DE69838784T2

DE69838784T2 - Säureempfindlicher neuronaler säugetierkationenkanal, dessen klonierung und anwendung

Info

Publication number: DE69838784T2
Application number: DE69838784T
Authority: DE
Inventors: Rainer Waldmann; Frederic Bassilana; Michel Lazdunski; Guy Champigny; Catherine Heurteaux; Eric Lingueglia
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1997-02-11
Filing date: 1998-02-11
Publication date: 2009-02-26
Anticipated expiration: 2018-02-12
Also published as: JP4129062B2; JP2001514487A; FR2759373B1; DE69838784D1; ES2297880T3; CA2281792A1; EP0977844B1; WO1998035034A1; FR2759373A1; EP0977844A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Familie vor allem humaner aziditätssensibler Säugetier-Ionenkanäle. Sie betrifft insbesondere die Identifizierung und die molekulare Charakterisierung eines neuen, von den Protonen aktivierten Kationenkanals beim Menschen und der Ratte, unter Bezugnahme auf die englischen Begriffe „Acid Sensing Ionic Channel" nachfolgend „ASIC" genannt. Der ASIC-Kanal bildet das erste Mitglied einer Gruppe von Kationenkanälen, die zu der Familie der auf Amilorid sensiblen Degenerin-Natriumkanäle (6, 11–14) gehören, das transitorisch durch eine extrazelluläre Säuerung aktiviert wird.
Die Säuresensibilität ist sowohl mit der Nozizeption (1) und der Transduktion des Geschmacks (2) verbunden. Die Stimulation der sensorischen Neuronen durch Säuren hat eine große Bedeutung, da die Azidität zahlreiche schmerzhafte entzündliche und ischämische Situationen begleitet. Der von den Säuren verursachte Schmerz wird als von den Kationenkanälen mediiert interpretiert, die auf Ebene der sensorischen Neuronen vorhanden sind und die von den Protonen (3–5) aktiviert werden. Die biophysikalischen und pharmakologischen Eigenschaften der ASIC-Kanäle der Erfindung ähneln denen der protonenaktivierten, in den sensorischen Neuronen beschriebenen Kationenkanäle (3, 15, 16). Allerdings wurden bis heute noch nie Ionenkanäle beschrieben, die von einem einfacheren Liganden als den ASIC-Kanälen aktiviert wurden, wie aus der nachfolgenden Beschreibung zu entnehmen sein wird.
Die vorliegende Erfindung hat demzufolge ein Protein zum Gegenstand, das einen auf Amilorid sensiblen und von den Protonen aktivierten neuronalen Kationenkanal bildet, dessen Aminosäuresequenz in der Sequenzliste in der Anlage unter der Nummer SEQ ID Nr. 1 oder unter der Nummer SEQ ID Nr. 2 dargestellt ist, und das etwa mit dem Protein des ASIC-Kanals der Ratte, mit ASIC1A bezeichnet, identisch ist, das in der Sequenzliste in der Anlage unter der Nummer SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist.
Ein anderes Beispiel ist das Protein, das einen Degenerin-Kationenkanal bildet, „MDEG" (14) oder „BnaC1" (20) genannt, oder nachfolgend ebenfalls als „ASIC2A" oder „MDEG1" bezeichnet, dessen Aminosäuresequenz in der Sequenzliste in der Anlage unter der Nummer SEQ ID Nr. 3 dargestellt ist. MDEG ist als ein auf Amilorid sensibler Säugetier-Kationenkanal beschrieben worden, der durch Mutationen aktiviert wird, die für Neurodegeneration mit Degenerinen von C. elegans verantwortlich sind. Der MDEG-Kanal ist strukturell mit dem ASIC-Kanal verwandt, dessen Aminosäuresequenz zirka 67% Übereinstimmung mit der Sequenz des MDEG-Ionenkanals aufweist. Allerdings sind die elektrophysiologischen Eigenschaften dieser zwei Kanäle unterschiedlich, da sie nicht von denselben pH-Änderungen aktiviert werden. So unterscheidet sich der Sensibilitätsbereich von MDEG (EC50 = 4,05) von dem von ASIC (EC50 = 6,2).
Es wurde nachgewiesen, dass der MDEG-Kanal von denselben Mutationen aktiviert wird wie von denjenigen, die eine neuronale Degeneration bei C. elegans verursachen. So sind die aktiven Mutanten von MDEG, ebenso wie die hyperaktiven Degenerin-Mutanten von C. elegans, für ein Absterben der Zellen verantwortlich, was darauf hinweist, dass der Funktionserwerb durch diesen neuronalen Ionenkanal bei mehreren Formen der neuronalen Degeneration bei Säugetieren und vor allem beim Menschen impliziert ist. Allerdings war bis zur Beschreibung seiner Aktivierung durch die Protonen gemäß den Kationenkanälen der vorliegenden Erfindung keine physiologisch normale Funktion von MDEG bekannt.
Andere Beispiele für Proteine, die einen auf Amilorid sensiblen und von den Protonen aktivierten neuronalen Kationenkanal bilden, werden nachfolgend gegeben:

– Ein mit ASIC1B bezeichneter Kanal, dessen aus 559 Aminosäuren bestehende Sequenz in der Sequenzliste unter der Nummer SEQ ID Nr. 4 dargestellt ist. ASIC1B ist eine Splicing-Variante des aus Rattenhirn durch degenerierte PCR geklonten ASIC1A-Kanals. Die ersten 185 Säuren werden durch eine neue Sequenz aus 218 Aminosäuren ersetzt, die in der SEQ ID Nr. 4 unterstrichen ist.
– Ein mit DRASIC bezeichneter Kanal, dessen aus 533 Aminosäuren bestehende Sequenz in der Sequenzliste unter der Nummer SEQ ID Nr. 5 dargestellt ist. DRASIC wurde aus sensorischen Rattenneuronen unter Verwendung einer Teilsequenz in den Datenbanken geklont („Expressed Sequence Tag” mit der Erwerbsnummer W62694). Die Eigenschaften von DRASIC sind folgende:
– Er ist in den sensorischen Neuronen exprimiert, aber nicht im Gehirn.
– Seine Expression in Oozyten von Krallenfröschen oder in Zellen von Säugetieren erlaubt, einen protonenaktivierten Natriumstrom zu ermitteln, der zwei Komponenten aufweist: eine Komponente, die sich schnell aktiviert und deaktiviert, und eine Komponente, die sich langsam aktiviert und nicht deaktiviert. Die zwei Komponenten sind für Na⁺ selektiv. Ein protonenaktivierter Kationenkanal, der sich nicht deaktiviert, war an der längeren Schmerzwahrnehmung beteiligt, die von einer Azidose hervorgerufen wurde.

