TW200307688A - A nucleic acid encoding a G-protein-coupled receptor, and uses thereof - Google Patents

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200307688 A7 B7 五、發明說明（1) [發明所屬之領域] 本發明概括性地有關編碼GAVE6( —種迄今未知之 G·蛋白質-偶聯受體)之新穎核酸分子，以及該核酸分子與 GAVE6之用途。 5 [先前技術] G蛋白質-偶聯受體(GPCRs)為涉及細胞訊息傳導之大 家族組成膜蛋白（integral membrane proteins)。GPCRs 對 多種細胞外訊息（包括神經傳導素、激素、氣味劑及光)有 反應，能傳導訊息而於細胞内引發第二信使反應。許多治 10療藥劑以GPCRs為標的，因為該等受體傳介各式各樣的 生理性反應，包括炎症、血管擴張、心搏數、支氣管擴 張、内分泌分泌及蠕動。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 GPCRs的特徵為細胞外功能部位、七個跨膜功能部 位及細胞内功能部位。該等受體表現的一些功能（例如結 15 合配位體及與G蛋白質相互作用）與關鍵位置存在特定胺 基酸相關聯。例如，多項研究證實GPCRs中胺基酸序列 差異為對天然配位體或小分子致效劑或拮抗劑親和力差異 之主因。換言之，序列差異可說明結合親和力及活性之不 同（參見，例如，Meng et al·，J Bio Chem (1996) 20 271(50):32016-20 ; Burd et al·，J Bio Chem (1998) 273(51):34488-95 ;及 Hurley et al·，J Neurochem (1999) 72(1):413-21)。詳言之，研究已證實於第三細胞内功能部 位中之胺基酸序列差異會造成活性的不同。Myburgh等發

現親性腺素釋放激素受艘胞内第3環之丙胺酸261對G -3- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200307688 A7 B7 五、發明說明（2) 經濟部智慧財產局員工消费合作社印數 蛋白質偶聯及受體内化至為重要（Bioeheni j (1998) 331(Part 3):893-6)。Wonerow等研究促甲狀腺激素受體， 並證明第三細胞内環中之刪除產生組成性受艘活性(J Bi〇 Chem (1998)273(14):7900-5)。 通常，内源配位體與受體的結合作用導致受體細胞内 功能部位構像改變，而容許細胞内功能部位與細胞内成分 (G-蛋白質）間之偶聯。有數種G蛋白質存在，例如、 Gs、Gi、Gz、與 G。（參見，例如，Dessauer et al·，Clin Sci (Cloch) (1996) 91(5).527-37) 〇IC-3 環以及受體之羧基端 與 G 蛋白質互相作用（Pauwels et al·，Mol Neurobiol (1998) 17(1-3):109-135 及 Wonerow et al·，文獻同前）。有些 GPCRs對G蛋白質具「雜交性」，亦即，一個GPCR可 與一個以上的G蛋白質相互作用（參見，例如，Kenakin， Life Sciences (1988) 43:1095) 〇 經配位體活化之偶聯G蛋白質的GPCR開始傳訊級 聯程序(稱為「訊息傳導」）。此等訊息傳導最後導致細胞 活化或細胞抑制。 GPCRs以兩種不同的構像：「失活」狀態及「活 性」狀態，平衡地存在細胞膜中。呈失活狀態的受體不能 20 與細胞内傳訊轉導途徑連接以產生生物性反應（有例外， 例如在受體於轉導細胞中大量表現期間，參見例如， wwwxreighton.edu/Pharmacologv/inverse,htm.) 〇 調整構像 至活性狀態則容許其與轉導途徑連接(經由G蛋白質）而產 生生物性反應。致效劑最有可能結合及產生活性構像。然 -4· 5 10 15 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 訂

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五、發明說明（3) 而，有時候，在無任何致效劑存在下，若已有相當程度的 反應則此等受趙被稱為具組成性活性（亦即，已呈活性 構像或不依存配位體或自主性活性狀態）。添加致效劑至 該等系統中時，慣常地觀察到反應增強。但是，添加傳統 5的拮抗劑時，該等分子之結合未產生作用。相反地，有些 拮抗劑引致受體之組成性活性受抑制，顯示後組藥物技術 上而言並非拮抗劑而係具有負性固有活性之致效劑。彼等 藥物 稱為反 致效劑 (www.crcighton.edu/Pharmacology/iriverse.htm·)。 10 受體之傳統研究已在假設於發明前首先被鑑定出的内 源配位體可向前推進以鑑定拮抗劑及其他受艎效應分子下 進行中。縱使拮抗劑可能先被發現，惟教條式的反應為鑑 定内源配位體(WO 00/22131)。然而，欲達分析篩檢之目 的，以活性狀態最有用，獲得此等組成性受體，尤其是 15 GPCRs，將容許在缺乏有關内源配位體資訊下，容易地單 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 離致效劑、部分致效劑、反致效劑及拮抗劑。此外，對於 受體活性失調造成的疾病，藉由使用自主性活性狀態受體 之分析方法，可能更容易發現引致組成性活性受抑制（或 更詳言之，減少有效活化受體濃度）之藥物。例如，可被 20 轉導入病患中治療疾病之受體，其活性可能使用藉該等分 析法發現之反致效劑予以細微調整。 例如氣喘、慢性梗塞性肺疾(COPD)及風濕性關節炎 (RA)之疾病通常被認為具有涉及T幫手細胞、單核細胞_ 巨噬細胞及嗜曙紅細胞之發炎病因。目前使用皮質類固醇 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公爱） 200307688 A7 B7 五、發明說明（4) 之抗發炎療法對氣喘有效，惟與代謝性及内分泌副作用有 關。可經由肺或鼻黏膜被吸收之吸入性調配物可能亦如 此。迄今仍缺乏令人滿意的RA或COPD之口服療法。 嗜曙紅細胞傳介過敏及氣喘的許多氣道機能障礙。研 5 究已證實IL-5為組織嗜曙紅細胞過多及造成氣道過度反 應之由嗜曙紅細胞傳介的組織傷害所必需（Chang et al·，J Allergy Clin Immunol (1996) 98(5 pt 1):922-931 及 Duez et al·，Am J Respir Crit Care Med (2000) 161(1):200-206)。於 異位性氣喘中，IL-5係暴露於過敏原（例如家中塵蟎抗原） 10 後，由T-幫手-2-細胞(Th2)所製造。 一般相信，風濕性關節炎係由受到影響的關節滑膜中 堆積活化巨嗤細胞所造成。干擾素r (IFNr )為具有許多 初炎性性質之T-幫手-1 (Thl)細胞衍生之細胞激肽，其係 最具效力之巨噬細胞活化細胞激肽，誘導促成似樹狀細胞 15 表現型之MHC族II基因轉錄。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 脂多聽(fPS)為革蘭氏陰性細菌細胞壁的成分，其引 出包括釋放腫瘤壞死因子〇!(TNFa)之發炎反應。臨床上 已證實風濕性關節炎之靜脈内抗-TNFα療法之效力。慢 性梗塞性肺疾亦被認為係肺中堆積巨噬細胞所造成，巨嗟 20細胞產生嗜中性白血球化學吸引劑（例如，IL-8· deB〇eret al·, J Pathol (2000) 190(5):619-626)。巨嗟細胞與嗜中性白 血球二者均釋放引致肺泡壁降解的組織蛋白酶。一般相信 肺上皮組織可能是發炎細胞化學吸引劑與其他發炎細胞活 化劑之重要來源(參見，例如，Thomas et al.，J Virol (2000) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 x 297公爱) ----- 200307688 A7 B7 五、發明說明（5) 74(18):8425-8433 ； Lamkhioued et al.? Am J Respir Crit Care Med (2000) 162(2 Pt. 1):723-732 ;及 Sekiya et al·，J Immunol (2000) 165(4):2205-2213)。 慮及GPCRs在疾病中的角色及藉調節GPCRs活性治 5 療疾病的能力，先前未知的GPCRs之鑑定與碟認可提供 治療涉及GPCR活性的疾病之新穎組成物與方法之開 發。因此，業界所需求的為編碼迄今未知的GPCRs之新 穎且有用的核酸分子之發現、單離與確認。 業界尚需求的為利用該等迄今未知之GPCRs鑑定可 10作為特定GPCRs的潛在致效劑或拮抗劑用的分子之測定 法。這些分子可輕易地應用作為調節活體内GPCRs活性 之治療劑，因此，可治療許多與GPCR活性相關之病 症0 本文引用之任何文獻不擬構成容許該等文獻成為本申 15請案之「先前技藝」。 [發明内容] 發明概述 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明鑑定及確認新穎組成性活性GPCR，GAVE6， 之表現’並提供運用此發現鑑定與治療相關病症之組成物 20 與方法。 因此廣言之，本發明係有關一種單離之核酸分子，其 包括第1圖之DNA序列(SEQIDNOil)、其變異體、其片 段、或其類似物或衍生物。本發明之此等變異體可為對偶 質變異體、簡併變異體、或於序列中產生簡併變化之對偶 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規袼（210 X297公爱） 200307688 A7 B7

五、發明說明（〇 質變異體。 此外，本發明係有關在嚴苛雜交條件下，可與SEQ ϊβ N〇:l之單離核酸分子雜交的一種單離核酸分子。進一 步地，本發明亦有關在嚴苛雜交條件下，可與SEq id 5 N0:l之DNA序列互補的核酸分子雜交之一種單離核酸 分子。嚴苛雜交條件如下文所述。 再者，本發明也有關一種單離核酸分子，其包括編碼 含有SEQIDN0:2胺基酸序列的多肽之DNA序列。 視需要地，如上述之本發明之單離核酸分子可予以可 1〇 檢測地標記。可應用於本文之可檢測標記包含，惟當然不 限於酵素、放射性同位素、或發螢光之化學劑，其特定實 例如下文所述。 特定之多肽亦涵蓋於本發明叙圍之内，例如，本發明 乃有關純化之多狀’其包括SEQ ID NO:2之胺基酸序 15 列、其保留性變異體、或其類似物或衍生物。視需要地， 本發明之多肽可予以可檢測地標記。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 此外，本發明乃有關一種抗體，其係以本發明多版為 免疫原予以製造。這些抗艎可為單株抗體或多株抗體。再 者，抗體可為「嵌合型」，例如，其可包括於不同品種中 20對抗本發明純化多肽培殖的抗體之蛋白質功能部位。於特 定具體實例中，本發明抗體可予以「擬人化」。當然，本 發明抗體可予以可檢測地標記。可應用於本文之可檢測標 記之特定實例如下文所述。 本發明進一步有關一種表現載體，其包括起作用地結 -8- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公袭） 200307688 A7 B7 五、發明說明（7) 合表現控制元件之含SEQ ID NO:l DNA序列、其變異 體、其類似物或衍生物、或其片段之核酸分子。再者，本 發明之表現載體包括起作用地結合表現控制元件之於嚴苛 雜交條件下可與含SEQ ID NO:l DNA序列之單離核酸分 5子雜交之單離核酸分子，或於嚴苛雜交條件下可與和含 SEQ ID NO:l DNA序列之單離核酸分子互補之雜交探針 雜交者，其中該雜交探針係起作用地結合表現控制元件。 應用於本文之表現控制元件之特定實例為啟動子。應用於 本發明之特定啟動子之實例包含，惟不限於hCMV之早 10期啟動子、SV40之早期啟動子、腺病毒之早期啟動子、 疫苗之早期啟動子、多瘤之早期啟動子、SV40之晚期啟 動子、腺病毒之晚期啟動子、疫苗之晚期啟動子、多瘤之 晚期啟動子、/ac系、吵系、MC系、77?C系、λ噬菌 體之主要操縱基因及啟動子區域、fd外殼蛋白之控制區 15域、3_磷酸甘油酸激酶啟動子、酸性磷酸酶啟動子、或酵 母α交配因子之啟動子。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 使用本發明之表現載體，可將宿主細胞轉染或轉形及 產生包括SEQ ID ΝΟ:2胺基酸序列、或其變異體之多 肽。宿主細胞可為原核生物細胞或真核生物細胞。可應用 20於本文之單細胞宿主之特定實例包含大腸桿菌、假單胞 菌、桿菌、鏈球菌、酵母、CHO ' Rl.l、B-W、L-M、 COS卜 COS7、BSC1、BSC40、ΒΜΤ10 及 Sf9 細胞，僅 舉數例如上。 此外，本發明進一步有關製造包括SEQ ID NO:2胺 •9· 本紙張尺度適用中國國豕標準(CNS)A4規格（21〇 x 297公） 200307688

五、發明說明（8) 基酸序列、其變異體、或其片段之純化多肽的方法。該等 方法包括於提供表現該分離多肽的條件下，培養以本發明 表現載體轉形或轉染的宿主細胞，然後自該單細胞宿主、 宿主細胞周圍的培養液、或自二者中回收純化多肽。 5 此外，本發明有關鑑定可調節GAVE0活性的化合物 之測定方法。此等化合物可為GAVE6之致效劑、拮抗劑 或反致效劑。因此，本發明乃有關鑑定GAVE6致效劑之 方法，該方法包括使潛在致效劑與表現GAVE6的細胞於 内源配位艘存在下接觸，並測定相對於該潛在致效劑不存 1〇在下之GAVE6傳訊活性，該潛在致效劑存在下之 GAVE6傳訊活性是否增加。 同樣地，本發明係有關鑑定GAVE6反致效劑之方 法。該方法包括使潛在反致效劑與表現GAVE6的細胞接 觸’並測定相對於内源配位體或致效劑存在惟潛在反致效 15劍不存在的條件下之GAVE6傳訊活性，該潛在反致效劑 及内源配位蟬或致效劑存在下之GAVE6傳訊活性是否降 低，及於内源配位體或致效劑存在下是否降低。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 當然’本發明亦有關鑑定GAVE6结抗劑之方法。該 方法包括使潛在拮抗劑與表現GAVE6的細胞接觸，並測 20 定相對於内源配位體或致效劑存在下之GAVE6活性，該 潛在拮抗劑存在下之GAVE6傳訊活性是否降低。 因此，本發明之目的在於提供編碼GAVE6蛋白質、 其片段、或其變異體之單離之核酸序列。 本發明之目的亦在於提供包括SEQ ID NO:l DNA序 •10· 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200307688 Α7 Β7

五、發明說明（9 ) 列之核酸分子之變異體，或於嚴苛條件下可與SEQ ID Ν0:1雜交之核酸分子之變異趙。 本發明之進一步目的在於提供GAVE6、及其變異 體、其片段、或其類似物或衍生物之胺基酸序列。 5 本發明之進一步目的在於提供包括編碼GAVE6、其 變異體、其片段、或其類似物或衍生物的DNA序列之表 現載體’其中該DNA序列係起作用地結合表現控制元 件。 本發明之又一目的在於提供具有GAVE6、其變異 10體、其類似物或衍生物、或其片段為免疫原之抗體。 本發明之尚又一目的乃有關鑑定可調節GAVE6蛋白 質活性的化合物之方法。此等調節劑可為GAVE6之拮抗 劑、GAVE6之致效劑、或GAVE6之反致效劑。 本發明之更進一步目的在於提供用於調節GAVE6活 15性之醫藥組成物。此等調節作用可用於治療與GAVE6活 性相關的多種病症，例如各種發炎病症、氣喘、慢性梗塞 性肺疾(COPD)、及風濕性關節炎，僅舉數例如上。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 參照下文圓式及詳細說明將更瞭解本發明之彼等及其 他態樣。 20 發明之詳細說明 如上述說明，本發明係有關令人驚奇且未預期地發現 編碼迄今未知而於本文稱為GAVE6的G蛋白質-偶聯受 趙之迄今未知之核酸分子。特別是，頃發現GAVE6在免 疫組織或器官(例如腎、肝及小腸）中表現。 -11· ^張^適用中Μ國家標準(CNS)A4規格（21〇 χ 297 ) 200307688

下文敘述本發明整個說明書及申請專利範圍所用的多 個術語及名詞： 本文所用之「調節劑」一詞係指調節GAVE6活性之 基圏（例如，惟不限於配位體及候選化合物）。本發明之調 5節劑可為GAVE6之致效劑、部分致效劑、拮抗劑、或反 致效劑。 本文所用之「致效劑」一詞係指與受髏結合時活化細 胞内反應、或増進GTP與膜結合之基團（例如，惟不限於 配位體及候選化合物）。 1〇 本文所用之「部分致效劑」一詞係指與受體結合時活 化細胞内反應的程度/量比致效劑小、或增進GTp與膜結 合的程度/量比致效劑小之基團（例如，惟不限於配位及 候選化合物）。 本文所用之「拮抗劑」一詞係指與致效劑競爭結合於 15受體的相同位點之基困（例如，惟不限於配位體及候°^化 合物）。然而.，拮抗劑不活化由受體活化形式引發之細胞 内反應，因而可抑制利用致效劑或部分致效劑之細胞内反 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 應。於相關態樣中，拮抗劑不會減少致效劑或部分致效劑 不存在下之基線細胞内反應。 20 I文所用之「反致效劑」一詞係指與組成性活性受艘 結合及抑制基線細胞内反應之基圏（例如，惟不限於配位 體及候選化合物）。基線反應係由致賴或部分致效劑不 存在下或降低GTP與膜之結錢察到的活性正常基礎量 以下之受體活化形式所引發。 土 -12· 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規;χ 297公羞） 200307688 Α7 Β7 五、發明說明（11) 本文所用之「候選化合物」一詞係指經得起筛選技術 檢驗之基困（例如，惟不限於化學化合物）。於一具體實例 中，此名詞不包含廣為人知之選自包括GAVE6之致效 劑、部分致效劑、反致效劑或拮抗劑的化合物組群之化合 5物。彼等化合物係利用傳統藥物發現程序予以鑑定，包括 鑑定對受體具專一性之内源配位體，及/或篩選對抗受體 之候選化合物’其中該等篩選需要競爭性測定法以評估效

本文所用之「組成性活化受體」或「自主性活性受 10艘」二詞可於本文中互換使用，係指配位想不存在下使受 體進行活化。此等組成性活化受體可為内源（例如， GAVE6)或非内源；亦即，可利用重組方式修飾GpCRs , 以產生野生型GPCRs之突變組成形式（例如，參見EP 1071701 ; WO 00/22129 ; WO 00/22131 ;及美國專利案 15 ό，150,393與6，140,509，其全部内容併入本文以資參考）。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本文所用之「組成性受體活化作用」一詞係指利用使 受體與内源配位體或其化學對等物結合以外之方式穩定呈 活化狀態的受體。 本文所用之「配位體」一詞係指與另一分子結合之基 20困，其中該基團包含，惟不限於，激素或神經傳導素，及 進一步地，其中該基困立體選擇性地與受體結合。 本文所用之「家族」一詞，在指本發明之蛋白質或核 酸分子時，意指具有似乎常見的結構性功能部位及具有足 夠之如本文界定之胺基酸或核苷酸序列同一性的兩個或兩 •13· 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200307688 A7 B7 五、發明說明（12) 個以上蛋白質或核酸分子。該等家族成員可為天然存在及 可得自相同或不同品種。例如，家族中可含人類來源的第 一個蛋白質與鼠類來源之該蛋白質之同質物，以及第二 個，人類來源的截然不同之蛋白質與該第二個蛋白質之鼠 5類同質物。家族中的成員亦可具有常見的功能特性。 於本文中可互換使用之「GAVE6活性」、「GAVE6 之生物活性」及「GAVE6之功能活性」等詞係指由 GAVE0蛋白質、依標準方法於活體内或試管内測定的 GAVE6反應性細胞上之多肽或核睃分子所發揮的活性。 10 GAVE6活性可為直接活性，例如結合第二個蛋白質或第 二個蛋白質上之酵素活性；或為間接活性，例如由 GAVE6蛋白質與第二個蛋白質相互作用所傳介之細胞傳 訊活性。於特定具體實例中，GAVE6活性包含，惟不限 於至少一個或多個下述活性：⑴與GAVE6傳訊途徑中的 15 蛋白質相互作用的能力；（ii)與GAVE6配位體相互作用的 能力；及(iii)與細胞内標的蛋白質相互作用的能力。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 再者，根據本發明，可運用熟習此項技藝者習知之分 子生物、微生物、及重組DNA技術。該等技術於文獻上 有完整的說明。參見，例如，Sambrook，Fritsch & 20 Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (下文稱為’’Sambrook et al·， 1989) ； DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985) ； Oligonucleotide Synthesis (M.J. -14· 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 x 297公釐) 200307688 A7 B7 五、發明說明（13)

Gait ed. 1984) ； Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)] ； Transcription And Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)] ； Animal Cell Culture [R.L Freshney, ed. (1986)] ； Immobilized Cells And 5 Enzymes [IRL Press, (1986)] ； B. Perbal, A. Practical Guide To Molecular Cloning (1984) ； F.M. Ausubel et al. (eds.)5 Current Protocols in Molecular Biology^ John Wiley & Sons, Inc· (1994)。 因此，於本文出現時，下述術語具有下文陳述之界 10 定。 15 訂 「載體」為複製子，例如質體、噬菌體或黏接質體， 其可連接另一 DNA片段以引起該連接片段之複製。「複 製子」為具有活體内DNA複製的自主單元功能（亦即，能 於自身控制下進行控制）之任何基因元件(例如，質體、染 色體、病毒）。載體之特定實例敘述於下文。 「卡匣」係指可嵌入載體的專一限制切割位點之 DNA片段。DNA片段編碼引人關注之多肽，卡匣與限制 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 切割位點則經設計以確保卡匣嵌入供轉錄及轉譯之適當譯 讀架中。 20 當外源或異源DNA被引入細胞内部時，則稱細胞被 該等DNA「轉染」。當轉染的DNa產生表現型變化時， 則稱細胞被外源或異源DNA「轉形」。較佳為，轉形 DNA被整合入（共償連接於）組成細胞基因體的染色體 DNA 中。 -15- 本紙張尺度細+目國冢標準(CNS)A4規袼（210 X 297公董） 200307688 A7

五、發明說明（14) 異源」DNA係指不是天然存在細胞中或細胞的染 色體部位中之DNA。較佳為，異源DNA包含與細胞不相 干之基因。 「同質重組」係指於染色體中嵌入載體之外來DNA 序列。洋θ之，載體導向專一染色體位點，以進行同質重 組。專-同質重組時，載體含有足夠長之與染色體序列同 質之區域以容許互補結合並將載體併入染色體中。同質區 域較長，則序列相同性程度較高，可增加同質重组的效 率。 10 15 經 濟 部 智 慧 財 產 局 貝 工 消 費 合 作 社 20 主曼明之單離核酴 於一態樣中，本發明係有關單離之核酸分子，其包括 第1圖之DNA序列(SEQIDN0.1)、其變異體、其片段、 或其類似物或衍生物。 睃分子」係指磷酸酯聚合物形式之核糖核苷（腺 嘌呤核苷、烏嘌呤核苷、尿嘧啶核苷或胞嘧啶核苷； 「RNA分子」)或脫氧核糖核替(脫氧腺嗓呤核菩脱氧烏 嘌呤核苷、脫氧胸腺嘧啶核苷或脫氧胞嘧啶核菩； 「DNA分子」），或其任何磷酸酯類似物，例如呈單股形 式或雙股螺旋之硫代磷酸酯及硫酯。雙股dna_dna、 DNA-RNA及RNA-RNA職均可行。核酸分子一詞，詳 言之為DNA或RNA分子，僅係指一級與二級結構分 子，而不限制於任何特定三級形式。因此，此名詞包含， 例如’在線型或環型DNA分子(例如，限制切割片段）、 質體、及染巴趙中發現之雙股DNa^討論特定雙股 -16· $紙張尺度適用中0國家標準(qjS)A4規格（21G X 297公釐) 200307688 A7 B7 五、發明說明（is) DNA分子之結構時，本文之序列可依照正常慣例僅沿著 DNA非轉譯股5’至3’之序列方向予以敘述（亦即，該股具 有與mRNA同質之序列）。「重組DNA分子」為已進行 分子生物操控之DNA分子。 5 「單離」核酸分子為與存在該核酸天然來源中的其他 核酸分子分離者。詳言之，「單離」核酸分子不含與衍生 該核酸的生物基因體DNA中編碼GAVE6的核酸自然側 接之序列（亦即，位於該核酸5,端與3,端之序列）。於多個 具體實例中，單離之GAVE6核酸分子可含少於約5 kb、 10 訂 4 kb、3 kb、2 kb、1 kb、0·5 kb 或 0.1 kb 之與衍生該核酸 的細胞基因體DNA中之核睃分子自然側接之核苷酸序 列。此外，「單離」之核酸分子，例如cDNA分子，於 利用重組技術製造時，可實質上不含其他細胞物質或培養 基；於化學合成時，可實質上不含化學前驅物或其他化學 15 劑。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 本發明之核酸分子，例如，具有SEQ ID ΝΟ:1核苷 酸序列的核酸分子或任何該核答酸序列之片段或補體、或 其類似物或衍生物，可使用標準分子生物技術及本文提供 之序列資訊予以單離。使用所有或部分SEQ ID ΝΟ:1核 20酸序列作為雜交探針，可以標準雜交與選殖技術（例如，

