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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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FMRFamid
(Phe-Met-Arg-Phe-Amid) und verwandte Peptide umfassen eine Familie
von Neuropeptiden, die bei vielen Wirbellosen reichlich vorhanden
sind, einschließlich
Caenorhabditis elegans (Nelson, L.S., Kim, K., Memmott, J.E. und
Li, C. (1998). FMRFamide-related gene family in the nematode, Caenorhabditis
elegans. Mol. Brain Res 58, 103-111), Aplysia california (Greenberg,
M.J. und Price, D.A. (1992). Relationships among the FMRFamide-like
peptides. Prog Brain Res. 92, 25-37) und Drosophila melanogaster(Schneider,
L.E. und Taghert, P.H. (1988). Isolation and characterization of
a Drosophila gene that encodes multiple neuropeptides related to
Phe-Met-Arg-Phe-NH2
(FMRFamide). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1998-1997). Bei diesen
Organismen wirken die FMRFamid-artigen Neuropeptide als Neurotransmitter
und Neuromodulatoren. Mindestens ein Gen, das FMRFamid-verwandte
Peptide codiert, ist in Säugern
vorhanden; es produziert Neuropeptid FF und Neuropeptid AF (A18Famid)
(Perry, S.J., Huang, E.Y.K., Cronk, D., Bagust, J., Sharma, R.,
Walker, R.J., Wilson, S., und Burke, J.F. (1997). A human gene encoding
morphine modulation peptides related to NPFF and FMRFamide, FEBS
Lett 409, 426-430; Vilim, F.S., Aarnisalo, A.A., Nieminen, M.L., Lintunen,
M., Karlstedt, K., Kontinen, V.K., Kalso, E., States B., Panula
P., und Ziff, E. (1999). Gene for pain modulatory neuropeptide NPFF:
induction in spinal cord by noxious stimuli. Mol Pharmacol. 55, 804-811).
Obschon FMRFamid selbst in Säugern nicht
entdeckt worden ist (Yang, H.Y.T., Fratta, W., Majane, E.A., und
Costa, E. (1985). Isolation, sequencing, synthesis, and pharmacological
characterization of two brain neuropeptides that modulate the action
of morphine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 7757-7761), ruft die Verabreichung von FMRFamid eine
Vielzahl physiologischer Wirkungen, einschließlich Veränderungen bei Blutdruck, Respirationsrate, Glucose-stimulierender
Insulinfreisetzung und Verhalten hervor (Kavaliers, G.M., und Hirst,
M. (1985), FMRFamide, a putative endogenous opiate antagonist: evidence
from suppression of defeat-induced analgesia and feeding in mice.
Neuropeptides 6, 485-494; Kavaliers, M. (1987). Calcium channel
blockers inhibit the antagonistic effects of Phe-Met-Arg-Phe-amide (FMRFamide)
on morphine- and stress-induced analgesia in mice. Brain Res 415, 380-384;
Mues, G., Fuchs,I., Wei, E.T., Weber, E., Evans, C.J., Barchas,
J.D., und Chang, J.-K. (1982). Blood pressure elevation in rats
by peripheral administration of Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Arg-Phe and
the invertrebrate neuropeptide, Phe-Met-Arg-Phe-NH2. Life Sciences 31, 2555-2561; Muthal,
A.V., Mandhane, S.N. und Chopde, C.T. (1997). Central administration
of FMRFamide produces antipsychotic-like effects in rodents. Neuropeptides
31, 319-322; Nishimura, M., Ohtsuka, K., Takahashi, H., und Yoshimura,
M. (2000). Role of FMRFamide-Activated Brain Sodium Channel in Salt-Sensitive Hypertensions.
Hypertension 35, 443-450; Raffa, R.B., Heyman, J., und Porreca,
F. (1986) Intrathecal FMRFamide (Phe-Met-Arg-Phe-NH2) induces excessive
grooming behavior in mice. Neuroscience Lett 65, 94-98; Sorenson,
R.L., Sasek, C.A., und Elde, R.P. (1984). Phe-Met-Arg-Phe-amide
(FMRF-NH2) inhibits inuslin and somatostatin secretion and anti-FMRF-NH2
sera detects pancreatic polypeptide cells in the rat islet. Peptides
5, 777-782, Tekegdy, G., und Bollo ,k, I. (1987). Amnesic action of
FMRFamide in rats. Neuropeptides 10, 157-163; Thiemermann, C., Al-Damluji,
S., Hecker, M., und Vane, J.R. (1991). FMRF-amide and L-Arg-1-Phe
increase blood pressure and heart rate in the anaesthetized rat
by central stimulation of the sympathetic nervous sysetm. Biochem
Biophys Res Comm 175, 318-324). Bei Säugern modifizieren FMRFamid
und Neuropeptid FF auch die Reaktion auf schmerzhafte Reize und
werden durch Entzündung
induziert (Kontinen, V.K., Aarnisalo, A.A., Idanpaan-Heikkila, J.J.,
Panula, P., und Kalso, E. (1997). Neuropeptide FF in the rat spinal
cord during carrageenan inflammation. Peptides 18, 287-292; Raffa,
R.B., und Connelly, C.D. (1992). Supraspinal antinociception produced
by [D-Met2]-FMRFamide in mice. Neuropeptides 22, 195-203; Tang,
J., Yang, H.Y.T., und Costa, E. (1984). Inhibition of spontaneous
and opiate-modified nociception by an endogenous neurpeptide with Phe-Met-Arg-Phe-NH2-like immunoreactivity.
Proc Natl Acad Sci USA 81, 5002-5005; Vilim, F.S., Aarnisalo, A.A.,
Nieminen, M.L., Lintunen, M., Karlstedt, K., Kontinen, V.K., Kalso,
E., States, B., Panula, P., und Ziff, E. (1999). Gene for pain modulatory
neuropeptide NPFF: induction in spinal cord by noxious stimuli.
Mol Pharmacol 55, 804.811; Yang, et al. (1985)). Werden FMRFamid
und verwandte Peptide intrazerebroventrikulär injiziert, so rufen sie eine Schmerzüberempfindlichkeit
und eine Verminderung der Morphin induzierten Schmerzunempfindlichkeit hervor
(Brussard, A.B., Kits, K.S., Ter Maat, A., Mulder, A.H., und Schoffelmeer,
A.N.M. (1989). Peripheral injection of DNA-RFa, a FMRFa agonist,
suppresses morphine-induced analgesia in rats. Peptides, 10, 735-739; Kavaliers (1987);
Raffa, R.B. (1988). The action of FMRFamide (Phe-Met-Arg-Phe-NH2) and related
peptides on mammals. Peptides 9, 915-922, Roumy, M., and Zajac,
J.M. (1998). Neuropeptide FF, pain and analgesia. Euro J. Pharm
345, 1-11; Tang et a. (1984); Yang, et al. (1985)). Außerdem wird
FMRFamid-immunreaktives Material in Säugern auf eine chronische Morphinverabreichung hin
freigesetzt, und können
Anti-FMRFamid-Antikörper
die Wirkungen des Morphins erhöhen
(Devillers, J.P., Boisserie, F., Laulin, J.P., Larcher, A., und
Simonnet, G. (1995). Simultaneous activation of spinal antiopioid
system (neuropeptide FF) and pain facilitatory circuitry by stimulation
of opioid receptors in rats. Brain Research 700, 173-181; Tang,
et al. (1984)).
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Einige
Wirkungen von FMRFamid und Neuropeptid FF scheinen durch Opioid-Rezeptoren
vermittelt zu sein; diese Wirkungen werden durch den Opioid-Antagonisten
Naloxon blockiert (Gouardéres, C.,
Sutak, M., Zajak, J.M. und Jhamandas, K. (1993). Antinociceptive
effects of intrathecally administered F8Famid and FMRFamide in the
rat. Eur J Pharm 237, 73-81; Kavaliers und Hirst (1985); Kavaliers (1987);
Raffa (1988); Roumy und Zajac (1998)). Andere Wirkungen von FMRFamid
und der FMRFamid-verwandten
Peptide sind jedoch von Opioid-Rezeptoren unabhängig und unempfindlich gegenüber Naloxon
(Allard, M., Geoffre, S., Legendre, P., Vincent, J.D., und Simonnet,
G. (1989). Characterization of rat spinal cord receptors to FLFQPQRFamide,
a mammalian morphine modulating peptide: a binding study. Brain
Research 500, 169-176; Gayton, R.J. (1982). Mammalian neuronal actions
of FMRFamide and the structurally related opioid Met-enkepahlin-Arg6-Phe7.
Nature 298, 275-176; Kavaliers (1987); Raffa (1988); Raffa, et al.
