DE69632830T2 - Rezeptor und dafür kodierendes nukleinsäuremolekül - Google Patents
Rezeptor und dafür kodierendes nukleinsäuremolekül Download PDFInfo
- Publication number
- DE69632830T2 DE69632830T2 DE69632830T DE69632830T DE69632830T2 DE 69632830 T2 DE69632830 T2 DE 69632830T2 DE 69632830 T DE69632830 T DE 69632830T DE 69632830 T DE69632830 T DE 69632830T DE 69632830 T2 DE69632830 T2 DE 69632830T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- receptor
- cell
- nucleic acid
- ligand
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 59
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 55
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 55
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 53
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 13
- 239000002719 pyrimidine nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 11
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 claims abstract description 11
- 239000002213 purine nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 10
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims abstract description 6
- 125000000561 purinyl group Chemical class N1=C(N=C2N=CNC2=C1)* 0.000 claims abstract 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 203
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 201
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 128
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 65
- PGAVKCOVUIYSFO-XVFCMESISA-N UTP Chemical group O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 PGAVKCOVUIYSFO-XVFCMESISA-N 0.000 claims description 57
- 229950010342 uridine triphosphate Drugs 0.000 claims description 57
- PGAVKCOVUIYSFO-UHFFFAOYSA-N uridine-triphosphate Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 PGAVKCOVUIYSFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 57
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 36
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 36
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims description 33
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 25
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 23
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 21
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 18
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 14
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 13
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 claims description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 12
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 10
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 10
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 9
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 7
- INAPMGSXUVUWAF-GCVPSNMTSA-N [(2r,3s,5r,6r)-2,3,4,5,6-pentahydroxycyclohexyl] dihydrogen phosphate Chemical compound OC1[C@H](O)[C@@H](O)C(OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O INAPMGSXUVUWAF-GCVPSNMTSA-N 0.000 claims description 7
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 6
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 claims description 6
- 150000001982 diacylglycerols Chemical class 0.000 claims description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 3
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 2
- 230000027425 release of sequestered calcium ion into cytosol Effects 0.000 claims description 2
- 238000003572 second messenger assay Methods 0.000 claims description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims 8
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims 1
- 208000024335 physical disease Diseases 0.000 claims 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 claims 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 abstract description 3
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 abstract 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 abstract 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 31
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 24
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 101001120086 Homo sapiens P2Y purinoceptor 12 Proteins 0.000 description 11
- 102000043971 human P2RY12 Human genes 0.000 description 11
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 10
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 9
- PNFZSRRRZNXSMF-UHFFFAOYSA-N 5'-phosphopyridoxal-6-azobenzene-2,4-disulfonic acid Chemical compound O=CC1=C(O)C(C)=NC(N=NC=2C(=CC(=CC=2)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)=C1COP(O)(O)=O PNFZSRRRZNXSMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 8
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 8
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 7
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 5
- IWFHOSULCAJGRM-UAKXSSHOSA-N 5-bromouridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 IWFHOSULCAJGRM-UAKXSSHOSA-N 0.000 description 5
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 5
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 5
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 5
- HAEJPQIATWHALX-KQYNXXCUSA-J ITP(4-) Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 HAEJPQIATWHALX-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 5
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 5
- 102000002298 Purinergic P2Y Receptors Human genes 0.000 description 5
- 108010000818 Purinergic P2Y Receptors Proteins 0.000 description 5
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 5
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 5
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 4
- XCCTYIAWTASOJW-XVFCMESISA-N Uridine-5'-Diphosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 XCCTYIAWTASOJW-XVFCMESISA-N 0.000 description 4
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000019025 Calcium-Calmodulin-Dependent Protein Kinases Human genes 0.000 description 3
- 108010026870 Calcium-Calmodulin-Dependent Protein Kinases Proteins 0.000 description 3
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 108010080192 Purinergic Receptors Proteins 0.000 description 3
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- FIAFUQMPZJWCLV-UHFFFAOYSA-N suramin Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC(S(O)(=O)=O)=C2C(NC(=O)C3=CC=C(C(=C3)NC(=O)C=3C=C(NC(=O)NC=4C=C(C=CC=4)C(=O)NC=4C(=CC=C(C=4)C(=O)NC=4C5=C(C=C(C=C5C(=CC=4)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)C)C=CC=3)C)=CC=C(S(O)(=O)=O)C2=C1 FIAFUQMPZJWCLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005314 suramin Drugs 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 2
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 2
- 102100037601 P2X purinoceptor 4 Human genes 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 102000002294 Purinergic P2X Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010000836 Purinergic P2X Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000000033 Purinergic Receptors Human genes 0.000 description 2
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 2
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 2
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 2
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- AIXAANGOTKPUOY-UHFFFAOYSA-N carbachol Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCOC(N)=O AIXAANGOTKPUOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004484 carbachol Drugs 0.000 description 2
- JFRSSYYNWAGMIW-UHFFFAOYSA-M cesium;guanidine;thiocyanic acid;chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+].SC#N.NC(N)=N JFRSSYYNWAGMIW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- ZINJLDJMHCUBIP-UHFFFAOYSA-N ethametsulfuron-methyl Chemical compound CCOC1=NC(NC)=NC(NC(=O)NS(=O)(=O)C=2C(=CC=CC=2)C(=O)OC)=N1 ZINJLDJMHCUBIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N glyoxal Chemical compound O=CC=O LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 2
- -1 inositol phosphates Chemical class 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 2
- CDQDCIXXBFSRJQ-UHFFFAOYSA-N 2-phenoxy-1-[4-(2-phenoxyacetyl)piperazin-1-yl]ethanone Chemical compound C1CN(C(=O)COC=2C=CC=CC=2)CCN1C(=O)COC1=CC=CC=C1 CDQDCIXXBFSRJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical class NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007347 Apyrase Human genes 0.000 description 1
- 108010007730 Apyrase Proteins 0.000 description 1
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000014415 Muscarinic acetylcholine receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050003473 Muscarinic acetylcholine receptor Proteins 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 102100028045 P2Y purinoceptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 229920000388 Polyphosphate Polymers 0.000 description 1
- 102000004257 Potassium Channel Human genes 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010085249 Purinergic P2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- JQYMGXZJTCOARG-UHFFFAOYSA-N Reactive blue 2 Chemical compound C1=2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C=2C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C1NC(C=C1S(O)(=O)=O)=CC=C1NC(N=1)=NC(Cl)=NC=1NC1=CC=CC(S(O)(=O)=O)=C1 JQYMGXZJTCOARG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- MMWCIQZXVOZEGG-HOZKJCLWSA-N [(1S,2R,3S,4S,5R,6S)-2,3,5-trihydroxy-4,6-diphosphonooxycyclohexyl] dihydrogen phosphate Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@H]1OP(O)(O)=O MMWCIQZXVOZEGG-HOZKJCLWSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-MVKANHKCSA-N [[(2R,3S,4R,5R)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxy(32P)phosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO[32P](O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-MVKANHKCSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229950006790 adenosine phosphate Drugs 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229940015043 glyoxal Drugs 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000005567 liquid scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001205 polyphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011176 polyphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 108020001213 potassium channel Proteins 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002287 radioligand Substances 0.000 description 1
- 238000003653 radioligand binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000002023 somite Anatomy 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- UEEFBRHXFDJPTA-KWIZKVQNSA-J tetrasodium;[[[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-amino-2-methylsulfanylpurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-oxidophosphoryl]oxy-oxidophosphoryl] phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C12=NC(SC)=NC(N)=C2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O UEEFBRHXFDJPTA-KWIZKVQNSA-J 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N tris phosphate Chemical compound OP(O)(O)=O.OCC(N)(CO)CO JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N uridine 5'-monophosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 210000001177 vas deferen Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Rezeptor mit einer Bevorzugung von Pyrimidin-Nukleotiden, vorzugsweise Uridin-Triphosphat, gegenüber Purin-Nukleotiden, und das Nukleinsäuremolekül, das den Rezeptor kodiert, Vektoren, die das Nukleinsäuremolekül umfassen, Zellen, die mit dem Vektor transformiert wurden, Antikörper, die gegen den Rezeptor gerichtet sind, Nukleinsäuresonden, die gegen das Nukleinsäuremolekül gerichtet sind, pharmazeutische Zusammensetzungen, welche die Produkte umfassen und nicht-humane transgene Tiere, die den erfindungsgemäßen Rezeptor oder das dem Rezeptor entsprechende Nukleinsäuremolekül exprimieren.
- Darüber hinaus stellt die Erfindung Verfahren für die Bestimmung einer Ligandenbindung, für den Nachweis einer Expression, für das Screenen nach Wirkstoffen, die spezifisch molekular an den Rezeptor binden und für eine Behandlung, die den erfindungsgemäßen Rezeptor beinhaltet, bereit.
- Seit 1993 wurde die Klonierung mehrerer ATP-Rezeptoren berichtet. Um bei dem neuesten Vorschlag zur Nomenklatur zu bleiben, können diese P2 purinergen Rezeptoren in zwei Klassen unterteilt werden: G-Protein gekoppelte Rezeptoren, oder P2Y-Rezeptoren, und Rezeptoren mit intrinsischer Ionenkanalaktivität, oder P2X-Rezeptoren (2). Aus der Ratte wurden zwei verschiedene P2X-Rezeptoren kloniert, aus dem Vas deferens (3) bzw. aus Phaechromozytom-PC12-Zellen (4): sie besitzen eine charakteristische räumliche Struktur mit zwei hydrophoben vermutlich Membran durchspannenden Segmenten und einem Ionenporenmotiv, das an Kaliumkanäle erinnert. In der P2Y-Familie wurden die Sequenzen zweier Subtypen veröffentlicht, die beide an die Phospholipase C gekoppelt sind: P2Y1-Rezeptoren (ehemals P2Y genannt) aus dem Huhn (5), dem Truthahn (6), dem Rind (7), der Maus und der Ratte (8); P2Y2-Rezeptoren (ehemals P2U genannt) aus der Maus (9, 10), der Ratte (11) und dem Menschen (12) andererseits. Darüber hinaus wurde ein P2Y3-Rezeptor aus dem Hühnergehirn kloniert, der eine Bevorzugung von ADP gegenüber ATP besitzt, aber seine Sequenz wurde noch nicht veröffentlicht (13). Ferner zeigt der 6H1-Rezeptor unbekannter Funktion, der aus aktivierten T-Lymphozyten des Huhns kloniert wurde, einen signifikanten Grad an Homologie zu den P2Y1- und P2Y2-Rezeptoren, was nahe legt, dass er ebenfalls zur P2Y-Familie gehört, obwohl seine Reaktivität gegenüber Nukleotiden noch nicht gezeigt wurde (14).