Die Erfindung betrifft ebenfalls einen Hybrid-Kationenkanal, der von der Verbindung eines ersten Proteins, das einen erfindungsgemäßen Ionenkanal bildet, der von den Protonen aktiviert ist oder nicht, mit einem zweiten Protein gebildet wird, das einen von den Protonen aktivierten Ionenkanal bildet. Das besagte zweite Protein ist in vorteilhafter Weise ebenfalls ein Protein, das einen erfindungsgemäßen, von den Protonen aktivierten Ionenkanal bildet. Als Beispiel für eine derartige Verbindung wäre die Verbindung des Proteins des Kanals ASIC1A oder ASIC2A oder DRASIC mit dem Protein des Kanals MDEG1 zu nennen, wodurch die Bildung eines Hybridkanals möglich wird, der einen dritten Bereich der pH-Sensibilität aufweist (mit ASIC: EC50 – 4,8). Ein anderes Beispiel für einen derartigen Hybridkanal ist die Verbindung des Proteins der Kanäle ASIC1A, ASIC1B, MEDG1 oder DRASIC mit dem Protein des Kanals MDEG2.
MDEG2 ist ein Kanal, der aus Rattenhirn bei Verwendung einer Teilsequenz der Maus geklont wurde, die in den Datenbanken verfügbar ist („Expressed Sequence Tag" mit der Erwerbsnummer W50528) und dessen Sequenz aus 563 Aminosäuren in der Sequenzliste in der Anlage unter der Nummer SEQ ID Nr. 6 dargestellt ist.
MDEG2 ist eine Splicing-Variante von MDEG1. Die ersten 185 Aminosäuren werden durch eine neue Sequenz aus 236 Aminosäuren ersetzt, die in der SEQ ID Nr. 6 unterstrichen ist. MDEG2 ist im Gehirn und in den sensorischen Neuronen der Ganglien der Radix dorsalis exprimiert.
MDEG2, der nur in den Oozyten des Krallenfroschs oder in Säugetierzellen exprimiert ist, bildet keinen vom Proton aktivierten Kationenkanal. Allerdings kann er sich mit MDEG1 oder DRASIC verbinden, um heteromultimerische, vom Proton aktivierte Kanäle mit veränderten Eigenschaften zu bilden:

– Der Aktivierungs-pH des nach der Co-Expression von MDEG1 und MDEG2 gebildeten Kanals ist unterschiedlich. Nach Expression in den COS-Zellen hat der Strom seinen maximalen Wert bei pH 3 nicht erreicht, währenddessen der allein von MDEG1 induzierte Strom bei einem pH inklusive zwischen 4,5 und 4,0 sättigt.
– Die Deaktivierungskinetiken und die Ionen-Selektivität des nach der Co-Expression von MDEG1 und MDEG2 gebildeten Kanals unterscheiden sich deutlich von denen von MDEG1 allein. Es bildet sich ein Strom aus, der sich langsam deaktiviert und für Na+ und K+ wenig selektiv ist.
– Der stetige Natriumstrom, der nach der Expression von DRASIC entsteht, wird nicht selektiv (er differenziert nicht mehr zwischen Natrium und Kalium), wenn MDEG2 mit DRASIC co-exprimiert ist. Diese neue Eigenschaft ähnelt der des protonenaktivierten Kationenkanals, der an der längeren Schmerzwahrnehmung beteiligt war, die von einer Azidose hervorgerufen wurde. Es ist sehr wahrscheinlich, dass DRASIC und MDEG2 an diesem Kanal beteiligt sind.

Die Aminosäuresequenzhomologien der Proteine, die die Kanäle ASIC1A, ASIC1B bilden, die erfindungsgemäß genannt werden, sind in folgender Tabelle 1 wiedergegeben. Tabelle 1

Kanäle ASIC 1B ASIC IA MDEG2 MDEG1 DRASIC

ASIC1B 100 80 56 61 52

ASIC1A 100 59 68 53

MDEG2 100 78 48

MDEG1 100 51

DRASIC 100
Poly- oder monoklonale Antikörper, die gegen mindestens ein Protein gerichtet sind, das einen erfindungsgemäßen Ionenkanal ausbildet und/oder einen obigen Hybridkanal, können mit klassischen Methoden hergestellt werden, die in der Literatur beschrieben sind. Diese Antikörper dienen dazu, das Vorhandensein von erfindungsgemäßen Ionenkanälen in verschiedenen menschlichen oder tierischen Geweben festzustellen, können aber auch auf therapeutischem Gebiet angewendet werden, um dank ihrer Spezifizität einen ASIC-Kanal und/oder seine Derivate in vivo zu inhibieren oder zu aktivieren.
Die vorliegende Erfindung hat ebenfalls ein Nukleinsäuremolekül zum Gegenstand, das eine Nukleinsequenz umfasst oder davon gebildet wird, die für ein Protein kodiert, das einen auf Amilorid sensiblen und von den Protonen aktivierten neuronalen Kationenkanal bildet. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Nukleinsäuremolekül, das mindestens eine Sequenz umfasst, die für das den ASIC-Kanal bildende Protein kodiert, dessen Aminosäuresequenz in der Sequenzliste in der Anlage unter der Nummer SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist oder für ein Derivat, das zu diesem Protein funktional äquivalent ist. Ein DNA-Molekül, das die für das ASIC-Protein kodierende Sequenz umfasst, ist dasjenige, das in der Sequenzliste in der Anlage unter der Nummer SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist, oder ihre komplementäre Sequenz. Ein anderes erfindungsgemäßes DNA-Molekül ist dasjenige, das in der Sequenzliste in der Anlage unter der Nummer SEQ ID Nr. 2 oder unter der Nummer SEQ ID Nr. 3 dargestellt ist, oder ihre komplementäre Sequenz.
Ein DNA-Molekül, das die für das ASIC1B-Protein kodierende Sequenz umfasst, ist das von 3647 pb, das in der Sequenzliste in der Anlage unter der Nummer SEQ ID Nr. 4 dargestellt ist, oder ihre komplementäre Sequenz. Insbesondere betrifft die Erfindung die Nukleinsequenz inklusive zwischen den Nukleotiden 109 und 1785 der Sequenz, die in der Sequenzliste in der Anlage unter der Nummer SEQ ID Nr. 4 dargestellt ist, oder ihre komplementäre Sequenz.
Ein DNA-Molekül, das für das DRASIC-Protein kodiert, ist das von 1602 pb, das in der Sequenzliste in der Anlage unter der Nummer SEQ ID Nr. 5 dargestellt ist, oder ihre komplementäre Sequenz.
Ein DNA-Molekül, das die für das Protein MDEG2 kodierende Sequenz umfasst, ist das von 1602 pb, das in der Sequenzliste in der Anlage unter der Nummer SEQ ID Nr. 6 dargestellt ist, oder ihre komplementäre Sequenz.
Die Erfindung betrifft ebenfalls einen Vektor, der mindestens ein vorangehendes Nukleinsäuremolekül umfasst, das vorzugsweise mit geeigneten Kontrollsequenzen verbunden ist, sowie ein Verfahren zur Herstellung oder Expression in einer Wirtszelle eines Proteins, das einen erfindungsgemäßen Ionenkanal bildet. Die Herstellung dieser Vektoren sowie die Produktion oder Expression der Kanäle der Erfindung in einem Wirt können durch Techniken der Molekularbiologie und Gentechnik durchgeführt werden, die dem Fachmann gut bekannt sind.
Beispielsweise besteht ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das einen erfindungsgemäßen Kationenkanal ausbildet, darin:

– ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül oder einen Vektor, der das besagte Molekül enthält, in eine Wirtszelle zu transferieren,
– die besagte Wirtszelle unter Bedingungen zu kultivieren, die die Produktion des Proteins erlauben, das den Kationenkanal bildet,
– die Proteine, die die erfindungsgemäßen Ionenkanäle bilden, mit allen geeigneten Mitteln zu isolieren.

