KR20040077791A - Ｇ-단백질-커플링된 수용체를 암호화하는 핵산 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본원에는 염증과 생리 면역학적 반응에 대한 시그널 전달에 관여하는 신규하고도 유용한 G-단백질 커플링된 수용체가 제공된다. 또한, 상기 수용체의 활성을 조정할 수 있는 분자를 스크리닝하기 위한 상기 수용체의 사용 방법이 본원에 제공된다. 이러한 분자는 다혈증 염증과 면역학적으로 관련된 질병 및 장애를 치료하는데 용이하게 적용될 수 있다.

Description

Ｇ-단백질-커플링된 수용체를 암호화하는 핵산 및 이의 용도{A nucleic acid encoding a G-protein-coupled receptor, and uses thereof}

G 단백질-커플링된 수용체 (GPCR)는 세포의 시그널 전달(signal transduction)에 관여하는 내재(integral) 막 단백질의 대 계열에 속한다. GPCR는 신경전달물질(neurotransmitter), 호르몬, 취기제(odorant) 및 빛을 포함한 각종 세포외 시그널에 반응하고, 해당 세포 내에서 제2의 메신저 반응을 개시하도록 시그널을 전달시킬 수 있다. 많은 치료 약물이 GPCR를 표적으로 하는데, 이는 이들 수용체가 염증, 혈관 확장, 심박수, 기관지 확장, 내분비선 분비 및 연동을 포함한 광범위한 생리학적 반응을 매개하기 때문이다.

GPCR는 세포외 도메인, 7개의 막 관통 도메인 및 세포내 도메인을 특징으로 한다. 이들 수용체가 행하는 기능들 중의 일부, 예를 들면 리간드와의 결합 및 G단백질과의 상호작용은 특정 아미노산이 결정적 위치에 존재하는 것과 관계가 있다. 예를 들어, 각종 연구 결과, GPCR 내의 아미노산 서열 차이로 인해, 천연 리간드나 작은 분자 효능제 또는 길항제에 대한 친화성 차이가 설명되는 것으로 밝혀졌다. 달리 언급하면, 사소한 서열 차이로 인해, 상이한 결합 친화성과 활성이 설명될 수 있다(참조: 예를 들면, Meng 등, J Bio Chem (1996) 271(50):32016-20; Burd 등, J Bio Chem (1998) 273(51):34488-95; 및 Hurley 등, J Neurochem (1999) 72(l):413-21). 특히, 제3 세포내 도메인 내에서의 아미노산 서열 차이가 상이한 활성을 가져다 줄 수 있다는 연구 결과가 보고되었다. 마이버우(Myburgh) 등은 고나도트로핀 방출 호르몬 수용체의 세포내 루프 3의 알라닌 261이 G 단백질 커플링과 수용체 내재화(internalization)에 중요한 역할을 한다는 사실을 발견하였다(Biochem J (1998) 33l(Part 3):8936). 워네로우(Wonerow) 등은 티로트로핀 수용체에 관해 연구한 결과, 제3 세포내 루프 내의 결실로 인해, 구성적(constitutive) 수용체 활성이 야기되었다는 사실을 입증하였다 (J Bio Chem (1998)273(14):79005).

일반적으로, 특정 수용체에 대한 내인성 리간드의 결합 작용으로 인해, 상기 수용체의 세포내 도메인(들)의 입체 구조가 변하게 되어, 이러한 수용체의 세포내 도메인(들)과 세포내 성분인 G-단백질 간의 커플링이 가능하게 된다. 몇 가지 G 단백질, 예를 들면, G_q, G_s, G_i, G_z및 G_o이 존재한다(참조: 예를 들면, Dessauer 등, Clin Sci (Colch) (1996) 91(5):527-37). 해당 수용체의 카르복시 말단 뿐만 아니라 IC-3 루프도 G 단백질과 상호작용한다 (Pauwels 등, Mol Neurobiol (1998) 17(1-3):109-135 및Wonerow 등, supra). 몇몇 GPCR는 G 단백질에 관하여 "무차별적"인데, 즉 GPCR은 하나 이상의 G 단백질과 상호작용할 수 있다 (참조: 예를 들면, Kenakin, Life Sciences (1988) 43:1095).

G 단백질과 리간드 활성화된 GPCR과의 커플링은 시그널링 연쇄증폭 과정을 개시한다("시그널 전달"로 지칭됨). 이러한 시그널 전달은 궁극적으로, 세포 활성화 또는 세포 억제를 가져다 준다.

GPCR 은 두 가지 상이한 입체 구조 상태, 즉 "불활성" 상태와 "활성" 상태 간의 평형을 유지하면서 세포막 내에 존재한다. 불활성 상태의 수용체는 생물학적 반응을 유발시키는 세포내 시그널 전달 경로에 연결될 수 없다(단, 전달된 세포 내에 수용체가 과발현하는 동안에는 예외가 존재한다)(참조: 예를 들면, www.creighton.edu/Pharmacology/inverse.htm.). 입체 구조를 활성 상태로 조정함으로써, 전달 경로에 연결될 수 있어(G 단백질을 통해서 이루어짐), 생물학적 반응이 유발된다. 효능제가 결합되면, 활성 입체 구조로 될 가능성이 훨씬 더 커진다. 그러나, 종종, 어떠한 효능제가 존재하지 않는 경우라도 이미 상당한 반응이 진행되고 있다면, 이러한 수용체는 구성적으로 활성이라고 불리운다(즉, 이미 활성 입체 구조이거나 또는 리간드-독립적 또는 자가 활성 상태이다). 효능제가 상기 시스템에 부가된 경우에는, 반응 증강이 통상적으로 관찰된다. 그러나, 전통적인 길항제가 부가된 경우에는, 이러한 분자에 의한 결합이 어떠한 효력도 발휘하지 못한다. 한편, 몇몇 길항제는 해당 수용체의 구성적 활성을 억제시킬 수 있는데,이는 후자 부류의 약물이 기술적으로는 길항제가 아니고, 고유의 음성적 활성을 지닌 효능제라는 것을 제시해준다. 이들 약물은 역(inverse) 효능제로 불리운다(www.creighton.edu/Pharmacology/inverse.htm.).

전통적으로 행해진 수용체에 관한 연구는 길항제와 기타 수용체 효과인자 분자를 동정하고자 하는 시도가 발표되기 전에 내인성 리간드가 먼저 동정되었다는 가정으로부터 계속해서 진행되어 왔다. 길항제가 먼저 발견되었다 할지라도, 절대적(dogmatic) 반응은 내인성 리간드를 동정해야만 하는 것이었다 (WO 00/22131). 그러나, 활성 상태가 검정 스크리닝 목적에 가장 유용하기 때문에, 상기 구성적 수용체, 특히 GPCR를 수득하는 것이 내인성 리간드에 관한 정보 부재하에서도 효능제, 부분 효능제, 역 효능제 및 길항제를 용이하게 분리시킬 수 있을 것이다. 더욱이, 수용체 활성 장애로부터 비롯된 질병에서는, 구성적 활성 억제를 유발시키거나 또는 보다 구체적으로는, 활성화 수용체 유효 농도를 감소시키는 약물이 자가 활성 상태의 수용체를 이용한 검정에 의해 보다 용이하게 발견될 수 있었다. 예를 들어, 수용체는 질병을 치료하기 위해 환자 내로 형질감염될 수 있기 때문에, 이러한 수용체의 활성을 상기 검정에 의해 발견된 역 효능제를 이용하여 세부적으로 조정할 수 있다.

천식, 만성 폐색성 폐 질환(COPD) 및 류마티스성 관절염(RA) 등의 질병은 T 헬퍼 세포(helper cell), 단구-대식세포 및 호산구와 관련이 있는 염증성 병인을 나타내는 것으로 일반적으로 간주되고 있다. 코르티코스테로이드를 이용한 현재의 소염 치료법은 천식에 유효하긴 하지만, 대사성 및 내분비성 부작용과 연관이있다. 폐 또는 비 점막을 통하여 흡수될 수 있는 흡입용 제형에 대해서도 마찬가지로 적용될 수 있을 것이다. RA 또는 COPD에 대한 만족할 만한 경구 치료법이 현재까지는 밝혀지지 않았다.

호산구는 알레르기와 천식에 있어 상당 부분의 기도 기능장애를 매개한다. 인터루킨-5(IL5)는 호산구 성장 및 활성화 사이토킨이다. IL-5가 기도 과반응성을 유발시키는 호산구-매개된 조직 손상과, 조직 호산구증가증에 필요하다는 연구 결과가 밝혀졌다 (참조: Chang 등, J Allergy Clin Immunol (1996) 98(5 pt 1):922-931 및 Duez 등, Am J Respir Crit Care Med (2000) 161(1):200206). IL5는 아토피성 천식에서 알레르기원(예: 집 먼지 진드기 항원) 노출 후 T- 헬퍼 세포-2 세포(Th2)에 의해 만들어진다.

RA는 활성화된 대식세포가 병든 활액 내에 축적됨으로써 비롯되는 것으로 여겨진다. 인터페론 γ (IFNγ)는 수 많은 프로-염증 특성을 지닌 T헬퍼 세포1 (Th1) 세포-유래된 사이토킨이다. 이는 가장 강력한 대식세포 활성화 사이토킨이고, 수지상 세포-유사 표현형에 기여하는 MHC 부류 II 유전자 전사를 유도한다.

리포폴리삭카라이드(LPS)는 종양 괴사 인자 α (TNFα) 방출을 포함한 염증 반응을 유발시키는 그람-음성 세균 세포 벽의 한 성분이다. RA에서의 정맥내 항- TNFα 요법의 효능이 임상실에서 입증되었다. COPD는 대식세포가 폐에 축적되는 것으로부터 비롯되는 것으로 여겨지기도 하는데, 이러한 대식세포는 호중구 화학유인물질 (예를 들면, IL8: de Boer 등, J Pathol (2000) 190(5):619626)를 생성시킨다. 대식세포와 호중구 둘 다는 폐포 벽의 분해를 야기시키는카텝신(cathepsin)을 방출시킨다. 폐 상피가 염증 세포의 화학유인물질과 기타 염증 세포-활성화제에 대한 중요한 공급원일 수 있는 것으로 여겨진다 (참조: 예를 들면, Thomas 등, J Virol (2000) 74(18):84258433; Lamkhioued 등, Am J Respir Crit Care Med (2000) 162(2 Pt. 1):723732; 및 Sekiya 등, J Immunol (2000) 165(4): 2205-2213).

질병에 있어서의 GPCR의 역할과, GPCR의 활성을 조정함으로써 질병을 치료할 수 있는 능력을 고려할 때, 기존에 공지되지 않은 GPCR를 동정하고 성상 확인하는 것이 GPCR 활성과 관련된 질병 상태를 치료하기 위한 새로운 조성물과 치료 방법을 개발할 수 있게 해준다. 따라서, 지금까지 공지되지 않은 GPCR을 암호화하는 신규하고도 유용한 핵산 분자를 발견, 분리 및 성상 확인하는 것이 필요하다.

특정한 GPCR의 잠재적 효능제 또는 길항제를 제공해줄 수 있는 분자를 동정하기 위해 상기와 같이 지금까지 공지되지 않은 GPCR를 활용하는 검정이 또한 요구된다. 이들 분자는 생체 내에서 GPCR의 활성을 조정하기 위한 치료제로서 용이하게 적용될 수 있으므로, GPCR 활성과 관계된 다혈증 질병을 치료할 수 있다

본 명세서 내에 인용된 모든 참조 문헌은 이러한 참조문헌이 본 발명에 대한 "선행 기술"로서 이용 가능하다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 아니된다.

발명의 요약

본 발명은 신규한 구성적 활성 GPCR인 GAVE6의 발현을 확인하고 이를 특징화하며, 이러한 발견을 관련 질병의 동정과 치료에 적용하는 방법 및 조성물을 제공한다.

따라서, 광범위하게 본 발명은 도 1의 DNA 서열(서열 번호 1)을 포함하는 분리된 핵산 분자, 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이의 동족체 또는 유도체에 관한 것이다. 이러한 본 발명의 변이체는 대립유전자 변이체, 축퇴성(degenerate) 변이체, 또는 서열 상의 축퇴성 변화를 가져다 주는 대립유전자 변이체일 수 있다.

더욱이, 본 발명은 엄격한 하이브리드화 조건 하에 서열 번호 1의 분리된 핵산 분자와 하이브리드화 가능한 분리된 핵산 분자, 또는 이의 변이체에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 엄격한 하이브리드화 조건 하에, 서열 번호 1의 DNA 서열에 상보적인 핵산 분자와 하이드리드화 가능한 분리된 핵산 분자에 관한 것이다. 엄격한 하이브리드화 조건은 다음에 기재되어 있다.

추가로, 본 발명은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.

임의로, 상기 언급된 바와 같은 본 발명의 분리된 핵산 분자는 탐지 가능한 수준으로 표지될 수 있다. 본원에 적용되는 탐지 가능한 표지물의 예로는 효소, 방사성 동위원소, 또는 형광 화학물질이 있지만, 이에 제한되지 않는다. 탐지 가능한 표지물의 특정한 예들이 다음에 기재되어 있다.

특정한 폴리펩티드가 또한 본 발명 내에 포괄된다. 예를 들면, 본 발명은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 정제된 폴리펩티드, 이의 보존적 변이체, 또는 이의 동족체 또는 유도체에 관한 것이다. 임의로, 본 발명의 폴리펩티드는 탐지 가능한 수준으로 표지될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드가 면역원으로서 사용되어 생성된 항체에 관한 것이다. 이들 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있다. 더욱이, 항체는 "키메라"일 수 있는데, 이는 예를 들어, 이들 항체가 상이한 종에서 본 발명의 정제된 폴리펩티드에 대하여 생성된 항체의 단백질 도메인을 포함할 수 있기 때문이다. 특정 양태에서는, 본 발명의 항체가 "사람화(humanized)"된 것일 수 있다. 물론, 본 발명의 항체도 탐지 가능한 수준으로 표지될 수 있다. 본원에 적용되는 탐지 가능한 표지물의 예들이 다음에 기재되어 있다.

본 발명은 추가로, 발현 제어 요소와 작동가능하게 결합된, 서열 번호 1의 DNA 서열을 포함하는 핵산 분자, 이의 변이체, 이의 동족체 또는 유도체, 또는 이의 단편을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. 추가로, 본 발명의 발현 벡터는, 발현 제어 요소와 작동가능하게 결합된, 서열 번호 1의 DNA 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자와 엄격한 하이브리드화 조건 하에 하이브리드화할 수 있는 분리된 핵산 분자를 포함할 수 있거나, 또는 서열 번호 1의 DNA 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자에 상보적인, 발현 제어 요소와 작동가능하게 결합된 하이브리드화 프로브와 엄격한 하이브리드화 조건 하에 하이브리드화될 수 있는 분리된 핵산 분자를 포함할 수 있다. 본 발명에 적용되는 발현 제어 요소의 특정한 한 예가 프로모터이다. 본 발명에 적용될 수 있는 특정한 프로모터의 예로는 hCMV의 초기 프로모터, SV40의 초기 프로모터, 아데노바이러스의 초기 프로모터, 백시니아의 초기 프로모터, 폴리오마의 초기 프로모터, SV40의 후기 프로모터, 아데노바이러스의 후기 프로모터, 백시니아의 후기 프로모터, 폴리오마의 후기 프로모터,lac 시스템,trp시스템,TAC시스템,TRC 시스템, 파아지 람다의 주요 작동인자 및 프로모터 영역, fd 외피 단백질의 제어 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 프로모터 , 산 포스파타제 프로모터 , 또는 효모 α 교배 인자의 프로모터가 있지만, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 발현 벡터를 사용하여, 숙주 세포를 형질감염 또는 형질전환시킬 수 있으며, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이의 변이체를 생성시킬 수 있다. 상기 숙주 세포는 원핵성 세포이거나 진핵성 세포일 수 있다. 본 발명에 적용되는 단세포 숙주의 특정한 예로는 이. 콜라이(E. coli), 슈도모나스(Pseudomonas),바실루스(Bacillus),스트렙토마이세스( Streptomyces ),효모, CHO, R1.1, B-W, L-M, COS1, COS7, BSC1, BSC40, BMT10 및 Sf9 세포가 있지만, 이에 제한되지 않는다.

더욱이, 본 발명은 추가로, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 정제된 폴리펩티드, 이의 변이체 또는 이의 단편의 생성 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포를, 본 발명의 정제된 폴리펩티드의 발현을 제공해주는 조건 하에 본 발명의 발현 벡터와 함께 배양하는 단계; 및 단세포 숙주, 숙주 세포를 둘러싸고 있는 배양물, 또는 이들 둘 다로부터 본 발명의 정제된 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한다.

더욱이, 본 발명은 GAVE6의 활성을 조정할 수 있는 화합물을 동정하기 위한 검정에 관한 것이다. 이러한 화합물은 GAVE6의 효능제, 길항제, 또는 역 효능제일 수 있다. 따라서, 본 발명은 잠재적 효능제를 내인성 리간드의 존재하에 GAVE6 발현 세포와 접촉시키는 단계; 및 잠재적 효능제가 존재한 경우의 GAVE6의 시그널링활성이 잠재적 효능제의 부재하에서의 GAVE6의 시그널링 활성에 비해 증가하였는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는, GAVE6의 효능제를 동정하는 방법에 관한 것이다.

마찬가지로, 본 발명은 GAVE6의 역 효능제를 동정하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 잠재적 역 효능제를, GAVE6 발현 세포와 접촉시키는 단계; 및 잠재적 역 효능제와 내인성 리간드 또는 효능제의 존재하에서의 GAVE6의 시그널링 활성이, 내인성 리간드 또는 효능제는 존재하지만 잠재적 역 효능제는 존재하지 않는 조건 하의 GAVE6의 시그널링 활성에 비해 저하되었는지의 여부와, 내인성 리간드 또는 효능제의 존재하에서 저하되었는지를 결정하는 단계를 포함한다.

물론, 본 발명은 GAVE6의 길항제를 동정하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 잠재적 길항제를 GAVE6 발현 세포와 접촉시키는 단계; 및 이러한 잠재적 길항제의 존재하에서의 GAVE6의 시그널링 활성이 내인성 리간드 또는 효능제의 존재하에서의 GAVE6의 활성에 비해 저하되었는지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다.

따라서, 본 발명의 목적은 GAVE6 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자, 이의 단편, 또는 이의 변이체를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 서열 번호 1의 DNA 서열을 포함하거나 또는 엄격한 조건 하에 서열 번호 1과 하이브리드화 가능한 핵산 분자의 변이체를 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 GAVE6에 대한 아미노산 서열을, 이의 변이체, 이의 단편 또는 이의 동족체 또는 유도체와 함께 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 GAVE6를 암호화하는 DNA 서열(이러한 DNA 서열은 발현 제어 요소와 작동가능하게 결합되어 있다), 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이의 동족체 또는 유도체를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 면역원으로서 GAVE6, 이의 변이체, 이의 동족체 또는 유도체, 또는 이의 단편을 갖는 항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 GAVE6 단백질의 활성을 조정할 수 있는 화합물을 동정하는 방법을 포함한다. 이러한 조정제는 GAVE6의 길항제, GAVE6의 효능제, 또는 GAVE6의 역 효능제일 수 있다.

본 발명의 추가의 목적은 GAVE6 활성을 조정하는데 사용하기 위한 약제학적 조성물을 제공하는 것이다. 이러한 조정을 이용하여 GAVE6 활성과 관계된 각종 질병, 예를 들면, 각종 염증 질환, 천식, 만성 폐색성 폐 질환(COPD), 및 류마티스성 관절염을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 질병을 치료할 수 있다.

본 발명의 이들 국면 및 기타 국면은 다음 도면과 상세한 설명을 참조하여 보다 잘 이해될 것이다.

본 발명은 일반적으로, 지금까지 공지되지 않은 G-단백질-커플링된 수용체인 GAVE6을 암호화하는 신규한 핵산 분자, 및 이러한 핵산 분자와 GAVE6의 용도에 관한 것이다.

도 1: GAVE6를 암호화하는 DNA 서열(서열 번호 1).

도 2: GAVE6의 아미노산 서열(서열 번호 2).

도 3: GAVE6의 아미노산 서열(서열 번호 2)과 HM74 및 GPR31의 아미노산 서열 (각각 서열 번호 3 및 4)의 비교.

도 4: 각종 조직에서 GAVE6의 전사에 대한 노던 블롯(Northern Blot).

도 5: 사람 기관/조직 패널에서 각종 조직에서의 GAVE6 발현 프로필.

상기 설명된 바와 같이, 본 발명은 본원에서 GAVE6로서 지칭된, 지금까지 공지되지 않은 G 단백질-커플링된 수용체를 암호화하는 지금까지 공지되지 않은 핵산 분자의 놀랍고도 예상치 못한 발견에 관한 것이다. 특히, GAVE6가 면역 조직 또는 기관, 예를 들면, 신장, 간 및 소장에서 발현된다는 사실이 밝혀졌다.

본 발명을 서술하기 위한 본 명세서 및 청구의 범위 전반에 걸쳐 사용된 각종 용어들이 다음에 제시되어 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "조정제"는 GAVE6의 활성을 조정하는 잔기(예를 들면, 리간드와 후보 화합물이 있지만, 이에 제한되지 않는다)를 지칭한다. 본 발명의 조정제는 GAVE6의 효능제, 부분 효능제, 길항제, 또는 역 효능제일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "효능제"는 수용체와 결합될 때 세포내 반응을 활성화시키거나, 또는 막에 대한 GTP 결합을 증강시키는 잔기(예를 들면, 리간드와 후보 화합물이 있지만, 이에 제한되지 않는다)를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "부분 효능제"는 수용체와 결합될 때 효능제 보다는 덜한 정도로 세포내 반응을 활성화시키거나, 또는 효능제 보다는 덜한 정도로 막에 대한 GTP 결합을 증강시키는 잔기(예를 들면, 리간드와 후보 화합물이 있지만, 이에 제한되지 않는다)를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "길항제"는 동일한 위치의 수용체와 결합하기 위해 효능제와 경쟁하는 잔기(예를 들면, 리간드와 후보 화합물이 있지만, 이에 제한되지 않는다)를 지칭한다. 그러나, 길항제는 활성 형태의 수용체에 의해 개시된 세포내 반응을 활성화시키지 않음으로써, 효능제 또는 부분 효능제에 의한 세포내 반응을 억제시킬 수 있다. 관련 국면에서는, 길항제가 효능제 또는 부분 효능제의 부재하에서의 기준선 세포내 반응을 저하시키지 않는다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "역 효능제"는 구성적 활성 수용체와 결합하여 기준선 세포내 반응을 억제시키는 잔기(예를 들면, 리간드와 후보 화합물이 있지만, 이에 제한되지 않는다)를 지칭한다. 이러한 기준선 반응은, 활성 형태의 수용체에 의해, 효능제 또는 부분 효능제의 부재하, 또는 막에 대한 GTP 결합 감소하에서 관찰되는 정상적 기본 수준 활성 아래로 개시된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "후보 화합물"은 스크리닝 기술에 적합한 잔기(예를 들면, 화학 화합물이 있지만, 이에 제한되지 않는다)를 지칭한다. 한 양태에서는, 상기 용어에 GAVE6의 효능제, 부분 효능제, 역 효능제 또는 길항제로 이루어진 그룹 중에서 선택된 화합물인 것으로 공지된 화합물은 포함되지 않는다. 이들 화합물은 특정 수용체에 특이적인 내인성 리간드를 동정하고/하거나 특정 수용체에 대한 후보 화합물을 스크리닝하는(이러한 스크리닝에는 효능을 평가해주는 경쟁적 검정이 요구된다) 것을 포함하는 전통적인 약물 개발 공정에 의해 동정되었다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "구성적 활성화 수용체" 또는 "자가 활성 수용체"는 상호 교환적으로 본원에 사용되고, 이는 리간드의 부재하에서 활성화시킨 수용체를 지칭한다. 이러한 구성적 활성 수용체는 내인성이거나(예: GAVE6) 비-내인성일 수 있는데, 즉 GPCR를 재조합 수단에 의해 변형시켜 야생형 GPCR의 돌연변이체 구성적 형태를 생성시킬 수 있다(참조: 예를 들면, EP 1071701; WO 00/22129; WO 00/22131; 및 미국 특허 제6,150,393호 및 제6,140,509호; 이들 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입되어 있다).

본원에 사용된 바와 같은 용어 "구성적 수용체 활성화"는 내인성 리간드 또는 이의 화학적 등가물을 이용하여 수용체의 결합 이외의 수단에 의해 활성 상태의 수용체를 안정화시키는 과정을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "리간드"는 또 다른 분자와 결합하는 잔기를 지칭하는데, 이러한 잔기로는 호르몬 또는 신경전달물질이 있지만, 이에 제한되지 않고, 추가로 상기 잔기는 특정 수용체와 입체-선택적으로 결합한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "계열"은 본 발명의 핵산 분자 또는 단백질을 지칭할 경우에, 외관상 공통의 구조 도메인을 갖고 본원에 규정된 바와 같은 충분한 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 실체를 지닌 둘 이상의 단백질 또는 핵산 분자를 의미한다. 이러한 계열 구성원은 천연 발생적일 수 있고, 동일하거나 상이한 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 특정 계열은 사람 기원의 제1 단백질과 쥐 기원의 상기 단백질의 상동체 뿐만 아니라 사람 기원의 별개의 제2 단백질과 이러한 제2 단백질의 쥐 기원 상동체를 함유할 수 있다. 특정 계열의 구성원들은 공통의 기능적 특징을 보유할 수도 있다.

본원에 상호 교환적으로 사용된 바와 같은 용어 "GAVE6 활성", "GAVE6의 생물학적 활성" 및 "GAVE6의 기능적 활성" 은 표준 기술에 따라서 생체내 또는 시험관 내에서 결정된 바와 같이, GAVE6 반응성 세포 상에서 GAVE6 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산 분자에 의해 발휘되는 활성을 지칭한다. GAVE6 활성은 직접적인 활성, 예를 들면, 제2 단백질과의 연합 활성 또는 제2 단백질 상의 효소적 활성, 또는 간접적 활성, 예를 들면, GAVE6 단백질과 제2 단백질과의 상호작용에 의해 매개된 세포의 시그널링 활성일 수 있다. 특정 양태에서는, GAVE6 활성에는 다음 활성들 중의 하나 이상의 활성이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다: (i) GAVE6 시그널링 경로에서 단백질들과 상호작용하는 능력, (ii) GAVE6 리간드와 상호작용하는 능력; 및 (iii) 세포내 표적 단백질과 상호작용하는 능력.

추가로, 본 발명에 따라서, 당해 기술 분야 내의 통상적인 분자 생물학, 미생물학, 및 재조합 DNA 기술이 이용될 수 있다. 이러한 기술은 다음 문헌에 상세히 설명되어 있다(참조: 예를 들면, Sambrook, Fritsch & Maniatis,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (herein "Sambrook 등, 1989");DNA Cloning: A Practical Approach,Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait ed. 1984);Nucleic Acid Hybridization[B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)];Transcription and Translation[B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)];Animal Cell Culture[R.I. Freshney, ed. (1986)];Immobilized Cells and Enzymes[IRL Press, (1986)]; B. Perbal,APractical Guide To Molecular Cloning(1984); F.M. Ausubel 등 (eds.),Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).

따라서, 본원에 제시된 경우, 다음 용어들은 다음에 언급된 정의를 나타낼 것이다.

"벡터"는 부착된 절편의 복제를 야기시키도록 또 다른 DNA 절편가 부착될 수 있는 레플리콘(replicon), 예를 들면, 플라스미드, 파아지 또는 코스미드(이에 제한되지 않음)이다. "레플리콘"은 생체 내에서 자가 DNA 복제 단위로서 작용하는, 즉 스스로의 제어 하에 복제할 수 있는 임의의 유전자 요소(예: 플라스미드, 염색체, 바이러스)이다. 벡터의 특정 예들이 다음에 기재되어 있다.

"카세트"는 특이적 제한 부위에서 벡터 내로 삽입될 수 있는 DNA의 절편을 지칭한다. 이러한 DNA의 절편은 목적하는 폴리펩티드를 암호화하고, 카세트와 제한 부위는 전사 및 해독을 위한 적당한 판독 프레임에 해당 카세트의 삽입을 보장해주도록 고안된다.

세포는 외인성 또는 이종 DNA가 이러한 세포 내부에 도입된 경우에 상기 외인성 또는 이종 DNA에 의해 "형질감염"된다. 세포는 형질감염된 DNA가 표현형 변화에 영향을 미치는 경우에 외인성 또는 이종 DNA에 의해 "형질전환"된다. 바람직하게는, 형질전환성 DNA는 해당 세포의 게놈을 구성하는 염색체성 DNA 내로 통합(공유적으로 결합)되어야 한다.

"이종" DNA는 본래부터 세포 내에 또는 이러한 세포의 염색체 부위에 위치하지 않았던 DNA를 지칭한다. 바람직하게는, 이종 DNA에는 해당 세포에 외래성인 유전자가 포함된다.

"상동 재조합"은 특정 벡터의 외래 DNA 서열이 염색체 내에 삽입되는 것을 지칭한다. 특히, 상기 벡터는 상동 재조합에 특이적인 염색체 부위를 표적으로 한다. 특이적 상동 재조합을 위해, 상기 벡터는 상보적 결합과 염색체 내로의 벡터의 도입을 허용해주기에 충분히 긴, 상기 염색체 서열에 대한 상동성 영역을 함유할 것이다. 보다 긴 상동성 영역과, 보다 큰 서열 유사도는 상동 재조합의 효능을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 분리된 핵산 분자

한 국면에서, 본 발명은 도 1의 DNA 서열(서열 번호 1)을 포함하는 분리된 핵산 분자, 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이의 동족체 또는 유도체에 관한 것이다.

"핵산 분자"는 일본쇄 형태 또는 이본쇄 나선 형태로 존재하는, 리보뉴클레오시드 (아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘; "RNA 분자") 또는 데옥시리보뉴클레오시드 (데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘 또는 데옥시시티딘; "DNA 분자")의 포스페이트 에스테르 중합체 형태, 또는 이의 임의의 포스포에스테르 동족체(예: 포스포로티오에이트 및 티오에스테르)를 지칭한다. 이본쇄 DNA-DNA, DNA-RNA 및 RNA-RNA 나선이 가능하다. 용어 핵산 분자, 및 특히 DNA 또는 RNA 분자는 단지 해당 분자의 1차 및 2차 구조만을 지칭하고, 특정한 어떠한 3차 형태로 제한되지 않는다. 따라서, 상기 용어에는 특히 선형 또는 환형 DNA 분자(예: 제한 단편), 플라스미드 및 염색체에서 발견되는 이본쇄 DNA가 포함된다. 특정한 이본쇄 DNA 분자를 논의하는데 있어서, 서열들은 DNA의 비-전사 쇄(즉, mRNA 와 상동성인 서열을 갖는 쇄)를 따라 5’에서 3’ 방향 서열만을 제시해주는 통상적 관행에 따라서 본원에 기재될 수 있다. "재조합 DNA 분자"는 분자 생물학적 조작을 진행시킨 DNA 분자이다.

"분리된" 핵산 분자는 핵산의 천연 공급원에 존재하는 기타 핵산 분자로부터 분리된 것이다. 특히, "분리된" 핵산 분자는 이러한 핵산이 유래되는 유기체의 게놈 DNA에 GAVE6을 암호화하는 핵산을 천연적으로 플랭킹하는 서열(즉, 상기 핵산의 5’ 및 3’ 말단에 위치한 서열)을 갖고 있지 않다. 각종 양태에서는, 분리된 GAVE6 핵산 분자가, 이러한 핵산이 유래되는 세포의 게놈 DNA에 상기 핵산 분자를 천연적으로 플랭킹하는 뉴클레오티드 서열 약 5kb, 4kb, 3kb, 2kb, 1kb, 0.5kb 또는 0.1kb 미만을 함유할 수 있다. 더욱이, "분리된" 핵산 분자, 예를 들면, cDNA 분자는 재조합 기술에 의해 생성되는 경우에는 기타 세포성 물질 또는 배양 배지를 실질적으로 함유하지 않거나, 또는 화학적으로 합성되는 경우에는 화학적 전구체 또는 기타 화학물질을 실질적으로 함유하지 않는다.

본 발명의 핵산 분자, 예를 들면, 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자, 또는 이들 임의의 뉴클레오티드 서열의 단편 또는 상보체, 또는 이의 동족체 또는 유도체는 본원에 제공된 서열 정보와 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 분리시킬 수 있다. 서열 번호 1의 핵산 서열의 전부 또는 일정 부분을 하이브리드화 프로브로서 사용하고, 표준 하이브리드화 기술과 클로닝 기술(예를 들면,Sambrook 등 에 기재된 바와 같음)을 사용하여 GAVE6 핵산 분자를 분리할 수 있다.