- Die Erfindung stellt einen Rezeptor mit einer Bevorzugung von Pyrimidin-Nukleotiden, vorzugsweise Uridin-Triphosphat, gegenüber Purin-Nukleotiden bereit. Ein Rezeptor mit einer Bevorzugung von Pyrimidin-Nukleotiden gegenüber Purin-Nukleotiden bedeutet einen Rezeptor, bei dem Pyrimidin-Nukleotide und Purin-Nukleotide nicht gleich aktiv und gleich wirksam sind. Dies bedeutet, dass der erfindungsgemäße Rezeptor in Gegenwart dieser Agonisten eher gegen geringere Konzentrationen von Pyrimidin-Nukleotiden, vorzugsweise Uridin-Trisphosphat, als gegenüber Purin-Nukleotiden eine funktionale Reaktion (vorzugsweise die Akkumulation von Inositol-Triphosphat (IP3), Diacylglyzerin (DAG) oder Calciumionen) zeigt oder bei einer ähnlichen Konzentration gegenüber dem Pyrimidin-Nukleotid eine wichtigere funktionale Reaktion zeigt als gegenüber dem Purin-Nukleotid.
- Die Inositolphosphat (IP3)-Akkumulation nach Gabe der Agonisten ist unten in der Beschreibung beschrieben.
- Vorteilhafterweise besitzt der erfindungsgemäße Rezeptor wenigstens eine zweifache, vorzugsweise eine zehnfache bis einhundertfache Bevorzugung von Pyrimidin-Nukleotiden gegenüber Purin-Nukleotiden.
- Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Rezeptors wird durch eine Bevorzugung von Uridin-Triphosphat gegenüber Adenin-Nukleotiden gekennzeichnet.
- Der erfindungsgemäße Rezeptor ist ein Rezeptor, vorzugsweise ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor, der strukturell der purinergen Rezeptorfamilie (P2Y-Familie) angehört, aber funktional ein pyrimidinerger Rezeptor, vorzugsweise ein UTP-spezifischer Rezeptor, ist.
- Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Rezeptor ein humaner Rezeptor.
- Der Rezeptor besitzt eine Aminosäuresequenz, die zu mehr als 60% homolog zu der in
1 dargestellten Aminosäuresequenz ist. Vorzugsweise besitzt die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Rezeptors wenigstens die Aminosäuresequenz, die in1 dargestellt ist oder einen Teil davon. - Ein Teil der Aminosäuresequenz bedeutet ein Peptid oder ein Protein, welches die selben Bindungseigenschaften wie der erfindungsgemäße Rezeptor besitzen (d. h. ein Peptid oder ein Protein, das durch eine Bevorzugung von Pyrimidin-Nukleotiden, vorzugsweise UTP, gegenüber Purin-Nukleotiden gekennzeichnet ist).
- Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Nukleinsäuremolekül wie ein DNA-Molekül oder ein RNA-Molekül, das den erfindungsgemäßen Rezeptor kodiert.
- Vorzugsweise ist das DNA-Molekül ein cDNA-Molekül oder ein genomisches DNA-Molekül.
- Vorzugsweise ist das Nukleinsäuremolekül mehr als 60% homolog zu der DNA-Sequenz, die in
1 dargestellt ist. - Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül wenigstens die DNA-Sequenz, die in
1 dargestellt ist, oder ein Teil davon. "Ein Teil einer Nukleinsäuresequenz" bedeutet eine Nukleinsäuresequenz, die wenigstens einen Teil der Aminosäuresequenz, wie oben beschrieben, kodiert. - Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Vektor, der das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül umfasst. Vorzugsweise ist der Vektor an eine Expression in einer Zelle angepasst und umfasst die regulatorischen Elemente, die nötig sind, um das Aminosäuremolekül in der Zelle zu exprimieren, wobei die regulatorischen Elemente operativ mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz verbunden sind, um ihre Expression zu erlauben.
- Vorzugsweise wird die Zelle aus bakteriellen Zellen, Hefezellen, Insektenzellen oder Säugetierzellen ausgewählt. Der erfindungsgemäße Vektor ist ein Plasmid oder ein Virus, vorzugsweise ein Baculovirus, ein Adenovirus oder ein Semliki-Forest-Virus.
- Das Plasmid kann pcDNA3-P2Y4 sein.
- Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Zelle (vorzugsweise eine Säugetierzelle, wie eine 1321N1-Zelle), die mit dem erfindungsgemäßen Vektor transformiert wurde. Vorteilhafterweise ist die Zelle vorzugsweise nicht-neuronalen Ursprungs und wird aus einer COS-7-Zelle, einer LM-(tk-)-Zelle, einer NIH-3T3-Zelle oder einer 1321N1-Zelle ausgewählt.
- Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Antikörper, der in der Lage ist, die Bindung eines Liganden an den erfindungsgemäßen Rezeptor kompetitiv zu inhibieren.
- Vorzugsweise ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper.
- Die vorliegende Erfindung betrifft auch den monoklonalen Antikörper, der gegen ein Epitop des erfindungsgemäßen Rezeptors gerichtet ist und auf der Oberfläche einer Zelle, die den Rezeptor exprimiert, vorliegt.
- Die Erfindung betrifft auch die pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge des erfindungsgemäßen Oligonukleotids umfasst, die wirksam ist, die Aktivität des Rezeptors zu senken, indem es durch eine Zellmembran tritt und spezifisch an eine mRNA bindet, die den erfindungsgemäßen Rezeptor in der Zelle kodiert, um so seine Translation zu verhindern. Die pharmazeutische Zusammensetzung umfasst auch einen pharmazeutisch verträglichen Träger, der in der Lage ist, durch die Zellmembran zu treten.
- Vorzugsweise ist in der pharmazeutischen Zusammensetzung das Oligonukleotid an eine Substanz gekoppelt, beispielsweise ein Ribozym, die mRNA inaktiviert.
- Vorzugsweise umfasst der pharmazeutisch verträgliche Träger eine Struktur, welche an einen Rezeptor auf einer Zelle bindet und die in der Lage ist, nach Bindung der Struktur von der Zelle aufgenommen zu werden. Die Struktur des pharmazeutisch verträglichen Trägers in der pharmazeutischen Zusammensetzung ist in der Lage, an einen Rezeptor zu binden, der für einen ausgewählten Zelltyp spezifisch ist.
- Vorzugsweise umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung eine Menge des erfindungsgemäßen Antikörpers, die wirksam ist, um die Bindung eines Liganden an den erfindungsgemäßen Rezeptor zu blockieren und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
- Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein transgenes, nicht-menschliches Säugetier, welches das Nukleinsäuremolekül, das den erfindungsgemäßen Rezeptor kodiert, überexprimiert (oder ektopisch exprimiert).
- Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein transgenes, nicht-menschliches Säugetier, welches einen Knockout des natürlichen erfindungsgemäßen Rezeptors durch homologe Rekombination umfasst.
- Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, umfasst das Genom des transgenen nicht-menschlichen Säugetiers eine Antisense-Nukleinsäure, die zu der erfindungsgemäßen Nukleinsäure komplementär ist, und die so platziert ist, dass sie in Antisense-mRNA transkribiert wird, die zu der mRNA komplementär ist, die den erfindungsgemäßen Rezeptor kodiert und die mit der mRNA hybridisiert, welche den Rezeptor kodiert, wodurch seine Translation verringert wird. Vorzugsweise umfasst das erfindungsgemäße transgene, nicht-menschliche Säugetier ein Nukleinsäuremolekül, das den erfindungsgemäßen Rezeptor kodiert und zusätzlich einen induzierbaren Promotor oder ein gewebespezifisches regulatorisches Element.
- Vorzugsweise ist das transgene, nicht-menschliche Säugetier eine Maus.
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Bestimmung, ob ein Ligand spezifisch an den erfindungsgemäßen Rezeptor gebunden werden kann, wobei das Verfahren die Schritte umfasst, eine Zelle, die mit einem Vektor transfiziert wurde, der die den Rezeptor kodierende Nukleinsäure exprimiert, mit dem Liganden, unter Bedingungen, welche die Bindung des Liganden an einen solchen Rezeptor erlauben, in Kontakt zu bringen und die Gegenwart eines spezifisch an den Rezeptor gebundenen Liganden nachzuweisen, wodurch bestimmt wird, ob der Ligand spezifisch an den Rezeptor bindet.
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Bestimmung, ob ein Ligand spezifisch an einen erfindungsgemäßen Rezeptor binden kann, wobei das Verfahren die Schritte umfasst, einen Zellextrakt von Zellen herzustellen, die mit einem Vektor transfiziert wurden, der die den Rezeptor kodierende Nukleinsäure exprimiert, eine Membranfraktion aus diesem Zellextrakt zu isolieren, den Liganden mit dieser Membranfraktion, unter Bedingungen, welche die Bindung des Liganden an einen solchen Rezeptor erlauben, in Kontakt zu bringen und die Gegenwart eines an den Rezeptor gebundenen Liganden nachzuweisen und dadurch zu bestimmen, ob der Ligand in der Lage ist, spezifisch an den Rezeptor zu binden. Vorzugsweise wird das Verfahren verwendet, wenn der Ligand nicht im voraus bekannt ist.
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Bestimmung, ob ein Ligand ein Agonist des erfindungsgemäßen Rezeptors ist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst, eine Zelle, die mit einem Vektor transfiziert wurde, der die den Rezeptor kodierende Nukleinsäure exprimiert, mit dem Liganden, unter Bedingungen, welche die Aktivierung einer funktionellen Antwort des Rezeptors durch die Zelle erlauben, in Kontakt zu bringen und mittels eines Bioassays, wie eine Änderung der Konzentration eines sekundären Botenstoffs oder eine Änderung des zellulären Stoffwechsels (vorzugsweise bestimmt durch die Ansäuerungsrate des Kulturmediums), eine Steigerung der Rezeptoraktivität nachzuweisen, wodurch bestimmt wird, ob der Ligand ein Agonist des Rezeptors ist.