(1986); Roumy and Zajac (1998)). Bei Säugern ist/sind der/die Nicht-Opioid-Rezeptor(en)
für FMRFamid
und verwandte Peptide nicht identifiziert worden, und es ist nicht
bekannt, wie diese Peptide die Schmerzempfindung modulieren. Die
Entdeckung eines FRMFamid-aktivierten Na+-Kanals
(FaNaCh) in der Molluske Heix aspersa (Lingueglia, E., Champigny,
G., Lazdunski, M., und Barbry, P. (1995). Cloning of the amiloride-sensitive
FMRFamide peptide-gated sodium channel. Nature 378, 730-733) lieferte
einen Hinweis darauf, dass ähnliche
Rezeptoren in Säugern
existieren könnten.
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Anders
als viele Neuropeptid-Rezeptoren ist FaNaCh ein Ionenkanal, der
direkt durch seinen Peptid-Liganden, FMRFamid, reguliert ist (Lingueglia,
et al., (1995)). Der Neuropeptid-Rezeptor, FaNaCh, ist ein Mitglied
der DEG/ENaC-Familie der Kanäle. DEG/ENaC-Kanäle sind
Homo- oder Heteromultimere, die sich aus multiplen Untereinheiten
zusammensetzen (Bassilana, F., Champigny, G., Waldmann, R., de Weille,
J.R., Heurteaux, C., und Lazdunski, M. (1997). The acid-sensitive
ionic channel subunit ASIC and the mammalian degenerin MDEG form
a heteromultimeric H+-gated Na+ channel
with novel properties. J. Biol Chem 272, 28819-28822; Coscoy, S.,
Lingueglia, E., Lazdunski, M., und Barbry, P. (1998). The Phe-Met-Arg-Phe-amid-activated
sodium channel is a tetrameter. J. Biol Chem. 273, 8317-8322; Lingueglia,
E., de Weille, J.R., Bassilana, F., Heurteaux, C., Sakai, H., Waldmann,
R., und Lazdunski, M.(1997). A modulatory subunit of acid sensing
ion channels in brain and dorsal root ganglion cells. J. Biol Chem
272, 29778-29783; Waldmann, R., und Lazdunski, M. (1998). H+-gated cation channels: neuronal acid sensors
in the NaC/DEG family of ion channels. Curr Opin Neurobiol 8, 418-424).
Jede Untereinheit enthält
zwei Transmembrandomänen, die
durch eine große
extrazelluläre
Cystein-reiche Domäne
getrennt sind, und cytosolische N- und C-Termini (Waldmann and Lazdunski
(1998)). DEG/ENaC-Kanäle
sind nicht spannungs-begrenzt und sind Kationen-selektiv (gewöhnlich Na+ > K+). FaNaCh ist der einzige bekannte DEG/ENaC-Kanal, der
als ein Neuropeptid-Rezeptor wirkt. Weitere Mitglieder dieser Familie
sind an der Mechanosensation, dem Salzgeschmack und der epithelialen Na+-Absorption beteiligt (Lindemann, B. (1996).
Taste reception. Physiol. Rev 76, 718-766; Mano I., und Driscoll,
M. (1999). DEG/ENaC channels: a touchy superfamily that watches
its salt. Bioessays 21, 568-578; Schild, L., Canessa, C.M., Shimkets,
R.A., Gautschi, I., Lifton, R.P., und Rossier, B.C. (1995). A mutation
in the epithelial sodium channel causing Liddle disease increases
channel activity in the Xenopus laevis oocyte expression system.
Proc Natl Acad Sci USA 92, 5699-5703; Snyder, P.M., Price, M.P., McDonald,
F.J., Adams, C.M., Volk, K.A., Zeihen, B.G., Stokes, J.B., und Welsh,
M.J. (1995). Mechanism by which Liddle's syndrome mutations increase activity
of a human epithelial Na+ channel. Cell
83, 969-978). Obschon bisher kein Säuger-FaNaCh isoliert worden
ist, verfügen
Säuger über vielfache DEG/ENaC-Familienmitglieder.
Interessanterweise ist für
ein Subset dieser Kanalfamilie der säureempfindlichen Ionenkanäle eine
Rolle in der Sinneswahrnehmung und möglicherweise, wie bei FMRFamid, eine
Rolle in der Schmerzempfindung festgestellt worden (Waldmann and
Lazdunski (1998)). Die säureempfindlichen
DEG/ENaC-Kanäle
reagieren auf Protonen und erzeugen einen spannungsunempfindlichen
Kationenstrom, wenn die extrazelluläre Lösung angesäuert ist.
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Die
mit Entzündung,
Infektion und Ischämie assoziierte
Gewebeazidose verursacht Schmerzen (Reeh, P.W., und Stehen, K.H.
(1996). Tissue acidosis in nociception and pain. Prog Brain Res
113, 143-151). Die Azidose erzeugt auch protonenabhängige vorübergehende
(transiente) und unterhaltene (sustained) Na+-Ströme in kultivierten
Sinnesneuronen (Bevan, S., und Yeats, J. (1991). Protons activate a
cation conductance in a sub-population of rat dorsal root ganglion
neurones. J. Physiol (Lond) 433, 145-161; Davies, N.W., Lux, H.D., und Morad,
M. (1988). Site and mechanism of activation of proton-induced sodium
current in chick dorsal root ganglion neurones. J Physiol (Lond)
400, 159-187). Obschon die molekulare Identität der für diese Ströme verantwortlichen Kanäle unbekannt
ist, wurden sie als säureempfindliche
Mitglieder der DEG/ENaC-Proteinfamilie ausgehend von ihrer Ionenselektivität, Spannungsunempfindlichkeit
und Expressionsmuster angenommen (Babinski, K., Le, K.T., und Séguéla, P.
(1999). Molecular cloning and regional distribution of a human proton
receptor subunit with biphasic functional properties. J. Neurochem
72, 51-57; Bassilana, et al. (1997); de Weille, J.R., Bassilana,
F., Lazdunski, M., und Waldmann, R. (1998). Identification, functional
expression and chromosomal localisation of a sustained human proton-gated cation
channel. FEBS Lett 433, 257-260; Lingueglia, et al. (1997); Waldmann,
R., Bassilana, F., de Weille, J., Champigny, G., Heurteaux, C.,
und Lazdunski, M. (1997). Molecular cloning of a non-inactivating
proton-gated Na+ channel specific for sensory
neurons. J Biol Chem 272, 20975-20978). Die säureempfindlichen Ionenkanäle umfassen
den Hirn-Na+-Kanal 1 (BNC1) und dessen differenziell
gespleißte
Isoform MDEG2 (Garcia-Anoveros, J., Derfler, B., Neville-Golden,
J., Hyman, B.T., und Corey, D.P. (1997). BnaC1 und BNaC2 constitute
a new family of human neuronal sodium channels related to degenerins
and epithelial sodium channels. Proc Natl Acad Sci USA 94, 1459-1464;
Lingueglia, et al. (1997); Price, M.P., Snyder, P.M., und Welsh,
M.J. (1996). Cloning and expression of a novel human brain Na+ channel. J. Biol Chem 271, 7879-7882; Waldmann,
R., Champigny, G., Voilley, N., Lauritzen, I., und Lazdunski, M. (1996).
The mammalian degenerin MDEG, an amiloride-sensitive cation channel activated
by mutations causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans.
J Biol Chem 271, 10433-10436), den säureempfindlichen Ionenkanal
(ASICα)
und seine unterschiedlich gespleißte Isoform ASICβ (Chen, C.-C., England,
S., Akopian, A.N., und Wood, J.N. (1998). A sensory neuron-specific,
proton-gated ion channel. Proc Natl Acad Sci USA 95, 10240-10245;
Waldmann, et al. (1997)) und den säureempfindlichen Ionenkanal
der Spinalnervenwurzel (DRASIC) (Säugerneuronen-DEG/ENaC-Kanäle haben
mehrere Namen. Die Namen der drei Kanäle, aufgelistet in der Reihenfolge
ihrer Veröffentlichung,
sind: (1) BNC1, MDEG, BNaC1, ASIC2 und die Spleiß-Variante MDEG2; (2) BNaC2,
ASICα, ASIC1,
und die Spleiß-Variante
ASICβ; und
(3) DRASIC und ASIC3.) (Babinski, et al., (1999); de Weille, et
al. (1998); Waldmann, et al. (1997)). BNC1, MDEG2, ASICα und DRASIC
werden im Zentralnervensystem exprimiert (Chen, et al. (1998); Lingueglia,
et al. (1997); Olson, T.H., Riedl, M.S, Vulchanova, L., Ortiz-Gonzalez, X.R., und
Elde, R. (1998). An acid sensing ion channel (ASIC) localizes to
small primary afferent neurons in rats. Neuron 9, 1109-1113, Waldmann,
et al. (1997)). ASICα,
ASICβ, DRASIC
und MDEG2 werden in den Sinnesneuronen der dorsalen Wurzelganglien
(DRG) exprimiert (Babinski, et al. (1999); Chen, et al. (1998);
Olson et al. (1998); Waldmann, et al. (1997)).
-
Außerdem haben
O'Gara et al. (Invertebrate Neuroscience,
Bd. 4, Nr. 1, 1999, S. 41-53)
die Regulierung der Schlundmotilität durch FMRFamid und verwandte
Peptide im medizinischen Blutegel, Hirudo medicinalis, untersucht.