본 발명의 핵산 분자는 표준 PCR 증폭 기술에 따라서 적당한 올리고뉴클레오티드 프라이머와 주형으로서 cDNA, mRNA 또는 게놈 DNA를 사용하여 증폭시킬 수 있다. 상기 프라이머는 서열 번호 1에 제시된 정보와 통상적인 실험 기술을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다. 이와 같이 증폭된 핵산을 적당한 벡터 내로 클로닝하고, DNA 서열 분석에 의해 이의 성상을 확인할 수 있다. 추가로, GAVE6 뉴클레오티드 서열에 상응하는 올리고뉴클레오티드는 표준 합성 기술, 예를 들면, 자동화 DNA 합성기를 사용하여 제조할 수 있다.

GAVE6 DNA 와 하이브리드화 가능한 분리된 핵산 분자

본 발명은 추가로, GAVE6 DNA와 하이브리드화 가능하거나, GAVE6 DNA에 상보적인 하이브리드화 프로브와 엄격한 하이브리드화 조건 하에서 하이브리드화 가능하거나, 또는 엄격한 하이브리드화 조건 하에서 이들 둘 다와 하이브리드화 가능한 분리된 핵산 분자를 포괄한다. 특히 본 발명은 엄격한 하이브리드화 조건 하에서 서열 번호 1의 DNA 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는 서열 번호 1의 DNA 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자에 상보적인 프로브와 하이브리드화 가능한 분리된 핵산 분자를 포괄한다.

핵산 분자는, 일본쇄 형태의 핵산 분자가 적당한 온도와 용액 이온 농도 조건 하에 (참조: Sambrook 등,supra) 또 다른 핵산 분자와 어닐링될 수 있는 경우에 또 다른 핵산 분자, 예를 들면, cDNA, 게놈 DNA 또는 RNA와 "하이브리드화 가능하다". 온도와 이온 농도 조건은 하이브리드화의 "엄격도"를 결정해준다. 상동 핵산에 대한 예비 스크리닝을 위해서는, T_m55 ℃에 상응하는 낮은 엄격도 하이브리드화 조건을 사용할 수 있다(예를 들면, 5x SSC, 0.1% SDS, 0.25% 우유, 및 포름아미드 부재; 또는 30% 포름아미드, 5x SSC, 0.5% SDS). 중간 정도의 엄격도 하이브리드화 조건은 보다 높은 T_m에 상응하고, 예를 들면, 40% 포름아미드, 5x 또는 6x SSC를 수반한다. 높은 엄격도 하이브리드화 조건은 가장 높은 T_m에 상응하고, 예를 들면, 50% 포름아미드, 5x 또는 6x SSC를 수반한다. 하이브리드화를 위해서는 2개의 핵산이 상보성 서열을 함유하는 것이 필요되지만, 하이브리드화 엄격도에 따라서 염기들 간의 부정합도 가능하다. 핵산을 하이브리드화하는데 적당한 엄격도는 당해 분야에 널리 공지된 변수들인 핵산 길이와 상보성 정도에 따라 좌우된다. 2개 뉴클레오티드 서열 간의 유사성 또는 상동성의 정도가 보다 커질수록, 이들 서열을 갖는 핵산 하이브리드에 대한 T_m값이 더 커진다. 핵산 하이브리드화의 상대적 안정성(보다 높은 T_m에 상응함)은 다음 순서로 저하된다: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. 길이가 100개의 뉴클레오티드를 초과하는 하이브리드의 경우에, T_m을 산정하는 방정식이 추론되었다(참조: Sambrook 등,supra, 9.50-0.51). 보다 짧은 핵산, 즉 올리고뉴클레오티드와 하이브리드화하는 경우에는, 부정합 위치가 보다 중요해지고, 이러한 올리고뉴클레오티드의 길이가 이의 특이성을 결정해준다 (참조: Sambrook 등,supra, 11.7-11.8). 하이브리드화 가능한 핵산 분자에 대한 최소 길이는 약 20개이상의 뉴클레오티드, 특히 약 30개 이상의 뉴클레오티드, 보다 특히 약 40개 이상의 뉴클레오티드, 보다 더 특히 약 50개 이상의 뉴클레오티드, 보다 더 특히 약 60개 이상의 뉴클레오티드이다. 본 발명의 특정 양태에서는, 본 발명의 하이브리드화 가능한 핵산 분자의 길이가 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000 또는 1100개 이상의 뉴클레오티드이고, 이는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 암호화 서열을 포함하는 핵산 분자, 이의 상보체 또는 이의 단편과 엄격한 하이브리드화 조건 하에서 하이브리드화된다.

본원에 사용된 바와 같이, "엄격한 조건 하에 하이브리드화하는 것"이란 서로 상보적인 뉴클레오티드 서열의 55%, 60%, 65%, 70% 및 바람직하게는 75% 이상이 전형적으로 하이브리드화를 유지하도록 하는 하이브리드화 및 세척 조건을 서술하고자 한 것이다. 이러한 엄격한 조건은 당업자에게 공지되어 있고 문헌(참조: "Current Protocols in Molecular Biology," John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.16.3.6)에 언급되어 있다. 엄격한 하이브리드화 조건의 바람직한 비-제한적 예는 약 45℃ 하에 6X 염화나트륨/나트륨 시트레이트(SSC) 중에서 하이브리드화한 다음, 50 내지 65 ℃ 하에 0.2X SSC, 0.1% SDS 중에서 1회 이상 세척하는 것이다. 바람직하게는, 서열 번호 1의 서열, 또는 이의 상보체와 엄격한 하이브리드화 조건 하에서 하이브리드화하는 본 발명의 분리된 핵산 분자는 천연 핵산 분자에 상응한다. 본원에 사용된 바와 같은 "천연" 핵산 분자는 천연적으로 존재하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 RNA 또는 DNA 분자(예: 천연 단백질을 암호화한다)를 지칭한다. 당업자는 이들 조건이 서열-특이적 변수(예: 길이, G-C 풍부도 등) 측면에서 변형될수 있다는 것을 인지할 것이다.

본 발명은 유사한 특성을 지닌 GAVE6-유사 분자를 진단해주는 GAVE6의 핵산 단편을 포괄한다. 이러한 진단성 단편은 GAVE6 유전자의 어떠한 부분(이에는 플랭킹 서열이 포함된다)으로부터도 발생될 수 있다. 공지된 방법을 실시하여 상기 단편을 라이브러리의 프로브로서 사용할 수 있다.

더욱이, 본 발명의 핵산 분자는 GAVE6를 암호화하는 핵산 서열의 일정 부분, 예를 들면, 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있는 단편, 또는 GAVE6의 생물학적 활성 부분을 암호화하는 단편 만을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 단편은 서열 번호 2의 약 1에서 약 14까지의 아미노산 잔기를 암호화하는 영역을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 사람 GAVE6 유전자의 클로닝으로부터 결정된 뉴클레오티드 서열은 기타 세포 유형, 예를 들면, 기타 조직으로부터 유래된 GAVE6 상동체 뿐만 아니라 기타 포유류로부터 유래된 GAVE6 상동체를 동정 및/또는 클로닝하기 위한 프로브와 프라이머를 생성시킬 수 있게 해준다. 이러한 프로브/프라이머는 전형적으로, 실질적으로 정제된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 전형적으로, 서열 번호 1의 센스 또는 안티-센스 서열, 또는 서열 번호 1의 천연 돌연변이체의 약 12개 이상, 바람직하게는 약 25개, 보다 바람직하게는 약 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 또는 400개의 연속되는 뉴클레오티드와 엄격한 하이브리드화 조건 하에 하이브리드화되는 뉴클레오티드 서열 영역을 포함한다. 사람 GAVE6 뉴클레오티드 서열을 기본으로 하는 프로브를 사용하여 유사하거나 동일한 단백질을 암호화하는 전사체 또는 게놈 서열을 탐지할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 본 발명의 분리된 핵산 분자의 "단편" 또는 "부분"은 12개 이상, 바람직하게는 약 25개, 보다 바람직하게는 약 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 또는 400개의 연속되는 뉴클레오티드를 포함한다. 결과적으로, 본 발명의 분리된 핵산 분자의 "단편"은 단순히 1 또는 2개의 뉴클레오티드가 아니다.

유사하게, 본 발명의 폴리펩티드의 "단편" 또는 "부분"은 9개 이상의 연속되는 아미노산 잔기를 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드의 단편의 특정 예에는 GAVE6 항체, 또는 이의 단편과 결합되는 에피토프가 포함된다.

"GAVE6의 생물학적 활성 부분"을 암호화하는 핵산 단편은 GAVE6 생물학적 활성을 지닌 폴리펩티드를 암호화하는 서열 번호 1의 일정 부분을 분리시키고; 이와 같이 암호화된 GAVE6 단백질 부분을 발현시킨 다음(예를 들어, 시험관 내에서의 재조합 발현에 의함); 암호화된 GAVE6 부분의 활성을 평가함으로써 제조할 수 있다. 본 발명은 추가로, 유전 암호의 축퇴성으로 인해 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열과 상이하지만, 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 바와 동일한 GAVE6 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포괄한다.

상동 핵산 분자

본 발명은 추가로, GAVE6 DNA 분자와 상동성인, 예를 들어, 서열 번호 1의 DNA 서열을 갖는 분리된 핵산 분자와 상동성인 분리된 핵산 분자를 포괄한다. 2개의 DNA 서열은 뉴클레오티드의 약 50% 이상(바람직하게는 약 75% 이상, 가장 바람직하게는 약 90% 또는 95% 이상)이 해당 DNA 서열의 규정된 길이 상에서 정합되는 경우에 "실질적으로 상동성이거나" 또는 "실질적으로 유사하다." 실질적으로 상동성인 서열은 디폴트 파라미터를 사용하여 서열 데이터 뱅크에서 입수 가능한 표준 소프트웨어를 이용하여 해당 서열들을 비교하거나 또는 특정 시스템에 대해 규정된 바와 같은 엄격한 조건 하에 서던(Southern) 하이브리드화 실험으로 비교함으로써 확인할 수 있다. 적당한 하이브리드화 조건을 규정하는 것은 당해 기술 분야 내이다(참조: 예를 들면, Maniatis 등,supra; DNA Cloning, Vols. I & II,supra; Nucleic Acid Hybridization,supra). 더욱이, 사람 GAVE6와 상이한 뉴클레오티드 서열을 갖는 기타 종으로부터 유래된 GAVE6 단백질을 암호화하는 핵산 분자(GAVE6 상동체)도 본 발명의 범위 내에 속한다

본 발명의 분리된 핵산 분자의 변이체

본 발명은 추가로, 서열 번호 1의 DNA 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자의 변이체를 포괄한다. 이러한 변이체는 축퇴성, 대립유전자성, 또는 이의 조합일 수 있다.

본 발명의 GAVE6 cDNA의 천연 대립유전자 변이체와 상동체에 상응하는 핵산 분자는, 엄격한 하이브리드화 조건 하에 표준 하이브리드화 기술에 따라서 하이브리드화 프로브로서 사람 cDNA 또는 이의 일정 부분을 사용하여, 본원에 기재된 사람 GAVE6 핵산과의 동일성에 근거하여 분리시킬 수 있다.

본원에 사용된 용어 "상응하는"이란 정확한 위치가 유사성 또는 상동성이 측정되는 분자와 동일하거나 상이하든지 간에, 유사하거나 상동성인 서열을 지칭한다. 따라서, "상응하는"이란 용어는 서열 유사성을 지칭하는 것이지, 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 염기 넘버링을 지칭하는 것은 아니다.

더욱이, 유전 암호에서의 코돈 축퇴성으로 인해, 본 발명의 GAVE6 단백질은 수 많은 분리된 핵산 분자에 의해 암호화될 수 있다. "축퇴성"은 유전 암호에 따라서 특정한 아미노산을 특정하는데 상이한 3-문자 코돈을 사용하는 것을 지칭한다. 다음 코돈이 각각의 특이적 아미노산을 암호화하기 위해 상호 교환적으로 사용될 수 있다는 것이 당해 분야에 널리 공지되어 있다:

페닐알라닌 (Phe 또는 F) UUU 또는 UUC

루이신 (Leu 또는 L) UUA 또는 UUG 또는 CUU 또는 CUC 또는 CUA 또는CUG

이소루이신 (Ile 또는 I) AUU 또는 AUC 또는 AUA

메티오닌 (Met 또는 M) AUG

발린 (Val 또는 V) GUU 또는 GUC 또는 GUA 또는 GUG

세린 (Ser 또는 S) UCU 또는 UCC 또는 UCA 또는 UCG 또는 AGU 또는 AGC

프롤린 (Pro 또는 P) CCU 또는 CCC 또는 CCA 또는 CCG

트레오닌 (Thr 또는 T) ACU 또는 ACC 또는 ACA 또는 ACG

알라닌 (Ala 또는 A) GCU 또는 GCG 또는 GCA 또는 GCG

티로신 (Tyr 또는 Y) UAU 또는 UAC

히스티딘 (His 또는 H) CAU 또는 CAC

글루타민 (Gln 또는 Q) CAA 또는 CAG

아스파라긴 (Asn 또는 N) AAU 또는 AAC

리신 (Lys 또는 K) AAA 또는 AAG

아스파르트산 (Asp 또는 D) GAU 또는 GAC

글루탐산 (Glu 또는 E) GAA 또는 GAG

시스테인 (Cys 또는 C) UGU 또는 UGC

아르기닌 (Arg 또는 R) CGU 또는 CGC 또는 CGA 또는 CGG 또는 AGA 또는 AGG

글리신 (Gly 또는 G) GGU 또는 GGC 또는 GGA 또는 GGG

트립토판 (Trp 또는 W) UGG

종결 코돈 UAA (오우커) 또는 UAG (앰버) 또는 UGA (오팔)

상기와 같이 구체화된 코돈이 RNA 서열에 대한 것이라는 것을 인지해야 한다. DNA에 대한 상응하는 코돈은 U가 T로 대체된다.

서열 번호 1에 제시된 사람 GAVE6 뉴클레오티드 서열 이외에도, GAVE6의 아미노산 서열 상의 변화를 가져다 주는 DNA 서열 다형성이 특정 집단(예: 사람 집단) 내에 존재할 수 있다는 사실을 당업자는 인지할 것이다. 이러한 GAVE6 유전자의 유전적 다형성은 천연 대립유전자 변이로 인해 특정 집단 내의 개체들 사이에 존재할 수 있다. 대립유전자는 소정의 유전자 좌에서 대안적으로 발생되는 유전자 그룹 중의 하나이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "유전자" 및 "재조합 유전자"는 GAVE6 단백질, 바람직하게는 포유류 GAVE6 단백질을 암호화하는 개방 판독 프레임을 포함하는 핵산 분자를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "대립유전자 변이체"는 GAVE6 유전자 좌에 존재하는 뉴클레오티드 서열, 또는 이러한 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드를 지칭한다. 또 다른 대립유전자는 수 많은 상이한 개체들 중에서 목적하는 유전자의 서열을 분석함으로써 동정할 수 있다. 이는 다양한 개개인들 중의 동일한 유전자 좌를 동정하기 위해 하이브리드화 프로브를 사용함으로써 용이하게 수행할 수있다. 이러한 모든 뉴클레오티드 변이와, 이로써 생성된 GAVE6 상에서 아미노산 다형성 또는 변이(이는 천연 대립유전자 변이의 결과이고 GAVE6의 기능적 활성을 변화시키지 않는다) 또한 본 발명의 범위 내에 속한다.

더욱이, 본 발명의 분리된 핵산 분자의 변이체는 통상적인 실험실 기술, 예를 들면, 부위-지시된 돌연변이유발을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 만들어질 수 있다.

안티센스 뉴클레오티드 서열

본 발명은 또한, 안티센스 핵산 분자, 즉 특정 단백질을 암호화하는 센스 핵산에 상보적인 분자, 예를 들면, 이본쇄 cDNA 분자의 암호화 쇄에 상보적이거나 또는 mRNA 서열에 상보적인 분자를 포괄한다. 따라서, 안티센스 핵산은 센스 핵산에 대해 수소 결합할 수 있다. 안티센스 핵산은 전체 GAVE6 암호화 쇄에 상보적이거나 또는 이의 일정 부분, 예를 들면, 단백질 암호화 영역(또는 개방 판독 프레임)의 전부 또는 일부에만 상보적일 수 있다. 안티센스 핵산 분자는 GAVE6를 암호화하는뉴클레오티드 서열의 암호화 쇄의 비-암호화 영역에 대해 안티센스일 수 있다. 이러한 비-암호화 영역("5’ 및 3’ 비-해독 영역")은 암호화 영역을 플랭킹하는 5’ 및 3’ 서열이고, 아미노산으로 해독되지 않는다.

본원에 기재된 GAVE6를 암호화하는 암호화 쇄 서열(예: 서열 번호 1)에 있어서, 왓슨 앤 크릭 염기 쌍 형성(Watson & Crick base pairing) 법칙에 따라서 본 발명의 안티센스 핵산을 고안할 수 있다. 안티센스 핵산 분자는 GAVE6 mRNA의 전체 암호화 영역에 상보적일 수 있지만, 보다 바람직하게는 GAVE6 mRNA의 암호화 또는 비-암호화 영역의 일정 부분에 대해서만 안티센스인 올리고뉴클레오티드이다. 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 GAVE6 mRNA의 해독 개시 부위의 주변 영역에 상보적일 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 길이가, 예를 들어 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개 뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 안티센스 핵산은 당해 분야에 공지된 과정을 사용하여 화학적 합성과 효소적 결찰(ligation) 반응들을 이용하여 작제할 수 있다. 예를 들어, 안티센스 핵산(예: 안티센스 올리고뉴클레오티드)는 해당 분자의 생물학적 안정성을 증가시키거나 또는 안티센스 핵산과 센스 핵산 간에 형성된 이중체의 물리적 안정성을 증가시키도록 고안된 화학적으로 변형된 각종 뉴클레오티드 또는 천연 뉴클레오티드를 사용하여 화학적으로 합성할 수 있는데, 예를 들어, 포스포로티오에이트 유도체, 포스포네이트 유도체 및 아크리딘-치환된 뉴클레오티드를 사용할 수 있다.

안티센스 핵산을 생성시키기 위해 사용될 수 있는 변형된 뉴클레오티드의 예에는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포크산틴, 크산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시하이드록실메틸)우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸 2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, D-갈락토실퀘오신, 이노신, N⁶-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N⁶-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸 2-티오우라실, β-D-만노실퀘오신, 5-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오 N⁶-이소펜테닐아데닌, 우라실5옥시아세트산, 위부톡소신, 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필)우라실 및 2,6-디아미노푸린이 포함된다. 또 다른 한편, 안티센스 핵산은 핵산을 안티센스 배향으로 서브클로닝시킨 발현 벡터를 사용하여(즉, 삽입된 핵산으로부터 전사된 RNA는 목적하는 표적 핵산에 대해 안티센스 배향일 것이다) 생물학적으로 생성시킬 수 있다.

본 발명의 안티센스 핵산 분자는 전형적으로, 특정 피험체에게 투여되거나, 또는 GAVE6 단백질을 암호화하는 게놈 DNA 및/또는 세포성 mRNA 와 결합하거나 이와 하이브리드화됨으로써, 단백질의 발현을 억제(예를 들어, 전사 및/또는 해독을 억제시킴으로써 이루어짐)시키도록 원위치에서 발생된다. 하이브리드화는 안정한 이중체를 형성하기 위한 통상적인 뉴클레오티드 상보성에 의해 이루어질 수 있거나, 또는 이중 나선의 대형 홈(major groove)에서의 특이적 상호작용을 통하여DNA 이중체와 결합하거나 GAVE6의 조절 영역과 결합하는 안티센스 핵산 분자의 경우에도 이루어질 수 있다.

본 발명의 안티센스 핵산 분자를 투여하는 경로 중의 한 예가 조직 부위에 직접 주사하는 것이다. 또 다른 한편으론, 선택된 세포를 표적으로 하여 안티센스 핵산 분자를 변형시킨 다음, 이를 전신 투여할 수 있다. 예를 들어, 전신 투여하는 경우에는, 예를 들어, 안티센스 핵산 분자를 세포 표면 수용체 또는 항원과 결합하는 항체 또는 펩티드에 연결시킴으로써, 이들 분자가 선택된 세포 표면 상에 발현된 수용체 또는 항원과 특이적으로 결합하도록 상기 안티센스 분자를 변형시킬 수 있다. 안티센스 핵산 분자는 본원에 기재된 벡터를 사용하여 세포에 전달할 수도 있다. 안티센스 분자의 충분한 세포내 농도를 달성하기 위해서는, 이러한 안티센스 핵산 분자를 강력한 pol II 또는 pol III 프로모터의 제어 하에 놓아둔 벡터 작제물이 바람직하다.

본 발명의 안티센스 핵산 분자는 α아노머성(anomeric) 핵산 분자일 수 있다. α아노머성 핵산 분자는 해당 쇄들이 서로 나란히 진행된다는 점에서 상보성 RNA와 특이적 이본쇄 하이브리드를 형성한다 (참조: Gaultier 등, Nucleic Acids Res (1987)15:66256641). 본 발명의 안티센스 핵산 분자는 메틸리보뉴클레오티드 (참조: Inoue 등, Nucleic Acids Res (1987) 15:61316148) 또는 키메라 RNADNA 동족체 (참조: Inoue 등, FEBS Lett (1987) 215:327330)를 포함할 수도 있다.

리보자임

본 발명은 리보자임을 포괄하기도 한다. 리보자임은 이 리보자임과 하이브리드화되는 일본쇄 핵산, 예를 들면, mRNA를 절단시킬 수 있는 리보뉴클레아제 활성을 지닌 촉매적 RNA 분자이다. 따라서, 리보자임(예를 들면, 해머헤드 리보자임 (Haselhoff 등, Nature (1988) 334:585591에 기재됨))을 사용하여 GAVE6 mRNA 전사체를 촉매적으로 절단함으로써, GAVE6 mRNA의 해독을 억제시킬 수 있다. GAVE6-암호화 핵산에 대한 특이성을 지닌 리보자임은 본원에 기재된 GAVE6 DNA의 뉴클레오티드 서열(예: 서열 번호 1)을 기초로 하여 고안할 수 있다. 예를 들면, 활성 부위의 뉴클레오티드 서열이 GAVE6-암호화 mRNA에서 절단될 뉴클레오티드 서열에 상보적이 되도록 테트라하이메나(Tetrahymena) L-19 IVS RNA의 유도체를 작제할 수 있다 (참조: 예를 들면, 미국 특허 제4,987,071호 및 제5,116,742호). 또 다른 한편, GAVE6 mRNA를 사용하여 RNA 분자 풀로부터 특이적 리보뉴클레아제 활성을 지닌 촉매적 RNA를 선별할 수 있다(참조: 예를 들어Bartel 등, Science (1993) 261:1411-1418).

본 발명의 삼중 나선 핵산 분자 및 펩티드 핵산

본 발명은 또한, 삼중 나선 구조를 형성하는 핵산 분자를 포괄한다. 예를 들어, GAVE6의 조절 영역(예: GAVE6 프로모터 및/또는 인핸서)에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 표적으로 하여 표적 세포 내에서 GAVE6 유전자의 전사를 방지하는 삼중 나선 구조를 형성시킴으로써, GAVE6 유전자 발현을 억제시킬 수 있다(참조: 일반적으로, Helene, Anticancer Drug Des (1991) 6(6):569; Helene Ann NY Acad Sci(1992) 660:27; 및 Maher, Bioassays (1992) 14(12):807).

특정 양태에서는, 본 발명의 핵산 분자를 대상으로 하여, 이의 염기 잔기, 당 잔기 또는 포스페이트 주쇄를 변형시켜 핵산 분자의 안정성, 하이브리드화 또는 용해도 등을 개선시킬 수 있다. 예를 들면, 핵산의 데옥시리보즈 포스페이트 주쇄를 변형시켜 펩티드 핵산을 생성시킬 수 있다(참조: Hyrup 등, Bioorganic & Medicinal Chemistry (1996) 4:5). 본원에 사용된 바와 같은 용어 "펩티드 핵산" 또는 "PNA"는 상기 데옥시리보즈 포스페이트 주쇄가 가성(pseudo)-펩티드 주쇄로 대체되고 제4의 천연 뉴클레오염기 만이 유지된다는 점에서 핵산 모의체(mimics), 예를 들면, DNA 모의체를 지칭한다. PNA의 중성 주쇄가 낮은 이온 농도 조건 하에서 DNA와 RNA에 대한 특이적 하이브리드화를 허용해주는 것으로 밝혀졌다. PNA 올리고머의 합성은 문헌(참조: Hyrup 등 (1996) supra; PerryO’Keefe 등, Proc Natl Acad Sci USA (1996) 93:14670)에 기재된 바와 같은 표준 고체 상 펩티드 합성 프로토콜을 사용하여 수행할 수 있다.

GAVE6의 PNA를 치료 및 진단 용도로 사용할 수 있다. 예를 들면, PNA는 예를 들어, 전사 또는 해독 억제를 유도하거나 복제를 억제함으로써 유전자 발현을 서열 특이적으로 조정하기 위한 안티센스 또는 안티젠(antigene) 제제로서 사용할 수 있다. GAVE6의 PNA를 사용할 수도 있다. 예를 들면, PNA는 PNA-지시된 PCR 클램핑에 의해 특정 유전자에서의 단일 염기 쌍 돌연변이를 분석하는데 사용할 수 있거나; 기타 효소, 예를 들면, S1 뉴클레아제와 조합하여 사용된 경우에 인공 제한 효소로서 사용되거나(참조: Hyrup 등 (1996) supra); 또는 DNA 서열 및 하이브리드화용프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있다(참조: Hyrup 등 (1996) supra; PerryO’Keefe 등 (1996) supra).

또 다른 양태에서는, 친지성 그룹 또는 기타 헬퍼 그룹을 PNA에 부착시키거나, PNA-DNA 키메라를 형성시키거나, 리포솜을 사용하거나 또는 당해 분야에 공지된 기타 약물 전달 기술을 사용함으로써 GAVE6의 PNA를 변형시켜, 예를 들면, 안정성, 특이성 또는 세포 흡수성을 증강시킬 수 있다. PNADNA 키메라의 합성은 문헌(참조: Hyrup 등 (1996) supra, Finn 등, Nucleic Acids Res (1996) 24(17):3357-63, Mag 등, Nucleic Acids Res (1989) 17:5973; 및 Peterser 등, Bioorganic Med Chem Lett (1975) 5:1119)에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다.

GAVE6 단백질

더욱이, 본 발명은 도 2의 아미노산 서열(서열 번호 2)을 포함하는 분리된 폴리펩티드, 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이의 동족체 또는 유도체를 포괄한다.

서열 번호 2의 서열과 상이한 서열을 갖는 GAVE6 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자, 예를 들면 변이체는 하나 이상의 뉴클레오티드 치환물, 부가물 또는 결실물을 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열 내에 도입하여 하나 이상의 아미노산 치환물, 부가물 또는 결실물이 상기 암호화된 단백질 내로 도입되도록 함으로써 제조할 수 있다.

특정 양태에서는, 돌연변이체 GAVE6 단백질을 대상으로 하여, 다음에 대해 검정할 수 있다: (1) GAVE6 시그널링 경로에서 단백질과 단백질: 단백질 상호작용물을 형성하는 능력; (2) GAVE6 리간드와 결합하는 능력; 또는 (3) 세포내 표적 단백질과 결합하는 능력. 또 다른 양태에서는, 돌연변이체 GAVE6를 대상으로 하여, 세포성 증식이나 세포성 분화를 조정하는 능력에 대해 검정할 수 있다.

표준 단백질 정제 기술을 사용하여 적당한 정제 도식에 의해 세포 또는 조직 공급원으로부터 본래의 GAVE6 단백질을 분리할 수 있다. 또 다른 한편, 재조합 DNA 기술에 의해 GAVE6 단백질을 용이하게 생성시킬 수 있다. 본 발명에 의해 포괄되는 또 다른 대체 양태는 표준 펩티드 합성 기술을 사용하여 GAVE6 단백질 또는 폴리펩티드를 화학적으로 합성하는 것이다.

"분리된" 또는 "정제된" 단백질, 또는 이의 생물학적 활성 부분은 GAVE6 단백질이 유래되는 세포 또는 조직 공급원으로부터의 세포성 물질이나 기타 오염성 단백질을 실질적으로 함유하지 않거나, 또는 화학적으로 합성되는 경우에는 화학적 전구체 또는 기타 화학물질을 실질적으로 함유하지 않는다. "세포성 물질을 실질적으로 함유하지 않는" 것에는, GAVE6 단백질이 분리되거나 재조합적으로 생성되는 대상 세포의 세포성 성분으로부터 상기 단백질을 분리(격리)시킨 GAVE6 단백질 제제가 포함된다. 따라서, 세포성 물질을 실질적으로 함유하지 않는 GAVE6 단백질에는 비- GAVE6 단백질(본원에서 "오염성 단백질"로서 지칭되기도 함)을 약 30%, 20%, 10% 또는 5% 미만(무수 중량 기준) 갖는 GAVE6 단백질 제제가 포함된다. GAVE6 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분을 재조합적으로 제조하는 경우에는, 배양 배지를 실질적으로 함유하지 않는 것이 바람직한데, 즉 배양 배지가 상기 단백질 제제 용적을 기준으로 하여 약 20%, 10% 또는 5% 미만을 차지하는 것이 바람직하다. GAVE6 단백질을 화학적 합성으로 제조하는 경우에는, 화학적 전구체 또는 기타 화학물질을 실질적으로 함유하지 않는 것이 바람직한데, 즉 상기 단백질을 이러한 단백질 합성에 관여한 화학적 전구체 또는 기타 화학물질로부터 분리시킨다. 따라서, 상기 GAVE6 단백질 제제는 화학적 전구체 또는 비- GAVE6 화학물질을 약 30%, 20%, 10% 또는 5% 미만(무수 중량 기준) 갖는다.

GAVE6 단백질의 생물학적 활성 부분 또는 단편에는 완전한 길이의 GAVE6 단백질 보다는 적은 수의 아미노산을 포함하고 GAVE6 단백질의 적어도 한 가지 활성을 나타내는, GAVE6 단백질의 아미노산 서열(예: 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열)과 충분히 동일하거나 이로부터 유도된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드가 포함된다. 전형적으로, 생물학적 활성 부분은 GAVE6 단백질의 적어도 한 가지 활성을 지닌 도메인 또는 모티프를 포함한다. GAVE6 단백질의 생물학적 활성 부분은, 예를 들어, 길이가 10, 25, 50, 100개 이상의 아미노산인 폴리펩티드일 수 있다. 특정한 생물학적 활성 폴리펩티드는 한 가지 이상 확인된 GAVE6 구조 도메인을 포함한다.

더욱이, 단백질의 기타 영역이 결실된 기타 생물학적 활성 부분을 재조합 기술에 의해 제조할 수 있으며, 이를 대상으로 하여, 본래의 GAVE6 단백질의 기능적 활성들 중의 한 가지 이상에 대해 평가할 수 있다.

기타 유용한 GAVE6 단백질은 서열 번호 2와 실질적으로 동일하고, 서열 번호 2의 단백질의 기능적 활성을 보유하고 있지만, 천연 대립유전자 변이 또는 돌연변이유발로 인해 아미노산 서열은 상이하다. 예를 들어, 이러한 GAVE6 단백질과 폴리펩티드는 본원에 기재된 생물학적 활성을 한 가지 이상 보유하고 있다.

따라서, 유용한 GAVE6 단백질은 서열 번호 2의 아미노산 서열과 약 45% 이상, 바람직하게는 55%, 65%, 75%, 85%, 95%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 2의 GAVE6 단백질의 기능적 활성을 보유하고 있는 단백질이다. 특정 양태에서는, GAVE6 단백질이 서열 번호 2의 GAVE6 단백질의 기능적 활성을 보유하고 있다.

두 아미노산 서열 또는 두 핵산 간의 동일성 %을 결정하기 위해, 해당 서열을 최적 비교 목적으로 정렬시킨다(예를 들면, 제1 아미노산 서열 또는 핵산 서열 내에 갭을 도입하여 제2 아미노산 또는 핵산 서열과 최적으로 정렬되도록 할 수 있다). 이어서, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 제1 서열 내의 특정 위치를 제2 서열 내의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 차지한 경우에는, 분자가 상기 위치에서 동일한 것으로 간주된다. 두 서열 간의 동일성 %는 이들 서열이 공유하는 동일한 위치 수의 함수이다(즉, 동일성 % = 동일한 위치 수/위치 총 수(예: 중복 위치) X 100). 한 양태에서는, 두 서열이 동일한 길이이다.

