟肽在结构上类似于规范多肽(即，具有生物学或药理学活性的多肽)，例如KCNQ5(W270L)，但是任选地具有被选自以下构成的组的键替代的一个或多个肽键：--CH2NH--、--CH2S--、--CH2--CH2--、--CH＝CH--(顺式和反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2—和--CH2SO--，通过本领域已知的方法和在以下参考文献中进一步描述的方法：SpatolaAF in“Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides，andProteins，”B.Weinstein，ed.，Marcel Dekker，New York，p.267(1983)；Spatola，AF，Vega Data(March1983)，Vol.1，Issue 3，“Peptide BackboneModifications”(general review)；Morley JS，Trends Pharmcol.Sci.1：463-68(1980)(general review)；Hudson D et al.，Int.J.Pept.Prot.Res.14：177-85(1979)(--CH2NH--，CH2CH2--)；Spatola AF et al.，Life Sci.38：1243-49(1986)(--CH2--S)；Hann MM，J.Chem.Soc.Perkin Trans.1，307-314(1982)(--CH-CH--，cis and trans)；Almquist RG et al.，J.Med.Chem.23：1392-98(1980)(--COCH2--)；Jennings-White C et al.，Tetrahedron Lett.23：2533-34(1982)(--COCH2--)；EP 0 045665(--CH(OH)CH2--)；Holladay MW et al.，Tetrahedron Lett.，24：4401-04(1983)(--C(OH)CH2--)；Hruby VJ，Life Sci.31：189-99(1982)(--CH2--S--)。特别优选的非肽键是-CH2NH-。这种肽模拟物可能比多肽实施方式有显著的优点，包括，例如：更为经济的生产、更高的化学稳定性、增强的药理学性质(半衰期、吸收、效力、效果，等等)、改变的特异性(例如，广谱的生物学活性)、降低的抗原性，等等。拟肽的标记通常涉及一个或多个标记物的共价附着，直接地或通过间隔区(例如，酰胺基)附着到通过定量的结构-活性数据和/或分子建模预测的拟肽上非干扰位置。这些非干扰位置一般是与大分子不形成直接接触的位置，拟肽结合到所述大分子上来产生治疗效果。拟肽的衍生化(例如，标记)应当基本上不影响拟肽的期望的生物学或药理学活性。
用相同类型的D氨基酸(例如，D-赖氨酸代替L-赖氨酸)系统性的替换KCNQ5或KCNQ5(W270L)氨基酸序列的一个或多个氨基酸可以用于产生更稳定的肽。此外，可以通过本领域已知的方法(Rizo andGierasch(1992)Ann.Rev.Biochem.61：387)，例如，通过添加能形成分子内二硫键使肽环化的内部半胱氨酸残基，来产生包含KCNQ5或KCNQ5(W270L)氨基酸序列或基本上相同的序列变体的限制肽。
在此鉴定的KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列将允许本领域的技术人员产生与KCNQ5或KCNQ5(W270L)肽序列和其序列变体相应的多肽。这些多肽可以通过表达编码KCNQ5或KCNQ5(W270L)肽序列、通常作为更大多肽的部分的多核苷酸在原核或真核宿主细胞中产生。做为选择，这些肽可以通过化学方法来合成。对于重组宿主中异源蛋白质的表达、多肽的化学合成和体外翻译的方法是本领域公知的，进一步在Sambrook J et al.，同上；Berger and Kimmel，Methods inEnzymology，Volume 152，Guide to Molecular Cloning Techniques(1987)，Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.；Gutte B and Merrifield RB，J.Am.Chem.Soc.91：501-02(1969)；Chaiken IM，CRC Crit.Rev.Biochem.11：255-301(1981)；Kaiser ET et al.，Science 243：187-92(1989)；Merrifield B，Science 232：341-47(1986)；Kent SBH，Ann.Rev.Biochem.57：957-89(1988)；Offord，R.E.(1980)Semisynthetic Proteins，WileyPublishing中描述。
肽一般可以通过直接化学合成来产生。肽可以作为修饰的肽产生，具有通过共价键连接到N-末端和/或C-末端的非肽部分。在某些优选的实施方式中，羧基末端或氨基末端之一或两者被化学上修饰。末端氨基和羧基的最常见的修饰分别是乙酰化和酰胺化。氨基末端修饰例如酰化(例如，乙酰化)或烷化(例如，甲基化)和羧基末端修饰例如酰胺化，以及其他末端修饰，包括环化，可以合并到各种实施方式中。某些氨基末端和/或羧基末端修饰和/或对核心序列的肽延伸可以提供有益的物理的、化学的、生物化学的和药理学的性质，例如：增强的稳定性、提高的效价和/或效力、对血清蛋白酶的抗性、希望的药物动力学性质，等等。肽可以治疗地使用来治疗疾病。
分离的KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白或其部分或片段也可以被用作免疫原使用多克隆和单克隆抗体制备的标准技术来产生结合KCNQ5或KCNQ5(W270L)的抗体。可以使用全长KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白，或做为选择，另一个方面提供了用作免疫原的KCNQ5或KCNQ5(W270L)的抗原性肽片段。KCNQ5或KCNQ5(W270L)的抗原性肽包括至少8个氨基酸残基，并且包括KCNQ5或KCNQ5(W270L)的表位，从而针对所述肽形成的抗体与KCNQ5或KCNQ5(W270L)形成特异性免疫复合物。优选的，所述抗原性肽包含至少10个氨基酸残基、更优选的至少15个氨基酸残基、再更优选的至少20个氨基酸残基、最优选的至少30个氨基酸残基。在一个实施方式中，所述抗原性肽包括SEQID NO：2的氨基酸270。
由所述抗原性肽包括的优选的表位是位于蛋白质的表面的KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽的区域，例如，亲水性区域，并且其对于KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽是独特的。在一个实施方式中，这种表位可以特异于来自一个物种的KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质，例如人类(即，跨越了在物种间非保守的KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽区域的抗原性肽被用作免疫原；这种非保守的残基可以使用在此提供的比对来确定)。可以进行蛋白质的标准的疏水性分析来鉴定亲水性区域。
KCNQ5或KCNQ5(W270L)免疫原一般用于通过使用该免疫原免疫适合的受试者(例如，兔、山羊、小鼠或其他哺乳动物)来制备抗体。适合的免疫原性制品可以含有，例如，重组表达的KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白或化学合成的KCNQ5或KCNQ5(W270L)肽。该制品可以进一步包括佐剂，例如弗氏完全或不完全佐剂，或类似的免疫刺激性试剂。用免疫原性KCNQ5或KCNQ5(W270L)制品免疫适合的受试者诱导了多克隆抗抗KCNQ5或抗KCNQ5(W270L)抗体反应。
因而，另一个方面涉及抗KCNQ5或抗KCNQ5(W270L)抗体的用途。如上所述通过用KCNQ5或KCNQ5(W270L)免疫原免疫适合的受试者可以制备多克隆抗KCNQ5或抗KCNQ5(W270L)抗体。可以通过标准技术，例如，用使用了固定的KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽的酶联免疫吸附分析(ELISA)，可以监视免疫的受试者中在时间上的抗KCNQ5或抗KCNQ5(W270L)抗体滴度。如果希望，针对KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽的抗体分子可以从哺乳动物(例如，从血液)分离，通过公知的技术进一步纯化，例如蛋白A层析，来获得IgG级分。在免疫后合适的时间，例如，当抗KCNQ5或抗KCNQ5(W270L)抗体滴度最高时，可以从受试者获得抗体生产细胞并用于通过标准技术制备单克隆抗体，例如由Kohler G and Milstein C，Nature 256：495-97(1975)首先描述的杂交瘤技术(还参见，Brown JP et al.，J.Immunol.127：539-46(1981)；Brown JP et al.，J.Biol.Chem.255：4980-83(1980)；Yeh MY et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：2927-31(1979)；Yeh MY et al.，Int.J.Cancer 29：269-75(1982))，更新近的人类B细胞杂交瘤技术(Kozbor D and Roder JC，Immunol.Today 4：72-79(1983))、EBV杂交瘤技术(Cole et al.(1985)，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)或三体瘤(trioma)技术。用于生产单克隆抗体杂交瘤的技术是公知的(一般参见，Kenneth RH，in Monoclonal Antibodies：A New Dimension In BiologicalAnalyses，Plenum Publishing Corp.，New York，N.Y.(1980)；Lerner EA，Yale J.Biol.Med.，54：387-402(1981)；Gefter ML et al.，Somatic Cell Genet.3：231-36(1977))。简要地，将永生细胞系(一般是骨髓瘤)与来自用如上所述KCNQ5或KCNQ5(W270L)免疫原免疫的哺乳动物的淋巴细胞(一般是脾细胞)融合，筛选产生的杂交瘤细胞的培养物上清液来鉴定产生特异性结合KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽的单克隆抗体的杂交瘤。
可以将许多用于融合淋巴细胞和永生细胞系的已知方案的任何一种，应用于产生抗KCNQ5或抗KCNQ5(W270L)单克隆抗体的目的(参见，例如Galfre G et al.，Nature 266：550-52(1977)；Geifer ML et al.，supra；Lerner EA，supra；Kenneth RH，同上)。此外，普通技术人员将能理解，存在着也会有用的这些方法的许多变体。一般地，永生细胞系(例如，骨髓瘤细胞系)来自与淋巴细胞相同的哺乳动物物种。例如，鼠杂交瘤通过融合来自用免疫原性制品免疫的小鼠的淋巴细胞和永生的小鼠细胞系来产生。优选的永生细胞系是小鼠骨髓瘤细胞系，其对于含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷的培养基(＂HAT培养基＂)是敏感的。任何的多种骨髓瘤细胞系可以根据标准技术用作融合配偶体，例如，P3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Ag14骨髓瘤系。这些骨髓瘤系可以从美国典型培养物保藏所(ATCC)，Rockville，Md获得。一般地，HAT敏感性小鼠骨髓瘤细胞使用聚乙二醇(“PEG”)与小鼠脾细胞融合。然后使用HAT培养基选择从融合产生的杂交瘤细胞，其杀死了未融合的和非生产性的融合骨髓瘤细胞(由于未被转化，未融合的脾细胞在几天后死亡)。生产单克隆抗体的杂交瘤细胞通过筛选杂交瘤培养物上清液中结合KCNQ5或KCNQ5(W270L)分子的抗体，例如，使用标准的ELISA分析，来检测。
作为对制备单克隆抗体分泌杂交瘤的选择，可以通过用KCNQ5或KCNQ5(W270L)筛选重组组合免疫球蛋白库(例如，抗体噬菌体展示库)从而分离结合KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽的免疫球蛋白库成员，来鉴定和分离单克隆抗KCNQ5或抗KCNQ5(W270L)抗体。用于产生和筛选噬菌体展示库的试剂盒是商业上可获得的(例如，GE Healthcare重组噬菌体抗体系统，Catalog No.27-9400-01)。另外，特别可以用于产生和筛选抗体展示库的方法和试剂的实例可以在，例如美国专利No.5,223,409；WO 92/18619；WO 91/17271；WO 92/20791；WO92/15679；WO 93/01288；WO 92/01047；WO 92/09690；WO90/02809；Fuchs P et al.，Biotechnology(N.Y.)9：1370-72(1991)；Hay BNet al.，Hum.Antibodies Hybridomas 3：81-85(1992)；Huse WD et al.，Science 246：1275-81(1989)；Griffiths AD et al.，EMBO J.12：725-34(1993)；Hawkins RE et al.，J.Mol.Biol.226：889-96(1992)；Clarkson T et al.，Nature 352：624-28(1991)；Gram H et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3576-80(1992)；Garrard LJ et al.，Biotechnology(N.Y.)9：1373-77(1991)；Hoogenboom HR et al.，Nucleic Acids Res.19：4133-37(1991)；Barbas CF et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：7978-82(1991)；和McCafferty J et al.，Nature 348：552-54(1990)中找到。
另外，可以使用标准重组DNA技术产生的重组抗KCNQ5或抗KCNQ5(W270L)抗体，例如包含人类和非人类部分的嵌合的和人源化单克隆抗体，处于当前的公开的范围之内。这种嵌合和人源化单克隆抗体可以通过本领域已知的重组DNA技术产生，例如，使用在WO 87/02671；EP 0 184 187；EP 0 171 496；EP 0 173 494；WO 86/01533；美国专利No.4,816,567；EP 0 125 023；Better Met al.，Science240：1041-43(1988)；Liu AY et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：3439-43(1987)；Liu AY et al.，J.Immunol.139：3521-26(1987)；SunLK et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：214-18(1987)；Nishimura Y et al.，Cancer Res.47：999-1005(1987)；Wood CR et al.，Nature314：446-49(1985)；Shaw DR et al.，J.Natl.Cancer Inst.80：1553-59(1988)；Morrison SL，Science 229：1202-07(1985)；U.S.PatentNo.5,225,539；Verhocyan M et al.，Science 239：1534-36(1988)；和Beidler CB et al.，J.Immunol.141：4053-60(1988)中描述的方法。
此外，人源化抗体可以根据标准方案，例如在美国专利NO.5,565,332中公开的那些来产生。在另一个实施方式中，抗体链或特异性结合配对成员可以通过使用本领域已知的技术，例如，如美国专利NO.5,565,332；5,871,907或5,733,743中描述的，在包含编码融合物的核酸分子的载体和含有编码单个结合配对成员的第二多肽链的核酸分子的载体之间重组来产生，所述融合物是特异性结合配对成员的多肽链和可复制的遗传展示包装的组件的融合物。
抗KCNQ5或抗KCNQ5(W270L)抗体(例如，单克隆抗体)可以用于通过标准技术，例如亲和层析或免疫沉淀来分离KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽。KCNQ5多肽可以含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域。做为选择，KCNQ5多肽可以含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域。抗KCNQ5或抗KCNQ5(W270L)抗体可以便于天然KCNQ5多肽从细胞中的纯化，或在宿主细胞中表达的重组产生的KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽的纯化。此外，抗KCNQ5或抗KCNQ5(W270L)抗体可以用于检测KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质(例如，在细胞溶胞产物或细胞上清液中)。KCNQ5多肽可以含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域。做为选择，KCNQ5多肽可以含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域。可以通过将抗体联结(即，物理连接)到可检测物质来便于检测。因而，在一个实施方式中，抗KCNQ5或抗KCNQ5(W270L)抗体用可检测物质来标记。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。适合的酶的实例包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合的辅基复合物的实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；适合的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红素；发光材料的实例包括鲁米诺；适合的放射性材料的实例包括125I、131I、35S或3H。
抗KCNQ5或抗KCNQ5(W270L)抗体还可通过包括以下的过程获得：
(a)用独特于KCNQ5多肽的免疫原性KCNQ5多肽或其免疫原性部分免疫动物；和
(b)从所述动物中分离特异性结合KCNQ5多肽的抗体。
优选的，所述KCNQ5多肽选自由(i)包含KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列的多肽；(ii)含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽；和(iii)含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽构成的组。更优选的，所述免疫原性KCNQ5多肽是SEQ ID NO：2。
因而，在一个实施方式中，例如，可以细胞内地使用抗KCNQ5或抗KCNQ5(W270L)抗体来抑制蛋白质活性。使用细胞内抗体来抑制细胞中的蛋白质功能是本领域已知的(参见，例如Carlson JR，Mol.Cell.Biol.8：2638-46(1988)；Biocca S et al.，EMBO J.9：101-08(1990)；Werge TM etal.，FEBS Lett.274：193-98(1990)；Carlson JR，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：7427-28(1993)；Marasco WA et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：7889-93(1993)；Biocca S et al.，Biotechnology(N.Y.)12：396-99(1994)；Chen S-Y et al.，Hum.Gene Ther.5：595-601(1994)；Duan L et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：5075-79(1994)；Chen S-Y etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：5932-36(1994)；Beerli RR et al.，J.Biol.Chem.269：23931-36(1994)；Beerli RR et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.204：666-72(1994)；Mhashilkar AM et al.，EMBO J.14：1542-51(1995)；Richardson JH et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：3137-41(1995)；WO 94/02610；和WO 95/03832)。
在一个实施方式中，制备重组表达载体，其编码这种形式的抗体链，从而在将载体导入细胞时，所述抗体链被表达为在细胞的细胞内区室中的功能性抗体。为了根据在此公开的抑制方法抑制KCNQ5或KCNQ5(W270L)活性，特异性结合KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的细胞内抗体在细胞的细胞质中或细胞外地表达。为了制备细胞内抗体表达载体，分离编码特异于感兴趣的目标蛋白质例如KCNQ5(W270L)的抗体链的抗体轻链和重链cDNA，一般从分泌特异于KCNQ5(W270L)蛋白质的单克隆抗体的杂交瘤分离。可以如上所述地制备分泌抗KCNQ5(W270L)单克隆抗体或重组抗KCNQ5(W270L)单克隆抗体的杂交瘤。一旦鉴定了特异于KCNQ5(W270L)蛋白质的单克隆抗体(例如，杂交瘤衍生的单克隆抗体或来自组合库的重组抗体)，通过标准的分子生物学技术分离编码单克隆抗体的轻链和重链的DNA。对于杂交瘤衍生的抗体，可以通过例如PCR扩增或cDNA库筛选来获得轻链和重链cDNA。对于重组抗体，例如，来自噬菌体展示库的，编码轻链和重链的cDNA可以从库筛选过程期间分离的展示包装物(例如，噬菌体)中回收。从中可以制备PCR引物或cDNA库探针的抗体轻链和重链基因的核苷酸序列是本领域已知的。例如，在Kabat EA et al.(1991)Sequences of Proteinsof Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health andHuman Services，NIH Publication No.91-3242中和在“Vbase”人类种系序列数据库中公开了许多这样的序列。