Außerdem
beschreiben Sakai et al. (Journal of Physiology, Bd. 519, 102, S. 323-333)
die Klonierung und funktionale Expression eines neuartigen Degenerin-artigen
Na+-Kanalgens in Säugern, und WO 98/35034 betrifft
ein Protein, das einen durch Protonen aktivierten neuronalen Amiloridempfindlichen
Kanal bei Säugern
darstellt, ebenso wie das Nukleinsäure-Molekül, das für dieses Protein codiert, als
auch ein Verfahren für
das Screening von Substanzen, die zum Modulieren der Aktivität von neuronalen
säureempfindlichen
Ionenkanälen
von Säugern
fähig sind.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für das Screening von Zusammensetzungen
zum Identifizieren von Agonisten, Antagonisten oder Modulatoren
von säure empfindlichen
Ionenkanälen, umfassend
das Zusammenbringen von Zellen, die säureregulierte Kanäle exprimieren,
mit der zu screenenden Zusammensetzung bei Vorhandensein von Phe-Met-Arg-Phe-Amid
(FMRFamid) und einem ausreichend sauren extrazellulären pH,
damit FMRFamid die säureregulierten
Kanalströme
moduliert; und Bestimmen, ob die Zusammensetzung die Öffnung der
säureempfindlichen
Ionenkanäle
der DEG/ENaC-Kanalfamilie verstärkt
oder hemmt.
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Eine
Aufgabe der Erfindung besteht daher in einem Assay für das Screening
von Zusammensetzungen, die die säureempfindlichen
Ionenkanäle
beeinflussen.
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung besteht in einem Assay für das Screening von Analgetika.
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Eine
weitere Aufgabe der Erfindung besteht in einem Kit, der zur Durchführung der
Assays der Erfindung verwendet werden kann.
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Diese
und weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile werden nach der Durchsicht
der folgenden Beschreibung und der Ansprüche der Erfindung erkennbar
werden.
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FMRFamid
und FMRFamid-artige Peptide modulieren säureaktivierte Ströme. Die
vorliegende Erfindung stellt einen Assay für das Screening von Zusammensetzungen
bereit, um jene zu identifizieren, die Agonisten, Antagonisten oder
Modulatoren von säureempfindlichen
Kanälen
der DEG/ENaC-Familie sind. Dieser Assay kann besonders nützlich zur Bestimmung
von Analgetika sein. Der Assay umfasst das Verabreichen der zu screenenden
Zusammensetzung an Zellen, die säureregulierte
Kanäle
exprimieren, und dann das Bestimmen, ob die Zusammensetzung die
Kanäle
hemmt, verstärkt
oder keine Wirkung auf sie hat, wenn Säure eingeführt wird. Die Bestimmung kann
durch Analysieren erfolgen, ob ein Strom durch die Zellen in Gegenwart
der Zusammensetzung und der Säure
unterhalten wird. Dieser Strom kann mit jenem verglichen werden,
der durch das FMRFamid und die verwandten Peptide unterhalten wird.
Der Assay kann auch in Kit-Form bereitgestellt werden.
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KURZBESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1.
Protonenregulierte Ströme
in Ratten-DRG-Neuronen werden durch FMRFamid moduliert.
- (A) Spuren eines protonenregulierten Ganzzellstroms (Whole-Cell-Stroms);
FMRFamid (100 μM) und
pH 5-Lösung
waren im Bad während
der durch die Striche angegebenen Zeit vorhanden. Sofern nicht anders
angegeben, war der pH 7,4. N = 8.
- (B) Naloxon (100 μM)
war während
der durch die Striche angegebenen Zeit vorhanden. N = 3.
- (C) Morphin (50 μM)
und FMRFamid (50 μM)
wurden wie angegeben zugesetzt. N = 3.
- (D) Neuropeptid FF (NPFF) (50 μM) und FMRFamid (50 μM) waren
während
der durch die Striche angegebenen Zeit vorhanden. N = 5.
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2.
Wirkung von FMRFamid auf H+-regulierte DEG/ENaC-Familienmitglieder.
Die Daten stellen repräsentative
Spuren von Xenopus-Oocyten, die ASICα (A), ASICβ (B), DRASIC (C) oder BNC1 (D) exprimieren,
von in Wasser injizierter Oozyte (E) und von HEK-293T-Zellen, die
ASICα exprimieren
(F), dar. Sofern nicht anders angegeben, war der extrazelluläre pH 7,4.
FMRFamid (50 oder 100 μM)
und pH 5-Lösung
waren in extrazellulärer
Lösung
während
der durch die Striche angegebenen Zeit vorhanden. Die Experimente
wurden mindestens 7-mal wiederholt.
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3.
FMRFamid moduliert die ASICα-Funktion
in ausgeschnittenen Outside-out-Patches
(Membranflecken). Die Spur ist repräsentativ für H+-abhängige Ströme, aufgezeichnet
von mit ASICα transfizierten
HEK-293T-Zellen. FMRFamid (100 μM)
und pH 5-Lösung
waren in extrazellulärer
Lösung
während
der durch die Striche angegebenen Zeit vorhanden; ansonsten war
der pH 7,4. N = 6.
-
4.
Wirkung der Reihenfolge der FMRFamid- und Säure-Zugabe. Die Daten stellen
Ganzzellströme
von Xenopus-Oocyten dar, die ASICα exprimieren
(A, C), (n = jeweils 5), HEK-293T-Zellen, die ASICα exprimieren
(B) (n = 8). Die römischen
Ziffern geben spezifische Interventionen an, auf die im Text Bezug
genommen wird. Der pH war 7,4, sofern nicht anders angegeben. FMRFamid
(50 oder 100 μM)
und pH 5-Lösung
waren im Bad während
der durch die Striche angegebenen Zeiten vorhanden. Im Panel D wurden
die Zellen kontinuierlich mit Lösung
bei pH 7,4 oder pH 5 für
80 Sek. während
der durch die Striche angegebenen Zeit perfundiert.
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5. Eigenschaften des FMRFamid-modulierten
ASICα-Stroms.
Die Daten stammen von Xenopus-Oocyten (A, B, D – F) oder HEK-293T-Zellen (C), die
ASICα exprimieren.
- (A) Wirkung der FMRFamid-Konzentration auf
die Potenzierung des H+-abhängigen unterhaltenen Stroms.
Die Eizellen wurden den angegebenen Konzentrationen von FMRFamid
vor und während der
Stromaktivierung mit pH 5-Lösung
ausgesetzt. Die Messungen wurden zu dem Wert des unterhaltenen Stroms
normalisiert, der mit 500 μM FMRFamid
erhalten wurde. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM dar;
n = 6-7.
- (B) Wirkung von Amilorid auf FMRFamid und den säureinduzierten
unterhaltenen Strom. Amilorid (1 mM), FMRFamid (50 μM) und pH
5 sind durch Striche angegeben. N = 5.
- (C) Amilorid (100 μM),
FMRFamid (100 μM)
und pH 5 sind durch Striche angegeben. N = 3.
- (D) pH-Empfindlichkeit des ASICα-Stroms bei Zugabe von FMRFamid.
FMRFamid (50 μM)
wurde vor der Säuerung
zugegeben. Die Werte wurden zu dem bei pH 3 erhaltenen Strom für den vorübergehenden
und den FMRFamid-modulierten unterhaltenen Strom normalisiert. Die
Daten stellen den Mittelwert ± SEM
dar; n = 7.
- (E, F) Strom-Spannungs-Beziehungen des ASICα-Stroms, gemessen bei pH 5 in
Gegenwart und Abwesenheit von FMRFamid (50 μM). Extrazelluläre Badlösung, enthaltend
116 mM Na+, K+ bzw. Li+, wie angegeben. Die Membranspannung wurde
von einer Haltespannung von -60 mV auf Spannungen von -80, -10 oder
+60 mV unmittelbar vor der Säuerung
abgestuft. Die Ströme
aus jeder Zelle wurden zu dem in derselben Zelle bei -80 mV in der
Na+-Lösung
(100 %) erhaltenen Strom (E) oder den unterhaltenen Strömen (F) normalisiert.
Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM dar; n = 8 Zellen für die Na+-Lösung
und 4 Zellen für
die K+- und Li+-Lösungen.
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6.
Wirkung von FMRFamid-artigen Peptiden auf den ASICα-Strom. ASICα exprimierende
Eizellen wurden den angegebenen Peptiden, Morphinsulfat oder Naloxon
vor und während
der Säuerung auf
pH 5 ausgesetzt. Alle Agenzien wurden bei 50 μM getestet und auf die Reaktion
auf FMRFamid (50 μM) normalisiert,
wie in derselben Zelle erhalten, mit Ausnahme von A18Famid (25 μM) und Naloxon
(500 μM).