두 서열 간의 동일성 %를 결정은 수학적 연산 방식을 이용하여 수행할 수 있다. 두 서열을 비교하는데 활용된 수학적 연산 방식의 특정한 비-제한적 예로는 문헌(참조: Karlin 등, Proc Natl Acad Sci USA (1993) 90:58735877)에서와 같이 변형된, 문헌(참조: Karlin 등, Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87:2264)의 연산 방식이다. 이러한 연산 방식을 문헌(참조: Altschul 등, J Mol Bio (1990) 215:403)의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 내로 도입한다. NBLAST 프로그램, 예를 들면, 스코어=100, 워드길이=12를 사용하여 BLAST 뉴클레오티드 조사를 수행하여, 본 발명의 GAVE6 핵산 분자와 상동성인 뉴클레오티드 서열을 획득할 수 있다. XBLAST 프로그램, 예를 들면, 스코어=50, 워드길이=3를 사용하여 BLAST 단백질 조사를 수행하여, 본 발명의 GAVE6 단백질 분자와 상동성인 아미노산 서열을 획득할 수 있다. 비교 목적을 위해 갭이 있는 정렬을 획득하기 위해서는, 문헌(참조: Altschul 등, Nucleic Acids Res (1997) 25:3389)에 기재된 바와 같이 갭이 있는 BLAST를 활용할 수 있다. 또 다른 한편으론, PSI-Blast를 사용하여 분자들 간의 독특한 관계를 탐지해 주는 반복 조사를 수행할 수 있다(참조: Altschul 등 (1997) supra). BLAST, 갭이 있는 BLAST 및 PSI-Blast 프로그램을 활용하는 경우에는, 각각의 프로그램의 디폴트 파라미터 (예: XBLAST 및 NBLAST)를 사용할 수 있다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

서열들을 비교하는데 활용된 수학적 연산 방식의 또 다른 특정한 비-제한적 예는 문헌(참조: Myers 등, CABIOS (1988) 4:11-17)의 연산 방식이다. 이러한 연산 방식은 GCC 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램 (버전 2.0) 내로 도입된다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 활용하는 경우에는, PAM120 중량 잔사 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 사용할 수 있다.

두 서열 간의 동일성 %는 갭을 허용하거나 허용하지 않으면서, 상기 언급된 바와 유사한 기술을 사용하여 결정할 수 있다. 동일성 %를 산정하는데 있어서는,정확한 정합물 만을 계수한다.

본 발명은 추가로, GAVE6 키메라 또는 융합 단백질을 포괄한다. 본원에 사용된 바와 같은 GAVE6 "키메라 단백질" 또는 "융합 단백질"은 비- GAVE6 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 GAVE6 폴리펩티드를 포함한다. "GAVE6 폴리펩티드"는 GAVE6에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. "비- GAVE6 폴리펩티드"는 GAVE6 단백질과 실질적으로 동일하지 않는 단백질, 예를 들면, GAVE6 단백질과는 상이하고 동일하거나 상이한 유기체로부터 유도된 단백질에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. GAVE6 융합 단백질 내에서는, GAVE6 폴리펩티드가 GAVE6 단백질의 전부 또는 일정 부분, 바람직하게는 GAVE6 단백질의 적어도 하나의 생물학적 활성 부분에 상응할 수 있다. 이러한 융합 단백질 내에서, "작동가능하게 연결된"이란 용어는 GAVE6 폴리펩티드와 비- GAVE6 폴리펩티드가 서로 동일 프레임 내에서 융합된다는 것을 의미한다. 비- GAVE6 폴리펩티드를 GAVE6 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 융합시킬 수 있다. 한 가지 유용한 융합 단백질은 GAVE6 서열이 글루타치온-S-트랜스퍼라제(GST)의 C-말단에 융합되는 GST- GAVE6이다. 이러한 융합 단백질은 재조합 GAVE6의 정제를 촉진시킬 수 있다.

또 다른 양태에서는, 본 발명의 융합 단백질이 GAVE6의 전부 또는 일부가 면역글로불린 단백질 계열의 구성원으로부터 유도된 서열에 융합된 GAVE6-면역글로불린 융합 단백질을 포괄한다. 본 발명의 GAVE6-면역글로불린 융합 단백질을 약제학적 조성물 내로 혼입시켜, 이를 특정 피험체에게 투여하여 특정 세포 표면 상에서 GAVE6 리간드와 GAVE6 단백질 간의 상호작용을 억제시킴으로써, 생체 내에서GAVE6-매개된 시그널 전달을 억제할 수 있다. GAVE6-면역글로불린 융합 단백질을 사용하여 GAVE6 동족 리간드의 생체내 이용 효율에 영향을 미칠 수 있다. GAVE6 리간드- GAVE6 상호작용을 억제시키는 것이 치료학적으로 유용할 수 있는데, 증식성 장애와 분화성 장애를 치료하고 또한 세포 생존을 조정하는데(예를 들면, 증진 또는 억제) 유용할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 GAVE6-면역글로불린 융합 단백질을 면역원으로서 사용하여 특정 피험체에게서 항- GAVE6 항체를 생성시킬 수 있고, GAVE6 리간드를 정제할 수 있으며, GAVE6와 GAVE6 리간드와의 상호작용을 억제시키는 분자를 동정하기 위한 스크리닝 검정에 사용될 수 있다.

특정 양태에서는, 본 발명의 GAVE6 키메라 또는 융합 단백질을 표준 재조합 DNA 기술에 의해 생성시킨다. 예를 들어, 상이한 폴리펩티드 서열을 암호화하는 DNA 단편은 통상적인 기술에 따라서, 예를 들면, 결찰을 위해 평활 말단 또는 스태거(stagger) 말단을 이용하고, 적당한 말단을 제공하기 위해 제한 효소 분해를 이용하며, 접착 말단을 적당한 것으로 채워놓으며, 바람직하지 못한 연결을 피하기 위해 알칼린 포스파타제 처리하며, 효소에 의해 결찰시킴으로써, 동일 프레임 내에서 함께 결찰시킨다. 또 다른 양태에서는, 자동화 DNA 합성기를 포함한 통상적인 기술에 의해 융합 유전자를 합성할 수 있다. 또 다른 한편으론, 앵커(anchor) 프라이머를 사용하여, 연속되는 2개 유전자 단편들 간의 상보적 돌출부을 생성시킨 후 어닐링 및 재증폭시켜 키메라 유전자 서열을 생성시키는 방법으로 유전자 단편의 PCR 증폭 과정을 수행할 수 있다(참조: 예를 들어, Ausubel 등, supra). 더욱이, 특정 융합 잔기(예: GST 폴리펩티드)를 이미 암호화하는 수 많은 발현 벡터가 시판되고 있다. GAVE6-암호화 핵산을 상기 발현 벡터 내로 클로닝하여, 상기 융합 잔기가 GAVE6 단백질과 동일 프레임 내에서 연결되도록 할 수 있다.

변이체

앞서 설명한 바와 같이, 본 발명은 추가로, GAVE6 단백질의 변이체를 포괄한다. 예를 들어, 표준 기술, 예를 들면, 부위-지시된 돌연변이유발 및 PCR-매개된 돌연변이유발을 사용하여 서열 번호 2의 아미노산 서열 내로 돌연변이를 도입할 수 있다. 더욱이, 하나 이상의 예정된 비-필수 아미노산 잔기에 보존적 아미노산 치환을 만들 수 있다. "보존적 아미노산 치환"은 특정 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체시킨 것이다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산을 기능적 등가물로서 작용하는, 유사한 극성의 또 다른 아미노산으로 대체하여, 침묵(silent) 변화를 얻는다. 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열 내의 아미노산에 대한 치환체는 해당 아미노산이 속하는 부류의 기타 구성원들 중에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 비극성(소수성) 아미노산으로는 알라닌, 루이신, 이소루이신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌이 있다. 방향족 환 구조를 함유하는 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신이다. 극성의 중성 아미노산으로는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민이 있다. 양전하를 띤(염기성) 아미노산으로는 아르기닌, 리신 및 히스티딘이 있다. 음전하를 띤(산성) 아미노산으로는 아스파르트산 및 글루탐산이 있다. 이러한 변화가 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 결정된 바와 같은 외견상 분자량 또는 등전점에 영향을 미칠 것으로는 예상되지 않는다.

특히 바람직한 치환은 다음과 같다:

- Arg을 Lys으로 치환하고 이와 반대로의 치환도 가능함: 이로써 양전하가 유지될 수 있다;

- Asp를 Glu로 치환하고 이와 반대로의 치환도 가능함: 이로써 음전하가 유지될 수 있다;

- Thr을 Ser로 치환함; 이로써 자유-OH가 유지될 수 있다;

- Asn을 Gln로 치환함: 이로써 NH2가 유지될 수 있다.

더욱이, 특정 아미노산을 특히 바람직한 특성을 지닌 것으로 치환하기 위해 아미노산 치환을 도입할 수도 있다. 예를 들면, Cys는 또 다른 Cys와의 디설파이드 브릿지를 형성하기 위한 잠재적 부위에 도입할 수 있다. His를 특정한 "촉매적" 부위로서 도입할 수 있다(즉, His는 산 또는 염기로서 작용할 수 있고, 이는 생화학적 촉매 작용에 가장 흔한 아미노산이다). Pro는 해당 단백질 구조 내에 β-턴을 유도시키는 이의 특별한 평면 구조 때문에 도입될 수 있다.

돌연변이는, 예를 들어, 포화 돌연변이유발에 의해, GAVE6 암호화 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위로 도입될 수도 있고, 이로써 생성된 돌연변이체를 대상으로 하여, GAVE6 생물학적 활성에 대해 스크리닝하여 활성을 보유하고 있는 돌연변이체를 동정할 수 있다. 돌연변이유발을 수행한 후, 암호화된 단백질을 재조합적으로 발현시키고, 이러한 단백질의 활성을 결정할 수 있다.

본 발명의 변이체는 GAVE6 효능제(모사체) 또는 GAVE6 길항제로서 작용할 수 있다. GAVE6 단백질의 변이체는 돌연변이유발, 예를 들면, GAVE6 단백질의 절두(truncation) 또는 별개의 점(point) 돌연변이에 의해 생성될 수 있다. GAVE6 단백질의 효능제는 천연 GAVE6 단백질의 생물학적 활성과 실질적으로 동일하거나 이의 서브세트를 보유할 수 있다. 예를 들어, GAVE6 단백질의 길항제는 GAVE6 단백질을 포함하는 세포의 시그널링 연쇄증폭의 하류 또는 상류 일원과 경쟁적으로 결합함으로써, 천연 형태의 GAVE6 단백질의 활성들 중의 한 가지 이상의 활성을 억제시킬 수 있다. 따라서, 제한된 기능의 변이체로 처리함으로써 특이적 생물학적 효과를 유발시킬 수 있다. 특정 피험체를, 천연 형태의 단백질의 생물학적 활성 서브세트를 지닌 변이체로 처리하는 것이 천연 형태의 GAVE6 단백질로 처리하는 것에 비해 더 적은 부작용을 나타낼 수 있다.

GAVE6 효능제(모사체) 또는 GAVE6 길항제로서 작용하는 GAVE6 단백질의 변이체는, GAVE6 단백질의 돌연변이체(예: 절두 돌연변이체)의 조합 라이브러리를 대상으로 하여 GAVE6 효능제 또는 길항제 활성에 대해 스크리닝함으로써 확인할 수 있다. 한 양태에서는, GAVE6 변이체의 다양화된 라이브러리가 핵산 수준에서의 조합 돌연변이유발에 의해 생성되고, 이는 다양화된 유전자 라이브러리에 의해 암호화된다. GAVE6 변이체의 다양화된 라이브러리는, 예를 들어, 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 유전자 서열 내로 효소적으로 결찰시킴으로써 생성시켜, 잠재적 GAVE6 서열의 축퇴성 세트가 개개의 폴리펩티드로서 발현되거나 아니면 그 안에 GAVE6 서열 세트를 함유하는 보다 큰 융합 단백질 세트(예: 파아지 디스플레이를 위함)로서 발현되도록 할 수 있다. 축퇴성 올리고뉴클레오티드 서열로부터 잠재적 GAVE6 변이체의 라이브러리를 생성시키기 위해 사용할 수 있는 각종 방법이 있다. 축퇴성 유전자 서열의 화학적 합성은 자동화 DNA 합성기에서 수행할 수 있고, 이어서 합성 유전자를 적당한 발현 벡터 내로 결찰시킬 수 있다. 유전자 축퇴성 세트를 사용함으로써, 목적하는 잠재적 GAVE6 서열 세트를 암호화하는 서열 모두를 하나의 혼합물에 제공할 수 있게 된다. 축퇴성 올리고뉴클레오티드 합성 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(참조: 예를 들어, Narang, Tetrahedron (1983) 39:3; Itakura 등, Ann Rev Biochem (1984) 53:323; Itakura 등, Science (1984) 198:1056; Ike 등, Nucleic Acid Res (1983) 11:477).

또한, GAVE6 단백질 암호화 서열 단편의 라이브러리를 사용하여, GAVE6 단백질의 변이체를 스크리닝하고 후속적으로 선별해주기 위한 GAVE6 단편의 다양화된 집단을 생성시킬 수 있다. 한 양태에서는, GAVE6 암호화 서열의 이본쇄 PCR 단편을 분자당 대략 1회 정도로만 닉(nick)이 형성되도록 하는 조건 하에 뉴클레아제로 처리하고; 이러한 이본쇄 DNA를 변성시키며; 상기 DNA를 재생시켜 상이한 닉 형성 생성물로부터 센스/안티센스 쌍을 포함할 수 있는 이본쇄 DNA를 형성시키고; S1 뉴클레아제로 처리함으로써 재구성된 이중체로부터 일본쇄 부분을 제거하며; 이로써 생성된 단편 라이브러리를 발현 벡터 내로 결찰시킴으로써, 암호화 서열 단편의 라이브러리를 생성시킬 수 있다. 상기 방법에 의해, GAVE6 단백질의 각종 크기의 내부 단편과 N-말단을 암호화하는 발현 라이브러리를 유도할 수 있다.

점 돌연변이 또는 절두에 의해 만들어진 조합 라이브러리의 유전자 생성물을 스크리닝하는 몇 가지 기술과, 선택된 특성을 지닌 유전자 생성물에 대해 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 몇 가지 기술이 당해 분야에 공지되어 있다. 이러한 기술은 GAVE6 단백질의 조합 돌연변이유발에 의해 생성된 유전자 라이브러리를 신속히 스크리닝하기 위해 변형시킬 수 있다. 큰 유전자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 고 처리량 분석에 적합하여 가장 광범위하게 사용되고 있는 기술에는 해당 유전자 라이브러리를 복제 가능한 발현 벡터 내로 클로닝하고, 이로써 생성된 벡터 라이브러리로 적당한 세포를 형질전환시킨 다음, 목적하는 활성 탐지로 인해 이의 생성물이 탐지되는 유전자를 암호화하는 벡터의 분리를 용이하게 해주는 조건하에 상기 조합 유전자를 발현시키는 기술이 포함된다. 해당 라이브러리에서 기능적 돌연변이체 발생 빈도수를 증강시키는 기술인 반복적 앙상블 돌연변이유발(REM)을 스크리닝 검정과 조합하여 사용하여 GAVE6 변이체를 동정할 수 있다(참조: Arkin 등, Proc Natl Acad Sci USA (1992) 89:7811-7815; Delgrave 등, Protein Engineering (1993) 6(3):327-331).

GAVE6의 동족체 및 유도체

더욱이, 본 발명에는 화학적 변형으로부터 생성된 GAVE6의 유도체 또는 동족체가 포함되기도 한다. 본 발명의 GAVE6 단백질은 하나 이상의 화학적 잔기를 단백질 잔기에 부착시킴으로써 유도체화할 수 있다

유도체화를 위한 화학적 잔기 .유도체화에 적합한 화학적 잔기는 수용성 중합체들 중에서 선택될 수 있기 때문에, GAVE6 동족체 또는 유도체는 수성 환경, 예를 들면, 생리학적 환경 하에서는 침전되지 않는다. 임의로, 상기 중합체는 약제학적으로 허용될 것이다. 당업자는 중합체/성분 접합체가 치료학적으로 사용될 것인지를 고려하고, 만일 그렇다면, 목적하는 투여량, 순환 시간, 단백질 분해에 대한 내성 및 기타 고려 사항들을 근거로 하여 목적하는 중합체를 선택할 수 있을 것이다. GAVE6의 경우에는, 본원에 제공된 검정을 이용하여 이를 확인할 수 있다. 본 발명에 적용되는 수용성 중합체의 예에는 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로즈, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독 중합체 또는 랜덤 공중합체), 덱스트란, 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 또는 폴리비닐 알코올이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드가 이의 수중 안정성으로 인해 제조하는데 유리할 수 있다.

상기 중합체는 어떠한 분자량의 것일 수도 있으며, 분지되거나 분지되지 않을 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜의 경우, 조작 및 제조하는데 용이한 바람직한 분자량은 약 2kDa 내지 약 100kDa이다(용어 "약"은 폴리에틸렌 글리콜을 제조하는데 있어서 몇몇 분자의 분자량이 언급된 분자량 보다 더 많거나 약간 적다는 것을 의미한다). 목적하는 치료학적 프로필(예: 목적하는 지속 방출 기간, 존재하는 경우에는 생물학적 활성에 대한 효과, 조작 용이성, 항원성 정도 또는 이의 결여, 및 치료학적 단백질 또는 동족체에 대한 폴리에틸렌 글리콜의 기타 공지된 효과)에 따라서 다른 크기들도 사용할 수 있다.

GAVE6에 부착된 바와 같은 중합체 분자 수는 다양할 수 있고, 당업자는 기능 상의 이의 효과를 확인할 수 있을 것이다. 동일하거나 상이한 화학적 잔기(예: 중합체, 예를 들면, 상이한 중량의 폴리에틸렌 글리콜)를 이용하여, 일-유도체화거나, 또는 이-, 삼-, 사-유도체화하거나 이들 유도체화의 몇 가지 조합을 수행할 수 있다. GAVE6 분자에 대한 중합체 분자의 비율은 다양한데, 이는 반응 혼합물 중에서의 이들의 농도로 제시될 것이다. 일반적으로, 최적 비(반응되지 않은 과도한 성분(들)과 중합체가 없다는 점에서 반응 효율에 근거함)는 목적하는 유도체화도(예: 일-, 이-, 삼-유도체화 등), 선택된 중합체의 분자량, 중합체가 분지되었는지 아니면 분지되지 않았는지의 여부, 및 반응 조건과 같은 요인들에 의해 결정될 것이다.

폴리에틸렌 글리콜 분자(또는 기타 화학적 잔기)는 GAVE6의 기능적 또는 항원성 도메인에 대한 효과를 고려하여 GAVE6에 부착시켜야 한다. 당업자는 수 많은 부착 방법을 이용할 수 있다(참조: 본원에 참조문헌으로써 삽입된 EP 0 401 384 (GCSF에 대한 PEG 커플링), Malik 등, 1992, Exp. Hematol. 20:1028-1035 (트레실 클로라이드를 사용한 GMCSF의 페길화가 보고되어 있다)). 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜은 반응성 그룹, 예를 들면, 자유 아미노 또는 카르복실 그룹을 통하여 아미노산 잔기에 의해 공유적으로 결합될 수 있다. 반응성 그룹은 활성화 폴리에틸렌 글리콜 분자가 결합될 수 있는 그룹이다. 자유 아미노 그룹을 갖는 아미노산 잔기로는 리신 잔기 및 N-말단 아미노산 잔기가 있으며; 자유 카르복실 그룹을 갖는 아미노산 잔기로는 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기 및 C-말단 아미노산 잔기가 있다. 폴리에틸렌 글리콜 분자(들)를 부착시키기 위한 반응성 그룹으로서 설프하이드릴 그룹을 사용할 수도 있다. 치료 목적에 바람직한 것은 아미노 그룹에의 부착, 예를 들면, N-말단 또는 리신 그룹에의 부착이다.

N-말단이 화학적으로 변형된 GAVE6이 특별히 요망될 수도 있다. 본 발명의 조성물의 한 예시로서 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여, 각종 폴리에틸렌 글리콜 분자(분자량, 분지도 등) 로부터, 반응 혼합물 중의 GAVE6 분자에 대한 폴리에틸렌 글리콜 분자의 비율, 수행될 페길화 반응의 유형, 및 선택된 N-말단 페길화 단백질을 수득하는 방법을 선택할 수 있다. N-말단이 페길화된 제제를 수득하는 방법(즉, 이러한 잔기를 필요에 따라 기타 모노페길화 잔기로부터 분리시키는 방법)은 N-말단이 페길화된 물질을 페길화 단백질 분자 집단으로부터 정제하는 것일 수 있다. GAVE6에서의 유도체화에 이용 가능한 상이한 유형의 1차 아미노 그룹의 시차 반응성(리신 대 N-말단)을 이용하는 환원적 알킬화 반응에 의해, 선택적인 N-말단 화학적 변형을 수행할 수 있다. 적당한 반응 조건 하에, N-말단 하의 GAVE6을 카르보닐 그룹 함유 중합체로 실질적으로 선택적 유도체화 한다. 예를 들면, GAVE6의 N-말단 잔기의 α아미노 그룹과 리신 잔기의 ε아미노 그룹 간의 pKa 차이의 이점을 이용하도록 해줄 수 있는 pH에서 해당 반응을 수행함으로써 GAVE6을 선택적으로 N-말단을 페길화할 수 있다. 이러한 선택적 유도체화에 의해, 수용성 중합체를 GAVE6에 부착시키는 것이 제어된다: 중합체와의 접합은 GAVE6의 N-말단에서 주로 일어나며,기타 반응성 그룹, 예를 들면, 리신 측쇄 아미노 그룹의 실재적 변형이 전혀 일어나지 않는다. 환원적 알킬화 반응을 이용하면, 수용성 중합체는 상기 언급된 유형의 것일 수 있고, 이는 GAVE6와 커플링하기 위한 단일 반응성 알데히드를 가져야 한다. 단일 반응성 알데히드를 함유하는 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드를 사용할 수 있다.

GAVE6, 이의 변이체 , 이의 단편, 또는 이의 동족체 또는 유도체의 항체

폴리클로날 및 모노클로날 항체 제조를 위한 표준 기술을 사용하여 GAVE6와 결합하는 항체를 생성시키기 위한 면역원으로서, 분리된 GAVE6 단백질, 또는 이의 일정 부분 또는 단편을 사용할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 면역글로불린 분자 및 이러한 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉 특정 항원(예: GAVE6), 또는 이의 단편과 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 함유하는 분자를 지칭한다. GAVE6와 특이적으로 결합하는 분자는 GAVE6와는 결합하지만, 본래 GAVE6를 함유하는 샘플(예: 생물학적 샘플) 중의 기타 분자와는 실질적으로 결합하지 않는 분자이다. 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분의 예에는 항체를 펩신 등의 효소로 처리함으로써 발생될 수 있는 F(ab) 및 F(ab')2 단편이 포함된다. 본 발명은 면역원으로서 GAVE6, 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이의 동족체 또는 유도체를 갖는 폴리클로날, 모노클로날 및 키메라 항체를 제공한다. 사람 질병이나 장애 치료법에 사용하는 데에는 키메라 항체가 바람직한데, 이는 사람 또는 사람화된 항체가 스스로 면역 반응, 특히 알레르기 반응을 유발하는데 있어 이종발생적(xenogenic) 항체 보다 훨씬 덜 할 것으로 예상되기 때문이다.

완전한 길이의 GAVE6 단백질이 사용될 수 있거나, 또 다른 한편으로, 본 발명은 면역원으로서 사용하기 위한 GAVE6의 항원성 펩티드 단편을 제공한다. 이러한 GAVE6의 항원성 펩티드는 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열의 8개 이상(바람직하게는, 10, 15, 20, 30개 이상)의 아미노산 잔기를 포함하고, 펩티드에 대하여 생성된 항체가 GAVE6와 특이적 면역 복합체를 형성하도록 하는 GAVE6의 에피토프를 포괄한다.

GAVE6 면역원은 전형적으로, 적합한 피험체(예: 토끼, 염소, 마우스 또는 기타 포유류)를 상기 면역원으로 면역시킴으로써 항체를 제조하는데 사용된다. 적당한 면역원성 제제는, 예를 들어, 재조합적으로 발현된 GAVE6 단백질 또는 화학적으로 합성된 GAVE6 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 상기 제제에는 애주번트(adjuvant)(예: 프로인트 완전 또는 불완전 애주번트) 또는 유사한 면역자극제가 추가로 포함될 수 있다. 적합한 피험체를 면역원성 GAVE6 제제로 면역시키면, 폴리클로날 항- GAVE6 항체 반응이 유도된다.

본 발명의 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 또는 키메라 항체일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어"모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 GAVE6의 특정한 에피토프와 면역 반응할 수 있는 항원-결합 부위의 한 가지 종 만을 함유하는 항체 분자 집단을 지칭한다. 따라서 모노클로날 항체 조성물은 전형적으로, 특정의 GAVE6 단백질 에피토프에 대한 단일 결합 친화성을 나타낸다.

폴리클로날 항-GAVE6 항체는 적합한 피험체를 GAVE6 면역원으로 면역시킴으로써 상기 언급된 바와 같이 제조할 수 있다. 이와 같이 면역된 피험체 중에서의 항- GAVE6 항체 역가는 표준 기술, 예를 들면, 고정화된 GAVE6를 이용하는 효소 결합 면역 흡착 검정(ELISA)를 사용하여 시간에 따라 모니터할 수 있다. 경우에 따라, GAVE6에 대해 유도된 항체 분자를 포유류(예: 혈액)으로부터 분리하고, 널리 공지된 기술, 예를 들면, 단백질 A 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하여 IgG 분획을 수득할 수 있다. 면역 후 적당한 시간, 예를 들면, 항- GAVE6 항체 역가가 가장 높을 때, 항체-생산 세포를 상기 피험체로부터 수득하고 이를 사용하여, 표준 기술, 예를 들면, 문헌(참조: Kohler 등, Nature (1975) 256:495497)에 최초로 기재된 하이브리도마 기술, 사람 B 세포 하이브리도마 기술 (참조: Kohler 등, Immunol Today (1983) 4:72), EBV 하이브리도마 기술 (참조: Cole 등, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, (1985), Alan R. Liss, Inc., pp. 7796) 또는 트리오마 기술에 의해 모노클로날 항체를 제조할 수 있다. 하이브리도마 생성 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있다(참조: 일반적으로, Current Protocols in Immunology (1994) Coligan 등, eds., John Wiley & Sons, Inc., New York, NY). 간략하게 언급하면, 상기 언급된 바와 같이 GAVE6 면역원으로 면역시킨 포유류로부터의 림프구(전형적으로, 비장 세포)에 불멸의 세포주(전형적으로, 골수종)를 융합시키고, 이로써 생성된 하이브리도마 세포의 배양 상등액을 스크리닝하여 GAVE6와 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 동정한다.

림프구와 불멸화 세포주를 융합시키기 위해 사용되는 것으로 널리 공지된 수많은 어떠한 프로토콜도 항- GAVE6 모노클로날 항체 생성 목적에 적용될 수 있다(참조: 예를 들면, Current Protocols in Immunology, supra; Galfre 등, Nature (1977) 266:550-552; Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, N.Y. (1980); 및 Lerner, Yale J Biol Med (1981) 54:387402). 더욱이, 당업자는 이러한 방법의 많은 변형이 또한 유용할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 전형적으로, 불멸 세포주(예: 골수종 세포주)를 림프구와 동일한 포유류 종으로부터 유도시킨다. 예를 들어, 본 발명의 면역원성 제제로 면역시킨 마우스로부터의 림프구를 불멸화 마우스 세포주, 예를 들면, 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 함유하는 배양 배지("HAT 배지")에 민감한 골수종 세포주와 융합시킴으로써 쥐과 하이브리도마를 만들 수 있다. 수 많은 모든 골수종 세포주, 예를 들면, P3-NS1/l-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 또는 Sp2/OAgl4 골수종 주를 표준 기술에 따라서 융합 파트너로서 사용할 수 있다. 이러한 골수종 주는 ATCC로부터 입수 가능하다. 전형적으로, 폴리에틸렌 글리콜("PEG")을 사용하여 HAT 민감성 마우스 골수종 세포를 마우스 비장 세포에 융합시킨다. 이어서, 융합되지 않은 골수종 세포와 비생산적으로 융합된 골수종 세포를 사멸시키는 HAT 배지를 사용하여, 상기 융합으로부터 비롯된 하이브리도마 세포를 선별한다(융합되지 않은 비장 세포는 수 일 후에 죽는데, 이는 이들이 형질전환되지 않았기 때문이다). 본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는, 예를 들어, 표준 ELISA 검정을 이용하여 GAVE6와 결합하는 항체에 대한 하이브리도마 배양 상등액을 스크리닝함으로써 탐지한다.

모노클로날 항체-분비성 하이브리도마를 제조하는 또 다른 방안으로, GAVE6로 재조합 복합 면역글로불린 라이브러리(예: 항체 파아지 디스플레이 라이브러리)를 스크리닝함으로써 모노클로날 항- GAVE6 항체를 동정 및 분리하고, 이로써 GAVE6와 결합하는 면역글로불린 라이브러리 일원을 분리할 수 있다. 파아지 디스플레이 라이브러리를 생성 및 스크리닝하기 위한 키트가 시판중이다(예를 들면, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-94000-1; 및 Stratagene "SURFZAP" Phage Display Kit, Catalog No. 240612).

부가적으로, 항체 디스플레이 라이브러리를 생성 및 스크리닝하는데 사용하기 특히 적합한 방법과 시약의 예가, 예를 들어, 다음 문헌에 기재되어 있다(참조: 미국 특허 제5,223,409호; PCT 공보 제 WO 92/18619호; PCT 공보 제 WO 91/17271호; PCT 공보 제WO 92/20791호; PCT 공보 제WO 92/15679호; PCT 공보 제 WO 93/01288호; PCT 공보 제WO 92/01047호; PCT 공보 제WO 92/09690호; PCT 공보 제WO 90/02809호; Fuchs 등, Bio/Technology (1991) 9:1370-1372; Hay 등, Hum Antibody Hybridomas (1992) 3:8185; Huse 등, Science (1989) 246:1275-1281; 및 Griffiths 등, EMBO J (1993) 25(12):725-734).

추가로, 사람 부분과 비-사람 부분 둘 다를 포함하는 사람화 및 키메라 모노클로날 항체와 같은 재조합 항- GAVE6 항체는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 만들 수 있다. 이러한 키메라 및 사람화 모노클로날 항체는 문헌(참조: PCT 공보 제WO 87/02671호; 유럽 특허 출원 제184,187호; 유럽 특허 신청 제171,496 호; 유럽 특허 출원 제173,494호; PCT 공보 제WO 86/01533호; 미국 특허 제4,816,567호;유럽 특허 출원 제 125,023호; Better 등, Science (1988) 240:1041-1043; Liu 등, Proc Natl Acad Sci USA (1987) 84:3439-3443; Lin 등, J Immunol (1987) 139:3521-3526; Sun 등, Proc Natl Acad Sci USA (1987) 84:214-218; Nishimura 등, Canc Res (1987) 47:999-1005; Wood 등, Nature (1985) 314:446-449; Shaw 등, J Natl Cancer Inst (1988) 80:1553-1559; Morrison, Science (1985) 229:1202-1207; Oi 등, Bio/Techniques (1986) 4:214; 미국 특허 제 5,225,539호; Jones 등, Nature (1986) 321:552-525; Verhoeyan 등, Science (1988) 239:1534; 및 Beidler 등, J Immunol (1988) 141:40534060)에 기재된 방법을 사용하여, 당해 분야에 공지된 재조합 DNA 기술에 의해 생성할 수 있다.

완전한 사람 항체는 사람 환자의 치료적 처치에 특히 바람직하다. 이러한 항체는 내인성 면역글로불린 중쇄와 경쇄 유전자는 발현할 수 없지만, 사람 중쇄와 경쇄 유전자는 발현할 수 있는 유전자전이된(transgenic) 마우스를 사용하여 생성할 수 있다. 이러한 유전자전이된 마우스는 선택된 항원, 예를 들면, GAVE6의 전부 또는 일정 부분으로 정상적 방식으로 면역시킨다. 통상적인 하이브리도마 기술을 사용하여, 해당 항원에 대해 유도된 모노클로날 항체를 수득할 수 있다. 유전자전이된 마우스에 의해 제공된 사람 면역글로불린 전이유전자(transgene)는 B 세포 분화 동안 재배열되어, 후속적으로 부류 전환(class switching)과 체세포 돌연변이를 겪는다. 따라서, 이러한 에피토프를 사용하여, 예를 들면, GAVE6 활성을 억제시키는 항체를 동정한다. 비-사람 항체의 중쇄와 경쇄를 클로닝하고, 이를 사용하여 파아지 디스플레이 Fab 단편을 제조한다. 예를 들어, 중쇄 유전자를 플라스미드 벡터내로 클로닝하여 이러한 중쇄가 세균으로부터 분비될 수 있도록 한다. 경쇄 유전자를 파아지 외피 단백질 유전자 내로 클로닝하여 이러한 경쇄가 파아지 표면 상에 발현될 수 있도록 한다. 파아지에 융합된 사람 경쇄의 레퍼토리(무작위 집합체)을 이용하여 비-사람 중쇄를 발현하는 세균을 감염시킨다. 이로써 생성된 자손 파아지는 하이브리드 항체(사람 경쇄/비-사람 중쇄)를 표시한다. 선별된 항원을 패닝 스크린에 사용하여, 이러한 선별된 항원과 결합하는 파아지를 선별한다. 파아지를 동정하기 위해서는 수 차례의 선별 과정이 요구될 수 있다.

