DE69534776T2

DE69534776T2 - Klonierung und expression von einer acetylcholin-durchlässigen ionenkanälen rezeptor-untereinheit

Info

Publication number: DE69534776T2
Application number: DE69534776T
Authority: DE
Inventors: Ana Belen Del Mar ELGOYHEN; David S. La Jolla JOHNSON; James Richard San Diego BOULTER; Stephen Fox La Jolla HEINEMANN
Original assignee: Salk Institute for Biological Studies
Current assignee: Salk Institute for Biological Studies
Priority date: 1994-07-21
Filing date: 1995-07-18
Publication date: 2006-10-12
Anticipated expiration: 2015-07-19
Also published as: ATE317434T1; US6646109B1; CA2192694A1; DE69534776D1; US6013766A; US5683912A; EP0765391A1; EP0765391B1; US6100046A; JPH10503091A; WO1996003504A1; CA2192694C

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Interzellulare Kommunikation ist wichtig für die Funktion vielzelliger Systeme. Als Vermittler des Informationstransfers im Gehirn, im endokrinen System, im enteralen Nervensystem und in der neuromuskulären Verbindung modulieren Ionenkanal-Proteine Spannungsänderungen über Zellmembranen hinweg erzeugende Ionenströme und wirken gleichzeitig als Sensoren für physiologische Signale, beispielsweise Änderungen der Ligandenkonzentration und der Transmembran-Spannung. Ligandengesteuerte Ionenkanäle stellen einen schnellen Dialog zwischen Zellen des Zentralnervensystems sicher, indem sie ein durch eine Zelle freigesetztes, chemisches Neurotransmittersignal in ein elektrisches Signal umwandeln, das sich entlang der Zellmembran einer Zielzelle verbreitet. Ligandengesteuerte Ionenkanäle sind multimere Proteinkomplexe mit durch verwandte Gene codierten Untereinheiten-Bestandteilen.
Bis jetzt wurden zahlreiche Familien von ligandengesteuerten Rezeptoren identifiziert und auf der Grundlage von Sequenzübereinstimmung charakterisiert. Zu denen, die kationische Kanäle bilden, gehören z.B. anregende nikotinische Acetylcholin-Rezeptoren (nAChRs), anregende glutamataktivierte Rezeptoren, der 5-HT₃ Serotonin-Rezeptor, der ATP-Rezeptor und der sarcoplasmatische Ryanodin-Rezeptor. Zu den anionische Kanäle bildenden gehören beispielsweise der hemmende GABA-Rezeptor und der glycinaktivierte Rezeptor.
Der Neurotransmitter Acetylcholin (ACh) aktiviert zwei pharmakologisch unterschiedliche Rezeptortypen: nikotinische Acetylcholin-Rezeptoren (nAChR) der ligandengesteuerten Ionenkanal-Superfamilie und muscarinische Acetylcholin-Rezeptoren (nAChR) der G-Protein-gebundenen Rezeptor-Superfamilie (Taylor, A. Goodman-Gilman, T.H. Rail, A.S. Nies und P. Taylor, Hrsg. (New York: Pergamon Press), S. 166–186, 1990); (Taylor, A. Goodman-Gilman, T.H. Rail, A.S. Nies und P. Taylor, Hrsg. (New York: Pergamon Press), S. 122–149, 1990). Eine Anzahl pathologischer Erscheinungen und/oder krankhafter Bedingungen stehen im Zusammenhang mit nAChR, wie beispielsweise Myasthenia gravis, Schizophrenie, Alzheimer-Krankheit, Tourette-Syndrom und Nikotinsucht. Biochemische und elektrophysiologische Daten haben gezeigt, dass nikotinische und muscarinische Rezeptoren funktionell verschiedene Einheiten sind. (Bonner et al., Science, 237, 527–532, 1987). Während nAChR aus verwandten Proteinuntereinheiten zusammengesetzte Pentamere sind, die die Plasmamembran viermal umfassen, bestehen mAChR aus einer einzigen Polypeptidkette, von der angenommen wird, dass sie die Plasmamembran siebenmal umfasst.
Nikotinische Acetylcholin-Rezeptoren, aus fünf Untereinheiten zusammengesetzte Glykoproteine, setzen die Bindung von Acetylcholin im kationischen Kanal um. Die fünf Rezeptor-Untereinheiten bilden einen pseudosymmetrischen Ring um einen zentralen Kanal. Neuronale nikotinische AChR (NnAChR) vermitteln Neurotransmission an vielen zentralen und peripheren Synapsen und umfassen zwei Typen von Untereinheiten (alpha und beta), die durch zehn verschiedene neuronale Gene codiert werden. Expression spezieller Kombinationen der Untereinheiten-RNAs in Oozyten erzeugt biophysikalisch verschiedene Kanäle, die pharmakologisch auf der Grundlage der diese Kanäle modulierenden Liganden unterschieden werden.
Rekombinante DNA-Technik hat die Identifizierung der muskulären nAChR-Untereinheiten alpha1, beta1, gamma, delta und epsilon und der neuronalen Untereinheiten alpha2, alpha3, alpha4, alpha5, alpha6, alpha7, alpha8, beta2, beta3 und beta4 (Ratten-Nomenklatur) von Wirbeltieren ermöglicht. Viele Kombinationen dieser Untereinheiten erzeugen funktionelle, rekombinante Rezeptor-Kanal-Komplexe, die sowohl durch ACh als auch durch Nikotin aktiviert werden. Vom nAChR in einer neuromuskulären Verbindung wird angenommen, dass er eine (α1)₂β1γδ Stöchiometrie (Galzi et al., Annu. Rev. Pharmacol., 31, 37–72, 1991) aufweist. Im Gegensatz dazu führen die neuronalen nAChR-Untereinheiten alpha2, alpha3 und alpha4, im Zusammenspiel mit entweder beta2 oder beta4, zum Zusammenbau funktioneller nAChR (Boulter et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 84, 7763–7767, 1987; Ballivet et al., Neuron, 1, 847–852, 1988; Wada et al., Science, 240, 330–334, 1988; Deneris et al., Neuron, 1, 45–54, 1988; Duvoisin et al., Neuron, 3, 487–496, 1989; Couturier et al., J. Biol. Chem, 265, 17560–17567, 1990), während die neuronalen alpha7 und alpha8-Untereinheiten in Abwesenheit jeglicher anderer Untereinheiten funktionelle nAChR bilden können. (Couturier et al., J. Biol. Chem, 265, 17560–17567, 1990; Seguela et al., J. Neurosci, 13, 596–604, 1993; Gerzanich et al., Molec. Pharmacol., 45, 212–220, 1994).
Vorausgesetzt, es existieren zehn verschiedene Gene für nikotinische Acetylcholin-Untereinheiten, so sind zahlreiche Kombinationen funktionelle Rezeptoren bildender Untereinheiten möglich. Trotz der zahlreichen Untereinheit-Kombinationen, die aus vorher klonierten Genen erzeugt werden können, passen die Eigenschaften der ursprünglichen nAChR nicht immer zu denen der rekombinanten Rezeptoren (Sargent, Annu. Rev. Neurosci., 16, 403–443, 1993). So zeigen beispielsweise die cholinergen Rezeptoren in chromaffinen Rinderzellen und in den Haarzellen der Cochlea von Ratte und Huhn ein pharmakologisches Profil, das zu keiner Kombination bekannter Untereinheiten passt (Shirvan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 88, 4860–4664, 1991; Housley et al., Proc. R. Soc. Lond. B, 244, 161–167, 1991; Fuchs et al., Proc. R. Soc. Lond. B, 248, 35–40, 1992; Erostegui et al., Hearing Res., 74, 135–147, 1994), woraus das Vorkommen weiterer, bisher nicht identifizierter Untereinheiten angenommen werden kann.
Folglich besteht eine Notwendigkeit, zusätzliche Mitglieder der nikotinischen Acetylcholin-Rezeptor-Superfamilie zu identifizieren und diese nAChR-Untereinheiten, genauso wie die daraus aufgebauten, funktionellen Rezeptoren, zu charakterisieren, wozu auch die Aufklärung der Art und Weise des Einbaus verschiedener Untereinheiten bei der Bildung funktioneller Rezeptoren (d.h. eines Untereinheit-Aufbaus, der Liganden-Bindungsstellen und einen ligandengesteuerten Transmembrankanal beinhaltet) sowie der Zusammenhang zwischen der Struktur des Untereinheit-Aufbaus und dem pharmakologischen Profil des entsprechenden Rezeptors gehören. Die vorliegende Erfindung entspricht diesem Bedarf und schafft auch die damit zusammenhängenden Vorteile.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt isolierte, eine alpha9-nikotinische Acetylcholin-Rezeptor(nAChR-)Untereinheit codierende Nucleinsäuren, ein isoliertes, dadurch codiertes Rezeptor-Untereinheit-Protein sowie einen rekombinant exprimierten alpha9-nikotinischen Acetylcholin-Rezeptor (nAChR) zur Verfügung. Darüber hinaus werden diese Nucleinsäuren beinhaltende Vektoren und Sonden, mit diesen Nucleinsäuren transformierte Wirtszellen, Antisense-Oligonucleotide und diese Oligonucleotide beinhaltende Zusammensetzungen, spezifisch an die Rezeptoren der Erfindung bindende Antikörper sowie diese Antikörper beinhaltende Zusammensetzungen und transgene, nicht-humane Säugetiere bereitgestellt.
Die alpha9-nAChR-Untereinheiten der Erfindung bilden einen kationischen Rezeptor-Kanal-Komplex, der durch Acetylcholin aktiviert wird und durchlässig ist für Kationen, inklusive Kalzium. Erfindungsgemäße funktionelle alpha9-nACh-Rezeptoren können als homomere Rezeptoren exprimiert sein, d.h., dass nur ein Untereinheit-Typ für die Funktion nötig ist, stattdessen können die erfindungsgemäßen Rezeptoren auch als heteromere Rezeptoren exprimiert sein, wobei mehr als ein Untereinheit-Typ benötigt wird, um einen funktionellen Rezeptor zu bilden. Zusätzlich stellt die Erfindung Verfahren zur Verfügung, um Verbindungen zu identifizieren, die die Aktivität der erfindungsgemäßen Rezeptoren oder die Aktivität von Nucleinsäuren, die diese Rezeptoren codieren, modulieren.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Nucleotid- und Aminosäuresequenz des cDNA-Klons, der die alpha9-nAChR-Untereinheit codiert. Die Aminosäuresequenz wird unterhalb der Nucleotidsequenz dargestellt. Spaltung des Signalpeptids wird an Aminosäureposition 1 vorhergesagt (Von-Heijne, Nucl. Acid. Res., 14, 4683–4691, 1986). Das Signalpeptid codierende Aminosäuren sind mit negativen Zahlen versehen. Nucleotide sind, beginnend mit dem ersten Nucleotid des Codons für den angenommenen N-terminalen Rest des reifen Proteins, in 5'-3'-Richtung nummeriert. Nucleotide auf der 5'-Seite des Aminosäurerests 1 werden mit negativen Zahlen angezeigt. Pfeilspitzen zeigen die durch genomische Sequenzierung bestimmte Intron-Position an. Membranübergreifende Regionen sind unterstrichen. Die Sequenzinformation, die in 1 gezeigt wird, wird auch in PatentIn-Format in SEQ ID NO: 1 und 2 dargestellt.
2A zeigt die Restriktionskarte des alpha9-Untereinheit-Gens und 2B zeigt eine partielle Restriktionskarte für überlappende genomische Klone M6 und MNANO, die die gesamte codierende Sequenz des alpha9-Untereinheit-Gens abdecken. NcoI und NheI Restriktionsstellen sind in pMNANO und Sac1 Restriktionsstellen in pM6 nicht kartiert.
3 zeigt die Gegenüberstellung der Aminosäuresequenzen der bekannten nAChR-alpha-Untereinheiten. Alle Sequenzen entsprechen den Ratte-Untereinheiten, außer alpha8, die eine Huhn-Untereinheit ist. In allen Sequenzen identische Reste sind als weiße Buchstaben auf schwarzem Hintergrund dargestellt. Leerzeichen sind eingeführt, um die Homologien zu vergrößern. Vorhergesagte Signalpeptide und die vier potentiell membranübergreifenden Bereiche werden angezeigt. Sternchen bezeichnen die in allen nAChR-alpha-Untereinheiten konservierten Cysteinreste 127, 141, 191 und 192 (alpha9-Nummerierung des reifen Peptides, enthält nicht die 28 das Signalpeptid umfassenden Aminosäurereste).
4A und 4B zeigen die elektrophysiologischen Reaktionen der alpha9-beimpften Oozyten gegenüber cholinergen Agonisten. 4A zeigt die Strom-Reaktionen die ACh, Nikotin, Muscarin, 1,1-Dimethyl-4-Phenylpiperazin (DMPP) und Oxotremorin-M (OXO-M) in alpha9-cRNA-beimpften Oozyten hervorrufen, die bei –50 mV in einer Spannungsklammer gehalten wurden.
4B zeigt die Kurven für die Konzentrations-Reaktion auf ACh, DMPP und OXO-M. Die gezeigten Werte sind der Mittelwert und der Standardfehler des Mittelwertes der Spitzenstromwerte in mindestens vier Oozyten pro Wirkstoff. Fehlerbalken werden nicht dargestellt, wenn der Standardfehler kleiner als das Symbol ist. Reaktionen einer jeden Zelle wurden gegenüber dem größten, durch ACh hervorgerufenen Strom normalisiert. Die HiII-Gleichung (EC₅₀ = 9,7 μM; Steigung = 1,3) wurde an die ACh-konzentrationsreaktive Kurve angepasst.