Naloxon wurde vor Zugabe von FMRFamid aufgebracht. Die Daten stellen
den Mittelwert ± SEM
für 5 bis
8 Zellen dar, die für
jede Bedingung untersucht wurden.
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7.
Wirkung von FMRFamid und FRRFamid auf H+-regulierte
DEG/ENaC-Familienmitglieder, exprimiert
in Xenopus-Oocyten. (A, B) ASICα und ASICβ. FMRFamid
(50 μM),
FRRFamid (50 μM)
und pH 5-Lösung
waren in extrazellulärer
Lösung
während
der durch die Striche angegebenen Zeit vorhanden. N = mindestens
8. (C) DRASIC. FMRFamid (100 μM),
FRRFamid (100 μM)
und pH 4-Lösung
waren wie durch die Striche angegeben vorhanden. N = 6.
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8.
Wirkung von Neuropeptid FF auf DRASIC und ASICα, wie in Xenopus-Oocyten exprimiert.
Neuropeptid FF (NPFF) (50 μM)
und FMRFamid (50 μM)
waren während
der durch die Striche angegebenen Zeiten vorhanden. N = 5.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung macht sich den Befund zunutze, dass FMRFamid
und FMRFamid-artige Peptide säureempfindliche
Ionenkanäle
direkt modulieren. Dieses Ergebnis kann zur Bestimmung von Zusammensetzungen
genutzt werden, die beim Verändern
der Reaktion auf diese Kanäle
nützlich sein
werden. Da diese Peptide und Kanäle
eine Rolle in der Nozizeption zu spielen scheinen, können die Zusammensetzungen
auf die Inhibierung säureempfindlicher
Ionenkanäle
und auf den Antagonismus von FMRFamid-verwandten Peptiden gescreent
werden, um neue Analgetika zu finden. Da FMRFamid-verwandte Peptide
Blutdruck-Effekte, Verhaltenseffekte und Insulin- und Somatostatin-Sekretionseffekte
hervorrufen können,
wird vom Screening auf Zusammensetzungen mit hemmenden oder verstärkenden
Wirkungen säureempfindlicher
Ionenkanäle die
Bereitstellung nützlicher
Wirkstoffe erwartet, die diese physiologischen Reaktionen ebenfalls
regulieren können.
-
FMRFamid-verwandte
Neuropeptide potenzieren Ströme
von säureempfindlichen
DEG/ENaC-Kanälen.
Die Lokalisation von säureempfindlichen
Ionenkanälen
und FMRFamid-artigen Peptiden läßt vermuten,
dass die beiden in vivo wechselwirken kön nen. Sowohl DRASIC als auch
Neuropeptid FF ist im DRG zu finden (Allard, M., Rousselot, P.,
Lombard, M.C., und Theodosis, D.T. (1999). Evidence for neuropeptide
FF (FLFQRFamid) in rat dorsal root ganglia. Peptides 20, 327-333;
Chen, et al. (1998); Waldmann, et al. (1997)). Sie sind beide auch
im Rückenmark
und Gehirn lokalisiert (Chen, et al. (1998); Majane, E.A., Panula,
P., und Yang, H.Y. (1989). Rat brain regional distribution and spinal
cord neuronal pathway of FLFQPQRF-NH2, a
mammalian FMRF-NH2-like peptide. Brain Res
484, 1-12; Majane, E.A. und Yang, H.Y. (1987). Distribution and
characterization of two putative endogenous opioid antagonist peptides
in bovine brain. Peptides 8, 657-662). Darüber hinaus wird eine FMRFamid-Immunreaktivität, die nicht
Neuropeptid FF zu sein scheint, in DRG und dem Gehirn gefunden (Ferrarese,
C., Iadarola, M.J., Yang, H.-Y.T., und Costa, E. (1986). Peripheral and
central origin of Phe-Met-Arg-Phe-amide immunoreactivity in rat
spinal cord. Regulatory Peptides 13, 245-252; Majane and Yang (1987);
Vilim, et al. (1999)). Überraschenderweise
war FMRFamid in der Aktivierung von ASIC- und DRG-Strömen wirksamer als
Neuropeptid FF.
-
Die
Entdeckung, dass FMRFamid Mollusken-FaNaCh aktivierte, zeigte, dass
ein Peptid-Neurotransmitter einen Ionenkanal direkt regulieren konnte
(Lingueglia, et al. (1995)). Mehrere Studien legten nahe, dass FMRFamid-artige
Peptide vielfache Rezeptortypen in Säugern aktivieren können. Zu diesen
können
ein Opioid-Rezeptor, ein G-Protein-gekoppelter
Rezeptor, der zweiter Botenstoff-Wege aktiviert, und weitere Rezeptoren
zählen,
die bisher unidentifiziert geblieben sind (Gherardi, N., und Zajac,
J.M. (1997). Neuropeptide FF receptors of mouse olfactory bulb:
binding properties and stimulation of adenylate cyclase acitivity.
Peptides 18, 577-583; Kavaliers (1987); Nishimura, et al. (2000); Payza,
K., und Yang, H.Y. (1993). Modulation of neuropeptide FF rececptors
by guanine nucleotides and cations in membranes of rat brain and
spinal cord. J Neurochem 60, 1894-1899; Raffa und Connelly (1992)).
Die Daten aus den nachstehenden Beispielen sind die ersten, die
darauf hinweisen, dass Säuger-Mitglieder der DEG/ENaC-Kanalfamilie
auch auf FMRFamid-artige Peptide ansprechen.
-
Eine
Azidose ist mit Entzündung
und Ischämie
assoziiert und aktiviert Kationenkanäle in Sinnesneuronen. Eine
Entzündung
ruft auch die Expression von FMRFamid-artigen Neuropeptiden hervor, die
Schmerz modulieren. Neuropeptid FF und FMRFamid er zeugen aus sich
selbst heraus keinen Strom, sondern potenzieren H+-regulierte
Ströme
aus kultivierten Sinnesneuronen und heterolog exprimierten ASIC-
und DRASIC-Kanälen. Die
Neuropeptide verlangsamen die Inaktivierung und rufen während der
Säuerung
unterhaltene Ströme
hervor. Die Wirkungen sind spezifisch; verschiedene Kanäle zeigen unterschiedliche
Reaktionen auf die verschiedenen Peptide. Die Ergebnisse legen nahe,
dass säureempfindliche
Ionenkanäle
vielfache extrazelluläre
Signale zur Modifizierung der Sinneswahrnehmung integrieren können. Der
Nachweis, dass FMRFamid die säureempfindliche
Kanalfunktion direkt moduliert, umfasst das folgende:
- (a) Die Wirkung von FMRFamid wurde nicht durch Morphin nachgeahmt
oder durch Naloxon blockiert.
- (b) FMRFamid wies dieselbe Wirkung auf ASICα auf, das in breit divergierenden
Zelltpen, nämlich Xenopus-Oocyten
und einer menschlichen Zelllinie, exprimiert wurde. Wäre die Wirkung
von FMRFamid indirekt, so müssten
beide Zelltyen ähnliche
endogene Rezeptoren in Kopplung an ähnliche zweiter Botenstoffsysteme
exprimieren.
- (c) In Zellen, die verschiedene individuelle säureregulierte
Kanäle
exprimieren, erzeugten FMRFamid, FRRFamid und Neuropeptid FF Ströme, die nicht
nur quantitativ verschieden waren, sondern bedeutsamererweise auch
qualitativ verschieden waren. Wiesen diese Neuropeptide unterschiedliche
Affinitäten
für einen
unidentifizierten endogenen Rezeptor in Kopplung an einen zweiten
Botenstoff auf, so wären
lediglich quantitative Unterschiede zu erwarten. Darüber hinaus
würde solch ein
Szenario vorhersagen, dass die quantitativen Wirkungen für verschiedene
Kanäle ähnlich wären. Dies
war nicht der Fall.
- (d) Anwendung von FMRFamid veränderte die ASICα-Funktion
in ausgeschnittenen Outside-out-Patches von Membranen, in denen
das Cytosol nicht vorhanden ist.
-
Die
vorliegenden Daten zeigen, dass das FMRFamid oder FMRFamid-artige
Peptide mit den ASIC- und DRASIC-Kanälen wechselwirken, welche evolutionär mit dem
Mollusken-FaNaCh verwandt sind. Das FMRFamid öffnete diese Säugerkanäle jedoch
nicht von sich aus, sondern modulierte vielmehr die Reaktion auf
einen anderen Agonisten, nämlich Protonen.
Diese Befunde zeigen, dass ein FMRFamid-Bindungsstelle in diesen
DEG/ENaC-Kanälen zumindest
teilweise konserviert worden ist, doch dass Veränderungen in der Struktur die
Konsequenzen der Wechselwirkung verändert haben.