상기 선별된 항원과 결합하는 선별된 파아지로부터 사람 경쇄 유전자를 분리한다. 이어서, 이와 같이 선별된 사람 경쇄 유전자를 사용하여 사람 중쇄 유전자의 선별을 다음과 같이 진행한다. 상기 선별된 사람 경쇄 유전자를 세균에 의한 발현을 위해 벡터 내로 삽입한다. 선별된 사람 경쇄를 발현하는 세균을, 파아지에 융합된 사람 중쇄 레퍼토리로 감염시킨다. 이로써 생성된 자손 파아지는 사람 항체(사람 경쇄/사람 중쇄)를 표시한다.

이어서, 선별된 항원을 패닝 스크린에 사용하여 이러한 선별된 항원과 결합하는 파아지를 선별한다. 선별된 파아지는 본래 선별된 비-사람 모노클로날 항체에 의해 인식된 바와 동일한 에피토프를 인식하는 완전한 사람 항체를 표시한다. 중쇄와 경쇄 둘 다를 암호화하는 유전자를 분리하고, 사람 항체 생성을 위해 이를 추가로 조작할 수 있다. 이러한 기술은 문헌(참조: Jespers 등 (Bio/Technology (1994) 12:899-903))에 기재되어 있다.

항-GAVE6 항체(예: 모노클로날 항체)를 사용하여 표준 기술, 예를 들면, 친화 크로마토그래피 또는 면역침전법에 의해 GAVE6를 분리할 수 있다. 항-GAVE6 항체는 세포로부터 천연 GAVE6의 정제와 숙주 세포에서 발현된 재조합적으로 생성된 GAVE6의 정제를 촉진시킬 수 있다. 더욱이, 항-GAVE6 항체를 사용하여 GAVE6 단백질(예: 세포성 용해물 중 또는 세포 상등액 중)을 탐지함으로써 GAVE6 단백질의 발현 패턴과 존재량을 평가할 수 있다. 항-GAVE6 항체를 사용하여, 예를 들어, 소정의 치료 섭생의 효능을 결정하기 위해, 임상 시험 과정의 일부로서 조직 내의 단백질 수준을 진단적으로 모니터할 수 있다. 상기 항체를 다음에 기재되는 탐지 가능한 물질에 커플링시킴으로써 탐지를 촉진시킬 수 있다.

탐지 가능한 표지물

임의로, 본 발명의 분리된 핵산 분자, 본 발명의 폴리펩티드, 및 본 발명의 항체 뿐만 아니라 이러한 잔기들의 단편을 탐지 가능한 수준으로 표지시킬 수 있다. 이러한 표지물에는 효소, 형광단(예를 들면, 형광성 이소티오시아네이트 (FITC), 피코에리트린 (PE), 텍사스 레드 (TR), 로다민, 자유 또는 킬레이트화 란타니드 계열 염, 특히 Eu³⁺이 있지만, 이에 제한되지 않는다), 발색단, 방사성 동위원소, 킬레이트제, 염료, 콜로이드성 금, 라텍스 입자, 리간드(예: 바이오틴), 생체 발광성 물질, 및 화학 발광제가 포함된다. 대조 마커가 사용될 때, 동일하거나 또는 상이한 표지물들이 수용체 및 대조 마커를 위해 사용될 수 있다.

방사성 표지물, 예를 들면, 동위원소³H,¹⁴C,³²P,³⁵S,³⁶Cl,⁵¹Cr,⁵⁷Co,⁵⁸Co,⁵⁹Fe,⁹⁰Y,¹²⁵I,¹³¹I, 및¹⁸⁶Re가 사용된 경우에는, 현재 이용 가능한 공지된 계수 과정을 활용할 수도 있다. 표지물이 효소인 경우에는, 당해 분야에 공지되어 현재 활용되고 있는 임의의 비색 정량, 분광측정, 형광분광측정, 전류측정 또는 기체 측정 기술을 사용함으로써 탐지를 수행할 수 있다.

직접적인 표지물은 본 발명에 따라서 사용될 수 있는 표지물의 한 가지 예이다. 직접적인 표지물은 천연 상태로 존재하는 경우에는 육안으로 용이하게 볼 수 있거나 광학 필터 및/또는 적용 자극, 예를 들면, 형광을 증진시키기 위한 자외선의 도움으로 용이하게 볼 수 있는 실재물(entity)로서 규정되었다. 본 발명에 따라서 사용될 수 있는 착색 표지물의 예로는 금속성 졸 입자, 예를 들면 금 졸 입자(예를 들면, Leuvering의 미국 특허 제4,313,734호에 기재된 바와 같음); 염료 졸 입자(예를 들면, Gribnau 등의 미국 특허 제4,373,932호 및 May 등의 WO 88/08534에 기재된 바와 같음); 염료 라텍스(예를 들면, May,supra, Snyder 의 EP-A 0 280 559 및 0 281 327에 기재된 바와 같음); 또는 리포솜에 피막 형성된 염료(Campbell 등의 미국 특허 제 4,703,017호에 기재된 바와 같음)가 있다. 기타 직접적인 표지물에는 방사성 뉴클레오티드, 형광성 잔기 또는 발광성 잔기가 있다. 이들 직접적인 표지화 도구 이외에도, 효소를 포함하는 기타 간접 표지물을 본 발명에 따라서 사용할 수도 있다. 각종 유형의 효소 결합 면역검정이 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들면, 알칼린 포스파타제 및 서양고추냉이 퍼옥시다제, 리소자임, 글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제, 락테이트 데하이드로게나제, 우레아제, 이들및 기타 효소가 문헌(참조: Eva Engvall in Enzyme Immunoassay ELISA 및 EMIT,Methods in Enzymology,70. 419-439, 1980 및 미국 특허 제4,857,453호)에 보다 상세히 논의되어 있다.

본 발명에 사용하기 위한 기타 표지물에는 자기 비드 또는 자기 공명 영상화 표지물이 포함된다.

또 다른 양태에서는,³²P 로 표지화하기 위해, 예를 들어, Sidney Pestka의 유럽 특허 제 0372707호 (출원 번호 제 89311108.8호) 또는 Foxwell 등에게 1995년 10월 17일자로 허여된 미국 특허 제5,459,240호에 기재된 바와 같이, 본 발명의 분리된 폴리펩티드, 본 발명의 항체, 또는 이들의 단편 상에 인산화 부위를 제조할 수 있다.

본원에 예시된 바와 같이, 항체를 포함한 단백질은 대사과정을 표지화시킴으로써 표지시킬 수 있다. 대사과정의 표지화는 대사과정의 표지물, 예를 들면, [³⁵S]-메티오닌 또는 [³²P]-오르트포스페이트가 보충된 배양 배지의 존재하에 상기 단백질을 발현하는 세포를 시험관 내에서 항온배양하는 동안에 일어난다. [³⁵S]-메티오닌으로의 대사적(또는 생합성적) 표지화 이외에도, 본 발명은 [¹⁴C]-아미노산과 [³H]-아미노산 (불안정하지 않은 위치에서 치환된 삼중 수소를 갖는다)으로 표지화시키는 것을 추가로 고려한다.

재조합 발현 벡터 및 숙주 세포

본 발명의 또 다른 국면은 GAVE6을 암호화하는 핵산(또는 이의 일정 부분)을 함유하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터에 관한 것이다. 앞서 설명한 바와 같이, 벡터의 한 가지 유형이 "플라스미드"이고, 이는 부가의 DNA 절편을 결찰시킬 수 있는 환형 이본쇄 DNA 루프를 지칭한다. 또 다른 유형의 벡터가 바이러스 벡터인데, 여기서는 부가의 DNA 절편을 바이러스성 게놈 내로 결찰시킬 수 있다. 특정 벡터는 숙주 세포 내에서 자가 복제할 수 있다(예를 들면, 세균 복제 기점을 갖는 세균 벡터 및 에피솜 포유류 벡터). 기타 벡터(예: 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로의 도입시 숙주 세포의 게놈 내로 통합됨으로써, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 발현 벡터는 이에 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 활용되는 발현 벡터는 종종 플라스미드(벡터) 형태이다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 제공해주는 기타 형태의 발현 벡터, 예를 들면, 바이러스 벡터(예: 복제 결함성 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스)도 포괄한다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 핵산이 숙주 세포 내에서 발현하기에 적합한 형태의 본 발명의 핵산 분자를 포함한다. 이는 본 발명의 재조합 발현 벡터가, 발현에 사용될 숙주 세포를 기준으로 하여 선택된, 발현될 핵산에 작동가능하게 연결되는 하나 이상의 조절 서열을 포함한다는 것을 의미한다. 재조합 발현 벡터 내에서 "작동가능하게 연결된다"는 것은 목적하는 뉴클레오티드 서열이 이러한 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용해 주는 방식으로 조절 서열(들)에 연결되는 것을 의미한다(예를 들면, 시험관내 전사/해독 시스템, 또는 해당 벡터가 숙주 세포 내로 도입되는 경우에는 숙주 세포에서 이루어짐). 용어 "조절 서열"에는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소(예: 폴리아데닐화 시그널)이 포함된다. 이러한 조절 서열은, 예를 들어, 문헌(참조: Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology Vol. 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))에 기재되어 있다. 조절 서열에는 수 많은 유형의 숙주 세포 내에서의 뉴클레오티드 서열의 구성적 발현을 지시하는 서열(예: 조직 특이적 조절 서열)이 포함된다. 당업자는 형질전환시키고자 하는 숙주 세포의 선택, 목적하는 단백질의 발현 정도 등의 요인들에 따라서 발현 벡터를 고안할 수 있다는 것을 인지해야 할 것이다. 본 발명의 발현 벡터를 숙주 세포 내로 도입하여 본원에 기재된 바와 같은 핵산에 의해 암호화된 단백질 또는 펩티드(예: GAVE6 단백질, 돌연변이체 형태의 GAVE6, 융합 단백질 등)를 생성할 수 있다.

본 발명의 재조합 발현 벡터를 원핵성 또는 진핵성 세포, 예를 들면, 세균성 세포, 예를 들어, 이. 콜라이, 곤충 세포(바쿨로바이러스 발현 벡터 사용), 효모 세포 또는 포유류 세포에서 GAVE6을 발현하는 용도로 고안할 수 있다. 적합한 숙주 세포는 문헌(Goeddel,supra)에 추가로 논의되어 있다. 또 다른 한편으론, 예를 들어, 파아지 조절 요소와 단백질, 예를 들면, T7 프로모터 및/또는 T7 폴리머라제를 사용하여 본 발명의 재조합 발현 벡터를 시험관 내에서 전사 및 해독할 수 있다.

원핵 생물체 내에서의 단백질 발현은 대부분이, 융합 또는 비-융합 단백질의 발현을 지시해주는 구성적 또는 유도성 프로모터를 함유하는 벡터를 수반하는 이.콜라이에서 수행된다. 융합 벡터는 수 많은 아미노산을, 이 안에 암호화된 단백질, 통상적으로는 재조합 단백질의 아미노 말단에 부가해준다. 이러한 융합 단백질은 전형적으로 3가지 목적을 제공해준다: 1) 재조합 단백질의 발현을 증가시키기 위한 목적; 2) 재조합 단백질의 용해도를 증가시키기 위한 목적; 및 3) 친화 정제에서 리간드로서 작용함으로써 재조합 단백질의 정제를 보조하기 위한 목적. 융합 발현 벡터에서는 종종, 융합 잔기와 재조합 단백질의 연결부에 단백질 분해적 절단 부위가 도입되어 이러한 재조합 단백질을 융합 잔기로부터 분리시켜 융합 단백질을 후속 정제할 수 있게 해준다. 이러한 효소 및 동족 인식 서열에는 인자 Xa, 트롬빈 및 엔테로키나제가 포함된다. 전형적인 융합 발현 벡터에는 pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith 등, Gene (1988) 67:3140), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) 및 pRITS (Pharmacia, Piscataway, NJ)가 포함되는데, 이들은 글루타치온 5-트랜스퍼라제 (GST), 말토즈 E 결합 단백질 또는 단백질 A 각각을 표적 재조합 단백질에 융합시켜 준다

적합한 유도성 비-융합 이. 콜라이 발현 벡터의 예에는 pTrc (Amann 등, Gene (1988) 69:301315) 및 pET 11d (Studier 등, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, California (1990) 185:6089)가 포함된다. pTrc 벡터로부터의 표적 유전자 발현은 하이브리드 trp-lac 융합 프로모터로부터의 숙주 RNA 폴리머라제 전사에 좌우된다.

이. 콜라이에서의 재조합 단백질 발현을 최대화하기 위한 한 가지 전략은 이러한 재조합 단백질을 단백질 분해적으로 절단하는 능력에 결함이 있는 숙주에서상기 단백질을 발현하는 것이다(참조: Gottesman, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, California (1990) 185:119-128). 또 다른 전략은 해당 핵산 분자의 핵산 서열이 발현 벡터 내로 삽입되도록 변화시켜 각 아미노산에 대한 개별적 코돈이 이. 콜라이에서 우선적으로 활용되도록 하는 것이다(참조: Wada 등, Nucleic Acids Res (1992) 20:2111-2118). 본 발명의 핵산 서열 상의 이러한 변화는 표준 DNA 합성 기술에 의해 수행할 수 있다.

또 다른 양태에서는, GAVE6 발현 벡터가 효모 발현 벡터이다. 에스. 세레비지애(S. cerevisiae)와 같은 효모에서 발현하기 위한 벡터의 예에는 pYepSecl (Baldari 등, EMBO J (1987) 6:229234), pMFa (Kurjan 등, Cell (1982) 30:933943), pJRY88 (Schultz 등, Gene (1987) 54:113123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) 및 pPicZ (Invitrogen Corp, San Diego, CA)가 포함된다.

또 다른 한편으론, 바쿨로바이러스 발현 벡터를 사용하여 GAVE6을 곤충 세포에서 발현할 수 있다. 배양된 곤충 세포(예: Sf9 세포)에서 단백질을 발현하는데 사용 가능한 바쿨로바이러스 벡터에는 pAc 시리즈 (Smith 등, Mol Cell Biol (1983) 3:2156-2165) 및 pVL 시리즈 (Lucklow 등, Virology (1989) 170:3139)가 포함된다.

또 다른 양태에서는, 포유류 발현 벡터를 사용하여 본 발명의 핵산을 포유류 세포에서 발현시킨다. 본원에 적용되는 포유류 발현 벡터의 예에는 pCDM8 (Seed,Nature (1987) 329:840) 및 pMT2PC (Kaufman 등, EMBO J (1987) 6:187-195)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 포유류 세포에서 사용되는 경우, 발현 벡터의 제어 기능은 바이러스 조절 요소에 의해 종종 제공된다. 예를 들어, 통상적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 시토메갈로바이러스 및 원숭이 바이러스 40으로부터 유래된다. 원핵 세포와 진핵 세포 둘 다에 적합한 기타 발현 시스템에 대해서는, 문헌(제16장 및 제17 장, Sambrook등, supra)을 참조할 수 있다.

또 다른 양태에서는, 본 발명의 재조합 포유류 발현 벡터가, 우선적으로 특정한 세포 유형에서 핵산 발현을 지시할 수 있다(예를 들어, 조직 특이적 조절 요소를 사용하여 핵산을 발현시킨다). 조직 특이적 조절 요소는 당해 분야에 공지되어 있다. 적합한 조직 특이적 프로모터의 비-제한적 예에는 알부민 프로모터 (간-특이적; Pinkert 등, Genes Dev (1987) 1:268-277), 유임파구-특이적 프로모터 (Calame 등, Adv Immunol (1988) 43:235-275), 특히 T 세포 수용체의 프로모터 (Winoto 등, EMBO J (1989) 8:729-733) 및 면역글로불린의 프로모터 (Banerji 등, Cell (1983) 33:729-740; Queen 등, Cell (1983) 33:741-748), 뉴런 특이적 프로모터(예를 들면, 신경세사 프로모터; Byrne 등, Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86:5473-5477), 췌장-특이적 프로모터 (Edlund 등, Science (1985) 230:912-916) 및 유선 특이적 프로모터 (예를 들면, 우유 유장 프로모터; 미국 특허 제 4,873,316호 및 유럽 신청 제264,166호)가 포함된다. 발생적으로 조절된 프로모터, 예를 들면, 쥐과 hox 프로모터 (Kessel 등, Science (1990) 249:374-379) 및 α페토프로테인 프로모터 (Campes 등, Genes Dev (1989) 3:537-546)가 또한 포괄된다.

본 발명은 추가로, 안티센스 배향으로 발현 벡터 내로 클로닝된 본 발명의 DNA 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 즉, 이러한 DNA 분자는 GAVE6 mRNA에 대해 안티센스인 RNA 분자의 발현(DNA 분자의 전사에 의함)을 허용해 주는 방식으로 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 안티센스 배향으로 클로닝된 핵산에 작동가능하게 연결된 조절 서열은 각종 세포 유형에서 안티센스 RNA 분자의 연속적 발현을 지시해주는 것으로 선택할 수 있다. 예를 들어, 안티센스 RNA의 구성적, 조직 특이적 또는 세포 유형 특이적 발현을 지시하는 바이러스 프로모터 및/또는 인핸서 또는 조절 서열을 선택할 수 있다. 안티센스 발현 벡터는 고 효율 조절 영역(이의 활성은 벡터가 도입되는 세포 유형에 의해 결정될 수 있다)의 제어 하에 안티센스 핵산을 생성시키는 재조합 플라스미드, 파아지미드 또는 약독화된 바이러스 형태일 수 있다. 안티센스 유전자를 사용하여 유전자 발현을 조절하는 것에 관한 논의는 다음 문헌(Weintraub 등 (ReviewsTrends in Genetics, Vol. 1(1)1986))을 참조할 수 있다.

본 발명의 또 다른 국면은 본 발명의 재조합 발현 벡터를 도입시킨 숙주 세포에 관한 것이다. 용어 "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 상기 용어는 특정한 피험체 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손이나 잠재적 자손 모두를 지칭한다. 돌연변이나 환경 상의 영향으로 인해 특정의 돌연변이가 후대에 일어날 수 있기 때문에, 이들 자손이 사실상 모 세포와 동일하지 않을 수도 있지만, 이들 역시 본원에 사용된 바와 같은 상기 용어 범위에 포함된다.

숙주 세포는 모든 원핵성 세포 또는 진핵성 세포일 수 있다. 예를 들어, GAVE6 단백질을 세균 세포(예: 이. 콜라이), 곤충 세포, 효모 또는 포유류 세포 (예: 중국산 햄스터 난소 세포 (CHO), 293 세포 또는 COS 세포)에서 발현할 수 있다. 기타 적합한 숙주 세포가 당업자에게 공지되어 있다. 벡터 DNA는 통상적인 형질전환 또는 형질감염 기술을 통하여 원핵성 또는 진핵성 세포 내로 도입할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "형질전환" 및 "형질감염"은 외래 핵산(예: DNA)을 특정 숙주 세포 내로 도입하는 것으로 당업계에 인식되어 온 각종 기술을 지칭하는데, 이러한 기술에는 인산칼슘 또는 염화칼슘 공-침전, 형질도입, DEAE-덱스트란-매개된 형질감염, 리포펙션(lipofection) 또는 전기천공이 포함된다.

포유류 세포를 안정적으로 형질감염시키기 위해, 사용된 발현 벡터와 형질감염 기술에 따라서 단지 작은 분획의 세포 만이 외래 DNA를 게놈 내로 통합시킬 수 있다는 사실이 공지되어 있다. 이러한 통합체를 동정하고 선별하기 위해서는, 선별 마커(예: 항생제에 대한 내성)를 암호화하는 유전자를 일반적으로, 목적하는 유전자와 함께 숙주 세포 내로 도입한다. 바람직한 선별 마커에는 약물에 내성을 부여해주는 것, 예를 들면, G418, 히그로마이신 및 메토트렉세이트가 포함된다. 선별 마커를 암호화하는 핵산을, GAVE6을 암호화하는 것과 동일한 벡터 상의 숙주 세포 내로 도입할 수 있거나, 또는 별개의 벡터 상에 도입할 수 있다. 상기와 같이 도입된 핵산으로 안정적으로 형질감염된 세포는 약물 선별에 의해 동정할 수 있다(예를 들면, 선별 마커 유전자가 혼입된 세포는 생존할 것이지만, 다른 세포들은 사멸된다).

본 발명의 숙주 세포, 예를 들면, 배양 중인 원핵성 또는 진핵성 숙주 세포를 사용하여 GAVE6 단백질을 생성(즉, 발현)할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포를 사용하여 GAVE6 단백질을 생성하는 방법을 추가로 제공한다. 한 양태에서는, 상기 방법이 (GAVE6를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 도입된) 본 발명의 숙주 세포를 적합한 배지에서 배양하여 GAVE6 단백질이 생성되도록 하는 단계를 포함한다. 또 다른 양태에서는, 상기 방법이 상기 배지 또는 숙주 세포로부터 GAVE6을 분리하는 단계를 추가로 포함한다.

또 다른 양태에서는, GAVE6이 변형된 발현 벡터에서 서브클로닝된 기타 단백질의 재조합 발현을 위한 유도성 발현 시스템을 포함한다. 예를 들어, 돌연변이된 G 단백질을 포함하는 숙주 세포(예: 효모 세포, Y2 부신피질 세포 및 cyc^-S49, 참조: 미국 특허 제 6,168,927 B1호, 제5,739,029호 및 제5,482,835호; Mitchell 등, Proc Natl Acad Sci USA (1992) 89(19):8933-37 및 Katada 등, J Biol Chem (1984) 259(6):3586-95)를, GAVE6을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제1 발현 벡터로 형질도입하는데, 여기서 GAVE6은 해당 숙주 세포에서 기능적으로 발현된다. 이와 같이 발현된 GAVE6이 구성적으로 활성인 경우일지라도, 상기 돌연변이로 인해 시그널 전달이 허용될 수 없는데, 즉 G-단백질 지시된 하류 연쇄증폭의 활성화가 전혀 발생되지 않는다(예: 아데닐릴 사이클라제 활성화가 없음). 연속해서, 제2 발현 벡터를 사용하여 GAVE6-포함 숙주 세포를 형질도입한다. 이러한 제2 벡터는 유도성 시스템에 의해 발현될 목적하는 유전자 이외에도, 숙주 세포의 G 단백질 돌연변이를보상해주는 구조 유전자(즉, 기능적 포유류 또는 효모 G_s, G_i, G_o, 또는 G_q, 참조: PCT 공보 제WO 97/48820호; 미국 특허 제6,168,927 B1호, 제5,739,029호 및 제5,482,835호)를 포함한다. 제2 벡터의 상보적 구조 유전자는 유도성인데, 즉 이러한 상보적 구조 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 활성화시키는 외인성 부가 성분(예: 테트라사이클린, IPTG, 작은 분자 등, 참조: Sambrook 등 supra)의 제어 하에 있다. 상기 유도 인자 부가시, 상보적 구조 유전자에 의해 암호화된 단백질이 기능적으로 발현되어, 구성적 활성 GAVE6이 적당한 하류 경로 활성화(예: 제2 메신저 형성)를 유발시키는 복합체를 형성하도록 할 것이다. 목적하는 유전자를 포함하는 제2 벡터는 적당한 제2 메신저에 의해 활성화되는 작동가능하게 연결된 프로모터(예: CREB, AP1 요소)를 보유한다. 따라서, 제2 메신저가 축적됨에 따라, 목적하는 유전자로부터 상류 프로모터가 활성화되어 해당 유전자의 생성물을 발현시킨다. 유도인자가 존재하지 않는 경우에는, 목적하는 유전자의 발현이 중지된다.

특정 양태에서는, 유도성 발현 시스템용 숙주 세포에 S49 (cyc^-) 세포가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. G-단백질 돌연변이를 포함하는 세포주가 고려되긴 하지만, 적합한 돌연변이체를 인공적으로 생성/작제할 수 있다(효모 세포의 경우, 미국 특허 제6,168,927 B1호, 제5,739,029호 및 제5,482,835호를 참조할 수 있다).

관련 국면에서는, 서열 번호 2에 제시된 바와 같은 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 cDNA에 작동가능하게 연결된 벡터를 사용하여 세포를 형질감염시킨다. 상기 시스템을 포함하는 제1 및 제2 벡터에는 pCDM8 (Seed, Nature (1987) 329:840) 및 pMT2PC (Kaufman 등, EMBO J (1987) 6:187-195), pYepSecl (Baldari 등, EMBO J (1987) 6:229-234), pMFa (Kurjan 등, Cell (1982) 30:933-943), pJRY88 (Schultz 등, Gene (1987) 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) 및 pPicZ (Invitrogen Corp, San Diego, CA)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

관련 국면에서는, 숙주 세포를 그러한 적합한 수단에 의해 형질감염시킬 수 있는데, 이러한 형질감염으로 인해 기능적 GAVE6 단백질의 발현이 이루어진다(참조: Sambrook 등, supra, 및 Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, Stockton Press, New York, NY, 1990). 이러한 "기능적 단백질"에는 일단 발현되면 G-단백질과 복합체를 형성하는 단백질(이러한 G-단백질은 제2 메신저 형성을 조절해준다)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에 적용되는 기타 숙주 세포 형질감염 방법에는 형질감염, 전기천공, 미세주사, 형질도입, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 인산칼슘 침전, 리포펙션(리소솜 융합), 유전자 총 사용, 또는 DNA 벡터 수송인자의 사용이 포함되지만, 이에 특정하게 제한되지 않는다(참조: 예를 들면, Wu 등, 1992, J. Biol. Chem. 267:963-967; Wu and Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263:14621-14624; Hartmut 등, 카나다 특허 신청 제2,012,311호, March 15, 1990).

수 많은 각종 프로모터가 본 발명에 적용된다. 실제로, 본 발명의 폴리펩티드의 발현은 당해 분야에 공지된 임의의 프로모터/인핸서 요소에 의해 제어될 수있지만, 이들 조절 요소들은 발현을 위해 선별된 숙주에서 기능적이어야만 한다. GAVE6 발현을 제어하기 위해 사용될 수 있는 프로모터에는 SV40 초기 프로모터 영역 (Benoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310), 라우스(Rous) 육종 바이러스의 3’ 장 말단 반복 서열 내에 함유된 프로모터 (Yamamoto, 등, 1980, Cell 22:787-797), 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터 (Wagner 등, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445), 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열 (Brinster 등, 1982, Nature 296:39-42); 원핵성 발현 벡터, 예를 들면, β-락타마제 프로모터 (Villa-Kamaroff, 등, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731), 또는tac프로모터 (DeBoer, 등, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25; "Useful proteins from recombinant bacteria", Scientific American, 1980, 242:74-94); 효모 또는 기타 진균으로부터의 프로모터 요소, 예를 들면, Gal 4 프로모터, ADC (알코올 데하이드로게나제) 프로모터, PGK (포스포글리세롤 키나제) 프로모터, 알칼린 포스포타제 프로모터; 및 조직 특이성을 나타내고 유전자전이된 동물에서 활용되어 온 동물 전사 제어 영역: 췌장 포상 세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 제어 영역 (Swift 등, 1984, Cell 38:639-646; Ornitz 등, 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 제어 영역 (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122), 유임파구 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 제어 영역 (Grosschedl 등, 1984, Cell 38:647-658; Adames 등, 1985, Nature 318:533-538; Alexander 등, 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), 고환, 유방, 유임파구 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유방 종양 바이러스 제어 영역 (Leder 등, 1986, Cell 45:485-495), 간에서 활성인 알부민 유전자 제어 영역 (Pinkert 등, 1987, Genes and Devel. 1:268-276), 간에서 활성인 알파-페토프로테인 유전자 제어 영역 (Krumlauf 등, 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer 등, 1987, Science 235:53-58), 간에서 활성인 알파 1-안티트립신 유전자 제어 영역 (Kelsey 등, 1987, Genes and Devel. 1:161-171), 골수 세포에서 활성인 베타-글로빈 유전자 제어 영역 (Mogram 등, 1985, Nature 315:338-340; Kollias 등, 1986, Cell 46:89-94), 뇌 중의 핍지교세포에서 활성인 미엘린 염기성 단백질 유전자 제어 영역 (Readhead 등, 1987, Cell 48:703-712), 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 제어 영역 (Sani, 1985, Nature 314:283-286), 및 시상하부에서 활성인 고나도트로픽 방출 호르몬 유전자 제어 영역 (Mason 등, 1986, Science 234:1372-1378)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 핵산 분자를 함유하는 발현 벡터는 다음 4가지 일반적인 접근법에 의해 확인할 수 있다: (a) 목적하는 플라스미드 DNA 또는 특이적 mRNA의 PCR 증폭, (b) 핵산 하이브리드화, (c) 선별 마커 유전자 기능의 존재 또는 부재, 및 (d) 삽입된 서열의 발현. 제1 접근법에서는, 핵산을 PCR에 의해 증폭시켜 증폭된 생성물의 탐지를 제공해준다. 제2 접근법에서는, 삽입된 마커 유전자에 상동성인 서열을 포함하는 프로브를 사용하여 핵산 하이브리드화함으로써, 발현 벡터 내에 삽입된 외래 유전자의 존재 여부를 탐지할 수 있다. 제3 접근법에서는, 외래 유전자가 재조합 벡터 내에 삽입함으로써 유발된 특정의 "선별 마커" 유전자 기능(예: β-갈락토시다제 활성, 티미딘 키나제 활성, 항생제에 대한 내성, 형질전환 표현형, 바쿨로바이러스에서의 봉입체 형성 등)의 존재 또는 부재에 근거하여, 재조합 벡터/숙주 시스템을 동정 및 선별할 수 있다. 또 다른 예에서는, GAVE6 단백질을 암호화하는 핵산, 이의 변이체, 또는 이의 동족체 또는 유도체가 상기 벡터의 "선별 마커" 유전자 서열 내에 삽입된 경우에는, 상기 삽입체를 함유하는 재조합체를 GAVE6 유전자 기능의 부재로써 동정할 수 있다. 제4 접근법에서는, 상기 재조합체에 의해 발현된 유전자 생성물의 활성, 생화학적 또는 면역학적 특징을 대해 검정함으로써, 재조합 발현 벡터를 동정할 수 있는데, 단 상기 발현된 단백질은 기능적 활성 입체 구조인 것으로 추정된다.

광범위한 숙주/발현 벡터 조합물을 본 발명의 DNA 서열 발현에 이용할 수 있다. 유용한 발현 벡터는, 예를 들어, 염색체, 비-염색체 및 합성 DNA 서열의 절편로 이루어질 수 있다. 적합한 벡터에는 SV40의 유도체 및 공지된 세균 플라스미드, 예를 들면, 이. 콜라이 플라스미드 col El, pCR1, pBR322, pMal-C2, pET, pGEX (Smith등, 1988, Gene 67:31-40), pMB9 및 이들의 유도체, 플라스미드, 예를 들면, RP4; 파아지 DNAS, 예를 들면, 파아지 λ의 수 많은 유도체, 예를 들면, NM989, 및 기타 파아지 DNA, 예를 들면, M13 및 필라멘트상 일본쇄 파아지 DNA; 효모 플라스미드, 예를 들면, 2μ 플라스미드 또는 이의 유도체; 진핵성 세포에 유용한 벡터, 예를 들면, 곤충 또는 포유류 세포에 유용한 벡터; 플라스미드와 파아지 DNA의 조합물로부터 유래된 벡터, 예를 들면, 파아지 DNA 또는 기타 발현 제어 서열을 이용하도록 변형시킨 바 있는 플라스미드 등이 포함된다.

예를 들어, 바쿨로바이러스 발현 시스템에서는, pVL941 (BamH1 클로닝 부위; Summers), pVL1393 (BamH1,SmaI,XbaI,EcoR1,NotI,XmaIII,BglII, 및PstI 클로닝 부위; Invitrogen), pVL1392 (BglII,PstI,NotI,XmaIII,EcoRI,XbaI,SmaI, 및BamH1 클로닝 부위; Summers 및 Invitrogen), 및 pBlueBacIII (BamH1,BglII,PstI,NcoI, 및HindIII 클로닝 부위, 블루/화이트 재조합 스크리닝이 가능함; Invitrogen)이 포함되지만 이에 제한되지 않는 비-융합 전이 벡터와, pAc700 (BamH1 및KpnI 클로닝 부위, 여기서는BamH1 인식 부위가 개시 코돈과 함께 시작된다; Summers), pAc701 및 pAc702 (pAc700와 동일하지만, 상이한 판독 프레임을 가짐), pAc360 (BamH1 클로닝 부위, 폴리헤드린 개시 코돈의 하류에 36 염기쌍을 가짐; Invitrogen(195)), 및 pBlueBacHisA, B, C (3가지 상이한 판독 프레임,BamH1,BglII,PstI,NcoI, 및HindIII 클로닝 부위 가짐, ProBond 정제를 위한 N-말단 펩티드, 및 플라크의 블루/화이트 재조합 스크리닝; Invitrogen (220)) 이 포함되지만 이에 제한되지 않는 융합 전이 벡터 둘 다가 사용될 수 있다.