5A und 5B zeigen die Blockade der ACh-Reaktion durch verschiedene Antagonisten in alpha9-beimpften Oozyten. Inhibitionskurven wurden durch gemeinsame Verabreichung von 10 μM ACh und ansteigende Konzentrationen von entweder (–) Nikotin oder (+) Muscarin (siehe 5A) und Strychnin, d-Tubocurarin (d-TC) oder Atropin (siehe 5B) durchgeführt. Reaktionen werden als Prozentanteil (%) des durch 10 μM ACh hervorgerufenen Kontrollstroms wiedergegeben. Der Mittelwert und der Standardfehler des Mittelwertes der Werte aus mindestens vier verschiedenen Oozyten pro Wirkstoff werden gezeigt. Fehlerbalken werden nicht dargestellt, wenn der Standardfehler kleiner als das Symbol ist.
6 zeigt die Sensitivität gegenüber α- und κ-Bungarotoxin der durch ACh hervorgerufenen Ströme in alpha9-beimpften Oozyten. Repräsentative Reaktionen auf 100 μM Ach, aufgezeichnet bei einem Haltepotential von –50 mV, sind dargestellt. Oozyten wurden vor der Verabreichung der zweiten Testkonzentration von ACh 30 Minuten lang mit α-Bungarotoxin (α-BTX, A) oder κ-Bungarotoxin (κ-BTX, B) inkubiert.
7A bis 7C zeigen die Spannungsabhängigkeit der durch ACh hervorgerufenen Ströme in alpha9-beimpften Oozyten und Ca²⁺-Permeabilität des rekombinanten alpha9-Rezeptors. In 7A wurde der Stromstärke-Spannungs-Zusammenhang der durch ACh hervorgerufenen Ströme in alpha9-beimpften Oozyten durch Anwendung einer Stromstärkensteigerung (2 Sekunden Dauer, +50 mV bis –120 mV) während der Plateauphase der Stromstärkereaktion bestimmt. Die Verläufe sind repräsentativ für jene, die für vier verschiedene Oozyten ermittelt wurden.
7B zeigt repräsentative Stromverläufe, die in alpha9-exprimierenden Oozyten vor und nach der Injektion von 50nl 20mM 1,2-bis(2-Aminophenoxy)-Ethan-N,N,N¹,N¹-Tetraessigsäure (BAPTA) durch 100 μM ACh bewirkt wurden.
7C zeigt durch ACh hervorgerufene Ströme in alpha9-beimpften Oozyten, die bei –10 mV in einer Spannungsklammer gehalten und mit einer 350mM NaCl beinhaltenden Ringer-Lösung gebadet wurden.
8 zeigt Detektion von alpha9-Transkripten in der Ratten-Cochlea. Vervielfältigungsreaktionen wurden, wie in Beispiel VI beschrieben, unter Verwendung von aus einer vollständigen RNA transkribierter cDNA als Matrize und alpha9-spezifischen Primern durchgeführt. Gezeigt wird die Auflösung der amplifizierten Produkte in einem mit Ethidiumbromid gefärbten 1,5%igen Agarosegel. Ein 10 μM – Aliquot jedes Reaktionsgemischs wurde pro Spur geladen. Spur 1, DNA-Leiter; Spur 2, keine DNA-Matrize; Spur 3, vervielfältigtes Produkt aus Riechepithel-cDNA; Spur 4, vervielfältigtes Produkt aus Riechepithel-cDNA; Spur 5, vervielfältigtes Produkt aus Ischiasnerv-cDNA.
9A bis 9F zeigen die Ergebnisse von in-situ-Hybridisierung von Sagittalschnitten von Rattenembryonen und Koronarschnitten von erwachsenen Gehirnen sowie die Identifizierung und Transkriptlokalisierung von alpha9. 9A und 9B zeigen die Anwesenheit von alpha9-Transkripten in der Hirnanhangdrüse, dem Riechepithel, dem Zungenbodenmuskel und der Zunge eines Rattenembryos in Entwicklungsstufe E16. 9C und 9D zeigen eine Ansicht mit großer Vergrößerung der Hypophyse in einem Rattenembryo in Entwicklungsstufe E16, in der alpha9-Transkript im Pars tuberalis, jedoch nicht im Pars distalis oder dem Pars nervosa lokalisiert ist. 9E und 9F zeigen die Anwesenheit des alpha9-Transkripts im Pars tuberalis des erwachsenen Rattengehirns.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Molekulare Klonierungsstudien haben die strukturelle und funktionelle Diversität nikotinischer Acetylcholin-Rezeptoren (nAChRs) gezeigt. Bis heute wurden im Nervensystem von Wirbeltieren sieben alpha-Untereinheiten (alpha2 bis alpha8) und drei beta-Untereinheiten (beta2 bis beta4) charakterisiert. Die vorliegende Erfindung beschreibt die Identifizierung und funktionelle Charakterisierung eines neuen Mitglieds dieser Familie von Rezeptor-Untereinheit-Genen, die durch den Neurotransmitter Acetylcholin (ACh) aktiviert werden. Das neue Mitglied wird als alpha9 bezeichnet. Die molekulare Struktur von alpha9 zeigt an, dass es eher zur ionotrophen (nikotinischen) als zur metabotrophen (muscarinischen) ACh-Rezeptorfamilie gehört. Dennoch weichen die gemischten nikotinisch-muscarinischen Eigenschaften des rekombinanten alpha9-Rezeptors vom pharmakologischen Profil aller bekannten funktionellen nikotinischen Rezeptoren ab.
Isolation und Identifizierung des neuartigen nAChR-Untereinheit-Gens der vorliegenden Erfindung wurde über Screening einer genomischen Rattenbibliothek, unter Verwendung einer Ratten-nAChR-alpha7-Untereinheit-cDNA als Sonde, erreicht. DNA-Sequenzanalyse zeigte, dass ein isolierter, genomischer Klon ein Protein mit signifikanter Aminosäuresequenzidentität zu Mitgliedern der ligandengesteuerten Ionenkanal-Gen-Superfamilie codierte. Seine Homologie zu bekannten Untereinheiten zeigte, dass es näher mit nAChR-Untereinheiten als mit GABA_A, Glycin oder 5-HT₃ Rezeptor-Untereinheiten verwandt war. Die Anwesenheit konservierter, zusammenhängender Cysteinreste, die ein Kennzeichen aller nAChR-alpha-Untereinheiten sind und von denen angenommen wird, dass sie ein Teil der Acetylcholin-Bindungsdomäne sind (Popot und Changeux, Physiol. Rev. 64, 1162–1193, 1984), in der extrazellulären Domäne, legt nahe, dass dieses Gen eine nAChR-alpha-Untereinheit kodierte. Daher wurde diese neuentdeckte Untereinheit, gemäß gängiger Nomenklatur, als die alpha9-Untereinheit der nAChR-Genfamilie bezeichnet.
Ein aus dem isolierten, genomischen Klon hergeleitetes Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)-Fragment wurde verwendet, um eine cDNA-Bibliothek des Riechepithels der Ratte zu screenen. Vier unabhängige cDNA-Klone wurden isoliert, von denen einer einen 1937 bp langen Einschub aufwies, der einen offenen Leserahmen für die alpha9-Untereinheit codierte. Die Nucleotid- sowie die abgeleiteten Aminosäuresequenzen sind in 1 gezeigt (und auch im PatentIn-Format in SEQ ID NO: 1 und 2 wiedergegeben). Die Volllängen-alpha9-cDNA kodiert ein reifes Protein mit 451 Aminosäureresten, denen eine Leitsequenz aus 28 Resten voransteht. Es weist alle Merkmale auf, die für die anderen Mitglieder der nAChR-Genfamilie charakteristisch sind, inklusive der in allen nAChR-alpha-Untereinheiten vorkommenden vier hydrophoben Bereiche, die potentiell membranübergreifende Bereiche MSR I bis IV (Kyte und Doolitle, J. Mol. Biol., 157, 105–132, 1982) vorhersagen sowie Cysteinreste an den Positionen 127, 141, 191 und 192 (alpha9-Nummerierung des reifen Peptids, ohne die 28 Aminosäurereste, die das Signalpeptid umfassen).
Die Volllängen-alpha9-cDNA wurde als Sonde zum Screenen von zwei genomischen, in die Phagenvektoren LambdaDASH II und LambdaFIX II eingebauten Mausbibliotheken verwendet. Man erhielt zwei überlagernde, genomische Klone (siehe 2). Diese, die gesamte codierende Sequenz des alpha9-Untereinheit-Gens abdeckenden Klone, wurden in Plasmidvektoren kloniert und die alpha9-Untereinheit-Genstruktur, durch Sequenzierung über die Intron-Exon-Grenzen hinweg, bestimmt. Die Intron-Exon-Grenzen des alpha9-Gens sind in 1 markiert. Das Gen besteht aus fünf Exonen und weist eine Intron-Exonstruktur auf, die von der aller bekannten nAChR-Gene abweicht (Noda et al., Nature, 305, 818–823, 1983; Nef et al., EMBO J., 7, 595–601, 1988; Wada et al., Science, 240, 330–334, 1988; Buonanno et al., J. Biol. Chem., 264, 7611–7616, 1989; Boulter et al., J. Biol. Ghem, 265, 4472–4482, 1990). So sind beispielsweise im Gegensatz zu anderen nAChR-Untereinheit-Genen mit konservierten Intron-Exon-Grenzen der ersten vier Exonen die Exone III und IV des alpha9-Gens verschmolzen.
Der alpha9-cDNA-Klon wurde sequenziert und die Sequenz mit den Sequenzen der anderen nAChR-alpha-Untereinheiten (siehe 3) verglichen. Basierend auf Sequenzähnlichkeit scheint die alpha9-Untereinheit ein entferntes Mitglied der nAChR-Untereinheit-Genfamilie zu sein. Sie unterscheidet sich von der neuronalen alpha7-alpha8-Unterfamilie (38% Aminosäuresequenz-Übereinstimmung) ebenso wie von der neuronalen alpha2- bis alpha6-Unterfamilie (36–39%) oder der muskulären alpha1-Untereinheit (37%). Obwohl alpha9 die höchstkonservierten Sequenzelemente mit anderen Mitgliedern der Familie teilt, weichen einige Aminosäurereste von den in anderen alpha-Untereinheiten als unveränderlich befundenen ab. So sind zum Beispiel die konservierten, hydrophoben Reste Phe-99 und Va1-230 (alpha9-Nummerierung des reifen Peptids, ohne die 28 Aminosäurereste die das Signalpeptid bilden) im alpha9-Protein gegen die polaren Reste Ser-99 und Ser-230 ausgetauscht und der konservierte, positiv geladene Rest Lys-144 durch den ungeladenen Rest Thr-144 ersetzt. Die hydrophoben Reste Leu-255 (alpha1- bis alpha6-Untereinheiten) oder Met-255 (alpha7-/alpha8-Untereinheiten), die in MSR II vorkommen, sind in der alpha9-Untereinheit durch die polare Aminosäure Gln-255 ersetzt. Verglichen mit den anderen nAChR-Untereinheiten weist alpha9 zusätzlich die Deletion eines Thr-Rests zwischen MSR II und MSR III auf.
Eine für Expressionsstudien in Xenopus-Oozyten geeignete Volllängen-alpha9-cDNA wurde über Subklonierung des Fragments von Nucleotid –94 bis 1766 (1; d.h. Reste 79 bis 1938, wie in SEQ ID NO:1 wiedergegeben) in den Expressionsvektor pGEMHE (Liman et al., Neuron, 9, 861–871, 1992) konstruiert. cRNA wurde unter Verwendung des mMessage-mMachine-Transkriptions-Kits (Ambion, Austin, TX), mit einem mit NheI linearisierten Plasmid erzeugt.
Zwei Tage nach der Injektion von alpha9-cRNA reagierten mehr als 95% der spannungsgeklammerten Xenopus-Oozyten auf Acetylcholin. Nach innen gerichtete Ströme als Reaktion auf 100 μM Acetylcholin reichten von 20 bis 500 nA. 4A zeigt für die Gabe von Acetylcholin repräsentative Stromverläufe. Hohe Konzentrationen (>10 μM ) dieses Agonisten bewirkten eine schnelle Reaktionsspitze, die schnell auf einen Plateaulevel zurückfiel. Oozyten, die alpha9 exprimierten, waren gegenüber Glutamat, GABA, Glycin, Serotonin, ATP, Histamin und Adenosin nicht sensitiv.
Alle vor der Klonierung der alpha9-Untereinheit klonierten, funktionellen nAChR-alpha-Untereinheiten bilden bei der Expression in Xenopus-Oozyten entweder heteromere oder homomere, durch Nikotin aktivierte Rezeptor-Kanalkomplexe (Boulter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7763–7767, 1987; Duvoisin et al., Neuron, 3, 487–496, 1989; Couturier et al., Neuron, 5, 847–856, 1990; Luetje und Patrick, J. Neurosci. 11, 837–845, 1991; Seguela et al., J. Neurosci., 13, 596–604, 1993; Gerzanich et al., Molec. Pharmacol., 45, 212–220, 1994). Erstaunlicherweise rief Nikotin (0,1 μM bis 1 mM ) in alpha9-beimpften Oozyten keine Reaktion hervor (4A). Gemeinsame Expression von alpha9 zusammen mit entweder beta2- oder beta4-nAChR-Untereinheiten führte nicht zur Bildung von Rezeptor-Kanälen, die durch Nikotin aktiviert wurden. Der alpha9-Rezeptor-Kanalkomplex wurde auch nicht durch Muscarin aktiviert (4A). Darüber hinaus bewirkten weder der nikotinische Agonist Cytosin noch die muscarinischen Agonisten Bethanecol und Pilocarpin Stromreaktionen. Trotzdem bewirkte sowohl der nikotinische Agonist 1,1-Dimethyl-4-Phenylpiperazin (DMPP) als auch der muscarinische M1-Agonist Oxotremorin M(OXO-M) nach innen gerichtete Ströme in alpha9-beimpften Oozyten (4A). 4B zeigt die Konzentrations-Reaktions- Kurven gegenüber diesen cholinergen Agonisten. Acetylcholin hatte eine offensichtliche Affinität (EC₅₀) von 10μM. Die maximalen, sowohl durch DMPP als auch OXO-M bewirkten Spannungsreaktionen lagen bei ungefähr 5% der bei Acetylcholin beobachteten.