Beispielsweise besteht ein Verfahren zur Expression eines erfindungsgemäßen Kationenkanals darin:

– ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül oder einen Vektor, der das besagte Molekül enthält, in eine Zelle zu transferieren,
– die besagte Wirtszelle unter Bedingungen zu kultivieren, die die Expression von erfindungsgemäßen Ionenkanälen erlauben.

Die in den vorangehenden Verfahren umgesetzte Wirtszelle kann aus den Prokaryoten oder den Eukaryoten und vor allem aus den Bakterien, den Hefen, den Säugetier-, Pflanzen- oder Insektenzellen ausgewählt sein.
Der verwendete Vektor ist in Abhängigkeit des Wirts ausgewählt, in den er transferiert wird, es kann sich um jeden Vektor wie ein Plasmid handeln.
Die Erfindung betrifft demzufolge auch die transformierten Zellen, die die ASIC-Kanäle und/oder ihre Derivate wie MDEG exprimieren, die gemäß den vorangehenden Verfahren hergestellt wurden. Diese Zellen sind für das Screening von Substanzen nützlich, die imstande sind, die Wahrnehmung des Säuregrads bzw. der Azidität zu modulieren, sowohl die Schmerzempfindung bzw. Nozizeption als auch die Transduktion des Geschmacks betreffend. Dieses Screening wird dadurch durchgeführt, dass variable Mengen einer zu testenden Substanz mit Zellen in Kontakt gebracht werden, die die ASIC-Kanäle exprimieren, wobei danach anhand aller geeigneten Mittel die eventuellen Wirkungen der besagten Substanz auf die Ströme der besagten Kanäle gemessen werden. Diese Studien werden ebenfalls von elektrophysiologischen Techniken erlaubt, die ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, sofern sie die ASIC-Kanäle oder ihre Derivate umsetzen. Mit diesen Screenings können neue Arzneimittel identifiziert werden, die für die Schmerzbehandlung oder -vorbeugung nützlich sind. Weiterhin erlauben sie, nach Wirkstoffen zu suchen, die den sauren Geschmack modulieren. Außerdem erlauben sie, Blocker zu suchen, die imstande sind, durch Hyperexpression dieser Kanäle hervorgerufene Neurodegenerationen zu inhibieren. Diese dank der oben genannten Verfahren isolierten und nachgewiesenen Arzneimittel sind ebenfalls Bestandteil der Erfindung. Die ASIC-Kanäle haben nämlich ionenselektive Eigenschaften, vor allem, was ihre selektive Natrium-, Kalium- und Kalziumpermeabilität betrifft, wodurch diese exzitotoxische Eigenschaften erwerben, wenn sie hyperstimuliert werden.
Ein Protein, das einen neuronalen ASIC-Ionenkanal bildet, kann auch für die Herstellung von Arzneimitteln nützlich sein, die dazu bestimmt sind, Pathologien zu behandeln oder vorzubeugen, die die schmerzhafte Wahrnehmung der Azidität implizieren, was bei entzündlichen Krankheiten, Ischämien und bei bestimmten Tumoren vorkommt. Die Erfindung betrifft damit auch die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die als Wirkstoffprinzip mindestens ein Protein umfassen, das einen erfindungsgemäßen Ionenkanal bildet.
Ein Nukleinsäuremolekül, das für ein Protein kodiert, das einen ASIC-Kanal oder ein Derivat desselben bildet, oder ein Vektor, der dieses Nukleinsäuremolekül umfasst oder auch eine Zelle, die ASIC-Kanäle exprimiert, sind ebenfalls für die Herstellung transgener Tiere nützlich. Es kann sich um Tiere handeln, die die besagten Kanäle überexprimieren, aber vor allem um „knock out" genannte Tiere, das heißt, denen es an diesen Kanälen ermangelt, wobei diese transgenen Tiere durch Methoden hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind, und erlauben, für das Studium von mit ASIC-Kanälen verbundenen Tierkrankheiten über lebende Modelle zu verfügen.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle oder die von dem besagten Molekül transformierten Zellen können demzufolge in Gentherapiestrategien verwendet werden, um ein Defizit an ASIC-Kanälen auf Ebene eines oder mehrerer Gewebe eines Patienten zu kompensieren. Die Erfindung betrifft demzufolge ebenfalls ein Arzneimittel, das erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle oder Zellen, die von den besagten Molekülen transformiert wurden, umfasst, für die Behandlung von Krankheiten, bei denen ASIC-Kanäle und ihre Derivate eine Rolle spielen.
Neben der Eigenschaft, von den Protonen aktiviert zu werden, und den oben genannten Anwendungen, die sich daraus auf dem Gebiet der Wahrnehmung der Azidität ergeben, ist der ASIC-Kanal aufgrund seiner strukturellen Verwandtschaft mit dem MDEG-Kanal imstande, sich nach einer Mutation wie ein neuronales Degenerin zu verhalten.
Das Absterben bestimmter Neuronen ist für verschiedene Typen neuronaler Degeneration wie die Alzheimer-, die Huntington-, die Parkinsonkrankheit, amyotrophe Lateralsklerose, die zerebellare Ataxie charakteristisch. Nur einige defiziente Gene sind bekannt, und viele sind noch zu identifizieren. Das einfache neuronale Netz des Fadenwurms C. elegans stellt ein gutes Modell für neuronale Entwicklung und Absterben dar. Die erbliche Degeneration bei C. elegans kann durch Mutationen der Degenerine deg-1, mec-4 und mec 10 verursacht sein. Die Übereinstimmungen mit den Untereinheiten des auf Amilorid sensiblen Natriumkanals, das Produkt der funktionalen Expression der Chimeren mec-4 des epithelialen Natriumkanals, deuten darauf hin, dass die Degenerine Ionenkanäle sind, deren Funktionserwerb der Grund für die neuronale Degeneration ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft damit auch die Anwendungen des ASIC-Kanals für das Studium dieser pathologischen Veränderungen, die imstande sind, zu Degenerationen zu führen. Die für diese Anwendungen umgesetzten Techniken, zum Beispiel für das Drogenscreening, ähneln den Techniken, die zuvor für die Suche nach geschmacksmodulierenden oder analgetischen Wirkstoffen beschrieben wurden.
Weiterhin können ein Protein, das einen neuronalen ASIC-Kanal bildet, ein Agonist oder ein Antagonist desselben ebenfalls für die Herstellung von Arzneimitteln nützlich sein, die bestimmt sind, Krankheiten zu behandeln oder vorzubeugen, die eine zerebrale neuronale Degeneration implizieren. Damit betrifft die Erfindung auch die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die als Wirkstoffprinzip mindestens eines dieser eventuell mit einem physiologisch akzeptablen Träger verbundenen Proteine umfassen.
Insbesondere betrifft die Erfindung eine chemische oder biologische Substanz, die in der Lage ist, die Ströme eines erfindungsgemäßen Ionenkanals und/oder eines Hybridkanals für die Zubereitung eines Arzneimittels zu modifizieren, das imstande ist, die Wahrnehmung der Azidität bei einem Menschen oder Tier sowohl im Hinblick auf die Nozizeption als auch die Transduktion des Geschmacks zu modulieren.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung, die sich auf die Forschungsarbeiten bezieht, die zur Herausarbeitung und Charakterisierung des ASIC-Kanals führten, wobei sich diese auf die Sequenzen und Zeichnungen in der Anlage bezieht, von denen:

– SEQ ID Nr. 1 die Sequenz von 526 Aminosäuren des Proteins des ASIC-Kanals darstellt, das aus der cDNA-Sequenz der Ratte abgeleitet wurde,
– SEQ ID Nr. 2 die Teilsequenz von 514 Aminosäuren des Proteins des ASIC-Kanals darstellt, das aus der Teilsequenz humaner cDNA abgeleitet wurde,
– SEQ ID Nr. 3 die Sequenz von 512 Aminosäuren des Proteins des MDEG-Kanals darstellt, das aus der Sequenz humaner cDNA abgeleitet wurde,
– SEQ ID Nr. 4 die Sequenz von 559 Aminosäuren des Proteins des ASIC1B-Kanals sowie die Sequenz eines DNA-Moleküls darstellt, das die für dieses Protein kodierende Sequenz umfasst,
– SEQ ID Nr. 5 die Sequenz von 533 Aminosäuren des Proteins des DRASIC-Kanals und die für dieses Protein kodierende DNA-Sequenz darstellt,
– SEQ ID Nr. 6 die Sequenz von 563 Aminosäuren des Proteins des MDEG2-Kanals sowie die Sequenz eines DNA-Moleküls darstellt, das die für dieses Protein kodierende Sequenz umfasst.

Die 1 stellt das Alignment der Sequenzen der ASIC-Proteine der Ratte (oben) und des Menschen (unten) der Sequenzen SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 dar. Bei einem Vergleich dieser Sequenzen fällt das Fehlen von 14 Aminosäuren zu Beginn der humanen kodierenden Phase im Vergleich zur Rattenphase auf.
Die 2 stellt den Vergleich der Sequenz des Proteins des ASIC-Kanals mit der Sequenz anderer Ionenkanäle dar:

– MDEG (14), ein Säugetier-Kationenkanal, der von Mutationen aktiviert ist, die für Neurodegenerationen mit den Degenerinen von C. elegans verantwortlich sind,
– FaNaCh (10), ein Peptid eines Natriumkanals von Helix aspersa, der von FMRFamid aktiviert ist,
– das Degenerin MEC-4 (12) von C. elegans.

Auf dieser Figur sind die Reste, die mit ASIC-Resten identisch oder ähnlich sind, jeweils in Weiß auf schwarzem Untergrund und in Schwarz auf grauem Untergrund gedruckt. Die vermutlichen Transmembran-Regionen (MI, MII) von ASIC sind durch schwarze Balken gekennzeichnet.
Die 3 veranschaulicht den phylogenetischen Baum der Proteine der Untereinheiten αNaCh, βNaCh, γCh, δNaCh des auf Amilorid sensiblen Natriumkanals und der Degenerine MEC-4, MEC-10 und DEG-1 von C. elegans.
Die 4 veranschaulicht die Topologie, die für diese letzte Ionenkanal-Familie vorgeschlagen ist (30).
Die 5 veranschaulicht die biophysikalischen Eigenschaften des protonenaktivierten Kanals ASIC1.

– bei a: die eingehenden makroskopischen Ströme, ermittelt bei –70 mV nach schnellen pH-Änderungen von pH 7,4 auf pH 6.
– bei b: die Dosis-Antwort-Kurve des extrazellulären pH. Der ursprüngliche pH war 7,4, und die schwarzen Punkte stellen die Mittelwerte von sechs Versuchen dar. Der Einschub auf dieser Figur zeigt die typischen Antworten bei –70 mV.
– bei c: die Beziehungen Q-V der „Outside-out"-Patche mit 140 mM Na+(∎) oder Li⁺(•) in der Lösung des Bades. Q ist die während der Transition des sauren pH transportierte Last. Der Einschub auf dieser Figur zeigt die typischen Antworten in einem Milieu, das Na⁺ enthält.
– bei d: die von den Protonen H⁺ aktivierten Ströme, die bei verschiedenen Spannungen in einem „Outside-out"-Patch in einem Milieu ermittelt wurden, das Na⁺ enthält.
– bei e: die durchschnittlichen Beziehungen i-V, gemessen anhand des „Outside-out"-Patches mit 140 mM Na+(∎), 140 mM Li⁺(•) oder 1,8 mM Ca2⁺ ( ), als permeable Ionen mehrheitlich in den externen Lösungen, wobei die Inversionsspannungen jeweils 65 mV, 58 mV und –34 mV betrugen.
– bei f: der Protonenstrom durch den Kanal ASIC1.

Die Beziehungen zwischen dem Kurvenmaximum und der Spannungshöhe wurden anhand von „Outside-out"-Patch in einer Lösung mit freiem Na⁺, freiem Ca2⁺ mit Pipetten, die eine Lösung von freiem K⁺ mit pH 4 (•) und pH 3 (∎) enthielten, gemessen. ( ) stellen die Ergebnisse dar, die unter denselben Bedingungen wie (∎) ermittelt wurden, aber mit KCl in der Pipette. Der Einschub auf dieser Figur zeigt die typischen Antworten, die unter den Bedingungen ( ) ermittelt wurden.
Die 6 zeigt die Wirkung von Ca2⁺ und von Amilorid auf den ASIC-Strom.

– bei a: die von den H⁺-Protonen aktivierten Ströme, die bei verschiedenen Membranspannungen anhand eines Outside-out-Patches mit 1,8 mM Ca²⁺ in einer Lösung von freiem Na⁺ ermittelt wurden, wobei sich die Ströme bei –35 mV umkehrten.
– bei b: die durchschnittlichen Beziehungen Q-V anhand eines Outside-out-Patches, ermittelt in Lösungen freien Na⁺, die 1,8 mM Ca²⁺ (o, Umkehrspannung –34 mV) oder 0,1 mM Ca²⁺ (•, Umkehrspannung –80 mV) enthielten.
– bei c: die Wirkung des externen Ca²⁺ auf das makroskopische Maximum des eintretenden Stroms, ermittelt bei –70 mV und aktiviert durch einen schnellen pH-Wechsel von pH 7,4 auf pH 6. Der Einschub auf dieser Figur veranschaulicht die typischen Antworten. Die Punkte veranschaulichen die Mittelwerte ± se von fünf Oozyten.
– bei d: die Wirkung des Amilorids auf die von den H⁺-Protonen aktivierten Ströme, ermittelt bei 0 mV anhand eines Outside-out-Patches.
– bei e: die Inhibition des makroskopischen Stroms (induziert durch eine Veränderung des pH von pH 7,4 auf pH 6) bei –70 mV durch das Amilorid und Derivate. Die Punkte veranschaulichen die Mittelwerte ± se von fünf Oozyten.

Die 7 veranschaulicht die Verteilung im Gewebe von mRNA des ASIC-Kanals.