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Bestimmung, ob ein Ligand ein Agonist des erfindungsgemäßen Rezeptors ist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst, einen Zellextrakt von Zellen herzustellen, die mit einem Vektor transfiziert wurden, der die den Rezeptor kodierende Nukleinsäure exprimiert, eine Membranfraktion aus diesem Zellextrakt zu isolieren, diese Membranfraktion mit dem Liganden, unter Bedingungen, welche die Aktivierung einer funktionellen Antwort des Rezeptors erlauben, in Kontakt zu bringen und mittels eines Bioassays, wie eine Änderung der Produktion eines sekundären Botenstoffs, eine Steigerung der Rezeptoraktivität nachzuweisen, wodurch bestimmt wird ob der Ligand ein Agonist des Rezeptors ist.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die Bestimmung, ob ein Ligand ein Antagonist des erfindungsgemäßen Rezeptors ist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst, eine Zelle, die mit einem Vektor transfiziert wurde, der die den Rezeptor kodierende Nukleinsäure exprimiert, mit dem Liganden in Gegenwart eines bekannten Agonisten des Rezeptors, unter Bedingungen, welche die Aktivierung einer funktionellen Antwort des Rezeptors erlauben, in Kontakt zu bringen und mittels eines Bioassays, wie eine Änderung der Konzentration eines sekundären Botenstoffs oder eine Änderung des zellulären Stoffwechsels (vorzugsweise bestimmt durch die Ansäuerungsrate des Kulturmediums) eine Abnahme der Rezeptoraktivität nachzuweisen, wodurch bestimmt wird, ob der Ligand ein Antagonist des Rezeptors ist.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die Bestimmung, ob ein Ligand ein Antagonist des erfindungsgemäßen Rezeptors ist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst, einen Zellextrakt von Zellen herzustellen, die mit einem Vektor transfiziert wurden, der die den Rezeptor kodierende Nukleinsäure exprimiert, eine Membranfraktion aus diesem Zellextrakt zu isolieren, diese Membranfraktion in Gegenwart eines bekannten Agonisten des Rezeptors mit dem Liganden, unter Bedingungen, welche die Aktivierung einer funktionellen Antwort des Rezeptors erlauben, in Kontakt zu bringen und mittels eines Bioassays, wie eine Änderung der Konzentration eines sekundären Botenstoffs, eine Abnahme der Rezeptoraktivität nachzuweisen, wodurch bestimmt wird, ob der Ligand ein Antagonist des Rezeptors ist.
- Vorzugsweise umfasst der Sekundäre-Botenstoff-Assay die Messung der intrazellulären cAMP-, intrazellulären Inositolphosphat (IP3)-, intrazellulären Diacylglyzerin-(DAG)-Konzentration oder der intrazellulären Calciummobilisierung.
- Vorzugsweise ist die in dem Verfahren verwendete Zelle eine Säugetierzelle nicht-neuronalen Ursprungs, beispielsweise eine COS-7-Zelle, eine CHO-Zelle, eine LM (tk-)-Zelle, eine NIH-3T3-Zelle oder 1321N1.
- Bei diesen Verfahren ist der Ligand nicht im Voraus bekannt.
- Die Erfindung betrifft auch den Liganden, der mit einem der vorhergehenden Verfahren isoliert und detektiert wurde.
- Die vorliegende Erfindung betrifft auch die pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge eines Agonisten oder Antagonisten des erfindungsgemäßen Rezeptors umfasst, wobei die Menge wirksam ist, um die Aktivität des Rezeptors zu reduzieren, sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
- Der Agonist oder Antagonist kann in einer pharmazeutischen Zusammensetzung z. B. für die Behandlung der zystischen Fibrose verwendet werden, und das erfindungsgemäße Verfahren kann vorteilhaft beim Nachweis verbesserter Wirkstoffe verwendet werden, die für die Behandlung der zystischen Fibrose verwendet werden.
- Daher können die vorhergehend beschriebenen Verfahren zur Durchmusterung von Wirkstoffen verwendet werden, um Wirkstoffe zu identifizieren, die spezifisch an den erfindungsgemäßen Rezeptor binden.
- Die Erfindung betrifft auch die Wirkstoffe, die mit einer dieser Verfahren isoliert und nachgewiesen wurden.
- Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche diese Wirkstoffe und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
- Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Nachweis der Expression eines erfindungsgemäßen Rezeptors mittels eines Nachweises der Gegenwart von mRNA, die den Rezeptor kodiert, wobei das Verfahren die Gewinnung von Gesamt-RNA oder Gesamt-mRNA der Zelle, das In-Kontakt-Bringen der so gewonnenen RNA oder mRNA mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresonde unter Hybridisierungsbedingungen und Nachweis der Gegenwart von mRNA, die mit der Sonde hybridisiert, umfasst, wodurch die Expression des Rezeptors durch die Zelle nachgewiesen wird.
- Die Hybridisierungsbedingungen sind stringente Bedingungen.
- Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung und/oder Vorbeugung zystischer Fibrose.
- Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren, um eine Veranlagung zu einer Erkrankung zu diagnostizieren, die mit der Aktivität des erfindungsgemäßen Rezeptors assoziiert ist. Dieses Verfahren umfasst folgende Schritte:
- a) Ausführung eines Restriktionsverdaus mit einer Reihe von Restriktionsenzymen mit Nukleinsäuren von Individuen, die an diesen Erkrankungen leiden;
- b) elektrophoretische Trennung der resultierenden Nukleinsäurefragmente auf einem Größengel;
- c) In-Kontakt-Bringen des resultierenden Gels mit einer Nukleinsäuresonde, die in der Lage ist, spezifisch an diese Nukleinsäure zu hybridisieren und mit einer nachweisbaren Markierung markiert ist;
- d) Nachweis der markierten Banden, die an die mit einem nachweisbaren Marker markierten Nukleinsäuren, unter Erzeugung eines einzigartigen Bandenmusters, hybridisiert haben, welches spezifisch für die Individuen ist, die an den Erkrankungen leiden;
- e) Herstellung von Nukleinsäuren für die Diagnoseschritte a)–e); und
- f) Vergleich des einzigartigen Bandenmusters, welches für die Nukleinsäuren von Individuen spezifisch ist, die an der Erkrankung von Schritt d) leiden, mit der Nukleinsäure für die Diagnose von Schritt e), um festzustellen, ob die Muster dieselben oder unterschiedlich sind und um damit die Veranlagung für die Erkrankung zu diagnostizieren, wenn die Muster dieselben sind.
- Ein letzter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Rezeptors, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
- a) Konstruktion eines für die Expression in einer Zelle angepassten Vektors, der die regulatorischen Elemente beinhaltet, die für die Expression von Nukleinsäuren in der Zelle nötig sind und die funktionell an die Nukleinsäure gekoppelt sind, welche den Rezeptor kodiert, um somit seine Expression zu gewährleisten, wobei die Zelle aus bakteriellen Zellen, Hefezellen, Insektenzellen und Säugetierzellen ausgewählt wird;
- b) Einbringen des Vektors von Schritt a) in eine geeignete Wirtszelle;
- c) Inkubation der Zelle von Schritt b) unter Bedingungen, welche die Expression des erfindungsgemäßen Rezeptors erlauben;
- d) Gewinnung des so erhaltenen Rezeptors; und
- e) Aufreinigung des so gewonnenen Rezeptors, wodurch ein isolierter erfindungsgemäßer Rezeptor zubereitet wird.
-
1 stellt die Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen humanen P2Y4-Rezeptors dar. Die putativen Membran spannenden Domänen sind unterstrichen und mit I bis VII nummeriert. Die zwischen allen P2Y-Rezeptoren konservierte Konsensussequenz und die drei Aminosäuren (AHN), welche der RGD-Sequenz in der ersten extrazellulären Schleife des P2Y2-Rezeptors entsprechen, sind fett gedruckt dargestellt. Die putativen Phosphorylierungsstellen für PKC oder Calmodulin-abhängige Proteinkinasen und PKC sind mit schwarzen Quadraten () bzw. mit offenen Kreisen (O) entsprechend angezeigt.
-
2 ist ein Dendrogramm, das die strukturelle Verwandtschaft zwischen den klonierten P2Y-Rezeptoren und den nächsten Nachbarn in der G-Protein-gekoppelten Rezeptorfamilie darstellt. Die Darstellung wurde mit dem multiplen Sequenz-Alignment-Programm Pileup des GCG Software Pakets (26) gemacht. Für jede Sequenz berücksichtigt die Analyse ein Segment, das die ersten fünf putativen Membran spannenden Domänen umfasst. -
3 stellt eine Northern Blot-Analyse der Expression des P2Y4-Rezeptors dar. Der Northern Blot wurde mit 15 μg Gesamt-RNA aus einer humanen Plazenta und 4 μg Poly(A)+ RNA aus K562-Zellen und aus zwei unterschiedlichen humanen Plazentas ausgeführt. Bei der Sonde handelte es sich um ein humanes P2Y4-Genfragment, das mittels PCR amplifiziert wurde (TM2 bis TM7). -
4 stellt den Zeitverlauf der InsP3-Akkumulation in 1321N1-Zellen dar, die den humanen P2Y4-Rezeptor exprimieren. 3H-Inositol-markierte Zellen wurden für die angezeigte Zeit mit UTP (100 μM), UDP (100 μM) und ATP (100 μM) in Abwesenheit von 10 mM LiCl (Teilabbildung A) oder in seiner Gegenwart (Teilabbildung B) inkubiert. Die Daten stellen den Mittelwert dreier Einzelexperimente dar und bezeichnen zwei unabhängige Experimente. -
5 stellt die Wirkung von ATP auf die Akkumulation von InsP3 dar, die mit UTP in transfizierten 1321N1-Zellen induziert wurde. Konzentrationskurven von ATP in der Gegenwart von UTP 10 oder 100 μM bei 30 s (Teilabbildung A) und 20 min. (Teilabbildung B). Konzentrations-Wirkungs-Kurve von ATP mit oder ohne UTP (10 μM) bei 20 min. (Teilabbildung C). Die Daten stellen den Mittelwert ±S. D. dreier Einzelexperimente dar und bezeichnen zwei (Teilabbildung A), fünf (Teilabbildung B) oder drei (Teilabbildung C) unabhängige Experimente. -
6 stellt die Konzentrations-Wirkungs-Kurven von UTP und UDP auf die InsP3-Akkumulation in drei unterschiedlichen Klonen von transfizierten 1321N1-Zellen dar. - Die Zellen wurden in Gegenwart verschiedener UTP-( ) und UDP-() Konzentrationen (0, 0,1, 1, 3, 10 und 100 μM) für 30 s oder 20 min. inkubiert. Die Daten stellen den Mittelwert ±S. D. dreier Einzelexperimente dar, die in einem repräsentativen Experiment gewonnen wurden. Die EC50-Werte wurden durch eine Kurvenanpassung (Sigma Plot: Version 2.0) bestimmt.