본 발명에 사용하도록 고려된 포유류 발현 벡터에는 유도성 프로모터, 예를 들면, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 프로모터를 갖는 벡터, 예를 들면,DHFR발현 벡터 또는DHFR/메토트렉세이트 공-증폭 벡터, 예를 들면, pED (PstI,SalI,SbaI,SmaI, 및EcoRI 클로닝 부위, 상기 벡터는 클로닝된 유전자와DHFR둘 다를 발현한다; 참조: Kaufman,Current Protocols in Molecular Biology, 16.12 (1991))를 갖는 모든 발현 벡터가 포함된다. 또 다른 한편으론, 글루타민 신테타제/메티오닌 설폭시민 공-증폭 벡터, 예를 들면, pEE14 (HindIII,XbaI,SmaI,SbaI,EcoRI, 및BclI 클로닝 부위, 여기서 상기 벡터는 글루타민 신타제와 클로닝된 유전자를 발현한다; Celltech)가 포함된다. 또 다른 양태에서는, 엡슈타인 바르 바이러스(EBV)의 제어 하에 에피솜성 발현을 지시해주는 벡터를 사용할 수 있는데, 이의 예를 들면, pREP4 (BamH1,SfiI,XhoI,NotI,NheI,HindIII,NheI,PvuII, 및KpnI 클로닝 부위, 구성적 RSV-LTR 프로모터, 하이그로마이신 선별 마커; Invitrogen), pCEP4 (BamH1,SfiI,XhoI,NotI,NheI,HindIII,NheI,PvuII, 및KpnI 클로닝 부위, 구성적 hCMV 즉발 초기 유전자, 하이그로마이신 선별 마커; Invitrogen), pMEP4 (KpnI,PvuI,NheI,HindIII,NotI,XhoI,SfiI,BamH1 클로닝 부위, 유도성 메탈로티오네인 Iia 유전자 프로모터, 하이그로마이신 선별 마커: Invitrogen), pREP8 (BamH1,XhoI,NotI,HindIII,NheI, 및KpnI 클로닝 부위, RSV-LTR 프로모터, 히스티디놀 선별 마커; Invitrogen), pREP9 (KpnI,NheI,HindIII,NotI,XhoI,SfiI, 및 BamHI 클로닝 부위, RSV-LTR 프로모터, G418 선별 마커; Invitrogen), 및 pEBVHis (RSV-LTR 프로모터, 하이그로마이신 선별 마커, ProBond 수지를 통하여 정제 가능하고 엔테로키나제에 의해 절단된 N-말단 펩티드; Invitrogen)이다. 본 발명에 사용하기 위한 선별적인 포유류 발현 벡터에는 pRc/CMV (HindIII,BstXI,NotI,SbaI, 및ApaI 클로닝 부위, G418 선별; Invitrogen), pRc/RSV (HindIII,SpeI,BstXI,NotI,XbaI 클로닝 부위, G418 선별; Invitrogen) 등이 포함된다. 본 발명에 따라서 사용하기 위한 백시니아 바이러스 포유류 발현 벡터(참조: Kaufman, 1991,supra) 에는 pSC11 (SmaI 클로닝 부위, TK- and β-gal 선별), pMJ601 (SalI,SmaI,AflI,NarI,BspMII,BamHI,ApaI,NheI,SacII,KpnI, 및HindIII 클로닝 부위; TK- 및 β-gal 선별), 및 pTKgptF1S (EcoRI,PstI,SalI,AccI,HindII,SbaI,BamHI, 및 Hpa 클로닝 부위, TK 또는 XPRT 선별)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

GAVE6 단백질, 이의 변이체, 또는 이의 동족체 또는 유도체를 발현하기 위해 본 발명에 따라서 효모 발현 시스템을 사용할 수도 있다. 예를 들어, 비-융합 pYES2 벡터 (XbaI,SphI,ShoI,NotI,GstXI,EcoRI,BstXI,BamH1,SacI,Kpn1, 및HindIII 클로닝 부위; Invitrogen) 또는 융합 pYESHisA, B, C (XbaI,SphI,ShoI,NotI,BstXI,EcoRI,BamH1,SacI,KpnI, 및HindIII 클로닝 부위, ProBond 수지로 정제되고 엔테로키나제에 의해 절단된 N-말단 펩티드; Invitrogen)(이들로 제한되지 않는다)을 본 발명에 따라서 이용할 수 있다.

특정한 재조합 DNA 분자가 일단 동정 및 분리되면, 당해 분야에 공지된 몇 가지 방법을 사용하여 이를 증식시킬 수 있다. 적합한 숙주 시스템과 성장 조건이 일단 확립되면, 재조합 발현 벡터를 정량적으로 증식 및 제조할 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이, 사용될 수 있는 발현 벡터에는 다음 벡터 또는 이의 유도체가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다: 사람 또는 동물 바이러스, 예를 들어, 백시니아 바이러스 또는 아데노바이러스; 곤충 바이러스, 예를 들면, 바쿨로바이러스; 효모 벡터; 박테리오파아지 벡터(예: 람다), 및 플라스미드 및 코스미드 DNA 벡터.

또한, 삽입된 서열의 발현을 조정해주거나 또는 유전자 생성물을 목적하는 특이적 방식으로 변형 및 프로세싱하는 숙주 세포 균주를 선택할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질의 해독 및 해독-후 프로세싱과 변형(예: 글리코실화, 절단[예:시그널 서열의 절단])에 대한 특징적이고도 특이적인 기전을 지니고 있다. 발현된 외래 유전자의 목적하는 변형과 프로세싱을 보장해주는데 적당한 세포 주 또는 숙주 시스템을 선택할 수 있다. 예를 들어, 세균성 시스템에서의 발현을 이용하여 비-글리코실화 코어 단백질 생성물을 생성할 수 있다.

유전자전이된 동물

본 발명의 숙주 세포를 사용하여 비-사람 유전자전이된 동물을 생성할 수 있다. 예를 들어, 한 양태에서는, 본 발명의 숙주 세포가, GAVE6-암호화 서열을 도입시킨 수정된 난모 세포 또는 배아 줄기 세포이다. 이어서, 이러한 숙주 세포를 사용하여, 외인성 GAVE6 서열을 게놈 내로 도입시킨 비-사람 유전자전이된 동물, 또는 내인성 GAVE6 서열을 변화시킨 상동 재조합 동물을 생산할 수 있다. 상기 동물은 GAVE6의 기능 및/또는 활성을 연구하고, GAVE6 활성 조정제를 동정 및/또는 평가하는데 유용하다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "유전자전이된 동물"은 해당 동물의 하나 이상의 세포가 전이유전자를 포함한다는 점에서 비-사람 동물, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 설치류(예: 랫트 또는 마우스)이다. 유전자전이된 동물의 기타 예로는 비-사람 영장류, 양, 개, 소, 염소, 닭, 양서류 등이 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "전이유전자"는 유전자전이된 동물이 발생되는 세포 게놈 내로 통합되어 성숙한 동물 게놈 내에 남아 있는 외인성 DNA를 지칭한다. 전이유전자는 유전자전이된 동물의 한 가지 이상의 세포 유형 또는 조직에서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 지시한다. 본원에 사용된 바와 같은 "상동 재조합 동물"은 상동 재조합에 의해 내인성 GAVE6 유전자를 변화시킨 비-사람 동물, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 마우스이다. 이는 동물의 발생에 앞서, 동물의 특정 세포, 예를 들면, 동물의 배아 세포 내로 도입된 외인성 DNA 분자와 내인성 유전자 간에 수행된다.

본 발명의 유전자전이된 동물은 상기 언급된 형질감염 방법들 중의 한 가지 방법을 사용하여 GAVE6-암호화 핵산 분자를 수정된 난모 세포의 웅성 프로-핵(male pronuclei) 내로 도입함으로써 생산할 수 있다. 이어서, 상기 난모 세포를 가임신 암컷 양육 동물에게서 발생시킨다. GAVE6 cDNA 서열, 예를 들면, 서열 번호 1의 서열을, 예를 들어, 전이유전자로서 비-사람 동물의 게놈 내로 도입할 수 있다. 또 다른 한편으론, 사람 GAVE6 cDNA에 대한 하이브리드화에 근거하여, 사람 GAVE6 유전자의 비-사람 상동체, 예를 들면, 마우스 GAVE6 유전자를 분리할 수 있고, 이를 전이유전자로서 사용할 수 있다. 인트론성 서열과 폴리아데닐화 시그널을 상기 전이유전자에 포함시켜 전이유전자의 발현 효율을 증가시킬 수도 있다. 조직 특이적 조절 서열(들)을 GAVE6 전이유전자에 작동가능하게 연결시켜 특정한 세포에서의 GAVE6 단백질의 발현을 지시할 수 있다. 배아 조작과 미세주사를 통하여 유전자전이된 동물, 특히 마우스 등의 동물을 생산하는 방법은 당해 분야에 통상적이며, 이는 예를 들어, 문헌(참조: 미국 특허 제 4,736,866호 및 제4,870,009호, 미국 특허 제 4,873,191호 및 Hogan, Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)에 기재되어 있다. 해당 동물의 조직이나 세포에서 GAVE6 mRNA를 발현하고/하거나 게놈 내에 전이유전자를 갖는기타 유전자전이된 동물을 생산하기 위한 유사한 방법이 사용된다. 이어서, 유전자전이된 원조 동물을 사용하여 전이유전자를 수반하는 추가의 동물을 양육할 수 있다. 더욱이, GAVE6을 암호화하는 전이유전자를 수반하는 유전자전이된 동물은 기타 전이유전자를 수반하는 기타 유전자전이된 동물을 추가로 양육할 수 있다.

상동 재조합 동물을 생산하기 위해, 결실, 부가 또는 치환이 도입됨으로써 GAVE6 유전자를 변화(예를 들면, 기능적으로 붕괴)시킨 GAVE6 유전자의 적어도 일정 부분(예: GAVE6 유전자, 예를 들면, 쥐과 GAVE6 유전자의 사람 또는 비-사람 상동체)을 함유하는 벡터를 제조한다. 특정 양태에서는, 상동 재조합시 내인성 GAVE6 유전자가 기능적으로 붕괴되도록 하는 벡터를 고안한다(즉, 더 이상 기능적 단백질을 발현하지 않는다; "녹 아웃(knock out)" 벡터로서 지칭되기도 함).

또 다른 한편으론, 상동 재조합시 내인성 GAVE6 유전자를 돌연변이시키거나 변화시키지만 기능적 단백질은 여전히 발현하도록 하는 벡터를 고안할 수 있다(예를 들어, 상류 조절 영역을 변화시킴으로써 내인성 GAVE6 단백질의 발현을 변화시킬 수 있다).

상기 상동 재조합 벡터에서는, 상기와 같이 변화된 GAVE6 유전자 부분을 GAVE6 유전자의 부가 핵산 서열에 의해 5’ 및 3’ 말단에 플랭킹하여, 배아 줄기 세포 내의 내인성 GAVE6 유전자와 상기 벡터에 의해 수반된 외인성 GAVE6 유전자 간에 상동 재조합이 일어나도록 할 수 있다. 부가의 플랭킹 GAVE6 핵산 서열은 내인성 유전자와의 성공적인 상동 재조합을 위한 충분한 길이를 갖는다. 전형적으로, 플랭킹 DNA(5’ 말단과 3’ 말단 모두에서) 수 킬로 염기가 벡터 내에 포함된다(상동 재조합 벡터에 관한 설명은, 예를 들어, Thomas 등, Cell (1987) 51:503을 참조한다).

상기 벡터를 배아 줄기 세포주 내로 도입하고(예를 들면, 전기천공에 의함), 도입된 GAVE6 유전자를 내인성 GAVE6 유전자와 상동적으로 재조합시킨 세포를 선별한다(참조: 예를 들면, Li 등, Cell (1992) 69:915). 이어서, 이와 같이 선별된 세포를 특정 동물(예: 마우스)의 포배낭에 주사하여 응집 키메라를 형성한다(참조: 예를 들면, Bradley in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Robertson, ed., IRL, Oxford, (1987) pp. 113l52). 이어서, 키메라 배아를 적합한 가임신 암컷 양육 동물에 이식할 수 있으며, 배아는 이에 따른다. 상동적으로 재조합된 DNA를 줄기 세포에 지니고 있는 자손을 이용하여, 동물의 모든 세포가 전이유전자의 생식세포(germline) 전달에 의해 상동적으로 재조합된 DNA를 함유하는 동물을 양육할 수 있다.

상동 재조합 벡터와 상동 재조합 동물의 작제 방법이 문헌(참조: Bradley, Current Opinion in Bio/Technology (1991) 2:823-829 및 PCT 공보 제WO 90/11354호, 제WO 91/01140호, 제WO 92/0968호 및 제WO 93/04169호)에 추가로 기재되어 있다.

또 다른 양태에서는, 전이유전자의 조절된 발현을 허용해주는 선별 시스템을 함유하는 유전자전이된 비-사람 동물을 생산할 수 있다. 이러한 시스템의 한 가지 예가 박테리오파아지 P1의 cre/loxP 레컴비나제(recombinase) 시스템이다. cre/loxP 레컴비나제 시스템에 관한 기재 내용은 문헌(예를 들면, Lakso 등, ProcNatl Acad Sci USA (1992) 89:6232-6236)을 참조할 수 있다. 레컴비나제 시스템의 또 다른 예는 에스. 세레비지애의 FLP 레컴비나제 시스템(참조: O'Gorrnan 등, Science (1991) 251:1351-1355)이다. cre/loxP 레컴비나제 시스템을 사용하여 전이유전자의 발현을 조절하는 경우에는, cre 레컴비나제와 선별된 단백질 둘 다를 암호화하는 전이유전자를 함유하는 동물이 요구된다. 이러한 동물은 "이중" 유전자전이된 동물을 작제함으로써, 예를 들면, 2마리의 유전자전이된 동물(한 마리는 선별된 단백질을 암호화하는 전이유전자를 함유하고, 다른 한 마리는 레컴비나제를 암호화하는 전이유전자를 함유한다)을 교배함으로써 제공될 수 있다.

본원에 기재된 비-사람 유전자전이된 동물의 클론은 문헌(Wilmut 등, Nature (1997) 385:810813 및 PCT 공보 제WO 97/07668호 및 제WO 97/07669호)에 기재된 방법에 따라서 생성할 수도 있다. 간략하게 언급하면, 유전자전이된 동물로부터 유래된 특정 세포, 예를 들면, 체 세포를 분리하고, 이것이 성장 주기를 벗어나서 G₀기로 유입되도록 유도할 수 있다. 이어서, 전기적 펄스를 사용함으로써, 휴지기 세포를 분리시킨 바와 동일한 종의 동물로부터 유래된, 핵이 제거된 난모 세포에 상기 휴지기 세포를 융합시킬 수 있다. 이어서, 이와 같이 재작제된 난모 세포를 배양하여 상실배(morula) 또는 포배낭이 발생하도록 한 다음, 이를 가임신 암컷 양육 동물에 전이시킨다. 이러한 암컷 양육 동물의 자손은 상기 세포(예: 체 세포)를 분리시킨 동물의 클론일 것이다.

약제학적 조성물

본 발명의 GAVE6 핵산 분자, GAVE6 단백질 및 항-GAVE6 항체(본원에서 "활성 화합물"로서 지칭되기도 함)를 투여에 적합한 약제학적 조성물 내로 혼입할 수 있다. 이러한 조성물은 전형적으로, 핵산 분자, 단백질 또는 항체와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "약제학적으로 허용되는 담체"란 약제학적 투여에 적합한 모든 용매, 분산 매질, 피복제, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 의미한다. 약제학적 활성 물질에 대한 이들 매질과 제제의 용도는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 통상적인 매질 또는 제제가 활성 화합물과 적합하지 않은 경우를 제외하고는, 조성물에 있어서의 이의 용도가 고려된다. 보충적 활성 화합물을 해당 조성물 내로 혼입시킬 수도 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 의도하는 투여 경로에 적합하도록 제형화시킨다. 투여 경로의 예로는 비경구, 예를 들면, 정맥내, 피내, 피하, 경구(예: 흡입), 경피(국소), 경점막 및 직장 투여가 있다. 비경구, 피내 또는 피하 투여용으로 사용되는 용제 또는 현탁제는 다음 성분들을 포함할 수 있다: 멸균성 희석제, 예를 들면, 주사용 수, 식염 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매; 항균제, 예를 들면, 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 산화방지제, 예를 들면, 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이트제, 예를 들면, EDTA; 완충제, 예를 들면, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트; 및 긴장도 조정제, 예를 들면, 염화나트륨 또는 덱스트로즈. HCl 또는 NaOH 등의 산 또는 염기를 사용하여 pH를 조정할 수 있다. 이러한 비경구 제제를 유리 또는 플라스틱으로만든 앰풀, 1회용 주사기 또는 다중 용량 바이알에 봉입할 수 있다.

주사용으로 적합한 약제학적 조성물에는 멸균성 수성 용제(수 혼화성) 또는 분산제, 및 멸균성 주사 용제 또는 분산제의 즉석 제조용 멸균성 산제가 포함된다. 정맥내 투여에 적합한 담체로는 생리 식염수, 정균용 수, "CREMOPHOR EL"(BASF; Parsippany, NJ) 또는 인산염 완충 식염수(PBS)가 있다. 모든 경우에 있어, 상기 조성물은 멸균성이어야만 하고, 용이하게 주사할 수 있을 정도로 유체여야 한다. 상기 조성물은 제조와 저장 조건 하에서 안정해야만 하고, 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보존해야만 한다. 상기 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예: 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들어, 레시틴과 같은 피복물을 사용하고, 분산제의 경우에는 요구하는 입자 크기를 유지시키며, 계면활성제를 사용함으로써, 적당한 유체도를 유지시킬 수 있다. 각종 항균제와 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 미생물 작용을 방지시킬 수 있다. 많은 경우에 있어, 등장성 제제, 예를 들면, 당, 폴리알코올, 예를 들면, 만니톨, 솔비톨 또는 염화나트륨을 해당 조성물 내에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 해당 조성물 내에 포함시킴으로써, 주사용 조성물의 흡수 연장을 유발시킬 수 있다.

멸균성 주사 용제는 필요량의 활성 화합물(예: GAVE6 단백질, 이의 변이체, 또는 이의 동족체 또는 유도체; 또는 항-GAVE6 항체)을 필요에 따라 상기 예시된성분들 중의 한 가지 성분 또는 이들 성분의 조합물과 함께 적당한 용매에 혼입한 다음, 여과 멸균시킴으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산제는 활성 화합물을 염기성 분산 매질과 상기 예시된 것들 중에서 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균성 비히클 내로 혼입함으로써 제조한다. 멸균성 주사 용제를 제조하기 위한 멸균성 산제의 경우에 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조시켜, 앞서 멸균성 여과된 용제로부터의 목적하는 임의의 부가 성분과 활성 성분을 함유하는 산제를 형성하는 것이다.

경구용 조성물은 일반적으로, 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 이러한 조성물은 젤라틴 캡슐에 봉입시키거나 또는 정제로 압축시킬 수 있다. 경구 치료 투여를 위해서는, 활성 화합물을 부형제와 함께 혼입하고, 이를 정제, 트로키제 또는 캅셀제의 형태로 사용할 수 있다. 구강 세정제로서 사용하기 위해서는 유체 담체를 사용하여 경구 조성물을 제조할 수도 있는데, 이러한 유체 담체 중의 화합물은 경구적으로 투여하고 뱉어내거나 삼킬 수 있다.

약제학적으로 부합되는 결합제 및/또는 애주번트 물질이 상기 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 환제, 캅셀제, 트로키제 등은 유사한 성질의 다음 성분 또는 화합물을 포함할 수 있다: 결합제, 예를 들면, 미세 결정성 셀룰로즈, 트라가칸드 검 또는 젤라틴; 부형제, 예를 들면, 전분 또는 락토즈; 붕해제, 예를 들면, 알긴산, 프리모겔 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예를 들면, 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로테스; 활탁제, 예를 들면, 콜로이드성 이산화규소; 감미제, 예를 들면, 슈크로즈 또는 삭카린; 또는 향미제, 예를 들면, 페퍼민트, 메틸 살리실레이트또는 오렌지 향료. 흡입 투여의 경우에는, 적합한 추진제, 예를 들면, 이산화탄소와 같은 기체 또는 분무기를 함유하는 가압 용기 또는 투약기로부터 에어로솔 분무 형태로 본 발명의 화합물을 전달한다.

전신 투여는 경점막 또는 경피 수단에 의해 수행될 수 있다. 경점막 또는 경피 투여의 경우, 침투하고자 하는 장벽에 적당한 침투제가 해당 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있고, 경점막 투여에 사용하기 위한 이의 예로는 세정제, 담즙 염 및 푸시드 산 유도체가 있다. 비내 분무제 또는 좌제를 사용함으로써 경점막 투여를 수행할 수 있다. 경피 투여의 경우에는, 활성 화합물을 당해 분야에 일반적으로 공지된 바와 같은 연고, 고약, 젤 또는 크림으로 제형화한다.

본 발명의 화합물은 직장 전달용 좌제(예를 들면, 통상적인 좌제용 기재, 예를 들면, 코코아 버터 및 기타 글리세라이드를 포함한다) 또는 정체 관장제 형태로 제조할 수도 있다.

특정 양태에서는, 활성 화합물이 신체로부터 신속하게 제거되는 것을 방지해줄 담체와 함께 상기 화합물을 제조하는데, 예를 들면, 임플란트(implant) 및 미세피포성(microencapsulated) 전달 시스템을 포함한 서방출 제형으로 만든다. 생분해 가능하면서 생체 적합한 중합체, 예를 들면, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산을 사용할 수 있다.

상기 제형의 제조 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 상기 물질은 공급원(Alza Corporation 및 Nova Pharmaceuticals, Inc.)으로부터 상업적으로 수득할 수도 있다. 리포솜성 현탁제(모노클로날 항체를 사용하여 감염된 세포에 표적화시킨 리포솜을 포함함)를 약제학적으로 허용되는 담체로서 사용할 수도 있다. 이들은 예를 들어, 미국 특허 제4,522,811호에 기재된 바와 같이, 당업자에게 공지된 방법에 따라서 제조할 수 있다.

투여를 용이하게 하고 투여량을 균일하게 하기 위해서는 경구 또는 비경구 조성물을 단위 투여 형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 바와 같은 단위 투여 형태는 치료하고자 하는 피험체에 대한 단일 투여형으로서 적당한, 물리적으로 별개의 단위를 지칭하고; 각 단위는 요구되는 약제학적 담체와 연합해서 목적하는 치료 효과를 제공하도록 산정된 예정량의 활성 화합물을 함유한다. 질병의 유형과 중증도에 따라서, 1회 이상의 별개의 투여가 이루어지든 아니면 연속적인 주입이 이루어지든지 간에, 환자에 대한 초기 후보 투여량은 화합물 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들면, 0.1 내지 20 mg/kg) 일 수 있다. 전형적인 1일 투여량 범위는 상기 언급된 요인들에 따라서 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 이상일 수 있다. 수 일 동안 또는 그 이상의 기간 동안 반복해서 투여하는 경우에는 상태에 따라서 목적하는 질병 증상 억제가 이루어질 때까지 치료를 지속적으로 수행한다. 그러나, 기타 투여 용법이 유용할 수도 있다. 통상적인 기술과 검정을 이용하여 치료 과정을 용이하게 모니터한다. 투약 용법의 예가 WO 94/04188에 기재되어 있다. 본 발명의 단위 투여 형태에 대한 상세한 셜명은 활성 화합물의 독특한 특징 및 달성하고자 하는 특정한 치료 효과와, 개개인 치료를 위해 그러한 활성 화합물을 배합하는 당업계에서 고유한 제한 사항에 직접적으로 좌우되고 이러한 요인들에영향을 받는다.

더욱이, 본 발명의 핵산 분자를 벡터 내로 삽입하고, 이를 유전자 요법 벡터로서 사용할 수 있다. 이러한 유전자 요법 벡터를, 예를 들어, 정맥내 주사, 국부 투여(미국 특허 제5,328,470호) 또는 정위 고정성(stereotactic) 주사(참조: 예를 들면, Chen 등, Proc Natl Acad Sci USA (1994) 91:30543057)에 의해 특정 피험체에게 전달할 수 있다. 상기 유전자 요법 벡터의 약제학적 제제는 유전자 요법 벡터를 허용되는 희석제 중에 포함할 수 있거나, 또는 유전자 전달 비히클이 내포된 서 방출 매트릭스를 포함할 수 있다. 또 다른 한편으론, 완전한 유전자 전달 벡터를 재조합 세포(예: 레트로바이러스성 벡터)로부터 본래 형태로 제조할 수 있는 경우에는, 약제학적 제제가 유전자 전달 시스템을 생성시키는 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 투여에 대한 지시 사항과 함께 용기, 팩 또는 투약기 내에 포함될 수 있다.

본 발명의 용도 및 방법

본 발명의 핵산 분자, 단백질, 단백질 상동체, 항체, 및 이들 잔기의 단편을 다음 방법들 중의 한 가지 이상의 방법에 사용할 수 있다: a) 스크리닝 검정; b) 탐지 검정(예: 염색체성 지도화, 조직 형별 검사, 법의학적 생물학); c) 예보 의학(예: 진단 검정, 예후 검정, 임상 시험 모니터링 및 약리게놈학); 및 d) 치료 방법(예: 치료 및 예방). GAVE6 단백질은 기타 세포성 단백질과 상호작용하므로,(i) 세포성 증식의 조절; (ii) 세포성 분화의 조절; 및 (iii) 세포 생존의 조절에 사용될 수 있다. 본 발명의 분리된 핵산 분자를 사용하여 GAVE6 단백질을 발현할 수 있고(예를 들면, 유전자 요법 적용에서 숙주 세포 내에서의 재조합 발현 벡터를 통하여 이루어짐), (예를 들어, 생물학적 샘플 중에서) GAVE6 mRNA를 탐지하거나 GAVE6 유전자 내의 유전적 병변을 탐지할 수 있으며, GAVE6 활성을 조정할 수 있다. 또한, GAVE6 단백질을 사용하여 GAVE6 활성 또는 발현을 조정하는 약물 또는 화합물을 스크리닝할 수 있을 뿐만 아니라 GAVE6 단백질의 불충분하거나 과도한 생성을 특징으로 하는 장애를 치료할 수 있다. 본 발명에 따라서, GAVE6 야생형 단백질에 비해 질병에 걸렸거나 이상한 활성을 지닌 GAVE6 단백질 형태 생성에 대한 스크리닝을 수행할 수도 있다. 또한, 본 발명의 항-GAVE6 항체를 사용하여 GAVE6 단백질을 탐지 및 분리할 수 있고, GAVE6 활성을 조정할 수 있다. 본 발명은 추가로, 상기 언급된 스크리닝 검정에 의해 동정된 신규한 제제, 및 본원에 기재된 바와 같은 치료에 대한 이의 용도에 관한 것이다.

스크리닝 검정

내인성 리간드의 존재하에 G 단백질 수용체를 활성화시키면 G 단백질 수용체 복합체가 형성되고, 이때 G 단백질에 대한 GTP의 결합이 유발된다. G 단백질의 GTPase 도메인은 GTP를 GDP로 서서히 가수분해시켜, 정상 조건 하에서 수용체 탈활성화를 가져다 준다. 그러나, 구성적 활성화된 수용체는 GDP를 GTP로 지속적으로 가수분해시킨다.

G 단백질의 비-가수분해 가능한 기질 [³⁵S]GTPγS을 사용하여, 구성적 활성화 수용체를 발현하는 막에 대한 결합 증강을 모니터할 수 있다. 트레이노(Traynor)와 나호르스키(Nahorski)는 [³⁵S]GTPγS를 사용하여 리간드의 존재 및 부재하에서 막에 대한 G 단백질 커플링을 모니터할 수 있다고 보고하였다(참조: Traynor 등, Mol Pharmacol (1995) 47(4):848-54). 이러한 검정 시스템의 바람직한 용도는 후보 화합물의 초기 스크리닝인데, 이는 상기 시스템이 상기 수용체와 결합하는 특정한 G 단백질에 상관없이 모든 G 단백질-커플링된 수용체에 총칭적으로 적용될 수 있기 때문이다.

Gs₂₀은 효소 아데닐릴 사이클라제를 자극하는 반면, G_i과 G_o는 이 효소를 억제한다. 당해 분야에 널리 공지된 바와 같이, 아데닐릴 사이클라제는 ATP가 cAMP로 전환되는 것을 촉매하므로; G_s단백질과 커플링되는 구성적 활성화 GPCR는 cAMP의 세포성 수준 증가와 연관이 있다. 또 다른 한편으론, G_i(또는 G_o) 단백질과 커플링될 수도 있는 구성적 활성화 GCPR는 cAMP의 세포성 수준 감소와 연관이 있다(참조: "Indirect Mechanism of Synaptic Transmission," 제 8자, Neuron to Brain (3rd Ed.), Nichols 등 eds., Sinauer Associates, Inc., 1992). 따라서, cAMP를 탐지해 주는 검정을 이용하여, 후보 화합물이 해당 수용체에 대한 역 효능제인지를 결정할 수 있다. cAMP를 측정하는 것으로 당해 분야에 공지된 각종 접근법을 활용할 수 있다. 한 양태에서는, 항-cAMP 항체를 ELISA-이용 포맷에 사용한다. 또 다른 양태에서는, 완전 세포 제2 메신저 리포터 시스템 검정이 고려된다(참조: PCT 공보 제WO 00/22131호).

관련 국면에서는, 사이클릭 AMP가 cAMP-반응성 DNA 결합 단백질 또는 전사 인자(CREB)의 결합을 증진시킨 다음, cAMP 반응 요소로 불리우는 특이적 위치에서 프로모터와 결합하고, 유전자의 발현을 구동시킴으로써 유전자 발현을 구동한다. 따라서, 리포터 유전자, 예를 들면, β-갈락토시다제 또는 루시퍼라제 앞에 다중 cAMP 반응 요소를 함유하는 프로모터를 갖는 리포터 시스템을 작제할 수 있다. 추가로, 구성적 활성화 G_s-연결된 수용체가 cAMP의 축적을 유발시킴에 따라, 이러한 수용체가 상기 유전자를 활성화시키고 리포터 단백질의 발현을 활성화시킨다. 이어서, 표준 생화학 검정을 이용하여, β-갈락토시다제 또는 루시퍼라제 등의 리포터 단백질을 탐지할 수 있다(PCT 공보 제WO 00/22131호).

기타 G 단백질, 예를 들면, G_o및 G_q는 2가지 세포내 메신저, 즉 디아실글리세롤(DAG)과 이노시톨 1,4,5-트리포스페이트(IP3)를 방출시키면서 인지질 PIP2를 가수분해시키는 효소인 포스포리파제 C의 활성화와 연관이 있다. IP3의 축적 증가는 G_q-관련 수용체와 G_o-관련 수용체의 활성화와 연관이 있다 (PCT 공보 제WO 00/22131호). IP3 축적을 탐지해 주는 검정을 이용하여, 후보 화합물이 G_q-관련 수용체 또는 G_o-관련 수용체에 대한 역 효능제인지를 결정할 수 있다. G_q-의존성 포스포리파제 C가 AP1 요소 함유 유전자의 활성화를 유발시키는지를 결정해주는 AP1 리포터 검정을 사용하여, G_q-관련 수용체를 검사할 수도 있다. 따라서, 활성화된 G_q-관련 수용체는 상기 유전자의 발현 증가를 입증해줌으로써, 역 효능제가 이러한 발현 저하를 입증해줄 것이다.

GAVE6 단백질과 결합하거나 또는, 예를 들어, GAVE6 발현 또는 GAVE6 활성에 대한 자극 또는 억제 효과를 나타내는 조정제, 즉 후보 또는 시험 화합물 또는 제제(예: 펩티드, 펩티드-모사체, 작은 분자 또는 기타 약물)을 동정하는 방법(본원에서 "스크리닝 검정"으로 지칭되기도 함)이 본원에 또한 제공된다.

한 양태에서는, 본 발명이 막-결합된 형태의 GAVE6 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 활성 부분의 활성을 조정해 주거나 이와 결합하는 후보 또는 시험 화합물을 스크리닝하는 검정법을 제공한다. 본 발명의 시험 화합물은 당해 분야에 공지된 조합 라이브러리 방법에서의 수 많은 접근법을 사용하여 수득할 수 있으며, 이러한 방법에는 생물학적 라이브러리; 공간적으로 번지 지정 가능한 병렬식 고체 상 또는 용액 상 라이브러리; 데컨벌루션(deconvolution)을 요구하는 합성 라이브러리 방법; "원-비드 원-화합물(one-bead-one-compound)" 라이브러리 방법; 및 친화 크로마토그래피 선별을 사용하는 합성 라이브러리 방법이 포함된다. 생물학적 라이브러리 접근법은 펩티드 라이브러리로 한정되는 반면, 기타 4가지 접근법은 펩티드, 비-펩티드 올리고머 또는 화합물의 작은 분자 라이브러리에 적용될 수 있다 (Lam, Anticancer Drug Des (1997) 12:145).

분자 라이브러리 합성법의 예가 예를 들어, 다음 문헌에 보고되었다(참조:DeWitt 등, Proc Natl Acad Sci USA (1993) 90:6909; Erb 등, Proc Natl Acad Sci USA (1994) 91:11422; Zuckermann 등, J Med Chem (1994) 37:2678; Cho 등, Science (1993) 261:1303; Carrell 등, Angew Chem Int Ed Engl (1994) 33:2059; Carell 등, Angew Chem Int Ed Engl (1994) 33:2061; 및 Gallop 등, J Med Chem (1994) 37:1233).