一旦获得了，使用标准方法将抗体轻链和重链序列克隆到重组表达载体中。为了允许轻链和重链的细胞质表达，除去编码轻链和重链的疏水性前导区的核苷酸序列。细胞内抗体表达载体可以以几种不同的形式之一编码细胞内抗体。例如，在一个实施方式中，载体编码全长抗体轻链和重链，从而全长抗体被细胞内地表达。在另一个实施方式中，载体编码全长轻链，但是仅重链的VH/CH1区域，从而细胞内地表达Fab片段。在最优选的实施方式中，载体编码单链抗体(scFv)，其中轻链和重链的可变区通过柔性的肽接头(例如，(Gly4Ser)3)连接并表达为单链分子。为了抑制细胞中的KCNQ5或KCNQ5(W270L)活性，编码抗KCNQ5或抗KCNQ5(W270L)细胞内抗体的表达载体通过标准转染方法导入细胞，如在此讨论的。
IV.重组表达载体和宿主细胞
另一个方面涉及载体，优选表达载体，含有编码KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质(或其部分)的核酸。核酸可以编码含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽。做为选择，核酸可以编码含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽。重组表达载体包含以适合于宿主细胞中核酸表达的形式存在的核酸，这意味着所述重组表达载体包括一个或多个根据用于表达的宿主细胞选择的调节序列，所述调节序列与要表达的核酸序列可操作连接。术语“调节序列”意图包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。例如，在Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)中描述了这些调节序列。调节序列包括在许多种类的宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型表达的那些，和仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列表达的那些(例如，组织特异性调节序列)。本领域技术人员要理解的是，表达载体的设计可以取决于一些因素，例如，要转化的宿主细胞的选择、希望的蛋白表达水平，等等。表达载体可以被导入宿主细胞，从而生产由在此描述的核酸编码的蛋白或肽，包括融合蛋白或肽(例如，KCNQ5(W270L)蛋白、KCNQ5(W270L)蛋白的突变形式、融合蛋白，等等)。
重组表达载体可以被设计为在原核或真核细胞中表达KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质。例如，KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白可以在细菌细胞例如E.coli、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞、两栖动物细胞或哺乳动物细胞中表达。适合的宿主细胞进一步在Goeddel，上文中讨论。做为选择，重组表达载体可以体外转录和翻译，例如，使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
原核生物中的蛋白表达最常见地在E.coli中利用载体进行，所述载体含有指导融合或非融合蛋白表达的组成型或可诱导启动子。融合载体向其中编码的蛋白质添加许多氨基酸，通常添加到重组蛋白质的氨基末端。这些融合载体一般提供了三个目的：1)提高重组蛋白质的表达，2)提高重组蛋白质的溶解度，以及3)通过作为亲和纯化中的配体起作用来帮助重组蛋白质的纯化。通常，在融合物表达载体中，将蛋白水解裂解位点导入到融合部分和重组蛋白质的连接处，以允许在融合蛋白的纯化之后从融合部分分离重组蛋白质。这些酶和它们的相关识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括，例如，pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith DB and Johnson KS，Gene67：31-40(1988))和pMAL(New England Biolabs，Beverly，Mass.)，其分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)或麦芽糖E结合蛋白融合到目标重组蛋白质。
纯化的融合蛋白可以在例如KCNQ5或KCNQ5(W270L)活性分析(例如，以下详述的直接测定或竞争性分析)中利用，或用于产生特异于KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的抗体。
适合的可诱导非融合E.coli表达载体的实例包括pTrc(Amann E etal.，Gene 69：301-15(1988))和pET 11d(Studier et al.，Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)pp.60-89)。来自pTrc载体的目标基因表达依靠来自杂交的trp-lac融合启动子的宿主RNA聚合酶转录。来自pET 11d载体的目标基因表达依靠由共表达的病毒RNA聚合酶(T7 gnl)介导的来自T7gnl0-lac融合启动子的转录。这种病毒聚合酶是在lacUV 5启动子的转录控制下由来自携带T7gnl基因的常驻原噬菌体的宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)提供的。
最大化在E.coli中的重组蛋白质表达的一种策略是在宿主细菌中表达蛋白质，所述宿主细菌具有的蛋白裂解所述重组蛋白质的能力受到损害(Gottesman S，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)pp.119-28)。另一个策略是改变要插入表达载体中的核酸的核酸序列，从而每个氨基酸的单独密码子是在E.coli中优先地利用的那些(Wada K et al.，Nucleic Acids Res.20(Suppl.)：2111-18(1992))。这些核酸序列的改变可以通过标准的DNA合成技术来进行。
在另一个实施方式中，所述KCNQ5或KCNQ5(W270L)表达载体是酵母表达载体。用于在酵母S.cerevisiae中表达的载体的实例包括pYepSecl(Baldari C et al.，EMBO J.6：229-34(1987))、pMFa(Kurjan J andHerskowitz I，Cell 30：933-43(1982))、pJRY88(Schultz LD et al.，Gene54：113-23(1987))、pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，Calif.)和picZ(Invitrogen Corp，San Diego，Calif.)。
做为选择，KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白或多肽可以使用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达。可用于在培养的昆虫细胞(例如，Sf9细胞)中表达蛋白的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith GE et al.，Mol.Cell.Biol.3：2156-65(1983))和pVL系列(Lucklow VA and Summers MD，Virology 170：31-39(1989))。
在又一个实施方式中，核酸使用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed B，Nature329：840-41(1987))和pMT2PC(Kaufman RJ et al.，EMBO J.6：187-95(1987)。当在哺乳动物细胞中使用时，通常通过病毒调节元件来提供表达载体的控制功能。例如，常用的启动子来源于多形瘤、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。关于原核和真核细胞的其他适合的表达系统，参见Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，and Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989的第16和17章。
在另一个实施方式中，重组哺乳动物表达载体能够指导核酸优先地在特定细胞类型中表达(例如，使用组织特异性调节元件来表达核酸)。组织特异性调节元件是本领域已知的。适合的组织特异性启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(liver-specific；Pinkert CA et al.，Genes Dev.1：268-77(1987))、淋巴特异性启动子(Calame K and Eaton S，Adv.Immunol.43：235-75(1988))、特别是T细胞受体的启动子(Winoto A andBaltimore D，EMBO J.8：729-33(1989))和免疫球蛋白(Banerji J et al.，Cell33：729-40(1983)；Queen C and Baltimore D，Cell 33：741-48(1983))、神经元特异性启动子(例如，神经丝启动子；Byrne GW and Ruddle FH，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5473-77(1989))、胰腺特异性启动子(Edlund T etal.，Science 230：912-16(1985))和乳腺特异性启动子(例如，牛奶乳清启动子；美国专利No.4,873,316和EP 0 264 166)。还包括发育调节的启动子，例如鼠hox启动子(Kessel M and Gruss P，Science 249：374-79(1990))和α-甲胎蛋白启动子(Camper SA and Tilghman SM，Genes Dev.3：537-46(1989))。
此外，在哺乳动物细胞中使用的可诱导的调节系统是本领域已知的，例如，其中基因表达被重金属离子调节的系统(参见，例如，MayoKE et al.，Cell 29：99-108(1982)；Brinster RL et al.，Nature296：39-42(1982)；Searle PF et al.，Mol.Cell.Biol.5：1480-89(1985))、热激的(参见，例如，Nouer L et al.(1991)in Heat Shock Response，ed.Nouer L，CRC，Boca Raton，Fla.，pp.167-220)、激素的(参见，例如，Lee Fet al.，Nature 294：228-32(1981)；Hynes NE et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2038-42(1981)；Klock G et al.，Nature 329：734-36(1987)；IsraelDI and Kaufman RJ，Nucleic Acids Res.17：2589-2604(1989)；WO93/23431)、FK506相关的分子(参见，例如，WO 94/18317)或四环素(Gossen M and Bujard H，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-51(1992)；Gossen M et al.，Science 268：1766-69(1995)；WO 94/29442；WO96/01313)。因而，另一个实施方式提供了重组表达载体，其中KCNQ5或KCNQ5(W270L)DNA可操作地连接到可诱导的真核启动子，从而允许KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质在真核细胞中的可诱导表达。
本领域还已知的是使用单臂同源重组表达内源蛋白质的方法(参见，例如，美国公开的专利申请No.2005/0003367；Zeh et al.，Assay DrugDev.Technol.1：755-65(2003)；Qureshi et al.，Assay Drug Dev.Technol.1：767-76(2003))。简要地，包含与KCNQ5或KCNQ5(W270L)目标序列可操作连接的启动子的分离的基因组构建体被导入细胞的均质群体(例如，人类细胞系的匀质群体，或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的匀质群体)。启动子对于KCNQ5或KCNQ5(W270L)目标基因是异源的。在重组之后，启动子控制了编码KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽的mRNA的转录。细胞的群体然后在引起KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽表达的条件下孵育。
进一步的方面提供了重组表达载体，其包含以反义方向克隆到表达载体中的DNA分子。也就是说，DNA分子以一定方式与调节序列可操作连接，这种方式允许表达(通过DNA分子的转录)与KCNQ5或KCNQ5(W270L)mRNA反义的RNA分子。可以选择与按反义方向克隆的核酸可操作连接的调节序列，其指导反义RNA分子在各种细胞类型中的连续表达，例如，病毒启动子或增强子，或可以选择调节序列，其指导反义RNA的组成型、组织特异性或细胞类型特异性表达。反义表达载体可以是重组质粒、噬菌粒或减毒病毒的形式，其中在高效率调节区域的控制下产生反义核酸，其活性可通过其中导入了该载体的细胞类型来测定。对于使用反义基因调节基因表达的论述，参见Weintraub H etal.，Trends Genet.1：22-25(1985)。
另一个方面涉及其中导入了重组表达载体的宿主细胞。例如，KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质可以在细菌细胞(例如，E.coli)、昆虫细胞、酵母细胞、两栖动物细胞(例如，爪蟾卵母细胞)或哺乳动物细胞(例如，CHO细胞或COS细胞)中表达。其他适合的宿主细胞是本领域技术人员公知的。
可以通过标准的转化或转染技术将载体DNA导入到原核或真核细胞中。如在此使用的，术语“转化”和“转染”意指用于将外源核酸(例如DNA)导入宿主细胞的各种本领域已知的技术，例如，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的适当方法可在Sambrook等(同上)中和其他实验规程中找到。
对于哺乳动物细胞的稳定转染，已知的是，取决于使用的表达载体和转染技术，仅小部分细胞可能将外源DNA整合到它们的基因组中。为了鉴定和选择这些整合体，一般与感兴趣的基因一起将编码选择性标记(例如，抗生素抗性)的基因导入宿主细胞。优选的选择性标记包括赋予对药物，例如G418、匀霉素和氨甲蝶呤的抗性的那些。编码选择性标记的核酸可以在编码KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的相同载体上导入宿主细胞，或可以在独立的载体上导入。用导入的核酸稳定转染的细胞可以通过药物选择来鉴定(例如，掺入了选择性标记基因的细胞将生存，而其他细胞将死亡)。
对于用KCNQ5或KCNQ5(W270L)稳定地转染的E.coli来说，可以产生这种细胞系从而KCNQ5或KCNQ5(W270L)基因是可诱导的。例如，表达的基因的调节可以通过第一“调节”质粒和第二“反应”质粒的双稳定表达来进行，所述第一“调节”质粒含有tet控制的反式激活物(tTA)，所述第二“反应”质粒含有在包括四环素响应元件(TRE)的启动子序列的控制下的KCNQ5或KCNQ5(W270L)。商业上可获得的调节质粒是在为新霉素选择而工程化的载体中，需要反应载体被构建以包括第二可选择标记。使用这种方法，KCNQ5或KCNQ5(W270L)表达可以在存在例如四环素或四环素相关化合物(例如，强力霉素)的试剂的情况下被关闭，当例如四环素的试剂没有添加到培养基时被打开。这种类型的细胞系的构建容许KCNQ5或KCNQ5(W270L)在细胞中稳定表达，在所述细胞中KCNQ5或KCNQ5(W270L)通常是有毒的。
宿主细胞，例如培养物中的原核或真核宿主细胞，可被用于产生(即，表达)KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白。因而，进一步的方面提供了使用宿主细胞产生KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的方法。在一个实施方式中，所述方法包括在适合的培养基中培养所述宿主细胞(其中导入了编码KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的重组表达载体)，从而产生KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质。在另一个实施方式中，所述方法进一步包括从培养基或宿主细胞分离KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质。
某些宿主细胞也可以用于产生非人类转基因动物。例如，在一个实施方式中，宿主细胞是受精的卵母细胞，或胚胎干细胞，其中已经导入了KCNQ5或KCNQ5(W270L)编码序列。然后这些宿主细胞可以用于创建非人类转基因动物，其中已经向它们的基因组中导入了外源的KCNQ5或KCNQ5(W270L)序列，或创建同源的重组动物，其中已经改变了内源的KCNQ5序列。这些动物对于研究KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽的功能和/或活性、对于鉴定和/或评估KCNQ5或KCNQ5(W270L)活性的调节物是有用的。如在此使用的，“转基因动物”是非人动物，优选的哺乳动物、更优选的啮齿动物，例如大鼠或小鼠，其中所述动物的一个或多个细胞包括转基因。转基因动物的其他实例包括非人灵长类、绵羊、犬、牛、山羊、鸡、两栖动物，等等。转基因是被整合到发育出转基因动物的细胞的基因组中、并保持在成熟动物的基因组中的外源DNA，从而指导编码的基因产物在所述转基因动物的一个或多个细胞类型或组织中的表达。如在此使用的，“同源重组动物”是非人动物、优选的哺乳动物、更优选的小鼠，其中在动物的发育之前已经通过内源基因和导入动物的细胞中的外源DNA分子之间的同源重组改变了内源的KCNQ5基因，所述动物的细胞例如动物的胚胎细胞。
转基因动物可以通过将KCNQ5或KCNQ5(W270L)编码核酸导入受精的卵母细胞的精原核中，例如通过显微注射或逆转录病毒感染，并容许所述卵母细胞在假孕雌性养育动物中发育来创造。SEQ ID NO：1的KCNQ5(W270L)序列或其部分可以作为转基因导入非人动物的基因组中。做为选择，KCNQ5(W270L)基因同源物，例如另一种KCNQ家族成员，可以根据与SEQ ID NO：1的KCNQ5(W270L)家族cDNA的杂交来分离(上文中进一步描述)并用作转基因。
内含子序列和多腺苷酸化信号也可以包括入转基因来提高转基因的表达效力。组织特异性调节序列可以可操作地连接到KCNQ5或KCNQ5(W270L)转基因来指导KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质在特定细胞的表达。通过胚胎操作和显微注射产生转基因的动物，特别是例如小鼠的动物的方法已经成为本领域中的标准，例如，在美国专利NO.4,736,866；4,870,009；4,873,191中；以及在Hogan B，Manipulating theMouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)中描述。相似的方法被用于其他转基因动物的产生。转基因建立者动物(transgenic founder animal)可以根据在它的基因组中KCNQ5或KCNQ5(W270L)转基因的存在和/或在动物的组织或细胞中KCNQ5或KCNQ5(W270L)mRNA的表达来鉴定。然后，转基因建立者动物可以用于培育携带该转基因的其他动物。此外，携带编码KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的转基因的转基因动物可以进一步培育成携带其他转基因的其他转基因动物。
为了创建同源重组动物，制备含有KCNQ5基因的至少一部分的载体，在所述KCNQ5基因中已经导入了删除、添加或替换，从而改变了，例如功能上破坏了KCNQ5基因。在优选的实施方式中，设计所述载体，从而在同源重组时，内源的KCNQ5被功能上地破坏(即，不再编码功能性蛋白；也称为“敲除”载体)。做为选择，可以设计所述载体，从而在同源重组时，内源的KCNQ5基因被突变或改变，但仍然编码功能性蛋白(例如，SEQ ID NO：1的核苷酸808-810可以被改变从而改变内源KCNQ5蛋白质的氨基酸270)。在同源重组载体中，KCNQ5基因的改变的部分在它的5′和3′末端侧翼是KCNQ5基因的其他核酸序列，以容许在载体携带的外源KCNQ5基因和胚胎干细胞内的内源KCNQ5基因之间发生同源重组。其他的侧翼KCNQ5核酸序列具有足够的长度用于与内源基因成功的同源重组。一般地，几千个碱基的侧翼DNA(在5′和3′末端)被包括入载体中(同源重组载体的描述参见，例如Thomas KR and CapecchiMR，Cell 51：503-12(1987))。载体被导入胚胎干细胞系(例如，通过电穿孔)中，并且选择细胞，在所述细胞中导入的KCNQ5基因与内源KCNQ5基因同源重组(参见，例如Li E et al.，Cell 69：915-26(1992))。选择的细胞然后注射到动物的胚泡中(例如，小鼠或大鼠)来形成聚集嵌合体(参见，例如Bradley A，Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：A PracticalApproach，Robertson EJ，ed.(IRL，Oxford，1987)pp.113-152)。然后嵌合的胚胎能够植入适合的假孕雌性养育动物(foster animal)中，胚胎进行妊娠。在它们的生殖细胞中携带同源重组的DNA的子代可以通过转基因的种系传播用于培育其中动物的所有细胞含有同源重组的DNA的动物。构建同源重组载体和同源重组动物的方法进一步在例如Bradley A，Curr.Opin.Biotechnol.2：823-29(1991)；WO 90/11354；WO 91/01140；和WO93/04169中描述。