-
7 stellt die Wirkung verschiedener Nukleotide auf die InsP3-Produktion in transfizierten 1321N1-Zellen dar. Die Zellen wurden mit UTP, UDP, 5BrUTP, dUTP, ITP, AP3A, AP4A, AP5A und AP6A mit derselben Konzentration von 100 μM oder ohne Agonisten (Kontr.) für 30 s oder 20 min. inkubiert. Die Daten stellen den Mittelwert ±S. D. dreier Einzelexperimente dar und sind für drei unabhängige Experimente repräsentativ. Die EC50-Werte wurden durch Kurvenanpassung (Sigma Plot: Version 2.0) bestimmt. -
8 stellt die Konzentrations-Wirkungs-Kurven verschiedener Nukleotide auf die InsP3-Akkumulation in 1321N1-Zellen dar, die einen humanen P2Y4-Rezeptor exprimieren. 1321N1-Zellen wurden in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von UTP, UDP, dUTP, 5BrUTP, ITP und ATP für einen Zeitraum von 20 min. inkubiert. Die Daten stellen den Mittelwert ± Schwankungsbereich von Doppelexperimenten dar, die in einem Experiment gewonnen wurden, das für zwei repräsentativ ist. -
9 stellt die Wirkung verschiedener P2-Antagonisten auf die InsP3-Produktion dar, die mit UTP in transfizierten 1321N1-Zellen induziert wurde. Zellen wurden in Gegenwart von Suramin, Reactive Blue 2 und PPADS bei einer Konzentration von 100 μM und verschiedenen UTP-Konzentrationen (0, 2 und 10 μM) für 20 min. inkubiert. Die Daten stellen den Mittelwert ±S. D. dreier Einzelexperimente dar und sind für zwei unabhängige Experimente repräsentativ. -
10 stellt die Wirkung von PPADS auf die UTP-Stimulation von InsP3 in transfizierten 1321N1-Zellen dar. Die Zellen wurden verschiedenen Konzentrationen von UTP in Gegenwart oder in Abwesenheit von PPADS (100 μM) für 20 min. ausgesetzt. Die Daten stellen den Mittelwert ±S. D. dreier Einzelexperimente dar, die in einem Experiment gewonnen wurden, das für zwei repräsentativ ist. -
11 stellt die Wirkung des Pertussis-Toxins auf die UTP-induzierte Akkumulation von InsP3 in 1321N1-Zellen dar, die einen humanen P2Y-Rezeptor exprimieren. Die Zellen wurden für 18 Stunden in Gegenwart oder in Abwesenheit von 20 ng/ml Pertussis-Toxin vorinkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit oder ohne UTP (100 μM) und mit oder ohne Pertussis-Toxin (20 ng/ml) für verschiedene Zeiträume inkubiert: 30 s, 5 min. oder 20 min. Die Daten stellen den Mittelwert ±S. D. dreier Einzelexperimente dar und sind für zwei unabhängige Experimente repräsentativ. - EXPERIMENTELLE VERFAHREN
- 1. Materialien
- Trypsin stammte von Flow Laboratories (Bioggio, Schweiz) und die Kulturmedien, Reagenzien, G418, fötales Kälberserum (FCS), Restriktionsenzyme und Taq-Polymerase wurden von GIBCO BRL (Grand Island, NY) erworben. Die radioaktiven Produkte Myo-D[2-3H] Inositol (17,7 Ci/mmol) und [α32P]ATP (800 Ci/mmol) stammten von Amersham (Gent, Belgien). Dowex AG1X8 (Formatform) stammte von Bio-Rad Laboratories (Richmond, Kalifornien, USA). UTP, UDP, ATP, ADP, Carbachol, LiCl und Apyrasegrad VII wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA.) erworben. 2MeSATP stammte von Research Biochemicals Inc. (Natick, MA, USA). pcDNA3 ist ein Expressionsvektor, der von Invitrogen (San Diego, CA, USA) entwickelt wurde.
- 2. Klonierung und Sequenzierung
- Auf der Grundlage der am besten konservierten Segmente zwischen der P2Y-Rezeptorsequenz der Maus und der P2Y1-Rezeptorsequenz aus dem Huhn wurden degenerierte Oligonukleotidprimer synthetisiert. Diese Primer wurden verwendet, um ausgehend von humaner genomischer DNA neue Rezeptorgenfragmente mittels PCR niedriger Stringenz zu amplifizieren. Die Amplifikationsbedingungen waren wie folgt: 93°C 1 min., 50°C 2 min., 72°C 3 min.; 35 Zyklen. Die PCR-Produkte der Größe, die zu Fragmenten eines P2-Rezeptorgens passten; wurden in M13mp18 und M13mp19 subkloniert und mit dem Didesoxynukleotid- Kettenabbruchverfahren nach Sanger sequenziert. Einer der resultierenden Klone, die Ähnlichkeiten mit P2-Rezeptoren hatten, wurde mittels Zufallspriming markiert und verwendet, um eine humane gnomische DNA-Bibliothek, die in dem λ-Charon 4a-Vektor konstruiert wurde, zu durchmustern. Die Hybridisierung erfolgte in 6 × SSC (1 × SSC: 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat) und 40% Formamid bei 42°C für 14 h, und die letzten Waschbedingungen waren 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C. Eine λ-Phagen-Präparation (15) wurde mit mehreren Klonen ausgeführt, die mit der Sonde stark hybridisierten. Eine Restriktionskarte und eine Southern Blot-Analyse ermöglichte die Isolierung eines 1,4 kb NheI-EcoRV-Fragments, das in den pBluescript SK*-Vektor (Stratagene) subkloniert wurde. Die komplette Sequenz einer Sequenz, die einen neuen Rezeptor kodiert, wurde nach Subklonierung überlappender Fragmente in M13mp18 und M13mp19 von beiden Strängen ermittelt.
- 3. Zellkultur und Transfektion
- Die den P2Y-Rezeptor kodierende Sequenz wurde in die HindIII und EcoRV-Stellen des pcDNA3-Expressionsvektors für die Transfektion in humane 1321N1-Astrocytomazellen subkloniert, eine Zelllinie, die nicht auf Nukleotide reagiert und die bereits für die Expression purinerger Rezeptoren verwendet worden ist (6, 12). Zellen wurden mit dem rekombinanten pcDNA3-Plasmid (pcDNA3-P2Y4) mit der Calciumphosphat-Präzipitationsmethode, wie beschrieben (16) transfiziert. 1321N1-Zellen wurden für 6 Stunden bei 37°C in Gegenwart des pcDNA3-Vektors alleine oder des Vektors, welcher die den P2Y4-Rezeptor kodierende Sequenz enthält, inkubiert, dann gewaschen und in Kulturmedium (10% FCS, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 2,5 μg/ml Amphotericin B in Dulbecco's modifizierten Eagle's Medium (DMEM)) inkubiert. Die Selektion mit G418 (400 μg/ml) begann zwei Tage nach Transfektion. Aus dem Pool transfizierter 1321N1-Zellen wurden mittels limitierender Verdünnung einzelne Klone mit der Zielsetzung isoliert, Klone mit hochregulierten IP-Stimulationsfaktoren als Reaktion auf Nukleotide zu selektionieren. Die verschiedenen Klone wurden in einem Medium mit 400 μg/ml G418 propagiert.
- 4. Messung der Inositolphosphate (IP)
- 1321N1-Zellen wurden für 24 Stunden mit 10 μCi/ml [3H] Inositol in inositolfreiem DMEM (Dulbeco's modifizierten Eagle's Medium) mit 5% fötalem Kälberserum, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 2,5 μg/ml Amphotericin B und 400 μg/ml G418 markiert. Zellen wurden zweimal mit KRH-Puffer (Krebs-Ringer Hepes) der folgenden Zusammensetzung gewaschen (124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,25 mM MgSO4, 1,45 mM CaCl2, 25 mM Hepes (pH 7,4) und 8 mM Glukose) und in diesem Medium für 30 min. inkubiert. Die Agonisten wurden in Gegenwart von LiCl (10 mM) zugegeben und die Inkubation wurde nach 30 s, 5 min. oder 20 min. durch die Zugabe einer eiskalten 3%-igen Perchlorsäurelösung beendet. Für die Zeitverlaufsuntersuchung wurde LiCl (10 mM) 5 min. vor den Agonisten zugegeben und die Inkubation wurde zu verschiedenen Zeitpunkten beendet. Als das Pertussis-Toxin getestet wurde, wurde es in einer Konzentration von 20 ng/ml für 18 h während des Markierungszeitraums und der Stimulation durch den Agonisten zugegeben. Inositolphosphate wurden extrahiert und InsP3 wurde mittels Chromatographie auf einer Dowexsäule wie vorhergehend beschrieben isoliert (17).
- 5. Radioligandbindungsassay
- Bindungsassays von [α32P] UTP an Zellmembranen wurden in Tris-HCl (50 mM, pH 7,5), EDTA 1 mM in einem Endvolumen von 0,5 ml, das 25–50 μg Protein und 0,5 nM Radioligand enthielt, ausgeführt (27). Die Assays wurden bei 30°C für 5 min. ausgeführt. Inkubationen wurden durch die Zugabe von 4 ml eiskaltem Tris-HCl (50 mM, pH 7,5) und eine schnelle Filtration durch Whatman GF/B-Filter mit Unterdruck beendet. Die Filter wurden anschließend dreimal mit 2 ml desselben eiskalten Tris-HCl-Puffers gewaschen. Die Radioaktivität wurde nach einer Übernachtinkubation der Filter in einem flüssigen Szintillationsgemisch mittels Flüssigszintillationszählung quantifiziert.
- 6. Northern Blot- und Southern Blot-Analyse
- Gesamt- und Poly(A)+-RNA wurde mit dem Guanidiniumthiocyanat-Cäsiumchlorid verfahren (15) aus unterschiedlichen Geweben und humanen Zelllinien präpariert, mit Glyoxal denaturiert und mit Elektrophorese auf einem 1%-igen Agarosegel in 10 mM Phosphatpuffer pH 7,0 fraktioniert. DNA-Proben, die aus den λ-Charon 4a-Klonen präpariert wurden, wurden mit Restriktionsenzymen verdaut. Northern und Southern Blots wurden ausgeführt (15) und für 90 min. bei 80°C gebacken. Die Membranen wurden wenigstens 4 Stunden lang vorhybridisiert und über Nacht mit der selben Sonde wie für die Durchmusterung bei 42°C in einer Lösung hybridisiert, die 50% Formamid für Northern Blots und 40% Formamid für Southern Blots enthielt. Die Filter wurden zweimal für 15 min. in 2 × SSC bei Raumtemperatur und dann zweimal für 30 min. in 0,2 × SSC bei 60°C gewaschen, bevor sie bei –70°C in Gegenwart von Verstärkerfolien für 5 Tage (Northern Blots) oder 1 Stunde (Southern Blots) exponiert wurden.
- ERGEBNISSE
- 1. Klonierung und Sequenzierung
- Um neue Subtypen der P2-Rezeptoren zu isolieren, wurden auf Basis der am besten konservierten Segmente in den veröffentlichten Sequenzen des P2Y1-Rezeptors aus dem Hühnergehirn (5) und des Neuroblastoma P2Y2-Rezeptors aus der Maus (9) degenerierte Oligonukleotid-Primer synthetisiert. Diese Primer wurden für die PCR niedriger Stringenz mit humaner genomischer DNA wie beschrieben (18) verwendet. Einige Kombinationen erzeugten diskrete Banden mit einer Größe, welche der für P2-Rezeptoren erwarteten entsprach. So amplifizierten z. B. der Primer [5'-CAGATCTAGATA (CT) ATGTT (CT) (AC) A (CT) (CT) T (ACGT) GC-3'], welche dem zweiten Transmembranbereich entsprach, und der Primer [5'-TCTTAAGCTTGG (AG) TC (ACGT) A (CG) (AG) CA (AG) CT (AG) TT-3'), welcher dem siebten Transmembranbereich entsprach, ein 712 bp großes Fragment. Die nach der Sequenzierung erhaltenen Partialsequenzen wurden in Peptidsequenzen translatiert und mit einer lokalen Datenbank verglichen, die G-Protein-gekoppelte Rezeptorsequenzen enthält. Die meisten aus diesen PCR-Produkten resultierenden Klone kodierten einen Teil eines neuen Rezeptors, der eine 58%-ige Identität mit dem P2Y2-Rezeptor der Maus und eine 42%-ige Identität mit Partialsequenzen des P2Y1-Rezeptors aus dem Huhn aufwies. Darüber hinaus kodierten einige Klone eine Peptidsequenz, die eine 87%-ige Identität mit dem P2Y1-Rezeptor aus dem Huhn aufwies und von dem daher geglaubt wurde, dass er ein Fragment des humanen P2Y1-Gens darstellt.