– bei a: die Northern Blot-Analyse der mRNA-Expression des ASIC-Kanals in humanen Geweben.
– bei b: die RT-PCR-Analyse der mRNA-Expression des ASIC-Kanals im Gehirn der Ratte und im Ganglion der Radix dorsalis (DRG). (+), (–) veranschaulichen jeweils Proben mit oder ohne Umkehrtranskriptase. Abschnitte eines Agarosegels, ermittelt mit Ethidiumbromid 1%. Die Pfeile zeigen die erwartete Größe (657 pb) des PCR-Produkts an.

Die 8 veranschaulicht die in situ-Hybridisierung.

– bei a und b: die Hybridisierung von Abschnitten 6 im eines Ganglions der Radix dorsalis einer drei Monate alten Ratte mit der Sonde E, markiert mit Digoxigenin. bei a: eine Mikrofotografie bei geringer Lichtstärke (30fache Vergrößerung). bei b: ein hochauflösendes Bild (80fache Vergrößerung) von a. Bemerkenswert ist die intensivere Markierung der Neuronen mit kleinem Durchmesser (Pfeile). Ähnliche Ergebnisse wurden ebenfalls mit den Sonden A, C und D erzielt.
– bei c: die Verteilung der mRNA des ASICK-Kanals im Gehirn einer erwachsenen Ratte, analysiert durch in situ-Hybridisierung mit dem Antisense-Oligonukleotid C. Identische Ergebnisse wurden mit dem Oligonukleotid B erzielt. Die Farben veranschaulichen die Häufung (Rot: hohe Ausprägung, Blau: nicht nachweisbar). Die auf der Figur verwendeten Abkürzungen sind folgende: Cer = Cerebellum; Hip = Hippokampus; OB = Bulbus olfaktorius; Cx = Cortex.

I – Materialien und Methoden
1) Klonierung des ASIC-Kanals
Die aus der Familie der ASIC-Ionenkanäle konservierten Sequenzen wurden verwendet, um PCR-Primer folgender Sequenzen herzustellen:
Eine cDNA-Bank Rattenhirn (Stratagène #936515) wurde mit dem PCR-Produkt von 1 kB Ratenhirn hybridisiert, die Teilklone wurden isoliert. Das 5'-Ende der DNA (202 bp) wurde nach einer für die Doppelstrang-cDNA geeignete Ligation durch PCR isoliert.
2) Elektrophysiologie
0,25 ng cRNA wurde in Oozyten von Xenopus laevis injiziert, die Mikroelektroden zur Aufzeichnung der festgesetzten Spannungshöhe und für das Patch-Clamp wurden zwei Tage nach der Injektion angebracht. Die Lösungen der Bäder für die Outside-out-Patch-Aufzeichnungen und die Pipetten für die Outside-out-Patch-Aufzeichnungen und der Zellen insgesamt enthielten 140 mM KCl (oder NMDG), 2 mM MgCl₂, 5 mM EGTA, 10 mM Hepes, pH 7,4 (mit KOH). Die Pipetten für die Outside-out-Patch-Aufzeichnungen und die Lösungen der Bäder für die Outside-out-Patch-Aufzeichnungen und der Zellen insgesamt enthielten 140 mM NaCl (oder LiCl oder NMDGC1), 2 mM MgCl₂, 1,8 mM CaCl₂, 10 mM Hepes, pH 7,4 (justiert mit HCl, NaOH, LiOH oder TMAOH). Durch Perfusion mit einer auf die in den Figuren genannten pH-Werte justierten Badlösung wurden vom Ausgangs-pH aus schnelle pH-Wechsel erzielt. Die intrazellulare Säuerung der Oozyten wurde durch Injektion von 50 nl der internen Lösung mit pH2 oder durch Perfusion und Rückzug aus einem Badmilieu mit 20 mM NH₄Cl durchgeführt. Von den aufgezeichneten Strömen ist kein Strom durch den auf Cl-sensiblen Strom Ca²⁺ der Xenopus-Oozyte beeinflusst worden. Die Daten wurden bei 2 kHz bemustert und bei 500 Hz für die Analyse filtriert (Logiciel Biopatch).
3) Northern Blot-Analyse, RT-PCR und in situ-Hybridisierung
Northern Blot wurde bei der Firma Clontech (Palo Alto, Ca) erworben und enthielt zirka 2 μg RNA poly(A+) je Linie. Blot wurde mit einem Fragment des humanen Teilklons (entspricht den Basen 270 bis 764 des Rattenklons), markiert mit ³²P, bei 65°C in 6×SSC hybridisiert. Für die RT-PCR-Analyse wurden 5 μg RNA total Rattenhirn und 3 μg Ganglion von Radix dorsalis reverstranskribiert, und 1/30 der Probe wurden durch 30 Zyklen PCR mit den folgenden Sequenzprimern amplifiziert:
Die negativen Kontrollen wurden identisch behandelt, mit Ausnahme der reverse Transkriptase, die nicht hinzugefügt wurde. Die der DB 70 bis 114 (A), 215 bis 248 (B), 1821 bis 1859 (C), 1896 bis 1940 (D) entsprechenden Antisense-Oligonukleotide und die der DB 1685 bis 2672 entsprechende Doppelstrang-DNA wurden für die in situ-Hybridisierungen verwendet. Die Hirnabschnitte der erwachsenen Ratte wurden mit den Oligonukleotiden B oder C, deren Ende mit ³²P markiert war, für eine Nacht bei 37°C in 50% Formamid, 2×SSC hybridisiert und danach bei Raumtemperatur in 1×SSC gewaschen. Das Signal wurde durch einen Überschuss 500 Mal nicht markierter Oligonukleotide aufgehoben. Die Ganglionabschnitte der Radix dorsalis wurden mit den durch Digoxigenin(DIG)-dUTP markierten Oligonukleotiden A, C oder D und mit der durch DIG-D-UT durch PCR markierten Sonde E hybridisiert. Die Markierung der Sonden, die Herstellung der Proben, die Hybridisierung und die Visualisierung der DIG-Nukleinsäuren mit der mit Anti-DIG-Antikörpern konjugierten alkalischen Phosphatase wurde gemäß den Protokollen des Lieferanten (Boehringer Mannheim) durchgeführt.
4) EDV-Analyse
Das Sequenz-Alignment und der phylogenetische Baum (Substitution Kimura, Option UPGMA) wurden mit der Software GCG (Genetics Computer Group, Madison WI) durchgeführt.
II – Ergebnisse
Die DNA 35 kb isoliert aus Rattenhirn kodiert für ein Protein mit 526 Aminosäuren, das, wie auf der 2 zu sehen ist, Homologien mit allen geklonten Mitgliedern der Familie der auf Amilorid sensiblen Degenerin-Natriumkanäle aufweist.
Wie auf der 5 zu sehen ist, hat die Expression der cRNA in den Oozyten von Xenopus einen eingehenden, von den Protonen H⁺ aktivierten Strom induziert. Die biophysikalischen Eigenschaften und die Pharmakologie des ASIC-Kanals ähneln denjenigen, die für die durch die Protonen der sensorischen Neuronen aktivierten Kationenkanäle beschrieben wurden (3, 15, 16). Ein Absinken des extrazellulären pH unter einen pH von 6,9 aktiviert einen schnell gestiegenen und desensibilisierten eingehenden Strom (5 a und b). Dieser Kanal ist von den extrazellulären Protonen aktiviert, da, wie auf der 5 (c und d) zu sehen ist, die Anwendung einer Säure auf der extrazellulären Seite des Outside-out-Patches den Kanal aktiviert. Die intrazelluläre Oozyten-Säuerung und die Säuerung der intrazellulären Seite des Outside-out-Patches aktiviert weder den ASIC-Kanal, noch wird der von den extrazellulären Protonen induzierte ASIC-Strom beeinträchtigt.
Die Analyse der Kurven I-V der 5 (c und e), die mit verschiedenen extrazellulären Kationen aufgezeichnet wurden, zeigt, dass Na⁺ das mehrheitlich permeable Ion ist (Kanal mit einfachem Leitwert 14,3 pS).
Wie der auf Protonen der sensorischen Neuronen sensible Ionenkanal (15, 16) diskriminiert der ASIC-Kanal schwach zwischen den Kationen (5 c, e, f). In der Tat ist der Kanal ebenfalls für Li⁺, K⁺, Ca²⁺ und H⁺ permeabel, in den Verhältnissen pNa⁺/pLi⁺ = 1,3 (5 c, e), pNa⁺/pK⁺ = 13 (5 c, e), pNa⁺/Ca²⁺ = 2,5 (5 e) und pNa⁺/H⁺ = 0,8 (5 f). Die Ca² ⁺-Permeabilität von ASIC könnte ein unabhängiger Spannungseingangsweg von Ca²⁺ in die Zelle sein. Ein in die Zelle über die ASIC-Kanäle eingehender Ca²⁺-Strom kann bei Abwesenheit von extrazellulärem Na⁺ festgestellt werden (6 a, b). Wie auf der 5(e) gezeigt wird, betrug der Einheitsleitwert für Ca²⁺ 5,2 pS. Bei Anwesenheit von 140 mM extrazellulärem Na⁺ sank bei einer Erhöhung der Konzentrationen an externem Ca²⁺ die Amplitude des von den Protonen aktivierten Stroms (6c), womit nachgewiesen wurde, dass Ca²⁺ die Na⁺-Permeabilität inhibiert. Eine Blockade durch das externe Ca²⁺ ist für den I(H⁺) der sensorischen Neuronen charakteristisch (17). Der eingehende, von H⁺ in den sensorischen Neuronen aktivierte Strom wird durch das Amilorid (18) und das Ethylisopropylamilorid (EIPA) inhibiert (19). Wie auf der 6 (d, e) zu sehen ist, weist der ASIC-Kanal dieselbe Pharmakologie auf und ist durch das Amilorid und seine Benzamil-Derivate und EIPA reversibel blockiert (Kd = 10 PM).
Im übrigen weist das Protein des ASIC-Kanals zirka 67% Sequenzhomologie mit den Degenerin-Ionenkanal „MDEG" (14) oder „BnaCI" (20) auf. Jedoch sind die elektrophysiologischen Eigenschaften dieser zwei in den Oozyten von Xenopus exprimierten Klone deutlich unterschiedlich:

– Wie auf der 5a zu sehen ist, wird der MDEG-Kanal nicht von denselben pH-Änderungen aktiviert wie der ASIC-Kanal.
– Durch Substitution des Glycinrests an Position 430 von MDEG durch eine hinderlich saure Aminosäure wie Valin oder Phenylalanin wird der Kanal aktiviert (14), ebenso wie die Mutation des Alanins an Position 704 des Degenerins MEC-4 bei C. elegans eine Neurodegeneration verursacht (12). Identische Mutationen von ASIC (Glycin an Position 431 ersetzt durch Valin oder Phenylalanin) führen zu keiner Aktivität, und die Mutanten können nicht von den Protonen aktiviert werden.

Die protonenaktivierten Kationenkanäle wurden in den sensorischen Neuronen, aber auch in den Neuronen des Zentralnervensystems beschrieben (21). Die Gewebsverteilung der mRNA-Expression des ASIC-Kanals stimmt mit dieser Beobachtung überein. Wie in der 7a zu sehen ist, wurde im Gehirn durch Northern Blot-Analyse ein 4,3 kb Transkript nachgewiesen, und die Ergebnisse der RT-PCR von 7b zeigen, das das Ganglion von Radix dorsalis die mRNA von ASIC exprimiert. Die 8 (a, b) zeigt, dass die mRNA von ASIC in den kleinen Neuronen des Ganglions von Radix dorsalis gut exprimiert ist, was die Tatsache unterstützt, das ASIC der schnell desensibilisierende, in den riozizeptiven sensorischen Neuronen beschriebene Kationenkanal ist. Auch wenn die Präsenz von protonenaktivierten Kationenkanälen in den Ganglien von Radix dorsalis mit ihrer Funktion als Säuredetektor in der Nozizeption in Übereinstimmung steht, bleibt ihre Rolle im Gehirn zu ermitteln. Die Ergebnisse der in situ-Hybridisierung von 8c zeigen eine breite und heterogene Expression der mRNA des ASIC-Kanals. Die höchsten Expressionsniveaus wurden im Haupt-Bulbus olfaktorius, im Cortex cerebri, im Hippokampus, in der Habenula, im basolateralen Teil des Mandelkerns und im Cerebellum beobachtet. Die synaptische Aktivität ist von Änderungen des extrazellulären pH begleitet (22, 23), und die lokalisierten schnellen pH-Änderungen im Synapsenspalt oder in dessen Nähe sind spürbar gesättigter und stärker als die berichteten makroskopischen pH-Fluktuationen.
Die protonenaktivierten Kationenkanäle sind die einzigen bekannten Ionenkanäle, die direkt durch eine pH-Änderung aktiviert werden, und es wird davon ausgegangen, dass die extrazellulären pH-Fluktuationen die Rolle eines Neuromodulators spielen (23). Die Expression von Kationenkanälen im Gehirn unterstützt im weiteren die Hypothese, dass die pH-Fluktuationen nicht nur eine produktbedingte neuronale Aktivierung sind, sondern vielmehr ein Kommunikationsweg im Zentralnervensystem.
Neben den protonenaktivierten, schnell deaktivierten Kationenkanälen wurde in den sensorischen Neuronen die Präsenz von protonenaktivierten Kationenkanälen nachgewiesen, die langsamere Kinetiken aufweisen (4, 24). Die protonenaktivierten Kationenkanäle bilden wahrscheinlich, wie andere durch einen Liganden aktivierte Kationenkanäle (25, 26), eine Kationenkanalfamilie, wo verschiedene Untereinheiten oder Kombinationen von Untereinheiten Kanäle mit verschiedenen pharmakologischen und biophysikalischen Eigenschaften bilden.
Die Empfindung der Azidität ist nicht nur in der Nozizeption impliziert, sondern auch mit der Transduktion des Geschmacks verbunden (2). Die sauren Stimulationen aktivieren die protonenaktivierten Kationenkanäle in den Geschmackszellen (2, 27), und das Amilorid inhibiert die Wahrnehmung des sauren Geschmacks (2). Auch weisen sowohl die physiologischen als auch die pharmakologischen Daten darauf hin, dass ASIC und andere Mitglieder dieser Familie an der Transduktion des Geschmacks beteiligt sind. Es ist nämlich besonders frappierend, dass dieselbe Klasse von Ionenkanälen mit verschiedenen Facetten der sensorischen Wahrnehmung verbunden sind:

– Die auf Amilorid sensiblen Natriumkanäle sind mit der Transduktion des salzigen Geschmacks verbunden (2).
– Die Degenerine von C. elegans sind in der mechanischen Transduktion impliziert und wurden als mechanisch sensible Ionenkanäle ausbildend vorgeschlagen (28, 29).
– Die ASIC-Kanäle sind in der Nozizeption und der Transduktion des sauren Geschmacks impliziert.

