DE60036676T2

DE60036676T2 - G-protein-gekoppelte rezeptor-ähnliche proteine

Info

Publication number: DE60036676T2
Application number: DE60036676T
Authority: DE
Inventors: Beate Sandwich Peter; Mark Anthony Sandwich O'Reilly
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1999-10-29
Filing date: 2000-10-24
Publication date: 2008-02-07
Anticipated expiration: 2020-10-25
Also published as: GB0026251D0; GB2356864A; DE60036676D1; EP1096009A1; GB2356864A8; ES2291177T3; ATE375390T1; EP1096009B1; US20030149242A1; JP2001211889A; GB2356864B

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung beschreibt eine Polynucleotidsequenz, welche ein Polypeptid codiert, das zu der Klasse von Proteinen gehört, die als G-Protein-gekoppelte Rezeptoren ("G-Protein coupled receptors") (GPCRs) bekannt sind. Die vorliegende Erfindung beschreibt inter alia auch Verfahren zum Herstellen der Polypeptide und ihre Verwendungen.
Hintergrund der Erfindung
Zellen und Gewebe reagieren auf eine breite Vielfalt extrazellulärer Signalmoleküle durch die Wechselwirkung dieser Moleküle mit spezifischen Zelloberflächenrezeptoren. Eine derartige Klasse von Rezeptoren ist bekannt als G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), und diese sind dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Reihe von 7 hydrophoben Transmembransegmenten enthalten. Beim Binden eines extrazellulären Liganden an seinen Rezeptor werden intrazelluläre Signale über Wechselwirkungen mit heterotrimeren G-Proteinen initiiert, die wiederum zu einer Anzahl von verschiedenen intrazellulären Ereignissen in Abhängigkeit davon, welcher Rezeptor aktiviert wurde, führen können. Zum Beispiel beeinflussen einige GPCRs die Adenylcyclaseaktivität, wohingegen andere über Phospholipase C wirken.
Mitglieder der GPCR-Superfamilie reagieren auf eine breite Vielfalt von Liganden, die Amine mit kleiner Molekülgröße (wie Serotonin, Dopamin, Acetylcholin), von Lipiden abgeleitete Mediatoren (wie LpA), Aminosäurederivate (wie Glutamat) und Neurotransmitterpeptide und Hormone (wie Neurokinin, Galanin, Glucagon, Gastrin) einschließen. Obwohl GPCRs durch eine lange Reihe von Liganden aktiviert werden, sollte angemerkt werden, dass einzelne GPCRs ein kleines und sehr spezifisches Ligandenrepertoire aufweisen. Basierend auf einer Analyse der Primarstruktur eines neuen GPCR ist es jetzt möglich, sie in spezifische Subfamilien zu klassifizieren, wodurch der Bereich potentieller Liganden eingeengt wird.
In vielen Fällen sind die endogenen Liganden von GPCRs relativ klein, was es ermöglicht, sie durch synthetische Analoga zu imitieren oder zu blockieren. Zum Beispiel sind Wirkstoffe, wie Prazosin, Doxazosin, Cimetidin, Ranitidin, alle wirksame Antagonisten ihrer entsprechenden Ziel-GPCRs.
Da die Modulation von GPCRs therapeutische Konsequenzen haben kann, besteht somit ein fortgesetzter Bedarf, neue GPCRs und deren damit assoziierte Agonisten und Antagonisten bereitzustellen.
Zusammenfassende Aspekte der Erfindung
In einem breiten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, welche die Eosinophilen-Chemotaxis moduliert, umfassend das Inkontaktbringen eines Polypeptids, umfassend:

(i) ein Polypeptid, translatiert aus der Polynucleotidsequenz in SEQ ID NO: 1;
(ii) ein Polypeptid von SEQ ID NO: 2;
(iii) ein Polypeptid, codiert durch die cDNA von NCIMB 41073; mit einer Kandidatenverbindung und Bestimmen, ob die Modulation des Polypeptids auftritt.

Zur Erleichterung der Bezugnahme werden die Aspekte der vorliegenden Erfindung nun unter geeigneten Abschnittsüberschriften diskutiert. Jedoch sind die Lehren unter jedem Abschnitt nicht notwendigerweise auf jeden speziellen Abschnitt beschränkt.
Im Folgenden beziehen sich erläuternde Bezugnahmen auf "Nucleotidsequenz" und "Aminosäuresequenz" entsprechend auf eine oder mehrere beliebige der Nucleotidsequenzen, die hierin präsentiert oder diskutiert werden, und auf eine oder mehrere beliebige der Aminosäuresequenzen, die hierin präsentiert oder diskutiert werden. Ebenso, und wie hierin verwendet, bezieht sich "Aminosäuresequenz" auf Peptid- oder Proteinsequenzen und kann sich auf Teile davon beziehen. Zusätzlich ist der Begriff "Aminosäuresequenz" synonym mit der Phrase "Polypeptidsequenz": Auch ist der Begriff "Nucleotidsequenz" synonym mit der Phrase "Polynucleotidsequenz".
Detaillierte Aspekte der Erfindung
Hierin beschrieben wird ein isoliertes und/oder gereinigtes Polynucleotid, umfassend eines oder mehrere von:

(a) einem Polynucleotid, das das Polypeptid, wie in SEQ ID NO: 2 dargelegt, codiert;
(b) einem Polynucleotid, umfassend eine Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1;
(c) einem Polynucleotid, das das Polypeptid, exprimiert durch die in NCIMB 41073 enthaltene DNA, codiert;
(d) einem Polynucleotid, umfassend eine Nucleotidsequenz, die mindestens 70% Identität mit dem Polynucleotid nach einem beliebigen der Punkte von (a) bis (c) aufweist;
(e) einem Polynucleotid, umfassend eine Nucleotidsequenz, die zum Hybridisieren an das Polynucleotid nach einem beliebigen der Punkte (a) bis (d) befähigt ist;
(f) einem Komplement zu dem Polynucleotid nach einem beliebigen der Punkte (a) bis (e); oder
(g) einem Polynucleotidfragment des Polynucleotids nach einem beliebigen der Punkte (a) bis (f).

Vorzugsweise umfasst das Polynucleotid eine Nucleotidsequenz, die mindestens 75% Identität mit dem Polynucleotid nach einem beliebigen der Punkte (a) bis (c) aufweist. Stärker bevorzugt umfasst das Polynucleotid eine Nucleotidsequenz, die mindestens 80% Identität mit dem Polynucleotid nach einem beliebigen der Punkte (a) bis (c) aufweist. Noch stärker bevorzugt umfasst das Polynucleotid eine Nucleotidsequenz, die mindestens 85% Identität mit dem Polynucleotid nach einem beliebigen der Punkte (a) bis (c) aufweist. Noch stärker bevorzugt umfasst das Polynucleotid eine Nucleotidsequenz, die mindestens 90% Identität mit dem Polynucleotid nach einem beliebigen der Punkte (a) bis (c) aufweist. Stärker bevorzugt umfasst das Polynucleotid eine Nucleotidsequenz, die mindestens 95% Identität mit dem Polynucleotid nach einem beliebigen der Punkte (a) bis (c) aufweist. Am stärksten bevorzugt umfasst das Polynucleotid eine Nucleotidsequenz, die mindestens 98% Identität mit dem Polynucleotid nach einem beliebigen der Punkte (a) bis (c) aufweist.
Das oben beschriebene Polynucleotid codiert einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR).
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch eine Polynucleotidsonde oder einen Primer, umfassend mindestens 15 zusammenhängende Nucleotide des oben beschriebenen Polynucleotids.
Die vorliegende Erfindung beschreibt weiterhin noch einen Vektor, umfassend das oben beschriebene Polynucleotid.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch eine Wirtszelle, die mit dem oben beschriebenen Vektor transformiert oder transfiziert ist. Vorzugsweise ist die Wirtszelle eine Säuger-, Insekten-, Pilz-, Bakterien- oder Hefezelle.
Ebenfalls bereitgestellt wird das transkribierte RNA-Produkt des oben beschriebenen Polynucleotids und ein RNA-Molekül oder ein Fragment davon, welches Antisense in Relation zu dem RNA-Produkt ist und das befähigt ist, daran zu hybridisieren.
Es wird weiterhin ein Ribozym- oder Zinkfinger-Protein beschrieben, das zur Bindung des oben beschriebenen Polynucleotids befähigt ist.
Ein Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids oder Fragmentes davon, umfassend das Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, die für die Expression des Polypeptids oder des Fragments ausreichend sind, wird beschrieben. Vorzugsweise wird das Polypeptid oder Fragment an der Oberfläche der Zelle exprimiert. Das Verfahren schließt weiterhin das Gewinnen des Polypeptids oder Fragments aus der Kultur ein.
Durch die vorliegende Erfindung wird auch ein Verfahren zum Produzieren von Zellen beschrieben, die zum Exprimieren eines Polypeptids oder Fragments davon befähigt sind, umfassend das Transformieren oder Transfizieren von Zellen mit dem oben beschriebenen Vektor.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch Zellen, die durch das oben beschriebene Verfahren hergestellt werden. Ebenfalls beschrieben wird eine Membranpräparation der Zellen.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Polypeptid, umfassend:

(a) ein Polypeptid mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz, translatiert aus der Polynucleotidsequenz in SEQ ID NO: 1, und Varianten, Fragmente, Homologe, Analoga und Derivate davon;
(b) ein Polypeptid von SEQ ID NO: 2 und Varianten, Fragmente, Homologe, Analoga und Derivate davon; oder
(c) ein Polypeptid, codiert durch die cDNA von NCIMB 41073, und Varianten, Fragmente, Homologe, Analoga und Derivate davon.

Durch die vorliegende Erfindung wird auch ein Antikörper gegen das oben beschriebene Polypeptid beschrieben.
Die vorliegende Erfindung beschreibt weiterhin noch eine Verbindung, welche das oben beschriebene Polypeptid moduliert. Vorzugsweise antagonisiert die Verbindung das Polypeptid oder sie antagonisiert es selektiv. Alternativ agonisiert die Verbindung das Polypeptid.
Durch die vorliegende Erfindung wird auch eine pharmazeutische Zusammensetzung beschrieben, umfassend den oben beschriebenen Antikörper oder die oben beschriebene Verbindung und einen oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Träger, Verdünnungsmittel, Adjuvanzien oder Exzipienzien.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung bereit, welche an das oben beschriebene Polypeptid bindet und es moduliert, umfassend das Inkontaktbringen des Polypeptids mit einer Kandidatenverbindung und Bestimmen, ob eine Modulation auftritt.
Vorzugsweise umfasst das Verfahren:

(a) Inkontaktbringen einer Verbindung mit Zellen, die das oben beschriebene Polypeptid auf ihrer Zelloberfläche exprimieren, wobei das Polypeptid mit einer zweiten Komponente assoziiert ist, die befähigt ist, ein detektierbares Signal als Reaktion auf die Bindung einer Verbindung an das Polypeptid bereitzustellen, wobei das Inkontaktbringen unter Bedingungen erfolgt, die ausreichend sind, um das Binden von Verbindungen an das Polypeptid zu ermöglichen; und
(b) Identifizieren einer Verbindung, die befähigt ist, an das Polypeptid zu binden, durch Detektieren des Signals, das durch die zweite Komponente erzeugt wird.

Alternativ umfasst das Verfahren:

(a) Inkontaktbringen (i) einer detektierbaren ersten Komponente, von der bekannt ist, dass sie an das oben beschriebene Polypeptid bindet, und (ii) einer Verbindung mit Zellen, die das obige Polypeptid auf ihrer Zelloberfläche exprimieren, wobei das Polypeptid mit einer zweiten Komponente assoziiert ist, die befähigt ist, ein detektierbares Signal als Reaktion auf das Binden einer Verbindung an das Polypeptid bereitzustellen, wobei das Inkontaktbringen unter Bedingungen erfolgt, die ausreichend sind, um das Binden von Verbindungen an das Polypeptid zu ermöglichen; und
(b) Bestimmen, ob die erste Komponente an das Polypeptid bindet, durch Detektieren des Fehlens oder andernfalls eines Signals, das aus der Wechselwirkung der ersten Komponente mit dem Polypeptid erzeugt wird.

