DE69731373T2

DE69731373T2 - Cc-chemokinzeptor c-c ckr-5, dessen derivate und verwendungen

Info

Publication number: DE69731373T2
Application number: DE69731373T
Authority: DE
Inventors: Michel Samson; Marc Parmentier; Gilbert Vassart; Frederick Libert
Original assignee: Euroscreen SA
Current assignee: Ogeda SA
Priority date: 1996-03-01
Filing date: 1997-02-28
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2017-03-01
Also published as: JP2000505301A; PT883687E; US6930174B2; ES2227672T3; CA2247989A1; US7285390B2; WO1997032019A3; DE69731373D1; EP0883687B1; EP1199360A3; US6448375B1; EP2034023A1; JP2008179639A; US20040161739A1; EP1482042A1; US20020106742A1; ATE428785T1; DK0883687T3; CA2247989C; DE69739366D1

Description

Gebiet der vorliegenden Erfindung
Die Erfindung stellt Verfahren zur Bestimmung von Anti-Liganden bereit, die in der Lage sind, eine Bindung eines Liganden an Peptide eines neuen Chemokinrezeptors zu inhibieren. Die Erfindung betrifft auch Durchmusterung auf Wirkstoffe, die an besagte Peptide spezifisch binden, und Behandlungen, die besagte Peptide oder die besagte Peptide codierenden Nukleinsäure-Moleküle involvieren.
Technische Grundlagen und Stand der Technik
Chemotaktische Cytokine oder Chemokine sind kleine Signalproteine, die abhängig von der relativen Position der ersten beiden konservierten Cysteine in zwei Unterfamilien (CC- und CXC-Chemokine) unterteilt sein können. Interleukin 8 (IL-8) ist das am meisten untersuchte von diesen Proteinen, aber eine große Anzahl von Chemokinen (Regulated on Activation Normal T-cell Expressed and Secreted (RANTES), Monocyte Chemoattractant Protein 1 (MCP-1), Monocyte Chemoattractant Protein 2 (MCP-2), Monocyte Chemoattractant Protein 3 (MCP-3), Growth-Related gene product α (GROα), Growth-Related gene product β (GROβ), Growth-Related gene product γ (GROγ), Makrophagen-inflammatorisches Protein 1α (MIP-1α) und β etc. sind nun beschrieben worden [4]. Chemokine spielen grundlegende Rollen bei der Physiologie von akuten und chronischen Entzündungsprozessen wie auch bei pathologischen Fehlregulationen dieser Prozesse, durch Attraktion und Stimulierung spezifischer Teilmengen von Leukocyten [32]. RANTES zum Beispiel ist ein Chemoattraktant für Monocyten, Gedächtnis-T-Zellen und Eosinophile und induziert die Freisetzung von Histamin von Basophilen. MCP-1, von glatten Muskelzellen in arteriosklerotischen Läsionen freigesetzt, wird als der Faktor (oder einer der Faktoren) betrachtet, der für Makrophagen-Attraktion und deshalb für die fortschreitende Verschlimmerung der Läsionen verantwortlich ist.
M1P-1α, M1P-1β und RANTES Chemokine sind kürzlich als wichtige HIV-suppressive Faktoren beschrieben worden, die von CD8+ T-Zellen produziert sind [9]. CC-Chemokine sind ebenfalls an der Regulation der Proliferation von humanen myeloiden Vorläufer-Zellen beteiligt [6, 7].
Jüngste Studien haben gezeigt, dass die Wirkungen von CC- und CXC-Chemokinen von Unterfamilien von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren vermittelt sind. Bis heute sind, trotz der Chemokinen zugeschriebenen zahlreichen Funktionen und steigender Zahl biologisch aktiver Liganden, nur sechs funktionelle Rezeptoren im Menschen identifiziert worden. Zwei Rezeptoren für Interleukin-8 IL-8) sind beschrieben worden [20, 29]. Einer (IL-8RA) bindet spezifisch IL-8, während der andere (IL-8RB) IL-8 und weitere CXC-Chemokine, wie GRO, bindet. Von den CC-Chemokine bindenden Rezeptoren bindet ein Rezeptor, als CC-Chemokinrezeptor 1 (CCR-1) bezeichnet, sowohl RANTES als auch MIP-1α [31], und der CC-Chemokinrezeptor 2 (CCR-2) bindet MCP-1 und MCP-3 [8, 44, 15]. Zwei zusätzliche CC-Chemokinrezeptoren wurden kürzlich kloniert: der CC-Chemokinrezeptor 3 (CCR3), von dem festegstellt wurde, dass er von RANTES, MIP-1α und MIP-1β aktiviert wird; der CC-Chemokinrezeptor 4 (CCR4) antwortet auf MIP-1, RANTES und MCP-1 [37]. Zusätzlich zu diesen sechs funktionellen Rezeptoren sind mehrere Orphanrezeptoren vom Menschen und anderen Spezies kloniert worden, die entweder mit CC- oder CXC-Chemokinrezeptoren strukturell verwandt sind. Diese umfassen den humanen BLR1 [13], EBI1 [5], LCR1 [21], die Maus MIP-1 RL1 und MIP-1 RL2 [17] und den bovinen PPR1 [25]. Ihr(e) entsprechende(r)n Ligand(en) und Funktionen) sind bis heute unbekannt.
Zusammenfassung der Erfindung
In einer Anwendungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung, ob ein Anti-Ligand in der Lage ist, die Bindung eines Liganden, wobei besagter Ligand ein HIV-Virus oder ein Teil dessen ist, an ein Peptid mit einer Aminosäure-Sequenz, die mehr als 80% Homologie mit der Sequenz SEQ ID NO: 2, wie in 1 dargestellt, aufweist, zu inhibieren, wobei besagtes Verfahren die Schritte umfasst, eine Zelle, die mit einem Vektor transfiziert ist, der das Nukleinsäure-Molekül, das für besagtes Peptid kodiert, exprimiert, mit dem Anti-Liganden unter Bedingungen in Kontakt zu bringen, die eine Bindung des Anti-Liganden an besagtes Peptid erlauben, und zu bestimmen, ob der besagte Anti-Ligand die Bindung des besagten Liganden an besagtes Peptid inhibiert.
In einer zweiten Anwendungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung, ob ein Anti-Ligand in der Lage ist, die Bindung eines Liganden, wobei besagter Ligand ein HIV-Virus oder ein Teil dessen ist, an ein Peptid mit einer Aminosäure-Sequenz, die mehr als 80% Homologie mit der Sequenz SEQ ID NO: 2, wie in 1 dargestellt, aufweist, zu inhibieren, wobei besagtes Verfahren die Schritte umfasst,

– einen Zellextrakt von Zellen zuzubereiten, die mit einem Vektor transfiziert worden sind, der das Nukleinsäure-Molekül, das für besagtes Peptid codiert, exprimiert,
– aus dem Zellextrakt eine Membran-Fraktion zu isolieren,
– den Anti-Liganden mit der Membran-Fraktion unter Bedingungen in Kontakt zu bringen, die die Bindung des Anti-Liganden an besagtes Peptid erlauben, und
– zu bestimmen, ob der besagte Anti-Ligand die Bindung des besagten Liganden an besagtes Peptid inhibiert.

In einer bevorzugten Anwendungsform umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Schritte:

– eine Zelle oder einen Zellextrakt zuzubereiten, wobei besagte Zelle mit dem Nukleinsäure-Molekül transfiziert worden ist, das für ein Peptid mit einer Aminosäure-Sequenz kodiert, die mehr als 80% Homologie mit der Sequenz SEQ ID NO: 2, wie in 1 dargestellt, aufweist,
– gegebenenfalls eine Membran-Fraktion aus dem Zellextrakt zu isolieren,
– die Zelle oder Membran-Fraktion in Gegenwart des besagten Liganden des besagten Peptids mit besagtem Anti-Liganden unter Bedingungen in Kontakt zu bringen, die die Aktivierung einer funktionalen Peptid-Antwort erlauben, und
– mittels eines Bioassays eine Modifikation in der Aktivität des Peptids nachzuweisen und dadurch zu ermitteln, ob der besagte Anti-Ligand die Bindung des besagten Liganden an besagtes Peptid inhibiert.

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Modifikation der Peptidaktivität mit Hilfe eines Bioassays nachgewiesen sein, der auf der Modifikation der Produktion eines zweiten Botenstoffes basiert. Besagter Bioassay kann auf einer Messung der Konzentration von Calcium-Ionen oder Inositol-Phosphaten (wie IP₃) beruhen.
In einer dritten Anwendungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Durchmustern von Wirkstoffen zur Identifizierung von Wirkstoffen, die spezifisch das Peptid binden, das die Aminosäure-Sequenz umfasst, die mehr als 80% Homologie mit der Sequenz SEQ ID NO: 2, wie in 1 dargestellt, oder einem Teil von dieser aufweist, und für die Behandlung und/oder Vermeidung von HIV-Virus-Infektionen verwendet werden können, wobei besagtes Verfahren die Schritte umfasst, eine Zelle, die mit einem Vektor transfiziert worden ist, der das Nukleinsäure-Molekül exprimiert, das für besagtes Peptid kodiert, mit einem Wirkstoff unter Bedingungen in Kontakt zu bringen, die eine Bindung besagten Wirkstoffes an besagtes Peptid erlauben, und zu bestimmen, ob besagter Wirkstoff die transfizierte Zelle spezifisch bindet, um dadurch einen Wirkstoff zu identifizieren, der an besagtes Peptid spezifisch bindet und der für die Behandlung und/oder Vermeidung von HIV-Virus-Infektionen verwendet werden kann.
In einer vierten Anwendungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Durchmustern von Wirkstoffen zur Identifizierung von Wirkstoffen, die spezifisch das Peptid binden, das die Aminosäure-Sequenz umfasst, die mehr als 80% Homologie mit der Sequenz SEQ ID NO: 2, wie in 1 dargestellt, oder einem Teil von dieser aufweist, und für die Behandlung und/oder Vermeidung von HIV-Virus-Infektionen verwendet werden können, wobei besagtes Verfahren die Schritte umfasst, einen Zellextrakt aus Zellen zuzubereiten, die mit einem Vektor transfiziert worden sind, der das Nukleinsäure-Molekül exprimiert, das für besagtes Peptid kodiert, aus dem Zellextrakt eine Membran-Fraktion zu isolieren, die Membran-Fraktion mit einem Wirkstoff unter Bedingungen in Kontakt zu bringen, die eine Bindung besagten Wirkstoffes an besagtes Peptid erlauben, und zu bestimmen, ob besagter Wirkstoff die transfizierte Zelle spezifisch bindet, um dadurch einen Wirkstoff zu identifizieren, der an besagtes Peptid spezifisch bindet und für die Behandlung und/oder Vermeidung von HIV-Virus-Infektionen verwendet werden kann.