Obwohl weder Nikotin noch Muscarin Reaktionen in alpha9-cRNA-beimpften Oozyten bewirkte (siehe 4A), verringerten diese beiden klassischen cholinergen Agonisten die durch Acetylcholin hervorgerufenen Ströme. 5A zeigt die Hemmungskurve, die sich aus der gemeinsamen Gabe von 10μM Acetylcholin und steigenden Konzentrationen von entweder Nikotin oder Muscarin (IC₅₀ = 30 μM bzw. 75 μM) ergab. Wie in 5B gezeigt, wurde der alpha9-Rezeptor-Kanalkomplex auch durch den nikotinischen Antagonisten d-Tubocurarin (IC₅₀ = 0,3 μM) ebenso wie durch den muscarinischen Antagonisten Atropin (IC₅₀ = 1,3 μM) blockiert. Das Alkaloid Strychnin, klassischerweise als Blocker der Glycingesteuerten Chlorid-Kanäle verwendet, zeigte sich, mit einer IC₅₀ von 0,02 μM (5B), als wirkungsvoller Antagonist der alpha9-Homomere. Sowohl α-Bungarotoxin (100 nM) als auch κ-Bungarotoxin (100 nM) blockierte Reaktionen auf 100 μM Acetylcholin (6). Die Blockade durch diese Toxine war nach 10-minütiger Spülung der Oozyten mit Frosch-Ringerlösung fast vollständig aufgehoben.
Elektrophysiologische Eigenschaften wurden an den alpha9-beimpften Oozyten 2–7 Tage nach der Injektion bestimmt. Der Zusammenhang zwischen Spannung und Stromstärke (I–V), der durch Anwendung einer Zwei-Sekunden-Spannungssteigerung in der Plateaureaktion gegenüber Acetylcholin ermittelt wurde, ist in 7A dargestellt. Die I-V-Kurve war nicht-linear und wies einen maximalen, durch Acetylcholin hervorgerufenen, nach innen gerichteten Strom bei –50 mV auf. Stromreaktionen wurden bei negativen Potentialen von bis zu –50mV reduziert. Die Tatsache, dass das Verhältnis zwischen dem nach innen gerichteten, durch 100 μM Acetylcholin und durch 1 μM Acetylcholin ausgelösten Strom bei –50 mV (2,1) größer als bei –80 mV (1,0) war, bedeutet, dass die Reduzierung der Stromreaktionen bei hyperpolarisierten Potentialen von der Agonistenkonzentration abhängen dürfte. Bei Haltepotentialen positiver als –50 mV wird der durch Acetylcholin aktivierte, nach innen gerichtete Strom bis auf –25 mV verringert, wobei bis zu einem Haltepotential von +20 mV eine starke Gleichrichtung beobachtet wurde. Durch schrittweisen Anstieg im Haltepotential ermittelte I–V-Kurven für Spitzen- und Plateaureaktionen hatten die gleiche Form wie in 7A gezeigt.
Aus den I-V-Zusammenhängen wird ein offensichtliches Umkehrpotential von –25 mV geschätzt. Dieser Wert passt entweder zu einem nicht-selektiven kationischen Strom oder zu einem anionischen (Cl^–) Strom. Die Veränderung der äußeren NaCl-Konzentration von 50 mM bis 150 mM erzeugte eine positive Verschiebung des Umkehrpotentials der Acetylcholin-induzierten Ströme. Dies weist darauf hin, dass der alpha9-Kanal für Na⁺ durchlässig ist. Die meiste der durch 100 mM Acetylcholin hervorgerufenen Spitzenreaktion der alpha9-exprimierenden Oozyten verschwand, sobald der Kalzium-Chelatbildner 1,2-bis (2-Aminophenoxy)Ethan-N,N,N¹,N¹-Tetraessigsäure (BAPTA) in die Oozyten injiziert wurde (siehe 7B). Wie schon für andere nAChR-Untereinheiten (Gerzanich et al., Molec. Pharmacol., 45, 212–220, 1994) angenommen, zeigt dieses Ergebnis also, dass ein Teil des durch Acetylcholin hervorgerufenen Stroms durch einen Cl^–-Strom durch Ca²⁺-aktivierte Cl^–-Kanäle, die bekanntlich in Oozyten vorkommen (Miledi und Parker, J. Physiol. (Lond)., 357, 173–183, 1984) transportiert wird. Um die Beteiligung eines Ca²⁺-aktivierten Cl^–-Stroms an der Reaktion auf Acetylcholin zu überprüfen, wurde das Umkehrpotential von Cl^– und Na⁺ in entgegengesetzte Richtungen verschoben, indem die äußere NaCl-Konzentration vorübergehend auf 350 mM gesteigert und die Oozyten bei –10 mV unter einer Spannungsklammer mit zwei Elektroden gehalten wurden. Unter dieser Bedingung riefen 100 μM Acetylcholin einen nach außen gerichteten, gefolgt von einem nach innen gerichteten Strom hervor (7C). Wie von anderen neuronalen nAChR berichtet (Vernino et al., Neuron, 8, 127–134, 1992; Seguela et al., J. Neurosci., 12, 596–604, 1993), resultiert der nach innen gerichtete Strom wahrscheinlich aus dem Einfließen von Kationen durch alpha9-Rezeptor-Kanäle und der nach außen gerichtete Strom aus dem Fluss von Cl^– durch Ca²⁺-aktivierte Cl^–-Kanäle. Es sollte festgehalten werden, dass I-V-Kurven, die für Oozyten, in die 1,2-bis(2-Aminophenoxy)Ethan-N,N,N¹,N¹-Tetraessigsäure injiziert wurde, ermittelt wurden, die gleiche wie oben beschriebene Form hatten und dadurch nahegelegt wird, dass der Cl^–-Strom unter den Versuchbedingungen nicht zur I-V-Kurve beitrug.
Die oben beschriebenen Xenopus-Oozyten-Expressionsstudien zeigen, dass die alpha9-Protein-Untereinheit durch Acetylcholin aktivierte und sowohl für Na⁺ als auch für Ca²⁺ durchlässige Ionen-Kanäle bildet. Wie neuronale alpha7- und alpha8-Untereinheiten (Couturier et al., Neuron, 5, 847–856, 1990; Gerzanich et al., Molec. Pharmacol., 45, 212–220, 1994) kann auch alpha9 in einen homomeren Rezeptor-Kanal-Komplex eingebaut werden. Dies weicht von anderen funktionellen, neuronalen nAChR-alpha-Untereinheiten ab, die den Einbau gemeinsam mit einer beta-Untereinheit voraussetzen, um Rezeptor-Kanalkomplexe zu bilden (Boulter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7763–7767, 1987; Ballivet et al., Neuron 1, 847–852, 1988; Wada et al., Science, 240, 330–334, 1988).
Durch Acetylcholin in alpha9-beimpften Oozyten hervorgerufene Ströme nahmen bei negativen Haltepotentialen von bis zu –50mV ab. Dies könnte das Ergebnis einer spannungsabhängigen Blockade des Kanals, entweder durch Acetylcholin oder durch die Kationen in der für die Erhaltung der Oozyten verwendeten Lösung, sein. Die Tatsache, dass die Blockierung bei hohen Agonistenkonzentrationen stärker hervortrat, zeigt an, dass zumindest ein Teil dieses Effekts auf die spannungsabhängige Kanalblockierung durch Acetylcholin zurückzuführen ist. Hohe Acetylcholin- und Carbamylcholinkonzentrationen sind dafür bekannt, eine spannungs- und konzentrationsabhängige Kanalblockierung muskulärer nAChR in BC₃H-1-Zellen zu bewirken (Sine und Steinbach, Biophys. J., 46, 277–284, 1984).
Aufgrund seiner Primärstruktur und der elektrophysiologischen Eigenschaften gehört das alpha9-Protein zu der nikotinischen Familie der ligandengesteuerten Ionenkanäle, die auch Untereinheiten für nAChR, GABA_A, Glycin und 5-HT₃-Rezeptoren beinhaltet. Jedenfalls blockierten, wie vorher beschrieben, in alpha9-beimpften Oozyten Nikotin, Muscarin, d-Tubocurarin und Atropin die durch Acetylcholin hervorgerufene Stromreaktion. Daher fällt der alpha9-Rezeptor-Kanalkomplex weder in die nikotinische noch die muscarinische Untergruppe des pharmakologischen Klassifikationsschemas der cholinergen Rezeptoren (P. Taylor in The pharmacological basis of therapeutics, A. Goodman-Gilman, T.H. Rall, A.S. Nies und P. Taylor, Hrsg. (New York: Pergamon Press), S. 122–149 und 166–186, 1990). Der Befund, dass sowohl der nikotinische Agonist DMPP als auch der muscarinische Agonist OXO-M in der Lage ist, Stromreaktionen in alpha9-beimpften Oozyten zu bewirken, zeigt an, dass der alpha9-Rezeptor eine gemischte, nikotinisch-muscarinische Pharmakologie aufweist. Darüber hinaus ist die Blockade der alpha9-Rezeptoren durch den Glycin-Rezeptor-Antagonisten Strychnin ungewöhnlich. Ein ähnlicher Effekt von Strychnin wurde auch für in Xenopus-Oozyten exprimierte alpha7- und alpha8-Homomere berichtet (Seguela et al., J. Neurosci., 12, 596–604, 1993; Gerzanich et al., Molec. Pharmacol., 45, 212–220, 1994).
Die alpha9-Protein-Untereinheit beinhaltet die am stärksten konservierten Aminosäurereste innerhalb der vorgeschlagenen Acetylcholin-Bindungsstelle der nAChR-alpha-Untereinheiten (Dennis et al., Biochem, 27, 2346–2357, 1988; Galzi et al., J. Biol. Chem., 265, 10430–10437, 1990). Dennoch liegen zwei nicht-konservative Ersetzungen im alpha9-Protein, Phe-99 durch Ser und Lys-144 durch Thr (Positionsnummern beziehen sich auf das reife Protein, ohne die 28 Reste der Leitsequenz) in der Nähe der ersten und zweiten Domäne der angenommenen Agonisten-Bindungsstelle des nAChR. Diese Aminosäureersetzungen sind wahrscheinlich verantwortlich für die unterschiedlichen pharmakologischen Eigenschaften des alpha9-Rezeptor-Kanalkomplexes.
Um das Expressionsmuster des alpha9-Gens in Geweben zu bestimmen, wurden in-situ-Hybridisierungsstudien durchgeführt. Aus der codierenden Sequenz des genomischen alpha9-Klons wurde in vitro synthetisierte RNA abgeleitet und Sagittalschnitte von Rattenembryonen und Koronarschnitte erwachsener Rattengehirne damit hybridisiert. Die Anwesenheit von Transkripten wurde in der Hypophyse eines Rattenembryos in der Entwicklungsstufe E16 (siehe 9B und 9D) festgestellt. Es wurde beobachtet, dass die alpha9-Genexpression auf den Pars tuberalis der Adenohypophyse begrenzt ist, wobei der Pars distalis und die Neurohypophyse kein detektierbares Signal zeigen. Die Anwesenheit von alpha9-mRNA wurde auch im erwachsenen Pars tuberalis der Ratte und der ventralen Oberfläche der Medianuserhebung (siehe 9F) beobachtet. Alpha9-Expression wurde auch in der Geruchsschleimhaut der E16-Ratte beobachtet (siehe 9B). Die alpha9-Transkripte wurden im pseudostratifizierten Stäbchenepithel, das jede der gewundenen Flächen des Riechorgans überzieht, entdeckt. Zusätzliche Expression wurde in der Zunge der sich entwickelnden Ratte festgestellt (9B). Schließlich bewirkten in-situ-Hybridisierungsanalysen auf 20 mm Koronarschnitten, die alle 180 mm durch das erwachsene Hirn angelegt wurden, keine alpha9-Genexpression im Zentralnervensystem der Ratte.
In-situ-Hybridisierungsstudien an Kryostatschnitten der Ratten-Cochlea zeigen an, dass das alpha9-Gen auch in den äußeren Haarzellbereichen aller Cochlea-Windungen exprimiert wird. Keine Expression des alpha9-Gens wurde in den Neuronen des Ganglion spirale oder anderen Stützstrukturen der Cochlea (siehe 9B) festgestellt.