Die Verbindung, die durch ein beliebiges der obigen Verfahren ermittelt wurde, bindet bevorzugt an das oben beschriebene Polypeptid und (i) antagonisiert es oder antagonisiert es selektiv oder (ii) agonisiert das oben beschriebene Polypeptid.
Da GPCRs an der Signaltransduktion beteiligt sind, können Modulatoren (z.B. Agonisten oder Antagonisten) des Polypeptids der vorliegenden Erfindung Verwendung beim Eingreifen in den Signaltransduktionsprozess finden.
Der oben beschriebene Antikörper, die oben beschriebene Verbindung oder Zusammensetzung kann als Pharmazeutikum verwendet werden.
Derartige Antikörper, Verbindungen und Zusammensetzungen, welche das hierin beschriebene Polypeptid modulieren können, können daher Anwendung in den therapeutischen Gebieten finden, welche Aspekte der Signaltransduktion treffen. Therapeutisch zweckmäßige Gebiete schließen, ohne Einschränkung darauf, Adipositas, Diabetes und metabolische Erkrankung, neurologische Erkrankung, Psychotherapeutika, urogenitale Erkrankung, Reproduktions- und Sexualmedizin, Entzündung, Krebs, Gewebewiederherstellung, Dermatologie, Hautpigmentierung, lichtbedingte Alterung, Gebrechlichkeit bzw. Schwäche, Osteoporose, kardiovaskuläre Erkrankung, gastrointestinale Erkrankung, Antiinfektion, Allergie und Atemwegserkrankung, Sinnesorganstörungen, Schlafstörungen und Haarverlust ein.
Bevorzugte Zustände zur Behandlung mit derartigen Antikörpern, Verbindungen und Zusammensetzungen sind allergische Störungen, wie extrinsisches Asthma, Rhinitis (allergisch und chronisch), onchozerkale Dermatitis bzw. Hautonchozerkose ("onchocercal dermatitis"), atopische Dermatitis, Wirkstoffreaktionen und NERDS (Noduli, Eosinophilie, Rheumatismus, Dermatitis und Schwellung), granulomatöse vaskulitische Erkrankungen ("vasculitic granulomatous diseases"), wie temporale Vaskulitis ("temporal vasculitis"), Churg-Strauss-Syndrom, Polyarteriitis, Wegner-Granulomatose und eosinophile granulomatöse Prostatitis, immunologische Störungen, wie Autoimmunreaktionen (z.B. Multiple Sklerose), Transplantatabstoßung und intrinsisches Asthma, interstitielle und andere Lungenerkrankungen, wie chronisch-obstruktive Lungenerkrankung (COPD), eosinophile Pleuraergüsse, transitorische eosinophile Lungeninfiltrate (Löffler), Histiozytose, chronische eosinophile Pneumonie, Hypersensitivitätspneumonitis, allergische bronchopulmonale Aspergillose, Sarkoidose, idiopathische Lungenfibrose und topische Eosinophilie ("topical eosinophilia"), infektiöse Parasitenerkrankungen, wie Toxocariasis, Filariose, Schistosomiasis, Trichinose, Strongyloides, Ascariasis und Echinokokkose/Zystizerkose, andere Infektionserkrankungen, wie akute Kokzidioidomykose, Katzenkratzkrankheit, afebrile Tuberkulose und Chlamydienpneumonie in der Kindheit, neoplastische und myoloproliferative Erkrankungen, wie Bronchialkarzinom, Hypereosinophiliesyndrom, T-Zelllymphome und Hodgkin'sche Krankheit, Entzündungszustände, wie entzündliche Darmerkrankungen (z.B. Colitis ulcerosa, Morbus Crohn) und Sinusitis sowie Zöliakie-Erkrankungen, obstruktive Lebererkrankung und Dermatitis herpetiformis.
Besonders bevorzugt zur Behandlung mit derartigen Antikörpern, Verbindungen und Zusammensetzungen sind Asthma (sowohl extrinsisch als auch intrinsisch), COPD und entzündliche Darmerkrankungen.
Demgemäß wird auch die Verwendung der oben beschriebenen Verbindung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Patienten, der einer Modulation des oben beschriebenen Polypeptids bedarf, beschrieben. Vorzugsweise ist die Behandlung für einen Patienten, der einer Antagonisierung oder selektiven Antagonisierung des Polypeptids bedarf. Alternativ ist die Behandlung für einen Patienten, der einer Agonisierung des Polypeptids bedarf.
Darüber hinaus beschreibt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der einer Modulation des oben beschriebenen Polypeptids bedarf, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge der oben beschriebenen Verbindung an den Patienten. Vorzugsweise ist das Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der einer Antagonisierung oder selektiven Antagonisierung des Polypeptids bedarf. Alternativ ist das Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der einer Agonisierung des Polypeptids bedarf.
Vorzugsweise ist die Verbindung ein Polypeptid und eine therapeutisch wirksame Menge der Verbindung wird verabreicht, indem für den Patienten DNA, die die Verbindung codiert, bereitgestellt wird und die Verbindung in vivo exprimiert wird.
Durch die vorliegende Erfindung wird auch die Verwendung des oben beschriebenen Antikörpers bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Patienten, der der Modulation des oben beschriebenen Polypeptids bedarf, beschrieben. Vorzugsweise ist das Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der einer Antagonisierung oder selektiven Antagonisierung des Polypeptids bedarf. Alternativ ist das Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der einer Agonisierung des Polypeptids bedarf.
Weiterhin wird durch die vorliegende Erfindung noch ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der einer Modulation des oben beschriebenen Polypeptids bedarf, beschrieben, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge des oben beschriebenen Antikörpers an den Patienten. Vorzugsweise ist das Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der einer Antagonisierung oder selektiven Antagonisierung des Polypeptids bedarf. Alternativ ist das Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der einer Agonisierung des Polypeptids bedarf.
Die vorliegende Erfindung beschreibt die Verwendung der oben beschriebenen Verbindung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von allergischen Störungen, granulomatösen vaskulitischen Erkrankungen, immunologischen Störungen, interstitiellen und anderen Lungenerkrankungen, Infektionserkrankungen, Entzündungserkrankungen und neoplastischen und myeloproliferativen Erkrankungen. Vorzugsweise ist die allergische Störung extrinsisches Asthma, ist die immunologische Störung intrinsisches Asthma, ist die Lungenerkrankung COPD und sind die Entzündungserkrankungen entzündliche Darmerkrankungen.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch die Verwendung des obigen Antikörpers bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von allergischen Störungen, granulomatösen vaskulitischen Erkrankungen, immunologischen Störungen, interstitiellen und anderen Lungenerkrankungen, Infektionserkrankungen, Entzündungserkrankungen und neoplastischen und myeloproliferativen Erkrankungen. Vorzugsweise ist die allergische Störung extrinsisches Asthma, ist die immunologische Störung intrinsisches Asthma, ist die Lungenerkrankung COPD und sind die Entzündungserkrankungen entzündliche Darmerkrankungen.
Hierin beschrieben wird ein Verfahren zur Behandlung von allergischen Störungen, granulomatösen vaskulitischen Erkrankungen, immunologischen Störungen, interstitiellen und anderen Lungenerkrankungen, Infektionserkrankungen, Entzündungserkrankungen und neoplastischen und myeloproliferativen Erkrankungen bei einem Patienten, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge der oben beschriebenen Verbindung an den Patienten. Vorzugsweise ist die allergische Störung extrinsisches Asthma, ist die immunologische Störung intrinsisches Asthma, ist die Lungenerkrankung COPD und sind die Entzündungserkrankungen entzündliche Darmerkrankungen.
Darüber hinaus beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von allergischen Störungen, granulomatösen vaskulitischen Erkrankungen, immunologischen Störungen, interstitiellen und anderen Lungenerkrankungen, Infektionserkrankungen, Entzündungserkrankungen und neoplastischen und myeloproliferativen Erkrankungen bei einem Patienten, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge des oben beschriebenen Antikörpers an den Patienten. Vorzugsweise ist die allergische Störung extrinsisches Asthma, ist die immunologische Störung intrinsisches Asthma, ist die Lungenerkrankung COPD und sind die Entzündungserkrankungen entzündliche Darmerkrankungen.
Der oben genannte Antikörper kann auch zur Anreicherung oder Isolierung von Eosinophilen aus Säuger-, vorzugsweise Human-, Blut verwendet werden.
Es wird auch beschrieben, dass genetisch manipulierte Zellen ex vivo oder in vivo das oben beschriebene Polypeptid exprimieren, überexprimieren, unterexprimieren oder dass sie eine gezielte Insertion oder Deletion des oben beschriebenen Polypeptids aufweisen. PFI-013-POLYPEPTID
Wie oben erklärt, beschreibt die vorliegende Erfindung einen GPCR – welcher intern als PFI-013 bezeichnet wird – und eine Nucleotidsequenz, die denselben codiert. Die vorliegende Erfindung beschreibt auch die Verwendung der neuen Nucleinsäure- und Aminosäuresequenzen bei der Diagnose und Behandlung von Erkrankungen. Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung der PFI-013-Nucleinsäure- und -Aminosäuresequenzen, um Mittel, die den GPCR modulieren können, zu beurteilen und/oder zu screenen. Die vorliegende Erfindung beschreibt weiterhin genetisch manipulierte Wirtszellen, die die neuen Nucleinsäure- und Aminosäuresequenzen umfassen oder exprimieren, um Mittel, die den GPCR modulieren können, zu beurteilen und/oder ein Screening auf diese Mittel durchzuführen.
Das PFI-013-Polypeptid kann das gleiche wie die natürlich vorkommende Form sein – für diesen Aspekt ist das PFI-013-Polypeptid vorzugsweise die nicht-native Aminosäuresequenz (d.h. es liegt nicht in seiner natürlichen Umgebung vor) – oder es ist eine Variante, ein Homologes, Fragment oder Derivat davon. Zusätzlich oder als Alternative ist das PFI-013-Polypeptid isoliertes PFI-013-Polypeptid und/oder gereinigtes PFI-013-Polypeptid. Das PFI-013-Polypeptid kann aus jeder beliebigen geeigneten Quelle, ob natürlich oder nicht, erhältlich sein oder durch sie erzeugt werden, oder es kann synthetisch, semisynthetisch oder rekombinant sein.
Die PFI-013-codierende Sequenz kann die gleiche wie die natürlich vorkommende Form sein – für diesen Aspekt ist die PFI-013-codierende Sequenz vorzugsweise die nicht-native Nucleotidsequenz (d.h., sie liegt nicht in ihrer natürlichen Umgebung vor) – oder sie ist eine Variante, ein Homologes, Fragment oder Derivat davon. Zusätzlich oder als Alternative ist die PFI-013-codierende Sequenz eine isolierte PFI-013-codierende Sequenz und/oder eine gereinigte PFI-013-codierende Sequenz. Die PFI-013-codierende Sequenz kann aus einer beliebigen geeigneten Quelle, ob natürlich oder nicht, erhältlich sein oder durch sie erzeugt werden, oder sie kann synthetisch, semisynthetisch oder rekombinant sein. PFI-013-POLYPEPTID UND SCREENING
Das PFI-013-Polypeptid und/oder seine codierende Sequenz und/oder eine Sequenz, die zur Hybridisierung daran befähigt ist, ist/sind zweckmäßig zum Testen der Selektivität von Wirkstoffkandidaten unter verschiedenen GPCRs.
Es wurde gezeigt (hierin), dass PFI-013 am ähnlichsten zu Histaminrezeptoren ist und dass PFI-013 einen neuen GPCR codiert, dessen Ligand wahrscheinlich ein kleines Amin ist.
Wirkstoffe, die den neuen PFI-013-Rezeptor modulieren, werden daher wahrscheinlich Signaltransduktionsprozesse modulieren. Es ist daher wahrscheinlich, dass Modulatoren des PFI-013-Rezeptors zur Behandlung vieler verschiedener mit der Signaltransduktion assoziierter Störungen zweckmäßig sind, die sehr wahrscheinlich Folgendes einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind: Adipositas, Diabetes und metabolische Erkrankung, neurologische Erkrankung, Psychotherapeutika, urogenitale Erkrankung, Reproduktions- und Sexualmedizin, Entzündung, Krebs, Gewebewiederherstellung, Dermatologie, Hautpigmentierung, lichtbedingte Alterung, Gebrechlichkeit bzw. Schwäche, Osteoporose, kardiovaskuläre Erkrankung, gastrointestinale Erkrankung, Antiinfektion, Allergie und Atemwegserkrankung, Sinnesorganstörungen, Schlafstörungen und Haarverlust.
Bevorzugte Zustände zur Behandlung mit derartigen Wirkstoffen sind allergische Störungen, wie extrinsisches Asthma, Rhinitis (allergisch und chronisch), onchozerkale Dermatitis bzw. Hautonchozerkose, atopische Dermatitis, Wirkstoffreaktionen und NERDS (Noduli, Eosinophilie, Rheumatismus, Dermatitis und Schwellung), granulomatöse vaskulitische Erkrankungen, wie temporale Vaskulitis, Churg-Strauss-Syndrom, Polyarteriitis, Wegner-Granulomatose und eosinophile granulomatöse Prostatitis, immunologische Störungen, wie Autoimmunreaktionen (z.B. Multiple Sklerose), Transplantatabstoßung und intrinsisches Asthma, interstitielle und andere Lungenerkrankungen, wie chronisch-ob struktive Lungenerkrankung (COPD), eosinophile Pleuraergüsse, transitorische eosinophile Lungeninfiltrate (Löffler), Histiozytose, chronische eosinophile Pneumonie, Hypersensitivitätspneumonitis, allergische bronchopulmonale Aspergillose, Sarkoidose, idiopathische Lungenfibrose und topische Eosinophilie ("topical eosinophilia"), infektiöse Parasitenerkrankungen, wie Toxocariasis, Filariose, Schistosomiasis, Trichinose, Strongyloides, Ascariasis und Echinokokkose/Zystizerkose, andere Infektionserkrankungen, wie akute Kokzidioidomykose, Katzenkratzkrankheit, afebrile Tuberkulose und Chlamydienpneumonie in der Kindheit, neoplastische und myoloproliferative Erkrankungen, wie Bronchialkarzinom, Hypereosinophiliesyndrom, T-Zelllymphome und Hodgkin'sche Krankheit, Entzündungszustände, wie entzündliche Darmerkrankungen (z.B. Colitis ulcerosa, Morbus Crohn) und Sinusitis sowie Zöliakie-Erkrankungen, obstruktive Lebererkrankung und Dermatitis herpetiformis.
Besonders bevorzugte Zustände zur Behandlung mit derartigen Wirkstoffen sind Asthma (sowohl extrinsisch als auch intrinsisch), COPD und entzündliche Darmerkrankungen.
Somit können das PFI-013-Polypeptid und/oder seine codierende Sequenz und/oder eine Sequenz, die zur Hybridisierung daran befähigt ist, für ein Screening von Wirkstoffkandidaten zur Behandlung von Erkrankungen, die mit Signaltransduktion assoziiert sind, zweckmäßig sein. Zusätzlich wird davon ausgegangen, dass das PFI-013-Polypeptid und/oder seine codierende Sequenz und/oder eine Sequenz, die zur Hybridisierung daran befähigt ist, für ein Screening von Wirkstoffkandidaten zur Behandlung von Erkrankungen, wie jenen die oben beschrieben sind, zweckmäßig sein können.
Eines von beiden oder beide, die Nucleotidsequenzen, die für das PFI-013-Polypeptid codieren, oder das PFI-013-Polypeptid selbst, kann/können verwendet werden, um cm Screening auf Mittel, die die GPCR-Aktivität beeinflussen können, durchzuführen. Insbesondere kann die Nucleotidsequenz, die für den PFI-013-Rezeptor selbst codiert, verwendet werden, um ein Screening auf Mittel, die eine GPCR-Aktivität antagonisieren können, durchzuführen. Zusätzlich kann die Nucleotidsequenz, die für das PFI-013-Polypeptid codiert, oder das PFI-13-Polypeptid selbst verwendet werden, um ein Screening auf Mittel, die selektiv die GPCR-Aktivität beeinflussen, wie z.B. selektives Antagonisieren des PFI-013-Rezeptors, durchgeführt werden.
POLYPEPTID
Der Begriff "Polypeptid" – der mit dem Begriff "Protein" austauschbar ist – schließt einzelkettige Polypeptidmoleküle sowie Komplexe aus mehreren Polypeptiden ein, in denen die einzelnen Polypeptidbestandteile durch kovalente oder nicht-kovalente Mittel verknüpft sind.
Vorzugsweise ist das Polypeptid der vorliegenden Erfindung ein einzelkettiges Polypeptid.
Die hierin beschriebenen Polypeptide können in einer im Wesentlichen isolierten Form vorliegen. Es wird verstanden werden, dass das Polypeptid mit Trägern oder Verdünnungsmitteln gemischt sein kann, welche keine Auswirkungen auf den beabsichtigten Zweck des Polypeptids haben, und dass es noch immer als im Wesentlichen isoliert angesehen wird. Ein hierin beschriebenes Polypeptid kann auch in einer im Wesentlichen gereinigten Form vorliegen, wobei es in diesem Fall das Polypeptid in einer Präparation darstellen wird, in der mehr als 90%, z.B. 95%, 98% oder 99%, des Polypeptids in der Präparation ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung ist. Polypeptide können z.B. durch Hinzufügen von Histidinresten modifiziert werden, um ihre Aufreinigung zu unterstützen.
Polypeptide können durch synthetische Mittel bzw. Synthesemittel (z.B. wie von Geysen et al., 1996 beschrieben) oder rekombinant, wie unten beschrieben, hergestellt werden.
Die Aminosäuresequenz per se deckt nicht den nativen PFI-013-Rezeptor ab, wenn er in seiner natürlichen Umgebung vorliegt und wenn er mittels seiner nativen codierenden Nucleotidsequenz exprimiert wurde, welche ebenfalls in ihrer natürlichen Umgebung vorliegt, und wenn diese Nucleotidsequenz unter der Kontrolle ihres nativen Promotors steht, welcher ebenfalls in seiner natürlichen Umgebung vorliegt. Zur Vereinfachung der Bezugnahme bezeichneten wir dies als die "nicht-native Aminosäuresequenz".
Die Begriffe "Variante", "Homologes", "Fragment", "Analogon" oder "Derivat" schließen im Bezug auf die Aminosäuresequenz für das Polypeptid jegliche beliebige Substitution, Variation, Modifikation, jeden beliebigen Austausch, jede beliebige Deletion oder Addition von einer (oder mehreren) Aminosäure(n) in bzw. an der Sequenz ein, vorausgesetzt, dass das resultierende Polypeptid GPCR-Aktivität aufweist, wobei es vorzugsweise mindestens eine biologische Aktivität aufweist, wie das Polypeptid, das in der beigefügten SEQ ID NO: 2 gezeigt ist. Insbesondere deckt der Begriff "Homologes" eine Homologie hinsichtlich Struktur und/oder Funktion ab. Hinsichtlich der Sequenzhomologie besteht mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 75%, stärker bevorzugt mindestens 80%, stärker bevorzugt mindestens 85%, stärker bevorzugt mindestens 90%, stärker bevorzugt mindestens 95%, Homologie zu der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Sequenz. Am stärksten bevorzugt besteht mindestens 98% Homologie zu der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Sequenz.
Bei der Variante, dem Homologen oder dem Fragment sollten die Typen von Aminosäuresubstitutionen, die gemacht werden könnten, typischerweise die Hydrophobie/Hydrophilie der Aminosäuresequenz aufrechterhalten. Aminosäuresubstitutionen können gemacht werden, z.B. von 1, 2 oder 3 bis 10, 20 oder 30 Substitutionen, vorausgesetzt, dass die modifizierte Sequenz die Fähigkeit als ein GPCR zu fungieren beibehält. Aminosäuresubstitutionen können die Verwendung von nicht natürlicherweise vorkommenden Analoga einschließen.
Die hierin beschriebene Aminosäuresequenz kann durch Expression einer Nucleotidsequenz, die für dieselbe codiert, in einem geeigneten Expressionssystem produziert werden.
Zusätzlich oder als Alternative könnte das Protein selbst unter Verwendung chemischer Verfahren zum Synthetisieren eines PFI-013-Polypeptids, zur Gänze oder teilweise, hergestellt werden. Zum Beispiel können Peptide mittels Festphasentechniken synthetisiert werden, von dem Harz abgespalten werden und mittels präparativer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigt werden (z.B. Creighton (1983) Proteins Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, NY, USA). Die Zusammensetzung der synthetischen Peptide kann mittels Aminosäureanalyse oder Sequenzierung (z.B. Edman-Abbau-Vorgehensweise) bestätigt werden.
Eine direkte Peptidsynthese kann unter Verwendung verschiedener Festphasentechniken (Roberge JY et al., Science, Bd. 269, 1995, 202-204) durchgeführt werden, und eine automatisierte Synthese kann z.B. unter Verwendung einer Peptidsynthesevorrichtung, ABI 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer), in Übereinstimmung mit den Anweisungen, die vom Hersteller bereitgestellt werden, erreicht werden. Zusätzlich kann die Aminosäuresequenz von PFI-013 oder eines beliebigen Teils davon während der direkten Synthese geändert werden und/oder unter Verwendung chemischer Verfahren mit einer Sequenz aus anderen Untereinheiten oder einem beliebigen Teil davon unter Produktion einer Polypeptidvariante kombiniert werden.
Eine natürliche, modifizierte oder rekombinante PFI-013-Aminosäuresequenz kann mit einer heterologen Sequenz ligiert werden, um ein Fusionsprotein zu codieren. Zum Beispiel kann es zum Screenen von Bibliotheken auf Verbindungen und Peptidagonisten und -antagonisten von PFI-013-GPCR-Aktivität zweckmäßig sein, ein chimäres PFI-013-Protein, das ein heterologes Epitop exprimiert, das durch einen kommerziell erhältlichen Antikörper erkannt wird, zu codieren. Ein Fusionsprotein kann auch so konstruiert werden, dass es eine Spaltstelle enthält, die zwischen einer PFI-013-Sequenz und der heterologen Proteinsequenz lokalisiert ist, so dass das PFI-013 abgespalten werden kann und von der heterologen Gruppierung gereinigt werden kann.
PFI-013 kann auch als ein rekombinantes Protein mit einer oder mehreren zusätzlichen Polypeptiddomänen, die zur Erleichterung bzw. Ermöglichung der Proteinaufreinigung angefügt wurden, exprimiert werden. Derartige die Aufreinigung erleichternde bzw. ermöglichende Domänen schließen, ohne Einschränkung darauf, Metallchelat-bildende Peptide, wie Histidin-Tryptophan-Module, die die Aufreinigung an immobilisierten Metallen ermöglichen (Porath J., Protein Expr. Purif., Bd. 3, 1992, S. 263-281), Protein A-Domänen, die die Aufreinigung an immobilisiertem Immunglobulin ermöglichen, und die Domäne, die in dem FLAGS-Anhang ("extension")/Affinitätsaufreinigungssystem (Immunex Corp., Seattle, WA, USA) verwendet wird, ein. Der Einschluss einer abspaltbaren Linkersequenz, wie Faktor XA oder Enterokinase (Invitrogen, San Diego, CA, USA), zwischen der Aufreinigungsdomäne und PFI-013 ist zweckmäßig, um die Aufreinigung zu erleichtern bzw. zu ermöglichen.
Eine spezielle Aminosäuresequenz von PFI-013 ist in SEQ ID NO: 2 gezeigt. Jedoch werden auch Aminosäuresequenzen beschrieben, die andere GPCRs codieren, welche Aminosäuresequenzen mit mindestens 70% Identität (vorzugsweise mindestens 75%, stärker bevorzugt mindestens 80%, stärker bevorzugt mindestens 85%, stärker bevorzugt mindestens 90%, stärker bevorzugt mindestens 95%, am stärksten bevorzugt mindestens 98% Identität) mit der speziellen Aminosäuresequenz einschließen würden.
Polypeptide schließen auch Fragmente der Aminosäuresequenz und Varianten davon ein. Geeignete Fragmente werden mindestens 5, z.B. mindestens 10, 12, 15 oder 20 Aminosäuren, groß sein.
Polypeptide können auch so modifiziert werden, dass sie eine oder mehrere (z.B. mindestens 2, 3, 5 oder 10) Substitutionen, Deletionen oder Insertionen enthalten, einschließlich konservierter Substitutionen. Diese Aspekte werden in einem späteren Abschnitt diskutiert.
NUCLEOTIDSEQUENZ
Der Begriff "Nucleotidsequenz", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Oligonucleotidsequenz oder Polynucleotidsequenz und Varianten, Homologe, Fragmente, Analoga und Derivate davon (wie Teile davon). Die Nucleotidsequenz kann DNA oder RNA sein, welche genomischen oder synthetischen oder rekombinaten Ursprungs sein kann, welche doppelsträngig oder einzelsträngig sein kann, unabhängig davon, ob sie den Sense- oder Antisense-Strang darstellt.
Vorzugsweise bedeutet der Begriff "Nucleotidsequenz" DNA.
Stärker bevorzugt bedeutet der Begriff "Nucleotidsequenz" DNA, die durch Verwendung rekombinanter DNA-Techniken hergestellt wurde (d.h. rekombinante DNA).
Die Nucleotidsequenz per se deckt nicht die native codierende Nucleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung in ihrer natürlichen Umgebung ab, wenn sie unter der Kontrolle ihres nativen Promotors steht, welcher ebenfalls in seiner natürlichen Umgebung vorliegt. Zur Erleichterung der Bezugnahme bezeichneten wir dies als die "nicht-native Nucleotidsequenz".
Die Nucleotidsequenzen können innerhalb von ihnen synthetische oder modifizierte Nucleotide einschließen. Eine Anzahl verschiedener Modifikationstypen bei Oligonucleotiden ist im Fachgebiet bekannt. Diese schließen Methylphosphonat- und Phosphorothioat-Gerüste, das Hinzufügen von Acridin- oder Polylysinketten am 3'- und/oder 5'-Ende des Moleküls ein. Es soll verstanden werden, dass die hierin beschriebenen Nucleotidsequenzen durch jedes beliebige im Fachgebiet verfügbare Verfahren modifiziert sein können. Derartige Modifikationen können durchgeführt werden, um die in vivo-Aktivität oder Lebensdauer der Nucleotidsequenzen zu erhöhen.
Ebenfalls beschrieben werden Nucleotidsequenzen, die zu den hierin dargestellten Sequenzen komplementär sind, oder eine beliebige Variante, ein beliebiges Homologes, Analogon, Fragment oder Derivat davon. Wenn die Sequenz zu einem Fragment davon komplementär ist, dann kann diese Sequenz als eine Sonde verwendet werden, um ähnliche codierende Sequenzen in anderen Organismen zu identifizieren etc.
Nucleotidsequenzen, die zur Hybridisierung an die hierin dargestellten Sequenzen befähigt sind, oder eine beliebige Variante, ein beliebiges Homologes, Analogon, Fragment oder Derivat davon werden hierin beschrieben.
Beschrieben werden Nucleotidsequenzen, die zur Hybridisierung an die Sequenzen, die zu den hierin dargestellten Sequenzen komplementär sind, befähigt sind oder eine beliebige Variante, ein beliebiges Homologes, Analogon, Fragment oder Derivat davon.
Der Begriff "Variante" umfasst auch Sequenzen, die zu Sequenzen, die zur Hybridisierung an die hierin dargestellten Nucleotidsequenzen befähigt sind, komplementär sind.
Vorzugsweise umfasst der Begriff "Variante" Sequenzen, die zu Sequenzen komplementär sind, die zur Hybridisierung unter stringenten Bedingungen (z.B. 65°C und 0,1 × SSC {1 × SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 Na₃-Citrat, pH 7,0}) an die hierin dargestellten Nucleotidsequenzen befähigt sind.
Ebenfalls beschrieben werden Nucleotidsequenzen, die an die oben beschriebenen Nucleotidsequenzen (einschließlich der zu jenen hierin präsentierten komplementären Sequenzen) hybridisieren können.
Ebenfalls beschrieben sind Nucleotidsequenzen, die zu Sequenzen komplementär sind, die an die oben beschriebenen Nucleotidsequenzen (einschließlich der zu jenen hierin präsentierten komplementären Sequenzen) hybridisieren können.
In der vorliegenden Erfindung ebenfalls beschrieben sind Polynucleotidsequenzen, die zur Hybridisierung an die hierin dargestellten Nucleotidsequenzen unter Bedingungen von mittlerer ("intermediate") bis maximaler Stringenz befähigt sind.
Die vorliegende Erfindung beschreibt Nucleotidsequenzen, die an die oben beschriebene Nucleotidsequenz oder das Komplement davon unter stringenten Bedingungen (z.B. 65°C und 0,1 × SSC) hybridisieren können.