Sambrookeia/中所述者）單離GAVE6核酸分子。

本發明核睃分子可以cDNA、mRNA或基因體DNA 為模板，及適當募核苷酸引子，根據標準PCR擴增技術 予以擴増。該等引子可使用SEq ID N〇:l敘述之資訊及 -17· 本紙張尺度適用中Η國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公爱） 200307688 A7 B7 五、發明說明（l6) 例行實驗室技術輕易地製造。經如此擴增的核酸可選殖入 適當載體中，並利用DNA序列分析予以確認。再者，對 應於GAVE6核苷酸序列之募核菩酸可利用標準合成技 術，例如，使用自動DNA合成儀，予以製備。 5 可輿GAVE6DNA雜交之簞離核酸分子 本發明進一步有關可與GAVE6 DNA雜交、可與嚴 苛雜交條件下GAVE6 DNA互補的雜交探針雜交、或於 嚴苛雜交條件下可與二者雜交之單離核酸分子。詳言之， 本發明係有關於嚴苛雜交條件下，可與含有SEQIDNO:l 10 DNA序列的核酸分子雜交、或與含有SEQ ID NO:l DNA 序列的單離核酸分子互補的探針雜交之單離核酸分子。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 於適當溫度與溶液離子強度條件下，當單股形式的核 酸分子可煉合於另一核酸分子時，則稱該核酸分子與另一 核酸分子（例如cDNA、基因體DNA、或RNA)「可雜 15 交」（參見Sambrook et al·，文獻同前）。溫度與離子強度等 條件決定雜考的「嚴苛性」。初步篩檢同質核酸時，可使 用相當於55°CTm之低嚴苛雜交條件(例如，5xSSC、0.1% SDS、0.25%牛奶、不含甲醯胺；或30%甲醯胺、5x SSC、0.5% SDS)。中度嚴苛雜交條件相當於較高之Tm， 20 例如，40%甲醯胺，帶有5x或6x SSC。高嚴苛雜交條件 相當於最高Tm，例如，50%甲醯胺，5x或6x SSC。雜交 需要兩個核酸含有互補序列，惟視雜交之嚴苛性而定，兩 個鹼基之間可能誤配。核酸雜交之適當嚴苛性取決於核酸 的長度與互補的程度，彼等為此項技藝中悉知之變數。兩 • 18- 本紙張尺度適財關家標準(CNS)A4規袼（21G χ 297公爱） - 200307688 A7 B7 五、發明說明（17) 個核答酸序列間相同或同質的程度愈高，具有這些序列的 核酸雜交之Tm值愈大。核酸雜交之相對穩定性(相當於較 高之Tm值）依下述順序遞減：RNA:RNA、DNA:RNA、 DNA:DNA 〇長度大於100個核苷酸的雜交，已獲得其Tm 5 計算等式（參見Sambrook et al·，文獻同前，9.50-0.51)。 較短的核酸（亦即，募核苷酸)之雜交，誤配的位置變得更 重要，該寡核菩酸的長度決定其專一性(參見Sambrook et al·，文獻同前，11·7-11·8)。可雜交的核酸分子，其最小 長度為至少約20個核苷酸；特別是至少約30個核苷酸； 10 更特別是至少約40個核苷酸；又更特別是至少約50個核 苷酸；尚更特別是至少約60個核苷睃。於本發明之特定 具體實例中，可雜交之本發明核酸分子，其長度為至少 300、325、350、375、400、425、450、500、550、600、 650、700、800、900、1000或1100個核苷酸，及於嚴苛 15條件下雜交於包括SEQ ID ΝΟ:1之核苷酸序列(較佳為編 碼序列）、其補體、或其片段之核酸分子。 經濟部智慧財產局貝工消费合作社印製 本文所用之「於嚴苛條件下雜交」意欲敘述於該等雜 交與洗滌條件下，至少55%、60%、65%、70%及較佳 7 5 %或更多彼此互補之核苷酸序列典型地保持雜交之條 20件。此等嚴苛條件為熟習此項技藝人士所悉知，並見 於’’Current Protocols in Molecular Biology，，，John Wiley & Sons，Ν·Υ· (1989)，6·3·1-6·3·6。嚴苛雜交條件之較佳、非 限制實例為於約45°C，在6Χ氣化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜 交，隨後於50-65t，在0.2X SSC、0.1% SDS中洗滌一 -19- ^紙張尺度適財目B家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐)一 200307688 A7 B7 五、發明說明（18) 或多次。較好，於嚴苛條件下，與SEq ID N〇:l序列或 其補體雜交之本發明單離核酸分子相當於天然存在之核酸 分子。本文所用之「天然存在之」核酸分子係指具有天然 發生的核苷酸序列（例如，編碼天然蛋白質）之RNA或 5 DNA分子。熟習此項技藝者將認知，慮及序列-專一性變 數(例如長度、富含G-C等），可修飾該等條件。 本發明意欲涵蓋用於診斷具有相同性質之似GAVE6 分子的GAVE6核酸片段。診斷片段可自GAVE6基因之 任何部分（包括側接序列）產生。該等片段可作為基因庫實 10施已知方法之探針用。 此外，本發明之核酸分子可僅包含編碼GAVE6的核 酸序列之一部分，例如，可作為探針或引子用之片段，或 編碼GAVE6活性部分之片段。舉例而言，該等片段可包 含，惟不限於，編碼SEQ ID NO:2約1至約14的胺基睃 15 殘基之區域。由人類GAVE6基因選殖決定之核苷酸序列 容許產生鑑零及/或選殖其他細胞類型（例如，從其他組 織)GAVE6同質物（以及得自其他哺乳類之GAVE6同質物) 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 用之探針及引子。探針/引子典型地含有實質上純化的募

核苷酸。募核苷酸典型地含有於嚴苛條件下與SEQ ID 20 NO:l意義或反義序列或SEQ ID ΝΟ:1天然存在的突變體 之至少約12個，較佳約25個，更佳約50、75、100、 125、150、175、200、250、300、350 或 400 個連續核菩 酸雜交之核苷酸區域。以人類GAVE6核苷酸序列為基礎 之探針可用於檢測編碼類似或相同蛋白質之轉錄本或基因 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公蘆） 200307688 A7 B7 五、發明說明（19) 體序列。 本文所用本發明單離核酸分子之「片段」或「部分」 等詞含有至少12個，特別是約25個，更特別是約50、 75、100、125、150、175、200、250、300、350 或 400 5 個連續核苷酸。因此，本發明單離核酸分子之「片段」不 只含1或2個核菩酸。 同樣地，本發明多肽之「片段」或「部分」含有至少 9個連續胺基酸殘基。本發明多肽片段之特定實例包含與 GAVE6抗體或其片段結合之抗原決定部位。 10 編碼「GAVE6生物活性部分」的核酸片段可利用將 編碼具有GAVE6生物活性的多肽之部分SEQ ID ΝΟ:1單 離，表現該GAVE6蛋白質編碼部分(例如，利用試管内 重組表現)及評估該GAVE6編碼部分之活性予以製備。 本發明進一步涵蓋由於基因密碼簡併而與SEQ ID N0:1 15核苷酸序列不同，惟編碼SEQ ID ΝΟ:1所示核苷酸序列 所編碼之相同GAVE6蛋白質的核酸分子。 B質核酸分早 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明進一步有關與GAVE6 DNA分子同質(例如， 與具有SEQIDNO.I DNA序列之單離核酸分子同質）之單 20離核酸分子。兩個DNA序列於其界定長度間有至少約 50%(較佳為至少約75%，及最佳為至少約9〇或95%)核 苷酸配對時，則稱此二DNA序列「實質上同質」或「實 質上類似」。實質上同質之序列可藉由利用使用預設參數 之序列數據庫中可用之標準軟體，或在例如，該特定系統 -21- 本紙張尺度綱+ S目ii^s)A4^⑽--一^一一^ 200307688 A7 B7 五、發明說明（2〇) 所界定之嚴苛條件下之南方雜交實驗中，比較序列予以鑑 定。適當雜交條件之界定乃屬熟習此項技藝者之範圍内。 參見’例如 ’ Maniatis et al.，文獻同前；DNA Cloning， V〇ls· I & II，文獻同前；Nucieic Acid Hybridization，文 5 獻同前。此外，具有與人類GAVE6不同的核苷酸序列之 編碼得自其他品種的GAVE6蛋白質（GAVE6同質物)之核 酸分子意欲涵蓋於本發明範圍之内。 夫發明單鎗核酸分手之轡異體 本發明進一步係有關包含SEQ ID N0:1 DNA序列的 10單離核酸分子之變異體。此等變異體可為簡併體、對偶質 艘、或其組合。 相當於本發明GAVE6 cDNA之天然對偶質變異體與 同質物之核酸分子，可根據與本文揭示的人類GAVE6核 酸之同一性，於嚴苛雜交條件下，使用人類cDNA或其 15 一部分作為雜交探針，根據標準雜交技術予以單離。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 本文所用之「相當於」一詞係指類似或同質序列，無 論其確實位置和欲測定類似性或同質性的分子相同與否。 因此，「相當於」一詞係指序列類似性，而不是胺基酸殘 基或核脊酸驗基之編號。 20 此外，由於基因密碼中密碼子之簡併性質，本發明之 GAVE6蛋白質可由許多單離核酸分子所編碼。「簡併性 質」係指使用不同的三字母密碼子指定根據基因密碼之特 定胺基酸。此項技藝中已悉知下述密碼子可交換使用以編 碼各特定胺基酸： •22- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公爱） 200307688 A7 B7 五、發明說明（21)

UUU 或 UUC UUA或UUG或CUU或CUC或

CUA 或 CUG

AUU 或 AUC 或 AUA

AUG

GUU 或 GUC 或 GUA 或 GUG UCU或UCC或UCA或UCG或 AGU 或 AGC

CCU 或 CCC 或 CCA 或 CCG

ACU 或 ACC 或 ACA 或 ACG

GCU 或 GCG 或 GCA 或 GCG

UAU 或 UAC

CAU 或 CAC

CAA 或 CAG

AAU 或 AAC

AAA 或 AAG

GAU 或 GAC

GAA 或 GAG

UGU 或 UGC

CGU或CGC或CGA或CGG或 AGA 或 AGG

GGU 或 GGC 或 GGA 或 GGG UGG UAA(赭石）或UAG(琥珀）或 UGA(蛋白石） 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 苯丙胺酸(Phe或F) 白胺酸(Leu或L) 異白胺酸(lie或I) 甲硫胺酸(Met或M) 纈胺酸(Val或V) 絲胺酸^Ser或S) 脯胺酸(Pro或P) 蘇胺酸(Thr或T) 丙胺酸(Ala或A) 酪胺酸(Tyr或Y) 組胺酸(His或H) 麩胺醯胺(Gin或Q) 天冬醯胺(Asn或N) 離胺酸(Lys或K) 天冬胺酸(Asp或E)) 麩胺酸(Glii或E) 半胱胺酸(Cys或C) 精胺酸(Arg或R) 甘胺酸(Gly或G) 色胺酸(Trp或W) 終止密碼子· 應瞭解的是，上文指明之密碼子係用於RNA序列。 用於DNA之對應密碼子係以τ取代xj。 除了 SEQ ID ΝΟ:1所示人類GAVE6核苷酸序列之 外，熟習此項技藝人士將認知，導使GAVE6之胺基酸序 列改變之DNA多形現象可於族群(例如，人類族群)之内 存在。由於天然的對偶質變異，GAVE6基因中之此等基 因多形現象可於族群内之個體之間存在。對偶基因為於特 -23· 本紙張尺度適用中0國家標準(CNS)A4 ^"(210x297公釐)_ A7 B7 200307688 五、發明說明（

I 定基因位置交替發生的基因群之一。本文所用「基因」及 「重組基因」等詞係指包含編碼GAVE6蛋白質（較佳為 哺乳類GAVE6蛋白質）的開放譯讀架構之核酸分子。本 文所用之「對偶質變異體J係指發生於GAVE6位置之核 5苷酸序列或係指由該核苷酸序列所編碼之多狀。替代對偶 基因可利用於許多相異個艎中將引起關注之基因定序予以 鑑定。此可利用以雜交探針於多種個體中鋥定相同基因位 置容易地進行。為天然對偶質變異結果且不改變GAVE6 功能活性之任何及所有該等核苷酸變異艘與所得胺基酸多 10 形現象或GAVE6變異體均欲涵蓋於本發明範圍之内。 訂 此外，本發明單離核酸分子之變異體可由熟習此項技 藝者使用例行實驗室技術，例如，定位導向之突變處理， 容易地予以製造。 反義核苷酸序列 15 本發明亦有關反義核酸分子，亦即，與編碼蛋白質之 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 意義核酸互補（例如，與雙股cDNA分子之編碼股互補或 與mRNA序列互補）之分子。因此，反義核酸可與意義核 酸可以氫鍵結合。反義核酸可與整個GAVE6編碼股或僅 與其一部分（例如，全部或部分之蛋白質編碼區域，或開 20 放譯讀架構)互補。反義核酸分子可對編碼GAVE6的核 苷酸序列編碼股之非編碼區域反義。非編碼區域（「5’與 3’未轉譯區域」）為側接編碼區域及不轉譯成胺基酸之5’ 與3’序列。

以編碼本文揭示的GAVE6之編碼股序列（例如SEQ -24- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 B7 200307688 五、發明說明（23) ID ΝΟ:1)為前提下，可根據Watson & Crick驗基配對規則 設計本發明之反義核酸。反義核酸分子可與GAVE6 mRNA的整個編碼區域互補，惟較佳為僅與GAVE6 mRNA的部分編碼區域或非編碼區域互補之寡核苷酸。 5 例如，反義寡核苷酸可與圍繞GAVE6 mRNA轉譯起始位 點的區域互補。反義寡核苷酸可為，例如，約5、10、 15、20、25、30、35、40、45或50個核苷酸長。本發明 之反義核酸可利用此項技藝中已知之程序，使用化學合成 及酵素黏接反應予以構築。舉例而言，反義核酸(例如， 10 反義募核苷酸）可使用天然存在的核苷酸或設計用來增加 分子的生物穩定性或增加反義及意義核酸間形成的雙鏈 (duplex)之物理穩定性之各種經化學修飾之核苷酸進行化 學合成，例如，可使用硫代磷酸酯衍生物、膦酸酯衍生物 及吖啶取代之核苷酸。 15 可用來產生反義核酸之改質核苷酸之實例包括5-氟 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氣尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌 呤、黃嘌呤、4-乙醯基胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、 5-羧甲基胺甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基胺甲基尿嘧啶、二 氫尿嘧啶、冷-D-半乳糖Q核苷、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌 20 呤、1·甲基烏嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基烏嘌呤、2-甲基腺嗓吟、2-甲基烏嗓岭、3-甲基胞喷咬、5_甲基胞喷 咬、以_腺嘌呤、7-甲基烏嘌呤、5-甲基胺甲基展喊咬、5-甲氧胺甲基_2-硫代尿嘧啶、泠甘露糖Q核苷、5_甲氧 羧甲基尿嘧啶、5-甲氧尿嘧啶、2_曱硫基-N6-異戊烯基腺 -25· 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 B7 200307688 五、發明說明（24) 嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸、維丁氧苷(wybutoxosine)、假 屎嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、 2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5·氧基乙酸、5-甲基-2-硫代尿嘧 5 啶、3-(3-胺基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶及2,6_二胺基嘌呤。 或者，反義核酸可使用其中已於反義方向次選殖入核酸 (亦即，自嵌入核酸轉錄之RNA在所關注的標的核酸之反 義方向）之表現載體進行生物製造。 本發明之反義核酸分子典型地係投與實驗對象或於原 10 處產生以與編碼GAVE6蛋白質之細胞mRNA及/或基因 體DNA雜交或結合，藉以抑制蛋白質之表現，例如，利 用抑制轉錄及/或轉譯。雜交可利用習知之核苷酸互補性 以形成穩定雙鏈，或，例如，於與DNA雙鏈結合的反義 核酸分子之情形下，經由於雙螺旋主要凹谷之專一性相互 15 作用，或至GAVE6之調控區域。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明反義核酸分子投與途徑之實例包括直接注射於 組織部位。或者，可修飾反義核酸分子以導向選定細胞， 然後進行全身投與。例如，供全身投與時，可修飾反義分 子，俾使該等分子與表現於選定細胞表現之受體或抗原結 20 合，例如，藉連接反義核酸分子至與細胞表面受體或抗原 結合之胜肽或抗體。亦可使用本文所述載體將反義核酸分 子遞送至細胞。欲達成反義分子足夠之細胞内濃度時，以 其中反義核酸分子置於強pol II或pol III啟動子控制下之 載體構築體較佳。 -26- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200307688 A7 B7 五、發明說明（25) 本發明之反義核酸分子可為α-反構體核酸分子° α-反構體核酸分子與互補RNA形成專一性雙股雜化物，其 雙股互相平行（Gaultier et al·，Nucleic Acids Res (1987) 15:6625-6641)。反義核酸分子亦可包含甲基核糖核苷酸 5 (Inoue et al·，Nucleic Acids Res (1987) 15:6131-6148)或嵌 合型 RNA-DNA 類似物（Inoue et al·，FEBS Lett (1987) 215:327-330) 〇 核糖酶 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 本發明亦涵蓋核糖酶。核糖酶為具有核糖核酸酶活性 10 之催化性RNA分子，其能分割單股核酸，例如與核糖酶 雜交之mRNA。因此，核糖酶(例如，敘述於Haselhoff et al·，Nature (1988) 334:585-591之鎚頭核糖酶)可用於分割 催化性GAVE6 mRNA轉錄本，因而抑制GAVE6 mRNA 之轉譯。對編碼GAVE6的核酸具專一性之核糖酶可以本 15 文揭示的GAVE6 DNA核苷酸序列（例如，SEQ ID ΝΟ:1) 為基礎予以芩計。例如，可構築四膜蟲(Tetrahymena) L-19 IVS RNA之衍生物，俾使活性部位之核苷酸序列與編 碼GAVE6的mRNA中欲被分割的核苷酸序列互補，參 見，例如，美國專利案4,987,071與5，116,742。或者， 20 GAVE6 mRNA可用於從許多RNA分子中選擇具有專一 性核糖核酸酶活性之催化性RNA，參見，例如，Bartel et al·，Science (1993) 261:1411-1418。 本發明之三股螺旋核酸分子及胜肽枋醢 本發明亦涵蓋形成三股螺旋結構的核酸分子。例如， -27· 本紙張尺度適用中關家鮮(CNS)A4規格（21G X 297公釐) ' —------ 200307688 A7 B7 五、發明說明（26) GAVE6基因表現可藉引導與GAVE6調控區域（例如， GAVE6啟動子及/或促進子）互補的核苷酸序列形成防止 GAVE6基因於標的細胞中轉錄之三股螺旋結構予以抑 制，參見概括而言，Helene，Anticancer Drug Des (1991) 5 6(6):569 ; Helene Ann NY Acad Sci (1992) 660:27 ;及

Maher, Bioassays (1992) 14(12):807 o 於特定具體實例中，本發明核酸分子可就鹼基部分、 糖部分或磷酸鹽主鏈加以修飾以增進，例如，分子之穩定 性、雜交作用或溶解性。例如，可修飾核酸之脫氧核糖磷 10 酸鹽主鏈而產生胜肽核酸(參見Hyrup et al·，Bioorganic &

Medicinal Chemistry (1996) 4:5)。本文所用之「胜狀核 酸」或「PNAs」等詞係指核酸模擬物，例如，DNA模擬 物，其中脫氧核糖磷酸鹽主鏈被假胜肽主鏈置換，僅保留 四個天然核鹼基。PNAs之中性主鏈已證實容許於低離子 15 強度條件下專一性雜交於DNA及RNA。PNA寡聚物之 合成可使用如Hyrup et al· (1996)文獻同前；Perry- O’Keefe et al·，Proc Natl Acad Sci USA (1996) 93:14670 所 述之標準固相胜肽合成實驗流程進行。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 GAVE6之PNAs可用於治療及診斷用途。舉例而 20 言，藉由，例如，誘發遏止轉錄或轉譯或抑制複製， PNAs可作為反義或抗基因劑用，以供基因表現之序列專 一性調節。GAVE6之PNAs亦可，例如，藉由PNA引導 之PCR夾持(PCR clamping)，於基因中用於分析單一驗基 對突變；與其他酵素組合使用時，成為人工限制切割酶， -28- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規袼（210 X 297公釐） 200307688 A7 B7 五、發明說明（27) 例如，S1核酸酶(Hyrup et al· (1996)文獻同前）；或成為供 DNA序列及雜交之探針或引子(Hyrup et al· (1996)文獻同 前；Perry-O’Keefe et al· (1996)文獻同前）。 於另一具體實例中，可修飾GAVE6之PNAs，例 5 如’藉由於PNA連接親脂基困或其他輔助基困、藉由形 成PNA-DNA嵌合體或藉由使用微脂粒或此項技藝中已知 之其他藥物遞送技術，以提高穩定性、專一性或細胞攝 入。PNA-DNA嵌合體之合成可如Hyrup et al. (1996)文獻 同前；Finn et al·，Nucleic Acids Res (1996) 24(17):3357-10 63 ; Mag et al·，Nucleic Acids Res (1989) 17:5973 ;及

Peterser et al., Bioorganic Med Chem Lett (1975) 5:1119 ff\ 述予以進行。 GAVE6 I白皙 此外，本發明乃有關一種單離之多肽，其包括第2圖 15 之胺基酸序列(SEQ ID ΝΟ··2)、其變異體、其片段或其類 似物或衍生物。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 編碼具有與SEQ ID ΝΟ:2不同序列的GAVE6蛋白質 (例如變異體)之單離核酸分子，可藉於SEQ ID ΝΟ:1核苷 酸序列中引入一或多個核苷酸取代、添加或刪除而產生， 20 俾使於編碼蛋白質中引入一或多個胺基酸取代、添加或刪 除。 於特定具體實例中，可測定GAVE6蛋白質之下述能 力：⑴於GAVE6傳訊途徑中，與諸蛋白質形成蛋白質: 蛋白質相互作用之能力；（2)與GAVE6配位體之結合能 •29- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200307688 A7 B7 五、發明說明（28 ) 力；或（3)與細胞内標的蛋白質之結合能力。於又另一具 體實例中，可測定GAVE6突變體調節細胞增殖或細胞分 化的能力。 原態GAVE6蛋白質可藉使用標準蛋白質純化技術之 適當純化程序，自細胞或組織來源單離。或者，可利用重 組DNA技術，容易地製造GAVE6蛋白質。本發明所涵 蓋之又一選擇為使用標準胜肽合成技術之GAVE6蛋白質 或多肽化學合成法。 10 15 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 费 合 作 社 20 經「單離」或「純化」之蛋白質，或其生物活性部 分，實質上不含細胞物質或得自GAVE6蛋白質所衍生的 細胞或組織來源之其他污染蛋白質，或於化學合成時，實 質上不含化學前驅體或其他化學劑。「實質上不含細胞物 質」一詞包括GAVE6蛋白質製劑，其中蛋白質與得自蛋 白質分離從出或重組製造的細胞之細胞成分分離。因此， 實質上不含細胞物質之GAVE6蛋白質包含具有少於約 30%、20%、10%或5%或更少（以乾重計）非GAVE6蛋白 質（本文中亦稱為「污染蛋白質」）之GAVE6蛋白質製 劑。當GAVE6蛋白質或其生物活性部分係重組製造時， 較好亦實質上不含培養基，亦即，培養基少於蛋白質製劑 容積之約20%、1〇〇/0或5%或更少。當GAVE6蛋白質係 以化學合成法製造時，較好實質上不含化學前驅體或其他 化學劑，亦即，將其與合成蛋白質時涉入之化學前驅體或 其他化學劑分離。因此，此等GAVE6蛋白質製劑具有少 於約30%、20%、10%或5%或更少（以乾重計)之化學前驅 •30-

200307688 A7 B7 五、發明說明（29) 體或非GAVE6化學劑。 GAVE0蛋白質之生物活性部分或片段包含由與 GAVE6蛋白質之胺基酸序列（例如，SEQ ID NO:2所示之 胺基酸序列）充分相同或自其衍生之胺基酸序列構成的胜 5肽，其含有比全長GAVE6蛋白質更少的胺基酸，並展現 至少一種GAVE6蛋白質活性。典型地，生物活性部分包 括具有至少一種GAVE6蛋白質活性之功能部位或主結構 (motif)。GAVE6蛋白質之生物活性部分可為，例如， 10、25、50、100或更多個胺基睃之多狀。特別的生物活 10 性多肽包含一或多個經鑑定之GAVE6結構功能部位。 訂 此外，該蛋白質之其他區域缺失之其他生物活性部分 可利用重組技術製備，及評估一或多種原態GAVE6蛋白 質功能性活性。 I 脅 其他有用的GAVE6蛋白質實質上與SEQ ID NO:2相 15 同且保留SEQ ID NO:2的蛋白質之功能性活性，惟由於 天然的對偶質變異或突變，造成胺基酸序列不同。例如， Λ 該等GAVE6蛋白質及多肽具有至少一種本文所述之生物 活性。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 因此，有用的GAVE6蛋白質為包含與SEQ ID ΝΟ:2 20 之胺基酸序列至少約45%、較佳55%、65%、75%、 85%、95%、99%或100%相同的胺基酸序列，及保留含 SEQ ID ΝΟ:2的GAVE6蛋白質功能性活性之蛋白質。於 特定具體實例中，GAVE6蛋白質保留含SEQ ID ΝΟ:2的 GAVE6蛋白質之功能性活性。 •31- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200307688 A7 B7 五、發明說明（30) 欲測定兩個胺基酸序列或兩個核酸之相同性百分率 (percent identity)時，為了最佳比較目的，對序列進行排 比[例如，可於第一個胺基酸或核酸序列引入空隙(gaps)， 俾使與第二個胺基酸或核酸序列達成最佳排比]。然後比 5 較對應胺基酸位置或核苷酸位置之胺基酸殘基或核苷酸。 當第一序列中的位置被與第二序列中對應位置相同之胺基 酸殘基或核苷酸佔據時，則該等分子於該位置被視為相同 (identical)。兩序列間之相同性百分率為該等序列所享有 的相同位置數之函數[亦即，相同性百分率=相同位置數/ 10 總位置(例如，重疊位置)數X 100]。於一具體實例中，兩 序列具有相同長度。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 兩序列間相同百分率之計算可使用數學演算法完成。 用於比較兩序列的數學演算法之特定、非限制實例為 Karlin et al·，Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87:2264 之演 15 算法，如 Karlin et al·，Proc Natl Acad Sci USA (1993) 90:5873-5877中所述予以修飾。此等演算法被併入 Altschul et al.，J Mol Bio (1990) 215:403 之 NBLAST 與 XBLAST程式中。BLAST核苷酸搜尋可與NBLAST程序 執行，例如，得分=100，字長=12，獲得本發明GAVE6 20 核酸分子之核苷酸序列同質物。BLAST蛋白質搜尋可與 XBLAST程序執行，例如，得分=50，字長=3，獲得本發 明GAVE6蛋白質分子之胺基酸序列同質物。欲獲得供比 較目的之空隙棑比，可使用如Altschul et al.，Nuleic Acids Res (1997) 25:3389 所述之 Gapped BLAST。或者，可使 -32·* ^紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 χ 297公釐) 200307688 A7 B7 五、發明說明（31) 用PSI-Blast執行檢測分子間遠距關係之重複搜尋 [Altschul et al. (1997)文獻同前]。使用 BLAST、Gapped BLAST與PSI-Blast程式時，可使用各個程式之預設參數 (例如，XBLAST 與 NBLAST),見 5 http: //www ·ncbi ·nlm ·nih · gov 〇 比較序列用的數學演算法之另一特定、非限制實例為 Myers et al·，CABIOS (1988) 4:11-17 之演算法。將此等演 算法併入為GCG序列排比套裝軟體一部分之ALIGN程 式(2·0版）中。使用ALIGN程式比較胺基酸序列時，可使 10用PAM120重量殘基表，空隙長度扣12分及空隙扣4 分。 兩序列間之相同百分率可使用與上述類似之技術，容 許空隙存在或不存在下，予以測定。計算相同百分率時， 僅计算正確之配對。 15 本發明進一步有關GAVE6嵌合型或融合蛋白質。本 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 文所用之G今VE6「敌合型蛋白質」或「融合蛋白質」包 括起作用地連接於非GAVE6多肽之GAVE6多肽。 ^GAVE6多肽」係指具有對應於GAVE6的胺基酸序列 之多狀。「非-GAVE6多肽」係指具有對應於非實質上與 20 GAVE6蛋白質相同的蛋白質（例如，與GAVE6蛋白質不 同而係衍生自相同或不同器官的蛋白質）之胺基酸序列之 多肤。於GAVE6融合蛋白質内，GAVE6多肽可對應於 所有或部分GAVE6蛋白質，較佳為對應於GAVE6蛋白 質之至少一個生物活性部分。於融合蛋白質内，「起作用 -33- 本紙張尺度翻+ a目家鮮(C卿从規格 7210 x 297 公釐） 200307688 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 费 合 作 社 A7 B7 五、發明說明（32) 地連接」意欲表示GAVE6多狀與非_GAVE6多肽彼此對 框(in-frame)融合。非-GAVE6多肽可融合於（JAVE6多肽 之N-端或C-端。一有用之融合蛋白質為GST-GAVE6, 其中GAVE6序列融合於麵胱甘肽-S-轉移酶(GST)之C-5 端。此等融合蛋白質可促進重組GAVE6的純化。 於另一具鱧實例中，本發明之融合蛋白質延伸至 0八¥£6_免疫球蛋白融合蛋白質，其中所有或部分GAVE6 融合於衍生自許多免疫球蛋白蛋白質家族之序列。本發明 之GAVE6-免疫球蛋白融合蛋白質可併入醫藥組成物中， 10 投與病患以抑制GAVE6配位體與GAVE6蛋白質間於細 胞表面之相互作用，因而壓抑活體内由GAVE6傳介之訊 息傳導。可使用GAVE6-免疫球蛋白融合蛋白質來影響 GAVE6關聯配位體之生物利用性。GAVE6配位體· GAVE6作用之抑制可能具有治療用途，用於治療增殖性 15 及分化性疾病及調節（例如促進或抑制）細胞存活。此外， 本發明之G今VE6_免疫球蛋白融合蛋白質可作為免疫原， 以於病患體内製造抗-GAVE6抗體、純化GAVE6配位體 及於薛檢分析中鑑定抑制GAVE6與GAVE6配位體相互 作用之分子。 於特定具體實例中，本發明之GAVE6嵌合型或融合 蛋白質係以標準重組DNA技術製造。舉例而言，根據習 知技術將編碼不同多肽序列之DNA片段對框黏接在一 起例如，使用黏接用鈍端或交錯端、限制切割韓分解以 提供適當端點、適當填入黏性末端、鹼性磷酸酶處理以避 -34- 規格（210 X 297 公釐）