Von bereits früher publizierten, neuronalen nAChR-Genen wird die Expression im Zentralnervensystem von Wirbeltieren berichtet (Sargent, Annu. Rev. Neurosci., 16, 403–443, 1993). Wie oben offenbart, bewirkten die in-situ-Hybridisierungsstudien in Koronarschnitten durch das Rattenhirn keine alpha9-Genexpression im Zentralnervensystem. Obwohl niedrige Mengen von alpha9-Transkripten oder ein sehr begrenztes Expressionsmuster, das sich der Detektion entzog, nicht ausgeschlossen werden können, legen die Ergebnisse doch nahe, dass alpha9, relativ zu anderen nAChR-Untereinheiten gesehen, nur an einem begrenzten Teil cholinerger Funktionen in vivo beteiligt ist. in-situ-Hybridisierungsstudien zeigen, dass das alpha9-Untereinheit-Gen in der Ratte im Pars tuberalis der Hypophyse, dem Riechepithei, den äußeren Haarzellen der Cochlea und im Skelettmuskel der Zunge exprimiert wird.
Der Pars tuberalis bildet einen anatomisch klar definierten Teil des Hypophysenvorderlappens (Adenohypophyse), der aus gonadotropen und thyreotropen, peptidausschüttenden Zellen besteht (Wittkowski et al., Acta Endocrinol., 126, 285–290, 1992). Neuroendokrine Effekte, wie z.B. die Hemmung der Ausschüttung von Progesteron und schilddrüsenstimulierender Hormone nach Nikotingabe, wurden bei Mensch und Ratte berichtet (Fuxe et al., Psychoneuroendocrinol., 14, 19–41, 1989). Obwohl diese Wirkungen der Aktivierung der nAChR des Hypothalamus zugeschrieben wurden, weist das Vorkommen der alpha9-nAChR-Untereinheit in der Hypophyse darauf hin, dass Nikotin diese Drüse unmittelbar beeinflussen kann.
Es ist eher so, dass sensorische Geruchszellen über efferente Innervation verfügt, die die Geruchsfunktionen abstimmt (Shirley, Olfaction. Intl. Rev. Neurobiol., 33, 1–53, 1992). Da die Gabe von Acetylcholin langsame elektrische Potentiale verursacht und nadelförmige Impulsaktivität der Neuronen der Geruchsrezeptoren verbessert, wird eine cholinerge Regulation angenommen (Bouvet et al., Neurosci. Res., 5, 214–223, 1988). Obwohl eine weitergehende pharmakologische Charakterisierung der Reaktion von Geruchsneuronen auf Acetylcholin ebenso wie eine genauere Lokalisierung der alpha9-Untereinheit innerhalb des Riechepithels nötig ist, könnte das Vorkommen von alpha9-Transkripten im Riechepithel die molekulare Grundlage für die beschriebenen cholinergen Wirkungen bilden.
Die alpha9-Genexpression im sich entwickelnden Zungenmuskel ist verblüffend. Mit den durchgeführten in-situ-Hybridisierungsstudien ist es nicht möglich zu unterscheiden, ob das Signal genau in den Muskelfasern oder im umgebenden Verbindungsgewebe lokalisiert ist. Dennoch scheinen die alpha9-Transkripte nicht in allen sich entwickelnden Skelettmuskeln vorzukommen. So gaben in-situ-Hybridisierungsstudien, die in Sagittalschnitten der Körpermitte von Rattenembryonen durchgeführt wurden, keine Hinweise auf alpha9-Transkripte in den Interkostal- oder Axialmuskel.
Alle pharmakologischen Merkmale des homomeren, in Oozyten exprimierten alpha9-Rezeptors unterscheiden sich von denen anderer klonierter nAChR (Boulter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7763–7767, 1987; Ballivet et al., Neuron, 1, 847–852, 1988; Wada et al., Science, 240, 330–334, 1988; Couturier et al., Neuron, 5, 847–856, 1990; Gerzanich et al., Molec. Pharmacol., 45, 212–220, 1994).
Um die Expressionsmuster des alpha9-Gens in der Ratten-Cochlea weiter zu untersuchen, wurde PCR mit aus der Gesamt-RNA der Cochlea revers transkribierter cDNA durchgeführt. Zwei für die alpha9-Sequenz spezifische Primer wurden entworfen und verwendet, um ein eine Intron-Exon-Grenze des alpha9-Gens übergreifendes Fragment zu vervielfältigen. Wie in 8 gezeigt, wurde mit alpha9-Primern ein Fragment der erwarteten Länge (573 bp) aus der cDNA der Ratten-Cochlea vervielfältigt. Die Analyse des Fragments mit den Restriktionsendonukleasen AccI, HinfI und NcoI bestätigte darüber hinaus, dass es vom alpha9-Transkript abgeleitet ist. Da das alpha9-Gen auch im Riechepithel der Ratte transkribiert wird, wurde RNA aus diesem Gewebe als Positivkontrolle verwendet. cDNA aus Ischiasnerven der Ratte wurde als Negativkontrolle genommen, um die Möglichkeit auszuschließen, dass aufgrund der verwendeten PCR-Parameter sehr niedrige Transkriptmengen in jedem untersuchten Gewebe aufgefunden werden. Wenn auch keine DNA aus dem Ischiasnerv mit den alpha9-spezifischen Primern vervielfältigt wurde (siehe 8), so konnten doch mit den entsprechenden spezifischen Primern sowohl alpha3- als auch alpha4-Untereinheiten in diesen Geweben nachgewiesen werden.
Eine mögliche physiologische Rolle des alpha9-Rezeptor-Kanals ist die efferente cholinerge Versorgung der Cochlea-Haarzellen mit Nervenbahnen. Die äußeren Haarzellen der Cochlea sind bei Wirbeltieren an der mechanischen Schallausbreitung beteiligt (Flock, R. Klinke und R. Hartmann, Hrsg. (Berlin: Springer-Verlag), S. 2–8, 1983). Diese Zellen erhalten eine efferente cholinerge Versorgung mit Nerven. Die elektrische Anregung dieser efferenten Neuronen führt zu einer Herabsetzung der Sensitivität und dem Anpassen der Gehörnervenfasern, die im Gegenzug Schutz gegen akustische Traumata bewirken (Brown und Nuttal, J. Physiol. (Lond.), 354, 625–646, 1984; Klinke, Hearing Res., 22, 235–243, 1986; Rajan und Johnstone, Brain Res., 458, 241–255, 1988). Die molekulare Beschaffenheit des an der efferenten Nervenversorgung der Haarzellen der Cochlea beteiligten Acetylcholin-Rezeptors wurde nicht beschrieben. Obwohl ein nicht-selektiver Kationenkanal wie auch ein an das G-Protein gebundener Rezeptor vorgeschlagen wurden, waren cholinerge Agonisten und Antagonisten bei der Beschreibung des Rezeptors als entweder nikotinisch oder muscarinisch wenig hilfreich (Housley und Ashmore, Proc. R. Soc. Lond. B, 244, 161–167, 1991; Fuchs und Murrow, Proc. R. Soc. Lond. B, 248, 35–40, 1992; Fuchs und Murrow, J. Neurosci., 12, 800–809, 1992; Kakehata et al., J. Physiol. (Lond.), 463-, 227–244, 1993; Erostegui et al., Hearing Res., 74, 135–147, 1994). Daher wird aufgrund der einzigartigen pharmakologischen Merkmale angenommen, dass es sich, wie auch immer die Primärstruktur dieses cholinergen Rezeptors sein mag, dabei um einen Rezeptor handelt, dessen Art vorher noch nicht beschrieben wurde (Fuchs und Murrow, Proc. R. Soc. Lond. B, 248, 35–40, 1992; Erostegui et al., Hearing Res., 74, 135–147, 1994).
Die hierin gezeigten Ergebnisse legen nahe, dass der alpha9-Rezeptor der cholinerge Bestandteil des zur Cochlea führenden Nervensystems ist. Diese Schlussfolgerung gründet in erster Linie auf dem Vorkommen von alpha9-Transkripten in den Haarzellen der Cochlea der Ratte. Derzeitige Befunde geben Grund zu der Annahme, dass das zur Cochlea führende System an der Verbesserung der Signalwahrnehmung innerhalb eines Hintergrundgeräusches dient, die Cochlea vor Schaden durch Lärm schützt und die Dämpfung der Cochlea-Reaktion gegenüber Hörreizen bewirkt, wenn die Aufmerksamkeit auf anderes gerichtet werden muss.
Verschiedene Versuche haben gezeigt, dass der cholinerge Bestandteil des zur Cochlea führenden Systems auch an der durch Aminoglycosid-Antibiotika bewirkten Ototoxizität beteiligt sein können. Bei Verabreichung in hohen Dosen lassen diese Antibiotika die äußeren Haarzellen (OHC) verkümmern (Govaerts et al., Toxicology Letters, 52, 227–251, 1990) Das Ergebnis dieser Verkümmerung reicht von Ohrklingeln bis zu vollständigem Gehörverlust. Gegenwärtige Theorien zu den Mechanismen, über die Aminoglycoside ihre ototoxische Wirkung auf die OHC ausüben, vermuten, dass die OHCs aufgrund der Blockade des intrazellulären Nachrichtensystems metabolisch destabilisiert werden. Gleichzeitig werden auch die efferenten Synapsen destabilisiert und können die infolge Reizung ausgeschüttete Menge an ACh nicht länger überwachen und steuern. Als Endergebnis tritt eine Überreizung (ein ACh-Überschuss) in Richtung der destabilisierten OHC auf, aus der die beobachtete Verkümmerung folgt (Williams et al., Hearing Res., 30, 11–18, 1987). Folglich sind ACh und der alpha9-Rezeptor, die für die Weiterleitung des efferenten Signals zum efferenten Endabschnitt der Haarzelle verantwortlich sind, stark an der Entfaltung des ototoxischen Potentials der Aminoglycosid-Antibiotika beteiligt. Demgemäß werden Antagonisten des Rezeptors, die wenigstens eine alpha9-Rezeptor-Untereinheit (d.h. alpha9-Blocker) umfassen, die Nebenwirkungen der Aminoglycosidinduzierten Ototoxizität verringern oder ausschalten.
Die vorliegende Erfindung stellt isolierte Nucleinsäuren zur Verfügung, die eine alpha9-nikotinische Acetylcholin-Rezeptor-Untereinheit codieren. Der Ausdruck "Nucleinsäuren" (auch als Polynucleotide bezeichnet) schließt RNA ebenso wie einzel- und doppelsträngige DNA und cDNA ein. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "isoliertes Polynucleotid" auf ein Polynucleotid, dass von seiner natürlichen Umgebung getrennt oder daraus entfernt wurde. Ein Mittel, um ein eine alpha9-nAChR-Rezeptor-Untereinheit codierendes Polynucleotid zu isolieren, ist, eine genomische Säugetierbibliothek mit einer DNA-Sonde mittels gut bekannter Verfahren zu untersuchen. Aus dem alpha9-Rezeptor-Gen abgeleitete DNA-Sonden sind für diesen Zweck besonders nützlich. DNA- und cDNA-Moleküle, die alpha9-Rezeptoren codieren, können verwendet werden, um komplementäre genomische DNA, cDNA oder RNA aus menschlichen, Säugetier- oder anderen tierischen Quellen zu erhalten. Derartige Moleküle können auch verwendet werden, um verwandte cDNA oder genomische Klone beim Screenen einer cDNA- oder genomischen Bibliothek, mit den unten ausführlicher beschriebenen Verfahren, zu isolieren. Die Nucleinsäuren der Erfindung umfassen Nucleotidsequenzen, die der in 1 (siehe auch SEQ ID NO:1) gezeigten Nucleotidsequenz von Grund auf gleichen. Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls Nucleinsäuren ein, die degenerierte Varianten der in 1 (und SEQ ID NO:1) gezeigten Nucleotidsequenz sind.
Der Ausdruck "degenerierte Varianten" bezieht sich auf alpha9-nAChR-Untereinheiten codierende Nucleinsäuren, die aufgrund der Degeneration des genetischen Codes nicht notwendigerweise mit den Nucleinsäuren der Erfindung unter den angegebenen Hybridisierungsbedingungen hybridisieren. Bevorzugt umfassen Polypeptid(e) oder Protein(e) der Erfindung codierende Nucleinsäuren Nucleotide, die im Grunde die gleiche Aminosäuresequenz wie in 1 (siehe auch SEQ ID NO:2) codieren. Als Alternative hybridisieren Polypeptid(e) der Erfindung codierende Nucleinsäuren bevorzugt unter hochstringenten Bedingungen mit nahezu der gesamten Sequenz oder wesentlichen Bereichen (d.h. typischerweise mit wenigstens 25–30 zusammenhängenden Nucleotiden) der in 1 (siehe auch SEQ ID NO:1) wiedergegebenen Nucleotidsequenz.
„Stringenz der Hybridisierung", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Bedingungen, unter denen Polynucleotidhybride stabil sind. Wie dem Fachmann bekannt, ist die Stabilität der Hybride eine Funktion der Natriumionen-Konzentration und der Temperatur (siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2d Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).
Die Erfindung stellt isoliertes alpha9-nikotinisches Acetylcholin-Rezeptor-Untereinheit-Peptid, Polypeptid und/oder Protein zur Verfügung, das durch die Nucleinsäuren der Erfindung codiert wird, sowie alpha9-nikotinischen Acetylcholin-Rezeptor, der diese Untereinheit umfasst. Die alpha9-nAChR-Untereinheit umfasst ein Protein mit einer Länge von ca. 451 Aminosäuren. Die Aminosäuresequenz der alpha9-Untereinheit wird in 1 (und in SEQ ID NO:2) wiedergegeben.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "isoliertes Protein" auf ein Protein, das frei ist von Zellbestandteilen und/oder Kontaminationen, die normalerweise einem Protein in seiner natürlichen in-vivo-Umgebung anhaften. Polypeptide und/oder Proteine der Erfindung beinhaften natürlich auftretende, allelische Abwandlungen, genauso wie rekombinante Formen davon. Das alpha9-nAChR-Polypeptid kann mit verschiedenen, einem Fachmann bekannten Verfahren isoliert werden. Zu den für Isolation und Aufreinigung der Proteine der Erfindung verfügbaren Verfahren zählen: Fällung, Gelfiltration, Ionenaustausch, Revers-Phasen- und Affinitätschromatographie. Andere bekannte Verfahren werden in Deutscher et al., Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology Vol. 182, (Academic Press, 1990) beschrieben. Alternativ können die isolierten Polypeptide der vorliegenden Erfindung über bekannte rekombinante Verfahren gewonnen werden, die beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2d Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) beschrieben sind.