Exemplarische Nucleinsäuren können alternativ als jene Nucleotidsequenzen charakterisiert werden, welche ein PFI-013-Protein codieren und an die in SEQ ID NO: 1 gezeigte DNA-Sequenz hybridisieren. Bevorzugt sind solche PFI-013-codierenden Sequenzen, welche unter Bedingungen hoher Stringenz an die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Sequenz oder das Komplement davon hybridisieren.
Die Erfindung beschreibt Nucleinsäuresequenzen, die zur Hybridisierung unter stringenten Bedingungen an ein Fragment der in SEQ ID NO. 1 gezeigten Sequenz oder des Komplements davon befähigt sind. Vorzugsweise ist das Fragment zwischen 15 und 50 Basen lang. Vorteilhafterweise ist es etwa 25 Basen lang.
Die Begriffe "Variante", "Homologes", "Analogon", "Derivat" oder "Fragment" schließen in Bezug auf die Nucleotidsequenz, die für das hierin beschriebene Polypeptid codiert, jegliche Substitution, Variation, Modifikation, jeglichen Austausch, jegliche Deletion oder Addition von einer (oder mehreren) Nucleinsäure(n) in der Sequenz ein, vorausgesetzt, dass die resultierende Nucleotidsequenz für ein Polypeptid mit PFI-013-Rezeptor-Aktivität, wobei dieses vorzugsweise mindestens eine biologische Aktivität wie das durch die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Sequenz codierte Polypeptid aufweist, codiert oder dieses zu codieren in der Lage ist. Insbesondere deckt der Begriff "Homologes" Homologie hinsichtlich Struktur und/oder Funktion ab, vorausgesetzt, dass die resultierende Nucleotidsequenz für ein Polypeptid mit Aktivität als ein PFI-013-GPCR codiert oder dieses zu codieren in der Lage ist. Hinsichtlich der Sequenzhomologie besteht vorzugsweise mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 75%, stärker bevorzugt mindestens 80%, stärker bevorzugt mindestens 85%, stärker bevorzugt mindestens 90%, stärker bevorzugt mindestens 95%, Homologie zu einer Nucleotidsequenz, die für die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Aminosäuresequenz codiert. Am stärksten bevorzugt besteht mindestens 98% Homologie zu einer Nucleotidsequenz, die für die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Aminosäuresequenz codiert. Hinsichtlich der Sequenzhomologie besteht mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 75%, stärker bevorzugt mindestens 80%, stärker bevorzugt mindestens 85%, stärker bevorzugt mindestens 90%, stärker bevorzugt mindestens 95%, Homologie zu der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Nucleotidsequenz. Am stärksten bevorzugt besteht mindestens 98% Homologie zu der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Nucleotidsequenz.
Wie angegeben, beschreibt die vorliegende Erfindung eine DNA-Sequenz (vorzugsweise eine cDNA-Sequenz), die PFI-013 codiert. Insbesondere beschreibt die vorliegende Erfindung cDNA-Sequenzen, die PFI-013 codieren.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch DNA-Segmente, die die in SEQ ID NO: 1 gezeigte DNA-Sequenz oder Allelvarianten davon umfasst.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch Polypeptide, die durch Expression in einer Wirtszelle, in welche die vorausgehenden DNA-Sequenzen oder Allelvarianten davon inkorporiert sind, produziert werden.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch DNA, umfassend die in SEQ ID NO: 1 gezeigte DNA-Sequenz oder Allelvarianten davon.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch nicht-native DNA, umfassend die in SEQ ID NO: 1 gezeigte DNA-Sequenz oder Allelvarianten davon.
Die vorliegende Erfindung beschreibt rekombinante DNA, umfassend die in SEQ ID NO: 1 gezeigte DNA-Sequenz oder Allelvarianten davon.
Die hierin beschriebenen Polynucleotide schließen Nucleinsäuresequenzen ein, die die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Polypeptide codieren. Es wird anerkannt werden, dass eine Reihe verschiedener Polynucleotide eine gegebene Aminosäuresequenz als Folge der Degeneration des genetischen Codes codiert.
Durch Kenntnis der hierin dargelegten Aminosäuresequenzen ist es möglich, partielle Nucleinsäuresequenzen und solche mit voller Länge, wie cDNA und/oder genomische Klone, die die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Polypeptide codieren, zu formulieren. Zum Beispiel können die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Polynucleotide unter Verwendung von degenerierter Polymerasekettenreaktion (PCR), welche Primer verwenden wird, die für Zielsequenzen, die die hierin dargestellten Aminosäuresequenzen codieren, konstruiert wurden, erhalten werden. Die Primer werden typischerweise mehrere degenerierte Positionen enthalten. Um jedoch die Degeneration zu minimieren, werden Sequenzen ausgewählt werden, die Regionen der hierin dargestellten Aminosäuresequenzen codieren, die Aminosäuren, wie Methionin, enthalten, welche nur durch ein Triplett codiert werden. Zusätzlich werden Sequenzen ausgewählt werden, um die Codonnutzung in dem Organismus zu berücksichtigen, dessen Nucleinsäure als Matrizen-DNA für das PCR-Verfahren verwendet wird. Die PCR wird bei Stringenzbedingungen verwendet, die geringer als jene sind, die zur Klonierung von Sequenzen mit Einzelsequenz-(nicht-degenerierten) Primern gegen bekannte Sequenzen verwendet werden.
Mittels PCR erhaltene Nucleinsäuresequenzen, die Polypeptidfragmente codieren, können verwendet werden, um größere Sequenzen unter Verwendung von Hybrierungs-Techniken für ein Screening von Bibiotheken zu erhalten. Zum Beispiel kann ein PCR-Klon mit radioaktiven Atomen markiert werden und verwendet werden, um eine cDNA- oder Genom-Bibliothek anderer Spezies, vorzugsweise anderer Säugerspezies, zu durchmustern bzw. zu screenen. Die Hybridisierungsbedingungen werden typischerweise Bedingungen von mittlerer bis hoher Stringenz (z.B. 0,03 M Natriumchlorid und 0,03 M Natriumcitrat bei von etwa 50°C bis etwa 60°C) sein.
Degenerierte Nucleinsäuresonden, die die gesamte Aminosäuresequenz oder einen Teil davon codieren, können auch verwendet werden, um cDNA- und/oder Genom-Bibliotheken anderer Spezies, vorzugsweise anderer Säugerspezies, zu untersuchen. Es ist jedoch bevorzugt, die PCR-Techniken anfänglich durchzuführen, um eine Einzelsequenz zur Verwendung in weiteren Screening-Verfahren zu erhalten.
Polynucleotidsequenzen, die PFI-013, Fragmente des Polypeptids, Fusionsproteine oder funktionelle Äquivalente davon, codieren, können verwendet werden, um rekombinante DNA-Moleküle zu erzeugen, die die Expression von PFI-013 in geeigneten Wirtszellen steuern. Aufgrund der inhärenten Degeneration des genetischen Codes können andere DNA-Sequenzen, welche im Wesentlichen die gleiche oder eine funktionell äquivalente Aminosäuresequenz codieren, verwendet werden, um PFI-013 zu klonieren und zu exprimieren. Wie von Fachleuten auf dem Gebiet verstanden werden wird, kann es vorteilhaft sein, PFI-013-codierende Nucleotidsequenzen zu erzeugen, die nicht-natürlich vorkommende Codons besitzen. Codons, die von einem speziellen prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt bevorzugt werden (Murray E. et al. (1989) Nuc. Acids Res., 17:477-508), können ausgewählt werden, um z.B. die PFI-013-Expressionsrate zu erhöhen oder rekombinante RNA-Transkripte mit wünschenswerten Eigenschaften, wie einer längeren Halbwertszeit als bei Transkripten, die von der natürlich vorkommenden Sequenz produziert wurden, zu produzieren.
Polynucleotidsequenzen, die unter Verwendung der oben beschriebenen Techniken erhalten wurden, können verwendet werden, um weitere homologe Sequenzen und Varianten unter Verwendung der oben beschriebenen Techniken zu erhalten. Sie können auch zur Verwendung beim Exprimieren der Polypeptide der vorliegenden Erfindung in einer Vielfalt von Wirtszellsystemen modifiziert werden, um z.B. die Codonbevorzugung für eine bestimmte Wirtszelle, in welcher die Polynucleotidsequenzen exprimiert werden, zu optimieren. Andere Sequenzänderungen können gewünscht sein, um Restriktionsenzymerkennungsstellen einzuführen oder um die Eigenschaft oder Funktion der durch die Polynucleotide codierten Polypeptide zu verändern.
Veränderte PFI-013-Polynucleotidsequenzen, welche in Übereinstimmung mit der Erfindung verwendet werden können, schließen Deletionen, Insertionen oder Substitutionen verschiedener Nucleotidreste ein, die in einem Polynucleotid resultieren, das das gleiche oder ein funktionell äquivalentes PFI-013 codiert. Das Protein kann auch Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Aminosäureresten aufweisen, welche eine stumme Veränderung ("silent change") erzeugen und in einem funktionell äquivalenten PFI-013 resultieren. Überlegte Aminosäuresubstitutionen können auf der Basis von Ähnlichkeit bei Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobie, Hydrophilie und/oder der amphipathischen Natur der Reste gemacht werden, solange die biologische Aktivität von PFI-013 erhalten bleibt. Zum Beispiel schließen negativ geladene Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure ein; positiv geladene Aminosäuren schließen Lysin und Arginin ein; und Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen mit ähnlichen Hydrophilie-Werten schließen Leucin, Isoleucin, Valin, Glycin, Alanin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Phenylalanin und Tyrosin ein.
Wie hierin verwendet, ist ein "Allel" oder eine "Allelsequenz" eine alternative Form von PFI-013. Allele resultieren aus einer Mutation, d.h. einer Änderung in der Nucleinsäuresequenz, und sie erzeugen allgemein veränderte mRNAs oder Polypeptide, deren Struktur oder Funktion geändert sein kann oder nicht. Jedes gegebene Gen kann keine, eine oder viele Allelformen aufweisen. Gewöhnliche Mutationsveränderungen, welche zu Allelen führen, werden allgemein auf Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Aminosäuren zurückgeführt. Jeder dieser Änderungstypen kann allein oder in Kombination mit den anderen einmal oder mehrmals in einer gegebenen Sequenz auftreten.
Die Nucleotidsequenzen können manipuliert werden, um eine PFI-013-codierende Sequenz aus einer Vielzahl von Gründen zu verändern, einschließlich, aber ohne Einschränkung darauf, Änderungen, welche die Klonierung, Prozessierung und/oder Expression des Genprodukts modifizieren. Zum Beispiel können Mutationen unter Verwendung von Techniken, die im Fachgebiet gut bekannt sind, z.B. ortsgerichtete Mutagenese, eingeführt werden, um neue Restriktionsschnittstellen zu inserieren, um Glycosylierungsmuster zu ändern oder um die Codonbevorzugung zu ändern.
Polynucleotide können verwendet werden, um einen Primer, z.B. einen PCR-Primer, einen Primer für eine alternative Amplifizierungsreaktion, eine Sonde, z.B. markiert mit einer detektierbaren Markierung ("revealing label") durch konventionelle Mittel unter Verwendung von radioaktiven oder nicht-radioaktiven Markierungen, zu erzeugen, oder die Polynucleotide können in Vektoren kloniert werden. Derartige Primer, Sonden und andere Fragmente werden mindestens 15, vorzugsweise mindestens 20, z.B. mindestens 25, 30 oder 40, Nucleotide lang sein.
Polynucleotide oder Primer können eine detektierbare Markierung tragen. Geeignete Markierungen schließen Radioisotope, wie ³²P oder ³⁵S, Enzymmarkierungen oder andere Proteinmarkierungen, wie Biotin, ein. Derartige Markierungen können an die Polynucleotide oder Primer angefügt werden, und sie können unter Verwendung von Techniken, die im Fachgebiet bekannt sind, detektiert werden.
Polynucleotide, wie ein DNA-Polynucleotid, und Primer können rekombinant, synthetisch oder durch jedes beliebige Mittel, das Fachleuten auf dem Gebiet zur Verfügung steht, hergestellt werden. Sie können auch mittels Standardtechniken kloniert werden.
Im Allgemeinen werden Primer durch Synthesemittel, die eine stufenweise Herstellung der gewünschten Nucleinsäuresequenz, ein Nucleotid nach dem anderen, einschließen, hergestellt werden. Techniken zum Erreichen davon unter Verwendung von automatisierten Techniken sind im Fachgebiet leicht verfügbar.
Längere Polynucleotide werden allgemein unter Verwendung von rekombinanten Mitteln bzw. Rekombinationsmitteln, z.B. unter Verwendung von PCR-Klonierungstechniken, hergestellt werden. Dieses wird das Herstellen eines Primerpaars (z.B. von etwa 15-30 Nucleotiden) für eine Region der Nucleotidsequenz, die kloniert werden soll, das Inkontaktbringen der Primer mit mRNA oder cDNA, die aus einer eukaryotischen oder prokaryotischen Zelle erhalten wurde, das Durchführen einer Polymerasekettenreaktion unter Bedingungen, die zu einer Amplifikation der gewünschten Region führen, das Isolieren des amplifizierten Fragments (z.B. durch Aufreinigen des Reaktionsgemisches in einem Agarosegel) und Gewinnen der amplifizierten DNA beinhalten. Die Primer können so konstruiert werden, dass sie geeignete Restriktionsenzymerkennungsstellen enthalten, so dass die amplifizierte DNA in einen geeigneten Klonierungsvektor kloniert werden kann.
DNA-Moleküle können modifiziert werden, um die intrazelluläre Stabilität und Halbwertszeit zu erhöhen. Mögliche Modifikationen schließen, ohne Einschränkung darauf, die Addition von flankierenden Sequenzen des 5'- und/oder 3'-Endes des Moleküls oder die Verwendung von Phosphorothioat oder 2'-O-Methyl anstelle von Phosphodiesterase-Verknüpfungen innerhalb des Gerüsts des Moleküls ein.
Nucleotidsequenzen, die zum Hybridisieren an die gesamte in SEQ ID NO: 1 gezeigte Sequenz oder an einen Teil davon oder an eine Allelvariante davon befähigt sind, können in Antisense-Techniken verwendet werden, um die PFI-013-Expression zu modifizieren. Alternativ können diese Sequenzen (oder Teile davon) als Sonde oder zum Amplifizieren einer gesamten derartigen Sequenz oder eines Teils davon verwendet werden, wenn sie als PCR-Primer verwendet werden.
Zusätzlich zu den rekombinanten DNA-Sequenzen sind auch genomische Sequenzen von Nutzen im Kontext der Wirkstoffermittlung bzw. -entwicklung ("drug discovery"). Es kann von Wert sein, die mRNA-Transkription einer speziellen Isoform zu inhibieren anstatt das translatierte Protein zu inhibieren. Dies kann bei PFI-013 zutreffend sein, wenn es Spleißvarianten gibt und wobei diese verschiedenen Spleißvarianten von verschiedenen Promotoren transkribiert werden können.
DNA-Sequenzen, sobald einmal bekannt, liefern die Information, die benötigt wird, um Assays zu konstruieren, um spezifisch Isoformen oder Spleißvarianten zu detektieren. Isoform-spezifische PCR-Primerpaare sind nur ein Beispiel eines Assays, der vollständig von der Kenntnis der spezifischen DNA-Sequenz der Isoform oder Spleißvariante abhängt. Ein derartiger Assay ermöglicht die Detektion von mRNA für die Isoform, um Zugang zur Gewebeverteilung und biologischen Relevanz jeder Isoform bei einem bestimmten Erkrankungsstatus bzw. -zustand zu erlangen. Er ermöglicht auch die Identifizierung von Zelllinien, die natürlicherweise nur eine Isoform exprimieren – eine Entdeckung, die die Notwendigkeit, rekombinante Gene zu exprimieren, umgehen könnte. Wenn von spezifischen PFI-013-Isoformen gezeigt wird, dass sie mit einem bestimmten Erkrankungszustand assoziiert sind, können sie bei der Entwicklung bzw. Konstruktion diagnostischer Assays, zum Detektieren des Vorhandenseins von mRNA einer Isoform, von Nutzen sein.
Eine abnormale Konzentration von Nucleotidsequenzen, die einen PFI-013-Rezeptor codieren, in einer biologischen Probe kann eine Chromosomenaberration, wie eine Nucleinsäuredeletion oder -mutation widerspiegeln. Demgemäß stellen Nucleotidsequenzen, die einen PFI-013-Rezeptor codieren, die Basis für Sonden dar, welche diagnostisch verwendet werden können, um Chromosomenaberrationen, wie Deletionen, Mutationen oder chromosomale Translokationen, in dem Gen, das PFI-013 codiert, zu detektieren.
Die PFI-013-Genexpression kann bei derartigen Erkrankungsstadien bzw. -zuständen verändert sein, oder es kann eine Chromosomenaberration in der Region des Gens, das PFI-013 codiert, vorliegen.
Die codierende Sequenz von PFI-013 könnte zur Gänze oder teilweise unter Verwendung chemischer Verfahren, die im Fachgebiet gut bekannt sind, synthetisiert werden (siehe Caruthers, M.H. et al. (1980) Nuc. Acids Res. Symp. Ser., 215-23, Horn, T. et al. (1980) Nuc. Acids Res. Symp. Ser., 225-232).
NATÜRLICH VORKOMMEND
Wie hierin verwendet, bezieht sich "natürlich vorkommend" auf ein PFI-013 mit einer Aminosäuresequenz, die in der Natur vorgefunden wird.
ISOLIERT/GEREINIGT
Wie hierin verwendet, beziehen sich die Begriffe "isoliert" und "gereinigt" bzw. "aufgereinigt" auf Moleküle, entweder Nucleinsäure- oder Aminosäuresequenzen, die aus ihrer natürlichen Umgebung entfernt und isoliert oder von mindestens einer anderen Komponente, mit der sie natürlicherweise assoziiert sind, abgetrennt wurden.
BIOLOGISCH AKTIV
Wie hierin verwendet, bezieht sich "biologisch aktiv" auf ein PFI-013, wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben – wie z.B. ein rekombinantes PFI-013 – das eine ähnliche strukturelle Funktion (aber nicht notwendigerweise im gleichen Ausmaß) und/oder ähnliche regulatorische Funktion (aber nicht notwendigerweise im gleichen Ausmaß) und/oder ähnliche biochemische Funktion (aber nicht notwendigerweise im gleichen Ausmaß) und/oder immunologische Aktivität (aber nicht notwendigerweise im gleichen Ausmaß) wie das natürlich vorkommende PFI-013 aufweist. Speziell hat ein PFI-013 die Fähigkeit als GPCR zu wirken.
IMMUNOLOGISCHE AKTIVITÄT
Wie hierin verwendet, ist "immunologische Aktivität" als die Fähigkeit des natürlichen, rekombinanten oder synthetischen PFI-013 oder eines beliebigen Oligopeptids davon, eine spezifische Immunreaktion in geeigneten Tieren oder Zellen zu induzieren und mit spezifischen Antikörpern eine Bindung einzugehen, definiert.
DERIVAT
Der Begriff "Derivat", wie hierin verwendet, schließt in Bezug auf Aminosäuresequenzen eine chemische Modifikation eines PFI-013 ein. Veranschaulichend für derartige Modifikationen waren der Ersatz von Wasserstoff durch eine Alkyl-, Acyl- oder Aminogruppe.
ANALOGON
Der Begriff "Analogon", wie hierin verwendet, schließt in Bezug auf die Aminosäuresequenz (oder die codierende Sequenz davon) eine chemische Modifikation eines PFI-013 oder der codierenden Sequenz davon ein. Veranschaulichend für derartige Modifikationen wäre der Ersatz natürlicher Aminosäurereste oder natürlicher Nucleotide durch nicht-natürliche Aminosäurereste (z.B. D-Aminosäuren, beta-Alanin, Hydroxyprolin) oder nicht-natürliche Nucleotide (z.B. Inosin, Dimethylcytidin ("demethyl-cytidine").
DELETION
Wie hierin verwendet, ist eine "Deletion" als eine Veränderung entweder in der Nucleotid- oder in der Aminosäuresequenz definiert, bei der ein oder mehrere Nucleotide bzw. Aminosäurereste fehlen.
INSERTION/ADDITION
Wie hierin verwendet, ist eine "Insertion" oder "Addition" eine Veränderung in einer Nucleotid- oder Aminosäuresequenz, die in der Addition bzw. Hinzufügung von einem oder mehreren Nucleotiden bzw. Aminosäureresten im Vergleich zu dem natürlich vorkommenden PFI-013 resultierte.
SUBSTITUTION
Wie hierin verwendet, resultiert eine "Substitution" aus dem Ersatz von einem oder mehreren Nucleotiden oder von einer oder mehreren Aminosäuren durch verschiedene Nucleotide bzw. Aminosäuren.
HOMOLOGES
Der Begriff "Homologes" kann hinsichtlich der Nucleotidsequenzen mit Allelvarianten der Sequenzen synonym sein.
Insbesondere kann der Begriff "Homologie", wie hierin verwendet, mit dem Begriff "Identität" gleichgesetzt werden. Hierbei kann die Sequenzhomologie im Hinblick auf die in der vorliegenden Erfindung beschriebene Nucleotidsequenz und die in der vorliegenden Erfindung beschriebene Aminosäuresequenz durch einen einfachen "Augenschein"-Vergleich ("eyeball" comparison) (d.h. ein strikter Vergleich) von einer beliebigen oder von mehreren der Sequenzen mit einer anderen Sequenz bestimmt werden, um festzustellen, ob diese andere Sequenz mindestens 70% Identität mit den Nucleotid- und Aminosäuresequenzen aufweist. Eine relative Sequenzhomologie (d.h. Sequenzidentität) kann ebenfalls mittels kommerziell erhältlicher Computerprogramme bestimmt werden, die den Prozentsatz (%) der Homologie zwischen zwei oder mehr Sequenzen berechnen können. Typische Beispiele derartiger Computerprogramme sind FASTA oder BLAST.
Ein alternatives Verfahren zum Erzeugen von vergleichenden Sequenzanordnungen bzw. Sequenz-Alignments ist es, das Computerprogramm ClustalW zu verwenden (Thompson, J.D., Higgins, D.G. und Gibson, T.J., Nucleic Acid Research, Bd. 22 (22), 4673-4680 (1994)).
Der Prozentsatz (%) der Homologie kann über benachbarte bzw. zusammenhängende Sequenzen berechnet werden, d.h. eine Sequenz wird mit der anderen Sequenz vergleichend angeordnet ("aligned") und jede Aminosäure in einer Sequenz wird direkt mit der entsprechenden Aminosäure in der anderen Sequenz, ein Rest nach dem anderen, verglichen. Dies wird als vergleichende Anordnung ohne Lücke bzw. "ungapped" Alignment bezeichnet. Typischerweise werden derartige "ungapped" Alignments nur über eine relativ kleine Anzahl von Resten (z.B. weniger als 50 zusammenhängende Aminosäuren) durchgeführt.
Obwohl dies ein sehr einfache und konsistente Methode ist, versagt sie bei der Berücksichtigung, dass z.B. bei einem ansonsten identischen Paar von Sequenzen eine Insertion oder Deletion dazu führen wird, dass die folgenden Aminosäurereste nicht mehr innerhalb des Alignments liegen, was möglicherweise in einer großen Verringerung der%-Homologie resultiert, wenn ein globales Alignment durchgeführt wird. Konsequenterweise werden die meisten Sequenzvergleichsverfahren so konstruiert, dass sie optimale Alignments erzeugen, die mögliche Insertionen und Deletionen berücksichtigen, ohne dass die Gesamthomologiepunktzahl bzw. der Gesamt-Homologie-Score ("overall homology score") unmäßig benachteiligt ("penalising") wird. Dies wird durch Einführen von Lücken bzw. "Gags" in das Sequenz-Alignment erreicht, um zu versuchen, die lokale Homologie zu maximieren.
Jedoch ordnen diese komplexeren Verfahren jeder Lücke, die in dem Alignment auftritt, Lückenstrafen bzw. "gap penalties" zu, so dass bei der gleichen Anzahl von identischen Aminosäuren ein Sequenz-Alignment mit so wenigen Lücken wie möglich – was eine höhere Verwandtschaft zwischen den zwei verglichenen Sequenzen widerspiegelt – einen höheren Score erreichen wird als eines mit vielen Lücken. Affine Lückenkosten bzw. "affine gap costs", die relativ hohe Kosten für die Existenz einer Lücke und eine kleinere Strafe für jeden nachfolgenden Rest in der Lücke auferlegen, werden typischerweise verwendet. Dies ist das am häufigsten verwendete "Gap-Scoring"-System. Hohe Lückenstrafen werden natürlich optimierte Alignments mit weniger Lücken erzeugen. Die meisten Alignment-Programme ermöglichen es, dass die Lückenstrafen modifiziert werden. Es ist jedoch bevorzugt, die voreingestellten Werte zu verwenden, wenn eine derartige Software für Sequenzvergleiche verwendet wird. Wenn z.B. das GCG Wisconsin Bestfit Package bzw. -Paket (siehe unten) verwendet wird, ist die voreingestellte Lückenstrafe für Aminosäuresequenzen -12 für die Erzeugung einer Lücke und -4 für jede Erweiterung. Alternative voreingestellte Lückenstrafen für Aminosäuresequenzen sind -8 für die Erzeugung einer Lücke und -2 für jede Erweiterung.
Die Berechnung der maximalen%-Homologie erfordert daher zuerst das Erzeugen eines optimalen Alignments, das Lückenstrafen berücksichtigt. Ein geeignetes Computerprogramm zum Ausführen eines derartigen Alignments ist das GCG Wisconsin Bestfit Package (University of Wisconsin, USA; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research, 12:387). Beispiele für andere Software, die Sequenzvergleiche durchführen kann, schließen ohne Einschränkung darauf das BLAST-Paket (siehe Ausubel et al., 1999 ibid – Kapitel 18), FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410) und die GENEWORKS-Programmfamilie von Vergleichswerkzeugen ein. Sowohl BLAST als auch FASTA sind für Offline- und Online-Suchen verfügbar (siehe Ausubel et al., 1999, ibid, Seiten 7-58 bis 7-60). Für einige Anwendungen ist es jedoch bevorzugt, das GCG Bestfit-Programm zu verwenden.
Obwohl die letztendliche %-Homologie in Form von Identität gemessen werden kann, basiert in einigen Fällen das Alignment-Verfahren selbst typischerweise nicht auf einem Alles-oder-Nichts-Paarvergleich. Stattdessen wird allgemein eine skalierte Ähnlichkeits-Punkt-Matrix ("similarity score matrix") verwendet, die jedem paarweisen Vergleich, basierend auf der chemischen Ähnlichkeit oder dem evolutionären Abstand, Punktwerte zuweist. Ein Beispiel einer derartigen Matrix, die gewöhnlich verwendet wird, ist die BLOSUM62-Matrix – die voreingestellte Matrix für die BLAST-Programmfamilie. Die GCG Wisconsin-Programme verwenden allgemein entweder die allgemeinen voreingestellten Werte oder eine maßgeschneiderte Symbolvergleichstabelle, falls bereitgestellt (siehe Benutzerhandbuch für weitere Details). Es ist bevorzugt, die allgemeinen voreingestellten Werte für das GCG-Paket, oder im Fall von anderer Software die voreingestellte Matrix, wie BLOSUM62, zu verwenden.
Sobald die Software ein optimales Alignment erzeugt hat, ist es möglich, die%-Homologie, vorzugsweise die%-Sequenzidentität, zu berechnen. Die Software führt dies typischerweise als Teil des Sequenzvergleichs durch und erzeugt ein numerisches Ergebnis.
Wie angegeben, kann für einige Anwendungen die Sequenzhomologie (oder -identität) unter Verwendung jedes geeigneten Homologiealgorithmus, z.B. unter Verwendung der voreingestellten Parameter, bestimmt werden. Für eine Diskussion der grundlegenden Fragen bei der Ähnlichkeitssuche in Sequenzdatenbanken, siehe Altschul et al. (1994) Nature Genetics, 6:119-129. Für einige Anwendungen wird der BLAST-Algorithmus angewendet, wobei die Parameter auf die voreingestellten Werte eingestellt sind. Der BLAST-Algorithmus ist im Detail unter http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html beschrieben.
Vorteilhafterweise wird die "wesentliche Homologe" bei Bewertung mittels BLAST mit Sequenzen gleichgesetzt, die mit einem EXPECT-Wert von mindestens etwa e-7, vorzugsweise mindestens e-9 und am stärksten bevorzugt e-10 oder weniger, übereinstimmen. Der voreingestellte Schwellenwert für den EXPECT(-wert) bei der BLAST-Suche ist gewöhnlich 10.
Sollten Lückenstrafen verwendet werden, wenn die Sequenzidentität bestimmt wird, dann werden vorzugsweise die folgenden Parameter verwendet:

FÜR BLAST

LÜCKENEINFÜHRUNG bzw. GAP OPEN 5

LÜCKENERWEITERUNG bzw. GAP EXTENSION 2

FÜR CLUSTAL DNA PROTEIN

WORTGRÖSSE 2 1 K-Triple

LÜCKENSTRAFE 10 10

LÜCKENERWEITERUNG 0,1 0,1
Andere Computerprogramm-Verfahren, um Identität und Ähnlichkeit zwischen den zwei Sequenzen zu bestimmen, schließen ohne Einschränkung darauf das GCG-Programmpaket (Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research, 12:387) und FASTA (Altschul et al., 1990, J. Molec. Biol., 403-410) ein.
PROFIL-HIDDEN-MARKOV-MODELLE ("PROFILE HIDDEN MARKOV MODELS")
Das Profil einer Familie von Sequenzen kann in einer wahrscheinlichkeitstheoretischen bzw. probabilistischen Weise unter Verwendung der Hidden-Markov-Modelle (HMMs) (Durbin, R., Eddy, S., Krogh, A. und Mitchison, G. (1998) Biological Sequence Analysis: Probabilistic models of Proteins and nucleic acids, Cambridge University Press, Cambridge, UK; Eddy, S.R. (1998) Profile hidden Markov models, Bioinformatics, 14: 755-763) modelliert werden. HMMs wurden ursprünglich zur Verwendung bei der Spracherkennung entwickelt, und sie wurden seither für einen Bereich der Signalverarbeitungsanwendungen verwendet. Ein Signal wird als eine Sequenz aus Elementen aus einer finiten Gruppe modelliert. Bei der Spracherkennung besteht diese Gruppe aus den Geräuschen, die die Sprache darstellen, und das Ziel ist es, abzuleiten, welche Worte die Geräusche darstellen. Eine Proteinsequenz aus einer bestimmten Familie kann man sich in der gleichen Weise vorstellen. Die Sequenz ist eine Reihe von Elementen aus der Gruppe von 20 Aminosäuren, und die Anforderung besteht darin, zu bestimmen, welche Proteinfamilie die Sequenz darstellen könnte.
Profil-HMMs können aus einem Mehrfach-Sequenz-Alignment ("multiple sequence alignment") bekannter Familienmitglieder konstruiert werden. Jede Position in dem Alignment entspricht einem Zustand, wobei die Zustände "übereinstimmend", "inseriert" oder "deletiert" sind. Man kann sich das gesamte Alignment daher als eine lineare Kette oder einen Pfad von Verbindungszuständen ("interconnecting states"), verbunden durch Übergangswahrscheinlichkeiten, vorstellen. Diese Zustände "ergeben" bzw. "emittieren" Aminosäurereste mit verschiedenen Wahrscheinlichkeiten (basierend auf dem Bereich von Resten, der in dem Alignment zusammen mit Substitutionsdaten und "Pseudozählungs" ("pseudocount")-Verfahren beobachtet wird – um die limitierten Daten in dem anfänglichen Alignment zu korrigieren). Die Wahrscheinlichkeit, dass eine bestimmte Sequenz mit dem Modell übereinstimmt, kann als eine Kombination der Übergangswahrscheinlichkeiten zwischen den Zuständen und den Ausgabewahrscheinlichkeiten ("emission probabilities") für diese Aminosäuresequenz berechnet werden.
Sobald ein gutes Alignment von bekannten Familienmitgliedern erhalten wurde, können HMMs mit geringer manueller Intervention (verglichen mit Profilen) konstruiert werden, und sie sind ein empfindlicheres bzw. sensitiveres Verfahren zum Detektieren von entfernten Homologen. Die Pfam-Datenbank ist eine Bibliothek von Profil-HMMs für viele Proteinfamilien (Bateman, A., Birney, E., Durbin, R., Eddy, S.R., Finn, R.D. und Sonhammer, E.L.L. (1999) Pfam 3.1 : 1313 multiple alignments and Profile HMMs match the majority of Proteins, Nucleic Acids Research, 27: 260-262). Es enthält Modelle, die aus sorgfältig editierten Seed-Aligments konstruiert wurden, und Modelle, die automatisch durch eine iterative Vorgehensweise erzeugt wurden. Diese vollständige Automatisierung des Verfahrens hat den Nachteil, dass jegliche Fehler, die gemacht werden, rasch verbreitet werden.
POLYPEPTIDVARIANTEN UND -DERIVATE
Die Begriffe "Variante" oder "Derivat" schließen in Bezug auf die hierin beschriebenen Aminosäuresequenzen jegliche Substitution, Variation, Modifikation, jeden Austausch, jede Deletion oder Addition von einer (oder mehreren) Aminosäure/n in bzw. an der Sequenz ein, vorausgesetzt, dass die resultierende Aminosäuresequenz PFI-013-Aktivität, vorzugsweise mit mindestens der gleichen Aktivität wie das in SEQ ID NO: 2 dargestellte Polypeptid, aufweist.
Die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Sequenzen können modifiziert sein. Typischerweise werden Modifikationen gemacht, die die PFI-013-Aktivität der Sequenz aufrechterhalten. Aminosäuresubstitutionen können durchgeführt werden, z.B. von 1, 2 oder 3 bis 10, 20 oder 30 Substitutionen, vorausgesetzt, dass die modifizierte Sequenz eine PFI-013-Aktivität beibehält. Aminosäuresubstitutionen können die Verwendung von nicht-natürlich auftretenden Analoga einschließen, z.B., um die Blutplasma-Halbwertszeit eines therapeutisch verabreichten Polypeptids zu erhöhen.
Konservative Substitutionen können z.B. gemäß der unten stehenden Tabelle durchgeführt werden. Aminosäuren im selben Block der zweiten Spalte und vorzugsweise in derselben Zeile in der dritten Spalte können durch einander substituiert werden:

ALIPHATISCH nicht-polar GAP

ILV

polar – ungeladen CSTM

NQ

polar – geladen DE

KR

AROMATISCH HFWY
Wie oben angegeben, werden die in der Erfindung verwendeten Proteine typischerweise durch rekombinante Mittel bzw. Rekombinationsmittel, z.B. wie hierin beschrieben, und/oder unter Verwendung von Synthesemitteln unter Verwendung von Techniken, die Fachleuten gut bekannt sind, wie Festphasensynthese, hergestellt. Varianten und Derivate derartiger Sequenzen schließen Fusionsproteine ein, wobei die Fusionsproteine mindestens die Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung umfassen, wobei diese (direkt oder indirekt) mit einer anderen Aminosäuresequenz verknüpft ist. Diese anderen Aminosäuresequenzen – welche manchmal als Fusionsproteinpartner bezeichnet werden – werden typischerweise eine vorteilhafte Funktionalität verleihen – wie z.B., um die Extraktion und Aufreinigung der Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung zu unterstützen. Beispiele für Fusionsproteinpartner schließen Glutathion-S-transferase (GST), 6 × His, GAL4 (DNA-Bindungs- und/oder Transkriptionsaktivierungsdomänen) und β-Galactosidase ein. Es kann auch zweckmäßig sein, eine Spaltstelle für Proteolyse zwischen dem Fusionsproteinpartner und der Proteinsequenz einzuschließen, so dass die Entfernung der letzteren ermöglicht wird. Vorzugsweise wird der Fusionsproteinpartner die Funktion des Proteins nicht behindern.
POLYNUCLEOTIDVARIANTEN UND -DERIVATE
Die Begriffe "Variante" oder "Derivat" schließen in Bezug auf die in der vorliegenden Erfindung verwendete Nucleotidsequenz jede Substitution, Variation, Modifikation, jeden Austausch, jede Deletion oder Addition von einer (oder mehreren) Nucleinsäure/n in bzw. an der Sequenz ein, vorausgesetzt, dass die resultierende Nucleotidsequenz für ein Polypeptid mit PFI-013-Aktivität, vorzugsweise mit mindestens der gleichen Aktivität wie die der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Sequenz, codiert.
Wie oben angegeben, besteht im Hinblick auf die Sequenzhomologie mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 75%, stärker bevorzugt mindestens 80%, stärker bevorzugt mindestens 85%, stärker bevorzugt mindestens 90%, stärker bevorzugt mindestens 95%, Homologie zu der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Nucleotidsequenz. Am stärksten bevorzugt besteht mindestens 98% Homologie zu der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Nucleotidsequenz. Nucleotidhomologievergleiche können wie oben beschrieben durchgeführt werden. Für einige Anwendungen ist ein bevorzugtes Sequenzvergleichsprogramm das oben beschriebene GCG Wisconsin Bestfit-Programm. Die voreingestellte Punkt- bzw. Scoring-Matrix hat einen Wert für eine Übereinstimmung ("match value") von 10 für jedes identische Nucleotid und von -9 für jede Fehlpaarung bzw. Nichtübereinstimmung ("mismatch"). Die voreingestellte Strafe für die Erzeugung einer Lücke ist -50 und die voreingestellte Strafe für die Erweiterung einer Lücke ist -3 für jedes Nucleotid.
Wie hierin verwendet, umfassen die Begriffe "Variante", "Homologes", "Fragment" und "Derivat" Allelvarianten der Sequenzen.
Der Begriff "Variante" umfasst auch Sequenzen, die komplementär zu den Sequenzen sind, die zur Hybridisierung an die hierin dargestellten Nucleotidsequenzen befähigt sind.
HYBRIDISIERUNG
Der Begriff "Hybridisierung", wie hierin verwendet, soll "the process by which a strand of mucleic acid joins with a complementary strand through base pairing" (das Verfahren, durch welches sich ein Nucleinsäurestrang mit einem komplementären Strang durch Basenpaarung verbindet) (Coombs, J. (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York, NY, USA) sowie das Verfahren der Amplifikation, wie es in den PCR-Technologien durchgeführt wird, wie bei Dieffenbach, C.W. und G.S. Dveksler (1995, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, USA) beschrieben, einschließen.
Die Hybridisierungsbedingungen basieren auf der Schmelztemperatur (Tm) des Nucleinsäurebindungskomplexes, wie bei Berger und Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Bd. 152, Academic Press, San Diego, CA, USA) gelehrt, und sie verleihen eine definierte "Stringenz", wie unten erklärt.
Die Stringenz der Hybridisierung bezieht sich auf die Bedingungen, unter welchen Polynucleinsäurehybride stabil sind. Derartige Bedingungen sind für Fachleute auf dem Gebiet offensichtlich. Wie es Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist, wird die Stabilität von Hybriden in der Schmelztemperatur (Tm) des Hybrids widergespiegelt, welche um etwa 1 bis 1,5°C bei jeder 1%igen Abnahme in der Sequenzhomologie abnimmt. Allgemein ist die Stabilität eines Hybrids eine Funktion der Natriumionenkonzentration und der Temperatur. Typischerweise wird die Hybridisierungsreaktion unter Bedingungen höherer Stringenz, gefolgt von Waschschritten bei variierender Stringenz, durchgeführt.
Wie hierin verwendet, bezieht sich hohe Stringenz auf Bedingungen, die nur die Hybridisierung jener Nucleinsäuresequenzen zulassen, die in 1 M Na⁺ bei 65-68°C stabile Hybride bilden.
Die maximale Stringenz tritt typischerweise bei etwa Tm-5°C (5°C unter der Tm der Sonde) auf.
Hohe Stringenz tritt bei etwa 5°C bis 10°C unter der Tm der Sonde auf. Bedingungen mit hoher Stringenz können z.B. durch Hybridisierung in einer wässrigen Lösung, enthaltend 6 × SSC, 5 × Denhardt(-Lösung), 1% SDS (Natriumdodecylsulfat), 0,1 Na⁺-Pyrophosphat und 0,1 mg/ml denaturierte Lachssperma-DNA als nicht-spezifischer Konkurrent bzw. Kompe titor, bereitgestellt werden. Nach der Hybridisierung kann das Waschen bei hoher Stringenz in mehreren Schritten mit einem finalen Waschschritt (etwa 30 min) bei der Hybridisierungstemperatur in 0,2-0,1 × SSC, 0,1% SDS durchgeführt werden.
Moderate bzw. mäßige oder mittlere Stringenz tritt typischerweise bei etwa 10°C bzw. 20°C unter der Tm der Sonde auf.
Geringe Stringenz tritt typischerweise bei etwa 20°C bis 25°C unter der Tm der Sonde auf.
Wie von Fachleuten auf dem Gebiet verstanden werden wird, kann eine Hybridisierung bei maximaler Stringenz verwendet werden, um identische Polynucleotidsequenzen zu identifizieren oder zu detektieren, während eine Hybridisierung bei mittlerer (oder geringer) Stringenz verwendet werden kann, um ähnliche oder verwandte Polynucleotidsequenzen zu identifizieren oder zu detektieren.
Mäßige Stringenz bezieht sich auf Bedingungen, die zu denjenigen der Hybridisierung in der oben beschriebenen Lösung äquivalent sind, aber eben bei etwa 60-62°C. In denn Fall wird der finale Waschschritt bei der Hybridisierungstemperatur in 1 × SSC, 0,1% SDS durchgeführt.
Geringe Stringenz bezieht sich auf Bedingungen, die zu denjenigen der Hybridisierung in der oben beschriebenen Lösung äquivalent sind, und zwar bei etwa 50-52°C. In diesem Fall wird der finale Waschschritt bei der Hybridisierungstemperatur in 2 × SSC, 0,1% SDS durchgeführt.
Es wird verstanden, dass diese Bedingungen angepasst und unter Verwendung einer Vielfalt von Puffern, z.B. Formamid-basierte Puffer, und Temperaturen dupliziert werden können. Denhardt-Lösung und SSC sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt, wie es auch andere geeignete Hybridisierungspuffer sind (siehe z.B. Sambrook et al., Hrsg., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY, USA, oder Ausubel et al., Hrsg., (1990), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.). Optimale Hybridisierungsbedingungen müssen empirisch bestimmt werden, da die Länge und der GC-Gehalt der Sonde ebenfalls eine Rolle spielen.
Polynucleotide, die zur selektiven Hybridisierung an hierin dargestellte Nucleotidsequenzen oder an deren Komplement befähigt sind, werden allgemein mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 75%, stärker bevorzugt mindestens 80%, stärker bevorzugt mindestens 85%, stärker bevorzugt mindestens 90%, stärker bevorzugt mindestens 95%, am stärksten bevorzugt mindestens 98%, homolog zu den entsprechenden hierin dargestellten Nucleotidsequenzen über einen Bereich von mindestens 20, vorzugsweise mindestens 25 oder 30, z.B. mindestens 40, 60 oder 100 oder mehr, zusammenhängenden Nucleotiden sein.
Der Begriff "selektiv hybridisierbar" bedeutet, dass das Polynucleotid, das als Sonde verwendet wird, unter Bedingungen verwendet wird, bei denen gefunden wurde, dass ein erfindungsgemäßes Zielpolynucleotid in einem Maß bzw. mit einem Level an die Sonde hybridisiert, das/der signifikant über dem Hintergrund liegt. Die Hintergrund-Hybridisierung ("background hybridization") kann auftreten, weil andere Polynucleotide vorhanden sind, z.B. in der cDNA-Bibliothek oder der Bibliothek der genomischen DNA, die durchmustert wird. Bei diesem Vorgang bedeutet Hintergrund einen Signallevel, der durch Wechselwirkung zwischen der Sonde und einem nicht-spezifischen DNA-Mitglied der Bibliothek erzeugt wird, welcher weniger als 10-mal, vorzugsweise weniger als 100-mal, so stark ist wie die spezifische Wechselwirkung, die bei der Ziel-DNA beobachtet wird. Die Intensität der Wechselwirkung kann z.B. durch radioaktives Markieren der Sonde, z.B. mit ³²P, gemessen werden.
Die vorliegende Erfindung beschreibt Nucleotidsequenzen, die an eine beliebige oder mehrere der Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung unter stringenten Bedingungen (z.B. 65°C und 0,1 × SSC {1 × SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Na₃-Citrat, pH 7,0}) hybridisieren können.
Polynucleotide, welche nicht zu 100% homolog sind, mit den hierin beschriebenen Sequenzen, können auf eine Anzahl von Weisen erhalten werden. Andere Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen können z.B. durch Screening von DNA-Bibliotheken, die aus einem Bereich von Individuen hergestellt wurden, z.B. Individuen aus unterschiedlichen Populationen, mit Sonden ("probing") erhalten werden. Zusätzlich können andere virale/bakterielle oder zelluläre Homologe, insbesondere zelluläre Homologe, die in Säugerzellen (z.B. Rinder-, Schafs-, Schweine-, Pferde-, Nager- und Primatenzellen) gefunden werden, erhalten werden, und derartige Homologe und Fragmente davon werden im Allgemeinen zur selektiven Hybridisierung an die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Sequenz befähigt sein. Derartige Sequenzen können durch Screening mittels Sonden von cDNA-Bibliotheken, die aus anderen Tierspezies hergestellt wurden, oder von Bibliotheken genomischer DNA, die von anderen Tierspezies stammen, und durch Screening mittels Sonden von solchen Bibliotheken mit Sonden, die die gesamte in SEQ ID NO: 1 gezeigte Sequenz oder einen Teil davon umfassen, unter Bedingungen von mittlerer bis hoher Stringenz erhalten werden. Ähnliche Überlegungen treffen auf das Verhalten von Spezies-Homologen und Allelvarianten der hierin dargestellten Polypeptid- oder Nucleotidsequenzen zu.
Varianten und Stamm/Spezies-Homologe können auch unter Verwendung von degenerierter PCR erhalten werden, welche Primer verwenden wird, die zum Abzielen auf Sequenzen innerhalb der Varianten und Homologen, die konservierte Aminosäuresequenzen innerhalb der hierin präsentierten Sequenzen codieren, konstruiert wurden. Konservierte Sequenzen können z.B. durch vergleichendes Anordnen ("aligning") der Aminosäuresequenzen von mehreren Varianten/Homologen vorhergesagt werden. Sequenz-Alignments können unter Verwendung von Computersoftware, die im Fachgebiet bekannt ist, durchgeführt werden. Zum Beispiel wird das GCG Wisconsin PileUp- oder das ClustalW-Programm weit verbreitet verwendet.
Die Primer, die in der degenerierten PCR verwendet werden, werden eine oder mehrere degenerierte Positionen enthalten, und sie werden bei Stringenzbedingungen verwendet werden, die geringer sind als jene, die zum Klonieren von Sequenzen mit Einzelsequenzprimern gegen bekannte Sequenzen verwendet werden.
Alternativ können derartige Polynucleotide durch ortsgerichtete Mutagenese von charakterisierten Sequenzen erhalten werden. Dies kann z.B. in dem Fall zweckmäßig sein, dass stumme Codonänderungen an den Sequenzen erforderlich sind, um die Codonbevorzugung für eine bestimmte Wirtszelle zu optimieren, in der die Polynucleotidsequenzen exprimiert werden. Andere Sequenzänderungen können gewünscht sein, um Restriktionsenzymerkennungsstellen einzuführen oder um die Eigenschaft oder Funktion der durch die Polynucleotide codierten Polypeptide zu ändern.
Polynucleotide können verwendet werden, um einen Primer, z.B. einen PCR-Primer, einen Primer für eine alternative Amplifizierungsreaktion, eine Sonde, z.B. markiert mit einer detektierbaren Markierung ("revealing label") durch konventionelle Mittel unter Verwendung von radioaktiven oder nicht-radioaktiven Markierungen, zu erzeugen, oder die Polynucleotide können in Vektoren kloniert werden. Derartige Primer, Sonden und andere Fragmente werden mindestens 15, vorzugsweise mindestens 20, z.B. mindestens 25, 30 oder 40, Nucleotide lang sein.
Polynucleotide, wie ein DNA-Polynucleotid, und Sonden können rekombinant, synthetisch oder durch jedes beliebige Mittel, das Fachleuten auf dem Gebiet zur Verfügung steht, hergestellt werden. Sie können auch mittels Standardtechniken kloniert werden.
Im Allgemeinen werden Primer durch Synthesemittel, die eine stufenweise Herstellung der gewünschten Nucleinsäuresequenz, ein Nucleotid nach dem anderen, einschließen, hergestellt werden. Techniken zum Erreichen davon unter Verwendung von automatisierten Techniken sind im Fachgebiet leicht verfügbar.
Längere Polynucleotide werden allgemein unter Verwendung von rekombinanten Mitteln bzw. Rekombinationsmitteln, z.B. unter Verwendung von PCR-Klonierungstechniken, hergestellt werden. Dieses wird das Herstellen eines Primerpaars (z.B. von etwa 15-30 Nucleotiden), die eine Region der Sequenz flankieren, die kloniert werden soll, das Inkontaktbringen der Primer mit mRNA oder cDNA, die aus einer Tier- oder humanen Zelle erhalten wurde, das Durchführen einer Polymerasekettenreaktion unter Bedingungen, die zu einer Amplifikation der gewünschten Region führen, das Isolieren des amplifizierten Fragments (z.B. durch Aufreinigen des Reaktionsgemisches in einem Agarosegel) und Gewinnen der amplifizierten DNA beinhalten. Die Primer können so konstruiert werden, dass sie geeignete Restriktionsenzymerkennungsstellen enthalten, so dass die amplifizierte DNA in einen geeigneten Klonierungsvektor kloniert werden kann.
REGULATORISCHE SEQUENZEN
Vorzugsweise ist das in der vorliegenden Erfindung verwendete Polynucleotid funktionell mit einer regulatorischen Sequenz verknüpft, welche zur Bereitstellung der Expression der codierenden Sequenz, wie durch die gewählte Wirtszelle, befähigt ist. Zum Beispiel beschreibt die vorliegende Erfindung einen Vektor, umfassend das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung in funktioneller Verknüpfung mit einer derartigen regulatorischen Sequenz, d.h. der Vektor ist ein Expressionsvektor.
Der Begriff "funktionell verknüpft" bzw. "in funktioneller Verknüpfung" bezieht sich auf eine Nebeneinanderstellung, wobei sich die beschriebenen Komponenten in einer Beziehung befinden, die es gestattet, dass sie in ihrer beabsichtigten Weise funktionieren. Eine regulatorische Sequenz, die mit einer codierenden Sequenz "funktionell verknüpft" ist, ist in einer derartigen Weise ligiert, dass die Expression der codierenden Sequenz unter einer Bedingung, die mit den Kontrollsequenzen kompatibel ist, erreicht wird.
Der Begriff "regulatorische Sequenzen" schließt Promotoren und Enhancer bzw. Verstärker und andere Expressionsregulationssignale ein.
Der Begriff "Promotor" wird im normalen Verständnis des Fachgebiets verwendet, z.B. eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle.
Eine verstärkte Expression des Polynucleotids, das das in der vorliegenden Erfindung verwendete Polypeptid codiert, kann auch durch die Auswahl von heterologen regulatorischen Regionen, z.B. Promotor-, Sekretions-Leader- und Terminator-Regionen, die dazu dienen, die Expression und, falls gewünscht, die Sekretionslevel des Proteins von Interesse aus dem gewählten Expressionswirt zu erhöhen und/oder dazu für die induzierbare Kontrolle der Expression des hierin beschriebenen Polypeptids zu sorgen, erreicht werden.
Vorzugsweise kann die in der vorliegenden Erfindung verwendete Nucleotidsequenz funktionell mit mindestens einem Promotor verknüpft sein.
Neben dem nativen Promotor des Gens, das das in der vorliegenden Erfindung verwendete Polypeptid codiert, können andere Promotoren verwendet werden, um die Expression des Polypeptids zu steuern. Der Promotor kann aufgrund seiner Effizienz beim Steuern der Expression des Polypeptids in dem gewünschten Expressionswirt ausgewählt werden.
In einer anderen Ausführungsform kann ein konstitutiver Promotor ausgewählt werden, um die Expression des gewünschten Polypeptids zu steuern. Ein derartiges Expressionskonstrukt kann zusätzliche Vorteile bieten, da es die Notwendigkeit umgeht, die Expressionswirte auf einem Medium zu kultivieren, das ein induzierendes Substrat enthält.
Beispiele geeigneter Promotoren wären LTR, SV40 und CMV in Säugersystemen, E. coli lac oder trp in Bakteriensystemen, Baculovirus-Polyhedron-Promotor (polh) in Insektensystemen und andere Promotoren, von denen bekannt ist, dass sie die Expression in eukaryotischen und prokaryotischen Zellen oder deren Viren kontrollieren.
Beispiele starker konstitutiver und/oder induzierbarer Promotoren, welche zur Verwendung in Pilzexpressionswirten bevorzugt sind, sind jene, die von den aus Pilzen stammenden Genen für Xylanase (xlnA)-, Phytase-, ATP-Synthetase-, Untereinheit 9 (oliC)-, Triosephosphatisomerase (tpi)-, Alkoholdehydrogenase (AdhA)-, α-Amylase (amy)-, Amylogucosidase (AG – aus dem glaA-Gen)-, Acetamidase (amdS)- und Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase (gpd)-Promotoren erhältlich sind.
Beispiele starker Hefepromotoren sind jene, die aus den Genen für Alkoholdehydrogenase, Lactase, 3-Phosphoglyceratkinase und Triosephosphatisomerase erhältlich sind.
Beispiele starker bakterieller Promotoren sind die α-Amylase- und SP02-Promotoren sowie Promotoren von Genen für extrazelluläre Proteasen.
Hybridpromotoren können ebenfalls verwendet werden, um die induzierbare Regulation des Expressionskonstrukts zu verbessern.
Der Promotor kann zusätzlich Merkmale einschließen, um die Expression in einem geeigneten Wirt sicherzustellen oder zu erhöhen. Zum Beispiel können die Merkmale konservierte Regionen, wie eine Pribnow-Box oder eine TATA-Box sein. Der Promotor kann sogar andere Sequenzen enthalten, um die Expressionslevel der Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung zu beeinflussen (wie aufrechtzuerhalten, zu verstärken oder zu verringern). Zum Beispiel schließen geeignete andere Sequenzen das Sh1-Intron oder ein ADH-Intron ein. Andere Sequenzen schließen induzierbare Elemente – wie Temperatur-, chemisch-, Licht- oder Stress-induzierbare Elemente – ein. Es können auch geeignete Elemente zur Verstärkung der Transkription oder Translation vorhanden sein. Ein Beispiel des letzteren Elements ist die TMV-5'-Signalsequenz (siehe Sleat, Gene, 217 [1987], 217-225; und Dawson, Plant Mol. Biol., 23 [1993], 97).
Der Expressionsvektor kann auch Sequenzen enthalten, die so auf den Promotor wirken, dass die Expression vervielfacht wird. Zum Beispiel können die SV40-, CMV- und cis-wirkende Polyom-("polyoma cis-acting") Elemente (Enhancer) und ein selektierbarer Marker ein phänotypisches Merkmal zur Selektion bereitstellen (z.B. Dihydrofolatreduktase oder Neonmycinresistenz für Säugerzellen oder Ampicillin/Tetracyclin-Resistenz für E. coli). Die Auswahl des geeigneten Vektors, der den geeigneten Promotor und Selektionsmarker enthält, liegt gut innerhalb des (Wissens-)Standes der Fachleute auf dem Gebiet.