In einer fünften Anwendungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung, ob ein Agonist oder Antagonist, der an ein Peptid bindet, das die Aminosäure-Sequenz umfasst, die mehr als 80% Homologie mit der Sequenz SEQ ID NO: 2, wie in 1 dargestellt, oder einem Teil von dieser aufweist, für die Behandlung und/oder Vermeidung einer HIV-Virus-Infektion verwendet werden kann, wobei besagtes Verfahren die Schritte umfasst, eine Zelle, die mit einem Vektor transfiziert worden ist, der das Nukleinsäure-Molekül exprimiert, das für besagtes Peptid kodiert, mit dem Agonisten oder Antagonisten unter Bedingungen in Kontakt zu bringen, die eine Bindung des Agonisten oder Antagonisten an besagtes Peptid erlauben, und zu bestimmen, ob der besagte Agonist oder Antagonist die Bindung von HIV-Virus an besagtes Peptid inhibiert.
In einer sechsten Anwendungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung, ob ein Agonist oder Antagonist, der an ein Peptid bindet, das die Aminosäure-Sequenz umfasst, die mehr als 80% Homologie mit der Sequenz SEQ ID NO: 2, wie in 1 dargestellt, oder einem Teil von dieser aufweist, für die Behandlung und/oder Vermeidung einer HIV-Virus-Infektion verwendet werden kann, wobei besagtes Verfahren die Schritte umfasst, einen Zellextrakt aus Zellen zuzubereiten, die mit einem Vektor transfiziert worden sind, der das Nukleinsäure-Molekül exprimiert, das für besagtes Peptid kodiert, aus dem Zellextrakt eine Membran-Fraktion zu isolieren, die Membran-Fraktion mit dem Agonisten oder Antagonisten unter Bedingungen in Kontakt zu bringen, die eine Bindung des Agonisten oder Antagonisten an besagtes Peptid erlauben, und zu bestimmen, ob der besagte Agonist oder Antagonist die Bindung von HIV-Virus an besagtes Peptid inhibiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren, die ein Peptid mit einer Aminosäure-Sequenz verwenden, die mehr als 80%, vorteilhaft mehr als 90%, bevorzugt mehr als 95% Homologie mit der Aminosäure-Sequenz aufweist, wie in SEQ ID NO: 2 dargestellt und in 1 gezeigt.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren, die die Aminosäure-Sequenz von SEQ ID NO: 2 oder einen Teil davon (in 1 dargestellt) verwenden.
Ein „Teil einer Aminosäure-Sequenz" bedeutet ein oder mehrere Aminosäure-Segmente mit den gleichen oder verbesserten Bindungseigenschaften des ganzen Peptids gemäß der Erfindung. Besagter Teil könnte ein Epitop sein, das von einem Liganden des Peptids spezifisch gebunden wird, der ein bekannter „natürlicher Ligand" von besagtem Peptid, ein Agonist oder Analogon von besagtem Liganden oder ein Inhibitor sein könnte, der in der Lage ist, die Bindung von besagtem Liganden an das Peptid (einschließlich der Antagonisten von besagtem Liganden an das Peptid) kompetitiv zu inhibieren.
Spezifische Beispiele von besagten Teilen der Aminosäure-Sequenz und ihre Herstellungsverfahren sind in der Veröffentlichung von Pucker et al. beschrieben (Cell, Vol. 87, Seiten 437–446 (1996)).
Gemäß der Erfindung umfasst besagter Teil der Aminosäure-Sequenz des in den Verfahren zu verwendenden Peptids gemäß der Erfindung das N-terminale Segment und den ersten extrazellulären Loop des Peptids.
Das Peptid oder ein Teil dessen, das in den Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden soll, ist ein aktiver CC-Chemokinrezeptor.
Der CC-Chemokinrezeptor, der in den Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden soll, wird durch das MIP-1β Chemokin bei einer Konzentration von weniger oder gleich 10 nm stimuliert und wird vorteilhaft auch von den MIP-1α oder RANTES Chemokinen stimuliert. Allerdings wird besagter Chemokinrezeptor nicht von den MCP-1, MCP-2, MCP-3, IL-8 und GROα Chemokinen stimuliert.
Zusätzlich ist das Peptid, das in den Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden soll, ein Rezeptor für HIV-Viren oder einen Teil von besagten HIV-Viren.
Mit „HIV-Viren" sind HIV-1 oder HIV-2 und alle verschiedenartigen HIV-Virusstämme gemeint, die bei der Entwicklung von AIDS involviert sind. Mit „ein Teil von HIV-Viren" ist ein beliebiges Epitop von besagten Viren gemeint, das in der Lage ist, mit besagtem Rezeptor spezifisch zu interagieren. Unter besagten Teilen von Viren, die bei der Interaktion mit dem Peptid, wie in der Erfindung definiert, beteiligt sein können, sind Peptide, die von den ENV und GAG Virus-Genen codiert sind.
Gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung, wie oben definiert, kann besagtes HIV-Virus aus der Gruppe ausgewählt sein, bestehend aus dem humanen Immundefizienzvirus 1 (HIV 1), dem humanen Immundefizienzvirus 2 (HIV 2) oder einem Teil von besagten HIV-Viren.
Vorzugsweise ist besagter Teil von HIV-Viren das Glycopeptid gp120/160 (Membran-gebunden oder das davon abstammende freie gp) oder ein Teil davon.
Mit „Teil des Glycopeptids gp 120/160" ist ein beliebiges Epitop, vorzugsweise ein immundominantes Eptitop, von besagtem Glycopeptid gemeint, das mit dem Peptid spezifisch interagieren kann, wie in der Erfindung definiert, wie zum Beispiel der V3-Loop (dritte hypervariable Domäne).
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung, wie oben definiert, können außerdem den Schritt des Messens der Infektiosität der Zelle mit einem HIV-Stamm umfassen, worin besagter Anti-Ligand, Wirkstoff, Agonist oder Antagonist die Infektiosität von besagtem HIV-Stamm vermindert. In besagtem Verfahren kann die Zelle ein Lymphocyt sein. Zusätzlich gemäß der vorliegenden Erfindung kann der HIV-Stamm das humane Immundefizienzvirus 1 (HIV-1) oder das humane Immundefizienzvirus 2 (HIV-2) sein. Die Erfindung spezifiziert außerdem, dass die Verminderung der HIV-Infektiosität durch die Dosierung eines HIV-Proteins gemessen sein kann. Vorzugsweise ist besagtes HIV-Protein das HIV Antigen P24.
Vorteilhaft ist das Peptid, das in den Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden soll, ein humaner Rezeptor.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren, die die Verwendung eines Nukleinsäure-Moleküls mit mehr als 80%, vorzugsweise mehr als 90% Homologie mit der Nukleinsäure von SEQ ID NO: 2, wie in 1 gezeigt, umfassen.
Vorzugsweise besitzt besagtes Nukleinsäure-Molekül wenigstens die in 1 gezeigte Nukleinsäure-Sequenz oder einen Teil davon.
Mit „Teil von besagtem Nukleinsäure-Molekül" ist eine beliebige Nukleinsäure-Sequenz mit mehr als 15 Nukleotiden gemeint, die verwendet sein könnte, um besagtes Nukleinsäure-Molekül oder seinen Komplementärstrang zu detektieren und/oder zu rekonstituieren. Ein derartiger Teil könnte eine Sonde oder ein Primer sein, der zur genetischen Amplifikation unter Verwendung der PCR, LCR, NASBA oder CPR-Techniken zum Beispiel verwendet werden könnte.
Die vorliegende Erfindung betrifft spezifischer Verfahren, die die Verwendung der Nukleinsäure-Moleküle umfassen, die das gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendende Peptid codieren. Besagte Nukleinsäure-Moleküle sind RNA oder DNA-Moleküle, wie ein cDNA-Molekül oder ein genomisches DNA-Molekül.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren zur Verwendung eines Vektors, umfassend das Nukleinsäure-Molekül wie oben definiert. Vorzugsweise ist besagter Vektor zur Expression in einer Zelle angepasst und umfasst die zur Expression des Nukleinsäure-Moleküls in besagter Zelle erforderlichen regulatorischen Elemente operativ verknüpft mit der Nukleinsäure-Sequenz gemäß der Erfindung, um dessen Expression zu erlauben.
Vorzugsweise ist besagte Zelle aus der Gruppe gewählt, bestehend aus Bakterienzellen, Hefezellen, Insektenzellen oder Säugerzellen. Der Vektor gemäß der Erfindung ist ein Plasmid, vorzugsweise ein pcDNA3 Plasmid, oder ein Virus, vorzugsweise ein Baculovirus, ein Adenovirus oder ein Semliki-Forest-Virus.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren, umfassend die Verwendung einer Zelle, vorzugsweise eine Säugerzelle wie CHO-K1 oder eine HEK293-Zelle, die mit dem oben beschriebenen Vektor transformiert ist. Vorteilhaft ist besagte Zelle nicht neuronalen Ursprungs und ist aus der Gruppe gewählt, bestehend aus CHO-K1, HEK293, BHK21, COS-7-Zellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung einer Zelle (vorzugsweise eine Säugerzelle wie einer CHO-K1-Zelle), transformiert von dem oben beschriebenen Vektor und einem weiteren Vektor, der ein Protein codiert, das die funktionale Antwort in besagter Zelle verstärkt. Vorteilhaft ist das besagte Protein das Ga15 oder Ga16 (G-Protein, α-Untereinheit). Vorteilhaft ist besagte Zelle die CHO-K1-pEFIN hCCRS-1/16 Zelle.
Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung eines Antisense-Oligonukleotids mit einer Sequenz, die in der Lage ist, an ein mRNA-Molekül spezifisch zu hybridisieren, das das oben definierte Peptid codiert, um die Translation von besagtem mRNA-Molekül zu verhindern, oder eines Antisense-Oligonukleotids mit einer Sequenz, die in der Lage ist, an das cDNA-Molekül spezifisch zu hybridisieren, das das Peptid gemäß der Erfindung codiert. Besagtes Antisense-Oligonukleotid kann chemische Nukleotid-Analoga oder Substanzen umfassen, die mRNA inaktivieren, oder in einem mRNA-Molekül enthalten sein, das mit der Ribozymaktivität ausgestattet ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft folglich die Verwendung eines Antisense-Oligonukleotids, umfassend eine Sequenz, die an ein Nukleinsäure-Molekül mit mehr als 80% Homologie mit Nukleinsäure-Sequenz SEQ ID NO: 2, wie in 1 gezeigt, spezifisch hybridisiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Vermeidung und/oder Behandlung einer Infektion mit dem humanen Immundefizienzvirus 1 (HIV-1) und/oder dem humanen Immundefizienzvirus 2 (HIV-2) (AIDS).
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung eines Antisense-Oligonukleotids, umfassend eine Sequenz, die an ein Nukleinsäure-Molekül mit wenigstens der Nukleinsäure-Sequenz SEQ ID NO: 2, wie in 1 gezeigt, oder einem Teil davon spezifisch hybridisiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Vermeidung und/oder Behandlung einer Infektion mit dem humanen Immundefizienzvirus 1 (HIV-1) und/oder dem humanen Immundefizienzvirus 2 (HIV-2) (AIDS).
Vorzugsweise codiert besagtes Nukleinsäure-Molekül ein wie oben definiertes Peptid. Darüber hinaus kann besagtes Molekül ein cDNA-Molekül oder ein genomisches DNA-Molekül sein. Zusätzlich kann gemäß der vorliegenden Erfindung besagtes Antisense-Oligonukleotid chemische Nukleotid-Analoga von umfassen.