-
Die
alternativ gespleißten
Isoformen, ASICα und
ASICβ, sind über den
Großteil
ihrer Länge
identisch; allerdings ist die Aminosäuresequenz von ihren N-Termini
bis M1 und über
eine kurze Distanz (etwa 100 Aminosäuren) in die extrazelluläre Domäne hinein
nicht dieselbe. Unterschiede in der Reaktion von ASICα und ASICβ auf FMRFamid
und FRRFamid legen nahe, dass die eher N-terminalen Abschnitte von ASIC
zur Wechselwirkung mit FMRFamid beitragen. Dieses, plus den unterschiedlichen
Wechselwirkungen von FMRFamid und Neuropeptid FF mit FaNaCh und
DRASIC und das Fehlen einer Reaktion mit BNC1 liefern eine Strategie
und die Reagenzien, um zu untersuchen, wo und wie diese Kanäle mit FMRFamid
und verwandten Peptiden wechselwirken.
-
Die
vorliegenden Daten können
auch Folgen für
die DEG/ENaC-Funktion im Gehirn haben. Zum Beispiel rief eine intrazerebroventrikuläre Injektion von
FMRFamid-verwandten
Peptiden eine Vielzahl physiologischer Reaktionen hervor (Kavaliers
und Hirst (1985); Kavaliers (1987); Mues, G., Fuchs, I., Wie, E.T.,
Weber, E., Evans, C.J., Barchas, J.D. und Chang, J.-K. (1982). Blood
pressure elevation in rats by peripheral administraion of Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Arg-Phe
and the invertebrate neuropeptide, Phe-Met-Arg-Phe-NH2. Life Sciences 31, 2555-2561;
Muthal, A.V., Mandhane, S.N. und Chopde, C.T. (1997). Central administration
of FMRFamide produces antipsychotic-like effects in rodents. Neuropeptides
31, 319-322; Raffa und Connelly (1992); Raffa, et al. (1986); Roumy
und Zajac (1998); Sorenson, R.L., Sasek, C.A. und Elde, R.P. (1984).
Phe-Met-Arg-Phe-amide (FMRF-NH2) inhibits insulin and somatostatin
secretion and anti-FMRF-NH2 sera detects pancreatic polypeptide cells
in the rats islet. Peptides 5, 777-782; Tang, et al. (1984); Thiemermann,
et al. (1991); Yang, et al. (1985)). Vor kurzem wurde gezeigt, dass
ein Amilorid-Analogon die FMRFamid-induzierte Regulation des Renin-Angiotensin-Systems
des Gehirns und Bluthochdruck hemmt (Nishimura, et al. (2000)).
Dies legt nahe, dass diese Kanäle
ein Ziel von FMRFamid im Gehirn sind.
-
Protonenregulierte
DEG/ENaC-Kanäle
können
so funktionieren, dass sie die Reaktion auf Säure und Neuropeptide im Nervensystem
integrieren. Interessanterweise integriert ein anderer Kanal, der
für an
der Nozizeption beteiligt erachtet wird, der Capsaicin- Rezeptor, ebenfalls
vielfache Hitze- und Azidose-Reize (Caterina, M.J., Schumacher,
M.A., Tominaga, M., Rosen, T.A., Levine, J.D. und Julius, D. (1997).
The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain
pathway. Nature 389, 816-824; Tominaga, M., Caterina, M.J., Malmberg,
A.B., Rosen, T.A. Gilbert, H., Skinner, K., Raumann, B.E., Basbaum,
A.I. und Julius, D. (1998). The cloned capsaicin receptor integrates
multiple pain-producing stimuli. Neuron 21, 531-543). Daher könnten in
Neuronen H+-regulierte Ströme in Abhängigkeit
von der Art und den Kombinationen der exprimierten DEG/EnaC-Untereinheiten
und vom Vorhandensein verschiedener FMRFamid-artiger Neuropeptide
variieren. Die Mannigfaltigkeit der Kanal-Unterein-heiten und Neuropeptide
bietet reiche Möglichkeiten
für Wechselwirkungen
und neue Ziele für
die Pharmakotherapie.
-
Protokolle
für das
Screening neuer Wirkstoffe, Kits, welche die Protokolle ausnützen, und
Wirkstoffe, ausgewählt
mittels der Screening-Protokolle, wie sie durch die vorliegenden
Befunde ins Auge gefasst werden, können die nachstehenden Informationen
zur weiteren Charakterisierung berücksichtigen.
-
Es
ist vorgeschlagen worden, dass Gewebeischämie und Entzündung durch
Stimulieren der H+-regulierten Kationenströme schmerzverursachend
sind (Reeh und Steen (1996)). Die unterhaltende Komponente dieser
Ströme
wird als besonders wichtig erachtet (Bevan und Yeats (1991); Lingueglia, et
al. (1997)). Daher legt die Fähigkeit
des Neuropeptids FF und FMRFamid zur Hervorrufung unterhaltener
Ströme
nahe, dass die Peptide und die säureregulierten
Kanäle
eine Rolle in der Nozizeption spielen. Interessanterweise sind diese
Peptide zuvor mit einer Schmerzempfindung im Rückenmark und Gehirn verknüpft worden.
Zum Beispiel induziert eine chronische Entzündung die Neuropeptid FF-Expression
im Rückenmark
(Kontinen, et al. (1997); Vilim, et al. (1999)). FMRFamid-verwandte
Peptide können ebenfalls
zur Opiattoleranz beitragen, bei der zunehmende Mengen an Opiaten
erforderlich sind, um dieselbe analgetische Wirkung zu erzielen
(Raffa (1988); Roumy und Zajac (1998)). Dies lässt sich zum Teil durch eine
Opiat-induzierte Sekretion von FMRFamid-verwandten Peptiden aus
Rückenmarksneuronen
erklären,
die möglicherweise
eine Hypersensibilität
der nozizeptiven Neuronen hervorruft (Tang, et al. (1984)).
-
Diese
Daten zeigen, dass die größten unterhaltenen
Ströme
in ASICα exprimierenden
Zellen eine FMRFamid-Zugabe vor der Senkung des extrazellulären pH erforderten,
doch den unterhaltenen Strom aufrechterhalten konnten, wenn das
Amid während
der Senkung des pH entfernt wurde. Dies legt nahe, dass die Wirkung
des FMRFamids nur bei pH 7,4 reversibel ist.
-
Es
ist verwirrend, dass FMRFamid vor der Säure zugeführt werden sollte, wenn man
bedenkt, dass ASIC und FMRFamid direkt wechselwirken. Die Ergebnisse
legen das folgende Modell nahe. Bei pH 7,4 bindet FMRFamid und ist
frei zu dissoziieren. Ist FMRFamid jedoch bei pH 7,4 gebunden und
wird dann der pH gesenkt, so wird FMRFamid in der Bindungsstelle
eingefangen. Ist die Bindungsstelle nicht besetzt, so wird der Kanal
selbst bei fortgesetztem Vorhandensein von Säure schnell inaktiviert. Enthält die Bindungsstelle
jedoch FMRFamid, so wird die Kanalinaktivierung verlangsamt und/oder
teilweise verhindert. Dieses Szenario erklärt zwei weitere Beobachtungen.
Die begrenzte Fähigkeit
des Peptids, den Strom bei Anwendung nach der Säuerung zu verändern, könnte durch
eine Konformationsänderung
bei einem niedrigen pH erklärt
werden, welche die FMRFamid-Bindungsstelle verdeckt oder versteckt (4A, 4B).
Das Einfangen von FMRFamid innerhalb einer verdeckten Bindungsstelle
bei niedrigem pH würde
die fortgesetzte Erzeugung von unterhaltenen Strömen selbst nach Entfernung
des Peptids aus dem Bad erklären
(4D). Diese Interpretation stimmt
mit der früheren
Beobachtung überein,
dass ein saurer pH eine Konformationsänderung im verwandten BNC1-Kanal
bewirkt, welche die extrazelluläre
Lösungsmittelzugänglichkeit
eines spezifischen Restes veränderte
(Adams, C.M., Snyder, P.M., Price, M.P., und Welsh, M.J. (1998).
Protons activate brain Na+ channel 1 by
inducing a conformational change that exposes a residue associated
with neurodegeneration. J. Biol. Chem. 273, 30204-30207).
-
Die
Daten aus den Beispielen zeigen auch die Mengen an FMRFamid an,
die Veränderungen bei
den Mengen der unterhaltenen Ströme
hervorrufen. Eine Menge von etwa 1 μM rief nachweisbare unterhaltene
Ströme
in ASICα-exprimierenden
Zellen hervor, wohingegen maximale unterhaltene Ströme bei etwa
250 μM erzielt
wurden. Halbmaximale unterhaltene Ströme wurden bei etwa 33 μM erzielt.
Der unterhaltene Strom zeigte eine unterschiedliche Kationenselektivität und pH-Reaktion.
FMRFamid-induzierte unterhaltene Ströme zeigten eine Empfindlichkeit
gegenüber
einem breiteren Bereich von pH-Werten im Vergleich zu vorübergehenden
Strömen.