- Die Partialsequenz des neuen Rezeptors wurde als eine Sonde verwendet, um eine humane genomische DNA-Bibliothek zu durchmustern. Es wurden einige Klone gewonnen und aufgereinigt, die unter hohen Stringenzbedingungen stark mit der Sonde hybridisierten. Die Inserts der Klone schwankten von 12 bis 17 kb, und eine Restriktionsanalyse deckte auf, dass alle Klone zu einem einzelnen Locus gehörten. Es wurde die vollständige Sequenz eines 1,4 kb großen NheI-EcoRV-Fragments gewonnen, und es wurde ein intronloses offenes Leseraster von 1095 bp identifiziert. Die Sequenz ist in
1 dargestellt, in der die vermeintlichen Membran spannenden Domänen unterstrichen und mit I bis VII nummeriert sind. Das vorausberechnete Molekulargewicht des kodierten Proteins ist 36,5 kDa. Es ist unwahrscheinlich, dass dieses Molekulargewicht in vivo modifiziert wird, da keine N-Glykosylierungs-Konsensussequenzen in den vermeintlichen extrazellulären Bereichen gefunden werden. Im Gegensatz zum humanen P2Y2-Rezeptor gibt es in der vermeintlichen ersten extrazellulären Schleife kein RGD-Motiv, eine Konsensus-Integrin-Bindesequenz. Die drei Aminosäuren (AHN), welche der RDG- Sequenz in der ersten extrazellulären Schleife des P2Y2-Rezeptors entsprechen, sind in1 fett gedruckt dargestellt. In der dritten intrazellulären Schleife und im carboxyterminalen Teil des Rezeptors wurden einige potenzielle Phosphorylierungsstellen für Proteinkinase (PKC) oder für Calmodulin-abhängige Proteinkinasen identifiziert. Die vermeintlichen Phosphorylierungsstellen für PKC oder Calmodulin-abhängige Proteinkinasen und PKC sind in1 mit schwarzen Quadraten und offenen Kreisen entsprechend gekennzeichnet. Die vier positiv geladenen Aminosäuren, von denen berichtet wurde, dass sie eine Rolle in der P2Y2-Rezeptoraktivierung durch ATP und UTP spielen (1), sind in der P2Y4-Sequenz konserviert: His262, Arg265, Lys289 und Arg292 (1 ). Die P2Y4-Aminosäuresequenz wurde mit der P2Y1-Aminosäuresequenz aus dem Huhn und der P2Y2-Aminosäuresequenz aus der Maus und mit ihren nächsten Nachbarn in der G-Protein-gekoppelten Rezeptorfamilie verglichen (2 ). Die Darstellung wurde mit dem Alignment-Programm Pileup des GCG-Softwarepakets (26) für multiple Sequenzen erstellt. Für jede einzelne Sequenz berücksichtigt die Analyse ein Segment, das die ersten fünf vermeintlichen Membran spannenden Domänen umfasst. Es ist klar, dass der neu klonierte Rezeptor in struktureller Hinsicht mit dem humanen P2Y2-Rezeptor näher verwandt ist (51% Identität zwischen den Komplettsequenzen) als mit dem P2Y1-Rezeptor aus dem Huhn (35%). - 2. Gewebeverteilung des P2Y4-Rezeptors
- Die Gewebeverteilung des P2Y4-Transkripts wurde mittels Northern Blot-Analyse untersucht. Eine Anzahl von Rattengeweben (Herz, Gehirn, Leber, Hoden und Niere) wurde getestet, indem eine humane Sonde bei geringer Stringenz verwendet wurde, aber es konnte kein Hybridisierungssignal erhalten werden. In den folgenden humanen Zelllinien konnte kein P2Y4-Transkript nachgewiesen werden: K562 Leukämiezellen (
3 ), HL-60 Leukämiezellen und SH-SY5Y humane Neuroblastomzellen. Der Northern Blot wurde mit 15 μg Gesamt-RNA aus der humanen Plazenta und 4 μg Poly(A)+-RNA aus K562-Zellen und aus zwei unterschiedlichen humanen Plazentas ausgeführt. Die Sonde war das mittels PCR amplizifierte humane P2Y4-Genfragment (TM2 bis TM7). Im Gegensatz dazu wurde in der humanen Plazenta ein starkes Signal, das einer 1,8 kb mRNA entsprach, gefunden (3 ). - 3. Funktionale Expression des neuen P2-Rezeptors in 1321N1-Zellen
- Nach Transfektion des pcDNA3-P2Y4-Konstrukts in 1321N1-Zellen wurde der Pool G418-resistenter Klone auf ihre funktionale Reaktion (IP3-Akkumulation) auf ATP und UTP getestet. Von beiden Nukleotiden wurde gefunden, dass sie Agonisten des P2Y4-Rezeptors sind, allerdings war die Reaktion auf UTP stärker. Etwa 20 transfizierte Klone wurden anschließend isoliert und auf ihre Reaktion auf UTP getestet. Der Klon, welcher den höchstens IP-Akkumulationsfaktor als Reaktion auf UTP aufwies, wurde ausgewählt und in allen nachfolgenden Experimenten verwendet. Eine funktionale Charakterisierung des P2Y4-Rezeptors wurde mittels der Bestimmung der Akkumulation von InsP3 nach 20-minütiger Inkubation mit dem Agonisten in Gegenwart von 10 mM LiCl ausgeführt. Wir beobachteten, dass die Reaktion auf UTP biphasisch war, mit einem Peak nach 30 s, gefolgt von einer nachhaltigeren Stimulation geringerer Stärke (
4A ). Mit ATP war nur diese zweite Phase nachweisbar: Seine Wirkung wurde erst nach einer einminütigen Stimulation offensichtlich und war für wenigstens 20 min. stabil (4A undB ). Wie für UTP, war die Stimulation durch UDP biphasisch, aber sie war ein wenig verzögert (4A undB ). Der Einbezug von LiCl zeigte wenig Wirkung auf den anfänglichen Peak, der durch UTP oder UDP induziert wurde, aber sie verstärkte stark die folgende Plateauphase (4B ). - Die maximale Wirkung von ATP, die nach einer 20-minütigen Inkubation beobachtet wurde, stellte etwa 27 ± 9% von der des UTP dar (Mittelwert ±S. D. von 10 Experimenten). Um zu zeigen, dass ATP in der Lage ist, die UTP-Reaktion zu antagonisieren, wurden Inkubationen von 1321N1-Zellen mit ATP alleine oder in Kombination mit UTP ausgeführt.
5 zeigt, dass ATP bei hohen Konzentrationen (500 μM oder mehr) in der Lage war, die Wirkung von UTP sowohl bei 30 s als auch 20 min. zu inhibieren. Bei 30 s wurde die Reaktion auf UTP 10 μM durch ATP 2 mM antagonisiert, was der Tatsache entspricht, dass ATP keine Wirkung auf den humanen P2Y4-Rezeptor bei diesem frühen Zeitpunkt besitzt (Teilabbildung A). Bei 20 min. wurde in Gegenwart von 2 mM ATP eine Inhibierung von 62 ± 11% der UTP-Wirkung (10 μM) beobachtet, was ein Unterschied in den UTP- und ATP-Wirkungen entspricht (Mittelwert ±S. D. von 5 unabhängigen Experimenten) (Teilabbildungen B und C). Die ATP-Konzentrations-Inhibierungs-Kurven wurden nach rechts verschoben, als die UTP-Konzentration erhöht wurde, was die kompetitive Natur dieses inhibitorischen Effekts anzeigt (Teilabbildungen A und B). Andererseits verstärkte ATP bei geringeren Konzentrationen (30–300 μM) die Reaktion auf UTP um 29% (Schwankungsbreite 12–47%, Mittelwert von vier Experimenten) (Teilabbildung B). ADP, das per se beinahe keine Wirkung hat und die Wirkung von UTP nicht inhibierte, reproduzierte diese Verstärkung: in Gegenwart von ADP (100 μM) stellte die Stimulation durch UTP (10 μM) 158 ± 15% Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten) von der durch UTP alleine verursachten dar (Daten nicht gezeigt). Allerdings war diese Potenzierungswirkung von ATP und ADP nicht spezifisch: Tatsächlich war in Gegenwart dieser Nukleotide auch die Wirkung von Carbachol, welche durch in 1321N1-Zellen endogen exprimierte Muscarinrezeptoren (6) vermittelt, wird ebenfalls verstärkt. Diese Beobachtung wurde auch mit Zellen gemacht, die mit dem rekombinantem Plasmid P2Y4-pcDNA3 oder dem Vektor alleine transfiziert wurden und wurde auch mit AMP und Adenosin gewonnen (Daten nicht gezeigt). - Wir verglichen in mehreren Klonen transfizierter Zellen die Konzentrations-Wirkungs-Kurven von UTP und UDP auf die InsP3-Produktion. Die Untersuchung wurde an zwei Zeitpunkten ausgeführt (
6 ): 30 s und 20 min. In dem an Klon 11 ausgeführten Set an Experimenten (ein Klon transfizierter 1321N1-Zellen, der für die pharmakologische Charakterisierung ausgewählt wurde), erschien UTP nach einer 20-minütigen Inkubation 10-fach potenter als UDP, und dieser Unterschied wurde mit zwei weiteren Klonen reproduziert (6 ). Die EC50-Werte waren 0,3 ± 0,1 μM und 3,3 ± 0,6 μM in Klon 2, 2,4 ± 0,1 μM und 19,8 ± 4,8 μM in Klon 11 und 0,3 ± 0,1 μM und 3,2 ± 0,8 μM in Klon 21 für UTP bzw. UDP (Mittelwert ±S. D. von zwei unabhängigen Experimenten). Beim Inkubationszeitpunkt 30 s war es nicht möglich, EC50-Werte zu ermitteln, weil die Kurven deutlich nach rechts verschoben waren, aber wir konnten einen noch deutlicheren Unterschied zwischen den Wirksamkeiten der zwei Agonisten beobachten (6 ). Mehrere Klone, einschließlich der Klone 2, 11 und 21, wurden in Bindungsuntersuchungen mit [α32P] UTP getestet, aber es wurde kein Anstieg der spezifischen Bindung im Vergleich mit den nur mit dem Vektor alleine transfizierten Zellen beobachtet (Daten nicht gezeigt). - Im Hinblick auf die Zeitunterschiede, die in