除了上述的之外，熟练的技术人员将理解，用于同源重组的本领域已知的其他方法可以应用于在此的公开内容。酶辅助的位点特异性整合系统是本领域已知的，可以应用于在第二目标DNA分子中的预定位置整合DNA分子。这些酶辅助的整合系统的实例包括Crd重组酶-lox目标系统(例如，如Baubonis W and Sauer B，Nucleic Acids Res.21：2025-29(1993)；和Fukushige S and Sauer B，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：7905-09(1992)所描述的)和FLP重组酶-FRT目标系统(例如，如DangDT and Perrimon N，Dev.Genet.13：367-75(1992)；和Fiering S et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：8469-73(1993)中所描述的)。也可以使用四环素调节的可诱导同源重组系统，例如在WO94/29442和WO96/01313中描述的。
例如，在另一个实施方式中，可以产生含有选择系统的转基因非人动物，所述选择系统容许转基因的调节表达。这些系统的一个实例是噬菌体P1的crd/loxP重组酶系统。cre/loxP重组酶系统的描述参见，例如，Lakso M et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6232-36(1992)。重组酶系统的另一个实例是酿酒酵母的FLP重组酶系统(O’Gorman S et al.，Science251：1351-55(1991))。如果crd/loxP重组酶系统被用于调节转基因的表达，需要含有编码Cre重组酶和选择的蛋白质的转基因的动物。这些动物可以通过构建“双”转基因动物来提供，例如，通过交配两个转基因动物，一个含有编码选定的蛋白质的转基因，另一个含有编码重组酶的转基因。
在此描述的非人转基因动物的克隆也可以根据在例如Wilmut I etal.，Nature 385：810-13(1997)；WO 97/07668；和WO 97/07669中描述的方法来产生。简言之，来自转基因动物的细胞，例如体细胞，可以被分离并诱导来退出生长周期并进入GO阶段。然后可以通过使用例如电脉冲将休眠细胞融合到去核的卵母细胞，所述卵母细胞来自于分离所述休眠细胞的相同物种的动物。然后培养重建的卵母细胞，从而它发展成桑椹胚或胚细胞，然后转移到假孕的雌性养育动物。从该雌性养育动物生出的后代将是分离出所述细胞，例如体细胞的动物的克隆。
V.本发明的用途和方法
离子通道是极好的药物靶点。在此公开的多核苷酸编码突变的电压门控钾通道，它的调节物对于鉴定用于诊断、治疗、预防或减轻与中枢神经系统(CNS)和外周系统的有害状况相关的疾病的化合物是有用的，包括各种类型的疼痛，例如，由例如灼伤、撞伤、擦伤、划伤、骨折、韧带撕裂、肌腱撕裂、肌撕裂、病毒、细菌、原生动物或真菌感染、接触性皮炎、炎症(由例如，外伤、感染、手术、灼伤或具有炎症性成分的疾病)、癌症、牙痛所引起的身体的、皮肤的或内脏的疼痛；由例如由于癌症、HIV(人类免疫缺陷病毒)感染、组织外伤、感染、自体免疫疾病、糖尿病、关节炎、糖尿病性神经病变、三叉神经痛或药物施用而对中央或外周神经系统的损伤所引起的神经性疼痛；治疗由例如恐慌失调、一般化焦虑失调或逆境失调、特别是急性逆境失调、情感障碍引起的焦虑、Alzheimer’s病、共济失调、由外伤、中风或神经变性疾病引起的CNS损伤、认识不全、强迫性行为、痴呆、忧郁症、Huntington’s病、狂躁、记忆损伤、记忆失调、记忆功能障碍、运动失调(motion disorders)、运动失调(motor disorders)、年龄相关的记忆丧失、神经退行性疾病、Parkinson’s病和Parkinson样运动失调、恐怖症、Pick’s病、精神病、精神分裂症、脊髓损坏、颤抖、发作、惊厥、癫痫症、Stargardt样斑点性营养不良、锥体-棒斑点性营养不良、Salla病、癫痫症、肌肉松弛药、退烧药、抗焦虑药、抗偏头痛试剂、镇痛药、双极失调、单极忧郁症、功能性肠失调(例如消化不良和肠易激综合症)、腹泻、便秘、各种类型尿失禁(例如，急促性尿失禁、应激性尿失禁、溢出尿失禁或无意识的尿失禁和混合的尿失禁)、尿急、膀胱不稳定性、神经原性膀胱、听力损失、耳鸣、青光眼、认识失调、慢性炎症性和神经痛性疼痛；用于防止或降低例如癌症、炎症、眼科疾病、和各种CNS失调的治疗的药物依赖性或耐受性。
在此描述的核酸分子、蛋白质、蛋白质同源物和抗体可被用于一种或多种以下方法：a)治疗方法，特别是在脑、骨骼肌或膀胱中；b)筛选分析；b)预测医学(例如，诊断分析、预后分析、监视临床试验或药物遗传学)。分离的核酸分子能被用于，例如，表达KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白(例如，在基因治疗应用中通过在宿主细胞中的重组表达载体)，检测KCNQ5或KCNQ5(W270L)mRNA(例如，在生物样品中)或KCNQ5基因中的遗传改变，和调节KCNQ5或KCNQ5(W270L)活性，如以下进一步描述的。此外，KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白可用于筛选天然发生的KCNQ5或KCNQ5(W270L)结合蛋白，来筛选调节KCNQ5或KCNQ5(W270L)活性的药物或化合物，以及用于治疗失调，所述失调将受益于KCNQ5的调节，例如，以不足的或过度的KCNQ5蛋白产生或与KCNQ5野生型蛋白相比具有降低的或异常的活性的KCNQ5蛋白的产生为特征。此外，抗KCNQ5或抗KCNQ5(W270L)抗体可以用于检测和分离KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质、调节KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的生物利用率、以及调节KCNQ5活性(例如，在脑中KCNQ5活性的降低将提高CNS中的神经元应激性)。在优选的实施方式中，在此公开的方法，例如KCNQ5或KCNQ5(W270L)的检测、调节等等，在CNS、骨骼肌或膀胱平滑肌中进行。
A.调节KCNQ5或KCNQ5(W270L)的方法
一个方面提供了调节细胞中KCNQ5或KCNQ5(W270L)的方法，例如，为了鉴定调节KCNQ5或KCNQ5(W270L)表达和/或活性的试剂，以及治疗受试者的预防性和治疗性的方法，所述受试者处于失调的风险中(或易感于失调)或患有与异常的KCNQ5表达或活性相关的失调，其将受益于KCNO5活性的调节。
又一个方面涉及调节细胞中KCNQ5或KCNQ5(W270L)表达和/或活性的方法。所述调节方法包括用调节KCNQ5或KCNQ5(W270L)表达和/或活性的试剂接触细胞，从而在所述细胞中的KCNQ5或KCNQ5(W270L)表达和/或活性被调节。所述试剂可以通过调节细胞中KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的活性、或通过调节KCNQ5或KCNQ5(W270L)基因的转录或KCNQ5或KCNQ5(W270L)mRNA的翻译来起作用。
因而，在一个实施方式中，所述试剂抑制KCNQ5或KCNQ5(W270L)活性。例如，抑制性试剂可以通过直接抑制KCNQ5或KCNQ5(W270L)活性、或通过调节信号转导途径来起作用，所述信号转导途径负调节KCNQ5或KCNQ5(W270L)。在另一个实施方式中，所述试剂刺激KCNQ5或KCNQ5(W270L)活性。例如，刺激性试剂可以通过直接刺激KCNQ5或KCNQ5(W270L)活性、或通过调节信号转导途径来起作用，所述信号转导途径引起KCNQ5或KCNQ5(W270L)活性的刺激。示范性的抑制性试剂包括反义KCNQ5或KCNQ5(W270L)核酸分子(例如，来抑制KCNQ5或KCNQ5(W270L)mRNA的翻译)、细胞内抗KCNQ5或抗KCNQ5(W270L)抗体(例如，来抑制KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的活性)，和KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的显性失活突变体。可以用于抑制KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的活性的其他抑制性试剂是抑制KCNQ5或KCNQ5(W270L)活性的化合物。这种化合物可以使用如在此描述的选择这种化合物的筛选分析来鉴定。另外地或作为选择，抑制KCNQ5或KCNQ5(W270L)活性的化合物可以使用本领域已知的方法来设计。
根据另一种调节方法，通过用刺激性试剂接触细胞来刺激细胞中的KCNQ5或KCNQ5(W270L)活性。这些刺激性试剂的实例包括活性KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质和编码KCNQ5或KCNQ5(W270L)的核酸分子，所述核酸分子被导入细胞以提高细胞中的KCNQ5或KCNQ5(W270L)活性。优选的刺激性试剂是编码KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的核酸分子，其中所述核酸分子以适合于在所述细胞中表达活性KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的形式被导入所述细胞中。为了在细胞中表达KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质，一般地，KCNQ5或KCNQ5(W270L)cDNA首先使用标准的分子生物学技术导入重组表达载体，如在此描述的。例如，通过使用PCR扩增或通过筛选在此描述的合适的cDNA库，可以获得KCNQ5或KCNQ5(W270L)cDNA。在分离或扩增KCNQ5或KCNQ5(W270L)cDNA之后，DNA片段被导入表达载体，并通过标准方法转染到目标细胞中，如在此描述的。可以用于刺激KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的活性和/或表达的其他刺激性试剂是刺激细胞中KCNQ5活性和/或表达的化合物，例如提高KCNQ5活性的化合物。这种化合物可以使用如在此详细描述的选择这种化合物的筛选分析来鉴定。
调节方法可以体外地(例如，通过用所述试剂培养细胞，或通过将所述试剂导入培养物中的细胞)，或作为选择，体内地(例如，通过向受试者施用所述试剂，或通过将所述试剂导入受试者的细胞中，例如通过基因治疗)进行。为了体外地实践调节方法，可以通过标准方法从受试者获得细胞，用调节试剂体外孵育(即，培养)来调节细胞中的KCNQ5或KCNQ5(W270L)活性。
对于包含核酸的刺激性或抑制性试剂(包括编码KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的重组表达载体、反义RNA、细胞内抗体或显性失活抑制物)，可以使用本领域已知的用于将核酸(例如，DNA)体内导入细胞的方法将所述试剂导入受试者的细胞中。这些方法的实例包括非病毒的和病毒的方法，包括：
直接注射：裸露的DNA可以通过直接将DNA注射到细胞中来体内地导入细胞(参见，例如Acsadi G et al.，Nature 332：815-18(1991)；WolffJA et al.，Science 247：1465-68(1990))。例如，可以使用用于将DNA注射入细胞的递送装置(例如，“基因枪”)。这种装置是商业上可获得的(例如，来自Bio-Rad Laboratories，Hercules，Calif.)。
阳离子脂质：通过使DNA与阳离子脂质复合或将DNA密封在阳离子脂质体中，可以将裸露的DNA体内地导入细胞中。适合的阳离子脂质制剂的实例包括N-[-1-(2，3-二油酰氧基)丙基]N，N，N-氯化三乙铵(DOTMA)和1:1摩尔比的1，2-十四烷基氧基-丙基-3-二甲基羟乙基溴化铵(DMRIE)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)(参见，例如，Logan JJ et al.，Gene Ther.2：38-49(1995)；San H et al.，Hum.Gene Ther.4：781-88(1993))。
受体介导的DNA摄取：通过将DNA与联结到细胞表面受体的配体的阳离子，例如聚赖氨酸复合，也可以将裸露的DNA体内导入细胞内(参见，例如，Wu GY and Wu CH，J.Biol.Chem.263：14621-24(1988)；WilsonJM et al.，J.Biol.Chem.267：963-67(1992)；和美国专利No.5,166,320)。DNA-配体复合物与受体的结合促进了DNA通过受体介导的内吞作用的摄取。与天然地破坏内涵体从而将材料释放到细胞质中的腺病毒衣壳连接的DNA-配体复合物可以用于避免细胞内溶酶体对复合物的降解(参见，例如，Curiel DT et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8850-54(1991)；Cristiano RJ et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2122-26(1993))。
逆转录病毒：缺陷的逆转录病毒对于基因治疗目的的基因转移中的用途被良好地表征(综述参见Miller AD，Blood 76：271-78(1990))。重组逆转录病毒可以被构建为具有掺入逆转录病毒基因组的感兴趣的核苷酸序列。另外，逆转录病毒基因组的部分可以被移除以使得逆转录病毒是复制缺陷的。复制缺陷的逆转录病毒然后通过标准技术包装到病毒颗粒中，其用于通过使用辅助病毒来感染目标细胞。生产重组逆转录病毒以及用这种病毒体外或体内感染细胞的方案可以在Current Protocols inMolecular Biology，Ausubel FM et al.(eds.)Greene PublishingAssociates，(1989)，Sections 9.10-9.14和其他标准的实验规程中找到。适合的逆转录病毒的实例包括pLJ、pZIP、pWE和pEM，它们对于本领域技术人员是公知的。适合的包装病毒系的实例包括ψCrip、ψCre、ψ2和ψAm。逆转录病毒已经被用于体内或体外地将多种基因导入多种不同的细胞类型中，包括上皮细胞、内皮细胞、淋巴细胞、成肌细胞、肝细胞、骨髓细胞(参见，例如，Eglitis MA et al.，Science 230：1395-98(1985)；DanosO and Mulligan RC，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：6460-64(1988)；WilsonJM et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：3014-18(1988)；Armentano D etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6141-45(1990)；Huber BE et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8039-43(1991)；Ferry N et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8377-81(1991)；Chowdhury JR et al.，Science254：1802-05(1991)；van Beusechem VW et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：7640-44(1992)；Kay MA et al.，Hum.Gene Ther.3：641-47(1992)；DaiY et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10892-95(1992)；Hwu P et al.，J.Immunol.150：4104-15(1993)；U.S.Patent No.4,868,116；美国专利No.4,980,286；WO 89/07136；WO 89/02468；WO 89/05345；和WO92/07573)。逆转录病毒载体需要目标细胞分裂，以使逆转录病毒基因组(和插入其中的外源核酸)被整合到宿主基因组中来将核酸稳定地导入细胞。因而，可能必需的是刺激目标细胞的复制。
腺病毒：腺病毒的基因组可以被操作，从而它编码并表达感兴趣的基因产物，但对于它在正常的溶胞病毒生命周期中复制的能力而言被钝化(参见，例如，Berkner KL，Biotechniques 6：616-29(1988)；Rosenfeld MAet al.，Science 252：431-34(1991)；和Rosenfeld MA et al.，Cell68：143-55(1992))。来自腺病毒毒株Ad型5 d1324或其他腺病毒毒株(例如，Ad2、Ad3、Ad7，等等)的适合的腺病毒载体是本领域技术人员公知的。重组腺病毒是有益的，因为它们不需要分裂细胞来成为有效的基因递送工具，并且可以用于感染各种各样的细胞类型，包括气道上皮细胞(Rosenfeld MA et al.，Cell 68：143-55(1992))、内皮细胞(Lemarchand P etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6482-86(1992))、肝细胞(Herz J andGerard RD，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2812-16(1993))和肌细胞(Quantin B et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：2581-84(1992))。此外，导入的腺病毒DNA(和其中含有的外源DNA)不被整合到宿主细胞的基因组中而保持游离，从而避免了在导入的DNA整合到宿主基因组的位置上插入诱变的结果而发生的潜在问题(例如，逆转录病毒DNA)。此外，腺病毒基因组的外源DNA携带能力相对于其他基因递送载体是大的(高达8千碱基对)(Berkner KL et al.，supra；Haj-Ahmad Y and Graham FL，J.Virol.57：267-74(1986))。当前使用的大多数复制缺陷的腺病毒载体被删除了病毒E1和E3基因的所有或部分，但保持了多达80％的腺病毒遗传物质。
腺病毒相关病毒：腺病毒相关病毒(AAV)是天然发生的缺陷性病毒，其需要另一种病毒，例如腺病毒或疱疹病毒作为辅助病毒用于有效的复制和生产性生命周期(综述参见Muzyczka N，Curr.Top.Microbiol.Immunol.158：97-129(1992))。它还是可以将其DNA整合到非分裂细胞的少数病毒之一，并展现了高频率的稳定整合(参见，例如，Flotte TR et al.，Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7：349-56(1992)；Samulski RJ et al.，J.Virol.63：3822-28(1989)；和McLaughlin SK et al.，J.Virol.62：1963-73(1988))。含有少至300碱基对的AAV的载体可以被包装并且可以整合。外源DNA的空间被限于约4.5kb。例如在Tratschin JD et al.，Mol.Cell.Biol.5：3251-60(1985)中描述的AAV载体可以用于将DNA导入细胞。已经使用AAV载体将各种核酸导入不同的细胞类型(参见，例如，Hermonat PLand Muzyczka N，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6466-70(1984)；TratschinJD et al.，Mol.Cell.Biol.4：2072-81(1985)；Wondisford FE et al.，Mol.Endocrinol.2：32-39(1988)；Tratschin JD et al.，J.Virol.51：611-19(1984)；和Flotte TR et al.，J.Biol.Chem.268：3781-90(1993))。
特定表达载体系统和将核酸导入细胞的方法的效力可以通过本领域中通常使用的标准方法来评定。例如，导入细胞中的DNA可以通过过滤杂交技术(例如，Southern blotting)来检测，由导入的DNA转录产生的RNA可以通过例如Northern印迹、RNase保护或逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)来检测。基因产物可以通过适合的分析来检测，例如，通过使用特异性抗体免疫学检测产生的蛋白质，或通过功能性分析来检测基因产物的功能活性。
存在着可以使用KCNQ5或KCNQ5(W270L)调节试剂治疗的多种病理学的状况(参见，例如，此处的V小节)。
1.预防方法
一个方面提供了在受试者中防止疾病或状况的方法，所述疾病或状况将受益于KCNQ5活性和/或表达的调节，例如，与异常的KCNQ5表达或活性相关的失调(例如，尿失禁和神经性疼痛)，通过向受试者施用KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽或调节KCNQ5多肽表达或至少一种KCNQ5活性的试剂。在一个方面，KCNQ5多肽可以含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域。做为选择，KCNQ5多肽可以含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域。处于由异常的KCNQ5表达或活性引起或促发的疾病的风险中的受试者可以通过例如在此描述的诊断或预后分析的任何或组合来鉴定。预防性试剂的施用可以在特征为KCNQ5异常的症状出现之前来发生，从而，疾病或失调被防止，或做为选择，延迟它的发展。取决于KCNQ5异常或状况的类型，例如，可以使用KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽、KCNQ5或KCNQ5(W270L)激动剂或KCNQ5或KCNQ5(W270L)拮抗剂试剂来治疗受试者。合适的试剂可以根据在此描述的筛选分析来确定。
2.治疗方法