Polypeptid(e) der Erfindung kann (können) hergestellt werden, indem die alpha9-nAChR-Untereinheit codierende Nucleinsäuren in einer geeigneten Wirtszelle, wie beispielsweise einer Bakterienzelle, einer Hefezelle, einer Amphibienzelle (d.h. einer Oozyte) oder einer Säugetierzelle mit bekannten Verfahren exprimiert werden. Das exprimierte Polypeptid kann mit bekannten Verfahren gewonnen werden. Polypeptide der Erfindung können, wie unten detaillierter beschrieben wird, direkt aus den mit Expressionsvektoren transformierten Zellen isoliert werden. Die Polypeptide der Erfindung, biologisch aktive Fragmente und funktionelle Äquivalente davon können auch über chemische Synthese hergestellt werden. Wie hierin verwendet, bezieht sich "biologisch aktives Fragment" auf jeden Abschnitt des durch die Aminosäuresequenz in 1 (siehe auch SEQ ID NO:2) repräsentierten alpha9-Polypeptids, das in einen kationischen, durch Acetylcholin aktivierten und für Kalzium durchlässigen Kanal eingebaut werden kann. Synthetische Polypeptide können zum Beispiel mit dem automatischen Peptidsynthetisierer, Modell 430A oder 431A, von Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA) unter Verwendung der durch den Hersteller zur Verfügung gestellten Chemie hergestellt werden.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "nikotinische Acetylcholin-Rezeptor-(nAChR)-Untereinheit" auf rekombinant exprimiertes/hergestelltes (d.h. isoliertes oder im wesentlichen reines) Protein, das vier hoch-hydrophobe, membran-übergreifende Regionen vorhersagende Bereiche und Cysteinreste an den Positionen 127, 141, 191 und 192 (bezogen auf das reife Peptid, ohne die 28 Aminosäure-Leitsequenz) aufweist. Solche Proteinuntereinheiten werden in einen kationischen Kanal eingebaut, der durch Acetylcholin aktiviert wird. nAChR-Untereinheiten der Erfindung schließen Abwandlungen, die durch mRNA, die über alternatives Spleißen eines Primärtranskripts erzeugte wurde, codiert sind, genauso wie biologisch aktive Fragmente ein.
Die alpha9-nAChR-Untereinheit der Erfindung trägt zur Bildung eines mit den hierin beschriebenen Methoden beurteilten funktionellen Rezeptors durch Kombination mit wenigstens einer zusätzlichen nAChR-Untereinheit der gleichen oder einer anderen Art bei. Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck "funktioneller Rezeptor", dass die Bindung eines Liganden, z.B. Acetylcholin (ACh), die Öffnung des Rezeptor-Ionenkanals bewirkt und es dabei Kationen, wie beispielsweise Ca²⁺, aber auch Na⁺ und K⁺ erlaubt, in die Zelle einzuströmen. Aktivierung des Agonisten eines "funktionellen Rezeptors der Erfindung" induziert den Rezeptor.
Die Erweiterung der Nucleinsäuren, Polypeptide oder Proteine der Erfindung mit den folgenden Zusätzen: "rekombinant exprimiert/hergestellt", "isoliert" oder "im wesentlichen rein" schließt Nucleinsäuren, Peptide, Polypeptide oder Proteine mit ein, die in dieser Form von Menschenhand hergestellt wurden und folglich aus ihrer ursprünglichen zellulären in-vivo-Umgebung herausgelöst sind. Durch das menschliche Einwirken sind diese rekombinanten Nucleinsäuren, Polypeptide und Proteine der Erfindung nützlich für Anwendungen, für die die entsprechenden, natürlich vorkommenden Moleküle nicht verwendet werden können, wie beispielsweise zur Identifizierung von Bestandteilen potentieller Verbindungen.
Sequenzen mit "substantieller Sequenzhomologie" beziehen sich auf Nucleotidsequenzen, die zu wenigstens 90% mit den Nucleinsäuren der Erfindung identisch sind; und Aminosäuresequenzen, die typischerweise wenigstens 95% Aminosäureidentität mit den Polypeptiden der Erfindung aufweisen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Nucleinsäuren zur Verfügung, die (eine) funktionsfähig an einen Promotor oder andere regulatorische Sequenzen gebundene alpha9-Rezeptor-Untereinheit(en) codiert(en). Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "funktionsfähig verbunden" auf die funktionelle Verbindung zwischen der Nucleinsäure und den regulatorischen und Effektorsequenzen wie Promotoren, Verstärker, Transkriptions- und Translations-Abbruchstellen sowie andere Signalsequenzen. Insbesondere bezieht sich die funktionsfähige Verbindung einer Nucleinsäure mit einem Promotor insofern auf den physikalischen und funktionellen Zusammenhang zwischen der Nucleinsäure und dem Promotor, als dass die Transkription der DNA vom Promotor aus durch eine RNA-Polymerase eingeleitet wird, die den Promotor spezifisch erkennt und daran bindet.
Zu den geeigneten Promotoren zählen spezifische Sequenzen, die für die Erkennung durch RNA-Polymerase, Bindung und Einleitung der Transkription ausreichen. Zusätzlich gehören zu den geeigneten Promotoren Sequenzen, die die Erkennung, Bindung und Einleitung der Transkriptionsaktivität der RNA-Polymerase modulieren. Solche Sequenzen können cis-aktiv sein oder auf trans-aktive Faktoren reagieren. In Abhängigkeit von der Art der Regulation können Promotoren konstitutiv oder reguliert sein, Beispiele für Promotoren sind SP6, T4, T7, der frühe SV40-Promotor, der Cytomegalovirus-(CMV-)Promotor, der Maus-Mammatumorvirus (MMTV), der Steroid-induzierbare Promotor, der Moloney-Nagetier-Leukämievirus-(MMLV-)Promotor und dergleichen.
Die in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Vektoren beinhalten sowohl einen Promotor als auch eine Klonierungsstelle, in der alpha9-Rezeptor-Untereinheit(en) codierende Nucleinsäure funktionsfähig eingebunden werden kann. Solche bekannten Vektoren sind in der Lage, RNA in vitro oder in vivo umzuschreiben und sind kommerziell von Quellen wie beispielsweise Stratagene (La Jolla, CA) und Promega Biotech (Madison, WI) erhältlich. Um die Expression und/oder in-vitro-Transkription zu optimieren, kann es nötig sein, 5' und/oder 3' untranslatierte Bereiche der Klone zu entfernen, hinzuzufügen oder zu verändern, um zusätzliche, möglicherweise unpassende, alternative Codons für den Translationsbeginn sowie andere Sequenzen zu entfernen, die die Expression auf der Transkriptions- oder Translationsebene behindern oder verringern. Alternativ können übereinstimmende Ribosomenbindungsstellen unmittelbar 5' vom Startcodon aus eingesetzt werden, um die Expression zu verstärken. (Als Beispiel siehe Kozak, J. Biol. Chem. 266:19867 (1991)). Genauso können alternative Codons, die die gleichen Aminosäure codieren, ursprüngliche Codons der alpha9-nAChR-Untereinheit ersetzen, um die Transkription zu verstärken (so kann z.B. die Codonpräferenz der Wirtszelle angenommen, die Anwesenheit G-C-reicher Domänen verringert werden und dgl.).
Beispiele für geeignete Vektoren, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, umfassen Viren, wie Baculoviren und Retroviren, Bakteriophage, Kosmide, Plasmide und andere Rekombinationsvehikel, die typischerweise bekanntermaßen verwendet werden. Nucleinsäuren der Erfindung werden durch bekannte Verfahren in die Vektorgenome eingesetzt. So können zum Beispiel das Insert und die Vektor-DNA unter geeigneten Bedingungen mit einem Restriktionsenzym zusammengebracht werden, um an jedem Molekül komplementäre Enden zu schaffen, die sich aneinander legen und durch eine Ligase miteinander verbunden werden können. Alternativ können synthetische Verbindungsstücke an den Enden der geschnittenen Nucleinsäuren der Erfindung angebracht werden. Diese synthetischen Verbindungsstücke beinhalten Nucleinsäuresequenzen, die zu einer speziellen Schnittstelle in der Vektor-DNA passen. Zusätzlich kann eine Nucleinsäure, die einen Abbruchcodon und eine passende Schnittstelle aufweist, mit dem Vektor verbunden werden, der zum Beispiel einige oder alle folgenden enthält: ein selektierbares Marker-Gen, wie das Neomycin-Gen für die Selektion stabiler oder vorübergehender Transfizienten in den Säugetierzellen; Verstärker/Promotor-Sequenzen des unmittelbaren, frühen Gens für den menschlichen CMV für hohe Transkriptionsniveaus; Transkriptionsabbruch- und RNA-Prozessierungssignale aus SV40 für die mRNA-Haltbarkeit; SV40-Polyom-Replikationsursprünge und ColE1 für saubere Episom-Replikation; vielseitige, mehrfache Klonierungsstellen; und T7- und SP6-RNA-Promotoren für die in-vitro-Transkription der Sense- und Antisense-RNA. Andere Mittel sind bekannt und erhältlich.
Ebenfalls werden Vektoren zur Verfügung gestellt, die die alpha9-nAChR-Untereinheit codierende Nucleinsäure aufweisen und für die Expression in einer Bakterienzelle, einer Hefezelle, einer Amphibienzelle (d.h. Oozyte), einer Säugetier- oder anderen tierischen Zelle angepasst sind. Derartige Vektoren umfassen zusätzlich regulatorische Elemente, die für die Expression von Nucleinsäure in den Bakterien-, Hefe-, Amphibien-, Säuger- oder Tierzellen notwendig sind und relativ zu der Nucleinsäure, die die alpha9-nAChR-Untereinheit codiert, angeordnet sind und so deren Expression erlauben. Wie hierin verwendet, bezieht sich "Expression" auf den Vorgang, bei dem Nucleinsäuren in mRNA umgeschrieben und in Peptide, Polypeptide oder Proteine übersetzt werden. Wird die Nucleinsäure aus genomischer DNA abgeleitet, kann Expression auch das Spleißen der mRNA umfassen, sofern ein geeigneter eukaryotischer Wirt gewählt wurde. Für die Expression benötigte regulatorische Elemente umfassen Promotorsequenzen zur Bindung von RNA-Polymerase und Transkriptionseinleitungs-Sequenzen für die Ribosomen-Bindung. Ein bakterieller Expressionsvektor könnte beispielsweise einen Promotor, wie beispielsweise den lac-Promotor, die Shine-Dalgarno-Transkriptionseinleitungs-Sequenz und das Startcodon AUG (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2d Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) beinhalten. Genauso könnte ein eukaryotischer Expressionsvektor einen heterologen oder homologen Promotor für die RNA-Polymerase II, ein stromabwärts gelegenes Polyadenylierungssignal, das Startcodon AUG und ein Abbruchcodon für die Ablösung des Ribosoms beinhalten. Solche Vektoren sind kommerziell erhältlich oder können aus vorhandenen Sequenzen mit bekannten Verfahren zusammengebaut werden.
Diese Erfindung stellt auch einen transformierten Wirt zur Verfügung, der rekombinant den alpha9-nikotinischen Acetylcholin-Rezeptor exprimiert. Ein derartiger Wirt wurde mit einer Nucleinsäure transformiert, die die alpha9-Untereinheit codiert. Ein Beispiel für einen transformierten Wirt gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine Säugetierzelle, die ein Plasmid umfasst, das für die Expression in einer derartigen Zelle spezifisch angepasst wurde. Das Plasmid beinhaltet eine eine alpha9-nAChR-Untereinheit und die für die Expression der Untereinheit notwendigen regulatorischen Elemente codierende Nucleinsäure. Geeignete, für die vorliegende Erfindung verwendbare Säugetierzellen sind beispielsweise Maus-Fibroblasten-NIH3T3-Zellen, CHO-Zellen, HeLa-Zellen, Ltk^–-Zellen, Neuronale PC12- und N2A-Zellen, HEK-293-Nierenzellen und CG4-Gliazellen. Wirtszellen können mit den oben beschriebenen Plasmiden, mit bekannten Methoden wie z.B. Kalzium-Phosphat-Fällung, DEAE-Dextran, Elektroporation, Mikroinjektion oder Lipofektion transformiert werden. Andere, für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignete Wirte sind Oozyten, insbesondere Xenopus-Oozyten.
Nikotinische Acetylcholin-Rezeptoren gemäß der Erfindung werden rekombinant in einer Wirtszelle exprimiert, die wenigstens eine alpha9-Untereinheit aufweist. Rekombinante Rezeptoren können homomer oder heteromer sein. Folglich kann eine transformierte Wirtszelle rekombinant einen Rezeptor exprimieren, der nur alpha9-Untereinheiten beinhaltet oder zumindest eine alpha9-Untereinheit und eine oder mehrere andere nAChR-Untereinheiten aufweist.