Durch die Klonierung des ASIC-Kanals wird ein neues Werkzeug für die Untersuchung dieser Ionenkanalgruppe zur Verfügung gestellt, und es können spezifische Blocker entwickelt werden, die ihre Anwendung vor allem als Analgetikum finden.
Referenzliste

1. Rang, H. P., Bevan, S. & Dray, A. Br. Med. Bull. 47, 534–548 (1991).
2. Lindemann, B. Physiol. Rev. 76, 718–766 (1996).
3. Krishtal, O. A. & Pidoplichko, V. I. Neuroscience 6, 2599–2601 (1981).
4. Bevan, S. & Geppetti, P. Trends Neurosci. 17, 509–512 (1994).
5. Akaike, N., Krishtal, O. A. & Maruyama, T. J. Neurophysiol. 63, 805–813 (1990).
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7. Canessa, C. M., Schild, L., Buell, G., Thorens, B., Gautschi, I., Horisberger, J. D. & Rossier, B. C. Nature 367, 463–467 (1994).
8. Lingueglia, E., Voilley, N., Waldmann, R., Lazdunski, M. & Barbry, P. Febs Lett. 318, 95–99 (1993).
9. Lingueglia, E., Renard, S., Waldmann, R., Voilley, N., Champigny, G., Plass, H., Lazdunski, M. & Barbry, P. J. Biol. Chem. 269, 13736–13739 (1994).
10. Lingueglia, E., Champigny, G., Lazdunski, M. & Barbry, P. Nature 378, 730–733 (1995).
11. Waldmann, R., Champigny, G., Bassilana, F., Voilley, N. & Lazdunski, M. J. Biol. Chem. 270, 27411–27414 (1995).
12. Driscoll, M. & Chalfie, M. Nature 349, 588–593 (1991).
13. Huang, M. & Chalfie, M. Nature 367, 467–470 (1994).
14. Waldmann, R, Champigny, G., Voilley, N., Lauritzen, I. & Lazdunski, M. J. Biol. Chem. 271, 10433–10434 (1996).
15. Kovalchuk Yu, N., Krishtal, O. A. & Nowycky, M. C. Neurosci. Lett. 115, 237–242 (1990).
16. Konnerth, A., Lux, H. D. & Morad, M. J. Physiol. 386, 603–633 (1987).
17. Davies, N. W., Lux, H. D. & Morad, M. J. Physiol. 400, 159–187 (1988).
18. Korkushko, A. O. & Krishtal, O. A. Neirofiziologiia 16, 557–561 (1984).
19. Grantyn, R, Perouansky, M., Rodriguez-Tebar, A. & Lux, H. D. Dev. Brain Res. 49, 150–155 (1989).
20. Price, M. P., Snyder, P. M. & Welsh, M. J. J. Biol. Chem. 271, 7879–7882 (1996).
21. Akaike, N. & Ueno, S. Prog. Neurobiol. 43, 73–83 (1994).
22. Krishtal, O. A., Osipchuk, Y. V., Shelest, T. N. & Smirnoff, S. V. Brain Res. 436, 352–356 (1987).
23. Chesler, M. & Kaila, K. Trends Neurosci. 15, 396–402 (1992).
24. Bevan, S. & Yeats, J. J. Physiol. 433, 145–161 (1991).
25. Lewis, C., Neidhart, S., Holy, C., North, R. A., Buell, G. & Surprenant, A. Nature 377, 432–435 (1995).
26. Barnard, E. A. Trends Pharmacol. Sci. 17, 305–309 (1996).
27. Okada, Y., Miyamoto, T. & Sato, T. J. Exp. Biol. 187, 19–32 (1994).
28. Liu, J., Schrank, B. & Waterston, R. Science 273, 361 (1996).
29. Waldmann, R., Champigny, G. & Lazdunski, M. J. Biol. Chem. 270, 11735–11737 (1995).
30. Renard, S., Lingueglia, E., Voilley, N., Lazdunski, M. & Barbry, P. J. Biol. Chem. 269, 12981–12986 (1994).

Sequenzliste

Anzahl der Sequenzen: 6

INFORMATION ÜBER DIE SEQ ID NR. 1

i) EIGENSCHAFT DER SEQUENZ:
A) LÄNGE: 3562 Basenpaare
B) TYP: Nukleinsäure
C) ANZAHL DER STRÄNGE: doppelt
D) KONFIGURATION: linear
ii) MOLEKÜLTYP: DNA
vi) URSPRUNG: Ratte
ix) EIGENSCHAFT
A) NAME/SCHLÜSSEL: ASIC
B) LOKALISIERUNG: 123 .. 1700
xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ SEQ ID NR. 1:

INFORMATION ÜBER DIE SEQ ID NR. 2

i) EIGENSCHAFT DER SEQUENZ:
A) LÄNGE: 1620 Basenpaare
B) TYP: Nukleinsdure
C) ANZAHL DER STRÄNGE: doppelt
D) KONFIGURATION: linear
ii) MOLEKÜLTYP: DNA
vi) URSPRUNG: Mensch
ix) EIGENSCHAFT
A) NAME/SCHLÜSSEL: ASIC
B) LOKALISIERUNG: 1 .. 1542
xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 2:

INFORMATION ÜBER DIE SEQ ID NR. 3

i) EIGENSCHAFT DER SEQUENZ:
A) LÄNGE: 1666 Basenpaare
B) TYP: Nukleinsäure
C) ANZAHL DER STRÄNGE: doppelt
D) KONFIGURATION: linear
ii) MOLEKÜLTYP: DNA
vi) URSPRUNG: Mensch
ix) EIGENSCHAFT
A) NAME/SCHLÜSSEL: MDEG
B) LOKALISIERUNG: 127 .. 1663
xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 3:

INFORMATION ÜBER DIE SEQ ID NR. 4

i) EIGENSCHAFT DER SEQUENZ:
A) LÄNGE: 3647 Basenpaare
B) TYP: Nukleinsäure
C) ANZAHL DER STRÄNGE: doppelt
D) KONFIGURATION: linear
ii) MOLEKÜLTYP: DNA
vi) URSPRUNG: Ratte
ix) EIGENSCHAFT
A) NAME/SCHLÜSSEL: ASIC1B
B) LOKALISIERUNG: 109 .. 1785
xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NR. 4:

INFORMATION ÜBER DIE SEQ ID NR. 5:

i) EIGENSCHAFT DER SEQUENZ:
A) LÄNGE: 1602 Basenpaare
B) TYP: Nukleinsäure
C) ANZAHL DER STRÄNGE: doppelt
D) KONFIGURATION: linear
ii) MOLEKÜLTYP: DNA
vi) URSPRUNG: Ratte
ix) EIGENSCHAFT
A) NAME/SCHLÜSSEL: DRASIC
B) LOKALISIERUNG: 1 .. 1602
xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ SEQ ID NR. 5:

INFORMATION ÜBER DIE SEQ ID NR. 6

i) EIGENSCHAFT DER SEQUENZ:
A) LÄNGE: 1948 Basenpaare
B) TYP: Nukleinsäure
C) ANZAHL DER STRÄNGE: doppelt
D) KONFIGURATION: linear
ii) MOLEKÜLTYP: DNA
vi) URSPRUNG: Ratte
ix) EIGENSCHAFT
A) NAME/SCHLÜSSEL: MDEG2
B) LOKALISIERUNG: 16 .. 1707
xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ SEQ ID NR. 6:

Claims

Protein, einen auf Amilorid sensiblen und von den Protonen aktivierten neuronalen Säugetier-Kationenkanal bildend, dadurch gekennzeichnet, das es aus einer seiner Aminosäuresequenzen, die in der Sequenzliste in der Anlage unter der Nummer SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 dargestellt sind, besteht.
Hybrid-Kationenkanal, dadurch gekennzeichnet, dass er aus der Verbindung eines ersten Proteins, das einen von den Protonen nach Anspruch 1 aktivierten Ionenkanal bildet oder aus einer der Aminosäuresequenzen, die in der Sequenzliste in der Anlage unter der Nummer SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4 oder SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6 dargestellt sind, besteht, mit einem zweiten Protein, das einen Ionenkanal bildet, der von den Protonen aktiviert ist oder nicht, gebildet wird.
Hybrid-Kationenkanal nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite Protein einen von den Protonen aktivierten Ionenkanal bildet, der aus einer der Aminosäuresequenzen besteht, die in der Sequenzliste in der Anlage unter der Nummer SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 6 dargestellt sind.
Hybrid-Kationenkanal nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Protein ein Protein ist, dessen Aminosäuresequenz in der Sequenzliste in der Anlage unter der Nummer SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4 oder SEQ ID Nr. 5 dargestellt ist, und das zweite Protein ein Protein ist, dessen Aminosäuresequenz in der Sequenzliste in der Anlage unter der Nummer SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 6 dargestellt ist.
Monoklonaler oder polyklonaler Antikörper, gegen mindestens ein Protein nach Anspruch 1 und/oder gegen mindestens einen Hybridkanal nach einem der Ansprüche 2 bis 4 gerichtet.
Nukleinsäuremolekül, eine Nukleinsequenz umfassend oder davon gebildet, die für ein Protein kodiert, das einen Kationenkanal nach Anspruch 1 oder einen Hybridkanal nach einem der Ansprüche 2 bis 4 bildet.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 6, die Nukleinsequenz umfassend oder davon gebildet, die zwischen den Nukleotiden 123 und 1700 der Sequenz eingeschlossen ist, die in der Sequenzliste in der Anlage unter der Nummer SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist, oder ihre komplementäre Sequenz.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 6, die Nukleinsequenz umfassend oder davon gebildet, die zwischen den Nukleotiden 1 und 1542 der Sequenz eingeschlossen ist, die in der Sequenzliste in der Anlage unter der Nummer SEQ ID Nr. 2 dargestellt ist, oder ihre komplementäre Sequenz.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 6, die Nukleinsequenz umfassend, die zwischen den Nukleotiden 109 und 1785 der Sequenz eingeschlossen ist, die in der Sequenzliste in der Anlage unter der Nummer SEQ ID Nr. 4 dargestellt ist, oder ihre komplementäre Sequenz.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 6, die Nukleinsequenz umfassend, die zwischen den Nukleotiden 1 und 1602 der Sequenz eingeschlossen ist, die in der Sequenzliste in der Anlage unter der Nummer SEQ ID Nr. 5 dargestellt ist, oder ihre komplementäre Sequenz.
Vektor, der mindestens ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 6 bis 10 umfasst, in vorteilhafter Weise mit Kontrollsequenzen verbunden.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das einen Ionenkanal nach Anspruch 1 oder einen Hybridkanal nach einem der Ansprüche 2 bis 4 bildet, dadurch gekennzeichnet, das es darin besteht: – ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 6 bis 10 oder einen Vektor nach Anspruch 11 in eine Wirtszelle zu übertragen, – diese Wirtszelle unter Bedingungen zu kultivieren, die die Herstellung des den Ionenkanal bildenden Proteins gestatten, – die die Ionenkanäle bildenden Proteine mit allen geeigneten Mitteln zu isolieren.
Verfahren zur Expression eines Proteins, das einen Ionenkanal nach Anspruch 1 oder einen Hybridkanal nach einem der Ansprüche 2 bis 4 bildet, in einer Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, dass es darin besteht: – ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 6 bis 10 oder einen Vektor nach Anspruch 11 in die Wirtszelle zu übertragen, – diese Wirtszelle unter Bedingungen zu kultivieren, die die Herstellung des den Ionenkanal bildenden Proteins gestatten.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle aus den Prokaryoten oder Eukaryoten und vor allem aus den Bakterien, den Hefen, den Säugetier-, Pflanzen- oder Insektenzellen ausgewählt ist.
Durch eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 6 bis 11 transformierte Zelle, die auf Amilorid sensible und von den Protonen nach einem der Ansprüche 1 bis 4 aktivierte neuronale Säugetier-Kationenkanäle exprimiert.
Screeningverfahren für Substanzen, die in der Lage sind, die Aktivität von neuronalen Säugetier-Ionenkanälen zu modulieren, dadurch gekennzeichnet, dass: – variable Mengen einer Testsubstanz mit Zellen nach Anspruch 15, die auf Amilorid sensible und von den Protonen aktivierte neuronale Säugetier-Kationenkanäle exprimieren, in Kontakt gebracht werden, – die eventuellen Wirkungen dieser Substanz auf die Ströme der auf Amilorid sensiblen und von den Protonen aktivierten Kationenkanäle mit allen geeigneten Mitteln gemessen werden, wobei diese Zellen auf Amilorid sensible und von den Protonen aktivierte neuronale Säugetier-Kationenkanäle exprimieren, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die die Kanäle nach einem der Ansprüche 1 bis 4 umfassen oder die Kanäle, die aus einer Aminosäuresequenz bestehen, die in der Sequenzliste in der Anlage unter den Nummern SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 6 dargestellt ist.
Screeningverfahren für Substanzen, die in der Lage sind, die Aktivität von neuronalen Säugetier-Ionenkanälen zu modulieren, dadurch gekennzeichnet, dass variable Mengen einer Testsubstanz mit Zellen nach Anspruch 15 in Kontakt gebracht werden und danach die eventuellen Wirkungen dieser Substanz auf die Ströme der auf Amilorid sensiblen und von den Protonen aktivierten Kationenkanäle mit allen geeigneten Mitteln gemessen werden.
Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, angewendet auf das Screening von Substanzen, die in der Lage sind, die Wahrnehmung des Säuregrads, sowohl die Schmerzempfindung als auch die Transduktion des Geschmacks betreffend, zu modulieren.