화합물의 라이브러리는 용액 중(예를 들면, Houghten Bio/Techniques (1992) 13:412421) 또는 비드 상(Lam, Nature (1991) 354:82-84), 칩들 (Fodor, Nature (1993) 364:555-556), 세균 (미국 특허 제5,223,409호), 포자 (미국 특허 제5,571,698호; 제5,403,484호; 및 제5,223,409호), 플라스미드 (Cull 등, Proc Natl Acad Sci USA (1992) 89:1865-1869) 또는 파아지 (Scott 등, Science (1990) 249:386-390; Devlin, Science (1990) 249:404-406; Cwirla 등, Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87:6378-6382; 및 Felici, J Mol Biol (1991) 222:301-310) 상에 존재할 수 있다.

본 발명의 특정 양태에서, 세포 표면 상에 막-결합된 형태의 GAVE6 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분을 발현하는 세포를 시험 화합물과 접촉시키고, GAVE6 단백질과 결합하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 세포-이용 검정이 사용되는 검정이다. 상기 세포는, 예를 들어, 효모 세포이거나 포유류 기원 세포일 수 있다. GAVE6 단백질과 결합하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 것은, 예를 들어, 시험 화합물을 방사성 동위원소 또는 효소적 표지물과 커플링시켜 복합체 중의 표지된 화합물을 탐지함으로써 GAVE6 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분에 대한 시험 화합물의 결합을 결정함으로써 수행할 수 있다. 예를 들어, 시험 화합물을¹²⁵I,³⁵S,¹⁴C 또는³H 로 직접 또는 간접적으로 표지시킬 수 있고, 이러한 방사성 동위원소는 방사성 방출량을 직접적으로 계수하거나 신틸레이션 계수함으로써 탐지하였다. 또 다른 방법으로는, 시험 화합물을, 예를 들어, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타제 또는 루시퍼라제로 효소적으로 표지시킬 수 있으며, 이러한 효소적 표지물은 적당한 기질이 생성물로 전환되는 것을 결정함으로써 탐지하였다. 특정 양태에서는, 상기 검정이 세포 표면 상에서 막-결합된 형태의 GAVE6 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분을 발현하는 세포를 GAVE6와 결합하는 공지된 화합물과 접촉시켜 검정 혼합물을 형성하는 단계; 이러한 검정 혼합물을 시험 화합물과 접촉시키는 단계; 및 GAVE6 단백질과 상호작용하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 단계를 포함하는데, GAVE6 단백질과 상호작용하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 단계는 공지된 화합물과 비교해서 GAVE6 또는 이의 생물학적 활성 부분과 우선적으로 결합하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 것을 포함한다.

또 다른 양태에서는, 세포 표면 상에 막-결합된 형태의 GAVE6 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분을 발현하는 세포를 시험 화합물과 접촉시키는 단계; 및 GAVE6 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분의 활성을 조정(예: 자극 또는 억제)하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 단계를 포함하는 세포-이용 검정이 사용된다. GAVE6 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분의 활성을 조정하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 단계는 예를 들어, GAVE6 표적 분자와 결합하거나 이와 상호작용하는 GAVE6 단백질의 능력을 평가함으로써 수행할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "표적 분자"는 본래 GAVE6 단백질과 결합하거나 상호작용하는 분자, 예를 들면, GAVE6 단백질을 발현하는 세포 표면 상의 분자, 제2 세포 표면 상의 분자, 세포외 환경 하의 분자, 세포막 내부 표면과 연합된 분자 또는 세포질성 분자이다. GAVE6 표적 분자는 본 발명의 GAVE6 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 비- GAVE6 분자일 수 있다. 한 양태에서는, GAVE6 표적 분자가 세포막을 통하고 세포 내로의 세포외 시그널(예를 들면, 막-결합된 GAVE6 분자에 대한 특정 화합물의 결합에 의해 생성된 시그널)의 전달을 촉진시켜 주는 시그널 전달 경로의 한 성분이다. 표적은, 예를 들어, 촉매적 활성을 지니는 제2 세포간 단백질, 또는 GAVE6와 하류 시그널링 분자의 연합을 촉진시켜 주는 단백질일 수 있다.

GAVE6 표적 분자와 결합하거나 이와 상호작용하는 GAVE6 단백질의 능력을 결정하는 것은 직접적인 결합을 결정하기 위한 상기 언급된 방법들 중의 한 가지 방법에 의해 수행할 수 있다. 특정 양태에서는, GAVE6 표적 분자와 결합하거나 이와 상호작용하는 GAVE6 단백질의 능력을 결정하는 것이 표적 분자의 활성을 결정함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 표적 분자의 활성은 표적의 세포성 제2 메신저(예: 세포내 Ca²⁺, 디아실글리세롤, IP3 등)의 유도를 탐지하거나, 적당한 기질 상에서의 표적의 촉매적/효소적 활성을 탐지하거나, 리포터 유전자(예를 들면, 탐지 가능한 마커, 예를 들면, 루시퍼라제를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 GAVE6-반응성 조절 요소)의 유도를 탐지하거나, 또는 세포성 반응, 예를 들면, 세포성 분화 또는 세포 증식을 탐지함으로써 결정할 수 있다.

본 발명은 추가로, GAVE6 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분을 시험 화합물과 접촉시키는 단계; 및 GAVE6 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분과 결합하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 단계를 포함하는 무세포 검정을 포괄한다. GAVE6 단백질에 대한 시험 화합물의 결합은 상기 언급된 바와 같이 직접 또는 간접적으로 결정할 수 있다. 바람직한 양태에서는, 상기 검정이 GAVE6 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분을 GAVE6와 결합하는 공지된 화합물과 접촉시켜 검정 혼합물을 형성하는 단계; 이러한 검정 혼합물을 시험 화합물과 접촉시키는 단계; 및 GAVE6 단백질과 상호작용하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 단계를 포함하는데, GAVE6 단백질과 상호작용하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 단계는 공지된 화합물과 비교해서 GAVE6 또는 이의 생물학적 활성 부분과 우선적으로 결합하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 것을 포함한다.

본 발명의 또 다른 무세포 검정은 GAVE6 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분을 시험 화합물과 접촉시키는 단계; 및 GAVE6 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분의 활성을 조정(예: 자극 또는 억제)하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 단계를 포함한다. GAVE6의 활성을 조정하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 단계는 예를 들어, 직접적인 결합을 결정하는 것으로 상기 언급된 방법들 중의 한 가지 방법에 의해 GAVE6 표적 분자와 결합하는 GAVE6 단백질의 능력을 평가함으로써 수행할 수 있다. 대체 양태에서는, GAVE6의 활성을 조정하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 단계가 GAVE6 표적 분자를 추가로 조정하는 GAVE6 단백질의 능력을 결정함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 적당한 기질 상의 표적 분자의 촉매적/효소적 활성은 앞서 기재된 바와 같이 결정할 수 있다.

본 발명의 또 다른 무세포 검정은 GAVE6 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분을 GAVE6와 결합하는 공지된 화합물과 접촉시켜 검정 혼합물을 형성하는 단계; 이러한 검정 혼합물을 시험 화합물과 접촉시키는 단계; 및 GAVE6 단백질과 상호작용하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 단계를 포함한다. GAVE6 단백질과 상호작용하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 단계는 GAVE6 표적 분자와 우선적으로 결합하거나 이의 활성을 조정하는 GAVE6 단백질의 능력을 결정하는 것을 포함한다.

리간드 결합을 반드시 억제시키지는 않지만, 수용체의 구조적 변화를 유발시켜 G 단백질 결합, 또는 아마도 수용체 응집, 이량체화 또는 클러스터링(이로써 활성화가 유발될 수 있다)을 가능케 하는 비-리간드 분자에 의해 수용체를 활성화시킬 수 있다. 예를 들어, 세포 표면에 노출된 GAVE6의 각종 부위에 대해 항체를 생성시킬 수 있다. 이러한 항체는 예를 들어, cAMP 수준 또는 세포내 Ca⁺²수준을 모니터하는 것과 같은 표준 검정에 의해 결정된 바와 같이 G 단백질 연쇄증폭을 통하여 특정 세포를 활성화시킨다. 분자 지도화, 특히 에피토프 지도화가 관여하기 때문에, 모노클로날 항체가 바람직할 수 있다. 이러한 모노클로날 항체는 세포 표면에서 발현된 본래의 수용체와, 세포 표면에서 형성되는 것으로 공지된 펩티드 둘 다에 대해 생성될 수 있다. 미국 특허 제5,998,577호(Geysen 등)의 방법을 실시하여 다수의 관련 펩티드를 수득할 수 있다. GAVE6를 활성화시키는 것으로 밝혀진 항체를 변형시켜 GAVE6 활성화와 무관한 활성, 예를 들면, 보체 고정화를 최소화할 수 있다. 따라서, 항체 분자를 절단하거나 돌연변이시켜 GAVE6 활성화를 벗어난 활성을 최소화하거나 제거할 수 있다. 예를 들어, 특정 항체의 경우에는, 항원-결합 부위 만이 필요하다. 따라서, 항체의 Fc 부분을 제거할 수 있다.

GAVE6 발현 세포를 항체에 노출시켜 GAVE6를 활성화시킨다. 이어서, 활성화된 세포를 각종 분자에 노출시켜, 수용체 활성을 조정해줌으로써 보다 높은 활성화 수준 또는 보다 낮은 활성화 수준을 가져다 주는 분자를 동정한다. 이어서, 이들 목표를 달성해주는 분자를 대상으로 하여, 항체를 사용하지 않고 GAVE6 발현 세포 상에서 시험하여 비-활성화 세포에 대한 효과를 관찰할 수 있다. 이어서, 표적 분자를 시험하고, 공지된 기술을 사용하여 변화된 GAVE6 대사와 연관된 장애 치료용 후보 약물로서 상기 분자를 변형시킬 수 있다.

본 발명의 무세포 검정은 가용성 형태 GAVE6와 막-결합된 형태 GAVE6 둘 다의 사용에 적합하다. 막-결합된 형태의 GAVE6를 포함하는 무세포 검정의 경우에는, 막-결합된 형태의 GAVE6가 용액 중에서 유지되도록 가용화제를 활용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 가용화제의 예로는 비-이온성 세정제, 예를 들면, n-옥틸글루코시드, n-도데실글루코시드, n-도데실말토시드, 옥타노일-N-메틸글루카미드, 데카노일-N-메틸글루카미드, TRITON X-100, TRITON X-114, THESIT, 이소트리데실폴리(에틸렌 글리콜 에테르)_n, 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸아미노]-1-프로판 설포네이트 (CHAPS), 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸아미노]-2-하이드록시1프로판 설포네이트 (CHAPSO) 또는 N-도데실=N,N디메틸-3-암모니오1프로판 설포네이트가 있다.

본 발명의 상기 검정 방법의 한 가지 이상의 양태에서는, GAVE6 또는 이의 표적 분자를 고정화시켜, 하나 또는 둘 다의 단백질의 복합체-형성되지 않은 형태로부터 복합체-형성된 형태를 분리시키는 것을 촉진시킬 뿐만 아니라 해당 검정의 자동화를 도모하는 것이 바람직할 수 있다. 후보 화합물의 존재 및 부재하에서 GAVE6와 표적 분자와의 상호작용 또는 GAVE6에 대한 시험 화합물의 결합은 해당 반응물을 함유하는데 적합한 어떠한 용기 내에서도 수행할 수 있다. 이러한 용기의 예로는 미세역가 판, 시험 튜브 및 미세-원심분리기 튜브가 있다. 한 양태에서는, 하나 또는 둘 다의 단백질이 매트릭스에 결합되도록 할 수 있는 도메인이 부가된 융합 단백질이 제공될 수 있다. 예를 들어, 글루타치온-S-트랜스퍼라제/ GAVE6 융합 단백질 또는 글루타치온-S-트랜스퍼라제/표적 융합 단백질을 글루타치온 SEPHAROSE 비드 (Sigma Chemical, St. Louis, MO) 상에 흡착시킬 수 있다. 또 다른 한편으론, 글루타치온-유도체화 미세역가 판을 시험 화합물과 조합한다. 연속해서, 비-흡착된 표적 단백질 또는 GAVE6 단백질과 상기 혼합물을 복합체 형성 수행 조건(예: 염 및 pH에 대한 생리학적 조건) 하에 항온배양한다. 항온배양 후, 상기 비드 또는 미세역가 판 웰을 세척하여 결합되지 않은 모든 성분을 제거하고, 복합체 형성의 존재 여부를 직접 또는 간접적으로 측정한다. 또 다른 한편으론, 상기 복합체를 매트릭스로부터 분해시키고, 표준 기술을 사용하여 GAVE6 결합 또는 활성 수준을 결정한다.

매트릭스 상에 단백질을 고정화시키는 기타 기술을 본 발명의 스크리닝 검정에 사용할 수도 있다. 예를 들어, 바이오틴과 스트렙타비딘과의 접합 기술을 이용하여 GAVE6 또는 이의 표적 분자를 고정화시킬 수 있다. 바이오티닐화 GAVE6 또는 표적 분자는 당해 분야에 널리 공지된 기술(바이오티닐화 키트, Pierce Chemicals, Rockford, IL)을 사용하여 바이오틴-NHS(N-하이드록시-석신이미드)로부터 제조할 수 있고, 이를 스트렙타비딘-피복된 96-웰 판(Pierce Chemicals)의 웰에서 고정화시킬 수 있다. 또 다른 한편으론, GAVE6 또는 표적 분자와는 반응성이지만, 이러한 표적 분자에 대한 GAVE6 단백질의 결합을 방해하지 않는 항체를 상기 판의 웰에 대해 유도체화할 수 있다. 항온배양시, 결합되지 않은 표적 또는 GAVE6을 항체 접합에 의해 상기 웰에 트랩핑시킬 수 있다. GST-고정화 복합체에 대해 상기 언급된 방법 이외에도, 상기 복합체를 탐지하는 방법에는 GAVE6 또는 표적 분자와 반응성인 항체를 사용하여 복합체를 면역 탐지하는 방법 뿐만 아니라 GAVE6 또는 표적 분자와 연관된 효소적 활성을 탐지하는 것에 의존하는 효소 결합 검정법이 포함된다.

또 다른 양태에서는, 특정 세포를 후보 화합물과 접촉시키고, 이러한 세포에서의 GAVE6 mRNA 또는 단백질의 발현을 결정하는 방법으로 GAVE6 발현 조정제를 동정한다. 후보 화합물의 존재하에서의 GAVE6 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 후보 화합물의 부재하에서의 GAVE6 mRNA 또는 단백질의 발현 수준과 비교한다. 이어서, 이러한 비교에 근거하여 후보 화합물을 GAVE6 발현의 조정제로서 동정할 수 있다. 예를 들어, 후보 화합물의 존재하에서의 GAVE6 mRNA 또는 단백질의 발현이 후보 화합물의 부재하에서 보다 더 클 경우(통계상 유의적으로 더 클 경우), 이러한 후보화합물은 GAVE6 mRNA 또는 단백질 발현의 자극제 또는 효능제로서 동정된다. 또 다른 한편, 후보 화합물의 존재하에서의 GAVE6 mRNA 또는 단백질의 발현이 후보 화합물의 부재하에서 보다 더 적을 경우(통계상 유의적으로 더 적을 경우), 이러한 후보 화합물은 GAVE6 mRNA 또는 단백질 발현의 억제제 또는 길항제로서 동정된다. GAVE6 활성이 리간드 또는 효능제의 존재하에 또는 구성적 GAVE6에서 기준선 아래로 저하되는 경우에는, 후보 화합물이 역 효능제로서 동정된다. 세포에서의 GAVE6 mRNA 또는 단백질 발현 수준은 본원에 기재된 GAVE6 mRNA 또는 단백질의 탐지 방법에 의해 결정할 수 있다.

본 발명의 또 다른 국면에서는, GAVE6 단백질이 2-하이브리드 검정 또는 3-하이브리드 검정에서 "유인 단백질"로서 사용되어(참조: 예를 들면, 미국 특허 제5,283,317호; Zervos 등, Cell (1993) 72:223232; Madura 등, J Biol Chem (1993) 268:1204612054; Bartel 등, Bio/Techniques (1993) 14:920924; Iwabuchi 등, Oncogene (1993) 8:16931696; 및 PCT 공보 제WO 94/10300호), GAVE6과 결합하거나 이와 상호작용하는 기타 단백질("GAVE6-결합 단백질" 또는 "GAVE6-bp")과, GAVE6 활성을 조정하는 기타 단백질을 동정할 수 있다. 이러한 GAVE6-결합 단백질은 GAVE6 단백질, 예를 들면, GAVE6 경로의 상류 또는 하류 요소에 의해 시그널의 증식에 관여하는 것으로 예상되기도 한다.

본 발명이 대량의 순수한 GAVE6의 생성을 가능케 하기 때문에, 기능 영역으로 추정되는 영역의 입체 구조를 물리적으로 성상 확인하는 것은 합리적 약물 고안을 위해 확인 할 수 있다. 예를 들어, 해당 분자의 IC3 영역과 EC 도메인이 특히목적하는 영역이다. 특정 영역의 외형과 이온 입체 배치가 일단 분별되면, 이들 영역과 상호작용해야 하는 후보 약물을 입체 배치할 수 있으며, 그 다음 이를 본래의 세포, 동물 및 환자에게서 시험할 수 있다. 이러한 3-D 구조 정보를 유도할 수 있게 해주는 방법에는 X선 결정학, NMR 분광법, 분자 모델링 등이 포함된다. 이러한 3-D-구조는 유사한 입체 구조상 부위에서 작용하는 공지된 약물이 존재하는 경우에는 기타 공지된 단백질에서 상동성인 입체 구조상 부위를 동정할 수 있게 해준다. 이들 약물 또는 이의 유도체는 GAVE6와 함께 사용될 수 있다.

본 발명은 추가로, 상기 언급된 스크리닝 검정에 의해 동정된 신규한 제제, 및 본원에 기재된 바와 같은 치료에 사용하기 위한 이의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 검정

탐지 검정

본 발명의 DNA 서열의 부분 또는 단편을 수 많은 방법에서 폴리뉴클레오티드 시약으로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 이들 서열을 사용하여 (i) 염색체 상에 각각의 유전자를 지도화하여, 유전 질병과 연관된 유전자 영역의 위치를 확인하고; (ii) 미소한 생물학적 샘플로부터 개개인을 동정하며(조직 형별 검사); (iii) 특정 생물학적 샘플의 법의학적 동정을 도와줄 수 있다. 이들 적용 분야에 다음 준항목에 기재되어 있다.

1. 염색체 지도화

특정 유전자의 서열(또는 이러한 서열의 일정 부분)을 일단 분리시키면, 이 서열을 사용하여 염색체 상의 GAVE6 유전자의 위치를 지도화할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 GAVE6 핵산 분자 또는 이의 단편을 사용하여 게놈에서의 GAVE6의 위치를 지도화할 수 있다. 게놈, 특히 사람 게놈에서 GAVE6 서열의 위치를 지도화하는 것은 질병과 연관된 유전자와 이들 서열을 상관짓는데 있어 중요한 첫 번째 단계이다.

간략하게 언급하면, GAVE6 서열로부터 PCR 프라이머(바람직하게는 길이가 15 내지 25 bp인 프라이머)를 제조함으로서 GAVE6 유전자를 게놈에서 지도화할 수 있다. 이들 프라이머는 개개의 사람 염색체를 함유하는 체 세포 하이브리드를 PCR 스크리닝하는데 사용된다. GAVE6 서열에 상응하는 사람 유전자를 함유하는 하이브리드 만이 증폭된 단편을 생성시킨다.

상이한 포유류(예: 사람 및 마우스 세포)로부터 체 세포를 융합시킴으로써 체 세포 하이브리드를 제조한다. 사람과 마우스 세포의 하이브리드가 성장하고 분할함에 따라, 일반적으로는 사람 염색체가 무작위 순서로 상실되지만, 마우스 염색체는 보존된다. 마우스 세포는 성장할 수 없지만(특정 효소의 결여로 인함), 사람 세포는 성장할 수 있는 배지를 사용함으로써, 필요한 효소를 암호화한 유전자를 함유하는 하나의 사람 염색체가 보존될 것이다. 각종 배지를 사용함으로써, 하이브리드 세포주 패널을 정립시킨다. 패널 중의 각 세포주는 단일 사람 염색체 또는 소수의 사람 염색체와 완전 세트의 마우스 염색체를 함유하므로, 개개 유전자를 특이적 사람 염색체에 대해 용이하게 지도화할 수 있다(참조: D'Eustachio 등, Science(1983) 220:919924). 전좌(translocations)와 결실이 수반된 사람 염색체를 사용함으로써, 사람 염색체의 단편만을 함유하는 체 세포 하이브리드를 제조할 수도 있다.

체 세포 하이브리드를 PCR 지도화하는 것은 특정 서열을 특정한 염색체에 할당하기 위한 신속한 과정이다. 단일 열순환기를 사용하여 1일 3개 이상의 서열을 할당할 수 있다.

GAVE6 서열을 게놈 내의 특정한 염색체에 대해 지도화하는데 유사하게 사용될 수 있는 기타 지도화 전략에는 원위치(in situ) 하이브리드화(참조: Fan 등, Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87:622327), 표지된 플로우-분류된 염색체를 이용한 예비-스크리닝, 및 염색체-특이적 cDNA 라이브러리에 대한 하이브리드화에 의한 예비-선별법이 포함된다.

중기 염색체성 확산체에 대한 DNA 서열의 형광 원위치 하이브리드화(FISH)를 이용하여 정확한 염색체 위치 확인을 한 단계로 제공할 수 있다. 유사분열 방추를 붕괴시키는 화학물질, 예를 들면, 콜세미드(colcemid)에 의해 분할 과정을 중기에서 차단시킨 세포를 사용하여 염색체 확산체를 만들 수 있다. 이 염색체를 트립신으로 간단히 처리한 다음, 김사(Giemsa)로 염색할 수 있다. 밝은 밴드와 어두운 밴드 패턴이 각 염색체 상에 현상되어, 염색체를 가시적으로 확인할 수 있다. 500 또는 600개 염기 정도로 짧은 DNA 서열을 수반한 FISH 기술을 사용할 수 있다. 그러나, 1,000개 이상의 염기를 갖는 클론이, 간단한 탐지용으로 충분한 시그널 세기를 지닌 독특한 염색체 위치에 결합할 가능성이 더 크다. 바람직하게는 1,000개 염기,보다 바람직하게는 2,000개 염기가 합리적 시간 내에 우수한 결과를 가져다 줄 것이다. 이러한 기술에 대한 고찰은 다음 문헌을 참조할 수 있다(Verma 등 (Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques (Pergamon Press, New York, 1988)). 염색체 지도화는 로드 스코어 또는 단순한 인접도와 같은 통계적 고려 사항을 이용하여 실리코로(in silico) 추론할 수 있다

염색체 지도화용 시약을 개별적으로 사용하여 단일 부위를 염색체 상에 위치시킬 수 있다. 추가로, 다중 부위 및/또는 다중 염색체를 표식하기 위해 시약 패널을 사용할 수 있다. GAVE6 유전자의 플랭킹 영역에 상응하는 시약은 실제적으로, 지도화 목적에 바람직하다. 암호화 서열은 유전자 가계 내에서 더 잘 보존될 것으로 예상되므로, 염색체성 지도화 동안 교차 하이브리드화 기회가 증가된다.

특정 서열이 일단 정확한 염색체 위치로 지도화되면, 염색체 상의 상기 서열의 물리적 위치는 유전자 지도 데이터와 상관있을 수 있다. (이러한 데이터는, 예를 들어, McKusick, Mendelian Inheritance in Man에서 발견되고, 이는 Johns Hopkins University, Welch Medical Library 로부터 온라인으로 입수 가능하다). 이어서, 동일한 염색체 영역에 대해 지도화된, 유전자와 질병 간의 유연 관계를, 예를 들어, 문헌(Egeland 등, Nature (1987) 325:783-787)에 기재된 연관 분석(물리적으로 인접한 유전자의 공동-유전)을 통하여 확인할 수 있다.

더욱이, GAVE6와 관련된 질병에 걸린 개개인과 이 질병에 걸리지 않은 개개인 간의 DNA 서열 차이를 결정할 수 있다. 돌연변이가 질병에 걸린 개개인 중의 일부 또는 전부에게서는 관찰되지만, 질병에 걸리지 않은 개개인에게서는 전혀 관찰되지 않는 경우에는, 이러한 돌연변이가 해당 특정 질병의 유발 요인인 것으로 예상된다. 질병에 걸린 개개인과 질병에 걸리지 않은 개개인을 구별하는 일반적인 방식은 먼저, 염색체 확산체로부터 가시적이거나 DNA 서열에 근거한 PCR을 사용하여 탐지 가능한, 염색체 내의 구조적 변화(예: 결실 또는 전좌)를 관찰하는 것이다. 궁극적으로는, 여러 명으로부터의 유전자를 완전히 서열 분석하여 돌연변이의 존재 여부를 확인할 수 있고, 돌연변이를 다형성과 구별할 수 있다.

2. 조직 형별 검사

본 발명의 GAVE6 서열을 사용하여 미소한 생물학적 샘플로부터 개개인의 신원을 확인할 수 있다. 미국방성은, 예를 들어, 부서 요원의 신원을 확인하기 위해 제한 단편 길이 다형성(RFLP)의 사용을 고려중이다. 이러한 기술에서는, 개개인의 게놈 DNA를 하나 이상의 제한 효소로 분해시키고, 이를 서던 블롯 상에 프로빙하여 신원 확인을 위해 독특한 밴드를 생성시킨다. 이 방법을 사용하게 되면, 현재 사용하고 있는 "도그 태그(Dog Tag)"의 문제점, 즉 분실되거나 전환시켜야 하거나 도둑맞을 염려가 있어 확실한 신원 확인을 어렵게 만드는 문제점이 없어진다. 본 발명의 서열이 RFLP(미국 특허 제5,272,057호에 기재됨)에 대한 부가의 DNA 마커로서 유용하다.

추가로, 본 발명의 서열을 사용하여 개개인 게놈의 선택 부위의 실제적 염기별 DNA 서열을 결정해주는 대체 기술을 제공할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 GAVE6 서열을 사용하여 이러한 서열의 5’ 및 3’ 말단으로부터 2개의 PCR 프라이머를 제조할 수 있다. 이어서, 이들 프라이머를 사용하여 개개인의 DNA를 증폭시킬 수 있고, 연속해서 이의 서열을 제공할 수 있다.

상기 방식으로 제조된, 개개인으로부터의 상응하는 DNA 서열 패널은 독특한 개개인의 신원 확인을 제공할 수 있는데, 이는 대립유전자 차이로 인해 각 개개인이 독특한 DNA 서열 세트를 지닐 것이기 때문이다. 본 발명의 서열을 사용하여 개개인과 조직으로부터 상기 신원 확인용 서열을 수득할 수 있다. 본 발명은 GAVE6 서열은 사람 게놈 부위를 독특하게 나타낸다. 대립유전자 변이는 해당 서열의 암호화 영역에서 어느 정도 발생하지만, 비암호화 영역에서는 보다 높은 수준으로 발생된다. 개개인들 간의 대립유전자 변이는 500개 염기당 약 1회의 빈도수로 발생된다. 본원에 기재된 각각의 서열은 어느 정도는, 특정 개개인으로부터의 DNA를 신원 확인 목적으로 비교할 수 있게 해주는 기준(표준) 으로서 사용될 수 있다. 보다 많은 수의 다형성이 비-암호화 영역에서 발생하기 때문에, 개개인을 구별하는데 보다 적은 수의 서열이 필요하다. 서열 번호 1의 비-암호화 영역은 개개인의 확실한 신원 확인을 제공해줄 수 있는데, 이는 아마도 10 내지 1,000개 프라이머를 사용하여 증폭된 100개 염기 비-암호화 서열을 각각 생성시킨다. 예정된 암호화 서열, 예를 들어, 서열 번호 1에 제시된 서열을 사용한 경우, 개개인의 확실한 신원 확인을 위한 보다 적당한 수의 프라이머는 500 내지 2,000개일 것이다.

본원에 기재된 GAVE6 서열로부터의 시약 패널을 사용하여 특정 개개인에 대한 독특한 신원 확인 데이터베이스를 생성시킨 경우에는, 이들 동일 시약을 나중에 사용하여 상기 개개인으로부터의 조직을 동정할 수 있다. 독특한 신원 확인 데이터베이스를 사용하여, 극도로 작은 조직 샘플로부터도 (살아있거나 죽은) 개개인의 확실한 신원 확인을 수행할 수 있다.

3. 법의학적 생물학에 있어서의 부분 GAVE6 서열의 용도

DNA-이용한 신원 확인 기술을 법의학적 생물학에 사용할 수도 있다. 법의학적 생물학은 예를 들어, 범죄자의 신원을 확실하게 확인하기 위한 수단으로서 범죄 현장에서 발견된 생물학적 증거물의 유전자 형별 검사를 이용하는 과학 분야이다. 이러한 확인을 하기 위해서는, PCR 기술을 사용하여, 범죄 현장에서 발견된 극소량의 생물학적 샘플, 예를 들면, 조직(예: 모발 또는 피부), 또는 체액(예: 혈액, 타액 또는 정액)으로부터 발췌한 DNA 서열을 증폭시킬 수 있다. 이어서, 이와 같이 증폭된 서열을 표준 서열과 비교함으로써, 생물학적 샘플 기원을 확인할 수 있다.

본 발명의 서열을 사용하여 사람 게놈 내의 특이적 유전자 좌에 대해 표적화된 폴리뉴클레오티드 시약, 예를 들면, PCR 프라이머를 제공할 수 있는데, 이러한 시약은 DNA-이용한 법의학적 신원 확인의 신뢰성을 증강시킬 수 있다. 예를 들어, 목적하는 핵산은 또 다른 "신원 확인 마커"(즉, 특정한 개개인에 대해 독특한 또 다른 DNA 서열)를 제공할 수 있다. 앞서 언급한 바와 같이, 실제적 염기 서열 정보는 제한 효소 생성된 단편에 의해 형성된 패턴에 대한 정확한 대체물로서 신원 확인에 사용될 수 있다. 서열 번호 1의 비-암호화 영역에 대해 표적화된 서열이 상기 용도에 특히 적당한데, 이는 보다 많은 수의 다형성이 비-암호화 영역에서 발생되어, 상기 기술을 사용하여 개개인을 구별해주는 식별 과정을 증강시키기 때문이다.폴리뉴클레오티드 시약의 예에는 GAVE6 서열 또는 이의 부분이 포함되는데; 예를 들면, 20 또는 30개 이상의 염기 길이를 갖는 서열 번호 1의 비-암호화 영역으로부터 유도된 단편이다.

본원에 기재된 GAVE6 서열을 추가로 사용하여 폴리뉴클레오티드 시약, 예를 들어, 원위치 하이브리드화 기술에 사용할 수 있는 표지되거나 표지 가능한 프로브를 제공하여, 특이적 조직, 예를 들면, 뇌 조직을 동정할 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드 시약은 법의학 병리학자가 공지되지 않은 기원의 조직을 제시한 경우에 매우 유용할 수 있다. 이러한 GAVE6 프로브 패널을 사용하여 종 별 및/또는 기관 유형 별로 조직을 동정할 수 있다.

유사한 방식으로, 상기 시약, 예를 들면, GAVE6 프라이머 또는 프로브를 사용하여 조직 배양물에 대한 오염 여부를 스크리닝할 수 있다(즉, 배양물 내에 상이한 유형의 세포 혼합물이 존재하는지를 스크리닝한다).

B. 예보 의학

본 발명은 또한, 진단 검정, 예후 검정, 약리게놈학 및 임상 시험 모니터링이 개개인을 예방적으로 치료하기 위한 예후(예보) 목적으로 사용되는 예보 의학 분야에 속한다. 따라서, 본 발명의 한 국면은 생물학적 샘플(예: 혈액, 뇨, 배설물, 담, 혈청, 세포 및 조직) 맥락에서 GAVE6 활성 뿐만 아니라 GAVE6 단백질 및/또는 핵산 발현을 결정하기 위한 진단 검정에 관한 것이다. 이러한 검정을 사용하여 개개인이 GAVE6 비정상 발현 또는 활성과 연관된 질병이나 장애에 걸렸는지아니면 이러한 장애가 발생할 위험이 있는지를 결정할 수 있다.

본 발명은 또한, 특정 개개인에게 GAVE6 단백질, 핵산 발현 또는 활성과 연관된 장애가 발생할 위험이 있는지를 결정하기 위한 예후(또는 예보) 검정을 제공해준다. 예를 들면, GAVE6 유전자 내의 돌연변이를 생물학적 샘플에서 검정할 수 있다. 이러한 검정을 예후 또는 예보 목적으로 사용함으로써, GAVE6 단백질, 핵산 발현 또는 활성과 연관되거나 이를 특징으로 하는 장애 발병에 앞서 개개인을 예방적으로 치료할 수 있다.