6 beobachtet wurden, wurde ein Test einer Reihe von Nukleotiden bei zwei Zeitpunkten ausgeführt: 30 s und 20 min. Wie7 zeigt, waren mehrere Agonisten bei 30 s kaum oder nicht aktiv (UDP, 5BrUTP, dUTP, ITP), während sie hingegen bei 20 min. eine signifikante Wirkung produzierten. Volle Konzentrations-Wirkungs-Kurven wurden bei 20 min. erhalten. Die Rangordnung der Wirksamkeit war wie folgt: UTP > UDP = dUTP > 5BrUTP > ITP > ATP (8 ). Die erhaltenen EC50-Werte waren wie folgt: EC50 UTP = 2,5 ± 0,6 μM, EC50 UDP = 19,5 ± 3,9 μM (Mittelwert ±S. D. von 8 unabhängigen Experimenten), EC50 dUTP = 20,0 ± 2,3 μM, EC50 5BrUTP = 27,1 ± 1,9 μM und EC50 ITP = 32,8 ± 5,4 μM (Mittelwert ±S. D. von zwei unabhängigen Experimenten). Der ungefähre EC50-Wert, der für ATP erhalten wurde, war 43 ± 12 μM (Mittelwert ±S. D. von fünf unabhängigen Experimenten). Die Diadenosinpolyphosphate erhöhten ebenfalls die InsP3-Produktion in transfizierten Zellen mit EC50 zwischen 3 und 7 μM (Daten nicht gezeigt), aber ihre maximale Wirkung betrug nur 20–25% von der des UTP, ein Wert, der nahe dem von ATP liegt (Schwankungsbreite von 4 unabhängigen Experimenten) (7 ). UMP, Uridin, AMP, Adenosin und AT-PγS waren ohne jede Wirkung (Daten nicht gezeigt). - Für keinen P2Y-Subtyp ist ein spezifischer Antagonist vorhanden. Nichtsdestotrotz wurden mehrere unselektive Antagonisten wie Suramin, RB2 oder PPADS an P2-Rezeptoren getestet, und ihre relativen Wirksamkeiten auf diese Subtypen können ein Mittel darstellen, um sie zu unterscheiden (27). Daher testeten wir die Fähigkeit dieser drei Antagonisten, die UTP-Reaktion im Model des humanen P2Y4-Rezeptors zu inhibieren. Wie wir in
9 sehen können, erschien PPADS als der wirksamste Antagonist (73 ± 14% Inhibition; EC50 um 15 μM (Daten nicht gezeigt)), Suramin war unwirksam und RB-2 produzierte eine Inhibition der UTP-Reaktion von 33 ± 5% (Mittelwert ±S. D. von zwei unabhängigen Experimenten).10 zeigt den gemischten Charakter des durch PPADS vermittelten Antagonismus auf die UTP-Reaktion: Es beeinflusst sowohl den EC50-Wert als auch die Maximalwirkung von UTP. Der EC50-Wert für UTP in Abwesenheit von PPADS betrug 3,3 ± 0,6 μM und 12,2 ± 4,5 μM in Gegenwart von 100 μM PPADS (Mittelwert ±S. D. von 2 unabhängigen Experimenten). - Die Wirkung des Pertussis-Toxins (20 ng/ml, 18 Stunden Vorbehandlung) wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach einer UTP-Zugabe (100 μM) untersucht (
11 ). Die UTP-Reaktion war deutlich zum Zeitpunkt 30 s inhibiert (62 ± 5% der Inhibition: Mittelwert ±S. D. von zwei unabhängigen Experimenten), während bei 5 und 20 min. keine signifikante Wirkung beobachtet wurde. - LITERATURHINWEISE
-
- 1. Erb, L., Garrad, R., Wang, Y, Quinn, T., Turner, J. T., and Weisman, G. A. (1995) J. Biol. Chem. 270, 4185–4188.
- 2. Fredholm, B. B., Abbracchio, M. P., Burnstock, G., Daly, J. W., Harden, T. K., Jacobson, K. A., Left, P., and Williams, M. (1994) Pharm. Rev. 46, 143–156.
- 3. Valera, S., Hussy, N., Evans, R. J., Adami, N., North, R. A., Surprenant, A., and Buell, G. (1994) Nature 371, 516–519.
- 4. Brake, A. J., Wagenbach, M. J., and Julius, D. (1994) Nature 371, 519–523.
- 5. Webb, T. E., Simon, J., Krishek, B. J., Bateson, A. N., Smart, T. G., King, B. F., Burnstock, G., and Barnard, E. A. (1993) FEBS 324, 219–225.
- 6. Filtz, T. M., Li, Q., Boyer, J. L., Nicholas, R. A., and Harden, T. K. (1994) Mol. Pharm. 46, 8–14.
- 7. Henderson, D. J., Elliot, D. G., Smith, G. M., Webb, T. E., and Dainty, I. A. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 212, 648–656.
- 8. Tokoyama, Y., Hara, M., Jones, E. M. C., Fan, Z., and Bell, G. I. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 211, 211–218.
- 9. Lustig, K. D., Shiau, A. K., Brake, A. J., and Julius, D. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90, 5113–5117.
- 10. Erb, L., Lustig, K. D., Sullivan, D. M., Turner, J. T., and Weisman, G. A. (1993) Proc Natl Acad Sci 90, 10449–10453.
- 11. Rice, W. R., Burton, F. M., and Fiedeldey, D. T. (1995) Am. J. Respir. Cell, Molec. Biol. 12, 27–32.
- 12. Parr, C. E., Sullivan, D. M., Paradise, A. M., Lazarowski, E. R., Burch, L. H., Olsen, J. C., Erb, L., Weisman, G. A., Boucher, R. C., and Turner, J. T. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 3275–3279.
- 13. Barnard, E. A., Burnstock, G., and Webb, T. E. (1994) TiPS 15, 67–70.
- 14. Kaplan, M. H., Smith, D. I., and Sundick, R. S. (1993) J. Immun. 151, 628–636.
- 15. Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY).
- 16. Velu, T. J., Beguinot, L., Vass, W. C., Zhang, K., Pastan, I., and Lowry, D. R. (1989) J. Cell. Biochem. 39, 153–166.
- 17. Communi, D., Raspe, E., Pirotton, S., and Boeynaems, J. M. (1995) Circ. Res. 76, 191–198.
- 18. Libert, F., Parmentier, M., Lefort, A., Dinsart, C., Van Sande, J., Maenhaut, C., Simons, M. J., Dumont, J. E., and Vassart, G. (1989) Science 244, 569–572.
- 19. Zeng, D., Harrison, J. K., D'Angelo, D. D., Barber, C. M., Tucker, A. L., Lu, Z., and Lynch, K. R. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 3102–3106.
- 20. Nomura, H., Nielsen, B. W., and Matsushima, K. (1993) Int. Immun. 5, 1239–1249.
- 21. Harrison, J. K., Barber, C. M., and Lynch, K. R. (1994) Neuroscience Letters 169, 85–89.
- 22. Seifert, R. and Schultz, G. (1989) TiPS 10, 365–369.
- 23. Brown, H. A., Lazarowski, E. R., Boucher, R. C., and Harden, T. K. (1991) Mol. Pharm. 40, 648–655.
- 24. O'Connor, S. E., Dainty, I. A., and Left, P. (1991) TiPS 12, 137–141.
- 25. Lazarowski, E. R. and Harden, T. K. (1994) J. Biol. Chem. 269, 11830–11836.
- 26. Devereux, J., Haeberli, P. and Smithies O. A. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 387–395.
- 27. Motte S., Swillens 5. and Boeynaems J. M. (1996) Eur. J. Pharmacol. 307, 201.
- 28. Boyer, J. L., Zohn, I. E., Jacobson, K. A. and Harden, T. K. (1994) Br. J. Pharmacol. 113, 614.
Claims (37)
- Rezeptor, der eine Aminosäuresequenz besitzt, die zu mehr als 60% homolog zu der in der
1 dargestellten Aminosäuresequenz ist und die eine zehnfache bis einhundertfache Bevorzugung von Pyrimidin-Nukleotiden gegenüber Purin-Nukleotiden aufweist. - Rezeptor gemäß dem Anspruch 1, der eine Aminosäuresequenz besitzt, die in
1 dargestellt ist. - Rezeptor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei das Pyrimidin-Nukleotid Uridin-Triphosphat ist.
- Rezeptor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, der UTP gegenüber UDP bevorzugt.
- Rezeptor gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, der ein menschlicher Rezeptor ist.
- Nukleinsäure, die einen Rezeptor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 kodiert.
- Nukleinsäure gemäß dem Anspruch 6, die mehr als 60% Homologie mit der DNA-Sequenz aufweist, die in
1 dargestellt ist. - Nukleinsäure gemäß dem Anspruch 7, welche die DNA-Sequenz besitzt, die in
1 dargestellt ist. - Vektor, der die Nukleinsäure gemäß der Ansprüche 6 oder 7 enthält.
- Zelle, die den Vektor gemäß dem Anspruch 9 enthält.
- Zelle gemäß dem Anspruch 10, die aus einer Gruppe bakterieller Zellen oder Säugetierzellen ausgewählt wird.
- Zelle gemäß dem Anspruch 11, wobei die Säugetierzellen aus einer Gruppe ausgewählt werden, die sich aus COS-7-, LM(tk-)-, NIH-3T3- oder 1321N1-Zellen zusammensetzt.
- Transgenes, nicht menschliches Säugetier, das die Nukleinsäure gemäß einem der vorstehenden Ansprüche 6 bis 8 exprimiert oder einen mittels homologer Rekombination erhaltenen Knockout des nativen Rezeptors gemäß der Ansprüche 1 bis 5 enthält.
- Verfahren für die Bestimmung, ob ein Ligand spezifisch an einen Rezeptor gemäß einem der Ansprüche von 1 bis 5 binden kann, wobei das Verfahren die Schritte umfasst, eine Zelle, die mit einem Vektor transfiziert wurde, der die den besagten Rezeptor kodierende Nukleinsäure exprimiert, mit dem Liganden, unter Bedingungen, welche die Bindung des Liganden an einen solchen Rezeptor erlauben, in Kontakt zu bringen und die Gegenwart eines spezifisch an den besagten Rezeptor gebundenen Liganden nachzuweisen, wodurch bestimmt wird, ob der Ligand spezifisch an den besagten Rezeptor bindet.