Ein andere Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein wie oben definiertes Verfahren unter Verwendung eines Liganden oder Anti-Liganden (vorzugsweise eines Antikörpers), andere als die bekannten „natürlicher Liganden", die aus der Gruppe gewählt sind, bestehend aus den MIP-1β, MIP-1α oder RANTES Chemokinen, HIV-Viren oder einem Teil von besagten HIV-Viren, worin besagter Ligand in der Lage ist, an den Rezeptor gemäß der Erfindung zu binden, und worin besagter Anti-Ligand in der Lage ist, das Binden von besagtem bekannten „natürlichen Liganden" oder dem Liganden gemäß der Erfindung an das Peptid gemäß der Erfindung zu inhibieren (vorzugsweise kompetitiv).
Die vorliegende Erfindung beschreibt außerdem ein Verfahren gemäß der Erfindung, worin der Anti-Ligand, der Wirkstoff oder der Antagonist ein Antikörper sein kann.
Der Ausschluss in der oben gemachten Definition von bekannten Chemokinen, HIV-Viren oder einem Teil von besagten HIV-Viren umfasst keine Varianten von besagten „natürlichen" Viren oder besagtem „natürlichen" Teil, die zum Beispiel durch gentechnische Herstellung erhalten sein können und die die Interaktion von besagten Viren und Teil von besagten Viren dem Peptid gemäß der Erfindung vortäuschen können.
Vorteilhaft ist besagter Antikörper, der in einem Verfahren der Erfindung verwendet werden soll, ein monoklonaler Antikörper, der vorzugsweise gegen ein Epitop des Peptids gemäß der Erfindung spezifisch gerichtet ist und das auf der Oberfläche einer besagtes Peptid exprimierender Zelle vorhanden ist.
Vorzugsweise ist besagter Antikörper von der Hybridomzelle AchCCRS-SAB1A7 produziert.
In einer weiteren Anwendungsform betrifft die Erfindung einen Antikörper, der die Bindung des humanen Immundefizienzvirus 1 (HIV-1) oder des humanen Immundefizienzvirus 2 (HIV-2) an ein Peptid mit einer Aminosäure-Sequenz, die mehr als 80%, 90% oder 95% Homologie mit SEQ ID NO: 2, wie in 1 gezeigt, aufweist und gemäß einem Verfahren der vorliegenden Erfindung identifiziert wird, inhibiert oder vermindert. Alternativ kann die Aminosäure-Sequenz des Peptids eine wie in SEQ ID NO: 2 von 1 dargestellte Aminosäure-Sequenz besitzen. Besagter Antikörper gemäß der Erfindung kann ein monoklonaler Antikörper, vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper sein, der gegen ein Epitop besagten Peptids gerichtet ist, das auf der Oberfläche einer besagtes Peptid exprimierender Zelle vorhanden ist.
Gemäß der Erfindung kann der wie oben beschriebene Antikörper die Infektiosität einer Zelle durch einen HIV-Stamm vermindern. Gemäß einer bevorzugten Anwendungsform der Erfindung ist besagte Zelle ein Lymphocyt. Der HIV-Stamm, der von dem Antikörper der vorliegenden Erfindung erkannt wird, kann ein humaner Immundefizienzvirus 1 (HIV-1 Stamm) oder Immundefizienzvirus 2 (HIV-2 Stamm) sein.
Die Erfindung betrifft ebenfalls die pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine wirksame Menge des oben identifizierten Antikörpers. Die pharmazeutische Zusammensetzung umfasst ebenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger, der vorzugsweise in der Lage ist, besagte Zellmembran zu passieren.
Vorzugsweise umfasst der pharmazeutisch verträgliche Träger eine Struktur, die an einen Rezeptor auf einer Zelle bindet, der in der Lage ist, von der Zelle nach Bindung an die Struktur aufgenommen zu werden. Die Struktur des pharmazeutisch verträglichen Trägers in besagter pharmazeutischer Zusammensetzung ist in der Lage, an einen Rezeptor zu binden, der für einen ausgewählten Zelltyp spezifisch ist.
Besagte pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der Erfindung kann zur Herstellung eines Medikaments zur Vermeidung und/oder Behandlung einer Infektion mit dem humanen Immundefizienzvirus 1 (HIV-1) und/oder dem humanen Immundefizienzvirus 2 (HIV-2) (AIDS) verwendet sein.
Die Erfindung betrifft ein wie oben definiertes Verfahren, worin das Detektionsmittel ein Bioassay, mit Hilfe einer Modifikation der Konzentration eines zweiten Botenstoffes (vorzugsweise Calcium-Ionen oder Inositol-Phosphate wie IP₃) oder einer Modifikation im Zellstoffwechsel (vorzugsweise durch die Versauerungsrate des Kulturmediums bestimmt).
Vorzugsweise umfasst der Assay des zweiten Botenstoffes, der gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, das Messen der Calcium-Ionen oder Inositol-Phosphate wie IP₃.
Vorzugsweise ist die Zelle, die in den Verfahren gemäß der Erfindung verwendet ist, eine Säugerzelle nicht neuronalen Ursprungs wie CHO-K1, HEK293, BHK21, COS-7-Zellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge eines Antikörpers gegen das Peptid gemäß der Erfindung, die wirksam ist, um die Aktivität besagten Peptids zu vermindern, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Mit „ein gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendender Agonist oder ein Antagonist des Peptids" sind alle Agonisten oder Antagonisten der bekannten „natürlichen Liganden" des wie oben beschriebenen Peptids gemeint.
Deshalb können die zuvor beschriebenen Verfahren zur Durchmusterung auf Wirkstoffe verwendet sein, um Wirkstoffe zu identifizieren, die an das gemäß der Erfindung zu verwendende Peptid spezifisch zu binden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der Erfindung zur Behandlung und/oder Vermeidung viraler Infektionen mit humanen Immundefizienzviren 1 und 2 (HIV-1 und 2).
Die Hinterlegungen der Mikroorganismen AchCCRS-SAB1A7 und CHO-K1-pEFINhCCRS-1/16 erfolgten nach dem Budapester Vertrag bei der Belgium Coordinated Collection of Micro-organisms (BCCM), Laboratorium voor Moleculaire Biologie (LMBP), Universiteit Gent, K. L. Ledeganckstraat 35, 3-9000 GENT, BELGIUM.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen.
Die 1 stellt die Primärstruktur der Peptide gemäß der Erfindung dar.
Die 2 stellt die Aminosäure-Sequenz des aktiven humanen CCRS-Chemokinrezeptors gemäß der Erfindung dar, mit den Sequenzen der humanen CCR1, CCR2b, CCR3 und CCR4-Rezeptoren aliniert. Aminosäuren, die mit der aktiven CCR5-Sequenz identisch sind, sind eingerahmt.
Die 3 zeigt die chromosomale Organisation der humanen CCR2 und CCR5-Chemokinrezeptor-Gene.
Die 4 zeigt die funktionelle Expression des humanen aktiven CCR5-Rezeptors in einer CHO-K1-Zelllinie.
Die 5 stellt die Verteilung von mRNA dar, die den CCR5-Rezeptor in einer Reihe humaner Zelllinien hämatopoietischen Ursprungs codiert.
Die 6 stellt sie Struktur der mutierten Form des humanen CCR5-Rezeptors dar.
Die 7 stellt die Quantifizierung von ENV-Proteinen vermittelte Fusion mittels Luciferase-Assays dar.
Die 8 stellt die Genotypisierung von Individuen mittels PCR und Segregation der CCR5-Allele in CEPH-Familien dar.
Die 9 stellt die FACS-Analyse von anti-CCR5-Seren auf einer CCR5-CHO-Zelllinie gemäß der Erfindung dar.
Die 10 stellt die Hemmung von HIV-Infektiosität mit CCR5-Antikörpern dar.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
1. EXPERIMENTELLER TEIL
Materialien
Rekombinante humane Chemokine, einschließlich MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, IL-8 und GROα waren von R & D Systems (London, UK) erhalten. [¹²⁵I)MIP-1α (spezifische Aktivität 2200 Ci/mmol) war von Dupont NEN (Brüssel, Belgien) erhalten. Von R & D Systems erhaltene Chemokine waren nach Herstellerangaben auf SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese) > 97% rein und in für jeden Liganden spezifischen Bioassays biologisch aktiv. Die lyophilisierten Chemokine waren als 100 μg/ml Lösung in einer sterilen Phosphat gepufferten Saline (PBS) gelöst und diese Stammlösung war bei –20°C in Aliquote aufbewahrt. Chemokine waren unmittelbar vor Gebrauch auf die Arbeitskonzentration verdünnt. Alle Zelllinien in der vorliegenden Untersuchung waren von der ATCC (Rockville, MD, USA) erhalten.
Klonierung und Sequenzierung
Der Maus MOP020-Klon wurde, wie zuvor beschrieben [24, 34], durch eine Polymerase-Kettenreaktion mit geringer Stringenz unter Verwendung genomischer DNA als Template erhalten. Eine in den lambda DASH-Vektor konstruierte humane genomische DNA-Bibliothek (Stratagene, LaJolla, CA) wurde bei geringer Stringenz [39] mit der MOP020 (511 bp) Sonde durchmustert. Die positiven Klone wurden bis zur Homogenität gereinigt und mit Southern-Blot analysiert. Die Restriktionskarte des Locus wurde bestimmt und ein relevantes Xba I-Fragment von 4.400 bp wurde in Bluescript SK+ (Stratagene) subkloniert. Eine Sequenzierung beider Stränge wurde nach Subklonierung in M13mp-Abkömmlinge mit Hilfe fluoreszierender Primer und eines automatischen DNA-Sequenzierers (Applied Biosystems 370A) durchgeführt. Sequenzbearbeitung und Datenanalyse wurden mit Hilfe der DNASIS/PROSIS Software (Hitachi) und derm GCG Software Paket (Genetics Computer Group, Wisconsin) durchgeführt.
Expression in Zelllinien
Die gesamte codierende Region wurde als ein 1056 bp Fragment unter Verwendung von Primern, die die BamHI beziehungsweise XbaI Restriktionsschnittstelle enthielten, mittels PCR amplifiziert und nach Schneiden in die entsprechenden Stellen des eukaryotischen Expressionsvektors pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA) kloniert. Das resultierende Konstrukt wurde mittels Sequenzierung verifiziert und in CHO-K1-Zellen, wie beschrieben [35], transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurde eine Selektion auf stabil transfizierte Zelllinien durch die Zugabe von 400 μg/ml G418 (Gibco) initiiert und resistente Klone wurden an Tag 10 isoliert. CHO-K1-Zellen wurden unter Verwendung von Hams F12 Medium, wie zuvor beschrieben [35, 11], kultiviert. Die Expression des aktiven CCR5-Rezeptors in den verschiedenen Zellklonen wurde durch Messen des spezifischen Transkriptlevels mittels Northern-Blotting an aus den Zellen hergestellter Gesamt-RNA (siehe unten) bewertet.