KONSTRUKTE
Der Begriff "Konstrukt" – welcher synonym ist mit Begriffen, wie "Konjugat", "Kassette" und "Hybrid" – schließt die hierin beschriebene Sequenz, die direkt oder indirekt mit einem Promotor verknüpft ist, ein. Ein Beispiel einer indirekten Verknüpfung ist die Bereitstellung einer geeigneten Abstandsgruppe bzw. Spacer-Gruppe, wie eine Intronsequenz, wie das Sh1-Intron oder das ADH-Intron, zwischen dem Promotor und der hierin beschriebenen Nucleotidsequenz. Das Gleiche trifft für den Begriff "fusioniert" zu, welcher direkte oder indirekte Verknüpfung einschließt. In jedem Fall decken die Begriffe nicht die natürliche Kombination der für das Protein codierenden Nucleotidsequenz, die gewöhnlich mit dem Wildtyp-Genpromotor assoziiert ist, und den Fall, wenn sie beide in ihrer natürlichen Umgebung vorliegen, ab.
Das Konstrukt kann sogar einen Marker enthalten oder exprimieren, der die Selektion des genetischen Konstrukts z.B. in Säuger-, Hefe-, Insekten-, Pilz- oder Bakterienzellen ermöglicht. Verschiedene Marker liegen vor, die verwendet werden können, wie z.B. jene, die für eine Antibiotikaresistenz gegenüber G418, Hygromycin, Bleomycin, Kanamycin und Gentamycin sorgen.
VEKTOREN
Der Begriff "Vektor" schließt Expressionsvektoren und Transformationsvektoren und Shuttle-Vektoren ein.
Der Begriff "Expressionsvektor" bedeutet ein Konstrukt, das zu einer in vivo- oder in vitro-Expression befähigt ist.
Der Begriff "Transformationsvektor" bedeutet ein Konstrukt, das befähigt ist, von einer Funktionseinheit in eine andere Funktionseinheit übertragen zu werden – welche von der gleichen Spezies oder von einer davon verschiedenen Spezies stammen können. Wenn das Konstrukt befähigt ist, von einer Spezies in eine andere übertragen zu werden – wie von einem Virusvektor, wie MMLV oder FIV, an eine humane oder Säuger-Primärzelle oder -Zelllinie, dann wird der Transformationsvektor manchmal als "Shuttle-Vektor" bezeichnet.
Eine große Vielfalt von Expressionssystemen kann in verschiedenen Wirten verwendet werden. Zum Beispiel episomale, chromosomale und von Viren abgeleitete Systeme (z.B. Vektoren, die von Bakterienplasmiden, Bakteriophagen, Papovavirus, wie SV40, Vaccinia-Virus, Adenovirus und Retrovirus abgeleitet sind).
Die DNA-Sequenz kann mittels einer Vielfalt von Techniken in den Vektor inseriert werden. Im Allgemeinen wird die DNA-Sequenz an einer geeigneten Restriktionsendonucleasenstelle durch Vorgehensweisen, die im Fachgebiet bekannt sind, inseriert, und dies wird als innerhalb des Rahmens (des Kenntnisstands) von Fachleuten auf dem Gebiet angesehen. Die DNA-Sequenz in dem Expressionsvektor ist mit geeigneten Kontrollsequenzen, die die mRNA-Synthese steuern (d.h. der Promotor), funktionell verknüpft.
Die Vektoren können in eine geeignete Wirtszelle, wie unten beschrieben, transformiert werden, um für die Expression eines Polypeptids zu sorgen. Somit beschreibt die Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zum Herstellen von Polypeptiden, welches das Kultivieren einer Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor, wie oben beschrieben, transformiert oder transfiziert wurde, und zwar unter Bedingungen zur Bereitstellung der Expression durch den Vektor von einer codierenden Sequenz, die die Polypeptide codiert, und das Gewinnen der exprimierten Polypeptide umfasst.
Die Vektoren können z.B. Plasmid-, Virus- oder Baktiophagen (Phagen)-Vektoren sein, die mit einem Replikationsstartpunkt, gegebenenfalls einem Promotor zur Expression des Polynucleotids und gegebenenfalls einem Regulator des Promotors ausgestattet sind.
Die Vektoren können ein oder mehrere selektierbare Markergene enthalten. Die geeignetsten Selektionssysteme für industrielle Mikroorganismen sind jene, die durch die Gruppe der Selektionsmarker gebildet werden, die keine Mutation in dem Wirtsorganismus erfordern. Beispiele pilzlicher Selektionsmarker sind die Gene für Acetamidase (amdS), ATP-Synthetase, Untereinheit 9 (oliC), Orotidin-5'-phosphatdecarboxylase (pvrA), Phleomycin- und Benomylresistenz (benA). Beispiele nicht-pilzlicher Selektionsmarker sind das bakterielle G418-Resistenz-Gen (dies kann auch in Säugerzellen, Hefe, aber nicht in Fadenpilzen, verwendet werden), das Ampicillinresistenz-Gen (E. coli), das Neomycinresistenz-Gen (Säugerzellen) und das E. coli uidA-Gen, das für β-Glucuronidase (GUS) codiert.
Die Vektoren können in vitro, z.B. zur Produktion von RNA, verwendet werden, oder sie können verwendet werden, um eine Wirtszelle zu transfizieren oder zu transformieren.
Somit können die Polynucleotide in einen rekombinanten Vektor (typischerweise einen replizierbaren Vektor), z.B. einen Klonierungs- oder Expressionsvektor, inkorporiert werden. Der Vektor kann verwendet werden, um die Nucleinsäure in einer kompatiblen Wirtszelle zu replizieren. Somit beschreibt die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen von Polynucleotiden durch Einführen eines Polynucleotids in einen replizierbaren Vektor, Einführen des Vektors in eine kompatible Wirtszelle und Wachsen lassen der Wirtszelle unter Bedingungen, welche zur Replikation des Vektors führen. Der Vektor kann aus der Wirtszelle gewonnen werden. Geeignete Wirtszellen werden unten in Verbindung mit den Expressionsvektoren beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von genetisch manipulierten Wirtszellen, die ein PFI-013-Polypeptid exprimieren, in Screening-Verfahren zur Identifizierung von Modulatoren (z.B. Antagonisten oder Agonisten) von PFI-013. Derartige genetisch manipulierte Wirtszellen könnten verwendet werden, um Peptidbibliotheken oder organische Moleküle, die zur Modulation der PFI-013-Aktivität befähigt sind, zu durchmustern. Modulatoren (z.B. Antagonisten) des PFI-013-Polypeptids, wie Antikörper, Peptide oder kleine organische Moleküle, werden die Basis für pharmazeutische Zusammensetzungen zur Behandlung von Erkrankungen, die mit, z.B., PFI-013 assoziiert sind, bereitstellen. Derartige Modulatoren (z.B. Antagonisten) können allein oder in Kombination mit anderen Therapeutika zur Behandlung derartiger Erkrankungen verabreicht werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Expressionsvektoren und Wirtszellen, die Polynucleotidsequenzen umfassen, die PFI-013 codieren, um ein Screening im Hinblick auf Mittel durchzuführen, die die PFI-013-Expression oder -Aktivität beeinflussen können.
GEWEBE
Der Begriff "Gewebe", wie hierin verwendet, schließt Gewebe per se und Organe ein.
WIRTSZELLEN
Der Begriff "Wirtszelle" – in Bezug auf die vorliegende Erfindung – schließt jede beliebige Zelle ein, die eine Nucleotidsequenz umfassen könnte, die für das in der vorliegenden Erfindung beschriebene rekombinante Protein und/oder davon erhaltene Produkte codiert, wobei ein Promotor die Expression der Polynucleotidsequenz bei Vorhandensein in der Wirtszelle ermöglichen kann.
Die vorliegende Erfindung beschreibt weiterhin Wirtszellen, die mit einem Polynucleotid transformiert oder transfiziert wurden. Vorzugsweise wird das Polynucleotid in einem Vektor zur Replikation und Expression des Polynucleotids geführt. Die Zellen werden so ausgewählt werden, dass sie mit dem Vektor kompatibel sind, und sie können z.B. prokaryotisch (z.B. Bakterienzellen) oder eukaryotisch (d.h. Säuger-, Pilz-, Insekten- und Hefezellen) sein.
Die Einführung von Polynucleotiden in Wirtszellen kann durch Verfahren bewirkt werden, wie sie in Sambrook et al., Hrsg., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY, USA, beschrieben sind. Diese Verfahren schließen ohne Einschränkung darauf Calciumphosphattransfektion, DEAE-Dextranvermittelte Transfektion, kationisches Lipid-vermittelte Transfektion, Elektroporation, Transvektion ("transvection"), Mikroinjektion, Transduktion, "Scrape Loading" und ballistische Einführung ein.
Beispiele repräsentativer Wirte schließen Bakterienzellen (z.B. E. coli, Streptomyces), Pilzzellen, wie Hefezellen und Aspergillus, Insektenzellen, wie Drosophila S2- und Spodoptera SF9-Zellen, tierische Zellen, wie CHO-, COS-, HEK-, HeLa- und 3T3-Zellen ein. Die Auswahl bzw. Selektion des geeigneten Wirts wird als innerhalb des Rahmens (des Kenntnisstands) von Fachleuten auf dem Gebiet erachtet.
In Abhängigkeit von der Beschaffenheit des Polynucleotids, das das hierin beschriebene Polypeptid codiert, und/oder der Erwünschtheit von weiterer Prozessierung des exprimierten Proteins können eukaryotische Wirte, wie Hefen oder andere Pilze, bevorzugt sein. Im Allgemeinen sind Hefezellen gegenüber Pilzzellen bevorzugt, weil sie leichter zu manipulieren sind. Jedoch werden einige Proteine in der Hefezelle nur schlecht exprimiert oder daraus sekretiert oder sie werden in einigen Fällen nicht richtig prozessiert (z.B. Hyperglycosylierung in Hefe). In diesen Fällen sollte ein davon verschiedener Pilzwirtsorganismus gewählt werden.
Beispiele geeigneter Expressionswirte zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind Pilze, wie Aspergillus-Spezies (wie jene, die in EP-A-0 184 438 und EP-A-0 284 603 beschrieben sind) und Trichoderma- Spezi es, Bakterien, wie Escherichia-Spezies, Streptomyces-Spezies und Pseudomonas-Spezies, und Hefen, wie Kluyveromyces-Spezies (wie jene, die in EP-A-0 096 430 und EP-A-0 301 670 beschrieben sind) und Saccharomyces-Spezies. Beispielsweise können typische Expressionswirte ausgewählt sein aus Aspergillus niger, Aspergillus niger var. tubigenis, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus aculeatis, Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae ("orvzae"), Trichoderma reesei, Kluyveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris und Saccharomyces cerevisiae.
Die Verwendung geeigneter Wirtszellen – wie Säuger-, Hefe-, Insekten- und Pilzwirtszellen – kann für post-translationale Modifikationen (z.B. Myristoylierung, Glycosylierung, Verkürzung, Lipidierung ("lapidation") und Tyrosin-, Serin- oder Threoninphosphorylierung) sorgen, wie es möglicherweise erforderlich ist, um den hierin beschriebenen rekombinanten Expressionsprodukten eine optimale biologische Aktivität zu verleihen.
ORGANISMUS
Der Begriff "Organismus" schließt jeglichen Organismus mit Ausnahme des Menschen ein, der die Nucleotidsequenz, die für das hierin beschriebene rekombinante Protein und/oder davon erhaltene Produkte codiert, umfassen könnte, wobei ein Promotor die Expression der hierin beschriebenen Nucleotidsequenz bei Vorhandensein in dem Organismus ermöglichen kann. Beispiele für Organismen können einen Pilz, eine Hefe oder einen Protozoen einschließen.
Der Begriff "transgener Organismus" schließt jeden beliebigen Organismus mit Ausnahme des Menschen ein, der die Nucleotidsequenz, die für das hierin beschriebene Protein und/oder davon erhaltene Produkte codiert, umfasst, wobei der Promotor die Expression der hierin beschriebenen Nucleotidsequenz innerhalb des Organismus ermöglichen kann. Vorzugsweise ist die Nucleotidsequenz in das Genom des Organismus inkorporiert.
Der Begriff "transgener Organismus" deckt nicht die native codierende Nucleotidsequenz in ihrer natürlichen Umgebung ab, wenn sie unter der Kontrolle ihres nativen Promotors steht, der ebenfalls in seiner natürlichen Umgebung vorliegt. Zusätzlich deckt die vorliegende Erfindung nicht das native Protein ab, wenn es in seiner natürlichen Umgebung vorliegt und wenn es durch seine native codierende Nucleotidsequenz codiert wurde, die ebenfalls in ihrer natürlichen Umgebung vorliegt, und wenn diese Nucleotidsequenz unter der Kontrolle ihres nativen Promotors steht, der ebenfalls in seiner natürlichen Umgebung vorliegt.
Daher schließt der hierin beschriebene transgene Organismus einen Organismus ein, der ein Beliebiges von oder Kombinationen von der Nucleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenz codiert, Konstrukten, Vektoren, Plasmiden, Zellen und Geweben oder den Produkten davon, die hierin beschrieben sind, umfasst. Die transformierte Zelle oder der transformierte Organismus könnte annehmbare Mengen der gewünschten Verbindung herstellen, welche leicht aus der Zelle oder dem Organismus gewinnbar wären.
TRANSFORMATION DER WIRTSZELLEN/WIRTSORGANISMEN
Wie zuvor angegeben, kann der Wirtsorganismus ein prokaryotischer oder ein eukaryotischer Organismus sein. Ein Beispiel eines geeigneten prokaryotischen Wirts ist E. coli. Die Lehren zur Transformation von prokaryotischen Wirten sind im Fachgebiet gut dokumentiert, siehe z.B. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY, USA) und Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.).
In einem bevorzugten Beispiel ist der transformierte Wirt eine Säugerzelle oder z.B. eine Insektenzelle, wobei die Einführung der Polynucleotide in diese Wirtszellen durch Verfahren bewirkt werden kann, wie sie z.B. in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY, USA) beschrieben sind. Diese Verfahren schließen ohne Einschränkung darauf Calciumphosphattransfektion, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, kationisches Lipid-vermittelte Transfektion, Elektroporation, Transvektion, Mikroinjektion, Transduktion, "Scrape Loading" und ballistische Einführung ein.
In einem anderen Beispiel kann der transgene Organismus eine Hefe sein. In diesem Zusammenhang wurde Hefe weithin als Vehikel zur heterologen Genexpression verwendet. Die Spezies Saccharomyces cerevisiae hat eine lange Geschichte industrieller Verwendung, einschließlich ihrer Verwendung zur heterologen Genexpression. Die Expression von heterologen Genen in Saccharomyces cerevisiae wurde von Goodey et al. (1987, Yeast Biotechnology, D.R. Berry et al., Hrsg. S. 401-429, Allen and Unwin, London) und von King et al. (1989, Molecular and Cell Biology of Yeasts, E.F. Walton und G.T. Yarronton, Hrsg., S. 107-133, Blackie, Glasgow) übersichtsartig zusammengefasst.
Aus mehreren Gründen ist Saccharomyces cerevisiae zur heterologen Genexpression gut geeignet. Erstens ist er für Menschen nicht pathogen, und er ist nicht zur Produktion bestimmter Endotoxine befähigt. Zweitens weist er eine lange Geschichte sicherer Verwendung nach Jahrhunderten kommerzieller Nutzung für verschiedene Zwecke auf. Dies führte zu einer breiten öffentlichen Akzeptanz. Drittens resultierte die ausgedehnte kommerzielle Verwendung und die ausgedehnte Forschung, die dem Organismus gewidmet wurde, in einer Fülle an Wissen über die Genetik und Physiologie sowie über Kenndaten zur Fermentation von Saccharomyces cerevisiae in großem Maßstab.
Ein Literaturüberblick über die Prinzipien der heterologen Genexpression in Saccharomyces cerevisiae und die Sekretion der Genprodukte wird von E. Hinchcliffe und E. Kenny ("Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", 1993, Yeasts, Bd. 5, Anthony H. Rose und J. Stuart Harrison, Hrsg., 2. Auflage, Academic Press Ltd.) gegeben.
Mehrere Typen von Hefevektoren sind verfügbar, einschließlich Integrationsvektoren, welche die Rekombination mit dem Wirtsgenom zu ihrer Erhaltung benötigen, und autonom replizierende Plasmidvektoren.
Um die transgenen Saccharomyces herzustellen, werden Expressionskonstrukte durch Inserieren von Nucleotidsequenzen in ein Konstrukt hergestellt, das zur Expression in Hefe konstruiert wurde. Mehrere Typen von Konstrukten, die zur heterologen Expression verwendet werden, wurden entwickelt. Die Konstrukte enthalten einen Promotor, der in Hefe aktiv ist, fusioniert mit der Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung; gewöhnlich wird ein Promotor mit Hefeursprung, wie der GAL1-Promotor, verwendet. Gewöhnlich wird eine Signalsequenz mit Hefeursprung, wie die Sequenz, die das SUC2-Signalpeptid codiert, verwendet. Ein Terminator, der in Hefen aktiv ist, beendet das Expressionssystem.
Zur Transformation von Hefe wurden mehrere Transformationsprotokolle entwickelt. Zum Beispiel kann ein transgener Saccharomyces durch Befolgen der Lehren von Hinnen et al. (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 75: 1929); Beggs, J.D. (1978, Nature, London, 275:104); und Ito, H. et al. (1983, J. Bacteriology, 153:163-168) hergestellt werden.
Die transformierten Hefezellen werden unter Verwendung verschiedener selektiver Marker selektiert bzw. ausgewählt. Unter den zur Transformation verwendeten Markern sind eine Anzahl von Auxotrophiemarkern, wie LEU2, HIS4 und TRP1, und dominante Antibiotikaresistenzmarker, wie Aminoglycosidantibiotikamarker, z. B. G418.
Somit beschreibt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zum Transformieren einer Wirtszelle mit einer in SEQ ID NO: 1 gezeigten Nucleotidsequenz oder einem Derivat, Homologen, einer Variante, einem Analogon oder Fragment davon.
Wirtszellen, die mit einer PFI-013-codierenden Nucleotidsequenz transformiert sind, können unter Bedingungen kultiviert werden, die zur Expression und Gewinnung des codierten Proteins (in den Zellmembranen) aus der Zellkultur geeignet sind. Das durch eine rekombinante Zelle produzierte Protein kann in Abhängigkeit von der verwendeten Sequenz und/oder dem verwendeten Vektor auf der Zelloberfläche exprimiert werden, sekretiert werden, oder es kann intrazellulär enthalten sein. Wie von Fachleuten auf dem Gebiet verstanden werden wird, werden Expressionsvektoren, die PFI-013-codierende Sequenzen enthalten, allgemein die Expression in der Zellmembran ermöglichen. Andere rekombinante Konstruktionen können die PFI-013-codierende Sequenz mit einer Nucleotidsequenz verbinden, die eine Polypeptiddomäne codiert, welche die Proteinaufreinigung/Identifizierung ermöglichen bzw. erleichtern wird (Kroll, D.J. et al. (1993), DNA Cell Biol., Bd. 12, S. 441-53, siehe auch obige Diskussion von Vektoren, die Fusionsproteine enthalten).
GENETISCH MANIPULIERT BZW: GENTECHNISCH VERÄNDERT ODER GENETISCH MODIFIZIERT
Eine Zelle, vorzugsweise eine tierische Zelle, die "genetisch modifiziert" ist, ist heterozygot oder homozygot für eine Modifikation, die in die Zelle oder eine Vorläuferzelle, Genmanipulation bzw. gentechnisch eingeführt wird. Die Standardverfahren zur Genmanipulation, die zum Einführen der Modifikation verfügbar sind, schließen homologe Rekombination, Gene-Trapping mittels viralem Vektor ("viral vector gene trapping"), Bestrahlung, chemische Mutagenese und die transgene Expression einer Nucleotidsequenz ein, die Antisense-RNA allein oder in Kombination mit katalytischen Ribozymen codiert. Bevorzugte Verfahren zur genetischen Modifikation sind homologe Rekombination und Gene-Trapping mittels viralem Vektor, welche beide ein endogenes Gen durch Inserieren einer fremden Nucleinsäuresequenz in den Genlokus modifizieren. Eine Nucleinsäuresequenz, die bezüglich des Gens fremd ist, ist eine exogene Sequenz, die nicht-natürlich in dem Gen auftritt. Diese Insertion von Fremd-DNA kann innerhalb jeder beliebigen Region des PFI-013-Gens, z.B. in einem Enhancer, Promotor, einer regulatorischen Region, einer nicht-codierenden Region, einer codierenden Region, einem Intron oder einem Exon, auftreten. Das am stärksten bevorzugte Verfahren zur Genmanipulation bzw. genetischen Manipulation ist die homologe Rekombination, bei welcher die fremde Nucleinsäuresequenz in einer gezielten Weise entweder allein oder in Kombination mit einer Deletion eines Teils der endogenen Gensequenz inseriert wird.
FUNKTIONELL UNTERBROCHEN ("FUNCTIONALLY DISRUPTED")