Die vorliegende Erfindung schafft auch Nucleinsäuresonden. Bei solchen Sonden handelt es sich um Polynucleotide, die in der Lage sind, spezifisch mit einer eine alpha9-nAChR-Untereinheit codierenden Sequenz zu hybridisieren. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Sonde" auf einzel- oder doppelsträngige DNA oder RNA, mit einer Nucleotidsequenz, die wenigstens die 25 zusammenhängenden Basen wie in 1 (siehe auch SEQ ID NO:1) umfasst. Zur Unterscheidung der alpha9-Untereinheit von anderen alpha-nAChR-Untereinheiten verwendete Sonden bestehen bevorzugt aus wenigstens 14 zusammenhängenden Basen aus dem Bereich der zytoplasmatischen Schleife der alpha9-Nucleotidsequenz. Alternativ dazu werden Sonden, die zum Auffinden zusätzlicher Untereinheiten der nAChR-Familie verwendet werden sollen, bevorzugt aus wenigstens 14 zusammenhängenden Basen eines membranübergreifenden Bereichs der alpha9-Nucleotidsequenz bestehen.
Wie hierin verwendet, schließt der Ausdruck "spezifisch hybridisierend" die Möglichkeit eines Polynucleotids ein, eine komplementäre Nucleinsäuresequenz zu erkennen und, über Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basenpaaren, ein doppel-helikales Segment zu bilden. Nucleinsäure-Sondentechnik ist dem Fachmann bekannt, der leicht erkennt, dass solche Sonden stark in der Länge veränderlich und mit einem detektierbaren Agens, wie beispielsweise mit einem Radioisotop, einem Fluoreszenzfarbstoff u.ä. markiert sein können, um die Detektion der Sonde zu erleichtern. Die Sonden der Erfindung sind nützlich, um die Anwesenheit von Nucleinsäuren zu detektieren, die die alpha9-nAChR-Untereinheit codieren. Die Sonden können beispielsweise für in-situ-Hybridisierungen verwendet werden, um spezielle Gewebe zu identifizieren, in denen das alpha9-nAChR-Untereinheit-Gen exprimiert wird. Zusätzlich sind die Oligonucleotide, die zu Nucleinsäuren komplementär sind, die die alpha9-nAChR-Untereinheit codieren, von Nutzen, um das alpha9-Gen und damit zusammenhängende mRNA zu detektieren, oder zur Isolation verwandter Gene durch Homologensuche in genomischen oder cDNA-Bibliotheken oder mittels bekannter Vervielfältigungsmethoden.
Weiterhin stellt die Erfindung Antisense-Oligonucleotide mit einer Sequenz zur Verfügung, die in der Lage ist, spezifisch an jeden Bereich einer mRNA zu binden, der die alpha9- nAChR-Untereinheit codiert, um so die Translation der mRNA zu verhindern. Antisense-Oligonucleotide können auch eine Sequenz beinhalten, die in der Lage ist, spezifisch an jeden Bereich der cDNA zu binden, die die alpha9-Untereinheit codiert. Wie hierin verwendet, schließt der Ausdruck "spezifisch binden" die Fähigkeit einer Nucleinsäuresequenz ein, komplementäre Nucleinsäuresequenz zu erkennen und damit doppel-helikale Abschnitte zu schaffen, indem Wasserstoffbrücken zwischen den komplementären Basenpaaren gebildet werden.
Auch werden durch die vorliegende Erfindung Zusammenstellungen geschaffen, die eine Menge eines erfindungsgemäßen Antisense-Oligonucleotides umfassen, das die herabgesetzte Expression der alpha9-nAChR-Untereinheit bewirkt, wobei dieses Antisense-Oligonucleotide in der Lage ist, an die den alpha9-nAChR-Rezeptor codierende mRNA zu binden, um dessen Translation zu verhindern. Die von der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellten Zusammenstellungen weisen einen annehmbaren, hydrophoben Träger auf, der durch die Zellmembran hindurchgehen kann und können auch eine Struktur umfassen, die an einen für einen gewählten Zelltyp spezifischen Rezeptor bindet und dabei durch die Zellen des gewählten Zelltyps aufgenommen wird. Die Struktur kann Teil eines Proteins sein, von dem bekannt ist, dass es an einen zelltypspezifischen Rezeptor bindet.
Antisense-Oligonucleotid-Zusammenstellungen (AOCs) gemäß der vorliegenden Erfindung sind so gestaltet, dass sie zur Verabreichung an ein Subjekt (Patient) durch Injektion im Blutstrom oder unter Labor-Zellkulturbedingungen stabil sind. Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der AOC sind so gewählt, dass die Zusammensetzung in der Lage ist, durch die Zellmembran hindurchzugehen, um so in das Zytoplasma der Zelle zu gelangen. Eine solche Zusammensetzung kann so gestaltet sein, dass sie kleine, hydrophobe chemische Strukturen oder alternativ dazu spezifische, zelluläre Transportsysteme beinhaltet, die die AOC vereinfachen und in die Zelle transportieren. Zusätzlich können die AOC nur für die Verabreichung an ausgewählte Zellpopulationen bestimmt sein, indem die AOC darauf abzielen, an ausgewählte Zellpopulationen gebunden und von diesen aufgenommen zu werden. Die Ausrichtung kann dadurch erreicht werden, dass zellspezifische AOCs entworfen werden, die an einen Rezeptor binden, der nur in einem bestimmten, wie oben besprochenen Zelltyp aufgefunden wird. Alternativ kann ein AOC auch dafür bestimmt sein, eine mRNA-Zielsequenz zu erkennen und selektiv daran zu binden. Im letztgenannten Fall wird die Ausrichtung beispielsweise dadurch erreicht, dass die eingesetzte Sequenz in der in 1 (SEQ ID NO:1) gezeigten Sequenz enthalten ist. Die AOC ist dazu bestimmt, die Ziel-mRNA zu deaktivieren, indem sie (1) an die Ziel-mRNA bindet und den Abbau der mRNA beispielsweise durch RNase I Verdau einleitet oder (2) die Translation der Ziel-mRNA unterbindet, indem sie die Bindung von translationsregulierenden Faktoren oder Ribosomen stört, oder durch den Einschluss anderer chemischer Strukturen, wie beispielsweise Ribozymsequenzen oder reaktiver chemischer Gruppen, die die ZielmRNA entweder abbauen oder chemisch verändern. AOC zeigten diese Eigenschaften, sobald sie auf mRNA-Ziele gerichtet wurden (siehe Cohen et al., TIPS, 10:435 (1989) und Weintraub, Sci. American, January (1990), S. 40).
Die Erfindung stellt auch Antikörper mit spezieller Reaktivität gegenüber alpha9-nAChR-Polypeptiden und/oder Proteinen des Erfindungsgegenstandes zur Verfügung. Aktive Fragmente von Antikörpern sind in der Definition von "Antikörper" mit erfasst.
Die Antikörper der Erfindung können mit bekannten Verfahren hergestellt werden. So können beispielsweise polyklonale und monoklonale Antikörper mit Verfahren hergestellt werden, die z.B. in Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory 1988) beschrieben werden. Das alpha9-Protein der Erfindung, oder Teile davon, können bei der Erstellung solcher Antikörper als das Immunogen benutzt werden. Alternativ können synthetische Peptide (in kommerziell erhältlichen Synthesegerät(en) erstellt und als Immunogene verwendet werden. Aminosäuresequenzen können mit bekannten Verfahren analysiert werden, um zu bestimmen, ob sie hydrophobe oder hydrophile Domänen des entsprechenden alpha9-Proteins der Erfindung codieren. Geänderte Antikörper, wie zum Beispiel chimäre, vermenschlichte, CDR-behaftete oder bifunktionelle Antikörper, können ebenfalls mit bekannten Verfahren hergestellt werden. Derartige Antikörper können auch über Hybridome, chemische Synthese oder rekombinante Methoden hergestellt werden, die z.B. in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2d Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 und Harlow und Lane, (siehe oben) beschrieben werden. Sowohl Anti-Peptid- also auch Anti-Fusionsprotein-Antikörper können verwendet werden (siehe z.B. Bahouth et al., Trends Pharmacol. Sci. 12: 338 (1991); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, NY 1989)).
Die Antikörper der Erfindung haben verschiedene Anwendungsbereiche, wie beispielsweise Isolierung des alpha9-Rezeptors der Erfindung. Zusätzlich sind die Antikörper nützlich, um die Anwesenheit des alpha9-Rezeptors zu detektieren und ebenso für die Analyse der Lokalisierung, der Untereinheit-Zusammensetzung und der Struktur der funktionellen Domänen des Rezeptors. Ein Verfahren zur Detektion der Anwesenheit von alpha9-nAChR auf der Oberfläche einer Zelle umfasst Kontaktieren der Zelle mit einem spezifisch am alpha9-nACh-Rezeptor bindenden Antikörper und Nachweis des gebundenen Antikörpers auf der Zelloberfläche. Im Hinblick auf den Nachweis der alpha9-Rezeptoren können die erfindungsgemäßen Antikörper z.B. für in-vitro-Diagnose- oder in-vivo-Abbildungsverfahren verwendet werden.
Immunologische Verfahren, die für den in-vitro-Nachweis des alpha9-Rezeptors in einer Probe nützlich sind, umfassen Immunoassays, die einen nachweisbaren Antikörper einsetzen. Zu derartigen Immunoassays zählen beispielsweise ELISA, das Pandex mikrofluorimetrische Assay, Agglutinationsassays, Flusszytometrie, Serumdiagnose Assays und bekannte immunohistochemische Färbeprozeduren. Ein Antikörper kann durch verschiedene bekannte Mittel nachweisbar gemacht werden. Ein nachweisbarer Marker kann beispielsweise direkt oder indirekt an den Antikörper angeheftet werden. Nützliche Marker umfassen z.B. Radionuclide, Enzyme, Fluorogene, Chromogene und chemolumineszente Markierungen.
Darüber hinaus können erfindungsgemäße Antikörper verwendet werden, um die Aktivität des Ionenkanals des alpha9-Rezeptors bei Tieren und Menschen, ebenso wie in daraus isolierten, biologischen Geweben, zu modulieren. Entsprechend stellt die Erfindung Zusammenstellungen zur Verfügung, die einen Träger und eine Menge eines Antikörpers mit Spezifität für den alpha9-Rezeptor umfasst und wirksam die Bindung von natürlich vorkommenden Liganden an den Rezeptor blockiert. Ein monoklonaler Antikörper, der auf ein Epitop eines alpha9-Rezeptors auf der Oberfläche einer Zelle gerichtet ist, wobei der Antikörper eine Aminosäuresequenz aufweist, die im Grunde die gleiche ist wie die Aminosäuresequenz in Sequenz ID NO:2, kann für diesen Zweck nützlich sein.
Weiterhin stellt die Erfindung ein transgenes, nicht-menschliches Säugetier bereit, das in der Lage ist, alpha9-Protein exprimierende Nucleinsäure zu codieren. Ebenfalls bereitgestellt werden transgene, nicht-menschliche Säugetiere, die nicht in der Lage sind, Nucleinsäure zu exprimieren, die biologisch funktionierendes alpha9-Protein codiert oder alternativ nur dazu in der Lage ist, in mancher Hinsicht biologisch fehlerhaftes alpha9-Protein zu exprimieren. Veränderliche Grade der Disfunktionalität werden durch Manipulation der alpha9-Nucleinsäure erreicht, um ein mutiertes Protein zu codieren.
Die vorliegende Erfindung steilt auch ein transgenes, nicht-menschliches Säugetier mit einem Genom bereit, das Antisense-Nucleinsäure umfasst, die in zur alpha9-mRNA komplementäre Antisense-mRNA umgeschrieben wird. Derartige Antisense-mRNA hybridisiert mit alpha9-mRNA und verringert deren Translation.
In den erfindungsgemäßen transgenen Tieren werden Nucleinsäuren verwendet, die mit einem induzierbaren Promotor und/oder gewebespezifischen, regulatorischen Elementen verbunden sein können, sodass die Expression induziert oder auf spezielle Zellen begrenzt werden kann. Beispiele für geeignete Promotoren sind der Metallothionein-Promotor und der L7-Promotor.
Die Übertragung von Nucleinsäurematerial in Säugerzellen zur Zeugung transgener Tiere kann durch Mikroinjektion, retrovirale Infektion oder andere, dem Fachmann bekannte Mittel durchgeführt werden, um das Material in geeignete, befruchtete Embryonen zu übertragen. (Siehe z.B. Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1986). Homologe Rekombination kann ebenfalls für die Hervorbringung transgener Tiere gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Homologe Rekombinationstechniken sind bekannt. Homologe Rekombination ersetzt ein ursprüngliches (endogenes) Gen durch ein rekombinantes oder mutiertes Gen, um ein Tier hervorzubringen, das keine ursprüngliche (endogene) alpha9-Rezeptor-Untereinheit, aber stattdessen beispielsweise eine mutierte Rezeptor-Untereinheit exprimieren kann. Im Gegensatz zur homologen Rekombination fügt die Mikroinjektion dem Wirtsgenom Gene hinzu, ohne Wirtsgene zu entfernen. Mikroinjektion kann ein transgenes Tier erzeugen, das in der Lage ist, sowohl endogene als auch exogene alpha9-Rezeptor-Untereinheiten zu exprimieren: Transgene, tierische Modellsysteme sind hilfreich für die in-vivo-Untersuchung von Zusammensetzungen zur Identifikation rezeptorspezifischer Liganden, d.h. Agonisten und Antagonisten, die Rezeptorreaktionen aktivieren oder unterbinden.