Bindungsassay
Stabil transfizierte CHO-K1-Zellen, die den aktiven CCR5-Rezeptor exprimieren, wurden bis zur Konfluenz angezogen und von den Kultursschalen durch Inkubation in Phosphat-gepufferter Saline (PBS), supplementiert mit 1 mM EDTA, abgelöst. Die Zellen wurden durch eine Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit gesammelt und in einer Neubauer Zelle (Zählkammer) gezählt. Bindungsassays wurden in Polyethylen minisorp Röhrchen (Nunc) in einem Endvolumen von 200 μl PBS, die 0,2% Rinderserumalbumin (BSA) und 10⁶ Zellen enthielt, in Gegenwart von [¹²⁵I]-MIP-1α durchgeführt. Unspezifische Bindung wurde durch Zugabe von 10 nM unmarkiertem MIP-1α bestimmt. Die Konzentration des markierten Liganden betrug 0,4 nM (etwa 100 000 cpm pro Röhrchen). Die Inkubation wurde für 2 Stunden bei 4°C durchgeführt, und durch schnelle Zugabe von 4 ml eiskaltem Puffer und sofortigem Sammeln der Zellen mittels Vakuumfiltration durch GF/B Glasfaserfilter (Whatman), die in 0,5% Polyethyleneininmin (Sigma) vorgetränkt waren, gestoppt. Die Filter wurden dreimal mit 4 ml eiskaltem Puffer gewaschen und in einem Gamma-Zähler gezählt.
Biologische Aktivität
Die CHO-K1-Zelllinien, die mit dem pcDNA3/CCR5 Konstrukt stabil transfiziert waren oder Wildtyp CHO-K1 Zellen (als Kontrolle eingesetzt) wurden mit einer Dichte von 2,5 10⁵ Zellen/Vertiefung in Harms F12 Medium, auf die Membran von Transwell Cell Kapseln (Molecular Devices ) ausplattiert. Am nächsten Tag wurden die Kapseln in ein Mikrophysiometer (Cytosensor, Molecular Devices) transferiert und die Zellen konnten ungefähr zwei Stunden mittels Perfusion von 0,2% BSA haltigem 1 mM Phosphat gepuffertem (pH 7,4) RPMI-1640 Medium äquilibrieren. Die Zellen wurden dann verschiedenen, im gleichen Medium verdünnten Cytokinen 2 Minuten lang exponiert. Säurebildungsraten wurden in ein Minuten Intervallen gemessen.
Northern Blotting
Gesamt-RNA wurde aus transfizierten CHO-K1-Zelllinien, von einer Reihe an humanen Zelllinien hämatopoietischen Ursprungs und von einer Reihe Hundegeweben unter Verwendung des RNeasy Kit (Qiagen) isoliert. RNA-Proben (10 μg/Spur) wurden in Gegenwart von Glyoxal denaturiert [26], auf einem 1% Agarosegel in einem 10 mM Phosphat-Puffer (pH 7,0) aufgetrennt und auf Nylon-Membranen (Pall Biodyne A, Glen Cove, NY) wie beschrieben [42], transferiert. Nach Backen wurden die Blots 4 h bei 42°C in einer Lösung aus 50% Formamid, 5 × Denhard-Lösung (1 × Denhard: 0,02% Ficoll, 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,02% BSA), 5 × SSPE (1 × SSPE: 0,18 M NaCl, 10 mM Natriumphosphat, 1 mM EDTA ph 8,3), 0,3% Natriumdodecylsulphat (SDS), 250 μg pro ml denaturierte Hering-DNA, vorhybridisiert. DNA-Sonden wurden mittels Zufalls-Priming (α³²P)-markiert [14]. Hybridisierungen wurden 12 h bei 42°C in der gleichen Lösung, die 10% (wt/vol) Dextransulfat und die hitzedenaturierte Sonde enthielt, durchgeführt. Filter wurden in 1 × SSC (1 × SSC: 150 mM NaCl, 15 mM Natriumcitrat pH 7,0), 0,1% SDS bei 60°C gewaschen und unter Verwendung von Amersham β-max Filmen bei –70°C autoradiographiert.
2. ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Klonierung und Strukturanalyse
Die Sequenzhomologie, die G-Protein-gekoppelte Rezeptoren codierende Gene kennzeichnet, hat die Klonierung von neuen Mitgliedern dieser Genfamilie mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bei geringer Stringenz erlaubt [23, 24]. Einer der aus Maus genomischer DNA amplifizierten Klone, MOP020 genannt, zeigte starke Ähnlichkeiten mit charakterisierten Chemokinrezeptoren, die zu 80% mit dem MCP-1 Rezeptor (CCR2) [8], zu 65% mit dem MIP-1α/RANTES Rezeptor (CCRI) [31] und zu 51% mit IL-8 Rezeptoren [20, 30] identisch waren. Der Klon wurde als Sonde zur Durchmusterung einer humanen genomischen Bibliothek verwendet. Insgesamt wurden 16 lambda Phagenklone isoliert. Es wurde aus dem Restriktionsmuster von jedem Klon und von partiellen Sequenzdaten geschlossen, dass alle Klone zu einem einzigen Contig gehörten, in dem zwei verschiedene codierende Sequenzen enthalten waren. Eine der codierenden Sequenzen war mit der berichteten cDNA identisch, die den CCR2-Rezeptor codiert [8, 44]. Ein 4.400 bp XbaI Fragment eines repräsentativen Klons, der die zweite Hybridisierungsregion enthielt, wurde in pBluescript SK+ subkloniert. Sequenzierung zeigte ein neues Gen, vorläufig CCR5 genannt, das zu 84% mit der M0P020-Sonde identisch war, was vermuten ließ, dass MOP020 das Maus Ortholog von CCR5 ist. MOP020 entsprach keinem der drei Maus Chemokinrezeptor-Gene, die vor kurzem geklont wurden [16], was die Existenz eines vierten murinen Chemokinrezeptors demonstriert.
Die Sequenz von CCR5 zeigte einen einzigen offenen Leserahmen von 352 Codons, die ein 40.600 Da Protein codieren. Die den vorgeschlagenen Initiationscodon umgebende Sequenz stimmt mit der Konsensus-Sequenz, wie von Kozak beschrieben [22], überein, da das Nucleotid in –3 ein Purin ist. Das Hydropathie-Profil der deduzierten Aminosäure-Sequenz stimmt mit dem Vorhandensein von 7 Transmembran-Segmenten überein. Alignment der CCR5-Amnosäure-Sequenz mit der Sequenz von anderen funktionell chrakterisierten humanen CC-Chemokinrezeptoren ist in 2 dargestellt. Die größte Ähnlichkeit besteht zum CCR2-Rezeptor [8], mit 75,8% identischen Resten. Es besteht ebenfalls eine 56,3% Identität mit dem CCR1 Rezeptor [3], 58,4% mit dem CCR3 [10] und 49,1% mit CCR4 [37]. CCR5 stellt deshalb ein neues Mitglied der CC-Chemokinrezeptorgruppe dar [30]. Wie die verwandten CCRI und IL-8 Rezeptoren [20, 29, 31, 16] scheint die codierende Region von CCR5 ohne Introns zu sein. Aus unseren Daten der partiellen Sequenzierung ist das CCR2-Gen ebenfalls ohne Intron in den ersten zwei Dritteln seiner codierenden Sequenz.
Sequenz-Ähnlichkeiten innerhalb der Chemokinfamilie sind in den transmembran erstreckenden Domänen und in den intrazellulären Loops größer. Als Beispiel steigen die Identitätswerte zwischen CCR5 und CCR2 auf bis zu 92%, wenn nur die Transmembran-Segmente betrachtet werden. Geringere Ähnlichkeiten werden in der N-terminalen extrazellulären Domäne und den extrazellulären Loops festgestellt. Es ist gezeigt worden, dass die N-terminale Domäne der IL-8 und CCR2 Rezeptoren für die Interaktion mit dem Liganden essenziell ist [19, 18]. Die Variabilität dieser Region bei den CC-Chemokinrezeptoren trägt vermutlich zur Spezifität für die verschiedenen Liganden der Familie bei.
Eine einzige mögliche Stelle für N-verknüpfte Glycosylierung wurde in dem dritten extrazellulären Loop identifiziert (1). Keine Glycosylierungsstelle wurde in der N-terminalen Domäne des Rezeptors gefunden, wo die meisten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren glycosyliert sind. Die anderen Chemokinrezeptoren CCR1 und CCR2 weisen eine derartige N-verknüpfte Glycosylierungsstelle in ihrer N-terminalen Domäne auf [31, 8]. Im Gegensatz hierzu zeigt der CCR3-Rezeptor [10] keine Glycosylierungsstellen weder im N-Terminus noch in den extrazellulären Loops. Der aktive CCR5 Rezeptor besitzt vier Cysteine in seinen extrazellulären Segmenten und alle vier sind in den anderen CC und CXC-Chemokinrezeptoren konserviert (2). Die im ersten und zweiten extrazellulären Loop vorhandenen Cysteine sind in den meisten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren vorhanden und es wird geglaubt, dass sie eine die Rezeptorstruktur stabilisierende Disulfidbrücke bilden [41]. Die beiden anderen Cysteine in dem N-terminalen Segment und im dritten extrazellulären Loop könnten ähnlich eine stabilisierende Brücke bilden, die für die Chemokinrezeptorfamilie spezifisch ist. Die intrazellulären Domänen von CCR5 enthalten keine potenziellen Stellen für eine Phosphorylierung durch Protein-Kinase C (PKC) oder Protein-Kinase A. PKC-Stellen die an einer heterologen Desensibilisierung involiert sind, sind in dem dritten intrazellulären Loop und C-Terminus vom G-Protein-gekoppelten Rezeptoren häufig. CCR1 ist ebenfalls ohne PKC-Stellen. Im Gegensatz hierzu sind alle CC-Chemokinrezeptoren reich an Serin- und Threonin-Resten in der C-terminalen Domäne. Diese Reste stellen potenzielle Phosphorylierungsstellen durch die Familie von G-Protein-gekoppelten Rezeptorkinasen dar und sind möglicherweise in der homologen Desensibilisierung [41] involviert. Fünf dieser S/T-Reste sind in allen fünf Rezeptoren perfekt aliniert (2).
Physikalische Verknüpfung der CCR5 und CCR2-Gene
Wie oben dargelegt, entsprachen die 16 Klone, die mit der MOP020-Sonde isoliert wurden, einem einzigen die CCR5 und CCR2-Gene enthaltenden Contig. Die Organisation dieses Contig wurde untersucht, um die physikalische Verknüpfung der beiden Rezeptorgene im menschlichen Genom zu charakterisieren. Eine Kombination aus Restriktionskartierung, Southern-Blotting, Fragment-Subklonierung und partieller Sequenzierung gestattete die Bestimmung der entsprechenden Grenzen und Überlappungen aller Klone. Von den 16 Klonen wurden 9 für eine Charaktensierung mit Hilfe einer spezifischen Restriktionskarte ausgewählt, und ihre Organisation ist in 3 skizziert. Vier dieser Klone (#11, 18, 21, 22) enthielten nur das CCR2-Gen, vier Klone (#7, 13, 15, 16) enthielten nur das ChemR13-Gen und ein Klon (#9) enthält Teile beider Sequenzen. Die CCR2 und CCR5-Gene sind hintereinander liegend organisiert, wobei CCR5 stromabwärts von CCR2 liegt. Die CCR2 und CCR5 offene Leserahmen trennende Distanz beträgt 17,5 kb. Die chromosomale Lokalisierung des Tandems ist gegenwärtig unbekannt. Weitere Chemokinrezeptoren sind allerdings in dem humanen Genom lokalisiert worden: das CCR1-Gen wurde mit Fluoreszenz in situ Hybridisierung in der p21-Region vom hunamen Chromosom 3 lokalisiert [16]. Die beiden IL-8-Rezeptor-Gene und ihre Pseudogene sind als Cluster auf der humanen 2q34-q35 Region gezeigt worden [1].