本发明的另一个方面涉及为治疗目的调节KCNQ5表达或活性的方法。因此，在示范性的实施方式中，本发明的调节方法包括用KCNQ5(W270L)多肽或试剂接触细胞，所述试剂调节与细胞相关的KCNQ5蛋白的一种或多种活性。调节KCNQ5蛋白质活性的试剂可以是在此描述的试剂，例如核酸或蛋白质、KCNQ5蛋白质的天然发生的目标分子(例如，KCNQ5结合蛋白)、KCNQ5或KCNQ5(W270L)抗体、KCNQ5或KCNQ5(W270L)激动剂或拮抗剂、KCNQ5或KCNQ5(W270L)激动剂或拮抗剂的肽模拟物，或其他小分子。在一个实施方式中，所述试剂刺激一种或多种KCNQ5活性。这些刺激试剂的实例包括活性KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白和已经被导入细胞、编码KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽的核酸分子。在另一个实施方式中，所述试剂抑制一种或多种KCNQ5活性。这种抑制试剂的实例包括反义KCNQ5或KCNQ5(W270L)核酸分子、抗KCNQ5或抗KCNQ5(W270L)抗体和KCNQ5或KCNQ5(W270L)抑制物。这些调节方法可以在体外进行(例如，通过培养细胞和所述试剂)，或作为选择，在体内进行(例如，通过向受试者施用所述试剂)。因而，进一步的方面提供治疗受到疾病或失调困扰的个体的方法，所述疾病或失调将受益于KCNQ5蛋白质的调节(例如，此处的V小节中描述的)，或者特征在于KCNQ5蛋白质或核酸分子的异常的表达或活性。在一个实施方式中，所述方法包括施用试剂(例如，通过在此描述的筛选分析鉴定的试剂)、或调节(例如，上调或下调)KCNQ5表达或活性的试剂的组合。在另一个实施方式中，所述方法包括施用KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质或核酸分子作为治疗来补偿降低的或异常的KCNQ5表达或活性。
在KCNQ5被异常地下调和/或在提高KCNQ5活性可能具有有益效果的情况下，刺激KCNQ5活性是可取的。同样地，在KCNQ5被异常地上调和/或在降低KCNQ5活性可能具有有益效果的情况下，同样地，抑制KCNQ5活性是可取的。其中希望KCNQ5调节的示范性的情况是在KCNQ5相关失调的治疗中(参见，例如，此处的V小节)。
由在此公开的方法所鉴定的试剂对于在经历了或易感于膀胱不稳定性或尿失禁的哺乳动物中诱导、帮助或维持期望的膀胱控制是有用的。这些方法包括预防、治疗或抑制膀胱相关的泌尿状况和膀胱不稳定性，包括突发性的膀胱不稳定性、夜间遗尿、夜尿症、排泄功能障碍和尿失禁。使用本发明的方法还可以治疗或预防的是继发于前列腺增生的膀胱不稳定性。通过在此公开的方法鉴定的试剂在促进无论是否希望的排尿暂时延迟方面也是有用的。所述试剂还可以用于稳定膀胱，以及治疗或预防失禁，其是哺乳动物中的急迫性尿失禁、应激性尿失禁或急迫性和应激性失禁的组合，其也可以称为混合的急迫和应激性失禁。这些方法包括在预防或治疗与继发状况例如前列腺肥大相关的尿失禁方面的辅助。
这些方法可以被利用来容许接受者控制排尿的急迫性和频率。本发明的方法包括治疗、预防、抑制和改善急迫性尿失禁，也称为膀胱不稳定性，神经原性膀胱、排泄功能障碍、亢进性膀胱、逼尿肌机能过度、逼尿肌亢进反射或不受约束的膀胱。
如上所述，有用的方法包括治疗、预防、抑制或改善亢进的或不稳定的膀胱、神经原性膀胱、感觉性膀胱急迫或亢进反射性膀胱。这些用途包括但不限于，针对膀胱活性和不稳定性的那些，其中尿急迫与前列腺炎、前列腺增生、间质性膀胱炎、尿路感染或阴道炎相关。所述试剂也可以用于辅助抑制或纠正频繁-急迫综合症、以及也称为罕见排泄综合症的lazy膀胱的状况。
所述试剂也可以用于治疗、预防、抑制或限制与其他药物的施用相关或由其引起的尿失禁、尿不稳定性(urinary instability)或尿急迫，所述药物包括利尿剂、加压素拮抗剂、抗胆碱能药试剂、镇静或安眠试剂、麻醉药、α-肾上腺素能激动剂、α-肾上腺素能拮抗剂或钙离子通道阻断剂。
在此公开的方法鉴定的试剂对于在需要这种救济的人类、包括成年人和儿科应用中诱导或帮助泌尿膀胱控制或者预防或治疗在此描述的病症是有用的。然而，它们也可以用于兽医学应用，特别是包括犬和猫科的膀胱控制方法。如果希望，此处的方法也可以用于家畜，例如羊、牛、猪和马品种。
B.筛选分析：
一个方面提供了鉴定对于例如KCNQ5或KCNQ5(W270L)表达或KCNQ5或KCNQ5(W270L)活性具有刺激性或抑制性效果的调节物的方法(在此也称为“筛选分析”)，所述调节物也就是候选物或测试化合物或试剂(例如，肽、拟肽、小分子或其他药物)。
测试化合物可以使用本领域已知的的组合库方法中的多种方法的任一种来获得，包括：生物学库；空间可寻址的平行的固相或液相库；需要解卷曲(deconvolution)的合成库方法；“一个珠子一个化合物”的库方法；以及使用亲和层析选择的合成库方法。生物学库的方法限于肽库，而其他四种方法对肽、非肽寡聚物或化合物的小分子库都是适合的(LamKS，Anticancer Drug Des.12：145-67(1997))。
用于分子库合成的方法的实例可在本领域中找到，例如：DeWittSH et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6909-13(1993)；Erb E et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：11422-26(1994)；Zuckermann RN et al.，J.Med.Chem.37：2678-85(1994)；Cho CY et al.，Science 261：1303-05(1993)；Carrell T et al.，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2059-61(1994)；Carrell Tet al.，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2061-64(1994)；和Gallop MA et al.，J.Med.Chem.37：1233-51(1994)。
例如，化合物的库可以存在于溶液中(例如，Houghten RA et al.，Biotechniques 13：412-21(1992))，或珠子上(Lam KS et al.，Nature354：82-84(1991))、芯片上(Fodor SPA et al.，Nature 364：555-56(1993))、细菌上(美国专利No.5,223,409)、孢子上(美国专利5,223,409)、质粒上(CullMG et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1865-69(1992))或噬菌体上(ScottJK and Smith GP，Science 249：386-90(1990)；Devlin JJ et al.，Science249：404-06(1990)；Cwirla SE et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.87：6378-82(1990)；Felici F et al.，J.Mol.Biol.222：301-10(1991)；U.S.Patent No.5,223,409)。
在测试调节试剂和天然提取物的库的许多药物筛选程序中，高通量分析是期望的，以最大化在给定时间内调查的调节试剂的数量。在无细胞系统中进行、例如可以用纯化的或半纯化的蛋白质衍生化的分析，通常优选的作为“初级”筛选，因为它们可以被产生以允许快速开发和相对容易地检测由测试调节试剂介导的分子目标中的改变。此外，测试调节试剂的细胞毒性和/或生物利用率的影响一般可以在体外系统中忽视，该分析反而主要集中于药物对分子目标的影响，在与上游或下游元件的结合亲和性的改变方面这可能是明显的。
在一个方面，通过用KCNQ5分子接触试剂并检测试剂对KCNQ5活性的影响来筛选试剂。其中在KCNQ5活性方面的提高或降低检出是试剂为KCNQ5的调节物的指示。KCNQ5分子可以是编码全部或部分KCNQ5(W270L)多肽的多核苷酸、编码含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸、或编码含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸。做为选择，所述KCNQ5分子可以是包含KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列的多肽、含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽、或含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽。
在另一个方面，通过用试剂接触细胞并测定KCNQ5分子的表达水平来筛选试剂。其中在KCNQ5表达方面的降低或提高的检出是试剂为KCNQ5的调节物的指示。KCNQ5分子可以是编码全部或部分KCNQ5(W270L)多肽的多核苷酸、编码含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸、或编码含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸。做为选择，所述KCNQ5分子可以是包含KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列的多肽、含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽、或含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽。
一个实施方式提供了用于筛选候选物或测试化合物的分析，所述候选物或测试化合物结合或调节KCNQ5蛋白质或多肽或其生物学活性部分的活性，例如，调节KCNQ5多肽的降低对于焦虑和/或神经性疼痛的神经元应激性、或者“安抚”尿失禁的膀胱平滑肌活性的能力。“安抚”(quiet down)意思是抑制失禁患者中的膀胱平滑肌细胞的异常收缩。
分析可以用于筛选调节试剂，包括KCNQ5或KCNQ5(W270L)同源物，其是受试者KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽的正常细胞功能的激动剂或拮抗剂。例如，一个方面提供了一种方法，其中提供了指示组合物，所述指示组合物具有有KCNQ5活性的KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质。所述指示组合物可以与测试化合物接触。然后，如所述指示组合物的改变所测量的测试化合物对于KCNQ5活性的影响可以被测定，从而鉴定调节KCNQ5蛋白质的活性的化合物。在存在测试化合物的情况下在KCNQ5活性水平方面统计学上显著的改变，例如降低或提高(相对于不存在所述测试化合物的情况下检测的)是测试化合物为KCNQ5调节试剂的指示。所述指示组合物可以是，例如，细胞或细胞提取物。
调节试剂的效力可以通过从使用各种浓度的测试调节试剂获得的数据产生剂量反应曲线来评定。此外，还可以进行对照分析来提供用于对比的基线。在对照分析中，分离的和纯化的KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质被添加到含有KCNQ5结合元件的组合物中，在不存在所述测试调节试剂的情况下定量复合物的形成。
在又一个实施方式中，分析是无细胞分析，其中KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质或其生物学活性部分与测试化合物接触，测定所述测试化合物与KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质或其生物学活性部分结合的能力。测试化合物与KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的结合可以如上所述直接或间接地测定。在一个实施方式中，所述分析包括使KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质或其生物学活性部分与结合野生型KCNQ5的已知化合物接触来形成分析混合物，使所述分析混合物与测试化合物接触，并测定所述测试化合物与KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质相互作用的能力，其中测定所述测试化合物与KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质相互作用的能力包括测定与所述已知化合物相比所述测试化合物优选地结合KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽或其生物学活性部分的能力。
KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质可以作为表达KCNQ5或KCNQ5(W270L)的细胞的溶胞产物、作为纯化的或半纯化的多肽、或作为重组表达的多肽来提供。在一个实施方式中，无细胞分析系统进一步包括细胞提取物或细胞的分离的成分，例如线粒体。这些细胞成分可以使用本领域已知的技术来分离。优选的，无细胞分析系统进一步包含KCNQ5或KCNQ5(W270L)与之相互作用的至少一个目标分子，测试化合物调节KCNQ5或KCNQ5(W270L)与所述目标分子的相互作用的能力被监视，从而鉴定出作为KCNQ5或KCNQ5(W270L)活性的调节物的测试化合物。例如，通过以上描述的用于测定直接结合的方法之一，通过测定KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质与KCNQ5或KCNQ5(W270L)目标分子结合的能力，可以实现测定测试化合物调节KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的活性的能力。测定KCNQ5(W270L)蛋白质与KCNQ5(W270L)目标分子结合的能力也可以使用例如实时生物分子互相作用分析(BIA)的技术来实现(参见，例如，Sjolander S and UrbaniczkyC，Anal.Chem.63：2338-45(1991)and Szabo A et al.，Curr.Opin.Struct.Biol.5：699-705(1995))。如在此使用的，“BIA”是实时地研究生物特异性相互作用，而不用标记任何反应物的技术(例如，BIAcore)。在表面等离子共振(SPR)的光学现象方面的改变可以用作生物分子之间实时反应的指示。
在又一个实施方式中，无细胞分析包括用结合野生型KCNQ5蛋白质的已知化合物接触KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质或其生物学活性部分来形成分析混合物，用测试化合物接触所述分析混合物，测定测试化合物与KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质相互作用的能力，其中测定测试化合物与KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质相互作用的能力包括测定KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质优先地结合或调节KCNQ5或KCNQ5(W270L)目标分子的能力。
无细胞的分析能够使用可溶的和/或膜结合形式的蛋白质。在使用膜结合形式的蛋白质(例如，KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质)无细胞分析的情况中，希望的是利用增溶剂，从而膜结合形式的蛋白质保持在溶液中。这种增溶剂的实例包括非离子型洗涤剂，例如n-辛基糖苷、n-十二烷基糖苷、n-十二烷基麦芽糖苷、辛酰基-N-甲基葡糖酰胺、癸酰基-N-甲基葡糖酰胺、
Figure A200780002569D00871
X-100、
Figure A200780002569D00872
X-114、
Figure A200780002569D00873
、Isotridecypoly(乙二醇醚)n、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-2-羟基-1-丙磺酸(CHAPSO)或N-十二烷基＝N，N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸。
KCNQ5或KCNQ5(W270L)目标分子可以是例如蛋白质。容许检测蛋白质-蛋白质相互作用的适合的分析是本领域已知的(例如，免疫沉淀，双杂交分析，等等)。通过在存在或不存在测试化合物的情况下进行这种分析，这些分析可以用于鉴定调节(例如，抑制或增强)KCNQ5或KCNQ5(W270L)与目标分子的相互作用的化合物。
测定KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质结合或相互作用于KCNQ5或KCNQ5(W270L)分子的配体的能力可以通过例如直接结合来实现。在直接结合分析中，KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质可以与放射性同位素或酶标记联结，从而KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质与KCNQ5或KCNQ5(W270L)目标分子的结合可以通过检测复合物中标记的KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质来测定。例如，KCNQ5或KCNQ5(W270L)分子，如KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质，可以用例如125I、35S、14C、32P或3H直接或间接地标记，并通过直接的放射计数或通过闪烁计数来检测放射性同位素。做为选择，可以用例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶来酶标记KCNQ5或KCNQ5(W270L)分子，酶标记可以通过检测合适底物到产物的转化来测定。
一般地，希望的是固定KCNQ5或KCNQ5(W270L)或它的结合蛋白以便于从未复合形式的蛋白质之一或两者中分离复合物，以及便于容许分析的自动化。在存在或不存在候选试剂的情况下，KCNQ5或KCNQ5(W270L)与上游或下游结合元件的结合可以在适合于含有所述反应物的任何容器中实现。容器的实例包括微量滴定板、试管和微量离心管。在一个实施方式中，可以提供融合蛋白，其添加了容许蛋白质与基质结合的结构域。例如，谷胱甘肽-S-转移酶/KCNQ5(W270L)(GST/KCNQ5(W270L))融合蛋白可以吸附在谷胱甘肽琼脂糖珠子(Sigma Chemical；St.Louis，MO.)或谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，其然后与细胞溶胞产物和测试调节试剂组合，以及在有利于复合物形成的条件，例如在盐和pH值的生理条件下孵育所述混合物，而稍微更严格的条件可能是希望的。在孵育之后，洗涤珠子来除去任何未结合的标记物，固定基质，直接地或在复合物解离之后在上清液中测定放射性标记(例如，置入闪烁计的珠子)。做为选择，复合物可以从基质解离，通过SDS-PAGE分离，在珠子级分中存在的KCNQ5(W270L)结合蛋白的水平使用标准的电泳技术从凝胶中测定。
用于将蛋白质固定到基质上的其他技术对于在受试者分析中使用也是可获得的。例如，KCNQ5(W270L)或它的相关结合蛋白可以利用生物素和链霉抗生物素蛋白的结合来固定。例如，生物素化的KCNQ5(W270L)分子可以使用本领域公知的技术(例如，生物素化试剂盒，Pierce Biotechnology，Rockford，Ill.)从生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)制得，并固定在链霉抗生物素蛋白包被的96孔板(Pierce Biotechnology)的加样孔中。做为选择，与KCNQ5(W270L)反应但是不干扰与上游或下游元件的结合的抗体可以衍生化到平板的反应孔上，KCNQ5(W270L)通过抗体结合捕获在反应孔中。如上，KCNQ5(W270L)结合蛋白(KCNQ5(W270L)-BP)制品和测试调节试剂在平板的存在KCNQ5(W270L)的反应孔中孵育，可以测定反应孔中捕获的复合物的数量。除了以上对于GST固定的复合物描述的那些之外，检测这种复合物的示范性的方法包括复合物的免疫检测，利用与KCNQ5(W270L)结合元件反应性的抗体、或与KCNQ5(W270L)蛋白质是反应性并与结合元件竞争的抗体；以及酶联分析，其依靠检测与结合元件相关的酶活性，所述酶活性是内在的或外在的活性。在后者的情况中，酶可以是化学上结合的，或者作为与KCNQ5(W270L)结合蛋白的融合蛋白来提供。为了说明，KCNQ5(W270L)结合蛋白可以化学地交联于或遗传地融合于辣根过氧化酶，在复合物中捕获的蛋白质的数量可以用酶的产色底物，例如，3，3′-二氨基-benzadine terahydrochloride或4-氯-1-萘酚来评定。同样地，可以提供包含蛋白质和谷胱甘肽-S-转移酶的融合蛋白，通过使用1-氯-2，4-二硝基苯检测GST活性来测定复合物形成(Habig WH et al.，J.Biol.Chem.249：7130-39(1974))。
对于依靠免疫检测用于测定复合物中捕获的蛋白质之一的过程，可以使用针对蛋白质的抗体，例如抗KCNQ5或抗KCNQ5(W270L)抗体。做为选择，在复合物中要检测的蛋白质可以以融合蛋白的形式被“表位标签化”，其除了KCNQ5或KCNQ5(W270L)序列之外包括第二蛋白质，针对所述第二蛋白质的抗体是可容易地获得的(例如，来自商业的来源)。例如，如上所述的GST融合蛋白也可以用于利用针对GST部分的抗体的结合定量。其他有用的表位标签包括myc-表位(参见，例如，Ellison MJand Hochstrasser M，J.Biol.Chem.266：21150-57(1991))其包括来自c-myc的10个残基的序列，以及
Figure A200780002569D00901
系统(SigmaAldrich，St.Louis，Mo.)或pEZZ-蛋白A系统(GE Healthcare，Piscataway，NJ)。
还处于当前公开的范围之内的是测定化合物调节KCNQ5或KCNQ5(W270L)和它们相应目标分子之间的相互作用的能力，而不标记任何反应物。例如，可以使用微型物理计来检测KCNQ5或KCNQ5(W270L)与它们相应的目标分子的相互作用而不用标记KCNQ5、KCNQ5(W270L)或目标分子(参见，例如，McConnell HM et al.，Science257：1906-12(1992))。如在此使用的，“微型物理计”(例如，细胞传感器)是一种分析仪器，使用光可寻址的电势传感器(light-addressablepotentiometric sensor，LAPS)测量细胞酸化其环境的速率。酸化速率的变化可用作化合物和受体之间的相互作用的指示。
除了无细胞分析之外，在此KCNQ5和KCNQ5(W270L)蛋白质的公开便于产生用于鉴定小分子激动剂/拮抗剂等等的基于细胞的分析。例如，可以使细胞在存在或不存在感兴趣的测试调节试剂的情况下表达或过量表达重组的KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质，使用对测试试剂介导的目标细胞的KCNQ5或KCNQ5(W270L)反应方面的调节计分的分析。例如，如无细胞分析一样，产生KCNQ5或KCNQ5(W270L)依赖性反应方面统计学上显著的改变的调节试剂可以被鉴定出来。