Mit einem PFI-013-Gen, das "funktionell unterbrochen" ist, ist ein PFI-013-Gen gemeint, das genetisch derart modifiziert ist, dass die zelluläre Aktivität des PFI-013-Polypeptids, das durch das unterbrochene Gen codiert wird, in Zellen, die normalerweise die Wildtyp-Version des PFI-013-Gens exprimieren, vermindert ist. Wenn die genetische Modifikation wirksam alle Wildtyp-Kopien des PFI-013-Gens in einer Zelle (z.B. ist die genetisch modifizierte Zelle, vorzugsweise eine tierische Zelle, homozygot für die PFI-013-Genunterbrechung bzw. -Gendisruption oder die einzige Wildtyp-Kopie des PFI-013-Gens, die ursprünglich vorhanden war, ist nun unterbrochen) eliminiert, dann resultiert die genetische Modifikation in einer Verringerung der PFI-013-Polypeptidaktivität (d.h. verringerte Rezeptorexpression) im Vergleich zu einer geeigneten Kontrollzelle, die das Wildtyp-PFI-013-Gen exprimiert. Diese Verringerung bei der PFI-013-Polypeptidaktivität (d.h. verringerte Rezeptorexpression) resultiert entweder aus einer verringerten PFI-013-Genexpression (d.h. die PFI-013-mRNA-Spiegel werden wirksam verringert und erzeugen verringerte Spiegel des PFI-013-Polypeptids) und/oder weil das unterbrochene PFI-013-Gen ein mutiertes Polypeptid mit verringerter Funktion oder Stabilität im Vergleich zu einem Wildtyp-PFI-013-Polypeptid codiert. Vorzugsweise ist die Aktivität (d.h. verringerte Rezeptorexpression) des PFI-013-Polypeptids in der genetisch modifizierten Zelle auf 50% oder weniger des Wildtyp-Niveaus, stärker bevorzugt auf 25% oder weniger und noch stärker bevorzugt auf 10% oder weniger des Wildtyp-Niveaus, verringert. Am stärksten bevorzugt resultiert die PFI-013-Genunterbrechung in einer Null-Mutation ("null mutation").
GENETISCH MODIFIZIERTE TIERZELLE BZW. TIERISCHE ZELLE
Mit einer "genetisch modifizierten tierischen Zelle", die ein funktionell unterbrochenes PFI-013-Gen enthält, ist eine tierische Zelle, einschließlich einer menschlichen Zelle, gemeint, die durch genetische Manipulation erzeugt wurde, so dass sie ein funktionell unterbrochenes PFI-013-Gen enthält, sowie Tochterzellen, die das unterbrochene PFI-013-Gen erben. Diese Zellen können gemäß einem beliebigen Standardverfahren, das im Fachgebiet bekannt ist, in Kultur genetisch modifiziert werden. Als eine Alternative zur genetischen Modifikation der Zellen in Kultur können nicht-humane Säugerzellen aus einem genetisch modifizierten, nicht-humanen Säuger, der eine PFI-013-Genunterbrechung enthält, isoliert werden. Tierische Zellen können von einer Primärzelle oder aus Gewebepräparationen sowie aus Kultur-adaptierten, tumorigenen oder transformierten Zelllinien erhalten werden. Diese Zellen und Zelllinien sind z.B. von Endothelzellen, Epithelzellen, Inseln ("islets"), Neuronen und anderen Zellen, die aus Nervengewebe stammen, mesothelialen Zellen, Osteozyten, Lymphozyten, Chondrozyten, hämatopoetischen Zellen, Immunzellen, Zellen der Hauptdrüsen bzw. großen Drüsen oder Organe (z.B. Leber, Lunge, Herz, Magen, Pankreas, Niere und Haut), Muskelzellen (einschließlich Zellen aus Skelettmuskel, glattem Muskel und Herzmuskel), exokrinen oder endokrinen Zellen, Fibroblasten und embryonalen und anderen totipotenten oder pluripotenten Stammzellen (z.B. embryonale Stamm (ES)-Zellen, ES-artige Zellen und embryonale Keimlinien ("embryonic germline") (EG)-Zellen und andere Stammzellen, wie Vorläuferzellen und aus Geweben stammende Stammzellen) abgeleitet. Die bevorzugten genetisch modifizierten Zellen sind ES-Zellen, stärker bevorzugt Maus- oder Ratten-ES-Zellen und am stärksten bevorzugt humane ES-Zellen.
Eine "Homologieregion", die in einem Targeting-Vektor zur homologen Rekombination mit einem PFI-013-Gen verwendet wird, steht in Bezug (d.h. ist komplementär) zu einem Teil des PFI-013-Gens oder einer Sequenz, die das PFI-013-Gen flankiert, und zwar in einem Ausmaß, das ausreichend ist, um das Auftreten der Hybridisierung zwischen der Homologieregion und der PFI-013-Gensequenz unter Standardbedingungen für geringe Stringenz, die im Fachgebiet bekannt sind (z.B. wie in Current Protocols in Human Genetics, Einheit 4.1, John Wiley & Sons, New York, NY, 2000, beschrieben), zu ermöglichen.
Mit einer "ES-Zelle" oder einer "ES-artigen Zelle" ist eine pluripotente Stammzelle gemeint, die von einem Embryo, aus einer primordialen Keimzelle oder aus einem Teratokarzinom stammt, die zur unbegrenzten Selbsterneuerung sowie zur Differenzierung in Zelltypen, die für alle drei embryonalen Keimblätter repräsentativ sind, befähigt ist.
Mit "verringert" ist eine statistisch signifikante Abnahme (d.h. p < 0,1) gemeint.
Die genetisch modifizierten tierischen Zellen, einschließlich humaner Zellen, sind heterozygot oder homozygot für eine Modifikation, die das PFI-013-Gen funktionell unterbricht. Die tierischen Zellen können durch Genmanipulation von Zellen in Kultur erhalten bzw. abgeleitet ("derived") werden, oder im Fall von nicht-humanen Säugerzellen können die Zellen aus genetisch modifizierten nicht-humanen Säugern isoliert werden.
Der PFI-013-Genlokus bzw. Genort wird durch eine oder mehrere Techniken zur genetischen Modifikation, die im Fachgebiet bekannt sind, einschließlich chemischer Mutagenese (Rinchik, Trends in Genetics, 7: 15-21, 1991, Russell, Environmental & Molecular Mutagenesis, 23 (Suppl. 24), 23-29, 1994), Bestrahlung (Russell, supra), transgener Expression von Antisense-RNA des PFI-013-Gens, entweder allein oder in Kombination mit einer katalytischen RNA-Ribozymsequenz (Luyckx et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 96: 1274-79, 1999; Sokol et al., Transgenic Research, 5: 363-71, 1996; Efrat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 2051-55, 1994; Larsson et al., Nucleic Acids Research, 22: 2242-48, 1994), funktionell unterbrochen und, wie unten weiter diskutiert, durch die Unterbrechung des PFI-013-Gens mittels Insertion einer fremden Nucleinsäuresequenz in den PFI-013-Genlokus. Vorzugsweise wird die fremde Sequenz durch homologe Rekombination oder durch die Insertion eines viralen Vektors inseriert. Am stärksten bevorzugt ist das Verfahren zur PFI-013-Genunterbrechung die homologe Rekombination, und es schließt eine Deletion eines Teils der endogenen PFI-013-Gensequenz ein.
Die Integration einer fremden Sequenz unterbricht das PFI-013-Gen durch einen oder mehrere der folgenden Mechanismen funktionell: durch Beeinträchtigen des PFI-013-Gentranskriptions- oder -translationsprozesses (z.B. durch Beeinträchtigen der Promotorerkennung oder durch Einführen einer Transkriptionsterminationsstelle oder eines Translations-Stopcodons in das PFI-013-Gen); oder durch Deformieren der PFI-013-Gen-codierenden Sequenz, so dass sie nicht länger ein PFI-013-Polypeptid mit normaler Rezeptorfunktion codiert (z.B. durch Inserieren einer fremden codierenden Sequenz in die PFI-013-Gen-codierende Sequenz, durch Einführen einer Rasterverschiebungsmutation oder von Substitution einer/Aminosäure(n) oder im Fall eines doppelten Crossing-over-Ereignisses durch Deletieren eines Teils der PFI-013-Gen-codierenden Sequenz, der für die Expression eines funktionellen Rezeptorproteins erforderlich ist).
Um eine Fremdsequenz in einen PFI-013-Genlokus im Genom einer Zelle zu inserieren, wird die fremde DNA-Sequenz gemäß einem Standardverfahren, das im Fachgebiet bekannt ist, wie Elektroporation, Calciumphosphatpräzipitation, retrovirale Infektion, Mikroinjektion, Biolistik, Liposomentransfektion, DEAE-Dextran-Transfektion oder Transferrinfektion (siehe z.B. Neumann et al., EMBO J., 1: 841-845, 1982; Potter et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81: 7161-65, 1984; Chu et al., Nucleic Acids Res., 15: 1311-26, 1987; Thomas und Capecchi, Cell, 51: 503-12, 1987; Baum et al., Biotechniques, 17: 1058-62, 1994; Biewenga et al., J. Neuroscience Methods, 71: 67-75, 1997; Zhang et al., Biotechniques, 15: 868-72, 1993; Ray und Gage, Biotechniques, 13: 598-603, 1992; Lo, Mol. Cell. Biol., 3: 1803-14, 1983; Nickoloff et al., Mol. Biotech., 10: 93-101, 1998; Linney et al., Dev. Biol. (Orlando), 213: 207-16, 1999; Zimmer und Gruss, Nature, 338: 150-153, 1989; und Robertson et al., Nature, 323: 445-48, 1986), in die Zelle eingeführt. Das bevorzugte Verfahren zum Einführen von Fremd-DNA in eine Zelle ist Elektroporation.
Homologe Rekombination
Das Verfahren der homologen Rekombination zielt bezüglich der Unterbrechung bzw. Disruption auf das PFI-013-Gen ab, indem ein PFI-013-Gen-Targeting-Vektor in eine Zelle eingeführt wird, die ein PFI-013-Gen enthält. Die Fähigkeit des Vektors, zur Unterbrechung bzw. Disruption auf das PFI-013-Gen abzuzielen, stammt aus der Verwendung der Nucleotidsequenz in dem Vektor, die homolog zu dem PFI-013-Gen ist. Diese Homologieregion erleichtert bzw. ermöglicht die Hybridisierung zwischen dem Vektor und der endogenen Sequenz des PFI-013-Gens. Bei Hybridisierung erhöht sich die Wahrscheinlichkeit eines Crossing-over-Ereignisses zwischen dem Targeting-Vektor und den genomischen Sequenzen stark. Dieses Crossing-over-Ereignis resultiert in der Integration der Vektorsequenz in den PFI-013-Genlokus und der funktionalen Unterbrechung bzw. Disruption des PFI-013-Gens.
Allgemeine Prinzipien hinsichtlich der Konstruktion von Vektoren, die zum Targeting verwendet werden, werden als Übersicht bei Bradley et al. (Biotechnol., 10: 534, 1992) dargestellt. Zwei verschiedene exemplarische Vektortypen können verwendet werden, um DNA mittels homologer Rekombination zu inserieren: ein Insertionsvektor oder ein Substitutionsvektor. Ein Insertionsvektor ist eine ringförmige DNA, welche eine Region mit PFI-013- Genhomologie mit einem Doppelstrangbruch enthält. Nach der Hybridisierung zwischen der Homologieregion und dem endogenen PFI-013-Gen resultiert ein einzelnes Crossing-over-Ereignis an dem Doppelstrangbruch in der Insertion der gesamten Vektorsequenz in das endogene Gen an dem Ort des Crossing-over.
Der am stärksten bevorzugte Vektor zur Verwendung für eine homologe Rekombination ist ein Substitutionsvektor, welcher eher colinear ("colinear") als ringförmig ist. Die Substitutionsvektorintegration in das PFI-013-Gen erfordert ein Doppel-Crossing-over-Ereignis, d.h. ein Crossing-over an zwei Orten der Hybridisierung zwischen dem Targeting-Vektor und dem PFI-013-Gen. Dieses Doppel-Crossing-over-Ereignis resultiert in der Integration der Vektorsequenz, die zwischen den zwei Orten des Crossing-over in dem PFI-013-Gen liegt ("sandwiched"), und der Deletion der entsprechenden endogenen PFI-013-Gensequenz, die sich ursprünglich zwischen den zwei Orten des Crossing-over erstreckte (siehe z.B. Thomas und Capecchi et al., Cell, 51: 503-12, 1987; Mansour et al., Nature, 336: 348-52, 1988; Mansour et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 7688-7692, 1990; und Mansour, GATA, 7: 219-227, 1990).
Ein Homologiebereich in einem Targeting-Vektor ist allgemein mindestens 100 Nucleotide lang. Am stärksten bevorzugt ist eine Homologieregion mindestens 1-5 Kilobasen (Kb) lang. Obwohl es weder eine gezeigte minimale Länge noch einen minimalen Grad an Verwandtschaft gibt, die/der für eine Homologieregion erforderlich ist, korrespondiert die Targeting-Effizienz für eine homologe Rekombination allgemein mit der Länge und dem Grad der Verwandtschaft zwischen dem Targeting-Vektor und dem PFI-013-Genlokus. In dem Fall, in dem ein Substitutionsvektor verwendet wird und ein Teil des endogenen PFI-013-Gens bei der homologen Rekombination deletiert wird, ist eine zusätzliche Überlegung die Größe des deletierten Teils des endogenen PFI-013-Gens. Wenn dieser Teil des endogenen PFI-013-Gens größer als 1 Kb lang ist, dann wird eine Targeting-Kassette mit Homologieregionen, die länger als 1 Kb sind, empfohlen, um die Rekombinationseffizienz zu erhöhen. Weitere Richtlinien hinsichtlich der Auswahl und Verwendung von Sequenzen, die bei der homologen Rekombination effektiv sind, werden in der Literatur beschrieben (siehe z.B. Deng und Capecchi, Mol. Cell. Biol., 12: 3365-3371, 1992; Bollag et al., Annu. Rev. Genet., 23: 199-225, 1989; und Waldman und Liskay, Mol. Cell. Biol., 8: 5350-5357, 1988).
Eine breite Vielfalt von Klonierungsvektoren kann als Vektorgerüste bei der Konstruktion von PFI-013-Gen-Targeting-Vektoren verwendet werden, einschließlich pBlue script-verwandter Plasmide (z.B. Bluescript KS + 11), pQE70, pQE60, pQE-9, pBS, pD10, Phagescript, phiX174, pBK-Phagemid, pNH8A, pNH16a, pNH18Z, pNH46A, ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 und pRIT5-PWLNEO, pSV2CAT, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, PBPV, PMSG und pSVL, pBR322 und pBR322-basierter Vektoren, pBM9, pBR325, pKH47, pBR328, pHC79, Phage Charon 28, pKB11, pKSV-10, pK19-verwandter Plasmide, pUC-Plasmide und der pGEM-Reihe von Plasmiden. Diese Vektoren sind aus einer Vielzahl kommerzieller Quellen erhältlich (z.B. Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN; Qiagen, Valencia, CA; Stratagene, La Jolla, CA; Promega, Madison, WI; und New England Biolabs, Beverly, MA). Jedoch können beliebige andere Vektoren, z.B. Plasmide, Viren oder Teile davon, verwendet werden, solange sie in dem gewünschten Wirt replizierbar und lebensfähig sind. Der Vektor kann auch Sequenzen umfassen, die ihn befähigen, sich in dem Wirt zu replizieren, dessen Genom modifiziert werden soll. Die Verwendung eines anderen Vektors kann die Wechselwirkungsdauer, während derer die Rekombination auftreten kann, verlängern, was die Effizienz des Targetings erhöht (siehe Molecular Biology, Hrsg. Ausubel et al., Einheit 9.16, 9.16.1).
Der spezielle Wirt, der zum Propagieren bzw. Vermehren der oben beschriebenen Targeting-Vektoren eingesetzt wird, ist nicht entscheidend. Beispiele schließen E. coli K12 RR1 (Bolivar et al., Gene 2: 95, 1977), E. coli K12 HB101 (ATCC-Nr. 33694), E. coli MM21 (ATCC-Nr. 336780), E. coli DH1 (ATCC-Nr. 33849), den E. coli-Stamm DH5α und E. coli STBL2 ein. Alternativ können Wirte, wie Saccharomyces cerevisiae, verwendet werden. Die oben genannten Wirte sind kommerziell verfügbar (z.B. Stratagene, La Jolla, CA; und Life Technologies, Rockville, MD).
Um einen Targeting-Vektor zu erzeugen, wird ein PFI-013-Gen-Targeting-Konstrukt zu einem oben beschriebenen Vektorgerüst hinzugefügt. Die oben beschriebenen PFI-013-Gen-Targeting-Konstrukte haben mindestens eine Region mit PFI-013-Gen-Homologie. Um die Regionen mit PFI-013-Gen-Homologie herzustellen, wird eine mit dem PFI-013-Gen verwandte Sequenz als Basis zum Produzieren von Polymerasekettenreaktion (PCR)-Primern verwendet. Diese Primer werden verwendet, um die gewünschte Region der PFI-013-Sequenz mittels PCR-Amplifikation mit hoher Genauigkeit ("high fidelity PCR amplification") zu amplifizieren (Mattila et al., Nucleic Acids Res., 19: 4967, 1991; Eckert und Kunkel, 1: 17, 1991; und US-Patent Nr. 4,683,202 ). Die genomische Sequenz wird aus seiner Bibliothek von genomischen Klonen oder aus einer Präparation genomischer DNA, vorzugsweise aus der Tierspezies, auf die hinsichtlich der PFI-013-Gendisruption abgezielt werden soll, erhalten.
Vorzugsweise schließen die oben beschriebenen Targeting-Konstrukte eine exogene Nucleotidsequenz ein, die ein Positivmarker-Protein codiert. Die stabile Expression eines Positivmarkers nach Vektorintegration verleiht der Zelle ein identifizierbares Kennzeichen bzw. Charakteristikum ohne die Zelllebensfähigkeit zu beeinträchtigen. Daher wird im Fall eines Substitutionsvektors das Markergen zwischen zwei flankierenden Homologieregionen positioniert, so dass es sich nach dem Doppel-Crossing-over-Ereignis in das PFI-013-Gen integriert.
Es ist bevorzugt, dass das Positivmarker-Protein ein selektierbares Protein ist; die stabile Expression eines derartigen Proteins in einer Zelle verleiht ein selektierbares phänotypisches Charakteristikum, d.h. das Charakteristikum erhöht das Überleben der Zelle unter ansonsten letalen Bedingungen. Somit können durch Auferlegung der selektierbaren Bedingung bzw. der Selektionsbedingung Zellen, die den selektierbaren Positivmarker stabil exprimieren, von anderen Zellen, die die Vektorsequenz nicht erfolgreich integriert haben, auf der Basis der Lebensfahigkeit isoliert werden. Beispiele selektierbarer Positivmarker-Proteine (und ihrer Selektionsmittel) schließen Neo (G418 oder Kanamycin), Hyg (Hygromycin), HisD (Histidinol), Gpt (Xanthin), Ble (Bleomycin) und Hprt (Hypoxanthin) (siehe z.B. Capecchi und Thomas, US-Patent Nr. 5,464,764 , und Capecchi, Science, 244: 1288-92, 1989) ein. Andere Positivmarker, die ebenfalls als Alternative zu einem selektierbaren Marker verwendet werden können, schließen Reporterproteine, wie β-Galactosidase, Glühwürmchen- bzw. Firefly-Luciferase oder grün fluoreszierendes Protein ("green fluorescent protein") (siehe z.B. Current Protocols in Cytometry, Einheit 9.5, und Current Protocols in Molelcular Biology, Einheit 9.6., John Wiley & Sons, New York, NY, 2000), ein.
Das oben beschriebene positive Selektionsschema unterscheidet nicht zwischen Zellen, die den Vektor durch zielgerichtete Rekombination bei dem PFI-013-Genlokus integriert haben versus der zufälligen, nicht-homologen Integration der Vektorsequenz in eine beliebige Chromosomenposition. Wenn ein Substitutionsvektor zur homologen Rekombination verwendet wird, ist es daher bevorzugt, auch eine Nucleotidsequenz einzuschließen, die ein selektierbares Negativmarker-Protein codiert. Die Expression eines selektierbaren Negativmarkers bewirkt, dass eine Zelle, die den Marker exprimiert, ihre Lebensfähigkeit verliert, wenn sie einem bestimmten Mittel ausgesetzt wird (d.h. das Markerprotein wird unter bestimmten Selektionsbedingungen tödlich für die Zelle). Beispiele selektierbarer Negativmarker (und ihrer Letalitätsmittel) schließen Herpes simplex-Virus-Thymidinkinase (Gancyclovir oder 1,2-Desoxy-2-fluor-α-D-arabinofuransyl-5-ioduracil), Hprt (6-Thioguanin oder 6-Thioxanthin) und Diphtherietoxin, Ricintoxin und Cytosindeaminase (5-Fluorcytosin) ein.
Die Nucleotidsequenz, die den selektierbaren Negativmarker codiert, ist außerhalb der zwei Homologieregionen des Substitutionsvektors positioniert. Angesichts dieser Positionierung werden Zellen den selektierbaren Negativmarker nur integreren und stabil exprimieren, wenn die Integration durch zufällige, nicht-homologe Rekombination auftritt; die homologe Rekombination zwischen dem PFI-013-Gen und den zwei Homologieregionen in dem Targeting-Konstrukt schließt die Sequenz, die den selektierbaren Negativmarker codiert, von der Integration aus. Somit verlieren bei Auferlegen der Negativbedingung Zellen, die den Targeting-Vektor durch zufällige, nicht-homologe Rekombination integriert haben, ihre Lebensfähigkeit.
Die oben beschriebene Kombination von selektierbaren Positiv- und Negativmarker ist bevorzugt, weil eine Reihe von Positiv- und Negativselektionsstufen konstruiert werden kann, um effizienter nur jene Zellen auszuwählen, die eine Vektorintegration durch homologe Rekombination durchlaufen haben und die daher ein möglicherweise unterbrochenes PFI-013-Gen aufweisen. Weitere Beispiele von Positiv-Negativ-Selektionsschemata, selektierbaren Marker und Targeting-Konstrukten werden z.B. in dem US-Patent mit der Nummer 5,464,764 , in WO 94/06908 und bei Valancius und Smithies, Mol. Cell. Biol., 11: 1402, 1991, beschrieben.
Damit ein Markerprotein bei Vektorintegration stabil exprimiert werden kann, kann der Targeting-Vektor so konstruiert werden, dass die den Marker codierende Sequenz bei Vektorintegration funktionell mit dem endogenen PFI-013-Gen-Promotor verknüpft wird. Die Expression des Markers wird dann durch den PFI-013-Gen-Promotor in den Zellen gesteuert, die normalerweise das PFI-013-Gen exprimieren. Alternativ kann jeder Marker in dem Targeting-Konstrukt des Vektors seinen eigenen Promotor enthalten, der die Expression unabhängig von dem PFI-013-Gen-Promotor steuert. Dieses letztere Schema hat den Vorteil, dass die Expression von Marker in Zellen ermöglicht wird, die nicht typischerweise das PFI-013-Gen exprimieren (Smith und Berg, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 49: 171, 1984; Sedivy und Sharp, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 227: 1989; Thomas und Capecchi, Cell, 51:503, 1987).