Funktionelle Expression und Pharmakologie des aktiven CCR5-Rezeptors
Stabile CHO-K1-Zelllinien, die den aktiven Rezeptor exprimieren, wurden etabliert und auf Basis des Levels der CCR5-Transkripte durchmustert, der mit Northern-Blotting bestimmt war. Drei Klone wurden selektiert und auf biologische Antworten in einem Mikrophysiometer unter Verwendung verschiedener CC- und CXC-Chemokine als potenzielle Agonisten getestet. Wildtyp-CHO-K1-Zellen wurden als Kontrolle verwendet, um sicher zu sein, dass die beobachteten Antworten für den transfizierten Rezeptor spezifisch waren und nicht das Ergebnis der Aktivierung endogener Rezeptoren waren. Das Mikrophysiometer erlaubt die Echtzeitdetektion der Rezeptoraktivierung durch Messen der Modifikationen des Zellstoffwechsels, die von der Stimulation intrazellulärer Kaskaden herrühren [33]. Mehrere Untersuchungen haben schon das Potenzial der Mikrophysiometrie bei Chemokinrezeptoren demonstriert. Modifikationen der Stoffwechselaktivität in humanen Monocyten als Antwort auf CC-Chemokine wurde unter Verwendung dieses Systems kontrolliert [43]. Ähnliche Änderungen bei der Säurebildungsrate von THP-1-Zellen (eine humane Monocyten-Zelllinie) als Antwort auf MCP-1 und MCP-3 ist gemessen worden [36]. Die Abschätzung des EC₅₀ für beide Proteine unter Verwendung dieser Prozedur entsprach den Werten, die durch Kontrolle des intrazellulären Calciums in anderen Untersuchungen erhalten wurden [8, 15].
Liganden, die zu der Klasse der CC- und CXC-Chemokine gehören, wurden auf den CCR5-transfizierten CHO-K1-Zellen getestet. Während MIP-1α, MIP-1β und RANTES als potente Aktivatoren des neuen Rezeptor befunden waren (4), hatten die CC-Chemokine MCP-1, MCP-2 und MCP-3 und die CXC-Chemokine GROα und IL-8 keinen Effekt auf die Stoffwechselaktivität, selbst bei den höchsten getesteten Konzentrationen (30 nM). Die biologische Aktivität eines der Chemokine, die keine Antwort auf CCR5 (IL-8) induzierten, konnte auf einer CHO-K 1-Zelllinie, die mit dem IL-8A Interleukinrezeptor transfiziert war, demonstriert werden (Mollereau et al., 1993): IL-8 produzierte einen 160% Anstieg der Stoffwechselaktivität, wie mit Hilde des Mikrophysiometers bestimmt wurde. Die biologische Aktivität der MCP-2 und MCP-3 Präparate, wie von J. van Damme geliefert, sind ausgiebig dokumentiert [2, 40]. MIP-1α, MIP-1β und RANTES wurden auf Wildtyp CHO-K1-Zellen mit einer 30 mM Konzentration getestet und keiner von ihnen induzierte eine Stoffwechselantwort. Auf den CCR5-transfizierten CHO-K1-Zelllinie verursachten alle drei aktive Liganden (MCP-1α, MCP-1β und RANTES) einen schnellen Anstieg der Säurebildungsrate, mit einem Maximum nach der zweiten oder dritten Minute nach der Perfusion des Liganden. Die Säurebildungsrate fiel innerhalb von 10 Minuten wieder auf den Basiswert. Der zeitliche Verlauf der zellulären Antwort ist mit dem zeitlichen Verlauf mit Chemokinen auf ihren natürlichen Rezeptoren in humanen Monocyten ähnlich [43]. Wenn Agonisten bei denselben Zellen wiederholt verwendet wurden, war die Antwort im Vergleich zur ersten Stimulation stark vermindert, was eine Desensibilisierung des Rezeptors vermuten lässt. Alle Messungen waren deshalb nach der ersten Stimulation von jeder Kapsel durchgeführt.
Die Konzentration-Wirkung-Beziehung wurde für drei aktive Liganden in dem Bereich von 0,3 bis 30 nM gemessen (3B und C). Die Reihenfolge der Stärke war MIP-1α > MIP-1β = RANTES. Bei 30 nM Konzentrationen schien der Effekt von MIP-1α eine Sättigung zu erreichen (bei 156% des Basiswerts), während MIP-1β und RANTES noch in der ansteigenden Phase waren. Höhere Chemokin-Konzentrationen konnten allerdings nicht eingesetzt werden. Der EC₅₀ war auf etwa 3 nM für MIP-1α geschätzt. Die Konzentrationen, die zum Erhalt einer biologischen Antwort wie unter Verwendung des Mikrophysiometers bestimmt erforderlich sind, liegen im selben Bereich wie die Konzentrationen, die mittels intrazellulärer Calcium-Mobilisierung für den CCR1 [31], den CCR2A und B [8] und den CCR3-Rezeptor [ 10] gemessen wurden. Die Ligandspezifität von CCR5 ist ähnlich wie die für CCR3 berichtete Spezifität [10]. CCR3 wurde als der erste geklonte Rezeptor, der auf MIP-1β antwortet, beschrieben. Allerdings löst MIP-1β bei 10 nM einen signifikanten Effekt auf den CCR5 aus, während die selbe Konzentration ohne Wirkung auf die CCR3-transfizierten Zellen ist [10]. Diese Daten lassen vermuten, dass CCR5 ein physiologischer Rezeptor für MIP-1β sein könnte.
Bindungsexperimente unter Verwendung von [¹²⁵I]-humanem MIP-1α Liganden erlaubten nicht ein spezifisches Binden an CCR53 exprimierende CHO-K1-Zellen zu zeigen, unter Verwendung von etwa 0,4 nM Radioligand und 1 Million transfizierter Zellen pro Röhrchen. Das Nichterhalten von Bindungsdaten könnte einer relativ geringen Affinität des Rezeptors für MIP-1 a zugeschrieben werden.
Northern-Blotting Analyse
Northern-Blotting, das mit einer Reihe von Hundegeweben durchgeführt war, erlaubte keine Detektion von Transkripts für CCR5. Anbetracht der Bedeutung der Chemokinrezeptorfamilie bei Vermittlung von Chemoattraktion und Aktivierung verschiedener Klassen von Zellen, die bei Entzündungs- und Immunantworten beteiligt sind, wurde die Sonde ebenfalls verwendet, um spezifische Transkripte in einer Reihe von humanen Zelllinien hämatopoietischen Ursprungs nachzuweisen (5). Diese Reihe umfasste lymphoblastische (Raji) und T-lymphoblastische (Jurkat) Zelllinien, promyeloblastische (KG-1A) und promyelocytische (HL-60) Zelllinien, eine monocytische (THP-1) Zelllinie, eine erythroleukämische (HEL 92.1.7) Zelllinie, eine megakaryoblastische (MEG-01) Zelllinie und eine meyologene Leukämie (K-562) Zelllinie. Humane mononukleäre Zellen des peripheren Bluts (PBMC), einschließlich reifer Monocyten und Lymphocyten, wurden ebenfalls getestet. CCR5-Transkripte (4,4 kb) konnten nur in der KG-1A promyeloblastischen Zelllinie detektiert werden, wurden aber nicht in der promyelocytischen Zelllinie HL-60, in PBMC oder in irgendeiner anderen getesteten Zelllinie gefunden. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass der aktive CCR5-Rezeptor in Vorläufern der granulocytischen Linie exprimiert sein könnte. Von CC-Chemokinen ist berichtet worden, dass sie reife Granulocyten stimulieren [27, 38, 23, 2]. Allerdings haben jüngere Daten ebenfalls eine Rolle von CC- und CXC-Chemokinen in der Regulation der Proliferation von marinen und humanen myeloiden Vorläufer-Zellen demonstriert [6, 7].
Es wurde gezeigt, dass CCR5 auf MIP-1α, MIP-1β und RANTES antwortet, die drei Chemokine sind als die hauptsächlichen HIV-suppressiven Faktoren identifiziert worden, die von CD8+ T-Zellen gebildet [9] und in höheren Mengen von CD4+ T-Lymphocyten von nicht infizierten aber vielfach exponierten Individuen freigesetzt werden [51]. CCR5 stellt ein wichtiger Co-Rezeptor für Makrophagen-trope (M-trope) HIV-1 primäre Isolate und Stämme dar [45, 50]. M-trope Stämme überwiegen während der asymptomatischen Phase der Erkrankung in infizierten Individuen und werden als verantwortlich für die HIV-Übertragung betrachtet. Stämme, die für ein Wachstum in transformierten T-Zelllinien angepasst sind (T-trope Stämme), nutzen als ein Co-Rezeptor LESTR (oder Fusin) [50], einen Orphanrezeptor, der ebenfalls zur Chemokinrezeptorfamilie gehört, aber bis jetzt noch nicht funktionell charakterisiert wurde [21, 52, 53]. Von dual-tropen Viren, die transitionale Formen des Virus in späten Stadien der Infektion darstellen können [54], ist gezeigt worden, dass sie sowohl CCR5 als auch LESTR als Co-Rezeptor wie auch die CC-Chemokinrezeptoren CCR2b und CCR3 nutzen [47]. Das breite Spektrum genutzter Co-Rezeptoren von dual-troπen Viren lasst vermuten, dass innerhalb infizierter Individuen sich das Virus wenigstens zum Teil aus Selektion mit Hilfe einer Reihe an Co-Rezeptoren, die auf verschiedenen Zelltypen exprimiert werden, evolvieren kann.