본 발명의 또 다른 국면은 특정 개개인에게서 GAVE6 단백질, 핵산 발현 또는 GAVE6 활성을 결정함으로써 이러한 개개인에 대해 적당한 치료제 또는 예방제를 선별하는 방법을 제공해준다(본원에서 "약리게놈학"으로 지칭됨). 약리게놈학은 개개인의 유전형(예를 들면, 특정 제제에 반응하는 개개인의 능력을 결정하기 위해 검사된 개개인의 유전형)을 기준으로 하여 개개인을 치료적 또는 예방적으로 처치하기 위한 제제(예: 약물)를 선택할 수 있게 해준다.

본 발명의 또 다른 국면은 임상 시험에 있어서 GAVE6의 발현 또는 활성에 대한 제제(예: 약물 또는 기타 화합물)의 영향을 모니터링하는 것에 관한 것이다. 이들 및 기타 제제가 다음 항목에 보다 상세히 기재되어 있다.

1. 진단 검정

생물학적 샘플 중에 GAVE6이 존재 또는 부재하는 지를 탐지하기 위한 예시적 방법은 시험 피험체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 및 이러한 생물학적 샘플을, GAVE6 단백질을 암호화하는 GAVE6 단백질 또는 핵산(예: mRNA 또는 게놈 DNA)을 탐지할 수 있는 화합물 또는 제제와 접촉시켜 GAVE6의 존재가 상기 생물학적 샘플에서 탐지되도록 하는 단계를 포함한다. GAVE6 mRNA 또는 게놈 DNA를 탐지하는데 바람직한 제제는 GAVE6 mRNA 또는 게놈 DNA와 하이브리드화할 수 있는 표지된 핵산 프로브이다. 이러한 핵산 프로브는, 예를 들어, 완전한 길이의 GAVE6 핵산, 예를 들면, 서열 번호 1의 핵산 또는 이의 일정 부분, 예를 들면, 길이가 15, 30, 50, 100, 250 또는 500개 이상의 뉴클레오티드이고 GAVE6 mRNA 또는 게놈 DNA와 엄격한 조건 하에서 특이적으로 하이브리드화하기에 충분한 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 진단 검정에 사용하기 적합한 기타 프로브가 본원에 기재되어 있다.

GAVE6 단백질을 탐지하기 위한 특정한 제제는 GAVE6 단백질과 결합할 수 있는 항체, 바람직하게는 탐지 가능한 표지물을 갖는 항체이다. 항체는 폴리클로날, 키메라, 또는 보다 바람직하게는 모노클로날일 수 있다. 본래의 항체 또는 이의 단편(예를 들면, Fab 또는 F(ab')2)을 사용할 수 있다. "생물학적 샘플"이란 용어는 특정 피험체로부터 분리된 조직, 세포 및 생물학적 유체 뿐만 아니라 피험체 내에 존재하는 조직, 세포 및 유체를 포함한다. 즉, 본 발명의 탐지 방법을 사용하여 생체내 뿐만 아니라 시험관 내에서 생물학적 샘플 중의 GAVE6 mRNA, 단백질 또는 게놈 DNA를 탐지할 수 있다. 예를 들어, GAVE6 mRNA를 탐지하기 위한 시험관내 기술에는 노던 하이브리드화 및 원위치 하이브리드화가 포함된다. GAVE6 단백질을 탐지하기 위한 시험관내 기술에는 ELISA, 웨스턴 블롯, 면역침전 및 면역형광법이 포함된다. GAVE6 게놈 DNA를 탐지하기 위한 시험관내 기술에는 서던 하이브리드화가 포함된다. 추가로, GAVE6 단백질을 탐지하기 위한 생체내 기술에는 표지된 항-GAVE6 항체를 피험체 내로 도입하는 방법이 포함된다. 예를 들어, 상기 항체는 방사성 마커로 표지할 수 있고, 이의 피험체 내에서의 존재 여부 및 위치는 표준 영상화 기술에 의해 탐지할 수 있다.

특정 양태에서는, 생물학적 샘플이 시험 피험체로부터의 단백질 분자를 함유한다. 또 다른 한편으론, 생물학적 샘플이 시험 피험체로부터의 mRNA 분자 또는 시험 피험체로부터의 게놈 DNA 분자를 함유할 수 있다. 본원에 적용되는 특정한 생물학적 샘플은 피험체로부터 통상적인 수단에 의해 분리된 말초 혈액 백혈구이다.

따라서, 특정 질병과의 연관성, 및 담체 또는 병에 걸린지에 대해 진단해 주는 핵산 또는 단백질 다형성의 동정이 예후 또는 진단 검정 개발에 유리할 수 있다. 예를 들어, 류마티스성 관절염, 천식, 크론병 등에 대한 예후 또는 진단 검정을 나타내는 것이 유리할 수 있다. GAVE6 발현 수준은 활성화 상태 또는 염증 상태와 연관된 세포에서 상승한다. 염증과 관련된 장애에는 아나필락시성 상태, 대장염, 크론병, 부종 상태, 접촉성 과민성, 알레르기, 기타 형태의 관절염, 수막염, 및 기타 질환(여기서는 면역계가 혈관 확장, 열에 의해 손상 부위와 반응하여, 특정 부위에 세포, 유체 등을 모아 팽윤 등을 유발시킨다)이 포함된다. 따라서, GAVE6 대사 상의 장애는 류마티스성 관절염을 진단해줄 수 있다. 더욱이, 류마티스성 관절염의 분자 기전을 탐지할 수 있는데, 예를 들면, 특정 조직 샘플(예: 혈액 샘플)에서 탐지될 수 있는, 진단성 SNP, RFLP, 발현 수준 가변성, 기능 가변성 등이 존재할 수 있다.

또 다른 양태에서는, 상기 방법이 대조군 피험체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 이러한 대조군 샘플을, GAVE6 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA를 탐지할 수 있는 화합물 또는 제제와 접촉시켜, GAVE6 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA 의 존재 여부와 이의 양을 상기 생물학적 샘플에서 탐지하는 단계; 및 대조군 샘플 중에서의 GAVE6 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA 의 존재 여부와 이의 양을, 시험 샘플 중에서의 GAVE6 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 존재 여부와 이의 양과 비교하는 단계를 추가로 포함한다

화학적 라이브러리의 고 처리량 검정

GAVE6의 활성을 조정할 수 있는 화합물에 대한 임의의 검정이 고 처리량 스크리닝에 적합하다. 고 처리량 스크리닝 시스템은 시판중이다(참조: 예를 들면, Zymark Corp., Hopkinton, MA; Air Technical Industries, Mentor, OH; Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA; Precision Systems, Inc., Natick, MA,etc.). 이들 시스템은 전형적으로, 모든 샘플과 시약 피펫팅, 액체 투약, 시간 설정된 항온배양, 및 해당 검정에 적당한 탐지기(들)에서 미세판의 최종 판독을 포함한 전체 과정을 자동화한다. 입체 배치된 이들 시스템은 고 처리량의 신속한 출발을 제공해줄 뿐만 아니라 고도의 융통성과 소비자 요구에 맞춘다. 상기 시스템 제작자는 각종의 고 처리량에 관한 상세한 프로토콜을 제공한다. 따라서, 예를 들어, Zymark Corp.은 유전자 전사, 리간드 결합 등의 조정을 탐지해주는 스크리닝 시스템에 관해 서술한 기술적 게시물을 제공해준다.

키트

본 발명은 또한, 생물학적 샘플(시험 샘플) 중에서의 GAVE6의 존재 여부를 탐지하기 위한 키트를 포괄한다. 이러한 키트를 사용하여, 특정 피험체에게 GAVE6의 비정상 발현과 연관된 장애(예: 면역학적 장애)가 있는지 아니면 이러한 장애가 발생할 위험이 증가되었는지를 결정할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 생물학적 샘플 중의 GAVE6 단백질 또는 mRNA를 탐지할 수 있는 표지된 화합물 또는 제제와, 상기 샘플 중에서의 GAVE6의 양을 결정하기 위한 수단(예를 들면, GAVE6를 암호화하는 DNA, 예를 들면, 서열 번호 1과 결합하는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 항-GAVE6 항체)를 포함할 수 있다. 키트를 또한 사용하여, GAVE6 단백질 또는 mRNA의 양이 정상 수준 보다 높거나 낮은 경우에, 시험된 피험체에게 GAVE6의 비정상 발현과 연관된 장애가 있는지 이러한 장애가 발생할 위험이 있는지를 지시해주는 결과를 산출할 수 있다.

항체-이용 키트의 경우에는, 이러한 키트가 예를 들어, (1) GAVE6 단백질과 결합하는 제1 항체(예를 들면, 고체 지지체에 부착됨); 및, 임의로 (2) GAVE6 단백질 또는 상기 제1 항체와 결합하고, 탐지 가능한 제제에 접합되는 제2의 상이한 항체를 포함할 수 있다. 제2 항체가 존재하지 않는 경우에는, 제1 항체를 탐지 가능한 수준으로 표지시킬 수 있거나, 또는 제1 항체와 결합하는 또 다른 항체를 탐지 가능한 수준으로 표지시킬 수 있다. 어떠한 경우든, 표지된 결합성 잔기는 당해 분야에 공지된 바와 같이 탐지 가능한 리포터 분자로서 작용한다.

올리고뉴클레오티드-이용 키트의 경우에는, 본 발명의 키트가, 예를 들어, (1) GAVE6 핵산 서열과 하이브리드화되는 올리고뉴클레오티드, 예를 들면, 탐지 가능한 수준으로 표지된 올리고뉴클레오티드 또는 (2) GAVE6 핵산 분자를 증폭시키는데 유용한 한 쌍의 프라이머를 포함할 수 있다.

상기 키트는 예를 들어, 완충제, 방부제 또는 단백질 안정화제를 포함할 수도 있다. 상기 키트는 또한, 탐지 가능한 제제(예: 효소 또는 기질)을 탐지하는데 필요한 성분들을 포함할 수 있다. 추가로, 상기 키트는 검정할 수 있어 시험 샘플과 비교할 수 있는 대조군 샘플 또는 대조군 샘플 시리즈를 함유할 수도 있다. 이러한 키트의 각 성분은 개개의 용기 내에 통상 봉입되고, 각종 용기 모두는 단일 패키지 내에 있다. 시험된 피험체에게 GAVE6의 비정상 발현과 연관된 장애가 있는지 아니면 이러한 장애가 발생할 위험이 있는지를 관찰한 지시 사항이 봉입될 수도 있다.

예후 검정

본원에 기재된 방법을 추가로 진단 또는 예후 검정으로서 활용하여, GAVE6 비정상 발현 또는 활성과 연관된 질병이나 장애가 있거나 이러한 질병이나 장애가 발생할 위험이 있는 피험체를 동정할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 검정, 예를 들면, 전술된 진단 검정 또는 다음의 검정을 활용하여, GAVE6 단백질, 핵산 발현 또는 활성과 연관된 장애가 있거나 이러한 장애가 발생할 위험이 있는 피험체를동정할 수 있다. 예를 들어, 천식, 만성 폐색성 폐 질환 및 류마티스성 관절염과 연관된 염증 또는 세균과의 최근의 접촉이 검정에 적합하다. 또 다른 한편으론, 예후 검정을 활용하여 상기 질병이나 장애가 있거나 이러한 질병이나 장애가 발생할 위험이 있는 피험체를 동정할 수 있다.

따라서, 본 발명은 특정 피험체로부터 시험 샘플을 수득하고, GAVE6 단백질 또는 핵산(예: mRNA 또는 게놈 DNA)을 탐지하는 방법을 제공한다. GAVE6 단백질 또는 핵산의 존재 여부는 GAVE6 비정상 발현 또는 활성과 연관된 질병이나 장애가 있거나 아니면 이러한 질병이나 장애가 발생할 위험이 있는 피험체를 진단해준다. 본원에 사용된 바와 같은 "시험 샘플"은 목적하는 피험체로부터 수득된 생물학적 샘플을 지칭한다. 예를 들어, 시험 샘플은 생물학적 유체(예: 혈청), 세포 샘플 또는 조직일 수 있다.

추가로, 본원에 기재된 예후 검정을 사용하여 GAVE6 비정상 발현 또는 활성과 연관된 질병이나 장애를 치료하기 위해 특정 제제(예: 효능제, 길항제, 펩티드-모사체, 단백질, 펩티드, 핵산, 작은 분자 또는 기타 약물 후보)를 피험체에게 투여할 수 있는지를 결정할 수 있다. 예를 들어, 상기 방법을 사용하여 특정 제제 또는 제제 부류(예를 들면, GAVE6 활성을 저하시키는 유형의 제제)를 사용하여 피험체를 효과적으로 치료할 수 있는지를 결정할 수 있다. 따라서, 본 발명은 시험 샘플을 수득하고 GAVE6 단백질 또는 핵산을 탐지하는, GAVE6 비정상 발현 또는 활성과 연관된 장애를 위한 제제를 사용하여 피험체를 효과적으로 치료할 수 있는지를 결정하는 방법을 제공한다(예를 들어, 여기서는 GAVE6 단백질 또는 핵산의 존재 여부가 GAVE6 비정상 발현 또는 활성과 연관된 장애를 치료하기 위한 제제가 투여될 수 있는 피험체를 진단해준다).

본 발명의 방법을 또한 사용하여, GAVE6 유전자 내의 유전적 병변 또는 돌연변이를 탐지함으로써, 이러한 병든 유전자를 갖는 피험체가 비정상 세포 증식 및/또는 분화를 특징으로 하는 장애에 걸릴 위험이 있는지를 결정할 수 있다. 바람직한 양태에서는, 상기 방법이 피험체로부터의 세포 샘플 중에서, GAVE6 유전자를 잘못 발현하거나 또는 GAVE6-단백질을 암호화하는 유전자의 원형 보존에 영향을 미치는 변화 중의 한 가지 이상을 특징으로 하는 유전적 병변 또는 돌연변이의 존재 또는 부재를 탐지하는 것을 포함한다. 예를 들어, 이러한 유전적 병변 또는 돌연변이는 다음들 중의 적어도 한 가지의 존재를 확인함으로써 탐지할 수 있다: 1) GAVE6 유전자로부터 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실; 2) GAVE6 유전자에 대한 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가; 3) GAVE6 유전자의 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환; 4) GAVE6 유전자와 관련된 염색체성 전위; 5) GAVE6 유전자의 메신저 RNA 전사체의 수준 변화; 6) GAVE6 유전자의 비정상 변형, 예를 들면, 게놈 DNA의 메틸화 패턴의 비정상 변형; 7) 비-야생형 수준의 GAVE6 단백질; 8) GAVE6 유전자의 대립유전자 손실; 및 9) GAVE6 단백질의 부적절한 해독 후 변형. 본원에 기재된 바와 같이, GAVE6 유전자 내의 병변을 탐지하는데 사용될 수 있는 수 많은 검정 기술이 당해 분야에 공지되어 있다. 바람직한 생물학적 샘플은 피험체로부터 통상적인 수단에 의해 분리된 말초 혈액 백혈구 샘플이다.

특정 양태에서는, 병변 탐지 방법이 프로브/프라이머를 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) (참조: 예를 들면, 미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호), 예를 들면, 앵커 PCR 또는 RACE PCR에, 또는 결찰 연쇄 반응 (LCR) (참조: 예를 들면, Landegran 등, Science (1988) 241:1077-1080; 및 Nakazawa 등, Proc Natl Acad Sci USA (1994) 91:360-364)에 사용하는 것을 포함하는데, 후자가 GAVE6 유전자 내의 점 돌연변이를 탐지하는데 특히 유용할 수 있다 (참조: 예를 들면, Abravaya 등, Nucleic Acids Res (1995) 23:675-682). 상기 방법은 환자로부터 세포 샘플을 수집하는 단계; 이러한 샘플 세포로부터 핵산(예: 게놈, mRNA 또는 둘 다)을 분리하는 단계; 이러한 핵산 샘플을, GAVE6 유전자(존재하는 경우)의 하이브리드화와 증폭이 발생되도록 하는 조건 하에 GAVE6 유전자와 특이적으로 하이브리드화하는 하나 이상의 프라이머와 접촉시키는 단계; 및 증폭 생성물의 존재 또는 부재를 탐지하거나 또는 증폭 생성물의 크기를 탐지하고, 이러한 길이를 대조군 샘플과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. PCR 및/또는 LCR을 본원에 기재된 돌연변이 탐지에 사용된 임의의 기술과 연계해서 예비 증폭 단계로서 사용하는 것이 바람할 수 있을 것으로 예상된다. 또 다른 증폭 방법에는 자가-지속된 서열 복제 (참조: Guatelli 등, Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87:1874-1878), 전사 증폭 시스템 (참조: Kwoh 등, Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86:1173-1177), Q 레플리카제 (참조: Lizardi 등, Bio/Technology (1988) 6:1197) 또는 기타 모든 핵산 증폭 방법이 포함되고, 이어서 상기 증폭된 분자를 당업자에게 널리 공지된 기술을 사용하여 탐지한다. 이러한 탐지 방식은 핵산 분자가 극히 적은 수로 존재하는 경우에 이 핵산 분자를 탐지하는데 특히 유용하다.

대체 양태에서는, 샘플 세포로부터의 GAVE6 유전자 내의 돌연변이를 제한 효소 절단 패턴 상의 변화에 의해 동정할 수 있다. 예를 들어, 샘플 DNA와 대조군 DNA를 분리하고, 증폭시키며(임의로), 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제로 분해시키며, 겔 전기영동에 의해 단편 길이 크기를 결정하고, 이를 비교한다. 샘플 DNA와 대조군 DNA 간의 단편 길이 크기 차이는 샘플 DNA 내의 돌연변이를 지시해준다. 더욱이, 서열 특이적 리보자임(참조: 예를 들면, 미국 특허 제5,498,531호)를 사용하여 리보자임 절단 부위의 발생이나 손실에 의해 특이적 돌연변이의 존재에 대해 점수를 매길 수 있다.

기타 양태에서는, 샘플 핵산과 대조군 핵산, 예를 들면, DNA 또는 RNA를, 수 백개 또는 수 천개의 올리고뉴클레오티드 프로브를 함유하는 고밀도 어레이(array)와 하이브리드화함으로써, GAVE6 내의 유전적 돌연변이를 동정할 수 있다(참조: Cronin 등, Human Mutation (1996) 7:244255; Kozal 등, Nature Medicine (1996) 2:753759). 예를 들어, GAVE6 내의 유전적 돌연변이는 문헌(Cronin 등, supra)에 기재된 바와 같은 광-발생된 DNA 프로브를 함유하는 2차원 어레이에서 동정할 수 있다. 간략하게 언급하면, 프로브의 제1 하이브리드화 어레이를 사용하여 샘플과 대조군 내의 DNA의 긴 연장물을 통하여 스캐닝하여, 순차적 중복 프로브의 선형 어레이를 발생함으로써 서열들 간의 염기 변화를 동정할 수 있다. 이러한 단계를 사용하여 점 돌연변이를 동정할 수 있다. 상기 단계에 이어, 제2 하이브리드화 어레이를 사용하여, 탐지된 모든 변이체 또는 돌연변이체에 상보적인 보다 작은 특수 프로브 어레이를 사용함으로써 특이적 돌연변이체를 성상 확인할 수 있다. 각 돌연변이 어레이는 병렬식 프로브 세트로 구성되는데, 이중 하나가 야생형 유전자에 상보적이고, 다른 하나는 돌연변이체 유전자에 상보적이다.

또 다른 양태에서는, 당해 분야에 공지된 각종 서열 분석 반응을 사용하여 GAVE6 유전자를 직접적으로 서열 분석할 수 있고, 샘플 GAVE6의 서열과 상응하는 야생형(대조군) 서열을 비교함으로써 돌연변이를 탐지할 수 있다. 서열 분석 반응의 예에는 Maxam & Gilbert에 의해 개발된 기술 (참조: Proc Natl Acad Sci USA (1977) 74:560) 또는 Sanger에 의해 개발된 기술 (참조: Proc Natl Acad Sci USA (1977) 74:5463)에 근거한 반응이 포함된다. 질량 분광법에 의한 서열 분석(참조: 예를 들면, PCT 공보 제WO 94/16101호; Cohen 등, Adv Chromatogr (1996) 36:127-162; 및 Griffin 등, Appl Biochem Biotechnol (1993) 38:147-159)을 포함한 각종의 자동화 서열 분석 과정을 진단 검정(Bio/Techniques (1995) 19:448) 수행시 활용할 수 있다.

GAVE6 유전자 내의 돌연변이를 탐지하는 기타 방법에는 절단제로부터의 보호를 이용하여 RNA/RNA 또는 RNA/DNA 이종-이중체 내의 부정합 염기를 탐지하는 방법이 포함된다(참조: Myers 등, Science (1985) 230:1242). 일반적으로, "부정합 절단" 기술은 야생형 GAVE6 서열을 함유하는 (표지된) RNA 또는 DNA를 조직 샘플로부터 수득된 잠재적 돌연변이체 RNA 또는 DNA와 하이브리드화함으로써 형성된 이종-이중체를 제공하는 단계를 수반한다. 대조군 쇄와 샘플 쇄 간의 염기 쌍 부정합으로 인해 존재하는 바와 같은, 이중체의 일본쇄 영역을 절단시키는 제제로 이본쇄 이중체를 처리한다. RNA/DNA 이중체를 RNase로 처리하여 부정합 영역을 분해시킬수 있고, DNA/DNA 하이브리드를 S1 뉴클레아제로 처리하여 부정합 영역을 분해시킬 수 있다. 기타 양태에서는, DNA/DNA 또는 RNA/DNA 이중체를 하이드록실아민 또는 사산화오스뮴 및 피페리딘으로 처리하여 부정합 영역을 분해시킬 수 있다. 이러한 부정합 영역을 분해시킨 후, 이로써 생성된 물질을 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 크기 별로 분리시켜 돌연변이 부위를 결정한다(참조: 예를 들면, Cotton 등, Proc Natl Acad Sci USA (1988) 85:4397; Saleeba 등, Methods Enzymol (1992) 217:286-295). 바람직한 양태에서는, 대조군 DNA 또는 RNA를 탐지를 위해 표지시킬 수 있다.

또 다른 양태에서는, 부정합 절단 반응이, 세포 샘플로부터 수득된 GAVE6 cDNAs 내의 점 돌연변이를 탐지하고 이를 지도화하기 위한 규정된 시스템에서 이본쇄 DNA 내의 부정합 염기 쌍을 인식하는 하나 이상의 단백질(소위 "DNA 부정합 복구" 효소)를 이용한다. 예를 들어, 이. 콜라이 mutY 효소는 G/A 부정합에서 A를 절단시키고, HeLa 세포로부터의 티미딘 DNA 글리코실라제는 G/T 부정합에서 T를 절단시킨다(참조: Hsu 등, Carcinogenesis (1994) 15:1657-1662). 예시 양태에 따르면, GAVE6 서열, 예를 들면, 야생형 GAVE6 서열에 근거한 프로브를 시험 세포(들)로부터의 cDNA 또는 기타 DNA 생성물에 하이브리드화한다. 상기 이중체를 DNA 부정합 복구 효소로 처리하고, 절단 생성물이 존재하는 경우에는, 이를 전기영동 프로토콜 등으로 탐지할 수 있다(참조: 예를 들면, 미국 특허 제5,459,039호).

기타 양태에서는, 전기영동적 이동도 상의 변화를 사용하여 GAVE6 유전자 내의 돌연변이를 동정할 수 있을 것이다. 예를 들어, 일본쇄 입체 구조 다형성(SSCP)을 사용하여 돌연변이체 핵산과 야생형 핵산 간의 전기영동적 이동도 차이를 탐지할 수 있다(참조: Orita 등, Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86:2766; 및 Cotton, Mutat Res (1993) 285:125-144; Hayashi, Genet Anal Tech Appl (1992) 9:73-79). 대조군 GAVE6 핵산과 샘플의 일본쇄 DNA 단편을 변성시킨 다음, 재생시킬 수 있다. 일본쇄 핵산의 2차 구조는 서열에 따라서 다양하며, 이로써 생성된 전기영동적 이동도 상의 변화로 인해, 규칙적인 단일 염기 변화를 탐지할 수 있다. DNA 단편을 표지시킬 수 있거나 표지된 프로브로 탐지할 수 있다. (DNA 보다는) RNA를 사용함으로써 검정 민감도를 증강시킬 수 있는데, 이는 RNA의 2차 구조가 서열 변화에 보다 민감하기 때문이다. 바람직한 양태에서는, 본 발명의 방법이 이종-이중체를 활용하여, 전기영동적 이동도 상의 변화에 근거하여 이본쇄 이종-이중체 분자를 분리시킨다(참조: Keen 등, Trends Genet (1991) 7:5).

또 다른 양태에서는, 변성제 구배를 함유하는 폴리아크릴아미드 겔에서의 돌연변이체 또는 야생형 단편의 이동을 변성 구배 겔 전기영동 (DGGE) (참조: Myers 등, Nature (1985) 313:495)을 사용하여 검정한다. DGGE가 분석 방법으로서 사용된 경우에는, DNA를 변형시켜, 예를 들어, 고융점 GC-풍부한 DNA의 대략 40 bp의 GC 클램프를 PCR에 의해 부가함으로써 상기 DNA가 완전히 변성되지 않았다는 것을 보장해줄 것이다. 추가의 양태에서는, 변성 구배 대신 온도 구배를 사용하여 대조군 DNA와 샘플 DNA의 이동도 차이를 확인한다(참조: Rosenbaum 등, Biophys Chem (1987) 265:12753).

점 돌연변이를 탐지하는 기타 기술의 예에는 선택적 올리고뉴클레오티드 하이브리드화, 선택적 증폭 또는 선택적 프라이머 연장이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 공지된 돌연변이를 중앙에 위치시킨 다음, 완벽한 정합물이 발견되는 경우에만 하이브리드화를 허용하는 조건 하에 표적 DNA와 하이브리드화하는 방식으로 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제조할 수 있다(참조: Saiki 등, Nature (1986) 324:163); Saiki 등, Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86:6230). 이러한 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드를 PCR-증폭된 표적 DNA와 하이브리드화시키거나, 또는 상기 올리고뉴클레오티드가 하이브리드화 막에 부착되고 표지된 표적 DNA와 하이브리드화되는 경우에는 수 많은 상이한 돌연변이물과 하이브리드화시킨다.

또 다른 한편으론, 선택적 PCR 증폭에 좌우되는 대립유전자-특이적 증폭 기술을 본 발명과 연계해서 사용할 수 있다. 특이적 증폭용 프라이머로서 사용된 올리고뉴클레오티드는 해당 분자의 중앙에 목적하는 돌연변이를 수반할 수 있거나(이로써 증폭이 시차 하이브리드화에 좌우된다)(참조: Gibbs 등, Nucleic Acids Res (1989) 17:2437-2448) , 또는 적당한 조건 하에 부정합이 폴리머라제 연장을 방지 또는 저하시킬 수 있는 1개 프라이머의 3’말단에 목적하는 돌연변이를 수반할 수 있다(참조: Prossner, Tibtech (1993) 11:238). 또한, 신규한 제한 부위를 돌연변이 영역에 도입하여 절단-이용 탐지를 제조하는 것이 바람직할 수도 있다(참조: Gasparini 등, Mol Cell Probes (1992) 6:1). 특정 양태에서는 증폭용 Taq 리가제를 사용하여 증폭을 수행할 수도 있는 것으로 예상된다(참조: Barany, Proc Natl Acad Sci USA (1991) 88:189). 이런 경우, 증폭의 존재 또는 부재를 관찰함으로써 특이적 부위에 공지된 돌연변이가 존재하는 지를 탐지해줄 수 있는 5’ 서열의 3’말단에 완벽한 정합이 존재하는 경우에만 결찰이 이루어질 것이다.

본원에 기재된 방법은, 예를 들어, 본원에 기재된 하나 이상의 프로브 핵산 또는 항체 시약을 포함하는 예비-패키지된 진단용 키트를 활용함으로써 수행할 수 있다. 상기 방법 및 키트는 예를 들어, 임상 세팅에 통상적으로 사용되어 GAVE6 유전자와 관련된 질병 증상을 나타내거나 이러한 질병 가족 병력이 있는 환자를 진단할 수 있다.

추가로, GAVE6가 발현되는 모든 세포 유형 또는 조직을 본원에 기재된 예후 검정에 활용할 수도 있다.

약리게놈학

본원에 기재된 스크리닝 검정에 의해 동정된 바와 같이 GAVE6 활성(예: GAVE6 유전자 발현)에 대한 자극 또는 억제 효과를 지니는 제제 또는 조정제를 개개인에게 투여하여, GAVE6 활성과 연관된 장애(예: 천식, 만성 폐색성 폐 질환 및 류마티스성 관절염과 연관된 염증)를 치료(예방적 또는 치료적)할 수 있다. 이러한 치료와 연계해서, 개개인의 약리게놈학(즉, 개개인의 유전형과, 외래 화합물 또는 약물에 대한 개개인의 반응 간의 유연 관계에 관한 연구)을 고려할 수 있다. 약리학적 활성 약물의 용량과 혈중 농도 간의 관계를 변화시킴으로써, 치료법 대사 차이가 심각한 독성 또는 치료 실패를 유발시킬 수 있다. 따라서, 개개인의 약리게놈학은 개개인의 유전형을 고려하여 예방 또는 치료에 유효한 제제(예: 약물)을 선택할 수 있게 해준다. 이러한 약리게놈학을 사용하여 적당한 투여량과 치료학적 섭생을 결정할 수 있다. 따라서, 특정 개개인에게서의 GAVE6 단백질의 활성, GAVE6 핵산의 발현 또는 GAVE6 유전자의 돌연변이 함량을 결정함으로써, 이러한 개개인의 치료적 또는 예방적 처치에 적당한 제제(들)를 선택할 수 있다.

약리게놈학은 환자에게서 비정상적인 작용과 변화된 약물 체질로 인해 약물에 반응하는 임상적으로 중요한 유전성 변이를 다루고 있다(참조: 예를 들면, Linder, Clin Chem (1997) 43(2):254-266). 일반적으로, 2가지 유형의 약리유전적 상태를 구별할 수 있다. 약물이 신체 상에서 작용하는 방식을 변화시키는 단일 요인으로서 유전된 유전적 상태가 "변화된 약물 작용"으로서 지칭된다. 신체가 약물에 대해 작용하는 방식을 변화시키는 단일 요인으로서 유전된 유전적 상태가 "변화된 약물 대사"로서 지칭된다. 약리유전적 상태는 희귀한 결함으로서 또는 다형성으로서 일어날 수 있다. 예를 들어, 글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제 결핍증(G6PD)이 흔히 발생하는 유전성 효소병이고, 이의 주요 임상 합병증은 산화제 약물(항-말라리아제, 설폰아미드, 진통제 또는 니트로푸란)의 섭취와 잠두(fava bean) 소비 후에 용혈이 유발된다는 것이다.

예시 양태로서, 약물 대사화 효소의 활성이 약물 작용 세기와 약물 작용 지속 기간을 결정해 주는 주요 요인이다. 약물 대사화 효소(예: N-아세틸트랜스퍼라제 2 (NAT 2) 및 시토크롬 P450 효소 CYP2D6 및 CYP2C19)의 유전적 다형성을 발견함으로써, 몇몇 환자가 예상되는 약물 효과를 획득하지 못한 이유, 또는 안전한 표준 용량의 약물을 섭취한 후에 심각한 독성과 지나친 약물 반응을 나타내는 이유를 설명할 수 있었다. 다형성은 집단 내에서 2가지 표현형, 즉 광범위한 대사자(EM)과불량한 대사자(PM)로 표현된다. PM이 우세하다는 것은 상이한 집단들 간에도 다르다. CYP2D6를 암호화하는 유전자는 고도로 다형성이고, 몇몇 돌연변이가 PM에서 동정되었는데, 이들 모두는 기능적 CYP2D6의 부재를 유발시킨다. CYP2D6 및 CYP2Cl9의 불량한 대사자는 표준 용량이 투여된 경우에도 지나친 약물 반응과 부작용을 꽤 자주 경험한다. 대사물이 활성 치료학적 잔기인 경우에는, CYP2D6-형성된 대사물인 모르핀에 의해 매개된 코데인의 진통 효과에 대해 입증된 바와 같이, PM은 치료학적 반응을 전혀 나타내지 않을 것이다. 다른 극한 예가 표준 용량에 반응하지 않는 소위 초속(ultra-rapid) 대사자이다. 최근에는, 분자에 기초한 초속 대사 작용의 원인이 CYP2D6 유전자 증폭 때문인 것으로 밝혀졌다.

따라서, 특정 개개인에게서의 GAVE6 단백질의 활성, GAVE6 핵산의 발현 또는 GAVE6 유전자의 돌연변이 함량을 결정함으로써, 이러한 개개인의 치료학적 또는 예방적 처치에 적당한 제제(들)를 선택할 수 있다. 또한, 약리유전학적 연구를 사용하여, 약물-대사화 효소를 암호화하는 다형성 대립유전자의 유전자형별 검사를 개개인의 약물 반응성 표현형의 동정에 적용할 수 있다. 이러한 지식을 투약이나 약물 선택에 적용하는 경우에는 불리한 반응이나 치료학적 실패를 피할 수 있으므로, GAVE6 조정제, 예를 들면, 본원에 기재된 예시적 스크리닝 검정들 중의 한 가지 검정에 의해 동정된 조정제로 특정 피험체를 치료하는 경우에 치료학적 또는 예방적 효능을 증강시킬 수 있다.