訂 鱗 200307688 A7 _ B7 五、發明說明（33) 免不為所欲之接合及酵素黏接。於另一具體實例中，利用 包括自動DNA合成儀之習知技術可合成融合基因。或 者，可使用錨狀引子進行基因片段之pCR擴增，引起兩 個一致基因片段間之互補突出，接著可煉合、再擴增產 5生喪合型基因序列（見例如，Ausubel et al·，文獻同前）。 此外，已編碼融合部分(例如，GST多肽）的許多表現載體 為市售可得。可將編碼GAVE6的核酸選殖入該等表現載 體中，使該融合部分與GAVE0蛋白質對框連接。 變異體 10 如上述說明，本發明進一步有關GAVE6蛋白質之變 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 異體。例如，可使用標準技術，例如定位導向突變及 PCR傳介之突變，將變異引入SEQ ID NO:2之胺基酸序 列中。此外，可針對一或多個預料之非必需胺基酸殘基進 行保留性胺基酸置換。「保留性胺基酸置換」為其中胺基 15 酸殘基被具有類似側鏈之胺基酸殘基取代者。例如，一或 多個胺基酸可被具有類似極性之另一胺基酸（其具有功能 性對等物之作用）置換，產生緘默改變。本發明多肽胺基 酸序列内之胺基酸置換可選自該胺基酸所屬組別之其他成 員。例如，非極性(疏水性）胺基酸包括丙胺酸、白胺酸、 20 異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸及甲硫胺 酸。含有芳族環結構的胺基酸為苯丙胺酸、色胺酸及酪胺 酸。極性中性胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱 胺酸、酪胺睃、精胺酸、及麩胺酸。帶正電荷（鹼性)之胺 基酸包括精胺酸、離胺酸及組胺酸。帶負電荷（酸性)之胺 -35- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200307688 A7 B7 五、發明說明（34 ) 基酸包括天冬胺酸及麵胺酸。此等改變不被預期影響由聚 丙醯胺凝膠電泳法測定之表觀分子量或等電點。 特佳之置換為·· -以Lys置換Arg，反之亦然，俾使保持帶正電荷； 5 以Glu置換Asp，反之亦然，俾使保持帶負電荷； -以Ser置換Thr，俾使保持游離; -以Gin置換Asn，俾使保持游離_nh2。 此外，亦可引入具有特佳性質的胺基酸之胺基睃置 換。例如，可引入Cys以提供與另一 cys的二硫鍵結之 10潛在位置，可引入呈特殊「催化」位置之His(亦即，His 具有酸或鹼的作用，為生化催化反應中最常見之胺基 酸）’Pro由於其特殊平面結構(其誘導蛋白質結構之石·翻 轉）而被引入。 突變亦可沿著所有或部分GAVE6編碼序列被無規引 15入(例如利用飽和突變），然後篩檢所得突變體之GAVE6 生物活性，q鑑定保留活性之突變體。突變之後，可重組 表現所編碼之蛋白質，並可測定蛋白質活性。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 本發明之變異體具有如GAVE6致效劑(模擬物）或如 GAVE0拮抗劑之功能。GAVE6蛋白質之變異體可利用突 20變產生’例如’ GAVE6蛋白質之固定點(discrete point)突 變或切截。GAVE6蛋白質之致效劑可實質上保留天然存 在的GAVE6蛋白質之相同或部分生物活性。例如， GAVE6蛋白質之拮抗劑可競爭性地結合於包含GAVE6 蛋白質的細胞傳訊級聯之下游或上游成員，因而抑制天然 -36- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 x 297公釐） 200307688 A7 __ B7 五、發明說明（35；) 存在形式GAVE6蛋白質之一或多種活性。因此，利用以 限制功能的變異體治療，可誘發專一生物效應。相對於以 天然存在形式GAVE6蛋白質治療，利用具有天然存在形 式GAVE6蛋白質部分生物活性的變異體對病患進行治 5 療，病患的副作用較少。 經濟部智慧財產工消费合作社印敦 具有如GAVE6致效劑(模擬物）或如GAVE6拮抗劑 功能的GAVE6蛋白質變異體，可利用篩檢GAVE6蛋白 質變異體(例如，平截變異體）組合庫之GAVE6致效劑或 拮抗劑活性予以鑑定。於一具體實例中，各式各樣 10 GAVE6變異體庫係利用核酸層次之組合突變產生，而由 各式各樣基因庫所編碼。各式各樣GAVE6變異體庫可藉 下述方法產生：例如，酵素性地將合成募核苷酸混合物黏 接成為基因序列，俾使潛在GAVE0序列簡併組呈各個多 肽表現，或者，呈其内含該組GAVE6序列之較大融合蛋 15白質組(例如，供噬菌體展示庫）表現。從簡併募核苷酸序 列製造潛在9AVE6變異體庫可使用多方法。簡併基因序 列之化學合成可於自動DNA合成儀中進行，然後將合成 的基因黏接於適當表現載體。基因簡併組之使用係慮及可 於一混合物中提供編碼所需潛在GAVE6序列組之所有序 20列。簡併寡核苷酸之合成法為此項技藝中所已知（參見， 例如，Narang，Tetrahedron (1983) 39:3 ; Itakura et al·，Ann Rev Biochem (1984) 53:323 ; Itakura et al·，Science (1984) 198:1056 ； Ike et al.5 Nucleic Acid Res (1983) 11:477) ° 此外，GAVE6蛋白質編碼序列之片段庫可用來產生 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規袼（210 X 297公釐） 200307688 A7 B7 五、發明說明（36 ) 各式各樣的GAVE6片段族群，以供GAVE6蛋白質變異 體之篩檢及接績之選擇Q於一具體實例中，編碼序列片段 庫之產生可藉於每分子只發生約一次缺口之條件下，以核 酸酶處理GAVE6編碼序列之雙股PCR片段；使該雙股 5 DNA變性；將DNA復性，形成可包含得自不同缺口產物 的意義/反義對之雙股DNA ;利用以S1核酸酶處理，自 再形成之雙鏈中移除單股部分，及將所得片段庫黏接成為 表現載體。利用該方法，可獲得編碼各種大小GAVE6蛋 白質的N_端及内部片段之表現庫。 1〇 篩檢利用位單點突變或平截製造的組合庫基因產物及 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製

篩檢cDNA庫中具有選定性質的基因產物之數種技術為 此項技藝中已知。可改造該等技術以迅速篩檢由GAVE6 蛋白質之組合突變產生之基因庫。經得起檢驗的筛檢大基 因庫高產能分析最廣為使用之技術典型地包括：將基因庫 15 選殖入可複製之表現載體中；以所得載體庫轉形適當載 體；於所需汚性之檢測有助於其產物被檢測的基因編碼載 體之單離的條件下，表現組合基因。遞迴式整體突變 (recursive ensemble mutagenesis，REM)，一種提高庫中功 能性突變體頻率的技術，可與篩檢分析法組合使用，以鑑 20 定 GAVE6 變異體[Arkin et al·，Proc Natl Acad Sci USA (1992) 89:7811-7815 ; Delgrave et al·，Protein Engineering (1993) 6(3):327-331] 〇 GAVE6類似物及衍生物 此外，本發明亦包含以化學修飾法製造之GAVE6衍 -38- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200307688

五、發明說明（37) 生物或類似物。本發明之GAVE6蛋白質可於蛋白質部分 連接一或多個化學基團予以衍化。 刀 好允居之必學差嚴—適用於衍化之化學基圏可選自 水溶性聚合物，使該GAVE6類似物或衍生物於水性環境 5 (例如生理職）巾*會職。視需要地，該聚合物為醫= 上可接受者。熟習此項技藝人士可基於例如該聚合物/成 分共輛體是否可於治療上使用，若然，則所需劑量、運行 時間、對蛋白水解的抗性、及其他考慮因素等考量選擇所 需之聚合物。GAVE6 ,可使用本文提供之測定法予以確 10疋。具有本文用途之水溶性聚合物包含，惟不限於，聚乙 二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、糊精、聚 乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-u_二噚環戊烷、聚q，3,6_ 二噚烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或者無 規共聚物）、糊精、聚（正乙烯基吡咯啶酮）聚乙二醇、丙 15二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙基化 之多醇或聚&稀醇。聚乙二醇丙搭由於在水中之穩定性而 於製造上具有優點。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 聚合物可具有任何分子量，及可具分支鏈或直鏈。以 聚乙二醇而言，為了容易操作及製造，較佳之分子量介於 20約2 kDa與約1〇〇 kDa之間（「約」一詞代表聚乙二醇製 劑中’有些分子較所述分子量重，有些則較輕）。視所需 治療性質（例如，所需緩釋性持續時間、若存在之對生物 活性、操作容易性、抗原性的程度或缺乏之效應、及聚乙 二醇對治療性蛋白質或類似物之其他已知效應）而定，可 •39- 本紙張尺度適用中國國豕標準(CNS)A4規格x A7 B7 200307688 五、發明說明（38) 使用其他大小。 如此連接於GAVE6之聚合物分子數可不同，熟習此 項技藝者可確定其功能上之效應。通常可以相同或不同的 化學基困（例如，聚合物，如不同重量之聚乙二醇類）予以 5 單一衍化，或可提供二-、三-、四·或更多衍化組合。聚 合物分子對GAVE6分子之比例可不同，其於反應混合物 中之濃度亦然。通常最適比例（就無過量未反應成分或諸 成分與聚合物之反應效率而言）由例如所需衍化程度（例 如，單、二·、三、等）、所選擇聚合物分子量、聚合物 10 為直鏈或具分支鏈、及反應條件等因素決定。 聚乙二醇分子（或其他化學基團）須慮及對GAVE6功 能性或抗原性功能部位之影響而連接於GAVE6。熟習此 項技藝者有許多可運用之連接方法，例如，併入本文供參 考用之EP 0 401 384 (連接PEG於G-CSF)，亦參見Malik 15 et al·，1992, Exp· Hematol· 20:1028-1035 (記載使用三氟乙 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 確醯氣之G^i-CSF之聚乙二醇化）。舉例而言，聚乙二醇 可藉反應基，例如，游離胺基或羧基，經由胺基酸殘基共 價結合。反應基為可與活化之聚乙二醇分子結合者。具有 游離胺基之胺基酸殘基包括離胺酸殘基及N-端胺基酸殘 20基；具有游離羧基者包括天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基及 C-端胺基酸殘基。亦可使用硫氫基作為反應基，以連接聚 乙二醇分子。供治療用途較佳者為連接於胺基，例如連接 於N-端或離胺酸基困。 通常可能特定需要N·端經化學修飾之GAVE6。使用 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 x 297公釐） ' A7 B7 200307688 五、發明說明（39) 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 聚乙二醇作為本發明組成物之說明下，通常可從多種聚乙 二醇分子（由分子量、分支性等）、反應混合物中聚乙二醇 分子對GAVE6分子之比例、所進行聚乙二醇化反應之種 類、及獲得選定N-端聚乙二醇化蛋白質之方法予以選 5 擇。獲得N-端聚乙二醇化製劑（亦即，如果需要則自其他 單聚乙二醇化基團中分離此基團）之方法可為對得自聚乙 二醇化蛋白質分子族群之N-端聚乙二醇化物質進行純 化。選擇性N·端化學修飾可藉由利用GAVE6之衍化中可 用的不同類型一級胺基之不同反應性(離胺酸對N-端）之還 10 原性烧化作用達成。於適當反應條件下，以含幾基之聚合 物達成GAVE6於N-端之實際選擇性衍化。例如，於容許 利用離胺酸殘基£_胺基與GAVE6N-端殘基〇：_胺基間的 pKa差異之pH下進行反應，可將GAVE6選擇性地N-端 聚乙二醇化。利用此等選擇性衍化，可控制水溶性聚合物 15 與GAVE6之連接：與聚合物之共輛主要發生於GAVE6 之N-端，其他反應基困，例如離胺酸側鏈胺基，則無明 顯的修飾作用發生。使用還原性烷化作用，水溶性聚合物 可能屬上述類型，及應具有供連接於GAVE6之單一反應 醛。可使用含單一反應醛之聚乙二醇丙醛。 20 GAVE0、其#異體、其片段、或其類似物或衍生物之抗 1 可使用單離之GAVE6蛋白質或其部分或片段作為抗 原，使用製備多株與單株抗體之標準技術產生結合 GAVE6之抗體。本文所用「抗體」一詞意指免疫球蛋白 •41- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200307688

五、發明說明（40) 分子及免疫球蛋白分子之具免疫學活性部分，亦即含有專 一性地結合抗原（例如GAVE6，或其片段）的抗原結合部 位之分子。專一性地結合抗原之分子為結合GAVE6，但 實際上不結合試樣(例如，自然含有GAVE6之生物試樣) 5中之其他分子之分子。免疫球蛋白分子之具免疫學活性部 分之實例包含可利用以酵素(例如胃蛋白酶)處理抗體產生 之haw與F(ab，)2片段。本發明提供以GAVE6、其變異 體、其片段、或其類似物或衍生物作為免疫原之多株、單 株及嵌合型抗體。用於治療人類病症或失調症時，以嵌合 10型抗體為佳，因為人類或擬人化抗體本身不似異種抗體般 地可能誘發免疫反應，特別是過敏反應。 可使用全長GAVE6蛋白質作為免疫原，或者，本發 明提供GAVE6之抗原性胜肽片段作為免疫原。GAVE6 之抗原性胜肽含有SEQ ID NO:2所示胺基酸序列之至少8 15 個（較佳為10、15、20、30或更多個）胺基酸殘基，及涵 蓋GAVE6 $抗原決定部位，俾使對抗該胜肽培殖之抗艘 與GAVE6形成專一免疫錯合物。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 典型地係使用GAVE6免疫原對適當對象(例如，兔 子、山羊、小鼠或其他哺乳動物）進行免疫處理，以製備 20 抗趙。適當免疫原製劑可含有，例如，重組表現之 GAVE6蛋白質或化學合成之GAVE6多肽。製劑中可進 一步包含佐劑，例如佛氏(Freund’s)完全或不完全佐劑或 類似之免疫促進劑。以免疫原性GAVE6製劑對適當對象 之免疫處理誘發多株抗-GAVE6抗艘反應。 -42· 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公 200307688 _ B7 -—------一· -__ 五、發明說明（41) 本發明之抗體可為單株抗體、多株抗體、或嵌合型抗 體。本文所用之「單株抗艘」或「單株抗體組成物」係指 僅含-種能與GAVE6之特定抗>^決定彡卩位進行免疫反應 的抗原結合部位之抗體分子族群。單株抗體組成物因此典 5型地表現對特定GAVE6蛋白質抗原決定部位之單一結合 親和性。 多株抗-GAVE6抗體可如上述，藉以GAVE6免疫原 對適當對象進行免疫處理予以製備。經免疫對象之抗· GAVE6抗體力價可利用標準方法進行經時偵測，例如使 10用固定化GAVE6之酵素連結免疫吸附測定法(ELISA)。 如果需要’則可從哺乳動物（例如，從血液）單離對抗 GAVE6之抗體分子，進一步利用悉知技術(例如蛋白質A 層析法）予以純化，獲得IgG區分。於免疫處理後之適當 時間，例如，當抗-GAVE6抗體力價達最高值時，可自該 15對象獲取產生抗體的細胞，用以利用標準技術製備單株抗 體，該等技辦如源自 Kohler et al.，Nature (1975) 256:495-497所述之融合瘤技術、人類B細胞融合瘤技術(Kohler 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 et al·，Immunol Today (1983) 4:72)、EBV 融合瘤技術(Cole et al·，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, (1985)， 20 Alan R· Liss，Inc·，ρρ·77-96)或三瘤技術。產生融合瘤之技 術已悉知（概括地參見 Current Protocols in Immunology (1994) Coligan et al·，eds.，John Wiley & Sons，Ine.，New

York，NY)。簡言之，將不朽的細胞株(典型地為骨髓細胞 瘤）融合於得自如上述以GAVE6免疫原進行免疫處理的 -43- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 200307688 at B7 五、發明說明（42) 哺乳動物之淋巴細胞(典型地為脾細胞），篩檢所得融合瘤 細胞之培養上澄液，以鑑定產生與GAVE6結合的單株抗 體之融合瘤。 為了產生抗-GAVE6單株抗體，可運用融合淋巴細胞 5 及不朽細胞株所用許多悉知實驗流程之任一者（參見，例 如，Current Protocols in Immunology,文獻同前；Galfre et al.? Nature (1977) 266:550-552 > Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Coq).，New York, N.Y· (1980);及 10 Lerner，Yale J Biol Med (1981) 54:387·402)。此外，熟習 此項技藝者將認知，該等方法的許多變通方法亦可使用。 典型地，不朽細胞株(例如，骨髓瘤細胞株)係衍生自與淋 巴細胞相同之哺乳動物品種。例如，鼠類融合瘤可利用融 合得自以本發明免疫原製劑進行免疫處理的小鼠之淋巴細 15 胞與不朽小鼠細胞株[例如，對含次黃嘌呤、胺基喋呤及 胸腺核苷的哼養基（「HAT培養基」）敏感之骨髓瘤細胞株] 予以製造。根據標準技術，可使用許多骨髓瘤細胞株之任 一者作為融合搭擋，例如，P3-NSl/l-Ag4_l、Ρ3-χ63-Ag8.653或Sp2/0-Agl4骨髋瘤細胞株。該等骨趙瘤細胞 20 株可自ATCC獲得。典型地，係使用聚乙二醇(“PEG”)將 對HAT敏感的小鼠骨髓瘤細胞融合於小鼠脾細胞。接著 使用殺死未融合與無成效融合骨髄瘤細胞（未融合的脾細 胞由於未轉形，於數天後死亡)之HAT培養基選擇融合產 生的融合瘤細胞。藉筛檢融合瘤培養物上澄液中與 -44- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐）

200307688 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 五、發明說明（43) AVE6結合的抗艘(例如，使用標準eusa測定法），檢 測產生本發明單株抗體之融合瘤細胞。 製備分泌單株抗體的融合瘤之另一方法為，利用以 GAVE6 _檢重㈣組合免疫球蛋白庫(例如，抗體嗔菌艘 5展示庫）而鑑定及單離單株抗-GAVE6抗體，因而將結合 GAVE6之免疫球蛋白庫成員單離。產生及篩檢噬菌體展 示庫用之套組為市售可得（例如，the pharmada Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400- 01 ;及 Ae Stratagene “SURFZAP” Phage Display Kit, 10 (Catalog No. 240612) 〇 此外，特別適用於產生及篩檢抗體展示庫的方法及試 劑之實例見述於下述文獻中：美國專利案5,223,409 ; PCT 公告案 WO 92/18619 ; PCT 公告案 WO 91/17271 ; PCT 公告案 WO 92/20791 ; PCT 公告案 WO 92/15679 ; 15 PCT 公告案 WO 93/01288 ; PCT 公告案 WO 92/01047 ; PCT 公告案 WO 92/09690 ; PCT 公告案 WO 90/02809 ;

Fuchs et al., Bio/Technology (1991) 9:1370-1372 ； Hay et al” Hum Antibody Hybridomas (1992) 3:81-85 ; Huse et al·，

Science (1989) 246:1275-1281 ;及 Griffiths et al.，EMBO J 20 (1993) 25(12):725-734。 再者，重組抗-GAVE6抗體，例如包含人類與非人類

部分的嵌合型及擬人化單株抗體，可使用標準重組DNA 技術製造。此等嵌合型及擬人化單株抗體之製造可利用此 項技藝中已知之重組DNA技術，例如使用下述文獻中敘 -45· 本張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210X297公爱) "