Identifizierung eines inaktiven ΔCCR5-Rezeptors
Es ist bekannt, dass Individuen trotz einer wiederholten HIV-1 Exposition nichtinfiziert bleiben [55, 56, 51). Ein Teil dieser exponierten nichtinfizierten Individuen resultiert aus dem relativ geringen Risiko einer Kontaminierung nach einem einzigen Kontakt mit dem Virus, aber es ist postuliert worden, dass es in der Tat resistente Individuen gibt. Tatsächlich sind von exponierten nichtinfizierten Individuen isolierte CD4+-Lymphocyten hoch resistent für eine Infektion mit primären M-tropen aber nicht T-tropen HIV-1 Stämmen. Ebenfalls werden mononukleäre Zellen des peripheren Bluts (PMCB) von verschiedenen Spendern nicht gleichermaßen mit verschiedenen HIV-1 Stämmen infiziert [57–59]. In Anbetracht der von CCR5 bei dem Fusionsereignis gespielten Schlüsselrolle, das die Infektion von M-tropen Viren vermittelt, wird postuliert, dass Varianten von CCR5 für die relative oder absolute Resistenz gegen HIV-1 Infektion, die von einigen Individuen gezeigt wird, und möglicherweise für die Variabilität der Krankheitsentwicklung in infizierten Patienten verantwortlich sein könnten [66]. Die Erfinder wählten drei HIV-1 infizierte Patienten, die als langsam Entwickelnde bekannt waren, und vier seronegative Individuen als Kontrollen aus: die vollständige codierende Region ihres CCR5-Gens wurde mittels PCR amplifiziert und sequenziert. Unerwartet zeigte einer der langsam Entwickelnden aber auch zwei der nichtinfizierten Kontrollen eine Heterozygotie am CCR5-Locus für einen biallelen Polymorphismus. Das häufigere Allel entsprach der veröffentlichten CCR5-Sequenz, während das geringere Allel eine 32 bp Deletion innerhalb der codierenden Sequenz zeigte, in einer Region, die dem zweiten extrazellulären Loop auf dem Rezeptor entspricht (6). Die 6 ist die Struktur der mutierten Form vom humanen CC-Chemokinrezeptor 5. a. Die Aminosäure-Sequenz des nicht funktionalen Δccr5-Proteins ist dargestellt. Die transmembrane Organisation ist durch eine Analogie mit der vorhergesagten Struktur von Wildtyp CCR5 gegeben. Schwarz unterlegte Aminosäuren entsprechen nichtnatürlichen Resten, die aus der von der Deletion verursachten Leserahmenverschiebung resultieren. Dem mutierten Protein fehlen die letzten drei Transmembran-Segmente von CCR5 wie auch die Regionen, die an der G-Protein-Kopplung beteiligt sind. b, Nukleotid-Sequenz des CCR5-Gens, die die deletierte Region umgibt, und Translation in den normalen Rezeptor (oben) oder in die verkürzte Mutante (ccr5 unten). Die 10 bp direkte Wiederholungssequenz ist kursiv dargestellt. Die vollständige codierende Region des CCR5-Gens wurde mittels PCR unter Verwendung von 5'-TCGAGGATCCAAGATGGATTATCAAGT-3' und 5'-CTGATCTAGAGCCATGTGC ACAACTCT-3' als Vorwärts- beziehungsweise Rückwärtsprimer amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden auf beiden Strängen unter Verwendung der gleichen Oligonukleotide als Primer wie auch interner Primer und Fluorochrom-markierten Didesoxynukleotiden als Terminatoren sequenziert. Die Sequenzierungsprodukte liefen auf einem Applied Biosystem Sequenzierer und zweifelhafte Positionen wurden entlang der codierenden Sequenz gesucht. Wenn das Vorliegen einer Deletion aus der direkten Sequenzierung vermutet war, wurden die PCR-Produkte nach Restriktion mit BamHI und XbaI Endonukleasen in pcDNA3 kloniert. Mehrere Klone wurden sequenziert, um die Deletion zu bestätigen. Die Deletion war in drei nichtverwandten Individuen identisch, die mittels Sequenzierung untersucht wurden.
Die Klonierung des PCR-Produkts und Sequenzierung von mehreren Klonen bestätigte die Deletion. Die Deletion verursacht eine Leserahmenverschiebung, von der vermutet wird, dass sie zu einer vorzeitigen Beendigung der Translation führt. Dem von diesem mutierten Allel (Δccr5) codierten Protein fehlen deshalb die drei Transmembran-Segmente des Rezeptors. Es wird von einer die deletierte Region auf beiden Seiten flankierenden 10 bp direkten Wiederholungssequenz (6b) vermutet, dass sie das zu der Deletion führende Rekombinationsereignis fördert. Zahlreiche Mutagenese-Untersuchungen mit verschiedenen Klassen G-Protein-gekoppelter Rezeptoren, einschließlich Chemokinrezeptoren, sind durchgeführt worden und stellen klar, dass ein verkürztes Protein bezüglich der Chemokin-induzierter Signaltransduktion gewiss nicht funktionsfähig ist: es fehlen der dritte intrazelluläre Loop und C-terminale cytoplasmatische Domänen, die beiden Regionen, die primär an der G-Protein-Kopplung beteiligt sind [41]. Um zu testen, ob das verkürzte Protein in der Lage war, als ein HIV-1 Co-Rezeptor zu fungieren, haben die Erfinder dessen Fähigkeit getestet, die Membranfusion von sowohl primären M-tropen als auch dual-tropen Virus ENV Proteinen zu unterstützen. Das rekombinante Protein war in Wachtel QT6-Zellen zusammen mit dem humanen CD4 exprimiert. Die QT6-Zellen wurden dann mit HeLa-Zellen, die das angegebene virale ENV-Protein exprimieren, gemischt und das Ausmaß von Zell-Zell-Fusionen unter Verwendung eines empfindlichen und quantitativen Gen-Reporter-Assays gemessen. Im Gegensatz zu Wildtyp CCR5 erlaubte der verkürzte Rezeptor keine Fusion mit Zellen, die das ENV-Protein entweder von M-tropen oder dual-tropen Viren exprimieren (7). 7 stellt die Quantifizierung von ENV-Protein-vermittelter Fusion mit Luciferase-Assay dar. Um die Zell-Zell-Fusionsereignisse zu quantifizieren, wurden QT6-Fibrosarkomzellen von japanischen Wachteln, wie angegeben, mit dem pcDNA3 Vektor (Invitrogen), der die codierende Sequenz für Wildtyp CCR5, die verkürzte ccr5 Mutante, die CCR2b oder die Duffy Chemokinrezeptoren enthielt, oder nur mit dem pcDNA3-Vektor transfiziert oder cotransfiziert. Die Zielzellen waren ebenfalls mit humanem CD4 transfiziert, das von dem CMV-Promotor und dem Luciferase-Gen unter der Kontrolle des T7 Promotors exprimiert wurde. HeLa-Effektorzellen waren mit Vaccinia-Vektoren infiziert (MOI = 10), die T7-Polymerase (vTF.1.1) und entweder die JR-FL (vCB28) oder 89.6 (vBD3) Hüllproteine exprimieren. Die aus der Zellfusion resultierende Luciferase-Aktivität ist als Prozentsatz der für Wildtyp CCR5 erhaltene Aktivität (in relativen Lichteinheiten) ausgedrückt. Alle Transfektionen waren mit identischen Mengen an Plasmid-DNA unter Verwendung von pcDNA3 als Träger, wenn erforderlich, durchgeführt. Um die Fusion zu starten, wurden die Ziel- und Effektorzellen in Platten mit 24 Vertiefungen bei 37°C in Gegenwart von ara-C und Rifampin gemischt und durften 8 Stunden fusionieren. Zellen wurden in 150 μl Reporter-Lyse-Puffer lysiert (Promega) und auf Luciferase-Aktivität gemäß Herstelleranleitung getestet (Promega).
Co-Expression von Δccr5 mit Wildtyp CCR5 verminderte übereinstimmend die Effizienz der Fusion für sowohl JR-FL als auch 89.9 Hüllen im Vergleich zu nur CCR5. Ob dieser in vitro Hemmeffekt (nicht von Chemokinrezeptor Duffy, der als Kontrolle eingesetzt war) ebenfalls in vivo erfolgt, ist gegenwärtig nicht bekannt. Co-Expression mit dem CCR2b-Rezeptor [31], der von den CC-Chemokinrezeptoren am engsten mit CCR5 verwandt ist, aber die Fusion von M-tropen HIV-1 Stämmen nicht fördert [48], rettete nicht die Mutation durch Bildung eines Hybridmoleküls (7).
Die 8 stellt eine Genotypisierung von Individuen mittels PCR und Segregation der CCR5-Allele in CEPH-Familien dar. a, Autoradiographie, die das Muster zeigt, das aus PCR-Amplifizierung und EcoRI Schneiden für Individuen, die für Wildtyp CCR5-Allel homozygot (CCR5/CCR5), das Null Δccr5-Allel (Δccr5/Δccr5) homozygot und (CCR5/Δccr5) heterozygot sind. Ein 735 pb PCR-Produkt wird zu einer normalen Bande von 332 bp für beide Allele und zu 403 und 371 bp Banden für die Wildtyp beziehungsweise mutierten Allele geschnitten. b, Segregation der CCR5-Allele in zwei informative Familien von CEPH. Halbschwarze und weiße Symbole stellen Heterozygote beziehungsweise Wildtyp Homozygote dar. Für einige wenige Individuen im Stammbaum war keine DNA verfügbar (ND: nicht bestimmt). PCRs wurden an genomischen DNA-Proben mit Hilfe von 5'-CCTGGCTGTCGTCCATGCTG-3' und 5'-CTGATCTAGAGCCATGTGCACAACCTC-3' als Vorwärts- beziehungsweise Rückwärtsprimer durchgeführt. Reaktionsmischungen bestanden aus 30 μl 10 mM Tris-HCl-Puffer pH 8, der 50 mM KCl, 0,75 mM MgCl₂, 0,2 mM dCTP, dGTP und dTTP, 0,1 mM dATP, 0,5 μi [α-³²P]-dATP, 0,01% Gelatine, 5% DMSO, 200 ng Ziel-DNA, jeweils 60 ng Primer und 1,5 U Taq-Polymerase enthielt. PCR-Bedingungen waren: 93°C 2 min 30; 93°C 1 min, 60°C 1 min, 72°C 1 min, 30 Zyklen; 72°C 6 min. Nach der PCR-Reaktion wurden die Proben für 60 min bei 37°C mit 10 U EcoRI inkubiert und 2 μl der denaturierten Reaktionsmischung wurden auf ein denaturierendes 5% Polyacrylamidgel, das 35% Formamid und 5,6 M Harnstoff enthielt, aufgetragen. Banden wurden mittels Autoradiographie detektiert.
Basierend auf den in dem ersten Experiment getesteten 14 Chromosomen schien das deletierte Δccr5-Allel in der kaukasischen Population eher häufig. Die genaue Häufigkeit wurde weiter abgeschätzt durch Testen einer großen Kohorte kaukasischer Individuen, einschließlich nichtverwandter Mitglieder der CEPH (Centre d'Etude des Polymorphismes Humains) Familien, Teil des IRIBHN-Personals und einer Bank anonymer DNA-Proben von gesunden Individuen, die vom Genetics Department of the Erasme Hospital in Brüssel gesammelt wurden. Von insgesamt mehr als 700 gesunden Individuen wurde herausgefunden, dass die Allel-Häufigkeiten 0,908 für das Wildtyp-Allel und 0,092 für das mutierte Allel betrug (Tabelle 1). Die beobachteten Genotyp-Häufigkeiten in der Population waren nicht signifikant verschieden von der erwarteten Hardy-Weinberg-Verteilung (CCR5/CCR5: 0,827 zu 0,824; CCR5/Δccr5: 0,162 zu 0,167; Δccr5/Δccr5: 0,011 zu 0,008, p > 0,999), was vermuten lässt, dass das Null-Allel keine drastische Wirkung auf die Gesundheit besitzt. Unter Verwendung zweier informativer CEPH-Familien wurde bestätigt, dass das Wildtyp CCR5-Gen und seine Δccr5-Variante Allele waren und auf normale Mendelsche Weise segregieren (8b). Interessanterweise zeigte eine Kohorte von 124 DNA-Proben, die aus Zentralafrika (in Zaire, Burkina Faso. Kamerun, Senegal und Benin gesammelt) und Japan stammten, nicht ein einziges Δccr5 mutiertes Allel, was vermuten lässt, dass dieses Allel in asiatischen und schwarzafrikanischen Populationen entweder fehlt oder sehr selten ist.