4. 임상 시험 동안의 효과 모니터링

GAVE6의 발현 또는 활성에 대한 제제(예: 약물 또는 화합물)의 영향(예: 이상 세포 증식 및/또는 분화를 조정하는 능력)을 모니터하는 것은 기본적 약물 스크리닝에서 뿐만 아니라 임상 시험에도 적용할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 스크리닝 검정에 의해 결정된 바와 같이, GAVE6 유전자 발현, 단백질 수준 또는 단백질 활성을 증가시키는 특정 제제의 효능은 GAVE6 유전자 발현, 단백질 수준 또는 단백질 활성 저하를 나타내는 피험체의 임상 시험에서 모니터할 수 있다. 또 다른 한편으론, 스크리닝 검정에 의해 결정된 바와 같이, GAVE6 유전자 발현, 단백질 수준 또는 단백질 활성을 저하시키는 특정 제제의 효능은 GAVE6 유전자 발현, 단백질 수준 또는 단백질 활성 증가를 나타내는 피험체의 임상 시험에서 모니터할 수 있다. 이러한 임상 시험에서는, GAVE6 발현 또는 활성, 및 바람직하게는, 예를 들어, 세포성 증식 장애에 대해 밀접한 영향을 끼치는 기타 유전자의 발현 및 활성을 특정 세포의 면역 반응성의 마커로서 사용할 수 있다. 예를 들어(이에 제한되지는 않는다), GAVE6 활성을 조정하는(예를 들어, 본원에 기재된 스크리닝 검정에 의해 동정된 바와 같음) 제제(예: 화합물, 약물 또는 작은 분자)로 처리함으로써 세포 내에서 조정되는 유전자(GAVE6 포함)를 동정할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 임상 시험에서 세포성 증식 장애에 대한 제제의 효과를 연구하기 위해서는, 세포를 분리시킬 수 있고, RNA를 제조한 다음, 이를 대상으로 하여, GAVE6과 상기 장애에 대해 밀접한 영향을 끼치는 기타 유전자의 발현 수준을 분석하였다. 유전자 발현 수준(즉, 유전자 발현 패턴)은 본원에 기재된 바와 같은 노던 블롯 분석 또는 RT-PCR에 의하거나, 또는 본원에 기재된 방법들 중의 한 가지 방법에 의해생성된 단백질의 양을 측정하거나 GAVE6 또는 기타 유전자의 활성 수준을 측정함으로써 정량화할 수 있다. 이러한 방식으로, 유전자 발현 패턴이 마커로서 제공될 수 있는데, 이는 해당 제제에 대한 세포의 생리학적 반응을 지시해준다. 따라서, 개개인을 상기 제제로 치료하는 동안의 각종 시점에서 및 치료 이전에 반응 상태를 결정할 수 있다.

특정 양태에서는, 본 발명이 (i) 제제를 투여하기에 앞서 피험체로부터 예비-투여용 샘플을 수득하는 단계; (ii) 이러한 예비투여용 샘플 중의 GAVE6 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 발현 수준을 탐지하는 단계; (iii) 상기 피험체로부터 하나 이상의 투여 후 샘플을 수득하는 단계; (iv) 이러한 투여 후 샘플 중의 GAVE6 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA 의 발현 수준 또는 활성을 탐지하는 단계; (v) 예비-투여용 샘플 중의 GAVE6 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA 의 발현 수준 또는 활성을, 투여-후 샘플(들) 중의 GAVE6 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA 의 발현 수준 또는 활성과 비교하는 단계; 및 (vi) 이에 따라, 피험체에 대한 제제의 투여를 변화시키는 단계를 포함하는, 피험체를 특정 제제(예: 효능제, 길항제, 펩티드-모사체, 단백질, 펩티드, 핵산, 작은 분자, 또는 본원에 기재된 스크리닝 검정에 의해 동정된 기타 약물 후보)로 치료한 효능을 모니터하는 방법을 제공한다. 예를 들어, GAVE6의 발현 또는 활성을 탐지된 것 보다 높은 수준으로 증가시키기 위해서는, 즉 제제의 효능을 증가시키기 위해서는, 제제 투여 증가가 바람직할 수 있다. 또 다른 한편으론, GAVE6의 발현 또는 활성을 탐지된 것 보다 낮은 수준으로 저하시키기 위해서는, 즉 제제의 효능을 저하시키기 위해서는, 제제 투여 감소가 바람직할 수 있다.

D. 치료 방법

본 발명은 GAVE6 비정상 발현 또는 활성과 연관된 장애가 있거나 또는 이러한 장애에 걸릴 위험이 있는(또는 이러한 장애에 걸리기 쉬운) 피험체를 처치하는 예방적 및 치료학적 방법을 제공한다. 이러한 장애에는, 예를 들어, 염증성 장애, 예를 들면, 천식, 만성 폐색성 폐 질환 및 류마티스성 관절염이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

1. 예방적 방법

한 국면에서, 본 발명은 특정 피험체에게 GAVE6 발현 또는 한 가지 이상의 GAVE6 활성을 조정하는 제제를 투여함으로써, 이러한 피험체에게서 GAVE6 비정상 발현 또는 활성과 연관된 질병이나 질환을 예방하는 방법을 제공한다. GAVE6 비정상 발현 또는 활성에 의해 유발되거나 이것에 의해 비롯되는 질병에 걸릴 위험이 있는 피험체는, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 모든 진단 또는 예후 검정, 또는 이들 조합에 의해 동정할 수 있다. GAVE6 비정상을 특징으로 하는 증상이 나타나기 전에 예방적 제제를 투여하여, 특정 질병이나 장애가 예방되거나 질병 진행이 지연되도록 할 수 있다. GAVE6 비정상 유형에 따라서, 예를 들어, GAVE6 효능제 또는 GAVE6 길항제를 해당 피험체 치료에 사용할 수 있다. 본원에 기재된 스크리닝 검정에 근거하여 적당한 제제를 결정할 수 있다.

2. 치료학적 방법

본 발명의 또 다른 국면은 치료 목적을 위해 GAVE6 발현 또는 활성을 조정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조정 방법은 특정 세포를, 이러한 세포와 연관된 GAVE6 단백질 활성들 중의 한 가지 이상의 활성을 조정해 주는 제제와 접촉시키는 것을 포함한다. GAVE6 단백질 활성을 조정해 주는 제제는 본원에 기재된 바와 같은 제제, 예를 들면, 핵산 또는 단백질, GAVE6 단백질의 천연 동종 리간드, 펩티드, GAVE6 펩티드-모사체, 또는 기타 작은 분자일 수 있다. 한 양태에서는, 상기 제제가 GAVE6 단백질의 생물학적 활성들 중의 한 가지 이상의 활성을 자극한다. 이러한 자극제의 예에는 해당 세포 내로 도입시킨 GAVE6를 암호화하는 핵산 분자 및 활성 GAVE6 단백질이 포함된다. 또 다른 양태에서는, 상기 제제가 GAVE6 단백질의 생물학적 활성들 중의 한 가지 이상의 활성을 억제한다. 이러한 억제제의 예에는 안티센스 GAVE6 핵산 분자 및 항-GAVE6 항체가 포함된다. 본 발명의 조정 방법은 시험관내에서 수행하거나(예를 들어, 세포를 제제와 함께 배양함으로써 수행함) 또는 생체내에서 수행할 수 있다(예를 들어, 제제를 피험체에게 투여함으로써 수행함). 따라서, 본 발명은 GAVE6 단백질 또는 핵산 분자의 비정상 발현 또는 활성을 특징으로 하는 질병이나 장애에 걸린 개개인을 치료하는 방법을 제공한다. 한 양태에서는, 상기 방법이 GAVE6 발현 또는 활성을 조정해주는(예를 들면, 상향 조절하거나 하향 조절해주는) 제제(예: 본원에 기재된 스크리닝 검정에 의해 동정된 제제) 또는 제제 조합물을 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 양태에서는, 상기 방법이 GAVE6 비정상 발현 저하를 보상하기 위한 치료법으로서 GAVE6 단백질 또는 핵산 분자를 투여하는 것을 포함한다.

GAVE6가 비정상적으로 하향 조절되고/되거나 GAVE6 활성 증가가 유리한 효과를 가져다 줄 것으로 예상되는 상황에서는 GAVE6 활성을 자극하는 것이 바람직하다. 역으로, GAVE6가 비정상적으로 상향 조절되고/되거나 GAVE6 활성 저하가 유리한 효과를 가져다 줄 것으로 예상되는 상황에서는 GAVE6 활성을 억제하는 것이 바람직하다.

본 발명은 본 발명의 예시로서 제공되는 다음의 비-제한적 실시예를 참조로 하여 보다 잘 이해될 수 있다. 다음 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 보다 상세히 예시하기 위해 제시된 것이다. 그러나, 이로써 본 발명의 범위가 제한되지 않아야 한다.

재료 및 방법

GAVE6의 동정.조회 인자로서 각종 GPCR을 사용하는 사람 게놈 서열 데이터베이스 HTG(NCBI/NIH)에 대한 상동성 조사는 FASTA 연산 방식 (Wisconsin GCG Package Version 10.1)을 사용하여 수행하였다. 통계적으로 유의성을 지닌 것으로 회수된 게놈 DNA 서열을, 단백질 데이터베이스의 BLASTp 조사를 위해 3개의 정방향 프레임 내로 해독하였다. 게놈 DNA 서열 AC013396이 추정상의 GPCR 서열을 함유하는 것으로 동정되었으므로, 이를 GAVE6로 명명하였다. GAVE6의 염색체 위치는2p22.1에서 지도화된다.

GAVE6을 암호화하는 게놈 DNA 의 클로닝 .예상된 GAVE6의 5’ 및 3’ 서열에 특이적인 프라이머를 고안하였다. 정방향 프라이머 HP157, CAG CCC ATG GAA CTT CAT AAC CTG (서열 번호 5), 및 역방향 프라이머 HP158, CTG GCC CTC AGC CCT GGG AGG AG (서열 번호 6)을 사용하여, 주형으로서 사람 게놈 DNA를 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 GAVE6 게놈 DNA를 증폭시켰다. PCR 조건은 다음과 같다: 94 ℃에서 30초 동안 변성, 55 ℃에서 30초 동안 어닐링, 및 72 ℃에서 1분 동안 연장을 35주기 동안 수행한 다음, 72 ℃에서 5분 동안 연장시킴. 증폭된 DNA 단편을 pCRII-TOPO 벡터(공급원: Invitrogen) 내로 클로닝시킨다. 이와 같이 클로닝된 DNA 삽입체를 DNA 서열 분석함으로써 확인한다. 모든 PCR 증폭을 DNA Engine Tetrad (MJ Research, model PTC-225)에서 수행하였다.

노던 블롯 분석. 사람 다중 조직 노던 블롯(공급원: Clontech)을 제조업자의 지시에 따라서 [α-³²P]dCTP 표지된 완전한 길이의 개방 판독 프레임 DNA 단편과 하이브리드화하였다. 이와 같이 하이브리드화된 블롯을 50 ℃ 에서 30분 동안 2XSSPE 및 0.1% SDS로 세척하고, 50 ℃에서 1시간 동안 0.1XSSPE 및 0.1%SDS로 세척한다. 이어서, 상기 블롯을 증감 스크린의 존재하에 -70 ℃에서, X선 필름에 노출시킨다. 이러한 노던 블롯 분석 결과가 도 4에 제시되어 있다.

Taqman 분석. 사람 조직으로부터의 총 RNA를 Clontech으로부터 구입하였다. cDNA 발생에 앞서, 총 RNA를 DNAse1으로 처리하여 잠재적 게놈 DNA의 오염을 피한다. 간략하게 언급하면, 총 RNA를 37℃에서 1시간 동안 50ul의 최종 용적으로, 5ul의 10x DNAseI 완충액 (20mM Hepes pH 7.5; 10mM CaCl₂;10mM MgCl₂; 1mM DTT 및 50% (v/v) 글리세롤) (Ambion), RNAse 억제제 및 1ul의 DNAseI RNase 유리 (2U/ul; Ambion)와 혼합한다. 페놀 침전 단계를 수행한 후, Life Technologies에 기재된 바와 같은 슈퍼스크립트 선택 시스템을 사용하여, cDNA 합성을 수행한다. Primer Express 1.0 소프트웨어 (ABI)를 사용하여 Taqman 프라이머/프로브를 고안하였다. Gave 6의 TaqMan 정방향 프라이머: 5' GCT GCC TGC AAA GTC AAC CT 3' (서열 번호 7), 역방향 프라이머: 5' TGG CTG TGA GGA AGA CAA CG 3' (서열 번호 8) 및 Taqman 프로브 서열: 5’FAM- CCA CCA ACC GCA CGG CAA - TAMRA 3’ (서열 번호 9). Fam이 리포터 염료로서 사용되고, Tamra가 소광인자로서 사용된다. Taqman 프로브는 주문 합성되고 있다(공급원: Operon Technologies). Taqman 반응은 25ul Taqman PCR 혼합물 (Perkin Elmer); 900nM의 최종 농도에 대한 1 ul 정방향 프라이머; 900nM의 최종 농도에 대한 1ul 역방향 프라이머 및 200nM의 최종 농도에 대한 1ul Taqman 프로브; 5ul의 cDNA 주형 (산정 농도 10ng/ul) 및 17 ul의 물을 함유하는 50ul의 최종 용적으로 96-웰 판 MicroAmp 광학 튜브 (PE)에서 수행하였다. Taqman PCR 조건은 PE Applied Biosystem에 의해 기재된 바와 같이 수행하였다. 사람 베타 악틴 프라이머 프로브(PE Applied Biosystem로부터 고안 및 구입함)를 내부 대조군으로 사용하였다. 각 조직의 대해, Taqman 반응을 표적 유전자와 내부 대조군 둘 다에 대해 2회 수행하였다. 또한, 주형의 양을 증가시키면서 총 뇌 cDNA 에서 사람 베타악틴에 대한 표준 곡선을 2회 발생시킨다. 이로써, 증폭된 앰플리콘의 상대적 수를 수득할 수 있다. 표적 유전자의 발현은 상대적 발현 배율로서 뇌 cDNA에 기준하여 표현된다. Taqman 분석으로부터 수득된 데이터가 다음 표 1에 제시되어 있고, 도 5에 그래프로 나타나 있다.

cDNA 라이브러리의 PCR 스크리닝. GAVE6 암호화 영역에 특이적인 PCR 프라이머: 5’TTC CTC CTG ATC AGC AAC CT 3’ (서열 번호 10), 및 5’TTG GTG GAC AGC ATG AAG AG 3’ (서열 번호 11)을 사용하여, 풀링된 사람 비장, 뇌, 신장, 활성화 T 세포, 및 폐 cDNA 라이브러리를 스크리닝하였다. PCR 스크리닝은 다음 PCR 프로토콜을 사용하여 96-웰 판에서 수행하였다: 94℃에서 3분 동안 유지; 94 ℃에서 30초 동안, 52 ℃에서 30초 동안, 및 68 ℃에서 45초 동안 40 주기. 추가 횟수의 PCR 스크리닝을 위해 양성 서브풀을 연속해서 희석시킨다. 양성 서브풀로부터의 제한된 수의 콜로니를 한천 판 상에 도말하고, 양성 플라스미드를 PCR로 확인한 다음, 이를 대상으로 DNA 서열 분석을 수행하였다.

본 발명은 이의 범위가 본원에 기재된 특정 예로써 제한되지 않는다. 실제로, 본원에 기재된 것 이외의 본 발명의 각종 변형이 전술된 기재 사항과 첨부된 도면으로부터 당업자에게는 명백할 것이다. 이러한 변형 또한, 첨부된 청구의 범위 내에 속한다.

핵산 또는 폴리펩티드에 대해 제공된, 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기, 및 모든 분자량 또는 분자량 수치는 근사치이며, 설명을 위해 제공된 것이라는 것을 추가로 인지해야 한다.

다양한 공개 문헌이 본원에 인용되었는데, 이의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입되어 있다.

<110> Aventis Pharmaceuticals Inc. <120> A nucleic acid encoding a G-protein-coupled receptor, and uses thereof <130> USAV2001/0054 WO PCT <150> US 60/351,006 <151> 2002-01-23 <150> GB 0210597.1 <151> 2002-05-09 <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1155 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggaacttc ataacctgag ctctccatct ccctctctct cctcctctgt tctccctccc 60 tccttctctc cctcaccctc ctctgctccc tctgccttta ccactgtggg ggggtcctct 120 ggagggccct gccaccccac ctcttcctcg ctggtgtctg ccttcctggc accaatcctg 180 gccctggagt ttgtcctggg cctggtgggg aacagtttgg ccctcttcat cttctgcatc 240 cacacgcggc cctggacctc caacacggtg ttcctggtca gcctggtggc cgctgacttc 300 ctcctgatca gcaacctgcc cctccgcgtg gactactacc tcctccatga gacctggcgc 360 tttggggctg ctgcctgcaa agtcaacctc ttcatgctgt ccaccaaccg cacggccagc 420 gttgtcttcc tcacagccat cgcactcaac cgctacctga aggtggtgca gccccaccac 480 gtgctgagcc gtgcttccgt gggggcagct gcccgggtgg ccgggggact ctgggtgggc 540 atcctgctcc tcaacgggca cctgctcctg agcaccttct ccggcccctc ctgcctcagc 600 tacagggtgg gcacgaagcc ctcggcctcg ctccgctggc accaggcact gtacctgctg 660 gagttcttcc tgccactggc gctcatcctc tttgctattg tgagcattgg gctcaccatc 720 cggaaccgtg gtctgggcgg gcaggcaggc ccgcagaggg ccatgcgtgt gctggccatg 780 gtggtggccg tctacaccat ctgcttcttg cccagcatca tctttggcat ggcttccatg 840 gtggctttct ggctgtccgc ctgccgatcc ctggacctct gcacacagct cttccatggc 900 tccctggcct tcacctacct caacagtgtc ctggaccccg tgctctactg cttctctagc 960 cccaacttcc tccaccagag ccgggccttg ctgggcctca cgcggggccg gcagggccca 1020 gtgagcgacg agagctccta ccaaccctcc aggcagtggc gctaccggga ggcctctagg 1080 aaggcggagg ccatagggaa gctgaaagtg cagggcgagg tctctctgga aaaggaaggc 1140 tcctcccagg gctga 1155 <210> 2 <211> 384 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Glu Leu His Asn Leu Ser Ser Pro Ser Pro Ser Leu Ser Ser Ser 1 5 10 15 Val Leu Pro Pro Ser Phe Ser Pro Ser Pro Ser Ser Ala Pro Ser Ala 20 25 30 Phe Thr Thr Val Gly Gly Ser Ser Gly Gly Pro Cys His Pro Thr Ser 35 40 45 Ser Ser Leu Val Ser Ala Phe Leu Ala Pro Ile Leu Ala Leu Glu Phe 50 55 60 Val Leu Gly Leu Val Gly Asn Ser Leu Ala Leu Phe Ile Phe Cys Ile 65 70 75 80 His Thr Arg Pro Trp Thr Ser Asn Thr Val Phe Leu Val Ser Leu Val 85 90 95 Ala Ala Asp Phe Leu Leu Ile Ser Asn Leu Pro Leu Arg Val Asp Tyr 100 105 110 Tyr Leu Leu His Glu Thr Trp Arg Phe Gly Ala Ala Ala Cys Lys Val 115 120 125 Asn Leu Phe Met Leu Ser Thr Asn Arg Thr Ala Ser Val Val Phe Leu 130 135 140 Thr Ala Ile Ala Leu Asn Arg Tyr Leu Lys Val Val Gln Pro His His 145 150 155 160 Val Leu Ser Arg Ala Ser Val Gly Ala Ala Ala Arg Val Ala Gly Gly 165 170 175 Leu Trp Val Gly Ile Leu Leu Leu Asn Gly His Leu Leu Leu Ser Thr 180 185 190 Phe Ser Gly Pro Ser Cys Leu Ser Tyr Arg Val Gly Thr Lys Pro Ser 195 200 205 Ala Ser Leu Arg Trp His Gln Ala Leu Tyr Leu Leu Glu Phe Phe Leu 210 215 220 Pro Leu Ala Leu Ile Leu Phe Ala Ile Val Ser Ile Gly Leu Thr Ile 225 230 235 240 Arg Asn Arg Gly Leu Gly Gly Gln Ala Gly Pro Gln Arg Ala Met Arg 245 250 255 Val Leu Ala Met Val Val Ala Val Tyr Thr Ile Cys Phe Leu Pro Ser 260 265 270 Ile Ile Phe Gly Met Ala Ser Met Val Ala Phe Trp Leu Ser Ala Cys 275 280 285 Arg Ser Leu Asp Leu Cys Thr Gln Leu Phe His Gly Ser Leu Ala Phe 290 295 300 Thr Tyr Leu Asn Ser Val Leu Asp Pro Val Leu Tyr Cys Phe Ser Ser 305 310 315 320 Pro Asn Phe Leu His Gln Ser Arg Ala Leu Leu Gly Leu Thr Arg Gly 325 330 335 Arg Gln Gly Pro Val Ser Asp Glu Ser Ser Tyr Gln Pro Ser Arg Gln 340 345 350 Trp Arg Tyr Arg Glu Ala Ser Arg Lys Ala Glu Ala Ile Gly Lys Leu 355 360 365 Lys Val Gln Gly Glu Val Ser Leu Glu Lys Glu Gly Ser Ser Gln Gly 370 375 380 <210> 3 <211> 387 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Asn Arg His His Leu Gln Asp His Phe Leu Glu Ile Asp Lys Lys 1 5 10 15 Asn Cys Cys Val Phe Arg Asp Asp Phe Ile Ala Lys Val Leu Pro Pro 20 25 30 Val Leu Gly Leu Glu Phe Ile Phe Gly Leu Leu Gly Asn Gly Leu Ala 35 40 45 Leu Trp Ile Phe Cys Phe His Leu Lys Ser Trp Lys Ser Ser Arg Ile 50 55 60 Phe Leu Phe Asn Leu Ala Val Ala Asp Phe Leu Leu Ile Ile Cys Leu 65 70 75 80 Pro Phe Val Met Asp Tyr Tyr Val Arg Arg Ser Asp Trp Asn Phe Gly 85 90 95 Asp Ile Pro Cys Arg Leu Val Leu Phe Met Phe Ala Met Asn Arg Gln 100 105 110 Gly Ser Ile Ile Phe Leu Thr Val Val Ala Val Asp Arg Tyr Phe Arg 115 120 125 Val Val His Pro His His Ala Leu Asn Lys Ile Ser Asn Trp Thr Ala 130 135 140 Ala Ile Ile Ser Cys Leu Leu Trp Gly Ile Thr Val Gly Leu Thr Val 145 150 155 160 His Leu Leu Lys Lys Lys Leu Leu Ile Gln Asn Gly Pro Ala Asn Val 165 170 175 Cys Ile Ser Phe Ser Ile Cys His Thr Phe Arg Trp His Glu Ala Met 180 185 190 Phe Leu Leu Glu Phe Leu Leu Pro Leu Gly Ile Ile Leu Phe Cys Ser 195 200 205 Ala Arg Ile Ile Trp Ser Leu Arg Gln Arg Gln Met Asp Arg His Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Arg Ala Ile Thr Phe Ile Met Val Val Ala Ile Val Phe 225 230 235 240 Val Ile Cys Phe Leu Pro Ser Val Val Val Arg Ile Arg Ile Phe Trp 245 250 255 Leu Leu His Thr Ser Gly Thr Gln Asn Cys Glu Val Tyr Arg Ser Val 260 265 270 Asp Leu Ala Phe Phe Ile Thr Leu Ser Phe Thr Tyr Met Asn Ser Met 275 280 285 Leu Asp Pro Val Val Tyr Tyr Phe Ser Ser Pro Ser Phe Pro Asn Phe 290 295 300 Phe Ser Thr Leu Ile Asn Arg Cys Leu Gln Arg Lys Met Thr Gly Glu 305 310 315 320 Pro Asp Asn Asn Arg Ser Thr Ser Val Glu Leu Thr Gly Asp Pro Asn 325 330 335 Lys Thr Arg Gly Ala Pro Glu Ala Leu Met Ala Asn Ser Gly Glu Pro 340 345 350 Trp Ser Pro Ser Tyr Leu Gly Pro Thr Ser Asn Asn His Ser Lys Lys 355 360 365 Gly His Cys His Gln Glu Pro Ala Ser Leu Glu Lys Gln Leu Gly Cys 370 375 380 Cys Ile Glu 385 <210> 4 <211> 319 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Pro Phe Pro Asn Cys Ser Ala Pro Ser Thr Val Val Ala Thr Ala 1 5 10 15 Val Gly Val Leu Leu Gly Leu Glu Cys Gly Leu Gly Leu Leu Gly Asn 20 25 30 Ala Val Ala Leu Trp Thr Phe Leu Phe Arg Val Arg Val Trp Lys Pro 35 40 45 Tyr Ala Val Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Leu Ala Asp Leu Leu Leu Ala 50 55 60 Ala Cys Leu Pro Phe Leu Ala Ala Phe Tyr Leu Ser Leu Gln Ala Trp 65 70 75 80 His Leu Gly Arg Val Gly Cys Trp Ala Leu Arg Phe Leu Leu Asp Leu 85 90 95 Ser Arg Ser Val Gly Met Ala Phe Leu Ala Ala Val Ala Leu Asp Arg 100 105 110 Tyr Leu Arg Val Val His Pro Arg Leu Lys Val Asn Leu Leu Ser Pro 115 120 125 Gln Ala Ala Leu Gly Val Ser Gly Leu Val Trp Leu Leu Met Val Ala 130 135 140 Leu Thr Cys Pro Gly Leu Leu Ile Ser Glu Ala Ala Gln Asn Ser Thr 145 150 155 160 Arg Cys His Ser Phe Tyr Ser Arg Ala Asp Gly Ser Phe Ser Ile Ile 165 170 175 Trp Gln Glu Ala Leu Ser Cys Leu Gln Phe Val Leu Pro Phe Gly Leu 180 185 190 Ile Val Phe Cys Asn Ala Gly Ile Ile Arg Ala Leu Gln Lys Arg Leu 195 200 205 Arg Glu Pro Glu Lys Gln Pro Lys Leu Gln Arg Ala Gln Ala Leu Val 210 215 220 Thr Leu Val Val Val Leu Phe Ala Leu Cys Phe Leu Pro Cys Phe Leu 225 230 235 240 Ala Arg Val Leu Met His Ile Phe Gln Asn Leu Gly Ser Cys Arg Ala 245 250 255 Leu Cys Ala Val Ala His Thr Ser Asp Val Thr Gly Ser Leu Thr Tyr 260 265 270 Leu His Ser Val Val Asn Pro Val Val Tyr Cys Phe Ser Ser Pro Thr 275 280 285 Phe Arg Ser Ser Tyr Arg Arg Val Phe His Thr Leu Arg Gly Lys Gly 290 295 300 Gln Ala Ala Glu Pro Pro Asp Phe Asn Pro Arg Asp Ser Tyr Ser 305 310 315 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 5 cagcccatgg aacttcataa cctg 24 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 6 ctggccctca gccctgggag gag 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 7 gctgcctgca aagtcaacct 20 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 8 tggctgtgag gaagacaa 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe <400> 9 ccaccaaccg cacggcaa 18 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 10 ctcctgatca gcaacct 17 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 11 ttggtggaca gcatgaagag 20

Claims (29)

1. 도 1의 DNA 서열(서열 번호 1)을 포함하는 분리된 핵산 분자.
2. 엄격한 하이브리드화 조건 하에, 제1항의 분리된 핵산 분자와 하이브리드화 가능하거나, 또는 제1항의 분리된 핵산 분자에 상보적인 하이브리드화 프로브와 하이브리드화 가능한 분리된 핵산 분자.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 도 2의 아미노산 서열(서열 번호 2)을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
4. 제2항에 있어서, 서열 번호 2의 아미노산 서열과 30% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 탐지 가능한 수준으로 표지되는 분리된 핵산 분자.
6. 제5항에 있어서, 탐지 가능한 표지물이 효소, 방사성 동위원소, 또는 형광 화학물질을 포함하는 것인 탐지 가능한 수준으로 표지된 분리된 핵산 분자.
7. 도 2의 아미노산 서열(서열 번호 2)을 포함하는 정제된 폴리펩티드.
8. 제7항의 정제된 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
9. 제7항에 있어서, 탐지 가능한 수준으로 표지되는 정제된 폴리펩티드.
10. 제9항에 있어서, 탐지 가능한 표지물이 효소, 방사성 동위원소, 또는 형광 화학물질을 포함하는 것인 정제된 폴리펩티드.
11. 면역원으로서 제7항의 정제된 폴리펩티드를 갖는 항체.
12. 제11항에 있어서, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 키메라 항체로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 항체.
13. 제11항에 있어서, 탐지 가능한 수준으로 표지되는 항체.
14. 제13항에 있어서, 탐지 가능한 표지물이 효소, 방사성 동위원소 또는 형광 화학물질을 포함하는 것인 항체.
15. 발현 제어 요소와 작동가능하게 결합된, 제1항의 분리된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
16. 발현 제어 요소와 작동가능하게 결합된, 제2항의 분리된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 발현 제어 요소가 구성적 조절 서열, 세포-특이적 조절 서열 및 유도성 조절 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인 발현 벡터.
18. 제17항에 있어서, 발현 제어 요소가 프로모터인 발현 벡터.
19. 제18항에 있어서, 프로모터가 hCMV의 즉발 초기(immediate early) 프로모터, SV40의 초기 프로모터, 아데노바이러스의 초기 프로모터 , 백시니아의 초기 프로모터, 폴리오마의 초기 프로모터, SV40의 후기 프로모터, 아데노바이러스의 후기 프로모터, 백시니아의 후기 프로모터, 폴리오마의 후기 프로모터,lac시스템, trp시스템,TAC시스템,TRC 시스템 , 파아지 람다의 주요 작동인자 및 프로모터 영역, fd 외피 단백질의 제어 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 프로모터 , 산 포스파타제 프로모터 , 또는 효모 α 교배 인자의 프로모터를 포함하는 것인 발현 벡터.
20. 제15항 또는 제16항의 발현 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포.
21. 제20항에 있어서, 원핵성 세포 또는 진핵성 세포를 포함하는 숙주 세포.
22. 제21항에 있어서, 이. 콜라이, 슈도모나스, 바실루스, 스트렙토마이세스, 효모, CHO, R1.1, B-W, L-M, COS1, COS7, BSC1, BSC40, BMT10 또는 Sf9 세포를 포함하는 숙주 세포.
23. a) 제7항의 분리된 폴리펩티드의 발현을 제공해 주는 조건 하에, 제20항의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및

    b) 상기 숙주, 상기 배양물, 또는 이의 조합으로부터 상기 분리된 폴리펩티드를 회수하는 단계

    를 포함하여, 제7항의 분리된 폴리펩티드를 생성하는 방법.
24. GAVE6의 효능제, 길항제 또는 역 효능제를, 치료가 필요한 환자에게 투여함을 포함하여, 이러한 환자에게서 GAVE6 시그널링 활성 또는 시그널 전달을 조정하는 치료학적 방법.
25. 잠재적 효능제를 GAVE6 발현 세포와 접촉시키는 단계; 및 이러한 잠재적 효능제의 존재하에서의 GAVE6의 시그널링 활성이 상기 잠재적 효능제의 부재하에서의GAVE6의 활성에 비해 증가되는지 여부를 결정하는 단계를 포함하여, GAVE6의 효능제를 동정하는 방법.
26. 잠재적 역 효능제를 GAVE6 발현 세포와 접촉시키는 단계; 및 이러한 잠재적 역 효능제의 존재하에서의 GAVE6의 활성이 상기 잠재적 역 효능제의 부재하에서의 GAVE6의 활성에 비해 저하되고, 내인성 리간드 또는 효능제의 존재하에서 저하되는지 여부를 결정하는 단계를 포함하여, GAVE6의 역 효능제를 동정하는 방법.
27. 잠재적 길항제를 GAVE6 발현 세포와 접촉시키는 단계; 및 이러한 잠재적 길항제의 존재하에서의 GAVE6의 시그널링 활성이 내인성 리간드 또는 효능제의 존재하에서의 GAVE6의 활성에 비해 저하되는지 여부를 결정하는 단계를 포함하여, GAVE6의 길항제를 동정하는 방법.
28. GAVE6 시그널링 활성 또는 시그널 전달을 조정할 수 있는 GAVE6의 효능제, 길항제 또는 역 효능제를 포함하는 치료학적 조성물.
29. GAVE6 시그널링 활성 또는 시그널 전달을 조정할 수 있는 GAVE6의 효능제, 길항제 또는 역 효능제를 포함하는 치료학적 조성물을, 치료가 필요한 환자에게 투여함을 포함하여, 질병을 치료하는 방법.