A7 B7 200307688 五、發明說明（44) 述之方法：PCT公告案WO 87/02671 ;歐洲專利申請案 184，187 ;歐洲專利申請案171,496 ;歐洲專利申請案 173,494 ; PCT公告案 WO 86/01533 ;美國專利案 4,816,567 ;歐洲專利申請案 125,023 ; Better et al·， 5 Science (1988) 240:1041-1043 ; Liu et al·，Proc Natl Acad Sci USA (1987) 84:3439-3443 ； Lin et al.? J Immunol (1987) 139:3521-3526 ； Sun et al., Proc Natl Acad Sci USA (1987) 84:214-218 ； Nishimura et al.5 Cane Res (1987) 47:999-1005 ; Wood et al·，Nature (1985) 314:446-449 ; Shaw et al·， 10 J Natl Cancer Inst (1988) 80:1553-1559 ； Morrison, Science (1985) 229:1202-1207 ; Oi et al·，Bio/Techniques (1986) 4:214 ;美國專利案 5,225,539 ; Jones et al·，Nature (1986) 321:552-525 ； Verhoeyan et al.? Science (1988) 239:1534 l 及 Beidler et al·，J Immunol (1988) 141:4053-4060。 15 供治療人類病患用時，特別需要完全人類抗體。此等 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 抗體之製造可使用無法表現内源免疫球蛋白重鏈及輕鏈基 因、惟可表現人類重鏈及輕鏈基因之基因選殖小鼠。使用 選定抗原（例如，所有或部分GAVE6)，以正常方式對基 因選殖小鼠進行免疫處理。對抗該抗原之單株抗體可使用 20 習知融合瘤技術獲得。基因選殖小鼠所懷的人類免疫球蛋 白選殖基因於B細胞分化期間重排，接著進行類別交換 (class switching)與體細胞突變。因此，例如，使用該等抗 原決定部位，可鑑定抑制GAVE6活性之抗體。選殖重鏈 及輕鏈非人類抗體，並用以製造噬菌體展示Fab片段。例 -46· 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） A7 B7 200307688 五、發明說明（45) 如，可將重鏈基因選殖入質體載體中，俾使該重鏈可自細 菌分泌。輕鏈基因可選殖入噬菌體外殼蛋白基因中，俾使 該輕鏈可於嗔菌體表面表現。使用融合於嗔菌體的整個 (無規聚集）人類輕鏈感染表現非人類重鏈之細菌。所得後 5 代噬菌體表現煉合抗體（人類輕鏈/非人類重鏈）。於左右定 位篩檢(panning screen)中，使用選定抗原挑選與其結合之 噬菌體。需經數回合之挑選，方可鑑定出此等噬菌艘。 從結合該選定抗原之選定噬菌體中，將人類輕鏈基因 單離。然後使用該選定之人類輕鏈基因如下文所述引導人 10 類重鏈基因之挑選：將該選定之人類輕鏈基因嵌入由細菌 表現之載體中；以融合於噬菌體的整個人類重鏈感染表現 該選定人類輕鏈之細菌；所得後代噬菌體展現人類抗體 (人類輕鏈/人類重鏈）。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 接著，於左右定位篩檢中，使用選定抗原挑選與其結 15 合之噬菌體。經選定之噬菌體展現完全人類抗體，此抗體 識別原先選芩、非人類單株抗體所識別之相同抗原決定部 位。單離出同時編碼重鏈及輕鏈之基因，進一步予以操作 以製造人類抗體。此技術由Jespers et al. (Bio/Technology (1994) 12:899-903)敘述。 2〇 以標準技術，例如親和性層析法或免疫沉澱法，可使 用抗_GAVE6抗體(例如，單株抗體）單離GAVE6。抗· GAVE0抗體可促進天然GAVE0自細胞中之純化及於宿 主細胞中表現的重組製造GAVE6之純化。此外，抗· GAVE6抗體可用於檢測GAVE6蛋白質（例如，於細胞性 -47- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 B7 200307688 五、發明說明（46) 溶胞產物或細胞上澄液中），以評估GAVE6蛋白質之大 量表現及表現模式。抗-GAVE6抗體可為臨床測試程序之 一部分而診斷性地用於偵測組織中之蛋白質層次，例如， 用於測定指定治療療程之效應。如下文所述，將抗體連接 5 於可檢測物質，可促進檢測。 可檢測之標該 視需要地’本發明單離核酸分子、本發明多狀、與本 發明抗體、以及該等基團之片段，可施以可檢測之標誌。 適當標誌包括酵素、螢光團[例如，螢光異硫氰酸鹽 10 (FITC)、藻紅蛋白(PE)、德州紅(TR)、薔薇紅、游離或鉗 合鑭系鹽（特別是Exi3+)等]、發光困、放射性同位素、鉗 合劑、染料、膠態金、乳膠粒、配位體(例如，生物素）、 生物發光物質、及化學發光劑。使用控制標記時，受體及 控制標記可使用相同或不同標誌。 15 使用放射性標誌，例如3H、14C、32P、35S、36C1、 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 51Cr、57Co、:8Co、59Fe、9()Y、125I、131I、及 186Re 之情形 下，可使用目前已知可用之計數程序。於標誌為酵素的情 形下，可利用此項技藝中目前使用之比色、光譜測定、螢 光測定、電流測定或氣體測定等技術之任一者達成檢測。 20 直接標誌為根據本發明可用標誌之一實例。直接標誌 被界定為呈天然狀態時，以肉眼或藉助於光學濾片及/或 施用激發(例如，以U.V.光引起螢光）易於被看見之實體。 根據本發明可用的有色標誌之實例包含金屬溶膠粒，例 如，如Leuvering(美國專利案4,313,734)所述之金溶膠 -48- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公爱） 200307688 A7 B7 五、發明說明（47 ) 粒；如 Gribnau et al.(美國專利案 4,373,932)與 May et al.(W〇 88/08534)所述之染料溶膠粒；如May(文獻同 前）、Snyder (EP-A 0 280 559 與 0 281 327)所述之染色乳 膠；或如Campbell et al.(美國專利案4,703,017)所述之封 5 裝於微脂粒中之染料。其他直接標誌包含放射性核苷酸、 螢光基團或發光基團。除了彼等直接標誌裝置外，包括酵 素在内之間接標誌亦可根據本發明予以使用。多種連接酵 素之免疫測定法為此項技藝中悉知，例如，鹼性磷酸酶與 辣根過氧化酶、溶菌酶、葡萄糖-6-磷酸鹽脫氩酶、乳酸 10 脫氫酶、脲酶，彼等及其他實例已由Eva Engvall於 加五似少讲70，419-439，1980 之 Enzyme Immunoassay ELISA and EMIT 及美國專利案 4,857,453 中 詳細討論。 用於本發明之其他標誌包含磁珠或磁共振影像標誌。 15 於另一具體實例中，可於本發明單離多肽、本發明抗 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 體、或其片磲上，產生供32P標記用之磷酸化位點，例 如，見述於Sidney Pestka之歐洲專利案0372702(申請案 號 89311108.8)或 1995 年10月17日頒給卩(《”61161&1.之 美國專利案5,459,240。 20 如本發明所例示，蛋白質，包括抗體，可利用代謝性 標誌予以標記。代謝性標記發生於在補充代謝性標誌(例 如[35S]-甲硫胺酸或[32P]·正磷酸鹽）的培養基存在下表現蛋 白質的細胞之活體外細胞培養期間。除了以[35S]-甲硫胺 酸進行代謝性（或生物合成性)標記外，本發明進一步慮及 -49- ^張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公爱） ^ 200307688 B7 五、發明說明（48) 以[14C]·胺基酸及[3H]-胺基酸(其中氚取代於非不穩定位 標記。 重組表現載體及宿主細胞 本發明之另一態樣乃有關含編碼GAVE6(或其部分） 5的核酸之載體，較佳為表現載體。如上述說明，一種載體 為「質體」，其係指環形雙股DNA環，其中可黏接另外 的DNA斷片。另一種載體為病毒載體，其中另外的Dna 斷片可黏接入病毒基因體中。特定載體能於宿主細胞中自 主性複製’例如具有細菌複製起點之動物載體及游離基因 10哺乳動物載體。其他載體(例如，非游離基因哺乳動物載 艘）則於引入宿主細胞内時整合入宿主細胞基因體中，因 而與宿主基因體一起複製。此外，表現載體能引導可操作 地連接其上的基因之表現。一般而言，用於重組DNA技 術中之表現載體常呈質體(載體)形式。然而，本發明意欲 15包含該等其他形式之表現載體，例如提供對等功能之病毒 載體(例如，嗥製缺陷逆轉錄酶病毒、腺病毒及腺關聯病 毒）。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 本發明之重組表現載體含有本發明之核酸分子，其呈 適於在宿主細胞中表現該核酸之形式。換言之，本發明之 20 重組表現載體包含根據供表現用的宿主細胞選定之一或多 個調控序列，係可操作地連接於欲表現的核酸。於重組表 現載體内，「可操作地連接」意指該引起關注之核苷酸序 列係以容許表現該核苷酸序列之方式（例如，於活體外轉 錄/轉譯系統中，或當載體被引入宿主細胞内時之宿主細 -50- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公董） A7 B7 200307688 五、發明說明（49) 胞中中），連接於調控序列。「調控序列」一詞意欲包含 啟動子、促進子及其他表現控制元件（例如，聚腺苷酸化 作用訊息）。此等調控序列見述於，例如’ Goeddel，Gene Expression Technology: Methods in Enzymology Vol. 185, 5 Academic Press，San Diego，CA (1990) Q 調控序列包含， 於許多類型宿主細胞中引導核苷酸序列之組成表現者，例 如，組織專一性調控序列。熟習此項技藝者將認知，表現 載髏之設計取決於例如欲轉形宿主細胞之選擇、所需蛋白 質之表現量等因素。本發明之表現載體可被引入宿主細胞 10 中，以製造如本文所述、由核酸編碼的蛋白質或胜肽(例 如，GAVE6蛋白質、突變形式之GAVE6、融合蛋白 等）。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 本發明之重組表現載體可經設計，以於原核生物或真 核生物細胞[例如，細菌細胞如大腸桿菌、昆蟲細胞(使用 15 桿狀病毒表現載體）、酵母細胞或哺乳動物細胞]中表現 GAVE6。適當宿主細胞於Goeddel(文獻同前）中進一步敘 述。或者，可於活體外轉錄及轉譯重組表現載體，例如’ 使用噬菌體調控元件與蛋白質，例如，T7啟動子及/或T7 聚合酶。 20 原核生物中之蛋白質表現最常在大腸桿菌（其含有引 導融合或非融合蛋白質表現的組成性或可誘導啟動子之載 體）中進行。融合載體添加許多胺基睃至其編碼之蛋白 質，通常添加於重組蛋白質之胺基端。此等融合載艘典髮 地提供三項目的：1)增加重組蛋白質的表現；2)增加重·组 •51- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） 200307688 A7 B7 五、發明說明（5〇) 蛋白質的溶解度；及3)於親和性純化中，利用呈配位體 之作用而有助於重組蛋白質之純化。時常，於融合表現載 趙中’在融合基團與重組蛋白質之接合點引入蛋白水解切 割位點，俾使於純化該融合蛋白質後，將重組蛋白質與融 5 合基困分離。此等酵素與關聯識別序列，包含Xa因子、 凝血酶及腸激酶。典型的融合表現載體包含分別融合麩胱 甘肽5-轉移酶(GST)、麥芽糖E結合蛋白或蛋白質A於標 的重組蛋白質之 pGEX [Pharmacia Biotech Inc ; Smith et al.5 Gene (1988) 67:31-40] ^ pMAL (New England Biolabs, 10 Beverly，MA)及 pRITS (Pharmacia，Piscataway，NJ) o 適當之可誘導非融合大腸桿菌表現載體實例包括 pTrc [Amann et al·，Gene (1988) 69:301_315]與 pET lid [Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology，Academic Press，San Diego, California (1990) 15 185:60-89]。得自pTrc載體之標的基因表現取決於得自雜 交trp-lac融合啟動子之宿主RNA聚合酶轉錄作用。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 使大腸桿菌之重組蛋白質表現增加至最大限度之一策 略為於能力受損的宿主中表現該蛋白質，以蛋白水解式地 切割該重組蛋白質[Gottesman，Gene Expression 20 Technology: Methods in Enzymology，Academic Press，San Diego, California (1990) 185:119-128]。另一策略為修改嵌 入表現載體内的核酸分子之核酸序列，俾使各胺基酸之個 別密碼子為大腸桿菌中優先利用者[Wada et a1·，Nucleic

Acids Res (1992) 20:2111-2118]。本發明核酸序列之此等 -52- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 x 297公釐） 200307688 A7 B7 五、發明說明（51) 修改可利用DNA合成技術進行。 於另一具體實例中，GAVE0表現載體為酵母表現載 體。酵母（例如& cerevb/ae)中表現載體之實例包括 pYepSecl [Baldari et al·，EMBO J (1987) 6:229_234]、 5 pMFa [Kurjan et al.5 Cell (1982) 30:933-943] - pJRY88 [Schultz et al·，Gene (1987) 54:113-123]、pYES2 (Invitrogen Corporation， San Diego，CA)及 pPicZ (Invitrogen Corporation，San Diego, CA)。 或者，可使用桿狀病毒表現載體，於昆蟲細胞中表現 10 GAVE0。於培養的昆蟲細胞(例如，sf 9細胞）中表現蛋白 質可用之桿狀病毒載體包括pAc系列[Smith et al·，Mol Cell Biol (1983) 3:2156-2165]及 pVL 系列[Lucklow et al·， Virology (1989) 170:31-39]。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 於又一具體實例中，本發明核酸係使用哺乳類表現載 15 體，於哺乳類細胞中表現。具有本文用途的哺乳類表現載 體之實例包食，惟不限於pCDM8 [Seed，Nature (I987) 329:840]及 pMT2PC [Kaufman et al·，EMBO J (1987) 6:187-195]。使用於哺乳動物細胞時，表現載體的控制功 能常由病毒調控元件所提供。例如，常用之啟動子係衍生 20自多瘤病毒、腺病毒2、巨細胞病毒及猿猴病毒40。至於 用於原核生物及真核生物細胞之其他適當表現系統，參見 Sambrook et al·(文獻同前）之第16與17章。 於另一具體實例中，本發明之重組鳴乳類表現載體能 引導核酸優先於特定細胞類型中表現(例如，使用組織專 -53· 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200307688 A7 B7 五、發明說明（52) 一性調控元件來表現核酸）。組織專一性調控元件於此項 技藝中為已知。適當組織專一性啟動子之非限制實例包括 白蛋白啟動子[肝臟專一性；Pinkert et al·，Genes Dev (1987) 1:268-277]、淋巴專一性啟動子[Calame et al.，Adv 5 Immunol (1988) 43:235-275]，特別是，T細胞受體之啟動 子[Winoto et al·，EMBO J (1989) 8:729-733]與免疫球蛋白 [Banerji et al·，Cell (1983) 33:729-740 ; Queen et al·，Cell (1983) 33:741-748]、神經元專一性啟動子[例如，神經細 絲啟動子；Byrne et al.，Proc Natl Acad Sci USA (1989) 10 86:5473-5477]、胰臟專一性啟動子[Edlund et al.，Science (1985) 230:912-916]及乳腺專一性啟動子[例如，乳清啟動 子；美國專利案4,873,316及歐洲申請案264，166]。發育 性地-調控之啟動子亦涵蓋在内，例如鼠類hox基因啟動 子[Kessel et al·，Science (1990) 249:374-379]及 α-胳兒蛋 15 白啟動子[Campes et al·，Genes Dev (1989) 3:537-546]。 本發明埤一步提供含有呈反義方向選殖入表現載體中 的本發明DNA分子之重組表現載體。亦即，該DNA分 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 子係以容許表現(利用DNA分子之轉錄作用）與GAVE6 mRNA反義的RNA分子之方式起作用地連接於調控序 20 列。可選擇起作用地連接呈反義方向選殖的核酸之調控序 列，而引導該反義RNA分子於各種細胞類型中之持續表 現。可選擇病毒啟動子及/或促進子或調控序列，而引導 反義RNA之組成性、組織專一性或細胞類型專一性表 現。反義表現載體可呈重組質體、噬菌質體或致弱病毒之 -54- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐) A7 B7 200307688 五、發明說明（53) 形式，其中反義核酸係於控制高效能調控區域下予以製 造，其活性可由引入載體之細胞類型決定。關於使用反義 基因的基因表現調控之討論，參見Weintraub et al.

[Reviews-Trends in Genetics，Vol· 1(1)1986] 〇 5 本發明之另一態樣係有關其内已引入本發明重組表現 載體之宿主細胞。「宿主細胞」與「重組宿主細胞」於本 文中可交換使用。一般瞭解，該等名詞不僅論及特定對象 細胞，亦論及該等細胞之後代或可能後代。因為特定變異 由於突變或環境影響，可能於後繼世代中發生，事實上， 10 該等後代可能與母細胞不同，惟仍涵蓋於本文所用名詞之 範圍内。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 宿主細胞可為任何原核生物或真核生物細胞。例如， GAVE6蛋白質可於細菌細胞例如大腸桿菌、昆蟲細胞、 酵母或哺乳類細胞[例如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、293細 15胞或COS細胞]中表現。其他適當宿主細胞為熟習此項技 藝者所已知。載體DNA可經由習知轉形或轉染技術被引 入原核生物或真核生物細胞中。本文所用之「轉形」及 「轉染」等名詞係意指將外源核酸(例如，DNA)引入宿主 細胞中所用之各種技藝認知之技術，包括磷酸鈣或氣化鈣 20 共沉澱、轉導、DEAE-糊精·傳介之轉染、微脂粒感染或 電穿孔法。 一般已知，哺乳類細胞之穩定轉染視所用表現載體及 轉染技術而定，只有小部分細胞可將外源DNA整合入基 因趙内。欲鑑定及挑選該整合物，通常係將編碼可選擇標 -55· i紙張尺度適用家標準(c卿A4規2iG X 297公^ 200307688 A7 B7 五、發明說明（54) 記(例如，抗生素耐性)之基因與引起關注之基因一起引入 宿主細胞中。較佳之可選擇標記包含賦與對藥物之耐性 者，例如G418、潮黴素及胺甲喋呤。編碼可選擇標記之 核酸可被引入宿主細胞中與編碼GAVE6之相同載體上， 5或可被引入至不同載體。被引入的核酸穩定轉染之細胞玎 利用藥物選擇性予以鑑定（例如，已併入該可選擇標記基 因的細胞將生存，而其他細胞則死亡）。 本發明之宿主細胞，例如培養物中之原核生物或真核 生物細胞，可用於製造（亦即，表現)GAVE6蛋白質。因 ίο此，本發明進一步提供使用本發明宿主細胞製造GAVE6 蛋白質之方法。於一具體實例中，該方法包括於適當培養 基中培養本發明之宿主細胞（其中已引入編碼GAVE6之 重組表現載體），俾使製造GAVE6蛋白質。於另一具艘 實例中，該方法進一步包括自培養基或宿主細胞中將 15 GAVE6 單離。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 於另一*體實例中，GAVE6包含供次選殖於經改造 的表現載體中的其他蛋白質重組表現之可誘導之表現系。 例如，將包含突變G蛋白之宿主細胞[例如，酵母細胞、 Y2腎上腺皮質細胞及cyc- S49，參見美國專利案 20 6368,927 B1、5,739,029 及 5,482,835 ; Mitchell et al·， Proc Natl Acad Sci USA (1992) 89(19):8933-37 及 Katada et al·，J Biol Chem (1984) 259(6):3586-95]以含有編碼 GAVE6的核酸序列之第一表現載體予以轉導，其中 GAVE6功能性地於宿主細胞中表現。雖然該表現之 -56- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200307688 A7 B7 五、發明說明（55) GAVE6具組成活性，惟該突變未提供訊息轉導；亦即， 未發生G·蛋白質引導的下游級聯之活化作用（例如，無腺 苷醯環化酶活化作用）。接著，以第二表現載體轉導該含 GAVE6之宿主細胞。該第二載體除了欲由可誘導系統表 5現的所關注之基因外，含有與宿主細胞g蛋白質突變互 補之結構基因（亦即，具功能之哺乳類或酵母&、&、 G〇、或Gq等，例如，參見PCT公告案WO 97/48820 ;美 國專利案 6，168,927 B1、5,739,029 及 5,482,835)。第二載 體之互補結構基因為可誘導；亦即，在活化可操作地連接 10該互補結構基因的啟動子之外源添加成分（例如，四環 素、IPTG、小分子等，參見sambrook et al·，文獻同前) 之控制下。於添加該誘導物下，由互補結構基因編碼的蛋 白質即功能性表現，俾使組成活性GAVE6形成錯合物， 導致適當下游途徑活化作用（例如，第二信使形成）c>包含 15第二載體之所關注之基因具有可操作地連接之啟動子，其 由適‘第一 ft使（例如，CREB、API元件）所活化。因 此’當第二信使堆積時，所關注基因上游的啟動子被活化 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 而表現該基因之產物。誘導物不存在時，所關注基因之表 現即告停止。 20 於特定具體實例中，用於可誘導表現系統之宿主細胞 包含’惟不限於，S49 (cy〇細胞。在細胞株慮及包含G- 蛋白質突變時，可人工製造/構築適當之突變型（參見用於 酵母細胞之美國專利案6 168,927 B1、5,739,029及 5,482,835)。 -57- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公爱） 200307688 A7 B7 五、發明說明（56) _ 於相關態樣中，細胞係以可操作地連接包含SEQ ID N0:2所述蛋白質編碼序列的cDNA之載體予以轉染。包 含該系統之第一與第二載體慮及包含，惟不限於， pCDM8 [Seed，Nature (1987) 329:840]及 pMT2PC 5 [Kaufman et al·，EMBO J (1987) 6:187-195]、pYepSecl [Baldari et al·，EMBO J (1987) 6:229-234]、pMFa [Kurjan et al·，Cell (1982) 30:933-943]、pJRY88 [Schultz et al·， Gene (1987) 54:113-123]、pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA)及 pPicZ (Invitrogen Corporation, San Diego, 10 CA)。 於相關態樣中，宿主細胞可利用該等適當方式轉染， 產生功能性GAVE6蛋白質之表現（例如，Sambrook et al.，文獻同前，及 Kriegler，Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual，Stockton Press，New York，NY， 15 1990)。此等「功能性蛋白質」包含，惟不限於，一旦表 m 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 現即與G-蛋声質形成錯合物之蛋白質，其中G-蛋白質調 控第二信使之形成。於本文中具有用途的宿主細胞轉染方 法包含，惟不限於，轉染、電穿孔、顯微注射、轉導、細 胞融合、DEAE糊精、磷酸鈣沉澱、微脂粒感染（溶菌酶 20 融合）、使用基因搶、或DNA載體轉運子（參見，例如， Wu et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:963-967 ； Wu and Wu, 1988, J· Biol· Chem· 263:14621-14624 ; Hartmut et al·，加 拿大專利申請案2,012,311，1990年3月15曰申請）。 廣泛種類的啟動子於本發明中具有用途。的確，本發 •58- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 B7 200307688 五、發明說明（57) 明多肽之表現可由此項技藝中已知之任何啟動子/促進子 元件控制，惟彼等調控元件必須在選定供表現之宿主中具 有功能。可用於控制GAVE6表現之啟動子包含，惟不限 於，SV40 早期啟動子區域（Benoist and Chambon，1981， 5 Nature 290:304-310)、勞氏腫瘤病毒3’長端重複體中所含 啟動子(Yamamoto et al.，1980，Cell 22:787-797)、癌療胸 腺核苷激酶啟動子(Wagner et al·，1981，Proc. Natl. Acad. 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製

Sci· U.S.A· 78:1441-1445)、金屬髄基蛋白基因之調控序列 (Brinster et al.，1982, Nature 296:39-42)、原核生物表現載 10 體例如冷-内醯胺晦啟動子（Villa-Kamaroff，et al·，1978, Proc· Natl. Acad· Sci. U.S.A· 75:3727-3731)、或 iac 啟動子 (DeBoer，et al·，1983, Proc· Natl· Acad· Sci· U.S.A· 80:21-25);亦參見’’Useful proteins from recombinant bacteria” in Scientific American，1980，242:74-94 ;得自酵母或其他真 15 菌之啟動子元件例如Gal 4啟動子、ADC(乙醇去氫酶)啟 動子、PGK(磷酸甘油激酶)啟動子、鹼性磷酸酶啟動子； 及具有組織專一性且已用於基因選殖動物之動物轉錄控制 區域：於胰臟腺泡細胞中具活性之彈性蛋白酶I基因控制 區域（Swift et al·，1984，Cell 38:639-646 ; Ornitz et al·， 20 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.50:399-409 ；

MacDonald, 1987，Hepatology 7:425-515);於胰臟泠細胞 中具活性之騰島素基因控制區域(Hanahan，1985，Nature 315:115-122)、於淋巴細胞中具活性之免疫球蛋白基因控 制區域(Grosschedl et al·，1984, Cell 38:647-658 ; Adames -59- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200307688 A7 B7 五、發明說明（58 ) et al., 1985, Nature 318:533-538 ； Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444)、於睪丸、乳房、淋巴與肥 大細胞中具活性之小鼠乳腺腫瘤病毒控制區域(Leder et al·，1986, Cell 45:485-495)、於肝臟中具活性之白蛋白基 5 因控制區域(Pinkert et al·，1987，Genes and Devel· 1:268_ 276)、於肝臟中具活性之a-胎兒蛋白基因控制區域 (Krumlauf et aL, 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 ； Hammer et al.，1987, Science 235:53_58)、於肝臟中具活性 之α 1抗胰蛋白酶基因控制區域(Kelsey et al.，1987, Genes 10 and Devel· 1:161-171)、於髓樣細胞中具活性之/5-血球蛋 白基因控制區域（1^1(^抑1116131.，1985，忖&加6 315:338- 340 ; Kollias et al·，1986, Cell 46:89-94)、於大腦募樹突膠 質細胞中具活性之骨髓磷脂鹼性蛋白質基因控制區域 (Readhead et al·，1987, Cell 48:703-712)、於骨骼肌中具活 15 性之肌球蛋白輕鏈-2基因控制區域（Sani，1985，Nature 314:283-286)、及於下視丘中具活性之親性腺釋放激素基 因控制區域(Mason et al·，1986, Science 234:1372-1378)。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 含本發明核酸分子之表現載體可由四種一般方法予以 鑑定：⑻所需質體DNA或專一性mRNA之PCR擴增、 20 0>)核酸雜交、（c)存在或不存在之選定標記基因功能、及 (d)嵌入序列之表現。第一方法中，核酸可利用pCR擴增 提供所擴增產物之檢測。第二方法中，嵌入表現載體中的 外源基因之存在可藉使用包含與嵌入標記基因同質的探針 之核酸雜交予以檢測。第三方法中，重組載體/宿主系統 -60· 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 x 297公爱j 200307688 A7 B7 五、發明說明（59 ) 可根據由載體中嵌入外源基因引致之特定「選定標記」基 因功能(例如’ ^半乳糖努酶活性、胸腺核普激酶活性、 抗生素耐性、轉形表現型、桿狀病毒中包含體形成等）之 存在定與挑選。於另—實例中若編碼 5 GAVE6蛋白質、其變異體、或其類似物或衍生物之核酸 嵌入載趙之「選定標記」基因序列内，則含該嵌入物之重 組體可由不存在GAVE6基因功能予以鑑定。第四方法 中，只要該表現蛋白質呈現功能活性形態，則重組表現載 體可藉測定由重組艘表現的基因產物之活性、生化或免疫 10 學特性予以鑑定。 廣泛種類的宿主/表現載體組合可用於表現本發明之 DNA序列。有用的表現載艘，舉例而言，可由染色艘斷 片、非染色體及合成DNA序列組成。適當之載體包含 SV40與已知細菌質體之衍生物，例如，大腸桿菌質體⑶^ 15 El、pCRl、pBR322、pMal.C2、ρΕΤ、ρ(}Εχ (如汕 et d， 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 1988, Gene ·67:31-40)、PMB9及其衍生物、質體例如 RP4 ;噬菌體DNAS，例如，噬菌體又的許多衍生物，例 如，NM989 ’及其他嗟菌趙DNA ,例如，M13與絲狀單 股噬菌體DNA;酵母質體例如2//質體或其衍生物；用 20於真核生物細胞之載體，例如用於昆蟲或哺乳動物細胞之 載體；由質體與噬菌體DNAs組合衍生之載體，例如經修 飾以使用噬菌體DNA或其他表現控制序列之質體等。 例如，於桿狀病毒表現系統中，非融合轉移載體，例 如惟不限於PVL941 (价/wHl選殖位點，· Summers)、 -61- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公》) " -- 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 200307688 A7 B7 五、發明說明（6〇) pVL1393 {Bamm - Smal ^ Xbal - EcoRl > Notl > Xmalll -5g/II、及尸对1 選殖位點；Invitrogen)、pVU392 (5g/II、 Pstl、Notl、Xmalll、EcoRl、Xbal、Smal、反 ΒωηΉΛ 選 殖位點；Summers and Invitrogen)、及 pBlueJ?acIII 5 (5amHl、5g/II、尸5ίΙ、、及 選殖位點，可能 具有藍/白重組體篩檢；Invitrogen)，及融合轉移載體，例 如惟不限於pAc700 (βα/wHl與办《1選殖位點，其中 Βα/wHl識別位點由起始密碼子開始；Summers)、pAc701 與pAc702 (與pAc700相同，惟譯讀架不同）、pAc360 [多 10 面體蛋白起始密碼子下游36鹼基對5ύτ»Η1選殖位點； Invitrogen(195)]、及 pBlueBacHisA、Β、C [三個不同譯 讀架，具有价/wHl、你/Π、Psil、//oil、及 /izTirflll 選殖 位點，供ProBond純化之N-端胜肽，及噬菌斑藍/白重組 體篩檢；Invitrogen(220)]均可使用。 15 考慮用於本發明之哺乳類表現載體包含具有可誘導的 啟動子[例如.二氫葉酸還原酶(DHFR)啟動子]之載體，例 如，具有D/ffT?表現載體之任何表現載體、或胺 甲喋呤共擴增載體，例如pED [户对1、、57^1、Swd、 及£^oRI選殖位點，具有表現選殖基因與二者之 20 載體；參見Kaufman，Cwrrewi尸⑹⑽必zw 狀 16·12 (1991)]。或者，麩胺醯胺合成酶/甲硫胺酸 亞磺醯亞胺共擴增載體，例如ρΕΕ14 (//ζ>κ/ΙΙΙ、ΖΜΙ、 57⑽ϊ、泓αΐ、五mRI、及J5dl選殖位點，其中載體表現麩 胺酸合成酶與選殖基因；Celltech)。於另一具體實例中， -62- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公薏) --