Die Konsequenzen aus der Existenz eines Null-Allels von CCR5 in der normalen kaukasischen Population wurden dann bezüglich einer Anfälligkeit für eine Infektion mit HIV-1 betrachtet. Wenn, wie vorausgesagt, CCR5 eine Hauptrolle (aber nicht übermäßig) beim Eindringen der meisten primären Virusstämme in die Zellen spielt, dann sollten Δccr5/Δccr5 Individuen besonders resistent sowohl in vitro als auch in vivo für eine HIV-1 Challenge sein. Die Häufigkeit des Δccr5/Δccr5-Genotyps sollte deshalb in HIV-infizierten Patienten signifikant geringer und erhöht in exponierten nichtinfizierten Individuen sein.
Ebenfalls, falls Heterozygote einen statistischen Vorteil aufgrund ihrer geringeren Anzahl an funktionellen Rezeptoren auf ihren weißen Blutzellen oder aufgrund der dominant negativen Eigenschaften des mutierten Allels besitzen, sollte die Häufigkeit an Heterozygoten (und mutierten Allelen) in HIV-infizierten Populationen abnehmen. Diese Hypothesen wurden mittels Genotypisierung einer großen Anzahl sereopositiver kaukasischer Individuen (n = 645) getestet, die zu den Kohorten gehörten, die von verschiedenen Hospitälern in Brüssel, Lüttich und Paris (Tabelle 1) stammten. Tatsächlich wurde gefunden, dass innerhalb dieser großen Reihen die Häufigkeit des Null Δccr5-Allels von 0,092 auf 0,053 (p < 10^–5) signifikant vermindert war. Die Häufigkeit von Heterozygoten war ebenfalls von 0,162 auf 0,106 (p < 0,001) vermindert war und nicht ein einziges Δccr5/Δccr5 Individuum konnte gefunden werden (p < 0,01).
Insgesamt lassen funktionelle und statistische Daten vermuten, dass CCR5 tatsächlich der wichtige Co-Rezeptor ist, der für die natürliche Infektion mit M-tropen HIV-Stämmen verantwortlich ist. Für das Null Δccr5/Δccr5 Allell homozygote Individuen (etwa 1% der kaukasischen Population) besitzen offensichtlich eine starke Resistenz gegen eine Infektion. Es ist zum jetzigen Zeitpunkt unklar, ob die Resistenz gegen HIV-1 absolut oder relativ ist und ob die Resistenz in Abhängigkeit der Art der viralen Kontamination variiert. Größere Kohorten seropositiver Individuen müssen getestet werden, um diesen Punkt zu klären. Heterozygote besitzen einen geringeren gleichwohl signifikanten Vorteil: Unter Annahme der gleichen Wahrscheinlichkeit eines Kontaktes mit HIV kann aus Tabelle 1 geschlossen werden, dass Heterozygote um 39% weniger wahrscheinlich seropositiv werden, im Vergleich zu Individuen, die homozygot für das Wildtyp CCR5-Allel sind. Sowohl eine Abnahme der funktionalen CCR5-Rezeptoranzahl als auch ein dominant-negativer Effekt von Δccr5 in vivo, vergleichbar mit dem, was in den in vitro Experimenten (7) beobachtet worden ist, sind mögliche Erklärungen für diesen relativen Schutz. Das mutierte Allel, das als ein natürlicher Knock out im Menschen betrachtet werden kann, ist nicht von einem offensichtlichen Phänotyp in homozygoten Individuen begleitet. Nichtsdestotrotz lässt das Fehlen eines offenkundigen Phänotyps, zusammen mit dem relativen Schutz, der heterozygote Personen kennzeichnet, vermuten, dass pharmakologische Mittel, die selektiv die Fähigkeit von HIV-1 blockieren, CCR5 als ein Co-Faktor zu nutzen, für eine Vermeidung einer HIV-1 Infektion wirksam sein könnten, und es könnte vorhergesagt werden, dass sie nicht mit wesentlichen Nebenwirkungen verbunden sind, die aus einer CCR5-Inaktivierung resultieren. Diese pharmazeutischen Mittel könnten mit anderen Verbindungen verwendet sein, die in der Lage sind, weitere Chemokinrezeptoren zu blockieren, die als Co-Rezeptoren von einigen HIV-Primärisolaten genutzt werden, um andere Zellen zu infizieren [47]. Das Überwiegen des Null-Allels in der kaukasischen Population lässt die Frage aufkommen, ob eine HIV-Pandemie (oder von verwandten Viren, die den gleichen Co-Rezeptor nutzen) während der Evolution des Menschen beigetragen haben, das mutierte ccr5-Allel mittels Selektion in einer derartig hohen Häufigkeit zu stabilisieren.
Produktion anti-CCR5-Antikörpern
Antikörper waren mit Hilfe genetischer Immunisierung produziert. Sechs Wochen alte halb/c Mäuse wurden verwendet. Für den humanen Rezeptor CCR5 codierende DNA wurde in den Expressionsvektor pcDNA3 unter der Kontrolle des CMV-Promotors inseriert und 100 μg DNA wurde in den Musculus tibialis anterior injiziert, fünf Tage nach Vorbehandlung dieses Muskels mit Cardiotoxin (aus Gift von Naja Nigricolis). Injektionen wurden in drei Wochenintervallen zweimal wiederholt. Fünfzehn Tage nach der letzten Injektion wurde Blut von jedem Tier entnommen und die Sera wurden auf das Vorhandensein von CCR5-Antikörpern getestet.
Serumtest unter Verwendung von Fluoreszenz-aktiviertem Zellsortierer (FACS)
Sera wurden mit Hilfe Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung unter Verwendung rekombinanter CHO-Zellen, die den CCR5-Rezeptor exprimieren, getestet. Kurz: Zellen wurden unter Zuhilfenahme einer PBS-EDTA-EGTA Lösung abgelöst und in PBS-BSA-Medium 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 5 μl Serum auf Basis von 100.000 Zellen pro Röhrchen inkubiert. Zellen wurden dann gewaschen und 30 Minuten auf Eis zusammen mit einem Fluoreszin-markierten anti-Maus Antikörper inkubiert. Zellen wurden gewaschen, in 200 μl PBS-BSA-Lösung aufgenommen und Fluoreszenz mit FACS (FACSCAN, Becton-Dickson) analysiert. 10.000 Zellen wurden gezählt. Wildtyp-CHO oder rekombinante CHO-Zellen, die den humanen CCR2b exprimieren, wurden als Kontrollen verwendet.
Wenn die Seren mit FACS-Analyse 2 Wochen nach der letzten Injektion getestet wurden (9), erkannten sämtliche Sera von Mäusen, die mit CCR5 cDNA immunisiert waren, eindeutig den auf CHO-Zellen exprimierten nativen Rezeptor (mittlere Fluoreszenz = 200), ohne signifikante Kreuzreaktion mit CCR2b exprimierenden Kontrollzellen (mittlere Fluoreszenz = 20).
Sera wurden entweder auf einer CHO-Zelllinie, die hohe Levels an CCR5-Rezeptor exprimierte (schwarzes Histogramm) oder als negative Kontrolle auf einer Zelllinie, die den CCR2b-Rezeptor exprimierte (weißes Histogramm), getestet. Jedes Serum wurde einzeln getestet.
Anti-CCR5 Antikörper und HIV-Infektiosität
Mononukleäre Zellen des peripheren Bluts (PBMC) von einem homozygoten Spender von Wildtyp CCR5-Gen wurden isoliert und drei Tage in Gegenwart von PHA kultiviert.
An Tag 4 wurden 800 μl Zellen (10⁵ Zellen/ml) mit 8 μl Seren von mit CCR5 cDNA immunisierten Mäusen 30 Minuten bei 37°C inkubiert. 1 ml Viruslösung (JRCSF HIV-Stamm) wird dann zugegeben und 2 Stunden inkubiert. Zellen wurden dann zweimal gewaschen und 15 Tage kultiviert.
Aliquote von Medium werden an Tag 0, 4, 7, 10 und 14 genommen und die Dosierung des Antigens p24 wird durchgeführt.
14 Tage nach Versuchsbeginn blockiert ein Serum (Serum B0) vollständig die Produktion von p24, was seine Fähigkeit zeigt, die Infektion von Lymphocyten mit diesem HIV-Stamm zu blockieren (10). Andere Seren zeigten ebenfalls eine partielle oder vollständige Wirkung auf diese Infektion (Serum A2 und B1). Alle anderen Seren zeigten keine Wirkung auf diese Infektion.
Produktion monoklonaler Antikörper
Mäuse mit dem höchsten CCR5-Antikörpertiter wurden für die Produktion monoklonaler Antikörper ausgewählt und erhielten eine intravenöse Injektion von 10⁷ rekombinanten CHO-K1-Zellen, die humane CCR5-Rezeptoren exprimieren. Drei Tage später wurden die Tiere getötet und es wurde Fusion von Milzzellen oder von Lymphknotenzellen aus der Nähe der Injektionsstelle mit SP2/0-Myelomzellen durchgeführt. Angewandtes Fusionsprotokoll war von Galfre et al. (Nature 266, 550 (1977)). Ein selektives HAT (Hypoxanthin/Aminopterin/Thymidin) Medium wurde für die Selektion der Hybridome eingesetzt und ihre Überstände sind mittels FACS unter Verwendung den humanen CCR5-Rezeptor exprimierender rekombinanter CHO-K1-Zellen getestet, wie es auch bei den Seren geschah. Positive Hybridome werden dann mittels begrenzter Verdünnung kloniert. Klone die mit FACS-Analyse als positiv bewertet werden, werden dann vermehrt und in Aszites in balb/c Mäusen produziert.
REFERENZEN

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Claims

Verfahren zur Bestimmung, ob ein Anti-Ligand in der Lage ist, die Bindung eines Liganden an ein Peptid mit einer Aminosäure-Sequenz, die mehr als 80% Homologie mit der Sequenz SEQ ID NO: 2, wie in 1 dargestellt, aufweist, zu inhibieren, wobei der Ligand ein HIV-Virus oder ein Teil dessen ist, und wobei das Verfahren die Schritte umfasst, eine Zelle, die mit einem Vektor transfiziert ist, der das Nukleinsäure-Molekül, das für das Peptid kodiert, exprimiert, mit dem Anti-Liganden unter Bedingungen in Kontakt zu bringen, die die Bindung des Anti-Liganden an das Peptid erlauben, und zu bestimmen, ob der Anti-Ligand die Bindung des Liganden an das Peptid inhibiert.