Nucleinsäuren, Oligonucleotide (inkl. Antisense), Vektoren, die gleiche, transformierte Wirte beinhalten, Rezeptor-Untereinheiten und Kombinationen daraus, ebenso wie Antikörper der vorliegenden Erfindung, können zum Screenen von Zusammensetzungen in vitro verwendet werden, um die Zusammensetzungen zu identifizieren, die als Agonisten oder Antagonisten der alpha9-Rezeptor-Untereinheiten der Erfindung funktionieren. Derartige in-vitro-Screening-Assays schaffen nützliche Information im Hinblick auf die Funktion und Aktivität der alpha9-Rezeptor-Untereinheiten der Erfindung, die die Identifizierung und die Entwicklung von Wirkstoffen erleichtern können, die zu spezifischer Interaktion mit einem oder mehreren Typen von Rezeptor-Untereinheiten oder Rezeptor-Subtypen in der Lage sind.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Identifizierung von Zusammensetzungen zur Verfügung, die an alpha9-nikotinische-Acetylcholin-Rezeptor-Untereinheiten binden. In einem derartigen Verfahren können die Rezeptor-Untereinheiten der Erfindung in einen kompetitiven Bindungsassay eingesetzt werden. Ein derartiges Assay kann das schnelle Screening einer großen Anzahl von Zusammensetzungen ermöglichen, um festzustellen, welche Zusammensetzungen, wenn es solche gibt, in der Lage sind, an die alpha9-nAChR-Untereinheit zu binden. Nachfolgend können detailliertere Assays mit den Zusammensetzungen durchgeführt werden, bei denen eine Bindung vorgefunden wurde, um weiter festzustellen, ob solche Zusammensetzungen als Agonisten oder Antagonisten der erfindungsgemäßen Rezeptoren (d.h. von nAChR, die wenigstens eine alpha9-Untereinheit umfassen) wirken.
Die vorliegende Erfindung stellt darüber hinaus auch ein Bioassay zur Identifizierung von Verbindungen zur Verfügung, die die Aktivität der erfindungsgemäßen Rezeptoren (d.h. von nAChR, die wenigstens eine alpha9-Untereinheit umfassen) modulieren. In einer Ausführungsform wird das Bioassay ausgeführt, indem Zellen, die den wenigstens eine alpha9-Untereinheit aufweisenden Rezeptor exprimieren, mit mindestens einem potentiellen Agonisten versehen werden und die Zellen danach auf Änderungen in der Ionenkanalaktivität überwacht werden. In noch einer weiteren Ausführungsform wird das Bioassay durchgeführt, indem Zellen, die Rezeptor exprimieren, der wenigstens eine alpha9-Untereinheit aufweist, mit einer konstanten Menge eines bekannten alpha9-Agonisten sowie steigenden Mengen wenigstens eines potentiellen Antagonisten kontaktiert werden und danach die Zellen auf Änderungen in der Ionenkanal-Aktivität überwacht werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Bioassay gemäß Anspruch 28 zur Identifizierung von Zusammensetzungen zur Verfügung, die die regulatorischen Bereiche des alpha9-nAChR-Untereinheit-Gens modulieren. Ein derartiges Assay wird durchgeführt, indem Säugetierzellen verwendet werden, die mit einem wenigstens einen Teil des regulatorischen Bereichs des funktionsfähig mit einem Reportergen verbundenen alpha9-Gens aufweisenden Nucleinsäurekonstrukt transformiert wurden. Die transformierten Zellen werden mit wenigstens einer Zusammensetzung kontaktiert, wobei die Fähigkeit dieser Zusammensetzung zur Modulation des regulatorischen Bereichs unbekannt ist. Danach werden die Zellen auf Expression des Reportergens überwacht. Zu geeigneten Reportergenen, die verwendet werden können, gehören beispielsweise das Chloramphenicol-Acetyltransferasegen, das Luciferasegen und dergleichen.
Eine Zusammensetzung oder ein Signal, zur "Modulation der Aktivität" eines erfindungsgemäßen Rezeptors bezieht sich auf eine Zusammensetzung oder ein Signal, durch die die Aktivität des alpha9-Rezeptors dahingehend verändert wird, dass sich der Rezeptor bei Anwesenheit der Zusammensetzung oder des Signals anders verhält als bei Abwesenheit der Zusammensetzung oder des Signals. Zusammensetzungen, die die Modulation beeinflussen, umfassen Agonisten und Antagonisten. Ein Agonist schließt eine Zusammensetzung, wie beispielsweise Acetylcholin, ein, die alpha9-Rezeptor-Funktion aktiviert. Alternativ beinhaltet ein Antagonist eine Zusammensetzung, die die alpha9-Rezeptor-Funktion behindert. Typischerweise wird die Wirkung eines Antagonisten als Blockade einer agonisten-induzierten Rezeptoraktivierung beobachtet. Zu Antagonisten zählen kompetitive ebenso wie nicht-kompetitive Antagonisten. Ein kompetitiver Antagonist (oder kompetitiver Blocker) wirkt an oder nahe bei der für die Agonistenbindung spezifischen Stelle. Ein nicht-kompetitiver Antagonist oder Blocker deaktiviert die Funktion des Rezeptors, indem er mit einer anderen Stelle als der Wirkungsstelle des Agonisten zusammenwirkt.
Dem Fachmann ist bekannt, dass Bioassay-Verfahren zur Identifizierung von Zusammensetzungen die die nAChR-Aktivität modulieren, im Allgemeinen den Vergleich mit einer Kontrolle brauchen. Eine Form der "Kontrolle" ist eine Zelle oder Kultur, die im Wesentlichen genauso behandelt wird wie die der Zusammensetzung ausgesetzte Testzelle oder Testkultur, mit dem Unterschied, dass die "Kontroll"-Zelle oder -Kultur nicht der Zusammensetzung ausgesetzt wird. So kann beispielsweise in Verfahren, die elektrophysiologische Spannungsklammer-Verfahren verwenden, die gleiche Zelle in An- und Abwesenheit der Zusammensetzung untersucht werden, indem einfach die äußere . Badlösung der Zelle gewechselt wird. Eine andere Art von "Kontroll"-Zelle oder -Kultur, die verwendet werden kann, ist eine mit den transfizierten Zellen identische Zelle oder Kultur, mit der Ausnahme, das die "Kontroll"-Zelle oder -Kultur die funktionelle alpha9-nACh-Rezeptor-Untereinheit nicht exprimiert. Dem entsprechend wird die Reaktion der transfizierten Zelle auf die Zusammensetzung mit der Reaktion (oder deren Fehlen) der "Kontroll"-Zelle oder Kultur auf die gleiche Zusammensetzung unter den gleichen Reaktionsbedingungen verglichen.
In noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Ionenkanal-Aktivität des alpha9-nAChR dadurch moduliert werden, dass der Rezeptor mit einer wirksamen Menge wenigstens einer Zusammensetzung kontaktiert wird, die in einem der oben beschriebenen Bioassays identifiziert wurde.
Die folgenden Beispiele sind dazu gedacht, die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen, ohne sie dabei einzugrenzen.
BEISPIEL I
Screening genomischer Bibliotheken
Eine Volllängen-alpha7-nAChR-Untereinheit-cDNA (Seguela et al., J. Neurosci., 13, 596–604, 1993) wurde für das Screening von 5 × 10⁵ Klonen einer lambdaCharon 4A genomischen Ratten-Bibliothek verwendet (bezogen von Dr. James Eberwine, Department of Pharmacology, University of Pennsylvania Medical School, Philadelphia, PA).
Hybridisierung wurde bei 65°C in 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,5% SDS, 100 mg/ml denaturierter Lachssperma-DNA und 0,1 % (w/v) von jeweils Ficoll, Polyvinylpyrrolidon und Rinderserum-Albumin durchgeführt. Die Filter wurden bei 45°C in 2 × SSPE (1 × SSPE ist 180mM NaCl, 9mM Na₂HPO₄, 0,9mM NaH₂PO₄ und 1 mM EDTA, pH 8,0) gewaschen. Ein Klon von ~16kb wurde isoliert, der die Exons IV und V des alpha9-Untereinheit-Gens beinhaltete.
BEISPIEL II
Screening einer cDNA Bibliothek
Ein aus codierenden Sequenzen des in BEISPIEL I beschriebenen, genomischen Rattenklons abgeleitetes PCR-Fragment (Nucleotide 283 bis 806, 1, d.h. Nucleotide 455 bis 979 der SEQ ID NO:1) wurde als Sonde verwendet, um 1 × 10⁶ Platten einer lambdaNM1149 cDNA-Bibliothek des erwachsenen Riechepithels der Ratte (erhalten von Dr. Heinz Breer und Dr. Klaus Raming, Universität Stuttgart-Hohenheim, Institut für Zoophysiologie, Stuttgart, Deutschland) zu screenen. Hybridisierung wurde wie in BEISPIEL I beschrieben durchgeführt und die Filter bei 65°C in 0,2 × SSPE gewaschen. Vier unabhängige Klone wurden isoliert, einer enthielt eine Volllängen-alpha9-cDNA (1). Die alpha9-cDNA besteht aus einem 87 bp 5'-untranslatierten Bereich, einem offenen Leserahmen von 1437 bp und einem 413 bp 3'-untranslatierten Bereich. Die Volllängen-alpha9-cDNA wurde als Sonde verwendet, um zwei in Phagenvektoren lambda DASHII und lambda FIXII eingebaute genomische Maus-(129SvJ-)Bibliotheken zu screenen. Es wurden zwei überdeckende genomische Klone erhalten (2). Diese Klone, die die gesamte codierende Sequenz des alpha9-Untereinheit-Gens umfassen, wurden in Plasmidvektoren kloniert und die Struktur des alpha9-Untereinheit-Gens dadurch bestimmt, dass über die Intron-Exon-Grenzen sequenziert wurde.
BEISPIEL III
Bestimmung und Analyse der Nucleotid-Sequenz
Der alpha9-Untereinheit-cDNA-Klon wurde unter Verwendung des Sequenase 2.0-Kit (United States Biochemical, Cleveland, OH) und synthetischer Oligonucleotid-Primer sequenziert. Ein Vergleich der alpha9-Aminosäuresequenzen mit anderen nAChR-alpha-Untereinheiten wurde unter Verwendung von Sequenzanalysesoftware der Universität von Wisconsin Genetics Computer Group [Devereux et al., Nucl. Acids. Res., 12, 387–395, 1984) durchgeführt. Der Prozentwert der Sequenzübereinstimmung der gegenübergestellten Sequenzen wurde errechnet, indem die Anzahl der gleichen Reste durch die Gesamtanzahl der Reste der kürzeren Sequenz geteilt und der Quotient mit 100 multipliziert wurde.
BEISPIEL IV
Elektrophysiologische Vorgehensweise
Eine für Xenopus-Oozyten-Expressionsstudien geeignete Volllängen-alpha9-cDNA wurde konstruiert, indem das Fragment von Nucleotid –94 bis 1766 (1; d.h. Reste 79 bis 1938, wie in SEQ ID NO:1 gezeigt) in den Expressionsvektor pGEMHE (Liman et al., Neuron, 9, 861–871, 1992) subkloniert wurde. cRNA wurde mit dem mMessage mMachine Transkriptionskit (Ambion, Austin, TX) mit durch NheI linearisierten Plasmiden hergestellt.
Die Isolierung und Erhaltung von Oozyten wurde bereits früher beschrieben (Boulter et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84, 7763–7767, 1987). In jede Oozyte wurden 1 bis 10 ng cRNA injiziert. Elektrophysiologische Aufzeichnungen wurden 2 bis 7 Tage nach der Injektion unter einer Zwei-Elektroden-Spannungsklammer mit einem Axoclamp-2A-Verstärker (Axon Instruments, Foster City, CA) durchgeführt. Spannungselektroden waren mit 3M KCl gefüllt und hatten einen Widerstand von ~10 MΩ; stromführende Elektroden waren mit 0,3M KCl gefüllt und hatten einen Widerstand von ~1 MΩ. Wenn nicht anders angegeben, lag das Haltepotential bei –50 mV. I-V-Zusammenhänge wurden mit der pClamp 5.5 Software (Axon Instruments) ermittelt, indem zwei Sekunden dauernde Spannungssteigerungen in Anwesenheit eines Agonisten aufgebracht wurden und die vor und nach der Agonistengabe ermittelten Durchschnittswerte der Kontrolle abgezogen wurden. Alle Aufzeichnungen wurden digitalisiert und in einem Computer gespeichert. Die Daten wurden mit einer Software analysiert, die von Dr. S. Traynelis (The Salk Institute for Biological Studies, La Jolla, CA) entwickelt und zur Verfügung gestellt wurde.
Oozyten waren durchgehend mit Ringer-Froschlösung (10mM HEPES, pH 7,2, 115mM NaCl, 1,8mM CaCl₂ und 2,5mM KCl) überschichtet. Es wurden keine Reaktionen gegenüber der Wirkstoffgabe an nicht-beimpfte Oozyten beobachtet. Für die Hemmungskurven (siehe 4B, 5A und 5B) wurden Antagonisten zusammen mit 10 μM Acetylcholine verabreicht. Im Fall von α-Bungarotoxin und κ-Bungarotoxin (siehe 6A und 6B) wurden die Oozyten mit diesen Wirkstoffen für 30 Minuten vorinkubiert. Der Mittelwert und der Standardfehler des Mittelwerts der Spitzenstromreaktion von wenigstens vier Oozyten pro Versuch sind in den Abbildungen dargestellt. Alle Kurvenanpassungen wurden mit der Sigma Plot Software (Jandel Scientific) mit den folgenden Gleichungen durchgeführt:

(i) Reaktion (für Konzentrations-Reaktionskurven) = [(max – min)/(1 + (EC₅₀/Konzentration)ⁿ)] + min und
(ii) Reaktion (für Konzentrations-Hemmungskurven) = [(max – min)/(1 + (Konzentration/IC₅₀)ⁿ)] + min.