200307688 A7 B7 五、發明說明（61) 可使用在Epstein Barr病毒(EBV)控制下，引導游離基因 體表現之載體，例如pREP4 (BcfwHl、期I、ΖΛοΙ、Wil、 、/fzm/III、、尸vwll、及处《1選殖位點、組成性 RSV-LTR啟動子、潮黴素可選擇標記；invitrogen)、 5 pCEP4 (BamHl、Sfil、Xhol、Notl、Nhel、HindlU、 M^I、尸vwll、及尤/wI選殖位點、組成性hCMV極早期基 因、潮黴素可選擇標記；Invitrogen)、pMEP4 (尤/7«1、 Pvul、Nhel、Hindlll、Notl、Xhol、Sfil、反 Bamill 選殖 位點、可誘導之金屬巯基蛋白Iia基因啟動子、潮擻素可 10 選擇標記；Invitrogen)、pREP8 、说〇1、从、 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 所邊1、偷I、及選殖位點、組成性RSV-LTR啟 動子、組織胺醇可選擇標記；Invitrogen)、pREP9 (Kpnl、Nhel、HindUl、Notl、Xhol、Sfil、反 BamlU 還 殖位點、RSV-LTR啟動子、G418可選擇標記； 15 Invitrogen)、及 pEBVHis (RSV-LTR 啟動子、潮黴素可選 擇標記、經句ProBond樹脂N-端胜肽可純化及以腸激酶 切割；Invitrogen)。用於本發明之可選擇哺乳類表現載體 包含 pRc/CMV (Hindm、BstXl、ΝοΛ、Sbal、反 Apal 選 殖位點、G418 選擇；Invitrogen)、pRc/RSV (所m/III、 20 Spel、BsiXI、、ΙόαΙ 選殖位點、G418 選擇； Invitrogen)等。根據本發明使用之牛痘病毒哺乳類表現載 體包含惟不限於pSCll (Smal選殖位點、TK·及yS-gal選 擇）、PMJ601 (以/1、、4/?1、浙I、卿MII、 Bamm ' Apal、Nhel、Sacll、Kprd、反 HindlU 選殖位 -63- ^纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 x 297公釐) A7 B7 200307688 五、發明說明（62) 點；TK-及 y3 -gal 選擇）、及 pTKgptFIS (及：冰1、、 如/1、ZccI、、劭αΐ、、及 Hpa 選殖位點； TK或XPRT選擇）。 根據本發明亦可使用酵母表現系統來表現GAVE6蛋 5 白質、其變異體、或其類似物或衍生物。例如，非融合 pYES2 (Xbal - Sphl > Shol - Notl - GstXl > EcoRl -

BstXI > BamUl - Sacl - Kpnl - A Hindlll ；

Invitrogen)或融合 pYESHisA、B、C 、S/7/2I、iSTwI、 訂

Notl、BstXI、EcoRl、BamWi、Sacl、Kprd、反 Hindlil 10 選殖位點、以ProBond樹脂純化及以腸激酶切割之N-端 胜肽；Invitrogen)，僅舉二例如上，均可根據本發明予以 使用。 一經鑑定及單離出特定之重組DNA分子，便可使用 此項技藝中已知的數種方法增殖它。一旦建立適當的宿主 15 系統及生長條件，即可將重組表現載體增殖並大量製備。 如先前之說叼，可使用之表現載體包含，惟不限於，下述 載體或其衍生物：人類或動物病毒例如牛痘病毒或腺病 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 毒；昆蟲病毒例如桿狀病毒；酵母載體；噬菌體載體(例 如，λ)、及質體與黏接質體DNA載體，僅舉數例如上。 20 此外，可選擇調節嵌入序列的表現、或以所需特定方 式修飾與處理基因產物之宿主細胞株。不同宿主細胞在蛋 白質的轉譯與後轉譯處理及修飾作用上[例如，糖基化作 用、切割（例如，訊息序列之切割）]具有獨特及專一機 制。可選擇適當的細胞系或宿主系統以確保表現的外源蛋 -64- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） A7 B7 200307688 五、發明說明（63) 白質所需之修飾及處理。例如，細菌系統中之表現可用於 製造非糖基化之核心蛋白質產物。 羞選殖動物 本發明宿主細胞亦可用於產生非人類基因選殖動物。 5 例如，於一具體實例中，本發明宿主細胞為其中已引入 GAVE6編碼序列之受精卵細胞或胚胎幹細胞。然後可以 該等宿主細胞製造已於基因體内引入外源GAVE6序列之 非人類基因選殖動物，或其内源GAVE6序列已改變之同 質重組動物。此等動物係用於研究GAVE6功能及/或活 10 性，及用於鑑定及/或評估GAVE6活性調節劑。本文所用 之「基因選殖動物」為非人類動物，較佳為哺乳類，更佳 為喷齒類例如大鼠或小鼠，其中該動物之一或多種細胞含 有選殖基因。基因選殖動物之其他實例包括非人類靈長 類、綿羊、犬、乳牛、山羊、雞、兩棲類等。 15 本文所用「選殖基因」一詞係指整合入一細胞之基因 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 體内（該細胞爹育形成基因選殖動物)並保留於成熟動物基 因體中之外源DNA。選殖基因於基因選殖動物之一或多 種細胞類型或組織中，引導編碼基因產物之表現。本文所 用之「同質重組動物」為非人類動物，較佳為哺乳類，更 2〇 佳為小鼠，其中内源GAVE6基因已經由同質重組發生改 變’其係於動物發育形成之前，在内源基因與引入動物細 胞(例如，動物胚胎細胞）内的外源DNA分子之間完成。 本發明基因選殖動物之製造可藉由使用上述轉染方法 之一’於受精卵細胞之雄性原核中引入編碼GAVE6的核 -65· 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（21〇 χ297公麓） 200307688 A7 B7 五、發明說明（64) 酸分子。然後令卵細胞於假孕雌性養育動物中發育。 GAVE6 cDNA序列，例如，SEQ ID ΝΟ:1序列，可成為 10 15 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 20 選殖基因，被引入非人類動物之基因體内。或者，人類 GAVE6基因之非人類同質物，例如小鼠GAVE6基因， 可根據與人類GAVE6 cDNA雜交予以單離，及作為選殖 基因。選殖基因中亦可包含插入序列及聚腺苷酸化訊息， 以增加選殖基因表現效率。組織專一性調控序列可操作性 地連接於GAVE6選殖基因，以引導GAVE6蛋白質於特 定細胞中之表現。經由胚胎操作及顯微注射產生基因選殖 動物（特別是例如小鼠之動物）之方法為此項技藝中習知， 及見述於，例如，美國專利案4,736 866與4 87〇,〇〇9、美 國專利案 4,873，191 及 Hogan，Manipulating the Mouse Embryo,（c〇ld Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring

Harbor，Ν·Υ·，1986)。類似之方法用於製造選殖基因在其 基因體内及/或GAVE6 mRNA於其組織或細胞中表現之 其他基因選埤動物。然後可使用基因選殖締造動物孕育攜 帶該選殖基因之其他動物。此外，攜帶編碼GAVE6選殖 基因之基因選殖動物可進一步孕育攜帶其他選殖基因之其 他基因選殖動物。 欲產生同質重組動物，則製備含有至少部分GAVE0 基因[例如，GAVE6基因之人類或非人類同質物，如鼠類 VE6基因，其中已引入缺失、添加或置換，以改變（例 如，功能性地破壞)該GAVE6基因]之載體。於特定具體 實例中’設计載體，俾使於同質重組時，内源基 •66· I紙張尺度適用^準(CNS)A4規格（21G χ 297公爱） 200307688 A7 B7 五、發明說明（65 ) 因被功能性地破壞（亦即，不再編碼功能性蛋白質；亦參 照「基因剔除」載體）。 或者，可設計載體，俾使於同質重組時，内源 GAVE6基因發生突變或改變，惟仍編碼功能性蛋白質（例 5 如，改變上游調控區域，因而改變内源GAVE6蛋白質之 表現）。 於同質重組載體中，GAVE6基因改變的部分係利用 附加的GAVE6基因核酸序列側接於5,及3’端，而令同質 重組發生於載體所攜帶的外源GAVE6基因與胚胎幹細胞 1〇 中的内源GAVE6基因之間。該附加之側接GAVE6核酸 序列具有足夠的長度，俾使與内源基因成功地同質重組。 典型地，該載體中包含數千鹼基之側接DNA (於5’及3’ 端）[同質重組載體之敘述參見，例如，Thomas et al.，Cell (1987) 51:503] 〇 15 將載體引入胚胎幹細胞系中（例如，利用電穿孔法）， 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 然後選擇其中引入的GAVE6基因已與内源GAVE6基因 同質重組之細胞[參見，例如，Li et al·，Cell (1992) 69:915]。接著將選定之細胞注入動物（例如，小鼠）囊胚 中，以形成集結後合體[參見，例如，Bradley in 20 Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach，Robertson，ed·，IRL，Oxford, (1987) pp· 113_ 152]。然後將嵌合胚胎植入適當假孕雌性養育動物中，孕 育至成熟。胚細胞中懷有同質重組DNA之後代，藉由選 殖基因之胚細胞系傳遞，可用來孕育其所有細胞含有該同 -67- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200307688 A7 B7 五、發明說明（66) 質重組DNA之動物。 同質重組載體與同質重組動物的建構方法進一步見述 於 Bradley，Current Opinion in Bio/Technology (1991) 2:823-829 及 PCT 公告案 WO 90/11354、WO 91/01140、 5 WO 92/0968 與 WO 93/04169。 於另一具體實例中，可產生含有選定系統容許調控表 現選殖基因之基因選殖非人類動物。該等系統之一實例為 嗔菌體 P1 之 cre/loxP 重組酵(recombinase)系。cre/loxP 重 組酶系之敘述，參見，例如，Lakso et al.，Proc Natl Acad 10 Sci USA (1992) 89:6232-6236。重組酶系之另一實例為 ^ 之 FLP 重組酶系[O’Gorrnan et al.，Science (1991) 251:1351-1355]。若以cre/loxP重組酶系調控選殖基因之 表現，則需要含有編碼ere重組酶及選定蛋白質二者的選 殖基因之動物。此等動物可經由建構「雙」基因選殖動物 15 而提供，例如，利用含有編碼選定蛋白質選殖基因之一動 物與含有編碼重組酶選殖基因之另一動物，二基因選殖動 物之交配。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本文所述非人類基因選殖動物之選殖體可根據 Wilmut et al·，Nature (1997) 385:810-813 及 PCT 公告案 20 WO 97/07668與WO 97/07669所述方法予以製造。簡言 之，可自基因選殖動物單離出細胞(例如體細胞），誘導其 走出生長循環進入G〇期。接著可使該靜息細胞與去核卵 細胞（得自單離該靜息細胞之相同品系動物）融合（例如， 經由使用電器脈衝）。然後培養該再建構之卵細胞，使其 -68- ^紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐f ~ 200307688 A7 B7 五、發明説明（67) 發育形成桑椹胚或胚細胞，再轉移入假孕雌性養育動物 中。該雌性養育動物所生的後代將是單離出該細胞(例如 體細胞）的動物之選殖體。 醫藥組成物 5 GAVE6核酸分子、GAVE6蛋白質及抗-GAVE6抗體 (本文中亦稱為「活性化合物」）可併入適用於投與之醫藥 組成物中。此等醫藥組成物典型地包含核酸分子、蛋白質 或抗髏’及醫藥上可接受之載劑。本文所用之「醫藥上可 接受之載劑」意欲包含與醫藥投與相容之任何及所有溶 10 劑、分散介質、塗層、抗細菌及接真菌劑、等張及吸收遲 緩劑等。用於醫藥活性物質的該等介質與製劑之使用為此 項技藝所悉知。除非與活性化合物不相容，否則任何習知 介質或製劑於本組成物中之用途均被慮及。補充的活性化 合物亦可併入組成物中。 15 本發明之醫藥組成物係經調配以與意指投與途徑相 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 容。投與途辑之實例包含非經腸，例如，經靜脈内、皮膚 内、皮下、經口（例如，吸入）、經皮（局部）、經黏膜及直 腸投與。供非經腸、皮唐内或皮下用途之溶液或懸浮液可 包含下述成分：無菌稀釋劑例如注射用水食鹽溶液、固 20定油、聚乙二醇類、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗細 菌劑例如苄醇或對羥笨甲酸甲酯類；抗氧化劑例如抗壞血 酸或亞硫酸氫鈉、鉗合劑例如EDTA ;缓衝劑例如乙酸 鹽、檸檬睃鹽或料鹽及張力調節劑例如氣化納或葡萄 糖。pH可利用酸或險，例如Ηα或Ν&〇Η，予以調節。 -69- I紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4 --一 200307688 A7 五、發明說明（6〇 該非經腸製劑可封入破蹲或塑料製成之安瓶、抛棄式注射 器或多劑量瓶中。 適用於注射用途之醫藥組成物包含無菌水性溶液（可 與水溶混）或分散體，及供處方臨_配㈣（含無菌注射 5溶液或分散體）用之無II㈣。供靜關投與用時，適當 載劑包括生理鹽液、抑菌用水、” CREMOPHOR EL，， (BASF ’ Parsippany，NJ)或磷酸鹽緩衝鹽液(PBS)。所有情 須無菌’且可流動至達易於注射處理的程 度。於製造及貯存條件下，板成物必須穩定 ，且須可對抗 經濟部智慧財產局員工消#合作社印製 10微生物(例如細菌與真菌）污染作用地予以保存。載劑可為 含有，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及 液癌聚乙二醇等）及其適當混合物之溶劑或分散介質。適 當流動性之維持可藉由，例如，使用塗層（例如卵磷脂）； 於分散艘情形下，維持需要的粒徑；及使用界面活性劑。 15微生物作用之防止可利用多種抗細菌及抗真菌劑（例如， 對羥苯甲酸_類、氣丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等) 而達成。許多情形下，較好組成物中含有等張劑，例如 糖、聚醇類例如甘露糖醇、山梨糖醇或氣化鈉。注射用組 成物之延長吸收可利用在組成物中包含延緩吸收劑（例 20如，單硬脂酸鋁）而達成。 無菌注射溶液之製備可於適當溶劑中併入需要量之活 性化合物(例如，GAVE6蛋白質、其變異體、其類似物或 衍生物；或抗-GAVE6抗體），以及依需要之上述一或多 種成分之組合，隨後予以過濾殺菌。通常，分散體之製備 -70- i紙張尺度適用中國國^^(cns)A4規格（21〇 χ 297公装^ 一 200307688 A7 B7 五、發明說明（69 ) 係於含有基本分散介質與得自上文例示的其他需要成分之 無菌賦形劑中，併入活性化合物。至於供無菌注射溶液用 之無菌粉劑，其較佳製法為將先前已無菌過漉之溶液真空 乾燥及冷凍乾燥，以獲得含活性成分與任何其他需要成分 5 之粉劑。 經口組成物通常含有惰性稀釋劑或食用載劑。可將該 組成物封入明膠膠囊中，或壓製成錠。欲達經口治療投與 之目的，活性化合物中可併入賦形劑，呈錠劑、酏劑或膝 囊形式予以使用。經口組成物亦可使用流體載劑製備而呈 10 漱口藥使用，其中流艘載劑中之化合物係經口施用，於口 中漱幾下後吐出或碟下。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 亦可含醫藥上相容的黏合劑、及/或辅助物質為組成 物之一部分。錠劑、丸劑、膠囊、醜劑等可含任何下述成 分或具有相同性質之化合物··黏合劑例如微晶纖維素、黃 15 耆膠或明膠；賦形劑例如澱粉或乳糖；崩解劑例如海藻 酸、澱粉羥基乙酸鈉或玉米澱粉；潤滑劑例如硬脂酸鎂或 Sterotes ;助流劑例如膠態二氧化矽；甜味劑例如蔗糖或 糖精；或調味劑例如薄荷、柳酸甲酯或柑橘香料。供吸入 投與時，化合物係呈出自含適當推進劑（例如，氣體如二 20 氧化碳）之加壓容器或分配器或喷霧器之氣溶膠喷霧形 亦可利用經黏膜或經皮方式施行全身投與。供經黏膜 或經皮投與時，調配物中使用對欲滲入之障壁適當的滲透 劑。此等渗透劑通常為此項技藝中已知，其包含，例如， -71- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200307688 A7 B7 五、發明說明（70) 供、、、i黏膜投與用之清潔劑、膽汁鹽及梭鏈孢酸衍生物。經 黏膜杈與可經由使用鼻内噴霧劑或栓劑而達成。供經皮投 與時，係將活性化合物調配成此項技藝中一般已知之軟 膏、藥膏、凝膠或霜劑。 5 化合物亦可製備成為栓劑（例如，使用習知栓劑基底 如可可脂及其他甘油酯）或留置灌腸劑形式，供經直腸遞 送。 於特定具體實例中，活性化合物係與保護化合物免於 自身體迅速排除之載劑一起製備，例如控制釋放調配物， 10包括植入物及微粒膠囊遞送系。可使用生物可分解、具生 物相容性之聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐類、聚 乙醇酸、膠原蛋白、聚正酯類及聚乳酸。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 該等調配物之製法為熟習此項技藝人士所悉知。其材 料亦可自 Alza Corporation 及 Nova Pharmaceuticals，Inc 購 15得。微脂粒懸浮劑（包括與單株抗體一起標的引導至感染 細胞之微脂粒）亦可作為醫藥上可接受之載劑用。彼等可 根據熟習此項技藝人士已知之方法，例如，美國專利案 4,522,811所述方法，予以製備。 為了容易投與及劑量之均一性，將經口或非經腸組成 20 物調配為劑量單位形式尤為有利。本文所用之劑量單位形 式係指適於供治療對象用之單一劑量完全分立單位；各單 位含有經計算結合所需醫藥載劑以產生所需治療效果之預 先決定量之活性化合物。視疾病種類與嚴重性而定，無 論，例如經由一或多個分開投與，或經由持績注入，供投 -72- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200307688 A7 B7 五、發明說明（71) 與病患用之初始候選劑量為約1微克/公斤至15毫克/公 斤（例如，0.1至20毫克/公斤）化合物。典型的日劑量視 上述因素而定，在約1微克/公斤至1〇〇毫克/公斤或更多 之範圍内。至於數日或更長時間之重複投與，視狀況而 5定，可持續治療至發生需要的疾病症狀之抑制為止。然 而，其他劑量療法亦有用。治療進展易於利用習知技術及 測定法予以偵測。用藥療法之範例揭示於WO 94/04188。 本發明劑量單位形式的規格受指定於及直接取決於活性化 合物之獨特性質與欲達成之特定治療效果，及摻合該等化 10 合物治療病患之技藝中固有的限制。 再者，本發明之核酸分子可嵌入載體中作為基因治療 載體之用。基因治療載體可利用，例如，靜脈内注射、局 邛才又與（美國專利案5,328,470)或利用立體定位注射[參 見，例如，Chen et al·，Pr〇c Natl Acad Sei USA (1994) 15 91.3054-3057]遞送給病患。基因治療載體之醫藥製劑可於 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 可接受之稀釋劑中含有該基因治療載體，或可包含其中包 埋基因遞送載劑之緩釋基質。或者，當整個基因遞送載體 了自重組細胞元整地產生（例如反轉錄病毒栽體）時，醫藥 製劑可包含產生該基因遞送系之一或多種細胞。 20 醫藥組成物可與投與用法說明一起包含於容器、藥包 或分配器中。 本發喝之用途及方法 本發明之核酸分子、蛋白質、蛋白質同質物、抗體、 及該等基團之片段可用於下述一或多種方法中：a)篩選分 -73- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（21〇 T297公爱y ^ 200307688 A7 B7 五、發明說明（72) 析，b)檢測分析（例如制定染色體圖譜、組織分型、法醫 生物學）；c)預測藥學（例如，診斷分析、預後分析、偵測 臨床試驗與藥理基因體學）；及d)治療方法(例如，治療性 與預防性）。GAVE6蛋白質與其他細胞蛋白質相互作用， 5因而可用於(〇調控細胞增殖；⑴)調控細胞分化；及(iii)調 控細胞生存。本發明單離之核酸分子可用於表現gave6 蛋白質（例如，經由基因治療應用中宿主細胞之重組表現 載體），以檢測GAVE6 mRNA(例如，於生物試樣中）或檢 /則GAVE6基因之基因病灶及調控GAVE6活性。此外， 1〇 GAVE6蛋白質可用於篩選調節GAVE6活性或表現的藥 物，以及治療特徵為GAVE6蛋白質製造不足或過量的疾 病。相較於GAVE6野生型蛋白質，製造活性降低或異常 的GAVE6蛋白質形式之篩選，亦可利用本發明進行。此 卜本發明之抗-GAVE6抗體可用於檢測與單離GAVE6 ，白質，及調節GAVE6活性。本發明進一步有關以上述 刀析法鑑定之新穎製劑，以及其如本文所述之治療用 途。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 於内源配位體存在下，G蛋白質受體之活化容許形成 20 G蛋占@ < 曰買戈:體錯合物，因而導使GTP與G蛋白質結合。 承條件下，G蛋白質之GTP酶功能部位緩缓地將GTP 良解成為GDP，造成受體失活。然而，組成性活化之受 體繼續水解GDP成為GTP。 G蛋白質之非水解性基質，[35S]GTPT S，可用於偵 -74-

200307688 A7 B7 五、發明說明（73 ) 測與表現組成性活化受體的膜之增進結合。根據Trayn〇r 與Nahorski之報告，於配位體存在或不存在下，[35s]gtp r S可用於偵測G蛋白質與膜的偶聯[Traynor et al.，Mol Pharmacol (1995) 47(4):848-54]。此等分析系統之較佳用 5 途為候選化合物之初始篩選，因為此系統係一般性地應用 於所有G蛋白質偶聯受體而不考慮與受體結合之特定〇 蛋白質。 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Gs2〇刺激腺普醯環化酶，而Gi與G。則抑制該酵素。 如此項技藝所已知，腺苷醯環化酶催化ATP成為CAMP 10 之轉化反應；因此，與Gs蛋白質偶聯的組成性活化 GPCRs與cAMP細胞含量之增加有關。或者，與Gi(或 G。)蛋白質偶聯的組成性活化GPCRs與cAMP細胞含量之 降低有關。參見 ’’Indirect Mechanism of Synaptic Transmission’’，Chpt· 8，from Neuron to Brain (3rd Ed·)， 15 Nichols et al· eds·，Sinauer Associates，Inc·，1992。因此， 檢測cAMP之分析法可用於測定候選化合物是否為受體 之反致效劑。此項技藝中已知用於測定cAMP之多種方 法可予以利用。於一具體實例中，係於運用ELISA之版 式中使用抗-cAMP抗體。於另一具體實例中，則慮及完 20 整細胞第二信使通訊子系統（參見PCT公告案WO 00/22131) ° 於相關態樣中，環狀AMP之驅動基因表現係藉促使 cAMP與反應性DNA結合蛋白或轉錄因子（CREB)之結 合，然後與特定位置（稱為eAMP反應元件）之啟動子結 -75- 本紙張尺度適用家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐) 200307688 A7 B7 五、發明說明（Μ) 合，並驅動基因之表現。因此，可構築於通訊子基因（例 如^半乳糖㈣錢t光素酶)之前含衫個eAMp反應 元件的啟動子之通訊子n又，由於組成性活化Gs_連 接受體引起CAMP之堆積’接著活化通訊子蛋白之基因 5及表現。然後可使用標準生物分析法檢測通訊子蛋白，例 如冷-半乳糖苷酶或蟲螢光素酶（參見pcT公告案w〇 00/22131)。 其他G蛋白質，例如G。與Gq，與鱗脂酶c的活化 有關，其接著水解磷脂(PIP2)，釋放兩個細胞内信使：甘 10油二酯（DAG)及肌醇1Λ5-三磷酸酯（IP3)。lp3之堆積增 加與Gq關聯^:體及G。關聯受體的活化有關(pCT公告案 WO 00/22131)。檢測IP3堆積的分析方法可用於決定候選 化合物是否為Gq關聯受體或G。關聯受體的反致效劑。& 關聯受财可制AP1通訊子分析法料制，該分析 15法係測量Gq依賴性璘麟c是判起含Αρι元件的基因 之活化因此，活化之Gq關聯受體顯示該等基因之表現 增加；而反致效劑顯示該等表現降低。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本文亦提供與GAVE6蛋白質結合或對例如 GAVE6 表見或GAVE6活性具刺激或抑制作用的調節劑[亦即候 20選或測試化合物或製劑（例如，胜狀、胜狀模擬物、小分 子或其他藥物)]之錘定方法(亦稱為「_選分析法」）。 、於-具體實例巾，本發明提供與GAVE6蛋白質、胜 狀或其生物活性部分結合或調節其膜結合形式的活性之候 選化合物或測試化合物之筛選分析法。本發明之測試化合 -76- t a a^#%cns)A4 ^ (210x297^3------ 200307688 A7 B7 五、發明說明（75) 物可使用此項技藝中已知之組合庫法中諸多方法之任一者 獲得，包括：生物庫；空間定址平行固相或溶液相庫；需 要去迴旋（deconvolution)之合成庫法；「一珠粒一化合 物」合成庫法；及使用親合性色層分析選擇之合成庫法。 5 生物庫方法侷限於胜肽庫，其他四個方法則可應用於胜 狀、非胜狀募聚物或化合物之小分子庫[Lam，Anticancer Drug Des (1997) 12:145]。 分子庫合成方法之實例見述於此項技藝，例如於： De Witt et al.? Proc Natl Acad Sci USA (1993) 90:6909 ； 10 Erb et al.? Proc Natl Acad Sci USA (1994) 91:11422 ； Zuckermann et al.5 J Med Chem (1994) 37:2678 ； Cho et al.? Science (1993) 261:1303 ； Carrell et al.? Angew Chem Int Ed Engl (1994) 33:2059 ； Carell et al.? Angew Chem Int Ed Engl (1994) 33:2601 ;及 Gallop et al·，J Med Chem (1994) 15 37:1233 中。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 化合物庫可於溶液中[例如，HoughtenBio/Techniques (1992) 13:412-421]或於珠粒[Lam，Nature (1991) 354:82-84]、晶片[Fodor，Nature (1993) 364:555-556]、細菌（美國 專利案5,223,409)、孢子（美國專利案5,571，698 ; 20 5,403,484 ;及 5,223,409)、質體[Cull et al·，Proc Natl Acad