-
Die
Daten zeigen, dass für
das ASICα-getestete
FMRFamid, FLRFamid und FRRFamid die einzigen FMRFamid-artigen Peptide
waren, die unterhaltene Ströme
induzieren konnten. Daher weisen die Kanäle eine Neuropeptid-Spezifität auf. FRRFamid zeigte
einen deutlichen Spezifitätsunterschied,
wenn mit anderen Kanälen
getestet. Mit ASICβ verlangsamte
FRRFamid die Inaktivierungsrate, ohne einen ebenso großen unterhaltenen
Strom wie bei FRMFamid. Bei DRASIC erhöhten FRRFamid und FMRFamid
den unterhaltenen Strom, obschon bei äquivalenten Konzentrationen
FRRFamid eine größere Wirkung
zeigte. Das Neuropeptid FF zeigte signifikante Wirkungen lediglich
mit DRASIC.
-
Obschon
die Einzelheiten der Wechselwirkungen dieser Peptide mit den Kanälen nicht
vollkommen klar sind, wird das Folgende über die obige Information bezüglich der
Spezifität
hinaus vorgeschlagen. N-terminale Verlängerungen der RFamid-enthaltenden
Peptide schienen die Ströme
nicht zu verändern,
wobei die Ergebnisse zeigten, dass das C-terminale Amid für eine Reaktion
erforderlich ist.
-
Von
weiteren FMRFamid-verwandten Peptiden wird eine Modulation der säureregulierten
Ionenkanäle
erwartet.
-
Die
vorangegangene und folgende Information weist auf einen Assay für das Screening
von Zusammensetzungen zum Identifizieren von solchen hin, die Agonisten,
Antagonisten oder Modulatoren von säureregulierenden Kanälen der
DEG/ENaC-Familie sind. Der Assay umfasst die Verabreichung der zu
screenenden Zusammensetzung an Zellen, die säureregulierte Kanäle in Gegenwart
von Säure
und FMRFamid oder FMRFamid-verwandten Peptiden exprimieren, und
die Bestimmung, ob die Zusammensetzung die Öffnung der säureempfindlichen
Ionenkanäle
der DEG/ENaC-Kanalfamilie verstärkt oder
hemmt. Die Bestimmung der Verstärkung
oder Hemmung kann über
elektrophysikalische Analyse erfolgen. Der Zellstrom ist messbar.
Da ein unterhaltener Strom als für
Schmerz erforderlich erachtet wird, sollte eine Zusammensetzung,
die den unterhaltenen Strom inaktiviert, der als Folge der Aktivierung
durch Säure
und FMRFamid oder einem verwandten Peptid der säureempfindlichen Ionenkanäle vorhanden
ist, als ein Analgetikum nützlich
sein. Das Screening kann zur Bestimmung der erforderlichen Menge
an Zusammensetzung eingesetzt werden, indem die Menge an verabreichter
Zusammensetzung variiert wird. Die Zusammensetzung kann vor oder nach
Zugabe der Säure
und des FMRFamids oder eines verwandten Peptids verabreicht werden,
um zu bestimmen, ob die Zusammensetzung prophylaktisch oder als
ein Therapeutikum für
bestehenden Schmerz verwendet werden kann. Ein Fachmann des Gebiets
wäre bei üblicher
Sachkenntnis in der Lage, weitere Variationen am Assay zu bestimmen.
-
Da
die säureempfindlichen
Ionenkanäle
der DEG/ENaC-Kanalfamilie und FMRFamid bei den anderen physiologischen
Reaktionen (Blutdruck, Verhalten, Insulin- und Somatostatinsekretion)
einbezogen sind, kann der Assay zur Bestimmung von Zusammensetzungen
verwendet werden, die auch diese Reaktionen hemmen oder verstärken. Ein
Fachmann wäre
bei üblicher
Sachkenntnis in der Lage, festzulegen, wie auf die gewünschten
Wirkungen zu screenen wäre.
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BEISPIELE
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Methoden und
Materialien
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cDNA-Konstrukte
-
Humanes
ASICα wurde
aus Hirn-polyA-RNA kloniert. Ratten-ASICβ und Maus-DRASIC wurden aus
DRG-RNA kloniert. Humanes BNC1 wurde kloniert, wie beschrieben bei
Price et al. (1996) (Price, M.P., Snyder, P.M. und Welsh, M.J. (1996).
Cloning and expression of a novel human brain Na+ channel. J.
Biol. Chem. 271, 7879-7882). Die Konstrukte wurden zur Expression
in pMT3 kloniert. Die Validität
der Konstrukte wurde mittels DNA-Sequenzierung bestätigt.
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Zellen und Expressionssysteme
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Ratten-DRG-Neuronen
wurden aus Norway-Ratten gezüchtet,
wie beschrieben bei Benson et al. (1999) (Benson, C.J., Eckert,
S.P., und McCleskey, E.W. (1999). Acidevoked currents in cardiac
sensory neurons: A possible mediator of myocardial ischemic sensation.
Circulation Research 84, 921-928). Die Zellen durften über Nacht bei
Raumtemperatur inkubieren, und die Studien wurden 1 bis 2 Tage nach
der Isolierung vorgenommen.
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Die
Expression der cDNA-Konstrukte in Xenopus Oozyten wurde durch Injektion
der Plasmid-DNA in den Kern von defollikulierten Albino-Xenopus
laevis-Oozyten erreicht (Nasco, Fort Atkinson, WI), wie zuvor beschrieben
(Adams, C.M., Snyder, P.M., Price, M.P., und Welsh, M.J. (1998).
Protons activate brain Na+ channel by inducing
a conformational change that exposes a residue associated with neurodegeneration.
J. Biol. Chem. 273, 30204-30207). Die Plasmide wurde bei Konzentrationen
von 100 ng/μl
bei den meisten Experimenten injiziert. Die Eizellen wurden in modifizierter
Barth-Lösung
bei 18°C für 12 – 26 Stunden
nach Injektion inkubiert. Mit DRASIC injizierte Zellen durften für 24 – 48 Stunden vor
der Analyse inkubieren.
-
Die
HEK-293T-Zellen waren ein Geschenk von Dr. Mark Stinski (Univ. of
Iowa). ASICα-cDNA wurde in HEK-293T-Zellen
unter Verwendung von Transfast-Lipidreagenzien (Promega, Madison,
WI) transfiziert. Um transfizierte Zellen zu identifizieren, wurde
pGreenlantern-Vektor, der grün
fluoreszierendes Protein codiert (Gibco, Gaithersburg, MD) mit ASICα bei einem
Verhältnis
von 1:6 cotransfiziert; transfizierte Zellen wurden unter Anwendung
der Epifluoreszenzmikroskopie identifiziert. Die Zellen wurden 1 – 2 Tage
nach der Transfektion untersucht.
-
Elektrophysiologische
Analyse
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Ganzzellströme in Eizellen
wurden unter Verwendung einer Zwei-Elektroden-Spannungsklemme gemessen, wie zuvor
beschrieben (Adams, et al. (1998)). Die Eizellen wurden in Frosch-Ringers-Lösung gebadet,
enthaltend in mM: 116 NaCl, LiCl oder KCl, 0,4 CaCl2,
1 MgCl2, 5,4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES),
pH 7,4. Die sauren Lösungen
wurden mit 5 mM 2-(4-Morpholino)-ethansulfonsäure (MES) anstelle von HEPES gepuffert.
Die Membranspannung wurde bei -60 mV gehalten, sofern nicht anders
angegeben. Die meisten Peptide und Naloxon wurden erhalten von Sigma Chemical
Co. (St. Louis, MO) und wurden der extrazellulären Lösung zugegeben. Das Peptid
FRRFamid wurde durch Research Genetics (Huntsville, AL) synthetisiert.
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Während des
Whole-Cell-Patch-Clamping von DRG-Neuronen und transfizierten HEK-293T-Zellen wurden
die Zellen mit einer extrazellulären
Lösung
gebadet, die in mM enthielt: 128 NaCl, 5 MgCl2,
1,8 CaCl2, 5,4 KCl, 5,55 Glucose, 20 HEPES,
pH 7,5 oder 5. Die Pipettenlösung
enthielt in mM: 120 KCl, 10 NaCl, 2 MgCl2,
5 EGTA, 10 HEPES. Die Perfusion der Zellen mit verschiedenen Lösungen erfolgte
durch Platzieren der entsprechenden Spitze vor der Zelle. Die Daten
wurden mit einem AXOPATCH 200 (Axon Instruments, Foster City, Kalifornien)
aufgezeichnet und wurden auf einem Digitalband-Rekorder gespeichert. Die Digitalisierung wurde
durch Erhebung der Daten bei 400 Hz unter Verwendung von pClamp6
(Axon Instruments, Foster City, Kalifornien) ausgeführt.
-
Ausgeschnittene
Outside-out-Patches wurden von transfizierten HEK-293T-Zellen erhalten.