Atropin-Sulphat, (–)-Nikotin-Ditartrat, (+)-Muscarin-Chlorid, Strychnin-Hydrochlorid und Oxotremorin-M wurden von RBI (Natick, MA) bezogen, kappa-Bungarotoxin wurde von Dr. V. Chiappinelli (St. Louis University Medical Center, St. Louis, MO) überlassen. Alle anderen Wirkstoffe wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) bezogen. Die Wirkstoffe wurden in Ringer-Froschlösung aufgelöst. Rinderserum-Albumin (100 mg/ml) wurde zu den Toxinlösungen hinzugefügt.
BEISPIEL V
In-situ-Hybridisierung
Es wurden Versuche an Sagittalschnitten durch die Mitte von E16-Rattenembryonen (hybridbereites Gewebe, Novagen, Madison, WI) und 20μm dicken Koronarschnitten des erwachsenen Rattenhirns nach dem von Simmons et al. in J. Histotechnol., 12, 169–181, 1989 beschriebenen Protokoll durchgeführt. Sowohl mit ³⁵S als auch mit ³²P markierte RNA-Sonden wurden aus der alpha9-cDNA (z.B. Nucleotide 283 bis 806, 1; d.h. Nucleotide 455 bis 979 der SEQ ID NO:1) abgeleitet. Hybridisierung wurde bei 65°C und abschließende Waschungen bei 72°C in 0,1 × SSC (1 × SSC ist 180mM NaCl und 17mM Natriumcitrat, pH 7,0) durchgeführt. Die Schnitte wurden in Kodak-NTB-2-Emulsion getaucht, nach dreiwöchiger Exposition bei 4°C in Kodak D19 entwickelt und nachfolgend NissI-gefärbt.
BEISPIEL VI
Vervielfältigungsreaktionen
Gewebe wurden aus erwachsenen Sprague-Dawley-Ratten entnommen. Die Tiere wurden geköpft und die Gewebe rasch präpariert und in flüssigen Stickstoff getaucht. Die vollständige RNA wurde nach Chomczynski und Sacchi (siehe Analytical Biochem., 162, 156–159, 1987) unter Verwendung des Reagens TRIzol (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) isoliert. Erststrang-cDNA wurde aus 2 μg Gesamt-RNA mit dem Superscript-Präamplifikations-System (Gibco BRL) hergestellt. Ein Aliquot mit 50ng cDNA wurde in Vervielfältigungsreaktionen als Matrize verwendet. Die folgenden für alpha9 spezifischen Primer wurden eingesetzt: Sense-Primer, Nucleotide 778 bis 802; Antisense-Primer, Nucleotid 1353 bis 1327 (1; Nucleotide 951 bis 975 bzw. Nucleotide 1526 bis 1500 von SEQ ID NO:1). Das vorhergesagte Fragment überdeckt eine Intron-Exon-Grenze. Eine 573 Basenpaar große Bande wird im Fall der Vervielfältigung von cDNA erwartet, wohingegen ein Fragment von 1450 bp das Ergebnis der Vervielfältigung kontaminierender genomischer DNA wäre. Reaktionen wurden in der folgenden Reaktionsmischung durchgeführt: 5U Taq DNA-Polymerase, 5U Taq Verstärker (Stratagene, La Jolla, CA), jeweils 5 μM Primer, jeweils 50 μM dATP, dGTP, dCTP und dTTP, 20mM Tris-HCl, pH 8,5, 10mM (H₄N)₂SO₄, 2mM MgSO₄, 0,1 % Triton X-100 und 0,1 mg/ml Rinderserum-Albumin. Zyklus Parameter waren: 2 Min. bei 95°C gefolgt von 34 Zyklen von jeweils 1 Min. bei 55°C, 1 Min. bei 72°C, 30 Sek. bei 95°C und ein abschließender Zyklus von 1 Min. bei 55°C, 5 Min. bei 72°C.
BEISPIEL VII
Detektion von alpha9-Transkripten in der Cochlea der Ratte
Um festzustellen, ob das alpha9-Gen in der Cochlea der Ratte exprimiert ist, wurden Vervielfältigungsreaktionen an aus der vollständigen RNA der Cochlea revers transkribierter cDNA durchgeführt. Wie in Beispiel V beschrieben, wurden zwei für die alpha9-Sequenz spezifische Primer eingesetzt, um ein Fragment, das eine Intron-Exon-Grenze überdeckt, zu vervielfältigen und um zusätzlich die mögliche Vervielfältigung genomischer DNA zu vermeiden. Da alpha9 im Riechepithel der Ratte vorkommt, wurde cDNA aus diesem Gewebe als Positivkontrolle verwendet. Ichiasnerv-cDNA wurde aufgenommen, um die Möglichkeit auszuschließen, dass aufgrund der für die Vervielfältigungsreaktionen verwendeten Parameter sehr kleine Mengen des Transkripts in einem der untersuchten Gewebe nachgewiesen werden. Während mit den alpha9-spezifischen Primern keine DNA aus dem Ischiasnerv vervielfältigt wurde (8), konnten sowohl alpha3- als auch alpha4-Untereinheiten mit den entsprechenden spezifischen Primern in diesen Geweben nachgewiesen werden.
Ein Fragment der erwarteten Größe (573 bp) wurde zur Vervielfältigung von alpha9-cDNA aus der Cochlea der Ratte erhalten. Analyse des Fragments mit Restriktionsendonukleasen AccI, HinfI und NcoI bestätigte weiterhin, dass es sich um ein aus alpha9-Transkripten abgeleitetes Fragment handelte.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Eine isolierte Nucleinsäure, die eine alpha9-nikotinische Acetylcholin-Rezeptor-(nAChR-)Untereinheit codiert, die wenigstens 95 % Identität mit der in SEQ ID NO:2 dargelegten Aminosäuresequenz aufweist.
Isolierte Nucleinsäure gemäß Anspruch 1, worin die Nucleinsäure DNA umfasst.
DNA gemäß Anspruch 2, worin die DNA eine cDNA ist.
DNA gemäß Anspruch 2, worin die DNA die in SEQ ID NO:2 dargelegte Aminosäuresequenz codiert.
Eine isolierte Nucleinsäure, die unter hochstringenten Bedingungen mit dem Komplement von SEQ ID NO:1 hybridisiert und wenigstens 14 zusammenhängende Nucleotide von SEQ ID NO:1 umfasst.
Eine isolierte Nucleinsäure, die DNA umfasst, worin die Nucleotidsequenz der DNA zu wenigstens 90 % identisch mit der in SEQ ID NO:1 dargelegten Nucleotidsequenz oder dem Komplement davon ist.
Ein Vektor, der DNA gemäß Anspruch 1, 5 oder 6 umfasst.
Eine Wirtszelle, die einen Vektor gemäß Anspruch 7 enthält.
Eine Wirtszelle gemäß Anspruch 8, worin die Zelle funktionellen nACh-Rezeptor exprimiert, der wenigstens eine Alpha9-nAChR-Untereinheit umfasst, die wenigstens 95 % Identität mit der in SEQ ID NO:2 dargelegten Aminosäuresequenz aufweist, worin der funktionelle nACh-Rezeptor einen Ionenkanal ausbildet, der sich bei Ligandenbindung daran öffnet.
Eine Wirtszelle gemäß Anspruch 9, worin der Rezeptor homomer ist.
Eine Wirtszelle gemäß Anspruch 9, worin der Rezeptor heteromer ist.
Eine Nucleinsäurensonde, die wenigstens 25 zusammenhängende Nucleotide von SEQ ID NO:1 umfasst und die Sonde unter hochstringenten Bedingungen mit SEQ ID NO:1 hybridisiert.
Isolierte mRNA, die komplementär zu Nucleinsäure gemäß Anspruch 1, 5 oder 6 ist.
Ein Antisense-Oligonucleotid, das speziell an die mRNA der Alpha9-nAChR-Untereinheit gemäß Anspruch 1, 5 oder 6 bindet und die Translation davon moduliert.
Ein funktioneller nikotinischer Acetylcholin-Rezeptor, der rekombinant in einer Wirtszelle exprimiert ist, wobei der Rezeptor dadurch gekennzeichnet ist, dass (i) er in Hypophyse, Riechepithel, Cochlea und Zunge exprimiert ist; (ii) er durch Acetylcholin aktiviert, aber durch Nicotin und Muscarin blockiert wird und (iii) wenigstens eine alpha9-nikotinische Acetylcholin-Rezeptor-Untereinheit umfasst, die wenigstens 95 % Identität mit der in SEQ ID NO:2 dargelegten Aminosäuresequenz aufweist, worin der funktionelle nACh-Rezeptor einen Ionenkanal ausbildet, der sich bei Ligandenbindung daran öffnet.
Ein Antikörper, der spezifische Reaktivität mit einer alpha9-nikotinischen Acetylcholin-Rezeptor-Untereinheit aufweist, die wenigstens 95 % Identität mit der in SEQ ID NO:2 dargelegten Aminosäuresequenz aufweist.
Ein Antikörper gemäß Anspruch 16, worin der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Ein Antikörper gemäß Anspruch 16, worin der Antikörper ein polyklonaler Antikörper ist.
Eine Zusammensetzung, die umfasst: – eine Menge eines Oligonucleotids gemäß Anspruch 14, das zur Modulation der Expression eines nikotinischen Acetylcholin-Rezeptors wirksam ist, der wenigstens eine Alpha9-Untereinheit umfasst, die wenigstens 95 % Identität mit der in SEQ ID NO:2 dargelegten Aminosäuresequenz aufweist, und – einen akzeptablen hydrophoben Träger, der imstande ist, durch eine Zellmembran hindurchzugehen.
Ein transgenes Säugetier, das DNA exprimiert, die eine alpha9-nikotinische Acetylcholin-Rezeptor-Untereinheit codiert, die wenigstens 95 % Identität mit der in SEQ ID NO:2 dargelegten Aminosäuresequenz aufweist, worin die DNA rekombinant eingeführte exogene DNA ist.
Ein transgenes Säugetier gemäß Anspruch 20, worin die Rezeptor-Untereinheit codierende DNA derart mutiert wurde, dass der exprimierte Rezeptor keine Wildtyp-Alpha9-Nicotin-Acetylcholin-Rezeptor-Untereinheiten enthält.
Ein transgenes Säugetier gemäß Anspruch 20, worin das transgene Säugetier eine Maus ist.
Ein Verfahren zur Identifizierung von Nucleinsäuren, die alpha9-nikotinische Acetylcholin-Rezeptor-Untereinheiten codieren, die wenigstens 95 % Identität mit der in SEQ ID NO:2 dargelegten Aminosäuresequenz aufweisen, wobei das Verfahren umfasst: – Kontaktieren einer Substanzprobe, die eine Population von Nucleinsäuren enthält, mit einer Sonde gemäß Anspruch 12, worin das Kontaktieren unter hochstringenten Hybridisierungsbedingungen bewirkt wird, und – Identifizieren von Nucleinsäuren, die mit der Sonde hybridisieren.
Ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die an alpha9-nikotinische Acetylcholin-Rezeptor-Untereinheit/en binden, die wenigstens 95 % Identität mit der in SEQ ID NO:2 dargelegten Aminosäuresequenz aufweisen, wobei das Verfahren Kontaktieren von Zellen gemäß Anspruch 9 mit Testverbindung und Identifizieren von Verbindungen umfasst, die daran binden.
Ein Bioassay zur Identifizierung von Verbindungen, weiche die Aktivität nikotinischer Acetylcholin-Rezeptoren modulieren, die wenigstens eine Alpha9-Untereinheit umfassen, die wenigstens 95 % Identität mit der in SEQ ID NO:2 dargelegten Aminosäuresequenz aufweist, wobei das Verfahren umfasst: – Kontaktieren von Zellen gemäß Anspruch 9 mit wenigstens einer Verbindung, worin die Eignung der Verbindung zum Modulieren des Ionenkanals des Rezeptors unbekannt ist; und – Überwachen der Zellen auf Veränderungen in der Ionenkanalaktivität.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 25, worin die Zellen mit wenigstens einem potentiellen Agonisten kontaktiert werden.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 25, worin die Zellen mit einer gleichbleibenden Menge des Agonisten und zunehmenden Mengen wenigstens eines potentiellen Antagonisten kontaktiert werden.
Ein Bioassay zur Identifizierung von Verbindungen, welche den/die regulatorischen Bereich/e des alpha9-nikotinischen Acetylcholin-Rezeptor-Untereinheitengens modulieren, wobei das Verfahren umfasst: – Transformieren von Säugerzellen mit einem Nucleinsäurekonstrukt, das wenigstens einen Teil des regulatorischen Bereiches des Alpha9-Gens umfasst, worin der Teil des Regulatorgens wirksam mit einem Reportergen verbunden ist und worin der regulatorische Bereich die Nucleotide 1–87 von SEQ ID NO:1 umfasst; – Kontaktieren der transformierten Zellen mit wenigstens einer Verbindung, worin die Eignung der Verbindung zum Modulieren des regulatorischen Bereiches des Alpha9-Rezeptor-Untereinheitengens unbekannt ist; und – Überwachen der Zellen auf Expression des Reportergens.