Sci USA (1992) 89:1865-1869]或噬菌體[Scott et al·， Science (1990) 249:386-390 ； Devlin, Science (1990) 249:404-406 ； Cwirla et al.5 Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87:6378-6382 ;及 Felici，J Mol Biol (1991) 222:301-310]上 -77- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200307688 A7 B7 五、發明說明（7〇 呈現。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 於本發明之特定具體實例中，有一分析法為使用細胞 之分析法，其中係使表現GAVE6蛋白質或其生物活性部 分的膜結合形式之細胞表面與測試化合物接觸，並測定該 5測試化合物與GAVE6蛋白質結合的能力。該細胞，舉例 而言’可為酵母細胞或哺乳類來源細胞。測試化合物與 GAVE6蛋白質結合能力之測定可利用，例如，使測試化 合物與放射性同位素或酵素性標誌偶聯，俾使測試化合物 與GAVE6蛋白質或其生物活性部分之結合可由檢測錯合 10物中之標記化合物予以測定而達成。例如，測試化合物可 直接或間接以1251、35S、14C或3H標記，再利用直接計算 放射性或利用閃爍計數法檢測該放射性同位素。或者，可 將測試化合物以，例如，辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶或蟲 螢光素酶予以酵素性標記，並利用適當基質對產物轉化作 15用之測定檢測該酵素標誌。於特定具體實例中，該項分析 包括使表現GAVE6蛋白質或其生物活性部分的膜結合形 式之細胞表面與結合GAVE6之已知化合物接觸形成分析 混合物，使該分析混合物與測試化合物接觸，並測定測試 化合物與GAVE6蛋白質互相作用的能力，其中測試化合 20物與GAVE6蛋白質互相作用能力之測定包括，與已知化 合物相較下，測試化合物優先與GAVE6或其生物活性部 分結合能力之測定。 於另一具體實例中，該分析法為使用細胞之分析法， 其中係使表現GAVE6蛋白質或其生物活性部分的膜結合 -78-

200307688 A7 B7 五、發明說明（77) 形式之細胞表面與測試化合物接觸，並測定該測試化合物 調節（例如’激發或抑制）GAVE6蛋白質或其生物活性部 分的活性之能力。測試化合物調節GAVE6或其生物活性 部分活性能力之測定可利用，例如，測定GAVE6蛋白質 5與GAVE6標的分子結合或相互作用的能力而達成。本文 所用之「標的分子」乃於本質上與GAVE6蛋白質結合或 相互作用的分子，例如，於表現GAVE6蛋白質的細胞表 面之分子、第二細胞表面之分子、細胞外周圍環境之分 子、與細胞膜内表面相關之分子或細胞質分子。GAVE6 1〇標的分子可為非GAVE6分子或為本發明之GAVE6蛋白 質或多狀。於一具體實例中，GAVE6標的分子為促進通 過細胞膜將細胞外訊息（例如，由化合物與膜結合gave6 分子結合產生的訊息）傳導至細胞内的訊息傳導途徑之成 分。該標的’例如，可為具有催化活性之第二細胞内蛋白 15質，或促進下游傳訊分子與GAVE6結合之蛋白質。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 GAVE6蛋白質與GAVE6標的分子結合或相互作用 能力之測定可利用上述直接結合測定方法之一者達成。於 一特芩具體實例中，GAVE6蛋白質與GAVE6標的分子 結合或相互作用能力之測定可利用測定標的分子之活性而 20 達成。例如’標的分子活性之測定可利用檢測該標的細胞 第二信使（例如，細胞内Ca2+、甘油二酯、IP3等）之誘 導，檢測適當基質上該標的之催化/酵素活性、檢測通訊 子基因[例如’可操作地連接編碼可檢測標記（例如蟲螢光 素酶)核酸之GAVE6反應性調控元件]之誘導、或檢測細 -79- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200307688 A7 B7 五、發明說明 胞反應（例如，細胞分化或細胞增殖）而進行。 本發明進一步有關不使用細胞之分析法，該分析法包 括使GAVE6蛋白質或其生物活性部分與測試化合物接 觸，並測定測試化合物與GAVE6蛋白質或其生物活性部 5 分結合的能力。測試化合物與GAVE6蛋白質之結合可如 上述直接或間接予以測定。於一較佳具體實例中，該分析 法包括使GAVE6蛋白質或其生物活性部分與結合 GAVE6之已知化合物接觸形成分析混合物，使該分析混 合物與測試化合物接觸，並測定測試化合物與GAVE6蛋 10白質互相作用的能力，其中測試化合物與GAVE6蛋白質 互相作用能力之測定包括，與已知化合物相較下，測試化 合物優先與GAVE6或其生物活性部分結合能力之測定。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明之另一不使用細胞之分析法涉及使GAVE6蛋 白質或其生物活性部分與測試化合物接觸，並測定該測試 15化合物調節（例如，激發或抑制）GAVE6蛋白質或其生物 活性部分的活性之能力。測試化合物調節GAVE6活性能 力之測定可，例如，利用上述方法之一測定GAVE6蛋白 質與GAVE6標的分子結合或相互作用的能力而達成。於 替代具體實例中，測試化合物調節GAVE6活性能力之測 20定可利用測定GAVE6蛋白質進一步調節GAVE6標的分 子的能力而達成。例如，可如前述測定適當基質上該標的 分子之催化/酵素活性。 本發明之又一不使用細胞之分析法包括使GAVE6蛋 白質或其生物活性部分與結合GAVE6之已知化合物接觸 -80- 本紙張尺度適;fl T國國家標準(CNS)A4規格（⑽x 297公复） 200307688 A7

形成分析混合物，使該分析混合物與測試化合物接觸，並 測定測試化合物與GAVE6蛋白f互相作㈣能力。測試 ，合物與GAVE6蛋白質互相作用能力之敎步驟包括測 定GAVE6蛋白質優先與GAVE6標的分子結合或調 5 GAVE6標的分子活性之能力。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 夂體可被必需不抑制配位體結合惟於受體中引起结構 變化使能產生引致活化之G蛋白質結合、或者受^聚 集、二聚化或群集的非配位體分子所活化。例如，可培殖 對抗暴露於細絲_ GAVE6多㈣分之㈣。如標準 10分析方法(例如，该測cAMP含量或細胞内Ca+2含量)所測 定，彼等抗體經由G蛋白質級聯活化細胞。由於涉及分 子定位（特別是抗原決定部位定位），因此可能以單株抗體 較隹。可培殖對抗於細胞表面表現的完整受體以及對抗已 知於細胞表面形成的胜肽之單株抗體。可施行Geyseii等 15之美國專利案5,998,577之方法，以獲得許多相關胜肽。 據發現可活化GAVE6之抗體可予以修飾，使無關 GAVE6活化之活性減至最小，例如補體固定法。因此， 可將抗體分子載短或突變，以去除或將GAVE6活化以外 之活性減至最小。例如，對特定抗體而言，只需要抗原結 20合部位；因此，可將抗體之Fe部分去除。 表現GAVE6的細胞可暴露於抗體，以活化 GAVE6 〇再將經活化之細胞暴露於多種分子，以鑑定何 種分子調節受體活性，產生較高活化量或較低活化量。然 後於無抗體下，在表現GAVE6的細胞上測試達彼等目標 -81- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200307688 A7 B7 五、發明說明（8〇) 之分子，以觀察對未活化細胞之影響。因此可測試標的分 子，並使用已知技術將其修飾成為用於治療與改變 GAVE6代謝相關的病症之候選藥物。 本發明之不使用細胞分析法經得起可溶性形式與膜結 5合形式GAVE6用途之檢驗。於包括膜結合形式GAVE6 之不使用細胞之分析方法中，可能需使用增溶劑，使膜結 合形式GAVE6維持於溶液中。該等增溶劑之實例包括非 離子性清潔劑例如正辛基葡萄糖苷、正十二基葡萄糖苷、 正十二基麥芽糖苷、辛醯基_N_甲基葡糖醯胺 10 (glucamide)、癸醯基_N_甲基葡糖醯胺、TRIT〇N χ 1〇〇、 TRIT〇N X-U4、THESIT、異三癸基聚（乙二醇醚)η、3- [(3-膽醯胺丙基（cholamidopropyl))二甲胺基]β1_丙烷磺酸 鹽（CHAPS)、3-[(3-膽醯胺丙基）二甲胺基]_2_羥基_丨_丙烷 磺酸鹽(CHAPSO)或N-十二基=N，N-二甲基_3_胺基_1β丙烷 15 磺酸鹽。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 於本發明上述分析方法之一個以上具體實例中，可能 希望固定GAVE6或其標的分子以促進錯合及未錯合形式 的蛋白質之一或二者之分離，以及提供自動化分析。於候 選化合物存在或不存在下，測試化合物與GAVE6的結合 20或GAVE6與標的分子之相互作用可於適用於容納反應物 之任何容器中完成。此等容器之實例包含微量滴定盤、試 管及微量離心管。於一具體實例中，可提供添加容許該蛋 白質之一或二者與基質結合的功能部位之融合蛋白質。例 如，可將麩胱甘肽-S_轉移酶/GAVE6融合蛋白質或麩胱甘 -82- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（_2i〇 x 297公爱)------ 200307688 A7 B7 五、發明說明（81) 肽-S-轉移酶/標的融合蛋白質吸附於麩胱甘肽 SEPHAROSE 珠粒上(Sigma Chemical, St· Louis，M0)。或 者，將麩胱甘肽衍生化之微量滴定盤與測試化合物組合。 接著，於引導形成錯合物之條件（例如，於鹽與pH生理 5 條件）下，培育未吸附之標的蛋白質或GAVE6蛋白質及 混合物。培育之後，洗滌珠粒或微滴定盤槽以去除任何未 結合的成分，直接或間接測量錯合物之形成。或者，可使 錯合物與基質解離，使用標準技術測定GAVE6結合量或 活性量。 10 將蛋白質固定於基質上之其他技術亦可於本發明之篩 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 選分析方法中使用。例如，GAVE6或其標的分子二者均 可利用生物素及抗生物素鏈菌素之共軛作用予以固定。生 物素化之GAVE6或標的分子可使用此項技藝中悉知之技 術（例如’生物素化套組，Pierce Chemicals，Rockford， 15 IL)，以生物素-NHS (N-羥基-琥珀醯亞胺）製備，及固定於 被覆抗生物素鍵菌素之96槽培養盤(Pierce Chemicals)之 諸槽中。或者，可將對GAVE6或標的分子具反應性，惟 不干預GAVE6蛋白質與標的分子結合之抗體，於培養盤 之諸槽中衍生化。培育之後，可利用抗體共軛將未結合的 20標的或GAVE6截留於槽中。檢測該等錯合物之方法，除 了上述用於GST-固定化錯合物者外，包括使用對GAVE6 或標的分子具反應性的抗體之錯合物免疫檢測法、以及依 靠檢測與GAVE6或標的分子相關的酵素活性之酵素連結 分析法。 -83- 本紙張尺度適用中國國家標準(Cns)A4規格（210 X 297公爱） 200307688 A7

五、發明說明（82) 於另一具體實例中，GAVE6表現之調節劑係以使細 胞與候選化合物接觸，及測定GAVE6 mRNA或蛋白質於 細胞中的表現之方法予以鑑定。將候選化合物存在下， GAVE6 mRNA或蛋白質的表現量，與候選化合物不存在 5下，GAVE6 mRNA或蛋白質的表現量進行比較。根據該 比較結果，則可鑑定候選化合物是否為GAVE6表現之調 節劑。例如，當GAVE6 mRNA或蛋白質的表現量於候選 化合物存在下比其不存在下更大（統計上顯著地更大）時， 則鑑定該候選化合物為GAVE6 mRNA或蛋白質表現之激 10發劑或致效劑；或者，當GAVE6 mRNA或蛋白質的表現 量於候選化合物存在下比其不存在下更小（統計上顯著地 更小）時，則鏗定該候選化合物為GAVE6 mRNA或蛋白 質表現之抑制劑或拮抗劑。於配位體或致效劑存在下，或 於組成性GAVE6中，若GAVE6活性減少至低於基線， 15則鑑定該候選化合物為反致效劑。細胞中GAVE6 mRNA 或蛋白質之表現量可利用本文所述用於檢測GAVE6 mRNA或蛋白質之方法測定。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 於本發明又另一態樣中，GAVE蛋白質可於雙雜交分 析法或三雜交分析法中作為「餌蛋白」用[參見，例如， 20 美國專利案 5,283,317;2^1^〇8 61&1.5€611 (1993) 72:223-232 ； Madura et al.? J Biol Chem (1993) 268:12046-12054 ； Bartel et al.，Bio/Techniques (1993) 14:920-924 ; Iwabuchi et al·，〇nc〇gene (1993) 8:1693-1696 ;及 PCT 公告案 WO 94/10300]，以鑑定與GAVE6-結合或相互作用、及調節 -84- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200307688 A7 B7 五、發明說明（83 ) GAVE6活性之其他蛋白質（前者稱為「从㈣-結 質」或”GAVE6_bp，，）。此等gaVE6_結合蛋白質亦可能涉 及利用GAVE6蛋白質之訊自值嫉 傅播，例如，GAVE6途徑 之上游或下游元件。 5 由於本發明賦能產生大量純GAVE6,因此可確立適 當功能區域構像之物理特性鐘定，供循理性藥物設計之 用。例如，分子之IC3區域與此功能部位為特別引人關 注者。-旦識別出區域之形狀及離子構像，則可配置應斑 彼等區域相互作用之候選化合物，接著於完整細胞、動物 10及病患中進行測試。能夠取得該等3-D結構資訊之方法 包括X光結晶學、NMR光譜學 '分子模擬法等。結 構亦可導使鑑定其他已知蛋白質（其中存在於該部位具有 作用之已知藥物）之類似構像部位。彼等藥物或其衍生物 可尋得使用GAVE6之用途。 15 本發明進一步有關利用上述篩選分析法鑑定之新穎製 劑，及其如本文所述之治療用途。 本發明之分析方法 A·檢測分折法 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明之部分DNA序列或片段可以許多方法作為多 20 核苷酸試劑用。例如，該等序列可用於：（i)制定染色體上 個別基因之圖譜，因此’定位與遺傳疾病相關的基因區 域，（ii)從微小生物试樣中鐘定個體（組織分型）；及(出)有 助於生物試樣之法醫學鑑定。該等應用將於下文詳述。 1.染色體圖譜制定 •8 5 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200307688 A7 84 ) 五、發明說明 定出一離⑽0序列（㈣分序列），即可仙該序列 GAVE6枋：基因於染色體上的位置。因此’本文敘述的 中的位/A分子或其片段可用於定出GAVE6於基因體 之定位，/她6序列於基因體(特別是人類基因體）中 步。纟使序列與疾病相關基因互相關聯重要的第一 10 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 〇AVlHGAVE6基因於基因體上的定位可利用以 引子乃備微引子（長度較佳為匕251^該等 =供:個別人類染色體的體細胞雜化物進行⑽筛 可獲得_#段。 的人類基因之彼等雜化物 人魅：細胞雜化物係融合不同哺乳動物之體細胞(例如， 上：鼠細胞)而製備。當人類與小鼠細胞雜化物生長 及刀裂時，通常人類染色體經雜亂順序而喪失，惟小鼠染 色體被保留。藉由制錢細胞無法生長（由於缺乏特定 酵惟人類細胞可生長之培養基，縣有該需要酵素編 碼土因之人類染色體將被保留下來。於使用多種培養基 下，可建立多組雜交細胞系。各組中之各細胞系含有單一 染色體或少數人㈣㈣及整組錢衫體，使得個別基 因對特^人類染色體之圖譜制以於崎[D，Eustachi〇 et al·，Science (1983) 220:919-924]。僅含人類染色體片段之 體細胞雜化物亦可藉使用具有移位與缺失之人類染色體予 以製造。 體細胞雜化物之PCR圖譜制定為將特定序列分派於 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200307688 A7 B7 五、發明說明（85) 特定染色體之迅速程序。使用單一循環加熱器，每天可分 派三或四個序列。 可同樣用於將GAVE6序列定位於基因體之特定染色 體之其他疋位方法包括原位雜交法[敘述於Fan et al，pr〇c 5 Natl Acad Sci USA (1990) 87:6223-27]，使用經標記的流 量分類染色體預篩檢，及利用與染色體專一性cDNA庫 雜交進行預選擇。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 使DNA序列螢光原位雜交(FISH)於中期染色體延伸 物’亦可用於以一個步驟提供精確的染色體位置。染色體 10延伸物可使用已於細胞分裂中期以化學製劑（例如，秋水 仙素）瓦解有絲分裂紡鐘體封阻細胞分裂之細胞製造。以 姨蛋白酶簡單處理染色體，然後以Giemsa染色。各染色 體逐漸形成光暗色帶模式，因此可進行染色體之個別鑑 定。FISH技術可用於短至500或600個鹼基之DNA序 15 列。然而，大於1，〇〇〇個鹼基之選殖株具有與獨特染色體 位置結合之較高可能性，及具有供簡單檢測用之足夠訊息 強度。較佳為1，000個鹼基，更佳為2,000個鹼基，即足 以於合理之時間用量内得到良好結果。此技術之回顧，參 見 Verma et al· [Human Chromosomes: A Manual of Basic 20 Techniques (Pergamon Press, New York, 1988)]。染色體圖 譜制定可利用電腦模擬，及運用統計考量（例如成功率或 單僅接近性）予以推論。 可個別使用供染色體圖譜制定用之試劑以定位染色體 上之單一位置。再者，可使用多組試劑以標記多個位置及 -87- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（21〇 χ 297公釐） 200307688 A7 B7 五、發明說明（86) /或多個染色體。供定位目的時，實際上以對應於GAVE6 基因側接區域之試劑為佳。於基因家族内之編碼序列更有 具保留性之可能，而於染色體定位期間增加雜交的機會。 一旦將序列定位於精確的染色體位置，即可使染色體 5 上該序列之物理位置與基因圖譜數據相關聯（此等數據見 於，例如，McKusick，Mendelian Inheritance in Man，經由 Johns Hopkins University，Welch Medical Library 聯線可 得）。透過連結分析（物理性緊鄰的基因之共遺傳）[見述 於，例如，Egeland et al·，Nature (1987) 325:783-787]，則 10 可鑑定定位於相同染色體區域的基因與疾病之間的關係。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 此外，可測定罹患及未罹患與GAVE6相關病症個體 間DNA序列之不同。若於一些或所有罹病個體觀察到， 而未於任何未罹病個體觀察到突變，則該突變很可能為該 特定病症之病因劑。罹病與未罹病個體之比較首先通常涉 15 及搜尋染色體的結構性變化，例如從染色體延伸物看得到 或使用根據該DNA序列的PCR可檢測之缺失或移位。最 後，可進行得自數個個體的基因之完全定序，以證實突變 存在及區分突變與多形現象之不同。 2.組織分型 20 本發明之GAVE6序列亦可用於從微小生物試樣中鑑 定個體。例如，美國軍方正考慮使用限制酶片段長度多形 性(RFLP)進行人事鑑定。該項技術係以一或多個限制切 割酶分解個體之基因體DNA，以南方墨點法進行探測， 得到鑑定用之獨特染色帶。此方法不致遭受目前使用之可 -88- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） " -- 200307688 A7 B7 五、發明說明（87) 能遺失、掉包或被偷，造成正向鑑定困難的「狗牌」極限 之苦。本發明序列係作為RFLp之附加標記用途(敘 述於美國專利案5,272,057)。 再者，本發明序列可用於提供一種替代技術，該技術 5測定個體基因體經選定部分的實際上一個驗基接著一個驗 基之DNA序列。因此，本文所述之gAVE6序列可用於 製備以序列之5,及3,端製備的兩個PCR引子。然後可使 用該等引子擴增個體之DNA，接著提供其序列。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 以該方法製備之得自個體的多組對應DNA序列，由 ίο於對偶質差異，各個體具有獨特的一套該等DNA序列， 因此可提供獨一無二之個體鑑定。本發明序列可用於從個 體及從組織獲得該等鑑定序列。本發明之GAVE0序列獨 特地代表部分人類基因體。對偶質變異某些程度上發生在 序列之編碼區域，較大程度發生於非編碼區域。一般評 15估，不同個體間之對偶質變異以每500個鹼基大約一次之 頻率發生。本文所述之各序列，在某些程度上，可作為標 準，得自個體之DNA可與其比較以供鑑定目的。由於較 大數量之多形現象發生於非編碼區域，因此欲區分個體需 要的序列較少。SEQ ID ΝΟ:1之非編碼序列可提供可能為 20 至丨，000個引子組(各獲得1〇〇個鹼基之非編碼擴增序 列）之肯定之個體鑑定。若係使用預測之編碼序列，例如 SEQ IDNO:l所述者，則供肯定之個體鑑定用的更適當之 引子數將為500-2,000個。 若係使用本文敘述之得自GAVE6序列之試劑組來產 -89- ^紙張尺度適用中標準(CNS)h規格（210x297公釐)---- 200307688 A7 B7 五、發明說明ο) 生個體的獨特鑑定資料庫，則彼等相同試劑以後可用於鑑 定得自該個體之組織。使用該獨特鑑定資料庫，可從極小 的組織試樣中進行無論活的或死亡的個體之肯定鑑定。 3·部分GAVE6序列於法醫生物學上之用途 5 使用DNA之鑑定技術亦可用於法醫生物學。法醫生 物學乃運用犯罪現場中發現的生物證據(例如，犯罪現場 的加害者）之基因類型作為肯定鑑定工具之科學領域。進 行此等鑑定時，可使用PCR技術擴增從犯罪現場發現的 非常小的生物試樣例如組織（例如，頭髮或皮膚）、或體液 10 (例如，血液、唾液或精液）中取得之DNA序列。然後將 擴增序列與標準進行比較，因而鑑定該生物試樣的來源。 本發明之序列可用於提供導向人類基因體特定位置之

多核苷酸試劑，例如，PCR引子，因而可增進使用DNA 的法醫學鑑定之可靠性。例如，引起關注的核酸可提供另 15 一項「鑑定標記」（亦即，對特定個體為獨一無二之另一 DNA序列）。如上述，可使用實際的鹼基序列資訊供鑑定 由限制切割酶產生片段形成模式之精確替代物用。導向 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 SEQ ID NO: 1非編碼區域之序列特別適用於該項用途，因 為較大數量之多形現象發生於非編碼區域，增進使用該項 20技術區分個體之識別力。多核苷酸試劑之實例，包括 GAVE6序歹丨J或其部分序歹丨j ;例如，衍生自seq id NO: 1 非編碼區域、長度為至少20或30個驗基之片段。 本文敘述之GAVE6序列進一步可用於提供多核苷酸 試劑，例如，經標記或可標記之探針，其可用於，例如， -90- 本纸張尺度適中國國i標準(CNS)A4規格（210 X 297公爱) 200307688 A7 B7 五、發明說明（89 5 10 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 原位雜交技術中，以鑑定特定的組織（例如，腦組織）。在 法醫病理學家提出不明來源的組織之諸多情形下，該等多 核苷酸試劑將非常有用。多組該等GAVE6探針可用於依 品種及/或器官類型鑑定組織。 該等試劑，例如GAVE6引子或探針，以類似方式可 用於篩檢組織培養物是否受污染（亦即，篩檢培養物中是 否存在不同類型細胞之混合物）。 B.預測藥學 本發明亦有關預測藥學之領域，其中係使用診斷分 析、預後分析、藥理基因體學及偵測臨床試驗供預後（預 測）目的以對個體進行預防性治療。因此，本發明之一態 樣係有關測定生物試樣（例如，血液、尿液、糞便、唾 液、血清、細胞及組織）中的GAVE6蛋白質及/或核酸表 現以及GAVE6活性之診斷分析法。該分析法可用於測定 個體疋否罹患或瀕臨逐漸形成與異常GAVE6表現或活性 相關的病症或失調症。 本發明亦提供用於測定個體是否瀕臨逐漸形成與 GAVE6蛋白質、核酸表現、或活性相關的失調症之預後 =測）分析法。例如，可分析生物▲趣巾以娜基因之 犬變此等》析法可供預後或預_途，從而於發生特徵 為GAVE6蛋白質 '核酸表現或活性或與其關聯的失調症 之刖’對個體進行預防性之治療。 本發明之另一態樣係提供測定個體的gave6蛋白 質、核酸表現或GAVE6活性，從而選擇該個體適用的治 疆 # 訂

I 本紙張尺度剌巾關家標準(CNS)A4 210 χ 297公楚） 200307688 A7 B7 五、發明說明（9〇 療或預防製劑之方法（本文中稱為「藥理基因體學」）。藥 理基因體學容許根據個體之基因型（例如，經檢測以確2 個體對特定製劑的反應能力之個體基因型）選擇供治療性 或預防性治療個體之製劑（例如，藥物）。 5 本發明之又另一態樣係有關臨床試驗中偵測製劑（例 如，藥物或其他化合物）對GAVE6表現或活性之影響。 彼等及其他製劑將於下文進一步詳細敘述。 1.診斷分析法 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 檢測GAVE6存在生物試樣中與否之例示方法涉及自 ίο測試對象獲得生物試樣，使該生物試樣與能檢測GAVE6 蛋白質或編碼GAVE6蛋白質的核酸(例如，mRNA或基 因體DNA)之化合物或製劑接觸，俾使得以檢測生物試樣 中GAVE6之存在。檢測GAVE6 mRNA或基因體簡八 之較佳製劑為能與GAVE6 mRNA或基因體DNA雜交之 15標記之核酸探針。核酸探針可為，例如，全長GAVE6核 酸，例如SEQ ID ΝΟ:1之核酸或其部分序列，例如長度 為至）15、30、50、1〇〇、250、500或更多個核苷酸且於 嚴苛條件下足以專一性地與GAVE6 mRNA或基因體 DNA雜交之募核苷酸。本發明診斷分析法使用之其他適 20當探針見述於本文。 檢測GAVE6蛋白質之特別製劑為能與GAVE6蛋白 質結合之抗體，較佳為具有可檢測標記之抗體。抗體可為 夕株、嵌合型、或更佳為單株抗體。可使用完整抗體或其 片衩[例如，Fab或F(ab，)2]。「生物試樣」一詞意欲包含自 -92- 張尺度適用標準(CNS)A4規格（21Q X 297公爱） - 200307688 Α7 B7 五、發明說明（91；) 10 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 對象單離出之組織、細胞及生物流體，以及存在對象内之 組織、細胞及流體。亦即，本發明之檢測方法可用於檢測 試管内以及活體内生物試樣中之GAVE6 mRNA、蛋白質 或基因體DNA。舉例而言，檢測GAVE6 mRNA之試管 内技術包含北方雜交法及原位雜交法。檢測GAVE6蛋白 質之試管内技術包含ELISA、西方墨點法、免疫沉澱法 及免疫螢光法。檢測GAVE6基因體DNA之試管内技術 包含南方雜交法。再者，檢測GAVE6蛋白質之活體内 技術包含於對象内引入標記之抗-GAVE6抗體。例如，該 抗體可以放射活性標記予以標記，其於對象中之存在及位 置可利用標準成像技術予以檢測。 於一具體實例中，生物試樣含有得自試驗對象的蛋白 質分子。或者’生物試樣可含得自試驗對象的mRNA分 子或得自試驗對象的基因體DNA分子。於本文中具用途 之特定生物試樣為以習知方法從對象單離出之末梢血液白 血球試樣。 因此，於預後或診斷分析法之發展中，供診斷帶菌者 或罹患者用之病症關聯性及核酸或蛋白質多形現象之鑑定 是有幫助的。例如，對於風濕性關節炎、氣喘、克隆氏症 (Crohn’s Disease)等而言，預後或診斷分析法是有幫助 的。在與活化或發炎狀態有關的細胞中，GAVE6表現提 升。與發炎有關的失調症包括，過敏狀態、結腸炎、克隆 氏症、水腫狀態、接觸性過敏、過敏症、其他形式之關節 炎跑膜炎及免疫系統藉由丘管擴張、發熱、聚集細胞、 -93· 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（21〇 χ 297公爱） 訂 200307688 A7 B7 五、發明說明（92 流體等反應造成部位腫脹之其他狀況等。因此，GAVE6 代謝失調可能被診斷為風濕性關節炎。此外，風濕性關節 炎之分子機制為可檢測，例如，診斷性SNP、RFLP、表 現量變化性、功能變化性等可於組織試樣（例如，血液試 5 樣）中檢測出來。 於另一具體實例中，該方法進一步有關從對照對象獲 得生物試樣；使該對照試樣與能檢測GAVE6蛋白質、 mRNA或基因體DNA的化合物或製劑接觸，以檢測該生 物試樣中GAVE6蛋白質、mRNA或基因體DNA之存在 10及量；然後針對對照試樣中GAVE6蛋白質、mRNA或基 因體DNA之存在及量與測試試樣中GAVE6蛋白質、 mRNA或基因體DNA之存在及量進行比較。 化學庫之高產能分拚法 能調節GAVE6活性的化合物之任何分析法均經得起 15高產能篩選之檢驗。高產能篩選系統為市售可得[參見， 例如，Zymark Corp·，Hopkinton，MA ; Air Technical Industries，Mentor，OH ； Beckman Instruments，Inc. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Fullerton, CA ; Precision Systems，Inc·，Natick, MA 等]0 彼等系統典型地整個程序為自動化，包括適用於該分析法 20 的所有試樣與試劑吸取、液體分配、定時培育、及檢測器 中微培養盤之最後讀取。彼等可配置系統提供高產能及迅 速啟動，以及高度靈活性與使用者自定性。該等系統之廠 商提供多種高產能之詳細實驗流程。舉例而言，Zymark