可以用于表达KCNQ5或KCNQ5(W270L)的重组表达载体是本领域已知的(参见以上讨论的)。在一个实施方式中，在表达载体中，KCNQ5或KCNQ5(W270L)编码序列可操作连接到调节序列，所述调节序列允许KCNQ5或KCNQ5(W270L)在指示细胞中的组成型或可诱导表达。对于鉴定增强或抑制KCNQ5或KCNQ5(W270L)活性的化合物，利用容许细胞中KCNQ5或KCNQ5(W270L)的组成型或可诱导表达的重组表达载体是优选的。在可选择的实施方式中，在所述表达载体内，KCNQ5或KCNQ5(W270L)编码序列与内源KCNQ5基因的调节序列可操作地连接(即，来自内源基因的启动子调节区域)。其中KCNQ5或KCNQ5(W270L)表达受到内源调节序列控制的重组表达载体的使用是优选的。在一个实施方式中，分析是基于细胞的分析，包括用测试化合物接触表达KCNQ5或KCNQ5(W270L)目标分子(即，KCNQ5细胞内相互作用分子)的细胞，并测定所述测试化合物调节(例如，刺激或抑制)KCNQ5或KCNQ5(W270L)目标分子的活性的能力。测定测试化合物调节KCNQ5或KCNQ5(W270L)目标分子的活性的能力可以通过，例如，测定KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质结合或相互作用于KCNQ5或KCNQ5(W270L)目标分子或其配体的能力来实现。
在说明性的实施方式中，KCNQ5(W270L)的表达或活性在细胞中被调节，可以测量感兴趣的调节试剂对于感兴趣的读数的影响(例如，离子电流数量可以从表达KCNQ5(W270L)通道的爪蟾卵母细胞电生理学地测量)。
在另一个实施方式中，KCNQ5或KCNQ5(W270L)表达的调节物在一种方法中测定，其中细胞与候选化合物接触并测定细胞中KCNQ5或KCNQ5(W270L)mRNA或蛋白质的表达。在存在候选化合物的情况下KCNQ5或KCNQ5(W270L)mRNA或蛋白质的表达水平与不存在所述候选化合物的情况下KCNQ5或KCNQ5(W270L)mRNA或蛋白质的表达水平相比较。然后，根据这种比较，候选化合物可以被鉴定为KCNQ5或KCNQ5(W270L)表达的调节物。例如，在存在候选化合物的情况下与缺少时相比，当KCNQ5(W270L)mRNA或蛋白质的表达更高时(例如，统计学上显著地更高)，候选化合物被鉴定为KCNQ5(W270L)mRNA或蛋白质表达的刺激物。做为选择，在存在候选化合物的情况下与缺少时相比，当KCNQ5(W270L)mRNA或蛋白质的表达更低时(做为选择，统计学上显著地更低)，候选化合物被鉴定为KCNQ5(W270L)mRNA或蛋白质表达的抑制物。细胞中KCNQ5或KCNQ5(W270L)mRNA或蛋白质表达的水平可以通过在此描述的用于检测KCNQ5或KCNQ5(W270L)mRNA或蛋白质的方法来测定。
在优选的实施方式中，测定KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质结合或相互作用于KCNQ5或KCNQ5(W270L)目标分子的能力可以伴随着测量KCNQ5或KCNQ5(W270L)的活性或目标分子的活性的读数。例如，KCNQ5或KCNQ5(W270L)或目标分子的活性可以通过检测目标的细胞第二信使的诱导、检测合适的底物的目标的催化/酶活性、检测报告物基因的诱导(包含与编码可检测标记物例如氯霉素乙酰转移酶的核酸可操作连接的目标应答调节元件)或检测目标调节的细胞反应，例如通过阻断KCNQ5或KCNQ5(W270L)通道诱导的Ca2+流入来测定。
在又一个方面，KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质或其部分可以用作双杂交分析或三杂交分析中的“诱饵蛋白质”(参见，例如，美国专利No.5,283,317；Zervos AS et al.，Cell 72：223-32(1993)；Madura K et al.，J.Biol.Chem.268：12046-54(1993)；Bartel P et al.，Biotechniques14：920-24(1993)；Iwabuchi K et al.，Oncogene 8：1693-96(1993)；和WO94/10300)来鉴定结合于或相互作用于KCNQ5或KCNQ5(W270L)的、和/或涉及KCNQ5或KCNQ5(W270L)活性的其他蛋白质。这种KCNQ5结合蛋白也可能涉及通过KCNQ5蛋白质或作为例如KCNQ5介导的信号转导途径的下游元件的KCNQ5目标的信号传播。做为选择，这些KCNQ5或KCNQ5(W270L)结合蛋白可以是KCNQ5或KCNQ5(W270L)抑制物。
双杂交系统基于大多数转录因子的模块特性，其由可分的DNA结合和活化结构域组成。简要地，分析利用了两种不同的DNA构建体。在一种构建体中，编码KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的基因融合到编码已知转录因子的DNA结合结构域的基因(例如，GAL-4)。KCNQ5蛋白质可以是含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽。做为选择，KCNQ5蛋白质可以是含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽。在另一个构建体中，来自DNA序列库、编码未鉴别的蛋白(“捕获物(prey)”或“样品”)的DNA序列被融合到编码已知转录因子的活化结构域的基因。如果“诱饵”和“捕获物”蛋白能够在体内相互作用，形成KCNQ5或KCNQ5(W270L)依赖性复合物，转录因子的DNA结合和活化结构域被带至紧密邻近。这种邻近容许报告基因(例如，lacZ)的转录，所述报告基因与对所述转录因子起反应的转录调节位点可操作连接。可以检测报告基因的表达，可以分离含有功能性转录因子的细胞克隆，并用于获得编码与KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质相互作用的蛋白的克隆基因。
在一个方面，鉴定的试剂是已知KCNQ5通道阻断剂或活化剂的新的类似物。例如，在一个实施方式中，鉴定的试剂是瑞替加滨的类似物。在另一个示范性的实施方式中，鉴定的试剂是XE991的类似物。在进一步的示范性的实施方式中，所述试剂是下式的化合物的新的类似物：
其中：
R1选自氢、C1-C6-烷基、C2-C6-烷酰基或基团Ar；
R2选自氢或C1-C6-烷基；
R3选自C1-C6-烷氧基、NH2、C1-C6-烷基氨基、C1-C6-双烷基氨基、由基团Ar取代的氨基、C1-C6-烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、基团Ar或基团ArO--；
R4选自氢、C1-C6-烷基或基团Ar；
R5选自氢或C1-C6-烷基或基团Ar；
Alk是具有1-9个碳原子的直链或分支的亚烷基基团，其也可以被基团Ar取代；
Ar是由基团R6、R7和/或R8取代的苯基基团，其中这些基团R6、R7和R8是相同的或不同的，并且代表H、C1-C6-烷基、C3-C7-环烷基、羟基、C1-C6-烷氧基、C2-C6-烷醇氧基、卤素、羟基、C1-C6-卤素烷基、--CN、--NH2、--NH--C1-C6-烷基、--N(C1-C6-烷基)2、--CO2H、--CO--C1-C6-烷基、--CO--O--C1-C6-烷基、--COAr、--CO--OAr、--CONH2、--CONH--C1-C6-烷基、--CON(C1-C6-烷基)2、--CONHAr、--NH--CO--C1-C6-烷基、--NHCO--Ar、--NHCO--C1-C6-烷氧基、--N--H--CO--Ar、--NHCO--NH2、--NHCO--N(--C1-C6-烷基)2、--NHCO--NHAr、--NH--SO2--C1-C6-烷基、--NH--SO2Ar、--NH--SO2-硝基苯基、--SO2--OH、--SO2-C1-C6-烷基、--SO2--Ar、--SO2-C1-C6-烷氧基、--SO2--OAr、--SO2--NH2、--SO2--NH-C1-C6-烷基、--SO2--N(C1-C6-烷基)2、--SO2--NHAr、--SO2--C2-C6-烷氧基；
n是0或1。
进一步的方面涉及由以上描述的筛选分析鉴定的新的试剂。因而，在当前公开的范围内的是进一步使用如在此描述的在合适的动物模型中鉴定的试剂。例如，在此描述鉴定的试剂(例如，KCNQ5(W270L)调节试剂、反义KCNQ5(W270L)多核苷酸、KCNQ5(W270L)特异性抗体或KCNQ5(W270L)结合配体)可以在动物模型中使用来测定这种试剂治疗的效力、毒性或副作用。做为选择，如在此描述鉴定的试剂可以在动物模型中使用来确定这种试剂的作用机制。此外，另一个方面涉及通过在此描述的筛选分析鉴定的新的试剂用于在此描述的治疗的用途。
C.理论药物设计的方法
KCNQ5或KCNQ5(W270L)和KCNQ5或KCNQ5(W270L)结合多肽可以用于候选物KCNQ5调节试剂的理论药物设计(rational drugdesign)。KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽可以用于蛋白质X-射线晶体衍射或其他结构分析方法，例如DOCK程序(参见，例如Kuntz ID et al.，J.Mol.Biol.161：269-88(1982)；Kuntz ID，Science 257：1078-82(1992))和其变体。潜在的治疗药物可以在这样提供的结构信息的基础上理论地设计。
D.检测分析
在此鉴定的cDNA序列的部分或片段(和相应的完整基因序列)可以在多种方面用作多核苷酸试剂。例如，这些序列可以用于：(i)在染色体上绘制它们相应的基因，因而，定位与遗传疾病相关的基因区域；(ii)从少量的生物样品鉴定个体(组织分型)；和(ii)帮助生物学样品的法医鉴定。
E.预测性药物
另一个方面涉及预测性药物的领域，其中诊断分析、预后分析，监视临床试验可用于预后(预测)目的从而来预防性地治疗个体。因此，一个方面涉及确定在生物样品(例如，血液、血清、细胞、组织(优选的脑、骨骼肌或膀胱)的环境中KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白和/或核酸表达以及KCNQ5或KCNQ5(W270L)活性的诊断分析，从而来确定个体是否患有疾病或失调，或存在发展出失调的风险，所述疾病或失调与异常的KCNQ5表达或活性有关。进一步的方面提高了预后(预测)分析，用于确定个体是否处于发生与KCNQ5蛋白质、核酸表达或活性相关的失调的风险中。例如，可以分析生物样品中KCNQ5基因中的突变。这些分析可以用于预后或预测目的从而来在特征为、或与KCNQ5蛋白、核酸表达或活性相关的失调发作之前预防性地治疗个体。
另一个方面涉及监视试剂(例如，药物、化合物)对临床试验中KCNQ5的表达或活性的影响。
这些和其他试剂在以下的小节中进一步详细地描述。
1.诊断分析
检测生物样品中存在或不存在KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质或核酸的示范性方法包括从测试受试者获得生物样品、用能够检测KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质或编码KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的核酸(例如，mRNA、基因组DNA)的化合物或试剂接触所述生物样品，从而检测所述生物样品中KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质或核酸的存在或不存在。检测KCNQ5或KCNQ5(W270L)mRNA或基因组DNA的优选的试剂是标记的核酸探针，其能够与KCNQ5或KCNQ5(W270L)mRNA或基因组DNA杂交。核酸探针可以是，例如，全长KCNQ5(W270L)核酸，例如SEQ ID NO：1的核酸或其部分，例如长度至少12、15、30、50、100、250或500或更多个核苷酸，并足以在严格条件下与KCNQ5或KCNQ5(W270L)mRNA或基因组DNA特异性杂交的寡核苷酸。在此描述了用于诊断分析的其他适合的探针。
用于检测KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的优选的试剂是能够结合KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的抗体，优选的是具有可检测标记的抗体。抗体可以是多克隆的，或更优选的，是单克隆的。可以使用完整抗体或其片段(例如，Fab或F(ab′)2)。术语＂标记的＂关于探针或抗体时，意图包括通过将可检测物质联结(即，物理地连接)到探针或抗体上直接标记探针或抗体，以及通过与另一个被直接标记的试剂的反应性间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的二级抗体检测原始抗体，和用生物素对DNA的末端标记，从而它可以用荧光标记的链霉抗生物素蛋白检测。术语“生物样品”意图包括从受试者分离的组织、细胞和生物液体，以及受试者体内存在的组织、细胞(优选的，脑、骨骼肌或膀胱)和液体；也就是说，所述检测方法可以用于检测体内和体外的生物样品中的KCNQ5或KCNQ5(W270L)mRNA、蛋白或基因组DNA。例如，用于KCNQ5或KCNQ5(W270L)mRNA的检测的体外技术包括Northern杂交和原位杂交。用于KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的检测的体外技术包括ELISA、Western印迹、免疫沉淀和免疫荧光。用于KCNQ5或KCNQ5(W270L)基因组DNA的检测的体外技术包括Southern杂交。此外，用于KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的检测的体内技术包括向受试者中导入标记的抗KCNQ5或抗KCNQ5(W270L)抗体。例如，可以用放射性标记物标记抗体，在受试者中放射性标记物的存在和位置可以通过标准成像技术来检测。
在一个实施方式中，所述生物样品含有来自测试受试者的蛋白质分子。做为选择，所述生物样品可以含有来自测试受试者的mRNA分子或来自测试受试者的基因组DNA分子。优选的生物样品是通过标准方法从受试者分离的脑或膀胱样品。
在另一个实施方式中，所述方法进一步包括从对照受试者获得对照生物样品，用能够检测KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质、mRNA或基因组DNA的化合物接触所述对照样品，从而检测生物样品中KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质、mRNA或基因组DNA的存在，并比较对照样品中KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质、mRNA或基因组DNA的存在和测试样品中KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质、mRNA或基因组DNA的存在。
一个方面还包括用于检测生物样品中KCNQ5或KCNQ5(W270L)的存在的试剂盒。例如，所述试剂盒可以包含能够检测生物样品中的KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质或mRNA的标记的化合物或试剂；测定样品中KCNQ5或KCNQ5(W270L)的数量的设施；和比较样品和标准中KCNQ5或KCNQ5(W270L)的数量的设施。所述化合物或试剂可以包装在适合的容器中。所述试剂盒可以进一步包括使用该试剂盒检测KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白或核酸的说明。
2.预后分析
在此描述的诊断方法此外可利用来鉴定患有与异常的KCNQ5表达或活性有关的疾病或失调、或有发展出所述疾病或失调的受试者。例如，在此描述的分析，如之前的诊断分析或以下的分析，可以用于鉴定患有或存在风险发生与KCNQ5蛋白质、核酸表达或活性相关的失调的受试者。因而，进一步的方面提供了鉴定与异常的KCNQ5表达或活性相关的疾病或失调的方法，其中从受试者获得测试样品，检测KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质或核酸(例如，mRNA、基因组DNA)，其中KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质或核酸的存在对于受试者患有或存在风险发生与异常的KCNQ5表达或活性相关的疾病或失调是诊断性的。如在此使用的，“测试样品”是指从感兴趣的受试者获得的生物样品。例如，测试样品可以是生物液体(例如，血清)、细胞样品或组织。
此外，在此描述的预后分析可以用于测定受试者是否将要施用试剂(例如，激动剂、拮抗剂、拟肽、蛋白质、肽、核酸、小分子或其他药物候选物)来治疗与异常的KCNQ5表达或活性相关的疾病或失调。因而，另一个方面提供了测定受试者是否可以用试剂来治疗与异常的KCNQ5表达或活性相关的失调的方法，其中获得测试样品并检测KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质或核酸表达或活性(例如，其中KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质或核酸表达或活性的丰度对于可以施用试剂来治疗与异常的KCNQ5表达或活性相关的失调的受试者是诊断性的)。
所述方法还被用于检测KCNQ5基因中的基因改变，从而确定具有改变的基因的受试者是否存在与KCNQ5基因相关的失调的风险。在优选的实施方式中，所述方法包括检测来自受试者的细胞的样品中基因改变的存在，所述基因改变的特征在于影响编码KCNQ5蛋白质的基因的完整性、或KCNQ5基因的错误表达的至少一个改变。例如，这种基因改变可以通过确定以下至少一项的存在来检测：1)从KCNQ5基因的一个或多个核苷酸的删除；2)一个或多个核苷酸对KCNQ5基因的添加；3)KCNQ5基因的一个或多个核苷酸的替换；4)KCNQ5基因的染色体重排；5)KCNQ5基因的信使RNA转录产物水平方面的改变；6)KCNQ5基因的异常修饰，例如基因组DNA的甲基化模式的异常修饰；7)KCNQ5基因的信使RNA的非野生型剪接模式的存在；8)KCNQ5蛋白质的非野生型水平；9)KCNQ5基因的等位损失；以及10)KCNQ5蛋白质的不适当的翻译后修饰。如在此描述的，存在着可以用于检测KCNQ5基因中的改变的本领域已知的大量的分析技术。优选的生物样品是通过标准设施从受试者分离的组织样品，例如，脑或膀胱样品。所述检测可以用至少一种包含来自KCNQ5多核苷酸的至少12个连续核苷酸的探针或引物来进行。优选的，KCNQ5多核苷酸编码所有或部分的KCNQ5(W270L)多肽、编码含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽、或编码含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽。更优选的，所述探针或引物包含来自包含核苷酸808-810的SEQ ID NO：1的至少12个连续的核苷酸。
在某些实施方式中，改变的检测包括在PCR(参见，例如，美国专利4,683,195和4,683,202)例如锚定PCR或RACE PCR中，或者作为选择，在连接链式反应(LCR)(参见，例如Landegren U et al.，Science241：1077-80(1988)；Nakazawa H et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：360-64(1994))中使用探针/引物，后者对于检测KCNQ5基因中的点突变是特别有用的(参见，例如Abravaya K et al.，Nucleic Acids Res.23：675-82(1995))。这种方法可以包括以下步骤，采集来自患者的细胞样品、从所述样品的细胞分离核酸(例如，基因组的、mRNA，或两者)、在一定条件下使所述核酸样品与一个或多个引物接触，从而发生KCNQ5基因(如果存在)的杂交和扩增、并检测扩增产物的存在或不存在、或者检测扩增产物的大小并与对照样品比较长度。预料的是，与在此描述的用于检测突变的任何技术一起，PCR和/或LCR用作初步的扩增步骤是期望的。
可选择的扩增方法包括，例如，自持的序列复制(Guatelli JC et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-78(1990))、转录扩增系统(Kwoh DY etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-77(1989))、Q-Beta复制酶(LizardiPM et al.，Biotechnology(N.Y.)6：1197(1988))、或任何其他扩增方法，之后使用本领域技术人员公知的技术检测扩增的分子。这些检测方案对于核酸分子的检测是特别有用的，如果这种分子以极低的数量存在。
在可选择的实施方式中，来自样品细胞的KCNQ5基因中的突变可以通过限制性内切酶裂解模式的改变来鉴定。例如，样品和对照DNA被分离、扩增(任选的)、用一个或多个限制性内切酶消化、通过凝胶电泳测定片段长度大小并比较。在样品和对照DNA之间片段长度大小的差异表明样品DNA中的突变。此外，序列特异性核酶(参见，例如，美国专利No.5,498,531)的使用可以用于通过核酶裂解位点的出现或消失来记录特定突变的存在。
在其他实施方式中，KCNQ5中的遗传突变可以通过使样品和对照核酸，例如DNA或RNA与含有数百或数千个寡核苷酸探针的高密度阵列杂交来鉴定(Cronin MT et al.，Hum.Mutat.7：244-55(1996)；Kozal MJet al.，Nat.Med.2：753-59(1996))。例如，KCNQ5中的遗传突变可以在含有如Cronin MT et al.(同上)中所描述的光产生的DNA探针的二维阵列中鉴定。简要地，通过产生连续重叠探针的线性阵列，探针的第一杂交阵列可以用于扫描样品和对照中DNA的整个长度延伸，来鉴定序列之间的碱基变化。这个步骤容许点突变的鉴定。这个步骤继之以第二杂交阵列，通过使用与检测的所有变体或突变互补的较小的、专门的探针阵列，其容许表征特定的突变。每个突变阵列由平行的探针集组成，一个互补于野生型基因，另一个互补于突变基因。