- Verfahren für die Bestimmung, ob ein Ligand spezifisch an einen Rezeptor gemäß einem der Ansprüche von 1 bis 5 binden kann, wobei das Verfahren die Schritte umfasst, einen Zellextrakt von Zellen herzustellen, die mit einem Vektor transfiziert wurden, der die den besagten Rezeptor kodierende Nukleinsäure exprimiert, eine Membranfraktion aus diesem Zellextrakt zu isolieren, den Liganden mit dieser Membranfraktion, unter Bedingungen, welche die Bindung des Liganden an einen solchen Rezeptor erlauben, in Kontakt zu bringen und die Gegenwart eines an den besagten Rezeptor gebundenen Liganden nachzuweisen und dadurch zu bestimmen, ob der Ligand in der Lage ist, spezifisch an den besagten Rezeptor zu binden.
- Verfahren für die Bestimmung, ob ein Ligand ein Agonist des Rezeptors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 ist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst, eine Zelle, die mit einem Vektor transfiziert wurde, der die den besagten Rezeptor kodierende Nukleinsäure exprimiert, mit dem Liganden, unter Bedingungen, welche die Aktivierung einer funktionellen Antwort des Rezeptors durch die Zelle erlauben, in Kontakt zu bringen und mittels eines Bioassays, wie eine Änderung der Konzentration eines sekundären Botenstoffs oder eine Änderung des zellulären Stoffwechsels, eine Steigerung der Rezeptoraktivität nachzuweisen, wodurch bestimmt wird, ob der Ligand ein Agonist des Rezeptors ist.
- Verfahren für die Bestimmung, ob ein Ligand ein Agonist des Rezeptors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 ist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst, einen Zellextrakt von Zellen herzustellen, die mit einem Vektor transfiziert wurden, der die den besagten Rezeptor kodierende Nukleinsäure exprimiert, eine Membranfraktion aus diesem Zellextrakt zu isolieren, diese Membranfraktion mit dem Liganden, unter Bedingungen, welche die Aktivierung einer funktionellen Antwort des Rezeptors erlauben, in Kontakt zu bringen und mittels eines Bioassays, wie eine Änderung der Produktion eines sekundären Botenstoffs, eine Steigerung der Rezeptoraktivität nachzuweisen, wodurch bestimmt wird, ob der Ligand ein Agonist des Rezeptors ist.
- Verfahren für die Bestimmung, ob ein Ligand ein Antagonist des Rezeptors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 ist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst, eine Zelle, die mit einem Vektor transfiziert wurde, der die den besagten Rezeptor kodierende Nukleinsäure exprimiert, mit dem Liganden in Gegenwart eines bekannten Agonisten des Rezeptors, unter Bedingungen, welche die Aktivierung einer funktionellen Antwort des Rezeptors erlauben, in Kontakt zu bringen und mittels eines Bioassays, wie eine Änderung der Konzentration eines sekundären Botenstoffs oder eine Änderung des zellulären Stoffwechsels, eine Abnahme der Rezeptoraktivität nachzuweisen, wodurch bestimmt wird, ob der Ligand ein Antagonist des Rezeptors ist.
- Verfahren für die Bestimmung, ob ein Ligand ein Antagonist des Rezeptors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 ist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst, einen Zellextrakt von Zellen herzustellen, die mit einem Vektor transfiziert wurden, der die den besagten Rezeptor kodierende Nukleinsäure exprimiert, eine Membranfraktion aus diesem Zellextrakt zu isolieren, diese Membranfraktion in Gegenwart eines bekannten Agonisten des Rezeptors mit dem Liganden, unter Bedingungen, welche die Aktivierung einer funktionellen Antwort des Rezeptors erlauben, in Kontakt zu bringen und mittels eines Bioassays, wie eine Änderung der Konzentration eines sekundären Botenstoffs, eine Abnahme der Rezeptoraktivität nachzuweisen, wodurch bestimmt wird, ob der Ligand ein Antagonist des Rezeptors ist.
- Verfahren gemäß einem der Ansprüche 14 bis 19, wobei der Sekundäre-Botenstoff-Assay die Messung der intrazellulären cAMP-, der intrazellulären Inositolphosphat-, der intrazellulären Diacylglyzerinkonzentration oder der intrazellulären Calciummobilisierung umfasst.
- Verfahren gemäß einem der vorgehenden Ansprüche 14 bis 20, wobei die Zelle eine Säugetierzelle ist.
- Verfahren gemäß dem Anspruch 21, wobei die Säugetierzelle nicht neuronalen Ursprungs ist und aus der Gruppe ausgewählt wird, die sich aus COS-7-, CHO-, LM(tk-)-NIH-3T3- oder 1321N1-Zellen zusammensetzt.
- Verfahren gemäß einem der vorgehenden Ansprüche 14 bis 22, wobei der Ligand nicht im Voraus bekannt ist.
- Verfahren zur Durchmusterung von Wirkstoffen, um Wirkstoffe zu identifizieren, die an der Zelloberfläche spezifisch an den Rezeptor. gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 binden, wobei das Verfahren die Schritte umfasst, eine Zelle, die mit einem Vektor transfiziert wurde, der die den besagten Rezeptor kodierende Nukleinsäure exprimiert, mit einer Vielzahl von Wirkstoffen, unter Bedingungen, welche die Bindung der besagten Wirkstoffe an den Rezeptor erlauben, in Kontakt zu bringen und diejenigen Wirkstoffe zu bestimmen, die spezifisch an die transfizierte Zelle binden, wodurch Wirkstoffe identifiziert werden, die spezifisch an den Rezeptor binden.
- Verfahren zur Durchmusterung von Wirkstoffen, um Wirkstoffe zu identifizieren, die an der Zelloberfläche spezifisch an den Rezeptor gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 binden, wobei das Verfahren die Schritte umfasst, einen Zellextrakt von Zellen herzustellen, die mit einem Vektor transfiziert wurden, der die den besagten Rezeptor kodierende Nukleinsäure exprimiert, eine Membranfraktion aus diesem Zellextrakt zu isolieren, die Membranfraktion mit einer Vielzahl von Wirkstoffen in Kontakt zu bringen und diejenigen Wirkstoffe zu bestimmen, die an die transfizierte Zelle binden, wodurch Wirkstoffe identifiziert werden, die spezifisch an den besagten Rezeptor binden.
- Verfahren zur Durchmusterung von Wirkstoffen, um Wirkstoffe zu identifizieren, die als Agonisten des Rezeptors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 wirken, wobei das Verfahren die Schritte umfasst, eine Zelle, die mit einem Vektor transfiziert wurde, der die den besagten Rezeptor kodierende Nukleinsäure exprimiert, mit einer Vielzahl von Wirkstoffen, unter Bedingungen, welche die Aktivierung einer funktionellen Antwort des Rezeptors erlauben, in Kontakt zu bringen und mittels eines Bioassays, wie eine Änderung der Konzentration eines sekundären Botenstoffs oder eine Änderung des zellulären Stoffwechsels, die Wirkstoffe zu bestimmen, die den Rezeptor aktivieren, wodurch Wirkstoffe identifiziert werden, die als Agonisten des Rezeptors wirken.
- Verfahren zur Durchmusterung von Wirkstoffen, um Wirkstoffe zu identifizieren, die als Agonisten des Rezeptors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 wirken, wobei das Verfahren die Schritte umfasst, einen Zellextrakt von Zellen herzustellen, die mit einem Vektor transfiziert wurden, der die den besagten Rezeptor kodierende Nukleinsäure exprimiert, eine Membranfraktion aus diesem Zellextrakt zu isolieren, die Membranfraktion mit einer Vielzahl von Wirkstoffen, unter Bedingungen, welche die Aktivierung einer funktionellen Antwort des Rezeptors erlauben, in Kontakt zu bringen und mittels eines Bioassays, wie eine Änderung der Konzentration eines sekundären Botenstoffs, die Wirkstoffe zu bestimmen, die den Rezeptor aktivieren, wodurch Wirkstoffe identifiziert werden, die als Agonisten des Rezeptors wirken.
- Verfahren zur Durchmusterung von Wirkstoffen, um Wirkstoffe zu identifizieren, die als Antagonisten des Rezeptors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 wirken, wobei das Verfahren die Schritte umfasst, eine Zelle, die mit einem Vektor transfiziert wurde, der die den besagten Rezeptor kodierende Nukleinsäure exprimiert, in Gegenwart eines bekannten Agonisten des Rezeptors mit einer Vielzahl von Wirkstoffen, unter Bedingungen, welche die Aktivierung einer funktionellen Antwort des Rezeptors erlauben, in Kontakt zu bringen und mittels eines Bioassays, wie eine Änderung der Konzentration eines sekundären Botenstoffs oder eine Änderung des zellulären Stoffwechsels, die Wirkstoffe zu bestimmen, welche die Aktivierung des Rezeptors inhibieren, wodurch Wirkstoffe identifiziert werden, die als Antagonisten des Rezeptors wirken.
- Verfahren zur Durchmusterung von Wirkstoffen, um Wirkstoffe zu identifizieren, die als Antagonisten des Rezeptors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 wirken, wobei das Verfahren die Schritte umfasst, einen Zellextrakt von Zellen herzustellen, die mit einem Vektor transfiziert wurden, der die den besagten Rezeptor kodierende Nukleinsäure exprimiert, eine Membranfraktion aus diesem Zellextrakt zu isolieren, diese Membranfraktion in Gegenwart eines bekannten Agonisten des Rezeptors mit einer Vielzahl von Wirkstoffen, unter Bedingungen, welche die Aktivierung einer funktionellen Antwort des Rezeptors erlauben, in Kontakt zu bringen und mittels eines Bioassays, wie eine Änderung der Konzentration eines sekundären Botenstoffs, die Wirkstoffe zu bestimmen, welche die Aktivierung des Rezeptors inhibieren, wodurch Wirkstoffe identifiziert werden, die als Antagonisten des Rezeptors wirken.
- Verfahren zum Nachweis der Expression des Rezeptors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 mittels eines Nachweises der Gegenwart von mRNA, die den besagten Rezeptor kodiert, wobei das Verfahren die Gewinnung von Gesamt-RNA oder Gesamt-mRNA der Zelle, das In-Kontakt-bringen der so gewonnenen RNA oder mRNA mit einer Nukleinsäuresonde, die eine Nukleinsäure mit einer Länge von mindestens 15 Nukleotiden beinhaltet, welche in der Lage ist, unter Hybridisierungsbedingungen spezifisch an eine einzigartige Sequenz zu hybridisieren, welche in der Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8 vorliegt und den Nachweis der Gegenwart der mRNA, die mit der Sonde hybridisiert, umfasst, wodurch die Expression des Rezeptors durch die Zelle nachgewiesen wird.
- Verfahren zur Bestimmung der physiologischen Effekte der Expression des Rezeptors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 in variierender Höhe, das die Herstellung eines transgenen, nicht menschlichen Säugetiers gemäß dem Anspruch 13 beinhaltet, dessen Expressionshöhe des Rezeptors durch die Verwendung eines induzierbaren Promotors variiert wird, der die Expression des Rezeptors reguliert.