Corp·提供敘述檢測基因轉錄調節、配位體結合等篩選系 -94- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200307688

五、發明說明（93 ) 統之技術公報。 套組 本發明亦涵蓋檢測生物試樣(試驗試樣）中GAVE6的 存在之套組。此等套組可用於測定對象是否罹患或瀕臨逐 5漸形成與GAVE6異常表現有關的失調症（例如，免疫學 失調症）。例如，套組可包含能檢測生物試樣中的σΑνΕ6 蛋白質或mRNA之標記化合物或製劑，及用於測定試樣 中的GAVE6量之裝置[例如，抗-GAVE6抗體或與編碼 GAVE6的DNA(例如，SEq ID N〇:1)^合之寡核苷酸探 10針]。套組亦可用於得到指示該試驗對象是否罹患或瀕臨 逐漸形成與GAVE6異常表現有關的失調症、GAVE6蛋 白質或mRNA之量是在正常量以上或以下之結果。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 關於使用抗體之套組，其中可包含，例如：G)與 GAVE6蛋白質結合的第一個抗體(例如，連接於固體支撐 15物），及視需要地，（2)與GAVE6蛋白質或第一個抗體結 合亚與可檢測製劑併合的第二個不同抗體。如果第二個抗 體不存在，則可將第一個抗體可檢測地予以標記，或者， 可將結合第一個抗體的另一分子可檢測地予以標記。總 之’如此項技藝中已知，套組中包含標記之結合基團以作 20 為可檢測之通訊分子。 關於使用寡核苷酸之套組，本發明套組可包含，例 如：⑴與GAVE6核酸序列雜交之募核苷酸，例如，可檢 測地予以標記之募核苷酸；或擴增GAVE6核酸分子用 的一對引子。 -95- 7紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（21〇 χ 297公g )-- 200307688 A7 B7 五、發明說明（94 ) 套組中亦可包含，例如，緩衝劑、防腐劑或蛋白質穩 定劑，及檢測可檢測製劑（例如，酵素或基質）需要的成 分。再者，套組中亦可含可分析及與試驗試樣比較用的對 照試樣或對照試樣系列。套組中之各成分通常封入個別容 5器之内，所有容器均在單一包裝之中。觀察試驗對象是否 罹患或瀕臨逐漸形成與GAVE6異常表現有關的失調症之 說明書亦封入其中。 2·預後分析法 此外，本文敘述之方法可使用於診斷或預後分析法 10中，以確認對象具有或瀕臨逐漸形成與異常GAVE6表現 或活性有關的病症或失調症。舉例而言，本文敘述之分析 法，例如刖文之診斷分析法或下文之分析法，可用於確認 對象具有，或瀕臨逐漸形成，與GAVE6蛋白質、核酸表 現或活性有關的失調症。例如，與細菌之新近接觸或與氣 15喘有關之炎症、慢性梗塞性肺疾及風濕性關節炎均可以該 分析法檢驗。或者，預後分析法可用於確認具有或瀕臨逐 漸形成該等病症或失調症之對象。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 因此，本發明提供一種方法，其中係從對象獲得試驗 試樣，及檢測GAVE6蛋白質或核酸(例如，mRNA或基 20因體DNA)。GAVE6蛋白質或核酸之存在為對象具有， 或瀕臨逐漸形成，與異常GAVE6表現或活性有關的病症 或失調症之診斷結論。本文所用之「試驗試樣」係指從引 起關注的對象獲得的生物試樣。例如，試驗試樣可^生物 流體（例如，血清）、細胞試樣或組織。 -96- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200307688 A7 B7 - ' ' ------- 五、發明說明（95) 此外’本文敘述之預後分析可用於決定對象是否可 杈與製劑（例如，致政劑、拮抗劑、胜肽模擬物、蛋白 質、胜肽、核酸、小分子或其他候選藥物），以治療與異 常GAVE6表現或活性有關的病症或失調症。例如，該等 5方法可用於決定對象是否可以特定製劑或製劑類（例如， 降低GAVE6活性之製劑類型）有效地治療。因此，本發 明提供用於決定對象是否可以製劑有效地治療與異常 GAVE6表現或活性有關的失調症之方法，其中係獲得試 驗試樣並檢測GAVE6蛋白質或核酸(例如，其中GAve6 10蛋白質或核酸之存在為對象可投與製劑以治療與異常 GAVE6表現或活性有關的失調症之診斷結論）。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明之方法亦可用於檢測GAVE6基因之基因病灶 或突變，從而決定具有該病灶基因之對象是否瀕臨罹患特 徵為異常細胞增殖及/或分化之失調症。於較佳具體實例 15中’該方法包括檢測得自該對象之細胞試樣中基因病灶或 突變存在與否，該等基因病灶或突變之特徵為至少有一個 影響編碼GAVE6·蛋白質的基因完整性之改變或GAVE6 基因之錯誤表現。例如，該等基因病灶或突變可藉確定下 述至少一者之存在予以檢測：1) GAVE6基因有一或多個 20核苷酸缺失；2) GAVE6基因添加一或多個核苷酸；3) GAVE6基因有一或多個核苷酸被置換；4)涉及GAVE6 基因之染色體重排；5) GAVE6基因信使RNA轉錄本之 量發生改變；6) GAVE6基因之異常修飾，例如基因體 DNA之甲基化；7) GAVE6蛋白質之非野生型含量；8) -97- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200307688 A7 B7 五、發明說明（96 ) GAVE6基因之對偶質喪失；及9) GAVE6蛋白質不適當 的轉譯後修飾。如本文所述，有大量此項技藝中已知之分 析技術可用於檢測GAVE6基因中之病灶。較佳之生物試 樣為利用習知方法從對象單離出之末梢血液白血球試樣。 5 於特定具體實例中，病灶之檢測涉及使用聚合酶連鎖 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 反應（PCR)中之探針/引子（參見，例如，美國專利案 4,683，195 及 4,683,202)，例如錨狀 PCR 或 RACE PCR， 或者，接合性連鎖反應（lcr)中之探針/引子[參見，例 如，Landegran et al·，Science (1988) 241:1077-1080 ;及 10 Nakazawa et al., Proc Natl Acad Sci USA (1994) 91:360-364]，其中後者特別適用於檢測GAVE6基因中之單點突 變[參見，例如，Abravaya et al·，Nucleic Acids Res (1995) 23:675-682]。該方法包含下述步驟：收集病患之細胞試 樣；從該細胞試樣中單離核酸(例如，基因體、mRNA或 15 二者）；在使GAVE6基因（若存在)發生雜交及擴增之條件 下，使核酸試樣與專一性地和GAVE6基因雜交之一或多 個引子接觸，檢測擴增產物之存在與否，或檢測擴增產物 之大小並與對照試樣比較長度。一般預料可能期望使用 PCR及/或LCR作為結合本文所述用於檢測突變的任何技 20 術之初步擴增步驟。 替代的擴增方法包括：自給自足式序列複製[Guatelli et al·，Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87:1874-1878]、轉錄 擴增系統[Kwoh et al” Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86:1173-1177]、Q-/3 複製酶[Lizardi et al·，Bio/Technology -98- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200307688 A7 B7 五、發明說明（97) (1988) 6:1197]或任何其他核酸擴增方法，隨後使用熟習 此項技藝者悉知之技術檢測該擴增分子。該檢測系統尤其 是用於檢測存在量非常小的核酸分子。 於替代之具體實例中，得自細胞試樣的GAVE6基因 5 之突變可利用限制切割酶切割模式的改變予以確認。單離 試樣及對照DNA，擴增（視需要），以一或多個核酸内切 限制酶分解，利用凝膠電泳法測定片段長度大小並進行比 較。試樣與對照DNA間片段長度大小之差異顯示試樣 DNA中之突變。此外，可使用序列專一性核糖酶(參見， 10 例如，美國專利案5,498,531)，利用核糖酶切割位置之形 成或喪失探查特異突變的存在與否。 於其他具體實例中，GAVE6之基因突變可藉由使試 樣及對照核酸(例如，DNA或RNA)與含千佰個寡核苷酸 探針之高密度陣列雜交予以確認[Cronin et al.，Human 15 Mutation (1996) 7:244-255 ； Kozal et al.5 Nature Medicine (1996) 2:753-759]。例如，GAVE6 之基因突變可如 Cronin 等（文獻同前)所述，於含有產生光的DNA探針之二維陣 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 列中予以確認。簡言之，可使用探針之第一個雜交陣列徹 底審視試樣及對照組中之DNA長延伸物，利用產生相繼 20 重疊探針之線型陣列來確認序列間之鹼基變化。該步驟容 許鑑定單點突變。隨後為第二個雜交陣列，其容許藉使用 較小、與檢測的所有變異體或突變互補之專門探針陣列進 行特異突變之確認。各突變陣列係由平行的探針組構成， 一者與野生型基因互補，另一者與突變基因互補。 -99- 張尺度適用1國國家標準(CNS)A4規格(21G X 297公釐)" -- 200307688 A7 B7 五、發明說明（98 ) 於又一具體實例中，可使用此項技藝中已知之任何各 種定序反應直接定序GAVE6基因，並利用比較試樣 GAVE6之序列與對應的野生型（對照)序列檢測突變。定 序反應之實例包括根據Maxam & Gilbert [Proc Natl Acad 5 Sci USA (1977) 74:560]或 Sanger [Proc Natl Acad Sci USA (1977) 74:5463]開發之彼等技術。亦慮及於進行診斷分析 法時，可使用任何各種自動定序程序[Bi〇/Techniques (1995) 19:448]，包括利用質量光譜法定序[參見，例如， PCT 公告案 WO 94/16101 ; Cohen et al·，Adv Chromatogr 10 (1996) 36:127-162 ;及 Griffin et al·，Appl Biochem

Biotechnol (1993) 38:147-159]。 檢測GAVE6基因中的突變之其他方法包括使用防護 切割劑以檢測RNA/RNA或RNA/DNA異源雙鏈中之誤配 驗基[Myers et al·，Science (1985) 230:1242]。通常，「誤 15 配切割」之技術必需提供使含野生型GAVE6序列之(標 記之)RNA或DNA與得自組織試樣的潛在突變型RNA或 DNA雜交形成之異源雙鏈。以雙鏈單股區域之切割劑處 理該雙股雙鏈，以切割由於對照與試樣股間之鹼基對誤配 存在之該單股區域。RNA/DNA雙鏈可以RNase處理以分 20 解誤配區域，DNA/DNA雜化物可以S1核酸酶處理以分 解誤配區域。於其他具體實例中，DNA/DNA或者 RNA/DNA雙鏈可以羥基胺或三氧化锇處理以分解誤配區 域。於分解誤配區域之後，接著於變性聚丙烯醯胺凝膠上 依大小分離所得物質，以測定突變位點。參見，例如， -100- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 裴 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 200307688 A7 B7 ~~—~——^Wm 五、發明說明（99)

Cotton et al.? Proc Natl Acad Sci USA (1988) 85:4397 ；

Saleeba et al·，Methods Enzymol (1992) 217:286_295。於較 佳具體實例中，可標記對照DNA或RNA以供檢測。 於又另一具體實例中，在用於檢測及定位得自細胞試 5 樣的GAVE6 cDNAs中的單點突變之界定系統中，誤配切 割反應係使用識別雙股DNA中的誤配鹼基對之一或多種 蛋白質（所謂「DNA誤配修補」酵素）。例如，大腸桿菌 酵素mutY切割G/A誤配的A;得自HeLa細胞之胸普 DNA 糖基酶切割 G/T 誤配的 T [Hsu et al·，Carcinogenesis 10 (1994) 15:1657-1662]。根據例示之具體實例，將以 GAVE6序列(例如，野生型GAVE6序列）為基底之探針與 得自測試細胞之cDNA或其他DNA產物雜交。以DNA 誤配修補酵素處理該雙鏈，若存在任何切割產物，則可於 電泳實驗流程等中予以檢測，參見，例如，美國專利案 15 5,459,039 〇 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 於其他具體實例中，可利用電泳移動性之改變確認 GAVE6基因中之突變。例如，可使用單股構像多形性 (S S C P)檢測突變型與野生型核酸之間電泳移動性之差異 [Orita et al·，Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86:2766 ;亦參 20 見 Cotton, Mutat Res (1993) 285:125-144 ; Hayashi，Genet Anal Tech Appl (1992) 9:73-79]。將試樣與對照 GAVE6 核 酸之單股DNA片段變性，再令其復性。單股核酸之第二 結構依序列而異，所得電泳移動性之改變使得甚至單一鹼 基變化也可檢測出來。DNA片段可使用標記探針予以標 -101-本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200307688 A7 B7 五、發明說明（100 記或檢測。由於RNA的第二結構對序列變化更為敏感， 因此此分析法的敏感性可藉使用RNA(而不是DNA)而增 進。於較佳具體實例中，此主題方法係根據電泳移動性之 變化，利用異源雙鏈分析分離雙股異源雙鏈分子^沈^ et 5 al·，Trends Genet (1991) 7:5]。 於又一具體實例中’係使用變性梯度凝膠電泳法 (DGGE)[Myers et al·，Nature (1985) 313:495]分析含梯度變 性劑的聚丙烯醯胺凝膠中突變型或野生型片段的動向。以 DGGE作為分析方法時，須修飾DNA以確保其不完全變 10 性，例如利用添加以PCR製備之含大約40 bp、高烙點、 富含GC的DNA之GC夹鉗(GC clamp)。於進一步之具 體實例中，以溫度梯度取代變性梯度以識別對照與試樣 DNA 的移動性差異[R〇senbaum et al·，Biophys Chem (1987) 265:12753]。 15 檢測單點突變之其他技術實例包含，惟不限於，選擇 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 性寡核苷酸雜交法、選擇性擴增法或選擇性引子延伸法。 例如，可製備將已知突變置於中心之寡核苷酸引子，然後 在只有完美配對才能雜交之條件下，使其與標的DNA雜 交[Saiki et al·，Nature (1986) 324:163 ; Saiki et al” Proc 20 Natl Acad Sci USA (1989) 86:6230]。將該等對偶基因專一 性寡核苷酸雜交於經PCR擴增之標的DNA，或當寡核苷 酸連接於雜交膜並以標記標的DNA雜交時，則雜交於許 多不同的突變。 或者，本發明可組合使用依賴選擇性PCR擴增作用 -102- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200307688 A7 Μ B7 五、發明說明（101) 之對偶基因專一性擴增技術。作為專一性擴增的引子用之 寡核苷酸可於分子中心（使擴增作用取決於差別雜 交）[Gibbs et al·，Nucleic Acids Res (1989) 17:2437-2448]或 於一引子3’端盡頭帶有引人關注的突變，如此，於適當 5 條件下，可預防誤配或減少聚合酶延伸[Prossner，Tibtech (1993) 11:238]。此外，可能希望在突變區域引入新的限 制切割位點以創造使用切割之檢測[GaSparini et al.，Mol Cell Probes (1992) 6:1]。一般預期，於特定具體實例中， 亦可使用供擴增用之Taq黏接酶進行擴增[Barany，Proc 10 Natl Acad Sci USA (1991) 88:189]。於該等情形下，只有 在5序列的3’端可完美配對時才發生黏接，因此得以利 用找尋擴增作用的存在與否來檢測特定位點已知突變之存 在。 本文敘述之方法可，例如，利用含有本文所述之至少 15 一種探針核酸或抗體試劑之預包裝診斷套組來執行。該方 法及套組可方便地使用，例如，於門診環境中，以診斷顯 現症狀的病患或涉及GAVE6基因的病症或疾病之家族 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 此外，表現GAVE6的任何細胞類型或組織均可於本 20 文敘述的預後分析法中使用。 3·藥理基因體學 以本文敘述的篩選分析法鑑定之對GAVE6活性（例 如，GAVE6基因表現)具激發或抑制效應之製劑或調節劑 可投與個體以治療（預防性或治療性)與GAVE6活性相關 -103- 本紙張尺度剌+國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公复巧〜" 200307688 A7

五、發明說明（1〇2) 失調症（例如，與氣喘有關之炎症、慢性粳塞性肺疾及 風屬性關節炎）。結合該等治療法，可慮及個體之藥理基 因學（亦即，個體基因型與個體對外源化合物或藥物的反 f之間的關係之研究）。由於治療學上之代謝差異，改變 5藥理活性藥物劑量與血液濃度間之關係可導致嚴重毒性或 /σ療失敗。因此，個體之藥理基因體學容許根據個體基因 型之考量而選擇供預防性及治療性處理用之有效製劑（例 如’藥物）。該等藥理基因體學進一步可用於決定適當劑 量及治療程序。因此，可測定個體之GAVE6蛋白質、 1〇 GAVE6核酸表現或GAVE6基因之突變量，從而選擇供 該個體預防性及治療性處理用之適當製劑。 藥理基因體學乃有關由於藥物配置改變及於罹病者體 内之異常作用，對藥物反應之臨床上顯著之遺傳變異。參 見’例如，Linder，Clin Chem (1997) 43(2):254_266。通 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 15常，藥理基因狀況可分為兩種類型。改變藥物對身體作用 的方式為單一因素所傳達之基因狀況稱為「改變藥物作 用」；改變身體對藥物作用的方式為單一因素所傳達之基 因狀況稱為「改變藥物代謝」。藥理基因狀況可呈稀有缺 陷或呈多形現像發生。例如，葡萄糖_6_磷酸鹽脫氫酶缺 20乏症(G6PD)為常見的遺傳性酵素症，其主要臨床併發症 為於攝取氧化劑藥物（抗癔疾藥物、續胺類藥物、止痛藥 或呋喃類藥）及食用蠶豆後，紅血球溶解。 、 於一說明性具體實例中，藥物代謝酵素活性為藥物作 用強度及持續時間之主要決定因素。藥物代謝酵素 -104- ’、 1 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200307688 A7 B7 五、發明說明（i〇3) 如，N-乙醯基轉移酶2 (NAT 2)與細胞色素p45〇酵素、 CYP2D6與CYP2C1 9]基因多形現象之發現已為在服用 標準及安全劑量之藥物後，有些病患不會獲得預期的藥物 效應，或顯示過大的藥物反應與嚴重毒性的原因提供說 5明。人們的多形現象呈兩種表現型表現，廣泛的代謝者 (EM)及不良代謝者(PM)。不同族群間，pM的普遍性不 同。例如，於PM中，CYP2D6的基因編碼非常多形，並 鑑定出數個突變’其均導使缺乏功能性CYP2D6。 CYP2D6與CYP2C1 9之不良代謝者在接受標準劑量時， 10經常體驗過大的藥物反應與副作用。如同CYP2D6形成 的代謝物（嗎啡)所傳介的可待因之止痛效力所示，若代謝 物為活性治療成分，PM不顯示治療反應。另一個極端為 對標準劑量不反應之所謂超迅速代謝者。最近，超迅速代 謝之分子基礎已確定係由於CYP2D6基因擴增。 15 因此，可測定個體之GAVE6蛋白質活性、GAVE6 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 核酸表現或GAVE6基因突變量，從而選擇適當製劑，供 個體之治療性或預防性處理。此外，可使用藥理基因研 究’將編碼藥物代謝酵素之基因型多形對偶基因應用在個 體藥物反應表現型之鑑定上。該項知識，應用於用藥或藥 20物選擇時，可避免不利反應或治療失敗，因而於以 GAVE6調節劑（例如利用本文敘述例示的篩選分析法之一 者鑑定之調節劑）處理對象時，可增進治療或預防效率。 4·臨床試驗期間之效力偵測 製劑（例如，藥物或化合物）對GAVE6表現或活性(例 -105- I紙張尺度適用中國S家標準(CNS)A4規格（210x297公爱） 200307688 A7 B7 五、發明說明（104) 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 如，調節異常細胞增殖及/或分化之能力）的影響之偵測不 僅可應用於基本藥物篩選，亦可應用於臨床試驗。舉例而 言’如利用本文敘述的篩選分析法所測定之製劑增加 GAVE6基因表現、蛋白質量或蛋白質活性之效力，可於 5展現降低的GAVE6基因表現、蛋白質量或蛋白質活性之 對象之臨床試驗中予以偵測。或者，如利用篩選分析法所 測定之製劑降低GAVE6基因表現、蛋白質量或蛋白質活 性之效力，可於展現增加的GAVE6基因表現、蛋白質量 或蛋白質活性之對象之臨床試驗中予以偵測。於該等臨床 10試驗中，GAVE6表現或活性，較佳為，其他基因已牵連 例如細胞增殖失調症者，可作為特定細胞免疫反應性之標 記。例如，而不限於，可鑑定利用調節GAVE6活性（例 如’如本文敘述之篩選分析法所鑑定者）的製劑（例如，化 合物、藥物或小分子）處理而於細胞中被調節之基因（包括 15 GAVE6)。因此，欲研究製劑對細胞增殖失調症的影響（例 如，於臨床研究中），可將細胞單離，製備RNA，分析 GAVE6與牽連該失調症的其他基因之表現量。基因表現 (亦即，基因表現模式）之量可利用北方墨點分析法或本文 所述之RT-PCR，或者利用測量以本文所述方法之一者製 20造的蛋白質之量，或測量GAVE6或其他基因活性之量予 以定量。如此，該基因表現模式可作為細胞對製劑的生理 反應之指不標記。該反應狀態可於以製劑處理個體之前或 於處理期間不同時間點予以測定。 於特定具體實财，本糾提供以製劑（例如，以本 -106-

200307688 A7 B7 五、發明說明（1〇5) 文所述篩選分析法確認之致效劑、拮抗劑、胜肽模擬物、 蛋白質、胜肽、核酸、小分子或其他候選藥物）治療對象 的有效性之偵測方法，該方法包括下述步驟：⑴投與製劑 之前，獲取對象之投與前試樣；（ϋ)檢測該投與前試樣之 5 GAVE6蛋白質、mRNA或基因體DNA之表現量；（iii)獲 取對象之一或多個投與後試樣；（iv)檢測該投與後試樣之 GAVE6蛋白質、mRNA或基因體DNA之表現量；（v)將 投與前試樣之GAVE6蛋白質、mRNA或基因體DNA之 表現量或活性與投與後（諸）試樣之GAVE6蛋白質、 10 mRNA或基因體DNA進行比較；及(vi)依比較結果更改 製劑對對象之投與。例如，可能希望增加製劑之投與，以 增加GAVE6表現或活性，使其量比檢測量更高，亦即， 增加製劑的效力。或者，可能希望減少製劑之投與，以降 低GAVE6表現或活性，使其量比檢測量更低，亦即，降 15 低製劑的效力。 D.處理方法 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明提供處理瀕臨（或易感染）或具有與異常 GAVE6表現或活性有關失調症的對象之預防以及治療方 法。該等失調症包含，惟不限於，例如，與氣喘有關之炎 20 症、慢性梗塞性肺疾及風濕性關節炎。 1.預防方法 於一態樣中，本發明提供利用投與對象調節GAVE6 表現或至少一種GAVE6活性之製劑而預防該對象罹患與 異常GAVE6表現或活性有關的失調症或狀況之方法。瀕 -107- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200307688 A7 B7 五、發明說明（106) 臨由異常GAVE6表現或活性引起或促進的疾病之對象可 利用，例如，本文所述之任何診斷或預後分析法或其組合 予以確認。預防劑之投與可於表現GAVE6異常的特有症 狀之前發生，以預防發病，或者延緩病情進展。視 5 GAVE6異常性的類型而定，可使用GAVE6致效劑或 GAVE6拮抗劑治療對象。適當製劑可根據本文所述之篩 選分析法予以決定。 2·治療方法 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明之另一態樣乃有關調節GAVE6表現或活性以 1〇供治療用途之方法。本發明之調節方法涉及使細胞與調節 與該細胞有關的一或多種GAVE6蛋白質活性之製劑接 觸。調節GAVE6蛋白質活性之製劑可為本文所述之製 劑，例如核酸或蛋白質、天然存在之GAVE6蛋白質關聯 配位體、胜肽、GAVE6胜肽模擬物或其他小分子。於一 15具體實例中，該製劑激發GAVE0蛋白質之一或多種生物 活性。此等激發劑之實例包含活性GAVE6蛋白質及已引 入細胞内之編碼GAVE6之核酸分子。於另一具體實例 中，該製劑抑制GAVE6蛋白質之一或多種生物活性。此 等抑制劑之實例包含反義GAVE6核酸分子及抗-GAVE6 2〇抗體。調節方法可於試管内（例如，以製劑培養該細胞）， 或者，於活體内（例如，投與對象該製劑）進行。因此，本 發月提供治療罹患特徵為GAVE6蛋白質或核酸分子表現 或/舌性異常之病症或失調症的個體之方法。於一具體實例 士 ’該方法涉及投與調節（向上調節或向下調節）GAVE6 -108- 標準(CNS)A4 規格（210 X 297 公釐)' 200307688 Α7 Β7 五、發明說明（1(Π ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 表現或活性之製劑（例如，以本文所述薛選分析法鑑定之 製劑）或製劑組合。於另一具體實例中，該方法涉及投與 GAVE6蛋白質或核酸分子作為治療劑，以補償減少或異 常之GAVE6表現或活性。 於GAVE6異常地向下調節及/或GAVE6活性增加可 能具有有利效應的情形下，希望激發GAVE6活性。相反 地，於GAVE6異常地向上調節及/或GAVE6活性降低可 能具有有利效應的情形下，希望抑制GAVE6活性。 參照下文提供作為本發明範例之非限制實例，可更瞭 解本發明。下文呈現之實例係為了對本發明之較佳具體實 例作更完整之說明，而決不擬對本發明之寬廣範圍構成侷 限。 [實施方式] 實例 15 材料輿方法 似叹(5之邀定—以各種GPCR為查詢標題，使用 FASTA 计鼻程式（Wisconsin GCG Package Version 10.1)進 行人類基因體序列資料庫HTG (NCBI/NIH)之同質性搜 尋。將所得具有統計顯著性之基因體DNA序列轉譯成供 蛋白質資料庫之BLASTp搜尋的三個前置架構(f0rward frames)。鑑定出基因體DNA序列AC013396，其含有推 定之GPCR序列，將其命名為GAVE6。GAVE6染色體位 置定位於2ρ22·1。 爲碑GZF56的差琢邀乃剔之選羞_設計對該預測 -109- 5 10 20 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（21〇 X 297公楚） 參 訂 200307688 A7 B7 五、發明說明（l〇8 ) GAVE6之5’與3’序列具專一性之引子。以人類基因體 DNA作為模板，經由聚合酶連鎖反應(PCR)，使用前置引