在又一个实施方式中，本领域已知的任何的多种序列反应可以用于直接测序KCNQ5基因并检测突变，通过比较样品KCNQ5或KCNQ5(W270L)的序列与相应的野生型(对照)序列。序列反应的实例包括基于由Maxam AM and Gilbert W，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74：560-64(1977)或Sanger F et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74：5463-67(1977)所开发的技术的那些。还预期的是，当进行诊断分析时可以利用任何的多种自动化测序过程(参见，例如，Naeve CW et al.，Biotechniques 19：448-53(1995))，包括通过质谱法测序(WO 94/16101；Cohen AS et al.，Adv.Chromatogr.36：127-62(1996)；和Griffin HG andGriffin AM，Appl.Biochem.Biotechnol.38：147-59(1993))。
用于检测KCNQ5基因中的突变的其他方法包括一些方法，其中针对裂解试剂的保护被用于检测RNA/RNA或RNA/DNA异双链体中错配的碱基(Myers RM et al.，Science 230：1242-46(1985))。一般地，“错配裂解”的技术从提供异双链体开始，所述异双链体通过由杂交(标记的)含有野生型KCNQ5序列的RNA或DNA与从组织样品获得的可能的突变RNA或DNA来形成。双链的双链体用裂解双链体的单链区域的试剂来处理，例如，所述单链区域将由于对照和样品链之间的碱基配对错配而存在。例如，RNA/DNA双链体可以用RNase处理，DNA/DNA杂交物用S1核酸酶处理来酶学地消化错配的区域。在其他实施方式中，DNA/DNA或RNA/DNA双链体的任一种都可以用羟胺或四氧化锇处理，并用哌啶处理来消化错配的区域。在消化错配的区域之后，产生的材料然后在变性聚丙烯酰胺凝胶上通过大小来分离，以确定突变的位置(参见，例如，Cotton RGH et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4397-4401(1988)；Saleeba JA and Cotton RGH，Meth.Enzymol.217：286-95(1993))。在优选的实施方式中，对照DNA或RNA可以被标记用于检测。在又一个实施方式中，错配裂解反应采用了一种或多种蛋白质，所述蛋白质在定义的系统中识别双链DNA中错配的碱基配对(所谓的“DNA错配修复”酶)，用于检测和绘制从细胞的样品获得的KCNQ5中的点突变。例如，E.coli的mutY酶裂解G/A错配处的A，来自HeLa细胞的胸腺嘧啶DNA糖基化酶裂解G/T错配处的T(Hsu IC et al.，Carcinogenesis15：1657-62(1994))。根据示范性的实施方式，基于KCNQ5(W270L)序列例如SEQ ID NO：1的探针与来自测试细胞的cDNA或其他DNA产物杂交。双链体用DNA错配修复酶处理，如果有的话，裂解产物可以从电泳方案等等中检出(参见，例如，美国专利No.5,459，039)。
在其他实施方式中，电泳迁移率中的改变将被用于鉴定KCNQ5基因中的突变。例如，单链构象多态性(SSCP)可以用于检测突变体和野生型核酸之间的电泳迁移率中的差异(Orita M et al.，Proc Natl.Acad.SciUSA：86：2766-70(1989)；see also，Cotton RGH，Mutat.Res.285：125-44(1993)；Hayashi K，Genet.Anal.Tech.Appl.9：73-79(1992))。样品KCNQ5或KCNQ5(W270L)和对照KCNQ5核酸的单链的DNA片段被变性并容许复性。单链核酸的二级结构根据序列不同；产生电泳迁移率中的改变容许检测即使是单个碱基的变化。可以用标记的探针标记或检测DNA片段。分析的敏感性可以通过使用RNA(而不是DNA)来增强，其中二级结构对序列改变更敏感。在优选的实施方式中，主题方法利用异源双链体分析来在电泳迁移率改变的基础上分离双链异源双链体分子(Keen J et al.，Trends Genet.7：5(1991))。
在又一个实施方式中，突变体或野生型片段在含有变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中的运动使用变性梯度凝胶电泳(DGGE)来分析(MyersRM et al.，Nature 313：495-98(1985))。当DGGE用作分析方法时，DNA将被修饰以确保它不被完全地变性，例如，通过用PCR添加约40bp的高熔点富GC DNA的GC夹子(clamp)。在进一步的实施方式中，使用温度梯度代替变性剂梯度来鉴定对照和样品DNA的移动性方面的差异(Rosenbaum V and Riesner D，Biophys.Chem.26：235-46(1987))。
用于检测点突变的其他技术的实例包括，但不限于，选择性寡核苷酸杂交、选择性扩增、或选择性引物延伸。例如，可以制备寡核苷酸引物，其中已知的突变被置于中央，然后在仅存在理想匹配时允许杂交的条件下与目标DNA杂交(Saiki RK et al.，Nature 324：163-66(1986)；SaikiRK et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6230-34(1989))。当寡核苷酸附着于杂交膜上时，这种等位基因特异性寡核苷酸与PCR扩增的目标DNA或多种不同的突变杂交，并与标记的目标DNA杂交。
做为选择，取决于选择性PCR扩增的等位基因特异性扩增技术可以与所公开的组合物和方法一起使用。用作特异性扩增的引物的寡核苷酸可以携带感兴趣的突变，在分子的中央(从而扩增取决于差异杂交)(Gibbs RA et al.，Nucleic Acids Res.17：2437-48(1989))，或在一个引物的极3′末端，其中在适合的条件下可以防止错配，或降低聚合酶延伸(Prosser J，Trends Biotechnol.11：238-46(1993))。此外，期望的是在突变的区域引入新的限制性位点来产生基于裂解的检测(Gasparini P et al.，Mol.Cell.Probes 6：1-7(1992))。在某些实施方式中预料的是，扩增也可以使用用于扩增的Taq连接酶来进行(Barany F，Proc.Natl.Acad.SciUSA 88：189-93(1991))。在这种情况下，将仅在5′序列的3′末端存在理想匹配时发生连接，使得通过寻找扩增的存在或不存在检测特定位置的已知突变的存在成为可能。
例如，通过利用包含在此描述的至少一种探针核酸或抗体试剂的预包装的诊断试剂盒，可以进行在此描述的方法，所述试剂盒可以在例如临床环境中方便地使用来诊断展现了涉及KCNQ5基因的疾病的症状或家族史的患者。
此外，其中表达KCNQ5的任何细胞类型或组织可以在在此描述的预后分析中利用。
VI.KCNQ5调节试剂的施用
KCNQ5或KCNQ5(W270L)调节试剂将以适合于体内药物施用的生物学相容的形式施用给受试者，来治疗例如在上文V小节描述的状况。“适合于体内施用的生物学相容的形式”是指要施用的蛋白质的一种形式，其中任何毒性效果被蛋白质的治疗效果胜过。术语“受试者”意图包括活的有机体，其中可以引发免疫反应，例如哺乳动物。如在此描述的试剂的施用可以是在任何药理学形式中，包括单独的治疗活性数量的试剂或与药学上可接受的载体组合。
治疗活性数量的治疗组合物的施用被定义为实现期望的结果所必需的、在剂量上和一定时间段上有效的数量。例如，治疗活性数量的KCNQ5或KCNQ5(W270L)调节试剂可以取决于一些因素而变化，例如，个体的疾病状况、年龄、性别和体重，以及肽在个体中引发期望的反应的能力。可以调节给药方案来提供最佳的治疗反应。例如，可以每天施用几次分开的剂量，或剂量可以如治疗情况的需求所指示的成比例降低。
治疗或药物组合物可以通过本领域已知的任何适合的途径施用，包括，例如，静脉内的、皮下的、肌肉内的、穿表皮的、阴道内的、或脑内的或在体外治疗方案中施用给细胞。施用可以是快速的，如通过注射，或者在一定时间段上，如通过缓慢的输注或缓释制剂的施用。
KCNQ5或KCNQ5(W270L)也可以与提供期望的药物或药效性质的试剂连接或结合。例如，KCNQ5或KCNQ5(W270L)可以与本领域已知的促进穿透性或转运跨越血脑屏障的任何物质连接，例如针对转铁蛋白受体的抗体，并通过静脉内注射来施用(参见，例如，Friden PM et al.，Science 259：373-77(1993))。此外，KCNQ5或KCNQ5(W270L)可以与聚合物例如聚乙二醇稳定地连接来获得溶解度、稳定性、半衰期的期望的性质，和其他药学上有益的性质(参见，例如，Davis et al.，Enzyme Eng.4：169-73(1978)；Burnham NL，Am.J.Hosp.Pharm.51：210-18(1994))。
此外，KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽可以处在帮助向细胞的细胞质内递送的组合物中。例如，肽可以与载体部分结合，例如能够将肽递送到细胞的细胞质的脂质体。这些方法是本领域公知的(参见，例如，Amselem S et al.，Chem.Phys.Lipids 64：219-37(1993))。做为选择，KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽可以被修饰以包括特定的转运肽或融合到这样的转运肽，其能够递送它们的KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽进入细胞。此外，多肽可以通过显微注射直接递送到细胞中。
组合物通常以药物制品的形式应用。这些制品以药物技术中公知的方式来制造。一种优选的制品利用了生理盐溶液的媒介物，但是期待的是也可以使用其他药学上可接受的载体例如其他的无毒盐的生理学浓度、百分之五十的含水葡萄糖溶液、无菌水等等。如在此使用的，“药学上可接受的载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌试剂、等渗和吸收延迟试剂，等等。这些介质和试剂用于药学活性物质的使用是本领域公知的。除非任何标准培养基或试剂与活性化合物不相容，其在治疗组合物中的使用是预期的。补充的活性化合物也可以掺入到组合物中。还期望的是适合的缓冲液存在于组合物中。如果希望，这种溶液可以被冻干并保持在无菌安瓿瓶中，准备用于通过添加无菌水来重构用于准备注射。主要溶剂可以是水性的或作为选择是非水性的。KCNQ5或KCNQ5(W270L)也可以掺入到固体或半固体的生物学相容的基质中，其可以被植入需要治疗的组织中。
载体也可以含有其他药学上可接受的赋形剂，用于改变或维持制剂的pH值、渗透性、粘度、透明度、颜色、无菌性、稳定性、分解速率、或气味。类似地，载体还可以含有其他药学上可接受的赋形剂，用于改变或维持释放或吸收或跨越血脑屏障的穿透性。这些赋形剂是通常和习惯上被采用来配制用于肠胃外施用的药剂的那些物质，以单位剂型或多剂量形式，或用于通过连续的或周期性的输注直接输注。
剂量施用可以取决于剂量制剂的药物动力学参数和使用的施用途径来重复。
还提供的是将要口服施用的含有KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽或其片段的某些试剂。这种制剂优选的是密封的，并与适合的载体配制为固体剂型。适合的载体、赋形剂和稀释剂的某些实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、明胶、糖浆、甲基纤维素、甲基和丙基羟基苯甲酸酯、滑石粉、镁、硬脂酸、水、矿物油，等等。制剂可以另外包括润滑剂、润湿剂、乳化和悬浮剂、防腐剂、甜味剂或调味剂。通过采用本领域公知的过程，可以配制组合物以提供在向患者施用之后快速的、持续的、或延迟的活性成分释放。所述制剂也可以含有将此蛋白水解性降解的物质和/或促进吸收的物质，例如表面活性剂。
特别有益的是以单位剂型配制胃肠外的组合物，便于施用和剂量的均匀化。在此使用的单位剂型是指物理上离散的单位，适合作为单位剂量用于要治疗的哺乳动物；每个单位含有计算的预定数量的活性化合物，以产生期望的治疗效果，与所需的药物载体相关联。本发明的剂量单位形式的规格由(a)活性化合物的独特特征和要实现的特定治疗效果、以及(b)本领域的化合物如用于治疗个体的活性化合物的固有限制来指示或直接取决于它们。比剂量可以由本领域普通技术人员容易地计算，例如，根据患者的近似的体重或体表面积或者待占据的身体空间体积。剂量还根据选择的特定给药途径来计算。测定治疗的合适的剂量所必需的计算的进一步精细化通常由普通技术人员进行。这种计算可以由本领域技术人员根据在此处目标细胞的分析制备中公开的活性无需过度实验地进行。与标准的剂量-反应研究一起确定精确的剂量。要理解的是，实际施用的组合物的数量将由医师根据相关的环境来确定，包括要治疗的状况；要施用的组合物的选择；个体患者的年龄、体重和反应；患者的症状的严重度；以及选择的施用途径。
这些化合物的毒性和治疗效力可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学过程来测定，例如，测定LD50(对50％群体的致死剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)。在有毒/治疗效果之间的剂量比例是治疗指数，它可以被表示为LD50/ED50之间的比例。展现大的治疗指数的化合物是优选的。当使用展现了毒性副作用的化合物时，应当小心地设计递送系统，所述递送系统将这些化合物靶向受感染组织以最小化对未感染细胞的潜在损害，从而降低副作用。
从细胞培养分析和动物研究获得的数据可被用于配制用于人类的剂量范围。这些化合物的剂量优选地处在包括很小或没有毒性的ED50的循环浓度范围内。取决于采用的剂型和使用的给药途径，剂量可以在这个范围内变动。对于在此公开的方法中使用的任何化合物，可以最初地从细胞培养分析来估计治疗有效剂量。可以在动物模型中配制剂量来达到包括在细胞培养中测定的IC50的循环血浆浓度范围(即，达到症状的半最大抑制的测试化合物的浓度)。这种信息可用于更精确地测定人类中有用的剂量。可以通过例如高效液相层析法测定血浆中的水平。
在一个实施方式中，KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽可以通过向患者中植入载体或细胞来治疗地施用，所述载体或细胞能够产生生物学活性形式的KCNQ5或KCNQ5(W270L)或KCNQ5或KCNQ5(W270L)的前体，所述前体是可以被身体容易地转变成生物学活性形式的KCNQ5或KCNQ5(W270L)的分子。
在一个方法中，分泌KCNQ5或KCNQ5(W270L)的细胞可以被密封到半透薄膜中用于向患者中植入。细胞可以是通常表达KCNQ5或其前体的细胞，或者所述细胞可以被转化以表达KCNQ5或KCNQ5(W270L)或其生物学活性片段或其前体。优选的是所述细胞是人类来源的。然而，此处的制剂和方法可以用于兽医学以及人类应用，在此使用的术语“患者”或“受试者”意图包括人类和兽医学患者。
监视试剂(例如，药物或化合物)对KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白的表达或活性的影响不仅可应用于基础药物筛选，还可应用于临床试验。例如，通过在此描述的筛选分析确定的试剂提高KCNQ5基因表达、蛋白水平或上调KCNQ5活性的有效性，可以在对展现出降低或升高的KCNQ5基因表达、蛋白水平，下调的KCNQ5活性的受试者的临床试验中监视。做为选择，通过在此描述的筛选分析确定的试剂提高KCNQ5基因表达、蛋白水平或上调KCNQ5活性的有效性，可以在对展现出提高或升高的KCNQ5基因表达、蛋白水平，上调的的KCNQ5活性的受试者的临床试验中监视。在这些临床试验中，KCNQ5基因的表达或活性、和优选的失调中牵涉的其他基因，可以用作特定细胞的表型的“读出(read out)”或标记物。
例如，而不是为了限制，可以鉴定包括KCNQ5的基因，其在细胞中由如下试剂的处理来调节，所述试剂调节KCNQ5活性(例如，化合物、药物或小分子)(例如，如在此描述的筛选分析中鉴定的)。因而，例如在临床试验中，为了研究试剂对于KCNQ5相关失调的影响，可以分离细胞，制备RNA，分别分析KCNQ5和在KCNQ5相关失调中涉及的其他基因的表达水平。基因表达的水平(即，基因表达模式)可以通过如在此描述的Northern印迹分析或RT-PCR、或作为选择通过测量产生的蛋白质的数量、通过在此描述的方法之一、或通过测量KCNQ5或其他基因的活性水平来测定。这样，基因表达模式可以充当标记物，细胞对所述试剂的生理反应的指示。因而，这种反应状态可以在用试剂治疗个体之前、期间的各个时点来测定。
优选的实施方式提供了监视用试剂(例如通过在此描述的筛选分析鉴定的激动剂、拮抗剂、拟肽、蛋白质、肽、核酸、小分子或其他药物候选物)治疗受试者的有效性的方法，包括步骤：(i)在施用所述试剂之前从受试者获得施用前的样品；(ii)检测所述施用前的样品中KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质、mRNA或基因组DNA的表达水平；(iii)从所述受试者获得一个或多个施用后的样品；(iv)检测所述施用后的样品中KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质、mRNA或基因组DNA的表达或活性的水平，(v)比较所述施用前的样品中KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质、mRNA或基因组DNA的表达或活性的水平和所述施用后的样品中KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质、mRNA或基因组DNA；和(vi)从而改变试剂对所述受试者的施用。例如，试剂的提高的施用可能是期望的，以提高KCNQ5或KCNQ5(W270L)的表达或活性到比检测的更高的水平，也就是提高试剂的有效性。做为选择，试剂的降低的施用可能是期望的，以降低KCNQ5或KCNQ5(W270L)的表达或活性到更低的水平，也就是降低试剂的有效性。根据这样的实施方式，KCNQ5或KCNQ5(W270L)表达或活性可以用作试剂的有效性的指标，即使在不存在可观察的表型反应的情况下。
在优选的实施方式中，KCNQ5或KCNQ5(W270L)调节试剂在将受益于KCNQ5或KCNQ5(W270L)的表达和/或活性的调节的受试者中调节例如小节V中描述的状况(上文)的能力，可以通过在施用所述试剂之后检测患者的状况方面的改善来测量。这种改善可以由本领域普通技术人员使用适合于患者的特定状况的指标来容易地测量。通过测量患者的状况方面的改变监视患者的反应在一些情况中是优选的，其中活检材料的采集将形成对患者的提高的风险和/或损害。
可能的是，KCNQ5或KCNQ5(W270L)的水平可以在各种状况中被改变，KCNQ5或KCNQ5(W270L)水平的定量将提供临床上有用的信息。
此外，在疾病状况的治疗中，含有KCNQ5或KCNQ5(W270L)的组合物可以外源地施用，可能希望的是在血清中、在任何希望的组织区室中、或在受影响的组织中实现KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽的某些目标水平。因而，有益的是能够监视患者中或生物样品中的KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽水平，所述生物样品包括从患者获得的组织活检样品，在某些情况下，还监视天然KCNQ5的水平。因而，另一个方面提供了用于检测来自患者的样品中KCNQ5或KCNQ5(W270L)的存在的方法。
VII.本发明的试剂盒
另一个方面涉及用于进行筛选分析、调节方法或诊断分析的试剂盒。例如，用于进行筛选分析的试剂盒包括包含KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽的细胞，测定KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽活性的设施，以及任选的，使用所述试剂盒来鉴定KCNQ5或KCNQ5(W270L)活性的调节物的说明书。在另一个实施方式中，用于进行筛选分析的试剂盒包括包含KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽的组合物，测定KCNQ5或KCNQ5(W270L)多肽活性的设施，以及任选的，使用所述试剂盒来鉴定KCNQ5或KCNQ5(W270L)活性的调节物的说明书。
另一个实施方式提供了用于进行调节方法的试剂盒。试剂盒可以包括，例如，在适合的载体中或包装在适合的容器中的调节试剂(例如，KCNQ5或KCNQ5(W270L)抑制性或刺激性试剂)，任选的具有使用所述调节物来调节KCNQ5或KCNQ5(W270L)活性的说明书。
另一个方面涉及用于诊断受试者中与异常的KCNQ5表达和/或活性相关的失调的试剂盒：所述试剂盒可以包括用于测定KCNQ5或KCNQ5(W270L)的表达的试剂(例如，用于检测KCNQ5或KCNQ5(W270L)mRNA的核酸探针，或用于将此KCNQ5或KCNQ5(W270L)蛋白质的一种或多种抗体)、受试者的结果可以与之比较的对照、以及任选的，为诊断目的使用所述试剂盒的说明书。
除非另有陈述，在此公开的方法的实施将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、重组DNA技术和免疫学的常规方法，这些都处在本领域普通技术人员的能力范围内。这些技术已经在文献中完整地说明了。参见，例如，Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.by Sambrook，Fritsch and Maniatis(Cold Spring Harbor LaboratoryPress：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glover ed.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.，1984)；美国专利No.4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the treatise，Methods InEnzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene Transfer Vectors ForMammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.，1987，Cold SpringHarbor Laboratory)；Methods In Enzymology，Vols.154 and 155(Wu et al.eds.)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer andWalker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of ExperimentalImmunology，Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
实施例