Die Badlösung
enthielt in mM: 140 NaCl, 2 MgCl2, 1,8 CaCl2, 10 HEPES bei pH 7,4, oder Tris(hydroxymethyl)aminomethan
(Tris) oder MES bei pH 5. Die Pipettenlösung enthielt: 140 NMDG-Cl,
2 MgCl2, 2 EGTA, 10 HEPES, pH 7,4.
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Beispiel 1
-
FMRFamid moduliert den
protonenregulierten Strom in Ratten-DRG-Neuronen
-
Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen wurden
zur Untersuchung der Wirkung von FMRFamid auf protonenregulierte
Ströme
in kultivierten Ratten-DRG-Neuronen verwendet. Wie zuvor berichtet (Akaike,
N., und Ueno, S. (1994). Proton-induced current in neuronal cells.
Prog. Neurobiol. 43, 73-83), erzeugte die Säuerung auf pH 5 schnell aktivierende und
inaktivierende Ströme
in den Sinnesneuronen des DRG (1A – 1D). Einzeln zugefügtes FMRFamid erzeugte keine
Reaktion irgendeines der getesteten Neuronen. Nach FMRFamid-Zugabe
(50 – 100 μM) jedoch
verlangsamte sich die Inaktivierung des protonenabhängigen Stroms,
und in vielen Neuronen lag ein unterhaltener Strom bei fortgesetztem
Vorhandensein von Säure
vor (1A und 1B).
Das Vorhandensein des Neuropeptids unmittelbar vor Säuerung veränderte die
Inaktivierung ebenfalls (1C, 1D).
-
Von
einigen Wirkungen des FMRFamids glaubt man, dass sie durch Aktivierung
von Opiat-Rezeptoren vermittelt sind (Raffa (1988); Roumy und Zajac
(1998)). Um zu un terscheiden, ob dies auf eine Potenzierung der
protonenregulierten Ströme
zurückzuführen wäre, wurde
die Wirkung von Naloxon, einem Opiat-Antagonisten, und Morphin,
einem Opiat-Agonisten, eingesetzt. Naloxon blockierte die Wirkung
von FMRFamid nicht (1B) und Morphin ahmte es nicht
nach (1C). Diese Ergebnisse legten
nahe, dass FMRFamid nicht durch Opioid-Rezeptoren an der Veränderung
des Stroms wirkte.
-
Das
Säuger-FMRFamid-artige
Neuropeptid FF (Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-Phe-Amid) wurde ebenfalls getestet. Neuropeptid
FF modulierte die Ströme
in einer ähnlichen
Weise wie FMRFamid; es erzeugte von sich aus keinen Strom, veränderte jedoch
die Inaktivierung der protonenregulierten DRF-Ströme (1D).
Die Wirkungen waren jedoch geringer als die durch FMRFamid erzeugten
Wirkungen (1D).
-
Beispiel 2
-
Wirkung von
FMRFamid auf säureempfindliche
Ionenkanäle
-
Mitglieder
der DEG/ENaC-Familie werden für
zumindest teilweise für
die säureregulierten
Ströme
im DRG verantwortlich gehalten. Daher wurde gefolgert, dass FMRFamid
eine direkte Wirkung auf säureregulierte
DEG/ENaC-Kanäle
haben könnte. Säureempfindliche
Ionenkanäle
von Säugern
in Xenopus-Oocyten wurden exprimiert und die resultierenden Ströme gemessen.
ASICα und
seine alternativ gespleißte
Variante ASICβ erzeugten
schnell inaktivierende Ströme,
wenn der extrazelluläre
pH von 7,4 auf 5 gesenkt wurde (2A, 2B). Im Gegensatz zu dieser Wirkung auf
FaNaCh wies FMRFamid alleine keine Wirkung auf keinen der Kanäle auf.
Allerdings potenzierte eine anschließende Senkung des pH in Gegenwart
von FMRFamid den Strom: 2A und 2B zeigen eine Verlangsamung der Inaktivierung und
das Auftreten eines unterhaltenen Stroms bei pH 5 sowohl bei ASICα als auch
ASICβ. DRASIC
zeigt eine ähnliche
Reaktion in Gegenwart von FMRFamid (2C);
nach einer Herabsetzung des pH-Werts war die Inaktivierung verlangsamt
und ein unterhaltener Strom erkennbarer. Im Gegensatz dazu waren die
säureregulierten
Ströme
von BNC1 exprimierenden Eizellen durch FMRFamid nicht erkennbar
verändert
(2D). Weder der pH-Wert noch FMRFamid
erzeugten in irgendeiner Kombination einen Strom bei der Kontrolle,
nämlich
in Wasser injizierten Oozyten (2E).
-
FMRFamid
veränderte
auch die Funktion von in der humanen Zelllinie HEG-293T exprimiertem ASICα (2F). Saure extrazelluläre Lösungen riefen schnell inaktivierende
Ganzzellströme
hervor. In Gegenwart von FMRFamid verlangsamte sich die Inaktivierung
und war ein unterhaltener Strom erkennbar. Die Wirkung von FMRFamid
auf den Strom von säureregulierten
Kanälen,
exprimiert in Xenopus-Oocyten und Säugerzellen, ahmte die in DRG-Neuronen
beobachtete Wirkung nach. Diese Ähnlichkeit legte
nahe, dass diese DEG/ENaC-Kanäle
zumindest zum Teil für
protonenregulierte Ströme
in Neuronen verantwortlich sein können. Weitere Studien konzentrierten
sich auf ASICα,
da es am umfangreichsten untersucht worden war, in nozizeptiven
Neuronen des DRG lokalisiert ist (Olson, et al. (1998)) und es einen
stabilen unterhaltenen Strom bei FMRFamid-Zugabe erzeugte.
-
Beispiel 3
-
FRMFamid moduliert den
ASICα-Strom
in Outside-out-Membran-Patches
-
Um
zu testen, ob FMRFamid mit dem Kanal direkt wechselwirkt, wurde
ASICα in
HEK293-Zellen exprimiert und der Strom aus ausgeschnittenen Outside-out-Patches
aufgezeichnet. 3 zeigt, dass eine Senkung des
extrazellulären
pH die vorübergehenden
Ströme
aktivierte. In Gegenwart von FMRFamid war die Inaktivierung wesentlich
verlangsamt. Diese Daten zeigten, dass FMRFamid ASICα direkt beeinflusst.
-
Beispiel 4
-
Sequenz der
Zugabe von FMRFamid und Säuerung
-
In
ASICα exprimierenden
Zellen rief das Vorhandensein von FMRFamid vor und während der Säuerung einen
unterhaltenen Strom hervor (4Aiii).
Das fortgesetzte Vorhandensein von FMRFamid verhinderte eine Schließung des
Kanals nicht, wenn der pH auf 7,4 zurückgebracht wurde (4Aiii). Folglich konnte FMRFamid den Strom weder
aktivieren noch unterhalten, sondern modulierte vielmehr den säureaktivierten
Strom. Dies steht in scharfem Gegensatz zu FaNaCh, welches als Reaktion
auf FMRFamid alleine und nicht auf Säure öffnet (Lingueglia, et al. (1995)).
Die Abfolge von Säure- und FMRFamid-Anwendung
war bedeutsam. Die größten unterhaltenen
Ströme
erfor derten eine FMRFamid-Zugabe vor der Senkung des extrazellulären pH;
eine gleichzeitige Zugabe von FMRFamid und Säure (4Avi)
oder eine Zugabe von FMRFamid bei pH 7,4 und dann Wegwaschen des
FMRFamids bei gleichzeitiger Senkung des pH-Werts, wobei sich daraus nach wie vor
ein unterhaltener Strom ergab (4Av).
Bei in HEK-283T-Zellen exprimiertem ASICα erforderte der maximale unterhaltene
Strom ebenfalls die Zugabe von FMRFamid vor der Säuerung (4Bii und 4Biii);
die Anwendung von FMRFamid nach der pH-Reduktion versagte darin, einen
großen
unterhaltenen Strom hervorzurufen (4Biv).
Daher erforderte eine Modulation die FMRFamid-Zugabe bei pH 7,4, wenn der Kanal geschlossen
war.
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FMRFamid
konnte einen unterhaltenen Strom generieren, selbst wenn es bei
gleichzeitiger Senkung des pH-Werts entfernt wurde (4Av, 4Biii). Ein ähnliches Verhalten wurde bei
durch Säure
hervorgerufenen Strömen
in DRG-Zellen beobachtet (1C und 1D). Die Wirkung der Entfernung von FMRFamid
auf die Badlösung
bei sowohl pH 7,4 als auch pH 5 wurde untersucht. FMRFamid wurde
bei pH 7,4 angewendet, woraufhin das Bad fortgesetzt für 80 Sek.
gewaschen wurde (4Diii). Nach diesem
Zeitraum erzeugte die Säuerung
keinen unterhaltenen Strom (4Div).