子 HP157，CAG CCC ATG GAA CTT CAT AAC CTG (SEQ Π) NO:5)，及反置引子 HP158，CTG GCC CTC 體DNA。PCR條件如下：於94°C變性30秒，於55°C煉 合30秒，及於72°C延伸1分鐘，進行35個循環，隨後 於72°C延伸5分鐘。將擴增之DNA片段選殖入pCRn-TOPO載體(得自Invitrogen)中。利用DNA定序法證實該 1〇選殖之DNA散入物。所有PCR擴增反應均於DNA Engine Tetrad (MJ Research，型號 PTC-225)中進行。

才暴爲分# -根據廠商指示，以標記全長開放譯 讀架構DNA片段之[a-32P]dCTP與人類多種組織北方墨 點（得自Clontech)雜交。雜交之墨點以2XSSPE與〇.1〇/0 15 SDS 於 50°C 洗滌 30 分鐘，及以 0.1XSSPE 與 0.1% SDS 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 於50°C洗滌1小時。然後於強化螢幕存在下，於_7〇〇c， 使該等墨點暴露於X光膜。此北方墨點分析結果示於第4 圖。 ragm⑼分於-自Clontech購買得自人類組織之全 20 量RNA。於產生cDNA之前，使全量RNA進行DNAsel 處理，以避免潛在的基因體DNA污染。簡言之，使全量 RNA 與 5 微升 l〇x DNAsel 緩衝液[20mM Hepes pH 7.5 ; lOmM CaCl2 ; lOmM MgCl2 ; lmM DTT 與 5〇°/0 (v/v)甘 油](Ambion)、RNAse抑制劑及1微升DNAsel(不含 -110- Ϊ紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 x 297公釐)" "'--- 200307688 A7 B7 五、發明說明（l〇9) RNase)(2U/微升；Ambion)，最終容積50微升，於37°C 混合1小時。經苯酚沉殿步驟之後，使用Superscript選 擇系統，如Life Technologies所述進行cDNA之合成。使 用 Primer Express 1.0 軟體(ABI)設計 Taqman 引子/探針0 5 GAVE6 之 Taqman 前置引子為·· 5’ GCT GCC TGC AAA GTC AAC CT 3，(SEQ ID NO:7)、反置引子為：5, TGG CTGTGAGGAAGACAACG3’（SEQIDNO:8)&

Taqman 探針序列：5，FAM- CCA CCA ACC GCA CGG CAA - TAMRA 3’（SEQ ID NO:9)。使用 Fam 作為通訊子 10 染料，Tamra 作為消色劑（quencher)。向 Operon Technologies訂製合成Taqman探針。於最終容積50微 升、含下述組成之96槽培養盤MicroAmp光電管(PE)中 進行Taqman反應：25微升TaqmanPCR混合物(perkin Elmer) ; 1微升前置引子，最終濃度900nM ; 1微升反置 15 引子’最終濃度900nM及1微升Taqman探針，最終濃 度200nM ; 5微升cDNA模板(計算濃度10奈克/微升)及 17 微升水。Taqman PCR 條件如 PE Applied Biosystem 所 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 述執行。使用人類召肌動蛋白引子探針（由PE Applied Biosystem設計及販售）作為内對照。各組織針對標的基因 20及内對照進行二重複Taqman反應。此外，使用二重複增 量模板，產生人類冷肌動蛋白於全量腦cDNa _之標準 曲線，由此得以獲得擴增染色體擴大區之相對數量。標的 基因之表現以相對於腦cDNA之相對倍數表現量表示。

Taqman分析所得數據揭示於下文表1及第5圖。 -111- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---- 200307688 A7 B7 五、發明說明（no) 表1 组織類型 平均值 B2平均值 dd Ct 表現 腎上腺 28.59 19.67 8.93 2.06 骨髓 28.25 21.45 6.81 8.91 臈 29.84 22.72 7.13 7.14 結腸 28.29 19.88 8.41 2.94 胎腦 29.11 23.92 520 27.30 胎肝 27.54 22.36 5.18 27.49 心 31.41 20.96 10.45 0.71 腎 26.23 21.26 4.97 31.80 肝 29.18 22.96 6.22 13.37 肺 30.18 19.09 11.09 0.46 乳腺 29.65 21.55 8.11 3.63 胰 31.66 24.91 6.75 9.29 胎盤 31.00 23.43 7.57 5.28 前列腺 29,34 20.66 8.69 2.42 唾腺 30.84 20.96 9.88 1.06 骨骼肌 28.80 20.18 8.63 2.53 小# 28.68 21.19 7.49 5.56 脊椎神經 29.84 21.56 8.28 3.23 脾 29.40 18.63 10.77 0.57 胃 29.48 21.36 8.13 3.58 睪丸 29.81 22.53 7.28 6.46 胸腺 28.08 20.07 8.02 3.87 甲狀腺 30.25 20.57 9.68 122 氣管 30.42 1941 11.01 0.48 子宮 29.57 20.93 8.65 2.49 PBMC/對照 26.64 18.48 8.15 3.52 PBMC/PMA 31.31 18.50 12.81 0.14 PBMC/PHA 32.22 18.34 13.88 0.07 PBMC/HDM 27.29 17.48 9.80 1·12 A549細胞 34.9 21.32 13.58 0.08 THP-1 28.4 20.50 7.90 4.19 (+ve)正對照組 30.95 21.98 8.96 2.00 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

cD见4肩之PCi?鏔選-使用對GAVE6編碼區域具 專一性之 PCR 引子·· 5’TTC CTC CTG ATC AGC AAC CT 5 3’（SEQ ID NO:10)、及 5，TTG GTG GAC AGC ATG AAG AG 3’（SEQ ID NO:ll)篩選收集之人類脾、腦、腎、活化 T細胞、及肺cDNA庫。使用下述PCR實驗流程於96槽 培養盤中進行PCR篩選：94°C，保持3分鐘；94°C30 秒、52°C30秒、及68°C45秒進行40個循環。接著稀釋 -112- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200307688 A7 B7 五、發明說明（111) 陽性次收集（positive subpools)，供下一回合pCR篩選之 用。於洋菜培養盤上平板培養得自陽性次收集之有限量菌 落，利用PCR證實陽性質體，並進行DNA定序分析。 本發明之範圍不擬受限於本文所述之特定具體實例。 5 的確，從前文說明及隨附圖式，除了本文所述以外的本發 明之各種修飾為熟習此項技藝人士所顯見。該等修飾意欲 包含於隨附申請專利範圍之内。 進一步應瞭解，所有驗基大小或胺基酸大小，及所給 予核酸或多肽的所有分子量或分子質量值為近似值，其提 10 供係作為說明之用。 本文引用的各種文獻，其全部内容均併入本文以資參 考。 [圖式簡單說明] 第 1 圖··編碼 GAVE6 之 DNA 序列（SEQ ID N0:1)。 15 第2圖：GAVE6之胺基酸序列（SEQ ID N0:2)。 第3圖：GAVE6胺基酸序列（SEQ ID N0:2)與HM74及 GPR31胺基酸序列（分別為SEQIDNO:3及SEQIDNO:4) 之比較。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 第4圖：多種組織中GAVE6轉錄之北方墨點。 20第5圖：於人類器官/組織組中各種組織之GAVE6表現性 質。 -113- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200307688

USAV20010054SQLT 序列表 <110> Eishingdrelo, Haifeng Cai, Jidong <120> 编碼G-蛋白質-偶聯之受逋的核酸及其用途 <130> USAV2001/0054 <140> 未指定 <141> 2002-01-23 <160> 11 <170> Patentln 版本 3.0 <210> 1 <211> 1155 <212> DNA <213> 人類 <400> 1 atggaacttc ataacctgag ctctccatct ccctctctct cctcctctgt tctccctccc 60 tccttctctc cctcaccctc ctctgctccc tctgccttta ccactgtggg ggggtcctct 120 ggagggccct gccaccccac ctcttcctcg ctggtgtctg ccttcctggc accaatcctg 180 gccctggagt ttgtcctggg cctggtgggg aacagtttgg ccctcttcat cttctgcatc 240 cacacgcggc cctggacctc caacacggtg ttcctggtca gcctggtggc cgctgacttc 300 ctcctgatca gcaacctgcc cctccgcgtg gactactacc tcctccatga gacctggcgc 360 tttggggctg ctgcctgcaa agtcaacctc ttcatgctgt ccaccaaccg cacggccagc 420 gttgtcttcc tcacagccat cgcactcaac cgctacctga aggtggtgca gccccaccac 480 gtgctgagcc gtgcttccgt gggggcagct gcccgggtgg ccgggggact ctgggtgggc 540 atcctgctcc tcaacgggca cctgctcctg agcaccttct ccggcccctc ctgcctcagc 600 tacagggtgg gcacgaagcc ctcggcctcg ctccgctggc accaggcact gtacctgctg 660 gagttcttcc tgccactggc gctcatcctc tttgctattg tgagcattgg gctcaccatc 720 cggaaccgtg gtctgggcgg gcaggcaggc ccgcagaggg ccatgcgtgt gctggccatg 780 gtggtggccg tctacaccat ctgcttcttg cccagcatca tctttggcat ggcttccatg 840 gtggctttct ggctgtccgc ctgccgatcc ctggacctct gcacacagct cttccatggc 900 tccctggcct tcacctacct caacagtgtc ctggaccccg tgctctactg cttctctagc 960 cccaacttcc tccaccagag ccgggccttg ctgggcctca cgcggggccg gcagggccca 1020 gtgagcgacg agagctccta ccaaccctcc aggcagtggc gctaccggga ggcctctagg 1080 玫aggcggagg ccat在gggaa gctgaaagtg cegggcgagg tctctctgga aaiaggaaggc 1140 tcctcccagg gctga 1155 -114· 200307688 <210> 2 <211> 384 <212> PRT <213> 人類

USAV20010054SQLT <400> 2

Met Glu Leu His Asn Leu Ser Ser Pro 1 5

Ser Pro Ser Leu Ser Ser Ser 10 15

Val Leu Pro Pro Ser Phe Ser Pro Ser 20 25

Pro Ser Ser Ala Pro Ser Ala 30

Phe Thr Thr Val Gly Gly Ser Ser Gly Gly Pro Cys His Pro Thr Ser 35 40 45 Ser Ser Leu Val Ser Ala Phe Leu Ala Pro lie Leu Ala Leu Glu Phe 50 55 60 Val Leu Gly Leu Val Gly Asn Ser Leu Ala Leu Phe lie Phe Cys lie 65 70 75 80

His Thr Arg Pro Trp Thr Ser Asn Thr Val Phe Leu Val Ser Leu Val 85 90 95

Ala Ala Asp Phe Leu Leu lie Ser Asn Leu Pro Leu Arg Val Asp Tyr 100 105 110

Tyr Leu Leu His Glu Thr Trp Arg Phe Gly Ala Ala Ala Cys Lys Val 115 120 125 Asn Leu Phe Met Leu Ser Thr Asn Arg Thr Ala Ser Val Val Phe Leu 130 135 140 Thr Ala lie Ala Leu Asn Arg Tyr Leu Lys Val Val Gin Pro His His 145 150 155 160 Val Leu Ser Arg Ala Ser Val Gly Ala Ala Ala Arg Val Ala Gly Gly 165 170 175 Leu Trp Val Gly lie Leu beu Leu Asn Gly His Leu Leu Leu Ser Thr 180 185 190 Phe Ser Gly Pro Ser Cys Leu Ser Tyr Arg Val Gly Thr Lys Pro Ser 195 200 205 Ala Ser Leu Arg Trp His Gin Ala Leu Tyr Leu Leu Glu Phe Phe Leu 210 215 220 Pro Leu Ala I«eu lie lieu Phe Ala lie A/al Ser lie Gly Thr lie 225 230 235 240 Arg Asn Arg Gly Leu Gly Gly Gin Ala Gly Pro Gin Arg Ala Met Arg 245 250 255 Val Leu Ala Met Val Val Ala Val Tyr Thr lie Cys Phe Leu Pro Ser 260 265 270 lie He Phe Gly Met Ala Ser Met Val Ala Phe Trp Leu Ser Ala Cys 275 280 285 Arg Ser Leu Asp Leu Cys Thr Gin Leu Phe His Gly Ser I^u Ala Phe 290 295 300

•115- 200307688

USAV20010054SQLT

Thr Tyr Leu Asn Ser Val Leu Asp Pro Val Leu Tyr Cys Phe Ser Ser 305 310 315 320

Pro Asn Phe Leu His Gin Ser Arg Ala Leu Leu Gly Leu Thr Arg Gly 325 330 335

Arg Gin Gly Pro Val Ser Asp Glu Ser Ser Tyr Gin Pro Ser Arg Gin 340 345 350

Trp Arg Tyr Arg Glu Ala Ser Arg Lys Ala Glu Ala lie Gly Lys Leu 355 360 365

Lys Val Gin Gly Glu Val Ser Leu Glu Lys Glu Gly Ser Ser Gin Gly 370 375 380 <210> 3 <211> 387 <212> PRT <213> 人類 <400> 3

Met Asn Arg His His Leu Gin Asp His Phe Leu Glu lie Asp Lys Lys 15 10 15

Asn Cys Cys Val Phe Arg Asp Asp Phe lie Ala Lys Val Leu Pro Pro 20 25 30

Val Leu Gly Leu Glu Phe lie Phe Gly Leu Leu Gly Asn Gly Leu Ala 35 40 45

Leu Trp lie Phe Cys Phe His Leu Lys Ser Trp Lys Ser Ser Arg lie 50 55 60

Phe Leu Phe Asn Leu Ala Val Ala Asp Phe Leu Leu lie lie Cys Leu 65 70 75 80

Pro Phe Val Met Asp Tyr Tyr Val Arg Arg Ser Asp Trp Asn Phe Gly 85 90 95

Asp He Pro Cys Arg Leu Val Leu Phe Met Phe Ala Met Asn Arg Gin 100 105 110

Gly Ser lie lie Phe Leu Thr Val Val Ala Val Asp Arg Tyr Phe Arg 115 120 125

Val Val His Pro His His Ala Leu Asn Lys lie Ser Asn Trp Thr Ala 130 135 140

Ala lie lie Ser Cys Leu Leu Trp Gly lie Thr Val Gly Leu Thr Val 145 150 155 160

His Leu Leu Lys Lys Lys Leu Leu lie Gin Asn Gly Pro Ala Asn Val 165 170 175

Cys He Ser Phe Ser He Cys His Thr Phe Arg Trp His Glu Ala Met 180 185 190

Phe Leu Leu Glu Phe Leu Leu Pro Leu Gly lie lie Leu Phe Cys Ser 195 200 205

Ala Arg lie lie Trp Ser Leu Arg Gin Arg Gin Met Asp Arg His Ala -116- 200307688 210 USAV2 001Q054SQLT 215 220

Lys lie Lys Arg Ala 225 Val lie Cys Phe Leu 245 Leu Leu His Thr Ser 260

He Thr Phe He Met Val Val Ala He Val Phe 230 235 240

Pro Ser Val Val Val Arg lie Arg lie Phe Trp 250 255

Gly Thr Gin Asn Cys Glu Val Tyr Arg Ser Val 265 270

Asp Leu Ala Phe Phe 275 Leu Asp Pro Val Val 290 Phe Ser Thr Leu lie 305 Pro Asp Asn Asn Arg 325 Lys Thr Arg Gly Ala 340 Trp Ser Pro Ser 1 355 Gly His Cys His Gin 370 Cys lie Glu 385 lie Thr Leu Ser Phe Thr Tyr Met Asn Ser Met 280 285

Tyr

Tyr 295

Phe Ser Ser Pro Ser Phe Pro Asn Phe 300

Asn Arg Cys Leu Gin Arg Lys Met Thr Gly Glu 310 315 320 Ser Thr Ser Val Glu Leu Thr Gly Asp Pro Asn 330 335 Pro Glu Ala Leu Met Ala Asn Ser Gly Glu Pro 345 350 Leu Gly Pro Thr Ser Asn Asn His Ser Lys Lys 360 365 Glu Pro Ala Ser Leu Glu Lys Gin Leu Gly Cys 375 380 <210> sRTf 3 p人 <211> <212> <213> <400> 4

Met Pro Phe Pro Asn Cys Ser Ala Pro Ser Thr Val Val Ala Thr Ala 15 10 15

Val Gly Val Leu Leu Gly Leu Glu Cys Gly Leu Gly Leu Leu Gly Asn 20 25 30

Ala Val Ala Leu Trp Thr Phe Leu Phe Arg Val Arg Val Trp Lys Pro 35 40 45

Tyr Ala Val Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Leu Ala Asp Leu Leu Leu Ala 50 55 60

Ala Cys Leu Pro Phe Leu Ala Ala Phe Tyr Leu Ser Leu Gin Ala Trp 65 70 75 80

His Leu Gly Arg Val Gly Cys Trp Ala Leu Arg Phe Leu Leu Asp Leu 85 90 95

Ser Arg Ser Val Gly Met Ala Phe Leu Ala Ala Val Ala Leu Asp Arg 100 105 110 117- 200307688

USAV2 0010054SQLT

Tyr Leu Arg Val Val His Pro Arg Leu Lys Val Asn Leu Leu Ser Pro 115 120 125

Gin Ala Ala Leu Gly Val Ser Gly Leu Val Trp Leu Leu Met Val Ala 130 135 140

Leu Thr Cys Pro Gly Leu Leu lie Ser Glu Ala Ala Gin Asn Ser Thr 145 150 155 160

Arg Cys His Ser Phe Tyr Ser Arg Ala Asp Gly Ser Phe Ser lie lie 165 170 175

Trp Gin Glu Ala Leu Ser Cys Leu Gin Phe Val Leu Pro Phe Gly Leu 180 185 190 lie Val Phe Cys Asn Ala Gly lie lie Arg Ala Leu Gin Lys Arg Leu 195 200 205

Arg Glu Pro Glu Lys Gin Pro Lys Leu Gin Arg Ala Gin Ala Leu Val 210 215 220

Thr Leu Val Val Val Leu Phe Ala Leu Cys Phe Leu Pro Gys Phe Leu 225 230 235 240

Ala Arg Val Leu Met His lie Phe Gin Asn Leu Gly Ser Cys Arg Ala 245 250 255

Leu Cys Ala Val Ala His Thr Ser Asp Val Thr Gly Ser Leu Thr Tyr 260 265 270

Leu His Ser Val Val Asn Pro Val Val Tyr Cys Phe Ser Ser Pro Thr 275 280 285

Phe Arg Ser Ser Tyr Arg Arg Val Phe His Thr Leu Arg Gly Lys Gly 290 295 300

Gin Ala Ala 305 Glu Pro Pro Asp Phe Asn 310 Pro Arg Asp Ser 1¾ 315 rr Ser <210> <211> <212> <213> 5 24 DNA 人工 <220> <223> 引子 <400> 5 cagcccatgg aacttcataa cctg

24 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> 引子 <400> 6 ctggccctca gccctgggag gag 23 -118- 200307688

USAV20010054SQLT <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> 引子 <400> 7 gctgcctgca aagtcaacct <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> 引子 <400> 8 tggctgtgag gaagacaa <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> 探針 <400> 9 ccaccaaccg cacggcaa <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> 引子 <400> 10 ctcctgatca gcaacct <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> 引子 <400> 11 ttggtggaca gcatgaagag -119-

Claims (1)

1. 200307688 8 8 8 A B c D 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 六、申請專利範圍 1· 一種單離之核酸分子，其包括第i圖之DNA序列 (SEQ ID ΝΟ:1) 〇 2· —種單離之核酸分子，其於嚴苛雜交條件下，可與根 據申請專利範圍第1項之單離核酸分子，或與根據申 請專利範圍第1項之單離核酸分子互補的雜交探針雜 交。 3·根據申請專利範圍第〗或2項之單離核酸分子，其編 碼具有第2圖的胺基酸序列（SEQIDNO:2)之多肽。 4.根據申請專利範圍第2項之單離核酸分子，其編碼具 有與SEQ ID N0:2之該胺基酸序列至少30%相同的胺 基酸序列之多肽。 5·根據申請專利範圍第1或2項之單離核酸分子，其係 可檢測地予以標記。 6.根據申請專利範圍第5項之可檢測標記之單離核酸分 子’其中該可檢測標記包括酵素、放射性同位素、或 發螢光之化學劑。 7· 一種單離之多肽，其包括第2圖之胺基酸序列（seq ro NO:2) 〇 8· —種單離之核酸分子，其編碼根據申請專利範圍第7 20 項之該純化多肽。 9·根據申請專利範圍帛7項之純化多狀，其係可檢測地 予以標記。 10·根據申請專利範圍第9項之純化多肽，其中該可檢測 標記包括酵素、放射性同位素、或發螢光之化學劑。 5 10 15 、-------------- 丄 本紙張尺㈣財關

   ti 200307688 Α8 Β8 C8 D8 六、申請專利範圍 1L 一種抗體，其具有根據申請專利範圍帛7項之純化多 狀為免疫原。 12·根據巾晴專利範圍第u項之抗體，其中該抗體係選 自包括單株抗體、多株抗體、絲合型抗體之組群。 5 據申請專圍第u項之抗體，其係可檢測地予 以標記。 14·:根據中晴專利顧第13項之抗體，其中該可檢測標 記包括酵素、放射性同位素、或發螢光之化學劑。 種表現載體’其包括起作用地結合表現控制元件之 10根據申請專利範圍第1項之單離核酸分子。 種表現載體’其包括起作用地結合表現控制元件之 根據申請專利範圍第2項之單離核酸分子。 17·根據申請專利範圍帛15或16項之表現載體 ，其中該 表現控制元件係選自包括組成性調控序列 、細胞專一 15 性調控序列、及料性馳序列之組群。 18·根據申請專利範圍第17項之表現載體，其中該表現 控制元件為啟動子。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 19·根據申請專利範圍第18項之表現載體，其中該啟動 子包括hCMV之極早期啟動子、SV40之早期啟動 20 早 、線病毒之早期啟動子、疫苗之早期啟動子、多瘤 之早期啟動子、SV40之晚期啟動子、腺病毒之晚期啟 動子、疫苗之晚期啟動子、多瘤之晚期啟動子、/^c 系、冲系、7L4C系、系、噬菌體lambda之主要 操縱基因及啟動子區域、fd外殼蛋白之控制區域、3_ ____ -121- _ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（2ΐ〇χ297公爱） 8 8 〇〇 ABC D 200307688 六、申請專利範圍 磷酸甘油酸激酶啟動子、酸性磷酸酶啟動子、或酵母 α交配因子之啟動子。 20· —種宿主細胞，其係以根據申請專利範圍第15或16 項之表現載體轉形或轉染。 5 21·根據申請專利範圍第2〇項之宿主細胞，其中該宿主 細胞包括原核生物細胞或真核生物細胞。 22·根據申請專利範圍第21項之宿主細胞，其中該宿主 細胞包括大腸桿菌、假單胞菌、桿菌、鏈球菌、酵 母、CHO、Ri.i、B-W、L μ、C0S1、c〇S7、 10 BSC1、BSC4〇、BMT10 或 Sf9 細胞。 23· —種製造根據申請專利範圍第7項之單離多肽之方 法，該方法包括下述步驟： a)於提供表現該分離多肽的條件下，培養根據申請專 利範圍第21項之宿主細胞；及 15 b)自該宿主、該培養液、或其組合物中回收該單離多 肽。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 24. —種醫藥組成物，係用於對需要治療的病患投與 GAVE6之致效劑、抬抗劑或反致效劑，以調節 GAVE6傳訊活性或訊息轉導。 2〇 25· —種鐘定QAVE6致效劑之方法，包括：使潛在致效 劑與表現GAVE6的細胞接觸，並測定相對於該潛在 致效劑不存在下之GAVE6活性，該潛在致效劑存在 下之GAVE6傳訊活性是否增加。 26· —種鑑定GAVE6反致效劑之方法，包括：使潛在反 _____-122- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） A8B8C8D8 200307688 六、申請專利範圍 致效劑與表現GAVE6的細胞接觸，並測定相對於該 潛在反致效劑不存在下之GAVE6活性，該潛在反致 效劑存在下之GAVE6活性是否降低，及於内源配位 體或致效劑存在下是否降低。 5 27· —種鑑定GAVE6拮抗劑之方法，包括：使潛在拮抗 劑與表現GAVE6的細胞接觸，並測定相對於内源配 位體或致效劑存在下之GAVE6活性，該潛在拮抗劑 存在下之GAVE6傳訊活性是否降低。 28· —種治療組成物，其包括能調節GAVE6傳訊活性或 1〇 轉導的GAVE6之致效劑、拮抗劑或反致效劑。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 適 度 尺 張 紙 本 準 標 家 祕 23 釐 公 97