在以下实施例中进一步定义了此处的公开。要理解的是，表明优选的实施方式的这些实施例仅通过例示的方式给出。根据以上的说明和这些实施例，本领域技术人员可以确定优选的特征而不背离本发明的精神和范围，可以进行各种变化和修改来使其适应各种用途和状况。
一般过程
KCNQ5和KCNQ1通道在非洲蟾蜍(Xenopus)卵母细胞中的表达—人类KCNQ5和KCNQ1基因被克隆到pKSM载体中，所述pKSM载体已经为卵母细胞表达被特别地工程化。基因序列通过DNA测序来确认。基因库登记号码是：KCNQ5，NM_019842(SEQ ID NO：3)；KCNQ1，U89364.1(SEQ ID NO：7)。构建体通过XbaI限制性内切酶(NEB，Beverly，MA)来线性化。用mMESSAGE mMACHINE
Figure A200780002569D0108093641QIETU
试剂盒(Ambion，Austin，TX)进行体外转录，通过苯酚提取来纯化cRNA。非洲蟾蜍卵母细胞使用Drumond Nanojet卵母细胞注射器(Drummond Scientific Co.，Broomall，PA)用含有大约9.2ng cRNA的46nl溶液注射。电生理学记录在注射后3-7天进行。
电生理学—所有的实验使用常规的卵母细胞双电极电压钳记录(TEVC)在室温下(22-23℃)进行。记录电极从1.5mm玻璃移液管使用Sutter P-97微量移液管拉伸器(Sutter Instrument，Novato，CA)拉出，用3M KCl填充。小心地切断移液管尖端来获得0.5-1Mohm的电极电阻。使用Dagan CA-1放大器(Dagan Corporation，Minneapolis MN)，保持电位在-100mV钳住。为了测试通道活化的电压依赖性，施加一系列的去极化电压脉冲。为了观察瑞替加滨的效果的时间过程，以15秒的间隔重复地施加40mV的单一(3秒)电压脉冲。具有Pulse 8.5软件的HEKA计算机界面(HEKA Elektronik，Lambrecht，Germany)被用于控制放大器并将数据数字化用于分析。
溶液和化学物质—含有(以mM)NaCl 96、KCl 2、CaCl2 1.8、MgCl2 1、HEPES 10的ND96溶液被用于卵母细胞孵育和记录。瑞替加滨以50mM作为DMSO中的贮备溶液来制备，在实验中应用之前稀释到期望的浓度。在KCNQ5通道上测试DMSO，没有观察到影响直到1％。在所有的实验中，使用的DMSO低于0.4％。
化合物经由快速水浴灌流系统(ALA Scientific Instruments，Westbury，NY)施加到细胞，水浴溶液改变在10秒内完成。
数据分析—使用HEKA Pulsefit 8.5软件在线测量电流振幅。为了从肉眼可见的电流获得通道导电性，K+逆转电位(reversal potential)在ND96溶液中是大约-80mV，应用以下方程式：G＝I/(V+80)，其中G是完整的卵母细胞导电性，I是完整的卵母细胞电流，V是由于诱导电流的电压。数据表示为平均值±SE，进行配对的student t检验。在P<0.05时差异被认为是显著的。
实施例1
为了产生含有来自KCNQ1的S5-S6区域的KCNQ5多核苷酸(编码SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8的氨基酸S253-V355)，侧翼于KCNQ1基因的S5-S6区域的一对寡引物被用于从KCNQ1获得DNA片段。两个引物都含有在每个末端导入的DNA序列，其在S5的上游和S6的下游相应的连接区域中重叠于KCNQ5基因序列。使用这些引物加上KCNQ1构建体作为模板的PCR产物被纯化，用作使用KCNQ5构建体作为模板的第二轮PCR的定点诱变引物。然后应用使用QuickChange方案的定点诱变(Stratagene，La Jolla，CA)。所有的突变通过DNA测序来确认。
测试了瑞替加滨对于功能嵌合体(含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5)的影响。如附图1A和1B所示，50μM的瑞替加滨不再增加通道活性。在5分钟的施加时期期间，电流振幅和电压依赖性活化都没有显著地改变(附图1C)。瑞替加滨对这种嵌合通道的作用的剧烈的破坏表明，瑞替加滨在KCNQ5中的作用位点最有可能位于S5-S6跨膜结构域的区域中。
实施例2
为了进一步解析瑞替加滨的作用位点，来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域被分成两个部分，S5跨膜结构域和S6跨膜结构域(用接头)，相应的嵌合KCNQ5通道含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域或S6跨膜结构域。具有交换的S6跨膜结构域的嵌合通道在膜电位从-100到100mV时没有显示电流。含有来自KCNQ1的S5结构域的另外的嵌合体作为向外的整流器(outward rectifier)起作用，具有非常独特的活化性质。如附图2A左侧画面中所示，当膜电位比20mV更高时，这种突变体看起来钝化了。当通道通过膜去极化被活化时，显现了短暂的外向电流(150-200毫秒)，使得通道活化是显著地双-部分样的。当膜电位低于20mV时，通道活化模式类似于野生型，不能观察到清楚的钝化(inactivation)。
然后测试了瑞替加滨对含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5的影响。瑞替加滨被施加于表达含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5的卵母细胞，其中稳态电流振幅被稳定在最大的水平。如附图2B中所示，50μM的瑞替加滨不再对这个突变体有影响。在5分钟的水浴施加中，通过去极化到40mV诱导的通道电流保持不变。附图2C显示了在瑞替加滨处理之前和之后的I-V曲线。电流的电流振幅和电压依赖性都没有被瑞替加滨改变(附图2A右侧画面，附图2C)。这个发现表明，瑞替加滨作用的分子依赖性在S5结构域之内。
实施例3
所有五个KCNQ成员的S5结构域进行序列比对，搜索可能说明对KCNQ1对瑞替加滨的反应的缺乏的独特氨基酸残基。如附图3上部画面所示，在KCNQ1和KCNQ5之间存在十个不匹配的残基。在附图3中高亮显示的它们中的七个对于KCNQ1是独特的。因此，分别地将7个残基的每一个修饰成KCNQ1中相应的，在KCNQ5中产生突变。一个突变体KCNQ5(F282Y)当在卵母细胞中表达时丧失了它的功能。其他六个突变体是有功能的，在膜电位的实验范围中显示了充足的电流水平。然后测试了瑞替加滨对这些突变体的每一个的影响。如附图3中底部画面所示，两个突变体KCNQ5(A269T)和KCNQ5(W270L)(SEQ IDNO：1，编码SEQ ID NO：2)具有对瑞替加滨的显著更少的反应。与实施例2中S5结构域交换的突变体类似，KCNQ5(W270L)完全地丧失了对瑞替加滨的反应，表明这个色氨酸残基对于瑞替加滨作用是关键的。
实施例4
为了进一步研究瑞替加滨效果对于S5中这个特别的色氨酸残基的功能依赖性，进行了KCNQ1 S5结构域中相应残基的反向突变，假定这个突变可能使得KCNQ1能够被瑞替加滨激活。令人惊讶地，这个突变体KCNQ1(L171W)实际上变得对瑞替加滨敏感。然而，不是被活化，KCNQ1(L171W)被瑞替加滨阻断。如在附图4A中所示，野生型KCNQ5通道对50μM瑞替加滨没有显著反应，但是对200μM瑞替加滨有轻微的抑制性反应。相比之下，50μM瑞替加滨明显地降低了KCNQ1(L171W)的稳态电流振幅，200μM瑞替加滨抑制了80mV的稳态电流的62.5％(附图4B)。瑞替加滨诱导的可能最显著的改变是通道活化。如在附图4C中所示，瑞替加滨改变了在80mV激起的电流的活化动力学，从单一的到双指数活化时间过程，其可以由钝化动力学的改变来描述。瑞替加滨不仅降低KCNQ1(L171W)的稳态电流水平，还修改了通道活化的电压依赖性(附图4D和插图)。对瑞替加滨的高度提高的敏感性表明，瑞替加滨分子能够接近KCNQ5或KCNQ1(L171W)的S5结构域中的色氨酸残基，引起电压依赖性活化的向上或向下调节。
实施例1-4突出了KCNQ5通道门控中S5螺旋的重要性，提供了瑞替加滨对KCNQ钾通道的作用的分子解释。
序列表
Figure A200780002569E01122
Figure A200780002569E01131
Figure A200780002569E01151
Figure A200780002569E01171
Figure A200780002569E01181
Figure A200780002569E01201
Figure A200780002569E01211
Figure A200780002569E01231
Figure A200780002569E01241
Figure A200780002569E01251
Figure A200780002569E01261
Figure A200780002569E01271
Figure A200780002569E01281
Figure A200780002569E01291
Figure A200780002569E01301
Figure A200780002569E01311
Figure A200780002569E01331
Figure A200780002569E01341

Claims (99)

1.一种编码全部或部分KCNQ5(W270L)多肽的分离的多核苷酸。
2.一种分离的多核苷酸，包含选自以下构成的组的多核苷酸：
(a)包含SEQ ID NO：1的核酸序列；
(b)编码SEQ ID NO：2的多核苷酸；
(c)编码多肽的与SEQ ID NO：1具有至少约95％同源性的核酸序列，条件是在核苷酸808-810的替换是针对产生对氨基酸亮氨酸的保守性替换的密码子；
(d)能够在高度严格条件下与SEQ ID NO：1杂交的核酸分子；
(e)与(a)、(b)、(c)或(d)互补的核酸分子；和
(f)SEQ ID NO：1的变体。
3.权利要求1或2的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸是DNA。
4.权利要求1或2的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸是RNA。
5.一种分离的多核苷酸片段，包含权利要求2的分离的多核苷酸的有义序列的至少12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、75、100、200、300、400、500、600或700个连续核苷酸，其中所述片段包含SEQ ID NO：1的核苷酸808-810。
6.一种引物或探针，包含权利要求5的分离的多核苷酸片段。
7.权利要求2的分离的多核苷酸，其中(d)的核酸分子与SEQ IDNO：1在以下条件下杂交：6×SSC在45℃，用0.2×SSC、0.1％SDS在50℃洗涤至少一次。
8.权利要求7的分离的多核苷酸，其中(d)的核酸分子与SEQ IDNO：1在以下条件下杂交：6×SSC在45℃，用0.2×SSC、0.1％SDS在55℃洗涤至少一次。
9.权利要求8的分离的多核苷酸，其中(d)的核酸分子与SEQ IDNO：1在以下条件下杂交：6×SSC在45℃，用0.2×SSC、0.1％SDS在65℃洗涤至少一次。
10.一种载体，包含权利要求2的分离的多核苷酸。
11.权利要求10的载体，其中所述载体是质粒。
12.权利要求10的载体，其中所述载体是表达载体。
13.一种用权利要求10-12的任一项的载体转化的宿主细胞。
14.权利要求13的宿主细胞，其是原核细胞。
15.权利要求14的宿主细胞，其中所述原核细胞是E.coli细胞。
16.权利要求13的宿主细胞，其是真核细胞。
17.权利要求16的宿主细胞，其中所述真核细胞是昆虫细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞或非洲蟾蜍卵母细胞。
18.一种包含权利要求2的分离的多核苷酸的非人类转基因动物。
19.一种分离的反义多核苷酸，其反义于权利要求2的分离的多核苷酸。
20.权利要求19的分离的反义多核苷酸，其中所述分离的反义多核苷酸是反义寡核苷酸、核酶或siRNA。
21.一种分离的多核苷酸，编码含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽。
22.权利要求21的分离的多核苷酸，其中所述S5-S6跨膜结构域来自人类KCNQ1。
23.一种分离的多核苷酸，包含选自以下构成的组的多核苷酸：
(a)包含SEQ ID NO：3的核酸序列，其中核苷酸769-1062被SEQ IDNO：5替换；
(b)编码SEQ ID NO：4的多核苷酸，其中氨基酸257-354被来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域替换；
(c)能够在高度严格条件下与(a)或(b)的核酸序列杂交的核酸分子；和
(d)与(a)、(b)或(c)互补的核酸分子。
24.权利要求23的分离的多核苷酸，其中(b)的所述S5-S6跨膜结构域是SEQ ID NO：6。
25.一种分离的多核苷酸，编码含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽。
26.权利要求25的分离的多核苷酸，其中所述S5跨膜结构域来自人类KCNQ1。
27.一种分离的多核苷酸，包含选自以下构成的组的多核苷酸：
(a)包含SEQ ID NO：3的核酸序列，其中核苷酸769-873被SEQ IDNO：5的核苷酸1-105替换；
(b)编码SEQ ID NO：4的多核苷酸，其中SEQ ID NO：4的氨基酸257-291被来自KCNQ1的S5跨膜结构域替换；
(c)能够在高度严格条件下与(a)或(b)的核酸序列杂交的核酸分子；和
(d)与(a)、(b)或(c)互补的核酸分子。
28.权利要求27的分离的多核苷酸，其中(b)的所述S5跨膜结构域是SEQ ID NO：6的氨基酸1-35。
29.一种分离的多肽，包含选自以下构成的组的氨基酸序列：
(a)KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列；
(b)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(c)(a)的变体；和
(d)与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列，条件是在氨基酸270处的替换是氨基酸亮氨酸的保守性替换。
30.一种融合蛋白，包含与第二、非KCNQ5(W270L)多肽可操作连接的、由权利要求29的分离的多肽组成的第一多肽。
31.一种编码权利要求30的融合蛋白的分离的多核苷酸。
32.一种包含权利要求29的分离的多肽的拟肽，其中至少一个肽键由选自由--CH2NH--、--CH2S--、--CH2--CH2--、顺式--CH＝CH--、反式--CH＝CH--、--COCH2--、--CH(OH)CH2—和--CH2SO--构成的组的键替代。
33.一种分离的肽片段，包含权利要求29的分离的多肽的至少8个连续氨基酸，其中所述片段包括SEQ ID NO：2的氨基酸270。
34.一种分离的肽片段，包含权利要求29的分离的多肽的至少10个连续氨基酸，其中所述片段包括SEQ ID NO：2的氨基酸270。
35.一种分离的肽片段，包含权利要求29的分离的多肽的至少15个连续氨基酸，其中所述片段包括SEQ ID NO：2的氨基酸270。
36.一种分离的肽片段，包含权利要求29的分离的多肽的至少20个连续氨基酸，其中所述片段包括SEQ ID NO：2的氨基酸270。
37.一种分离的肽片段，包含权利要求29的分离的多肽的至少30个连续氨基酸，其中所述片段包括SEQ ID NO：2的氨基酸270。
38.一种抗体，其特异性地结合包含SEQ ID NO：2的KCNQ5(W270L)多肽。
39.权利要求38的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
40.权利要求38的抗体，其中所述抗体是多克隆抗体。
41.一种抗体，其特异性地结合包含SEQ ID NO：2的至少8个连续氨基酸的KCNQ5(W270L)多肽片段，其中所述片段包括SEQ ID NO：2的氨基酸270。
42.一种分离的KCNQ5多肽，含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域。
43.权利要求42的分离的KCNQ5多肽，其中所述S5-S6跨膜结构域来自人类KCNQ1。
44.权利要求42的分离的KCNQ5多肽，其中所述KCNQ5多肽的氨基酸序列包含具有用来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域替换的氨基酸257-354的SEQ ID NO：4。
45.权利要求44的分离的KCNQ5多肽，其中SEQ ID NO：4的氨基酸257-354被SEQ ID NO：6替换。
46.一种分离的KCNQ5多肽，含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域。
47.权利要求46的分离的KCNQ5多肽，其中所述S5跨膜结构域来自人类KCNQ1。
48.权利要求46的分离的KCNQ5多肽，其中所述KCNQ5多肽的氨基酸序列包含具有用来自KCNQ1的S5跨膜结构域替换的氨基酸257-291的SEQ ID NO：4。
49.权利要求48的分离的KCNQ5多肽，其中SEQ ID NO：4的氨基酸257-291被SEQ ID NO：6的氨基酸1-35替换。
50.一种KCNQ二聚通道，包含至少一个KCNQ5亚单位，其是权利要求29、42或46的分离的多肽。
51.权利要求50的KCNQ二聚通道，其中两个通道亚单位都是权利要求29、42或46的分离的多肽。
52.权利要求50的KCNQ二聚通道，其中一个亚单位是KCNQ3。
53.权利要求52的KCNQ二聚通道，其中所述KCNQ3亚单位是人类KCNQ3。
54.一种KCNQ四聚通道，包含至少一个KCNQ5亚单位，其是权利要求29、42或46的分离的多肽。
55.权利要求54的KCNQ四聚通道，其中四个通道亚单位中的两个是权利要求29、42或46的分离的多肽。
56.权利要求55的KCNQ四聚通道，其中四个通道亚单位中的三个是权利要求29、42或46的分离的多肽。
57.权利要求56的KCNQ四聚通道，其中四个通道亚单位全都是权利要求29、42或46的分离的多肽。
58.权利要求54的KCNQ四聚通道，其中至少一个亚单位是KCNQ3。
59.权利要求58的KCNQ四聚通道，其中所述KCNQ3亚单位是人类KCNQ3。
60.一种筛选试剂的方法，所述方法包括：
(a)用选自以下构成的组的KCNQ5分子接触试剂：
(i)编码全部或部分KCNQ5(W270L)多肽的多核苷酸；
(ii)编码含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸；
(iii)编码含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸；
(iv)包含KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列的多肽；
(v)含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽；和
(vi)含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽；和
(b)检测所述试剂对KCNQ5活性的影响；
其中在KCNQ5活性方面的降低或提高的检出是试剂为KCNQ5的调节物的指示。
61.权利要求60的方法，其中KCNQ5活性是神经元应激性的降低或膀胱平滑肌的安抚(quieting down)。
62.权利要求60的方法，其中KCNQ5活性通过电生理学地测量KCNQ5通道的离子电流数量来检测。
63.权利要求60的方法，其通过无细胞分析进行。
64.一种筛选试剂的方法，所述方法包括：
(a)用试剂接触细胞；和
(b)检测选自以下构成的组的KCNQ5分子的表达水平：
(i)编码全部或部分KCNQ5(W270L)多肽的多核苷酸；
(ii)编码含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸；
(iii)编码含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸；
(iv)包含KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列的多肽；
(v)含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽；和
(vi)含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽；
其中在KCNQ5表达方面的降低或提高的检出是试剂为KCNQ5的调节物的指示。
65.一种通过权利要求60-64的任一项的方法鉴定的试剂。
66.权利要求65的试剂，其中所述试剂是瑞替加滨的类似物。
67.权利要求65的试剂，其中所述试剂是下式的化合物的类似物：
Figure A200780002569C00071
其中：
R1选自氢、C1-C6-烷基、C2-C6-烷酰基或基团Ar；
R2选自氢或C1-C6-烷基；
R3选自C1-C6-烷氧基、NH2、C1-C6-烷基氨基、C1-C6-双烷基氨基、由基团Ar取代的氨基、C1-C6-烷基、C2-C6-烯基、C2-C6-炔基、基团Ar或基团ArO--；
R4选自氢、C1-C6-烷基或基团Ar；
R5选自氢或C1-C6-烷基或基团Ar；
Alk是具有1-9个碳原子的直链或分支的亚烷基基团，其也可以被基团Ar取代；
Ar是由基团R6、R7和/或R8取代的苯基基团，其中这些基团R6、R7和R8是相同的或不同的，并且代表H、C1-C6-烷基、C3-C7-环烷基、羟基、C1-C6-烷氧基、C2-C6-烷酰氧基、卤素、羟基、C1-C6-卤代烷基、--CN、--NH2、--NH--C1-C6-烷基、--N(C1-C6-烷基)2、--CO2H、--CO--C1-C6-烷基、--CO--O--C1-C6-烷基、--COAr、--CO--OAr、--CONH2、--CONH--C1-C6-烷基、--CON(C1-C6-烷基)2、--CONHAr、--NH--CO--C1-C6-烷基、--NHCO--Ar、--NHCO--C1-C6-烷氧基、--N--H--CO--Ar、--NHCO--NH2、--NHCO--N(--C1-C6-烷基)2、--NHCO--NHAr、--NH--SO2--C1-C6-烷基、--NH--SO2Ar、--NH--SO2-硝基苯基、--SO2--OH、--SO2-C1-C6-烷基、--SO2--Ar、--SO2-C1-C6-烷氧基、--SO2--OAr、--SO2--NH2、--SO2--NH--C1-C6-烷基、--SO2--N(C1-C6-烷基)2、--SO2--NHAr、--SO2--C2-C6-烷氧基；
n是0或1。
68.一种诱导或维持哺乳动物中的膀胱控制的方法，所述方法包括向有需要的哺乳动物施用治疗有效量的、由权利要求60-64的任一项的方法鉴定的试剂。