Dieses Ergebnis gibt wieder, dass während des Waschgangs von 80
Sek. das Peptid vom Kanal dissoziierte. Wurde der pH-Wert jedoch
bei gleichzeitiger Entfernung des FMRFamids gesenkt, so bestand
der unterhaltene Strom während
des 80-sekündigen Waschgangs
bei pH 5 und darüber
hinaus weiter (4Dv). Diese Ergebnisse
legen nahe, dass die Wirkung von FMRFamid bei pH 7,4 reversibel
ist; ist der Kanal einmal durch Säure aktiviert worden, so bleibt
die Wirkung des FMRFamids aufrechterhalten, bis der pH auf 7,4 zurückgebracht
ist.
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Beispiel 5
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Eigenschaften des durch
pH und FMRFamid erzeugten Stroms
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FMRFamid-Konzentrationen
um 1 μM
riefen nachweisbare unterhaltene Ströme in ASICα exprimierenden Zellen hervor
(5A). Maximale Mengen an unterhaltenem Strom wurden
bei ~ 250 μM FMRFamid
erzielt. Die FMRFamid-Konzentration, die halbmaximale unterhaltene
Ströme
induzierte, war ~ 33 μM.
Diese Konzentration ist höher
als die für FaNaCh
berichtete Konzentration (2 μM)
(Lingueglia, et al. (1995)).
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Es
wurde untersucht, ob FMRFamid die Eigenschaft der vorübergehenden
ASICα-Ströme veränderte und
ob der FMRFamid-generierte unterhaltene Strom Eigenschaften aufwies,
die vom vorübergehenden
Strom verschieden waren. 5B und 5C zeigen, dass der FMRFamid-induzierte
unterhaltene Strom durch Amilorid in Eizellen und HEK293-Zellen gehemmt
wurde. 5D zeigt, dass FMRFamid die pH-Empfindlichkeit
des vorübergehenden
Stroms nicht veränderte.
Der FMRFamid-induzierte unterhaltene Strom zeigte jedoch eine Empfindlichkeit
gegenüber
einem breiteren pH im Vergleich zum vorübergehenden Strom. Dieser breitere
Empfindlichkeitsbereich erlaubt möglicherweise eine abgestuftere pH-Reaktion
auf den FMRFamid-gebundenen Kanal. Dies kann Konsequenzen für die Empfindung
von durch Säure
hervorgerufenem Schmerz haben, da davon ausgegangen wird, dass unterhaltene
Ströme eine
Rolle in der pH-abhängigen
Nozizeption spielen (Bevan, S., und Geppetii, J. (1994). Protons:
small stimulations of capsaicin-sensitive sensory nerves. Trends
Neurosci 17, 509-512).
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Die
Strom-Spannungs-(I-V)-Beziehung des H+-aktivierten
vorübergehenden
Stroms von ASICα zeigte
eine ähnliche
Kationenselektivität
zu der, die zuvor berichtet worden ist (Waldmann, et al. (1997)); die
relativen Durchlässigkeiten
waren: Na+/Li+ =
0,95 ± 0,06,
und Na+/K+ = 6,76 ± 0,40.
Die Leitfähigkeitsabnahme
war für
alle Kationen ähnlich.
Die I-V-Beziehung des Spitzenstroms war in Gegenwart von FMRFamid
nicht verändert
(5E). Der unterhaltene Strom zeigte
eine etwas unterschiedliche Ionenselektivität (5F);
die relative Durchlässigkeit war
Na+/Li+ = 1,05 ± 0,07
und Na+/K+ = 1,25 ± 0,2,
und die Sequenz der Leitfähigkeitsabnahme
war Na+ ≥ Li+ > K+. Der unterhaltene Strom zeigte keine Ca2+-Leitfähigkeit.
Folglich veränderte
FMRFamid die ASICα-Reaktion
auf den pH oder die Eigenschaften des anfänglichen vorübergehenden
Stroms nicht. Allerdings zeigte der unterhaltene Strom eine unterschiedliche
Kationenselektivität
und pH-Reaktion.
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Beispiel 6
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Wirkung von
FMRFamid-artigen Neuropeptiden auf ASICα
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Da
FMRFamid selbst nicht in Säugern
gefunden worden ist, wurde untersucht, ob andere FMRFamid-artige
Peptide ASICα wirksamer
beeinflussen würden.
FMRFamid-artige
Verbindungen, die in Säugern
identifiziert worden sind, einschließlich Neuropeptid FF und A18Famid,
welche mit der Sequenz PQRFamid enden (Perry, S.J., Huang, E.Y.K.,
Cronk, D., Bagust, J., Sharma, R., Walker, R.J., Wilson S., und
Burke, J.F. (1997). A human gene encoding morphine modulating peptides
related to NPFF and FMRFamide, FEBS Lett 409, 426-430; Yang, et
al. (1985)) und Metenkephalin-Arg-Phe (MERF), welches mit FMRF endet,
doch dem das Amid fehlt, wurden getestet. Weder A18Famid noch MERF
veränderten
den ASICα-Strom,
und Neuropeptid FF erzeugte lediglich geringfügigere Wirkungen auf die Inaktivierungsrate,
doch keinen unterhaltenen Strom (6 und unten).
Tests mehrerer der vielen Neuropeptide, die mit RFamid enden und
die in Wirbellosen entdeckt worden sind, wurden durchgeführt (Greenberg,
M.J. und Price, D.A. (1992). Relationships among the FMRF-amid-like
peptides. Prog. Brain. Res. 92, 25-37; Nelson, L.S., Kim, K., Memmott,
J.E. und Li, C. (1998). FMRFamide-related gene family in the nematode,
Caenorhabditis elegans. Mol Brain Res 58, 103-111; Perry, et al.,
(1997); Schneider, et al. (1988)). FLRFamid rief auch einen unterhaltenen Strom
in ASICα hervor,
wenn auch geringer als FMRFamid (6). N-terminale
Verlängerungen
von FLRFamid und anderen RFamid-enthaltenden Peptiden, die in Wirbellosen
identifiziert worden sind, veränderten
ASICα-Ströme in Gegenwart
(6) oder Abwesenheit von Säure nicht. FMRF-OH induzierte keine
Reaktion, was darauf hinweist, dass das C-terminale Amid erforderlich
ist. Diese Ergebnisse sind ähnlich
zu der Neuropeptid-Spezifität,
die für
FaNaCh beobachtet wurde, von der berichtet wurde, die berichtetermaßen lediglich
auf FMRFamid und FLRFamid anspricht (Cottrell, G.A. (1997). The
first peptide-gated ion channel. J Exp Biol 200, 2377-2386). Morphin
wurde getestet, um zu bestimmen, ob es einen unterhaltenen Strom
hervorrufen konnte, und Naloxon, um zu sehen, ob es den FMRFamid-induzierten unterhaltenen
Strom in Xenopus-Ooctyen blockierte. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen
in Ratten-DRG (1B und 1C) veränderten
weder Morphin noch Naloxon den ASICα-Strom (6).
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Beispiel 7
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Unterschiedliche
Effekte von FMRFamid und FRRFamid
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Bei
einem Versuch, mehr über
die Peptid-Spezifität
der säureregulierten
Kanal-Modulation zu
erfahren, wurden mehrere FXRFamid-Peptide getestet. Eines davon,
FRRFamid, zeigte eine ausgeprägte
Verschiedenartigkeit der Spezifität zwischen den säureregulierten
Kanälen
Mit ASICα erzeugten äquivalente
Konzentrationen von FRRFamid einen unterhaltenen Strom ähnlich dem,
der durch FMRFamid erzeugt wurde, obschon er von kleinerer Größe war (7A). Mit ASICβ verlangsamte FRRFamid die Inaktivierungsrate
deutlich, ohne dabei einen ebenso großen unterhaltenen Strom wie
FMRFamid zu generieren (7B). Mit DRASIC
verlangsamten sowohl FRRFamid als auch FMRFamid die Inaktivierung
des vorübergehenden
Stroms und erhöhten
den unterhaltenen Strom, obschon äquivalente Konzentrationen
von FRRFamid eine größere Wirkung
auf vorübergehende
und unterhaltene Ströme
aufwiesen (7C).
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Beispiel 8
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Neuropeptid
FF potenziert den DRASIC-Strom
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Die
unterschiedliche Modulation der verschiedenen säureempfindlichen Ionenkanäle durch verschiedene
Peptide, und der Befund, dass Neuropeptid FF die DRG-Ströme modulierte,
legte nahe, dass dieses Säuger-Neuropeptid
an allen säureempfindlichen
Kanälen
getestet werden sollte. 8A zeigt,
dass die Zugabe von Neuropeptid FF vor der Säuerung die Inaktivierung von
H+-regulierten DRASIC-Strömen verlangsamte.
Interessanterweise waren die Kinetiken der Neuropeptid FF-induzierten Potenzierung
von denen verschieden, die durch FMRFamid induziert wurden. Neuropeptid
FF zeigte schwache Wirkungen auf ASICα-Ströme, indem es die Inaktivierung
verlangsamte, doch keinen nennenswerten unterhaltenen Strom erzeugte
(8B). ASICβ und BNC1 schienen durch die
Neuropeptid FF-Zugabe unbeeinflusst (Daten nicht gezeigt).