Verfahren zur Bestimmung, ob ein Anti-Ligand in der Lage ist, die Bindung eines Liganden an ein Peptid mit einer Aminosäure-Sequenz, die mehr als 80% Homologie mit der Sequenz SEQ ID NO: 2, wie in 1 dargestellt, aufweist, zu inhibieren, wobei der Ligand ein HIV-Virus oder ein Teil dessen ist, und wobei das Verfahren die Schritte umfasst, – einen Zellextrakt von Zellen zuzubereiten, die mit einem Vektor transfiziert worden sind, der das Nukleinsäure-Molekül, das für das Peptid kodiert, exprimiert, – aus diesem Zellextrakt eine Membran-Fraktion zu isolieren, – den Anti-Liganden mit der Membran-Fraktion unter Bedingungen in Kontakt zu bringen, die die Bindung des Anti-Liganden an das Peptid erlauben, und – zu bestimmen, ob der Anti-Ligand die Bindung des Liganden an das Peptid inhibiert.
Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: – eine Zelle oder einen Zellextrakt zuzubereiten, wobei die Zelle mit dem Nukleinsäure-Molekül transfiziert worden ist, das für ein Peptid kodiert, das eine Aminosäure-Sequenz aufweist, die mehr als 80% Homologie mit der Sequenz SEQ ID NO: 2, wie in 1 dargestellt, aufweist, – gegebenenfalls eine Membran-Fraktion aus dem Zellextrakt zu isolieren, – die Zelle oder Membran-Fraktion in Gegenwart des Liganden des besagten Peptids mit dem Anti-Liganden unter Bedingungen in Kontakt zu bringen, die die Aktivierung einer funktionellen Peptid-Antwort erlauben, und – mittels eines Bioassays eine Modifikation in der Aktivität des Peptids nachzuweisen und dadurch zu ermitteln, ob der Anti-Ligand die Bindung des Liganden an das Peptid inhibiert.
Verfahren zum Durchmustern von Wirkstoffen zur Identifizierung von Wirkstoffen, die spezifisch an das Peptid binden, das eine Aminosäure-Sequenz aufweist, die mehr als 80% Homologie aufweist mit der Sequenz SEQ ID NO: 2, wie in 1 dargestellt, oder einen Teil von dieser aufweist, und für die Behandlung und/oder Vermeidung von HIV-Virus-Infektionen verwendet werden können, wobei das Verfahren die Schritte umfasst, eine Zelle, die mit einem Vektor transfiziert worden ist, der das Nukleinsäure-Molekül exprimiert, das für das Peptid kodiert, mit einem Wirkstoff unter Bedingungen in Kontakt zu bringen, die die Bindung des Wirkstoffs an das Peptid erlauben, und zu bestimmen, ob der Wirkstoff die transfizierte Zelle spezifisch bindet, um dadurch einen Wirkstoff zu identifizieren, der das Peptid spezifisch bindet und der für , die Behandlung und/oder Vermeidung von HIV-Virus-Infektionen verwendet werden kann.
Verfahren zum Durchmustern von Wirkstoffen zur Identifizierung von Wirkstoffen, die spezifisch an das Peptid binden, das eine Aminosäure-Sequenz aufweist, die mehr als 80% Homologie aufweist mit der Sequenz SEQ ID NO: 2, wie in 1 dargestellt, oder einen Teil von dieser aufweist, und für die Behandlung und/oder Vermeidung von HIV-Virus-Infektionen verwendet werden können, wobei das Verfahren die Schritte umfasst, einen Zellextrakt aus Zellen zuzubereiten, die mit einem Vektor transfiziert worden sind, der das Nukleinsäure-Molekül exprimiert, das für das Peptid kodiert, aus dem Zellextrakt eine Membran-Fraktion zu isolieren, die Membran-Fraktion mit einem Wirkstoff unter Bedingungen in Kontakt zu bringen, die die Bindung des Wirkstoffs an das Peptid erlauben, und zu bestimmen, ob der Wirkstoff die transfizierte Zelle spezifisch bindet, um dadurch einen Wirkstoff zu identifizieren, der das Peptid spezifisch bindet und für die Behandlung und/oder Vermeidung von HIV-Virus-Infektionen verwendet werden kann.
Verfahren zur Bestimmung, ob ein Agonist oder Antagonist, der ein Peptid bindet, das eine Aminosäure-Sequenz umfasst, die mehr als 80% Homologie aufweist mit der Sequenz SEQ ID NO: 2, wie in 1 dargestellt, oder einen Teil von dieser aufweist, für die Behandlung und/oder Vermeidung einer HIV-Virus-Infektion verwendet werden kann, wobei das Verfahren die Schritte umfasst, eine Zelle, die mit einem Vektor transfiziert worden ist, der das Nukleinsäure-Molekül exprimiert, das für das Peptid kodiert, mit dem Agonisten oder Antagonisten unter Bedingungen in Kontakt zu bringen, die die Bindung des Agonisten oder Antagonisten an das Peptid erlauben, und zu bestimmen, ob der Agonist oder Antagonist die Bindung von HIV-Virus an das Peptid inhibiert.
Verfahren zur Bestimmung, ob ein Agonist oder Antagonist, der ein Peptid bindet, das eine Aminosäure-Sequenz umfasst, die mehr als 80% Homologie aufweist mit der Sequenz SEQ ID NO: 2, wie in 1 dargestellt, oder einen Teil von dieser aufweist, für die Behandlung und/oder Vermeidung einer HIV-Virus-Infektion verwendet werden kann, wobei das Verfahren die Schritte umfasst, einen Zellextrakt aus Zellen zuzubereiten, die mit einem Vektor transfiziert worden sind, der das Nukleinsäure-Molekül exprimiert, das für das Peptid kodiert, aus dem Zellextrakt eine Membran-Fraktion zu isolieren, die Membran-Fraktion mit dem Agonisten oder Antagonisten unter Bedingungen in Kontakt zu bringen, die die Bindung des Agonisten oder Antagonisten an das Peptid erlauben, und zu bestimmen, ob der Agonist oder Antagonist die Bindung von HIV-Virus an das Peptid inhibiert.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der HIV-Virus ausgewählt ist aus HIV-1, HIV-2 oder Teilen dieser HIV-Viren.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Teil des HIV-Virus das Glykoprotein gp120/gp160, oder ein Teil von diesen, ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Verfahren weiterhin den Schritt umfasst, den Grad der Infektion der Zelle durch einen HIV-Stamm zu bestimmen, wobei der Anti-Ligand, der Wirkstoff, der Agonist oder Antagonist die Infektion durch den HIV-Stamm abschwächt.
Das Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Zelle ein Lymphozyt ist.
Das Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei der HIV-Stamm das HIV-1 ist.
Das Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei der HIV-Stamm HIV-2 ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei die Abschwächung der HIV-Infektion gemessen wird über die Konzentration eines HIV-Proteins.
Das Verfahren nach Anspruch 14, wobei das HIV-Protein das HIV-Antigen p24 ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Aminosäure-Sequenz des Peptids mehr als 90% Homologie mit der Sequenz SEQ ID NO: 2, wie in 1 dargestellt, aufweist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Aminosäure-Sequenz des Peptids mehr als 95% Homologie mit der Sequenz SEQ ID NO: 2, wie in 1 dargestellt, aufweist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Aminosäure-Sequenz des Peptids die Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 2, wie in 1 dargestellt, oder einen Teil von dieser, der wenigstens das N-terminale Segment und den ersten extrazellulären Loop der Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 2, dargestellt in 1, umfasst, ist.
Das Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Modifikation der Peptid-Aktivität mittels eines Bioassays auf Basis der Modifikation in der Produktion eines sekundären Botenstoffs nachgewiesen wird.
Das Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Bioassay auf einer Messung der Konzentration der Calcium-Ionen oder von Inositol-Phosphaten (wie IP₃) beruht.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei die Zelle eine Säugetier-Zelle nicht-neuronalen Ursprungs ist, vorzugsweise ausgewählt aus CHO-K1-, HEK293-, BHK21- und COS-7-Zellen.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei der Anti-Ligand, der Wirkstoff, der Agonist oder der Antagonist ein Antikörper ist.
Das Verfahren nach Anspruch 22, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Das Verfahren nach Anspruch 23, wobei der monoklonale Antikörper auf ein Epitop des Peptids gerichtet ist, das auf der Oberfläche einer Zelle vorliegt.
Antikörper, der die Bindung von HIV-1 oder von HIV-2 an ein Peptid mit einer Aminosäure-Sequenz, die mehr als 80% Homologie mit der Sequenz SEQ ID NO: 2, wie in 1 dargestellt, aufweist, inhibiert oder reduziert, und der identifiziert wurde nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24.
Der Antikörper nach Anspruch 25, wobei die Aminosäure-Sequenz des Peptids mehr als 90% Homologie mit der Sequenz SEQ ID NO: 2, wie in 1 dargestellt, aufweist.
Der Antikörper nach Anspruch 25, wobei die Aminosäure-Sequenz des Peptids mehr als 95% Homologie mit der Sequenz SEQ ID NO: 2, wie in 1 dargestellt, aufweist.
Der Antikörper nach Anspruch 25, wobei die Aminosäure-Sequenz des Peptids die Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 2, wie in 1 dargestellt, ist.
Der Antikörper nach einem der Ansprüche 25 bis 28, der ein monoklonaler Antikörper ist.
Der Antikörper nach Anspruch 29, der ein monoklonaler Antikörper ist, der auf ein Epitop des Peptids gerichtet ist, das auf der Oberfläche einer dieses Peptid exprimierenden Zelle sitzt.
Der Antikörper nach einem der Ansprüche 25 bis 30, wobei der Antikörper den Grad der Infektion einer Zelle durch einen HIV-Stamm vermindert.
Der Antikörper nach Anspruch 31, wobei die Zelle ein Lymphozyt ist.
Der Antikörper nach Anspruch 31 oder 32, wobei der HIV-Stamm ein HIV-1-Stamm ist.
Der Antikörper nach Anspruch 31 oder 32, wobei der HIV-Stamm ein HIV-2-Stamm ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend einen geeigneten pharmazeutischen Träger und eine ausreichende Menge des Antikörpers nach einem der Ansprüche 25 bis 34.
Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 35 für die Herstellung eines Medikaments für die Prophylaxe und/oder Behandlung einer Infektion durch HIV-1 und/oder HIV-2 (AIDS).
Verwendung eines Antisense-Oligonukleotids umfassend eine Sequenz, die spezifisch mit einem Nukleinsäure-Molekül hybridisiert, das mehr als 80% Homologie mit der Nukleinsäure-Sequenz SEQ ID NO: 2, wie in 1 dargestellt, aufweist, für die Herstellung eines Medikaments für die Prophylaxe und/oder die Behandlung einer Infektion durch HIV-1 und/oder HIV-2 (AIDS).
Verwendung eines Antisense-Oligonukleotids umfassend eine Sequenz, die spezifisch mit einem Nukleinsäure-Molekül hybridisiert, das zumindest die Nukleinsäure-Sequenz SEQ ID NO: 2, wie in 1 dargestellt, oder einen Teil von dieser Sequenz aufweist, für die Herstellung eines Medikaments für die Prophylaxe und/oder Behandlung einer Infektion durch HIV-1 und/oder HIV-2 (AIDS).
Verwendung nach Anspruch 37 oder 38, wobei das Nukleinsäure-Molekül für ein Peptid kodiert, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 7 und 16 bis 18 definiert ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 37 bis 39, wobei das Nukleinsäure-Molekül eine cDNA oder eine genomische DNA ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 37 bis 40, wobei das Antisense-Oligonukleotid chemische Analoga von Nukleotiden aufweist.