69.一种治疗或预防哺乳动物中的尿失禁的方法，所述方法包括向有需要的哺乳动物施用治疗有效量的、由权利要求60-64的任一项的方法鉴定的试剂。
70.一种治疗或预防哺乳动物中的神经性疼痛的方法，所述方法包括向有需要的哺乳动物施用治疗有效量的、由权利要求60-64的任一项的方法鉴定的试剂。
71.一种鉴定能够结合KCNQ5多肽的多肽的方法，包括：
(a)应用哺乳动物双杂交操作，其中编码KCNQ5多肽的序列由一个杂交载体携带，来自cDNA或基因组DNA文库的序列由第二杂交载体携带，其中所述KCNQ5多肽选自以下构成的组：
(i)包含KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列的多肽；
(ii)含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽；和
(iii)含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽；
(b)用所述载体转化所述宿主细胞；
(c)分离阳性转化的细胞；和
(d)提取所述第二杂交载体来获得编码与KCNQ5多肽结合的多肽的序列。
72.一种检测KCNQ5多肽的方法，包括检测选自由以下构成的组的抗体
(a)选择性地结合包含KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列的KCNQ5多肽的抗体；
(b)选择性地结合含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽的抗体；
(c)选择性地结合含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽的抗体；和
(d)选择性地结合包含来自SEQ ID NO：2的至少8个连续氨基酸的KCNQ5(W270L)多肽片段的抗体，其中所述片段包括SEQ ID NO：2的氨基酸270；
与怀疑含有KCNQ5多肽、KCNQ5(W270L)多肽或KCNQ5(W270L)多肽片段的样品中的分子的结合，其中所述抗体在一定条件下与所述样品接触，所述条件允许与样品中存在的任何KCNQ5多肽、KCNQ5(W270L)多肽或KCNQ5(W270L)多肽片段特异性结合，所述抗体与样品中所述分子的结合表明KCNQ5多肽、KCNQ5(W270L)多肽或KCNQ5(W270L)多肽片段的存在。
73.权利要求72的方法，其中所述样品来自中枢神经系统、骨骼肌或膀胱平滑肌。
74.权利要求73的方法，其中所述中枢神经系统样品来自脑。
75.一种检测KCNQ5的表达的方法，包括在来自怀疑表达KCNQ5的细胞或组织的样品中，检测编码选自由以下构成的组的KCNQ5多肽的mRNA：
(i)包含KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列的多肽；
(ii)含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽；和
(iii)含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽；
使用包含来自选自以下构成的组的多核苷酸的至少12个连续核苷酸的探针：
(i)编码全部或部分KCNQ5(W270L)多肽的多核苷酸；
(ii)编码含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸；和
(iii)编码含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸。
76.权利要求75的方法，其中所述探针包含来自包含核苷酸808-810的SEQ ID NO：1的至少12个连续的核苷酸。
77.权利要求75的方法，其中所述组织是脑、骨骼肌或膀胱。
78.一种测定KCNQ5基因是否被突变或删除的方法，包括检测来自受试者的细胞或组织的样品中基因改变的存在或不存在，所述基因改变的特征在于影响编码KCNQ5蛋白质的基因的完整性或KCNQ5基因的错误表达的至少一个改变，其中所述检测步骤用至少一种探针或引物进行，所述探针或引物包含来自选自以下构成的组的多核苷酸的至少12个连续核苷酸：
(i)编码全部或部分KCNQ5(W270L)多肽的多核苷酸；
(ii)编码含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸；和
(iii)编码含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸。
79.权利要求78的方法，其中所述探针或引物包含来自包含核苷酸808-810的SEQ ID NO：1的至少12个连续的核苷酸。
80.权利要求78的方法，其中所述组织是脑、骨骼肌或膀胱。
81.一种鉴定KCNQ5多肽的变体的方法，包括筛选包含KCNQ5突变体的组合库中的KCNQ5多肽激动剂或拮抗剂；其中所述KCNQ5多肽选自由以下构成的组：
(i)包含KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列的多肽；
(ii)含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽；和
(iii)含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽。
82.通过权利要求81的方法鉴定的KCNQ5变体。
83.一种分离KCNQ5多肽的方法，包括：
(a)用怀疑含有KCNQ5多肽的样品接触KCNQ5抗体，所述KCNQ5多肽选自由以下构成的组：
(iv)包含KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列的多肽；
(v)含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽；和
(vi)含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽；和
(b)从所述样品分离KCNQ5抗体-KCNQ5多肽复合物。
84.权利要求83的方法，其中所述抗体选自由以下构成的组：
(a)特异性地结合包含SEQ ID NO：2的KCNQ5多肽的抗体；和
(b)特异性地结合包含来自SEQ ID NO：2的至少8个连续氨基酸的KCNQ5多肽片段的抗体，其中所述片段包括SEQ ID NO：2的氨基酸270。
85.一种生产KCNQ5多肽的方法，包括：
(a)在适合的培养基中培养包含表达载体的转化的宿主细胞；其中所述表达载体包含选自由以下构成的组的多核苷酸：
(i)编码全部或部分KCNQ5(W270L)多肽的多核苷酸；
(ii)编码含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸；和
(iii)编码含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸；
从而产生KCNQ5多肽；和
(b)任选的，回收步骤(a)的KCNQ5多肽。
86.一种治疗需要提高的KCNQ5活性的哺乳动物的方法，包括向所述有需要的哺乳动物施用治疗有效量的选自由以下构成的组的KCNQ5分子：
(i)编码全部或部分KCNQ5(W270L)多肽的多核苷酸；
(ii)编码含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸；
(iii)编码含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸；
(iv)包含KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列的多肽；
(v)含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽；和
(vi)含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽。
87.权利要求86的方法，其中所述治疗是针对尿失禁或神经性疼痛。
88.一种治疗需要降低的KCNQ5活性的哺乳动物的方法，包括向所述有需要的哺乳动物施用治疗有效量的：
(a)KCNQ5反义多核苷酸，其反义于选自由以下构成的组的多核苷酸：
(i)编码全部或部分KCNQ5(W270L)多肽的多核苷酸；
(ii)编码含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸；和
(iii)编码含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸；或
(b)选自由以下构成的组的KCNQ5抗体：
(A)选择性地结合包含KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列的KCNQ5多肽的抗体；
(B)选择性地结合含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽的抗体；
(C)选择性地结合含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽的抗体；和
(D)选择性地结合包含来自SEQ ID NO：2的至少8个连续氨基酸的KCNQ5(W270L)多肽片段的抗体，其中所述片段包括SEQ ID NO：2的氨基酸270。
89.权利要求88的方法，其中所述KCNQ5反义多核苷酸是反义寡核苷酸、核酶或siRNA。
90.一种获得抗KCNQ5多肽抗体的方法，包括：
(a)用KCNQ5多肽独特的免疫原性KCNQ5多肽或其免疫原性部分来免疫动物，其中所述KCNQ5多肽选自由以下构成的组：
(i)包含KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列的多肽；
(ii)含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽；和
(iii)含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽；和
(b)从所述动物中分离特异性结合KCNQ5多肽的抗体。
91.权利要求90的方法，其中所述免疫原性KCNQ5多肽是SEQ IDNO：2。
92.一种分析KCNQ5多肽编码功能性离子通道的能力的方法，包括：
(a)用编码选自由以下构成的组的KCNQ5多肽的多核苷酸转染宿主细胞：
(i)包含KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列的多肽；
(ii)含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽；和
(iii)含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽；
(b)在所述宿主细胞中表达所述KCNQ5多肽；和
(c)电生理学地测量所述KCNQ5多肽的离子电流数量。
93.权利要求92的方法，其中步骤(c)通过完整细胞记录或双电极电压钳完成。
94.权利要求93的方法，其中在完整细胞记录中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
95.权利要求93的方法，其中在双-电极电压钳中所述宿主细胞是爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞。
96.一种在受试者中预防疾病或状况的方法，所述疾病或状况将受益于KCNQ5活性和/或表达的调节，包括向所述受试者施用KCNQ5多肽或试剂，所述试剂调节KCNQ5表达或至少一种KCNQ5活性，其中所述KCNQ5多肽选自由以下构成的组：
(i)包含KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列的多肽；
(ii)含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽；和
(iii)含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽。
97.权利要求96的方法，其中所述状况是尿失禁或神经性疼痛。
98.一种用于检测KCNQ5多肽或多核苷酸的试剂盒，包括：
(a)能够检测生物样品中的KCNQ5多肽或多核苷酸的标记的化合物或试剂；
(b)检测样品中KCNQ5多肽或多核苷酸的数量的设施；
(c)与标准物比较所述样品中KCNQ5多肽或多核苷酸的数量的设施；和
(d)任选的，使用所述试剂盒来检测KCNQ5多肽或多核苷酸的说明书；
其中所述KCNQ5多肽或多核苷酸选自由以下构成的组：
(i)编码全部或部分KCNQ5(W270L)多肽的多核苷酸；
(ii)编码含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸；
(iii)编码含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸；
(iv)包含KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列的多肽；
(v)含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽；和
(vi)含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽。
99.一种用于鉴定KCNQ5活性的调节物的试剂盒，包括：
(a)包含KCNQ5多肽的细胞或组合物；
(b)用于测定KCNQ5多肽活性的设施；和
(c)任选的，使用所述试剂盒来鉴定KCNQ5活性的调节物的说明书；
其中所述KCNQ5多肽选自由以下构成的组：
(i)包含KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列的多肽；
(ii)含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽；和
(iii)含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽。
100.一种用于诊断受试者中与异常的KCNQ5表达和/或活性相关的失调的试剂盒，包括：
(a)用于测定KCNQ5多肽或多核苷酸的表达的试剂；
(b)受试者的结果与之相比较的对照物；和
(c)任选的，为诊断目的使用所述试剂盒的说明书；
其中所述KCNQ5多肽或多核苷酸选自由以下构成的组：
(i)编码全部或部分KCNQ5(W270L)多肽的多核苷酸；
(ii)编码含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸；
(iii)编码含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽的多核苷酸；
(iv)包含KCNQ5(W270L)多肽的氨基酸序列的多肽；
(v)含有来自KCNQ1的S5-S6跨膜结构域的KCNQ5多肽；和
(vi)含有来自KCNQ1的S5跨膜结构域的KCNQ5多肽。
CNA200780002569XA 2006-01-19 2007-01-17 瑞替加滨在kcnq5上的新的结合位点 Pending CN101370824A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US76025206P 2006-01-19 2006-01-19
US60/760,252 2006-01-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101370824A true CN101370824A (zh) 2009-02-18

Family

ID=38229824

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA200780002569XA Pending CN101370824A (zh) 2006-01-19 2007-01-17 瑞替加滨在kcnq5上的新的结合位点

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20070190554A1 (zh)
EP (1) EP1973939A2 (zh)
JP (1) JP2009525024A (zh)
CN (1) CN101370824A (zh)
AU (1) AU2007207596A1 (zh)
BR (1) BRPI0707165A2 (zh)
CA (1) CA2634221A1 (zh)
WO (1) WO2007084531A2 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107987144B (zh) * 2017-12-14 2020-05-15 中国科学院昆明动物研究所 一种蜈蚣多肽SLP_SsTx及其编码基因和应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5492825A (en) * 1993-08-06 1996-02-20 The Regents Of The University Of California Mammalian inward rectifier potassium channel cDNA, IRK1, corresponding vectors, and transformed cells
US20030204075A9 (en) * 1999-08-09 2003-10-30 The Snp Consortium Identification and mapping of single nucleotide polymorphisms in the human genome
WO2001092526A1 (en) * 2000-05-26 2001-12-06 Bristol-Myers Squibb Company Human kcnq5 potassium channel, methods and compositions thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US20070190554A1 (en) 2007-08-16
WO2007084531A3 (en) 2007-09-20
BRPI0707165A2 (pt) 2011-04-26
EP1973939A2 (en) 2008-10-01
AU2007207596A1 (en) 2007-07-26
JP2009525024A (ja) 2009-07-09
CA2634221A1 (en) 2007-07-26
WO2007084531A2 (en) 2007-07-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU751396B2 (en) Novel molecules of the Tango-77 related protein family and uses thereof
US5800998A (en) Assays for diagnosing type II diabetes in a subject
US20060035849A1 (en) Methods and composition for modulating type I muscle formation using pgc-1 alpha
EP1185649B1 (en) The myostatin gene promoter and inhibition of activation thereof
JP2002531069A (ja) タンパク質のカプサイシン／バニロイド受容体ファミリーの新規メンバー及びそれらの使用
US20130123122A1 (en) Secreted proteins and uses thereof
US20060141575A1 (en) Secreted proteins and nucleic acids encoding them
Hirz et al. Neuronal ceroid lipofuscinosis (NCL) is caused by the entire deletion of CLN8 in the Alpenländische Dachsbracke dog
US5795726A (en) Methods for identifying compounds useful in treating type II diabetes
US20040260058A1 (en) Novel endothelially expressed dnas and proteins, and their use
US7160986B2 (en) BCL-xγ, a novel BCL-x isoform, and uses related thereto
JP2003508030A (ja) 新規ポリペプチドおよびそれをコードする核酸
WO1998005777A9 (en) BCL-xη, A NOVEL BCL-x ISOFORM, AND USES RELATED THERETO
US6037173A (en) Isolated nucleic acid encoding TRBP
US6406884B1 (en) Secreted proteins and uses thereof
CN101370824A (zh) 瑞替加滨在kcnq5上的新的结合位点
JP2002534114A (ja) 新規ｌｒｓｇタンパク質および核酸分子ならびにそのための用途
JP2002514078A (ja) Ｆｔｈｍａ−０７０関連蛋白質ファミリーおよびｔ８５関連蛋白質ファミリーの新規分子ならびにそれらの使用
US6380382B1 (en) Gene encoding a protein having diagnostic, preventive, therapeutic, and other uses
JP2003515319A (ja) パブロ、すなわちＢｃｌ−ｘＬと相互作用するポリペプチド、およびそれに関連する使用
US6008014A (en) Method of making lipid metabolic pathway compositions
JP2002528046A (ja) 新規レセプタースーパーファミリー分子およびそれについての用途
US20020164330A1 (en) Novel molecules of the tango-77 related protein family and uses thereof
WO1998021363A1 (en) Compositions and methods for treating type ii diabetes involving hnf-4
JP2004075569A (ja) Ｉｌ２０受容体およびｉｌ２０の新規用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20090218