- Verfahren zur Identifizierung eines Antagonisten oder Agonisten des Rezeptors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, der in der Lage ist, eine Störung eines Individuums zu lindern, wobei die Störung durch die Erhöhung oder Verringerung der Aktivität des Rezeptors gelindert wird, wobei das Verfahren die Verabreichung eines Antagonisten oder Agonisten einem transgenen, nicht menschlichen Säugetier gemäß dem Anspruch 13 und die Bestimmung, ob der Antagonist oder Agonist die physischen Störungen und Störungen im Verhalten, die das transgene, nicht menschliche Säugetier als Ergebnis der Rezeptoraktivität aufweist, lindert, umfasst, und wodurch der Antagonist oder Agonist identifiziert wird.
- Verfahren, um eine Veranlagung zu einer Erkrankung zu diagnostizieren, die mit der Aktivität eines spezifischen Allels des Rezeptors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 assoziiert ist, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: a) Ausführung eines Restriktionsverdaus mit einer Reihe von Restriktionsenzymen mit Nukleinsäuren von Individuen, die an besagten Erkrankungen leiden; b) Elektrophoretische Trennung der resultierenden Nukleinsäurefragmente auf einem Größengel; c) In-Kontakt-bringen des resultierenden Gels mit einer Nukleinsäuresonde, die in der Lage ist, spezifisch an die besagte Nukleinsäure zu hybridisieren und mit einer nachweisbaren Markierung markiert ist; d) Nachweis der markierten Banden, die an die besagten mit einem nachweisbaren Marker markierten Nukleinsäuren, unter Erzeugung eines einzigartigen Bandenmusters, hybridisiert haben, welches spezifisch für die Individuen ist, die an den besagten Erkrankungen leiden; e) Herstellung von Nukleinsäuren für die Diagnoseschritte a–e; und f) Vergleich des einzigartigen Bandenmusters, welches für die Nukleinsäuren von Individuen spezifisch ist, die an der Erkrankung von Schritt d leiden, mit der Nukleinsäure für die Diagnose von Schritt e, um festzustellen, ob die Muster die selben oder unterschiedlich sind und um damit die Veranlagung für die Erkrankung zu diagnostizieren, wenn die Muster die selben sind.
- Verfahren, zur Herstellung des aufgereinigten Rezeptors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: a) die Konstruktion eines für die Expression in einer Zelle angepassten Vektors, der die regulatorischen Elemente beinhaltet, die für die Expression von Nukleinsäuren in der Zelle nötig sind und die funktionell an die Nukleinsäure gekoppelt sind, welche den besagten Rezeptor kodiert, um somit seine Expression zu gewährleisten, wobei die Zelle aus einer Gruppe ausgewählt wird, die sich aus bakteriellen Zellen, Hefezellen, Insektenzellen und Säugertierzellen zusammensetzt; b) das Einbringen des Vektors von Schritt a in eine geeignete Wirtszelle; c) die Inkubation der Zelle von Schritt b unter Bedingungen, welche die Expression des Rezeptors erlauben; d) die Gewinnung des so erhaltenen Rezeptors; und e) die Aufreinigung des so gewonnenen Rezeptors.
- Antikörper, der in der Lage ist, an den Rezeptor gemäß einem der vorstehenden Ansprüche 1 bis 5 zu binden.
- Antikörper gemäß Anspruch 35, der ein monoklonaler Antikörper ist.
- Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 36, der gegen ein Epitop des Rezeptors gemäß einem der vorstehenden Ansprüche 1 bis 5 gerichtet ist, der auf der Oberfläche einer Zelle vorhanden ist, die den besagten Rezeptor exprimiert.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP95870124 | 1995-11-21 | ||
| EP95870124 | 1995-11-21 | ||
| PCT/BE1996/000123 WO1997019170A1 (en) | 1995-11-21 | 1996-11-21 | Receptor and nucleic acid molecule encoding said receptor |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE69632830D1 DE69632830D1 (de) | 2004-08-05 |
| DE69632830T2 true DE69632830T2 (de) | 2005-08-25 |
Family
ID=8222166
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE69632830T Expired - Lifetime DE69632830T2 (de) | 1995-11-21 | 1996-11-21 | Rezeptor und dafür kodierendes nukleinsäuremolekül |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US6790626B2 (de) |
| EP (2) | EP1452600A1 (de) |
| JP (1) | JP4439592B2 (de) |
| AT (1) | ATE270331T1 (de) |
| CA (1) | CA2235627C (de) |
| DE (1) | DE69632830T2 (de) |
| DK (1) | DK0862628T3 (de) |
| WO (1) | WO1997019170A1 (de) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4439592B2 (ja) * | 1995-11-21 | 2010-03-24 | エーロスクレーン エッス．アー． | レセプター及び前記レセプターを符号化する核酸分子 |
| AU5578699A (en) * | 1998-08-20 | 2000-03-14 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | 14400 receptor, a g-protein coupled receptor |
| SE9804175D0 (sv) * | 1998-12-02 | 1998-12-02 | Astra Pharma Prod | New assay |
| TWI229674B (en) | 1998-12-04 | 2005-03-21 | Astra Pharma Prod | Novel triazolo[4,5-d]pyrimidine compounds, pharmaceutical composition containing the same, their process for preparation and uses |
| AU784543B2 (en) * | 1999-11-16 | 2006-04-27 | Pharmacia & Upjohn Company | Novel G protein-coupled receptors |
| WO2002000700A2 (en) * | 2000-06-26 | 2002-01-03 | Bayer Aktiengesellschaft | Regulation of human p2y8-like g protein-coupled receptor |
| WO2002004955A2 (en) * | 2000-07-07 | 2002-01-17 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Assay method and system for identification of p2y receptor agonists and antagonists |
| WO2005101003A1 (en) * | 2004-04-13 | 2005-10-27 | Bayer Healthcare Ag | Diagnostics and therapeutics for diseases associated with purinoceptor 4 type y (p2y4) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU7965694A (en) * | 1993-10-15 | 1995-05-04 | Curators Of The University Of Missouri, The | Dna encoding the human p2u receptor and null cells expressing p2u receptors |
| US6008039A (en) | 1995-06-02 | 1999-12-28 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Polynucleotide encoding a novel purinergic P2U receptor |
| JP4439592B2 (ja) * | 1995-11-21 | 2010-03-24 | エーロスクレーン エッス．アー． | レセプター及び前記レセプターを符号化する核酸分子 |
-
1996
- 1996-11-21 JP JP51924397A patent/JP4439592B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-21 US US09/077,173 patent/US6790626B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-21 DK DK96938867T patent/DK0862628T3/da active
- 1996-11-21 CA CA2235627A patent/CA2235627C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-21 WO PCT/BE1996/000123 patent/WO1997019170A1/en active IP Right Grant
- 1996-11-21 EP EP04001324A patent/EP1452600A1/de not_active Withdrawn
- 1996-11-21 AT AT96938867T patent/ATE270331T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-11-21 DE DE69632830T patent/DE69632830T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-21 EP EP96938867A patent/EP0862628B1/de not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-01-08 US US10/753,695 patent/US7270966B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-03-26 US US10/811,198 patent/US7312317B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-03-26 US US10/811,192 patent/US20040268426A1/en not_active Abandoned
-
2006
- 2006-07-07 US US11/483,432 patent/US20070044166A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4439592B2 (ja) | 2010-03-24 |
| US20040268426A1 (en) | 2004-12-30 |
| CA2235627C (en) | 2010-08-10 |
| DE69632830D1 (de) | 2004-08-05 |
| JP2000503526A (ja) | 2000-03-28 |
| US6790626B2 (en) | 2004-09-14 |
| WO1997019170A1 (en) | 1997-05-29 |
| US20030082674A1 (en) | 2003-05-01 |
| US7312317B2 (en) | 2007-12-25 |
| US20040175766A1 (en) | 2004-09-09 |
| US20040259171A1 (en) | 2004-12-23 |
| CA2235627A1 (en) | 1997-05-29 |
| ATE270331T1 (de) | 2004-07-15 |
| EP0862628A1 (de) | 1998-09-09 |
| US20070044166A1 (en) | 2007-02-22 |
| US7270966B2 (en) | 2007-09-18 |
| DK0862628T3 (da) | 2004-11-01 |
| EP0862628B1 (de) | 2004-06-30 |
| EP1452600A1 (de) | 2004-09-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE69819345T2 (de) | Für den capsaicin rezeptor kodierende nukleinsäuresequenzen und dem capsaicin rezeptor ähnliche polypeptide und ihre verwendung | |
| DE69731373T2 (de) | Cc-chemokinzeptor c-c ckr-5, dessen derivate und verwendungen | |
| Falls et al. | ARIA, a protein that stimulates acetylcholine receptor synthesis, is a member of the neu ligand family | |
| DE69834432T2 (de) | G-protein gekoppelter rezeptor | |
| DE69423007T3 (de) | Dna codierend für einen menschlichen pankreaspolypeptid-rezeptor (y4) und seine verwendung | |
| DE69534776T2 (de) | Klonierung und expression von einer acetylcholin-durchlässigen ionenkanälen rezeptor-untereinheit | |
| DE69334187T2 (de) | Stabil transfizierte Zelllinien welche Humane GABA-A Rezeptoren mit der Untereinheitskombination Alpha-2, Beta-3 und Gamma-2 exprimieren | |
| DE69632830T2 (de) | Rezeptor und dafür kodierendes nukleinsäuremolekül | |
| DE69636870T2 (de) | KVLQT1 - EIN GEN DES LONG-QT-SYNDROMS, WELCHES FÜR KVLQT1 KODIERT UND WELCHES SICH MIT Mink ZUSAMMENSETZT, UM Iks-KALIUMKANÄLE DES HERZENS ZU BILDEN | |
| DE69633131T2 (de) | Rezeptor des y-y5 neuropeptids | |
| DE69813476T2 (de) | G-protein-gekoppelter rezeptor mit selektiver affinität für atp | |
| DE69920681T2 (de) | Humaner k+ ionenkanal und therapeutische verwendungen davon | |
| DE60225699T2 (de) | Nierenspezifischer urattransporter und dessen gen | |
| DE60038025T2 (de) | Hochaffinitäts-cholintransporter | |
| DE69937563T2 (de) | Neuer gaba-b rezeptor | |
| EP1102847B1 (de) | Neuer spannungsabhängiger kaliumkanal und seine verwendung zur entwicklung von therapeutika | |
| US7485703B2 (en) | Antibody against G-protein coupled receptor showing selective affinity for ATP and uses therefor | |
| DE19963612B4 (de) | Neue spannungsabhängige Kaliumkanäle aus der Kv4-Familie sowie deren Verwendung zur Entwicklung von Therapeutika | |
| EP1112365A2 (de) | Humaner un muriner g-protein gekoppelter rezeptor edg6 (endothelial differentiation gen) und seine verwendung | |
| DE19846979A1 (de) | G-Protein gekoppelter Rezeptor EDG6 und seine Verwendung |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8364 | No opposition during term of opposition |