Exogene Promotoren, die verwendet werden können, um die Markergenexpression zu steuern, schließen Zell-spezifische oder Stadien-spezifische Promotoren, konstitutive Promotoren und induzierbare oder regulierbare Promotoren ein. Nicht-einschränkende Beispiele dieser Promotoren schließen den Herpes simplex-Thymidinkinase-Promotor, Cytomegalovirus (CMV)-Promotor/Enhancer, SV40-Promotoren, PGK-Promotor, PMCI-neo, Metallothionein-Promotor, Adenovirus-late-Promotor, Vaccinia-Virus-7,5K-Promotor, den avianen beta-Globin-Promotor ("avian beta globin promotor"), Histon-Promotoren (z.B. Maus-Histon H3-614), beta-Actin-Promotor, Neuronen-spezifische Enolase-, Muskelactin-Promotor und den Blumenkohl-Mosaik-Virus-35S-Promotor ein (siehe allgemein, Sambrook et al., Molecular Cloning, Bd. I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, und Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 2000; Stratagene, La Jolla, CA).
Um zu bestätigen, ob Zellen die Vektorsequenz in den PFI-013-Genlokus, auf den abgezielt wurde, integriert haben, können Primer oder genomische Sonden, die spezifisch für das gewünschte Vektorintegrationsereignis sind, in Kombination mit PCR oder Southern-Blot-Analyse verwendet werden, um das Vorhandensein der gewünschten Vektorintegration in den PFI-013-Genlokus zu identifizieren (Erlich et al., Science, 252: 1643-51, 1991; Zimmer und Gruss, Nature, 338: 150, 1989; Mouellic et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 87: 4712, 1990; und Shesely et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 88: 4294, 1991).
Gene-Trapping
Ein anderes Verfahren, das zum Inserieren einer fremden Nucleinsäuresequenz in den PFI-013-Genlokus, um das PFI-013-Gen funktionell zu unterbrechen, zur Verfügung steht, ist Gene-Trapping. Dieses Verfahren zieht einen Vorteil aus der Zellmaschinerie, die in allen Sängerzellen vorhanden ist, die Exone in mRNA spleißt, um eine Gene-Trag-Vektor-codierende Sequenz in einer zufälligen Weise in ein Gen zu inserieren. Sobald einmal inseriert, erzeugt der Gene-Trag-Vektor eine Mutation, die das eingeschlossene bzw. abgefangene ("trapped") PFI-013-Gen funktionell unterbrechen kann. Im Gegensatz zur homologen Rekombination erzeugt dieses Mutagenesesystem größtenteils Zufallsmutationen. Um eine genetisch modifizierte Zelle zu erhalten, die ein funktionell unterbrochenes PFI-013-Gen enthält, müssen somit Zellen, die diese spezielle Mutation enthalten, identifiziert und aus einem Pool von Zellen selektiert werden, die Zufallsmutationen in einer Vielzahl von Genen enthalten.
Gene-Trapping-Systeme und -Vektoren wurden zur Verwendung bei der genetischen Modifikation von murinen Zellen und anderen Zelltypen beschrieben (siehe z.B. Allen et al., Nature, 333: 852-55, 1988; Bellen et al., Genes Dev., 3: 1288-1300, 1989; Bier et al., Genes Dev., 3: 1273-1287, 1989; Bonnerot et al., J. Virol., 66: 4982-91, 1992; Brenner et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86: 5517-21, 1989; Chang et al., Virology, 193: 737-47, 1993; Friedrich und Soriano, Methods Enzymol., 225: 681-701, 1993; Friedrich und Soriano, Genes Dev., 5: 1513-23, 1991; Goff, Methods Enzymol., 152: 469-81, 1987; Gossler et al., Science, 244: 463-65, 1989; Hope, Develop., 113: 399-408, 1991; Kerr et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 2: 767-776, 1989; Reddy et al., J. Virol., 65: 1507-1515, 1991; Reddy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89: 6721-25, 1992; Skarnes et al., Genes Dev., 6: 903-918, 1992; von Melchner und Ruley, J. Virol. 63: 3227-3233, 1989; und Yoshida et al., Transgen. Res., 4: 277-87, 1995).
Promotor-Trap(5'-Trap)-Vektoren enthalten in 5'- zu 3'-Richtung eine Spleißakzeptorsequenz, gefolgt von einem Exon, typischerweise charakterisiert durch ein Translationsstartcodon und ein offenes Leseraster (ORF) und/oder eine interne Ribosomeneintrittsstelle. Im Allgemeinen enthalten diese Promotor-Trag-Vektoren weder Promotoren noch funktionell verknüpfte Spleißdonorsequenzen. Konsequenterweise unterbricht die Promotor-Trap-Vektorsequenz nach Integration in das zelluläre Genom der Wirtszelle das normale Spleißen des stromaufwärts gelegenen Gens und wirkt als ein terminales Exon. Die Expression der den Vektor codierenden Sequenz ist davon abhängig, dass sich der Vektor in dem geeigneten Leseraster in ein Intron des unterbrochenen Gens integriert. In einem derartigen Fall spleißt die zelluläre Spleißmaschinerie Exons aus dem eingeschlossenen bzw. abgefangenen ("trapped") Gen stromaufwärts der den Vektor codierenden Sequenz (Zambrowicz et al., WO 99/50426 ).
Ein alternatives Verfahren zum Produzieren eines Effekts, der demjenigen des oben beschriebenen Promotor-Trag-Vektors ähnlich ist, ist ein Vektor, der eine verschachtelte Gruppe ("nested set") von Stoppcodons einschließt, die in der Region zwischen dem Spleißakzeptor des Promotor-Trag-Vektors und dem Translationsstartcodon oder der Polyadenylierungssequenz vorliegt oder andernfalls dort eingeführt wurde ("engineered into"). Die codierende Sequenz kann auch so manipuliert werden, dass sie eine unabhängige Riboso meneintrittsstelle ("independent ribosome entry site") (IRES) enthält, so dass die codierende Sequenz in einer Weise exprimiert werden wird, die größtenteils von der Integrationsstelle innerhalb des Wirtszellgenoms unabhängig ist. Typischerweise, aber nicht notwendigerweise, wird eine IRES in Verbindung mit einer verschachtelten Gruppe von Stoppcodons verwendet.
Ein anderer Typ eines Gene-Trapping-Schemas verwendet einen 3'-Gene-Trag-Vektor. Dieser Vektortyp enthält in funktioneller Kombination eine Promotorregion, welche die Expression einer sich anschließenden codierenden Sequenz vermittelt, die codierende Sequenz und eine Spleißdonorsequenz, die das 3'-Ende des Exons der codierenden Sequenz definiert. Nach der Integration in ein Wirtszellgenom wird das mittels des Vektorpromotors exprimierte Transkript an eine Spleißakzeptorsequenz von dem eingeschlossenen bzw. abgefangenen ("trapped") Gen, das stromabwärts der integrierten Gene-Trap-Vektorsequenz lokalisiert ist, gespleißt. Somit resultiert die Integration des Vektors in der Expression eines Fusionstranskripts, umfassend die codierende Sequenz der 3'-Gene-Trap-Kassette und jegliche stromabwärts gelegene zelluläre Exone, einschließlich des terminalen Exons und seines Polyadenylierungssignals. Wenn sich derartige Vektoren in ein Gen integrieren, spleißt die zelluläre Spleißmaschinerie die den Vektor codierende Sequenz stromaufwärts des 3'-Exons des eingeschlossenen bzw. abgefangenen ("trapped") Gens. Ein Vorteil derartiger Vektoren ist, dass die Expression der 3'-Gene-Trap-Vektoren durch einen Promotor innerhalb der Gene-Trap-Kassette gesteuert wird und keine Integration in ein Gen, das normalerweise in der Wirtszelle exprimiert wird, erfordert (Zambrowicz et al., WO 99/50426 ). Beispiele für Transkriptionspromotoren und -Enhancer, die in den 3'-Gene-Trap-Vektor eingeschlossen sein können, schließen jene ein, die oben hinsichtlich der Targeting-Vektoren diskutiert wurden.
Das Virusvektorgerüst, das als die strukturelle Komponente für den Promotor- oder 3'-Gene-Trap-Vektor verwendet wird, kann aus einem breiten Bereich von Vektoren ausgewählt werden, die in das Genom einer Zielzelle inseriert werden können. Geeignete Gerüstvektoren schließen ohne Einschränkung darauf Herpes simplex-Virus-Vektoren, Adenovirusvektoren, Adeno-assoziierte Virusvektoren ("adeno-associated virus vectors"), retrovirale Vektoren, lentivirale Vektoren, Pseudorabiesvirus-, alpha-Herpes-Virus-Vektoren und dergleichen ein. Eine gründliche Durchsicht viraler Vektoren bzw. von Virusvektoren, insbesondere von Virusvektoren, die zur Modifikation nicht-replizierender Zellen geeignet sind, und darüber, wie derartige Vektoren in Verbindung mit der Expression einer exogenen Polynucleotidsequenz zu verwenden sind, kann in Viral Vectors: Gene Therapy and Neuroscience Applications, Hrsg., Caplitt und Loewy, Academic Press, San Diego, 1995, gefunden werden.
Vorzugsweise werden retrovirale Vektoren zum Gene-Trapping verwendet. Diese Vektoren können in Verbindung mit retroviralen Verpackungszelllinien, wie jenen, die im US-Patent Nr. 5,449,614 beschrieben sind, hergestellt werden. Wenn nicht-murine Säugerzellen als Zielzellen für die genetische Modifikation verwendet werden, können amphotrope oder pantrope Verpackungszelllinien verwendet werden, um geeignete Vektoren zu verpacken ("package") (Ory et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93: 11400-11406, 1996). Repräsentative retrovirale Vektoren, die adaptiert werden können, um die gegenwärtig beschriebenen 3'-Gene-Trap-Vektoren zu erzeugen, werden z.B. in dem US-Patent mit der Nummer 5,521,076 beschrieben.
Die Gene-Trapping-Vektoren können eines oder mehrere der Positivmarker-Gene, die oben im Hinblick auf Targeting-Vektoren, die zur homologen Rekombination verwendet werden, diskutiert wurden, enthalten. In ähnlicher Weise wie bei ihrer Verwendung in Targeting-Vektoren werden diese Positivmarker in Gene-Trapping-Vektoren verwendet, um Zellen, die den Vektor in das Zellgenom integriert haben, zu identifizieren und zu selektieren. Das Markergen kann so manipuliert werden, dass es eine unabhängige Ribosomeneintrittsstelle (IRES) enthält, so dass der Marker in einer Weise exprimiert werden wird, die im Wesentlichen von der Lokalisierung, an welcher sich der Vektor in das Zielzellgenom integriert hat, unabhängig ist.
Angesichts dessen, dass sich Gene-Trag-Vektoren in einer ziemlich zufälligen Weise in das Genom von infizierten Wirtszellen integrieren werden, muss eine genetisch modifizierte Zelle mit einem unterbrochenen PFI-013-Gen aus einer Population von Zellen, die eine zufällige Vektorintegration durchlaufen haben, identifiziert werden. Vorzugsweise sind die genetischen Modifikationen in der Population von Zellen von ausreichender Zufälligkeit und Häufigkeit, so dass die Population Mutationen in im Wesentlichen jedem Gen, das in dem Genom der Zelle gefunden wird, aufweist, was es wahrscheinlich macht, dass eine Zelle mit einem unterbrochenen PFI-013-Gen aus der Population identifiziert werden wird (siehe Zambrowicz et al., WO 99/50426 ; Sands et al., WO 98/14614 ).
Individuelle Mutantenzelllinien, die ein unterbrochenes PFI-013-Gen enthalten, werden in einer Population mutierter Zellen unter Verwendung von z.B. reverser Transkrip tion und PCR (RT-PCR) zum Identifizieren einer Mutation in einer PFI-013-Gensequenz identifiziert. Dieses Verfahren kann durch Poolen bzw. Zusammenfassen von Klonen rationalisiert werden. Um z.B. einen einzelnen Klon zu finden, der ein unterbrochenes PFI-013-Gen enthält, wird eine RT-PCR unter Verwendung eines Primers durchgeführt, wobei dieser in dem Gene-Trag-Vektor verankert ist und der andere Primer in der PFI-013-Gensequenz lokalisiert ist. Ein positives RT-PCR-Ergebnis zeigt an, dass die Vektorsequenz in dem PFI-013-Gentranskript codiert ist, was anzeigt, dass das PFI-013-Gen durch ein Gene-Trap-Integrationsereignis unterbrochen wurde (siehe z.B. Sands et al., WO 98/14614 ). Zeitliche, räumliche und induzierbare Gendisruptionen
Eine funktionelle Disruption bzw. Unterbrechung des endogenen PFI-013-Gens kann bei speziellen Entwicklungs- oder Zellzyklusstadien (zeitliche Disruption) oder bei speziellen Zelltypen (räumliche Disruption) auftreten. Die PFI-013-Gendisruption kann auch induzierbar sein, wenn bestimmte Bedingungen vorliegen. Ein Rekombinase-Exzisions-System ("recombinase excision system"), wie ein Cre-Lox-System, kann verwendet werden, um das PFI-013-Gen in einem spezifischen Entwicklungsstadium, in einem speziellen Gewebe- oder Zelltyp oder unter bestimmten Umweltbedingungen zu aktivieren oder zu inaktivieren. Allgemein werden Verfahren, die die Cre-Lox-Technlogie einsetzen, durchgeführt, wie bei Torres und Kuhn, Laboratory Protocols for Conditional Gene Targeting, Oxford University Press, 1997, beschrieben. Eine Methodologie, die ähnlich zu derjenigen ist, die für das Cre-Lox-System beschrieben ist, kann ebenfalls eingesetzt werden, wobei das FLP-FRT-System eingesetzt wird. Weitere Richtlinien hinsichtlich der Verwendung von Rekombinase-Exzisions-Systemen zum bedingten Unterbrechen von Genen durch homologe Rekombination oder Virusinsertion werden z.B. in US-Patent Nr. 5,626,159 , US-Patent Nr. 5,527,695 , US-Patent Nr. 5,434,066 , WO 98/29533 , Orban et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 89: 6861-65, 1992; O'Gorman et al., Science, 251: 1351-55, 1991; Sauer et al., Nucleic Acids Research, 17: 147-61, 1989; Barinaga, Science, 265: 26-28, 1994; und Akagi et al, Nucleic Acids Res., 25: 1766-73, 1997, bereitgestellt. Es kann mehr als ein Rekombinasesystem verwendet werden, um eine tierische Zelle genetisch zu modifizieren.
Wenn eine homologe Rekombination verwendet wird, um das PFI-013-Gen in einer zeitlichen, räumlich oder induzierbaren Weise zu unterbrechen, wobei ein Rekombinasesystem, wie das Cre-Lox-System, verwendet wird, wird ein Teil der PFI-013-Gen-codierenden Region durch ein Targeting-Konstrukt, umfassend die PFI-013-Gen-codierende Region, flankiert durch loxP-Orte, ersetzt. Tierische Zellen, die diese genetische Modifikation tragen, enthalten ein funktionelles, LoxP-flankiertes PFI-013-Gen. Der zeitliche, räumliche oder induzierbare Aspekt der PFI-013-Gendisruption wird durch das Expressionsmuster eines zusätzlichen Transgens, eines Cre-Rekombinase-Transgens, das in der tierischen Zelle unter der Kontrolle des gewünschten räumlich-regulierten, zeitlich-regulierten bzw. induzierbaren Promotors exprimiert wird, bewirkt. Eine Cre-Rekombinase zielt für die Rekombination auf die LoxP-Stellen ab. Wenn daher die Cre-Expression aktiviert ist, durchlaufen die LoxP-Orte eine Rekombination, um die sandwichartig dazwischen liegende PFI-013-Gen-codierende Sequenz auszuschneiden, was in einer funktionellen Disruption des PFI-013-Gens resultiert (Rajewski et al., J. Clin. Invest., 98: 600-03, 1996; St.-Onge et al., Nucleic Acids Res., 24: 3875-77, 1996; Agah et al., J. Clin. Invest., 100: 169-79, 1997; Brocard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 14559-63, 1997; Feil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 10887-90, 1996; und Kühn et al., Science, 269: 1427-29, 1995).
Eine Zelle, die sowohl ein Cre-Rekombinase-Transgen und ein loxP-flankiertes PFI-013-Gen enthält, kann durch transgene Standardtechniken erzeugt werden. Weitere Richtlinien im Hinblick auf die Verwendung von spezifischen Promotoren von Rekombinasesystemen, um das PFI-013-Gen zeitlich, räumlich oder bedingt zu unterbrechen, werden z.B. in Sauer, Meth. Enz., 225: 890-900, 1993, Gu et al., Science, 265: 103-06, 1994; Araki et al., J. Biochem., 122: 977-82, 1997; Dymecki, Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 6191-96, 1996; und Meyers et al., Nature Genetics, 18: 136-41, 1998, gefunden.
Eine induzierbare Disruption des PFI-013-Gens kann auch unter Verwendung eines auf Tetracyclin reagierenden binären Systems ("tetracycline responsive binary system") erzielt werden (Gossen und Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-51, 1992). Dieses System beinhaltet das genetische Modifizieren einer Zelle, um einen Tet-Promotor in das regulatorische Element des endogenen PFI-013-Gens einzuführen, und ein Transgen, das einen Tetracyclin-kontrollierbaren Repressor (TetR) exprimiert. Bei einer derartigen Zelle aktiviert die Verabreichung von Tetracyclin den TetR, welcher wiederum die PFI-013-Genexpression inhibiert und daher das PFI-013-Gen funktionell unterbricht (St.-Onge et al., Nucleic Acids Res., 24: 3875-77, 1996, US-Patent Nr. 5,922,927 ).
Die oben beschriebenen Systeme für zeitliche, räumliche und induzierbare Disruptionen des PFI-013-Gens können auch übernommen werden, wenn z.B. Gene-Trapping als das Verfahren zur genetischen Modifikation verwendet wird, wie z.B. in WO 98/29533 beschrieben. Erzeugen genetisch modifizierter tierischer Zellen
Die oben beschriebenen Verfahren zur genetischen Modifikation können verwendet werden, um ein PFI-013-Gen in nahezu jedem beliebigen Typ von Körperzelle oder Stammzelle, die von einem Tier stammt, funktionell zu unterbrechen. Erfindungsgemäße genetisch modifizierte tierische Zellen schließen ohne Einschränkung darauf Säugerzellen, einschließlich humaner Zellen, und aviane Zellen ein. Diese Zellen können durch genetisches Manipulieren jeder beliebigen tierischen Zelllinie, wie Kultur-adaptierte, tumorigene oder transformierte Zelllinien, abgeleitet bzw. erhalten werden, oder sie können aus einem genetisch modifizierten, nicht-humanen Säuger, der die gewünschte PFI-013-Genmodifikation trägt, isoliert werden.
Die Zellen können heterozygot oder homozygot für das unterbrochene PFI-013-Gen sein. Um Zellen zu erhalten, die für die PFI-013-Gendisruption homozygot sind (PFI-013-/-), kann ein direktes, sequenzielles Targeting beider Allelen durchgeführt werden. Dieses Verfahren kann durch das Rückführen ("recycling") eines selektierbaren Positivmarkers erleichtert bzw. ermöglicht werden. Gemäß diesem Schema wird die Nucleotidsequenz, die den selektierbaren Positivmarker codiert, nach der Disruption einer Allele unter Verwendung des Cre-LoxP-Systems entfernt. Somit kann der gleiche Vektor in einer nachfolgenden Runde des Targetings verwendet werden, um das zweite PFI-013-Gen-Allel zu unterbrechen (Abuin und Bradley, Mol. Cell. Biol., 16: 1851-56, 1996; Sedivy et al., T.I.G., 15: 88-90, 1999; Cruz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 88: 7170-74, 1991; Mortensen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 88: 7036-40, 1991; te Riele et al., Nature (London), 348: 649-651, 1990).
Eine alternative Strategie zum Erhalten von ES-Zellen, die PFI-013-/- sind, ist die Homogenotisation ("homogenotization") von Zellen aus einer Population von Zellen, die für die PFI-013-Gendisruption heterozygot ist (PFI-013+/-). Das Verfahren verwendet ein Schema, in dem PFI-013+/- -targierte Klone, die einen selektierbaren Wirkstoffresistenzmarker exprimieren, gegen eine sehr hohe Wirkstoffkonzentration selektiert werden; diese Selektion begünstigt Zellen, die zwei Kopien der Sequenz, die den Wirkstoffresistenzmarker codiert, exprimieren und die daher homozygot für die PFI-013-Gendisruption sind (Mortensen et al., Mol. Cell. Biol., 12: 2391-95, 1992).
Nach der genetischen Modifikation der gewünschten Zelle oder Zelllinie kann der PFI-013-Genlokus als Ort der Modifikation durch PCR-Analyse, gemäß Standard-PCR- oder -Southern-Blotting-Verfahren, die im Fachgebiet bekannt sind, bestätigt werden (siehe z.B. US-Patent Nr. 4,683,202 ; und Erlich et al., Science, 252: 1643, 1991). Eine weitere Verifizierung der funktionellen Disruption des PFI-013-Gens kann auch durchgeführt werden, wenn die PFI-013-Gen-Messenger-RNA (mRNA)-Spiegel und/oder die PFI-013-Polypeptid-Spiegel in Zellen, die normalerweise das PFI-013-Gen exprimieren, verringert sind. Messungen der PFI-013-Gen-mRNA-Spiegel können unter Verwendung von Reverse-Transkriptase-vermittelter Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), Northern-Blot-Analyse oder in-situ-Hybridisierung erhalten werden. Die Quantifizierung der durch die Zellen produzierten PFI-013-Polypeptid-Spiegel kann z.B. durch Standard-Immunoassay-Verfahren, die im Fachgebiet bekannt sind, durchgeführt werden. Derartige Immunoassays schließen ohne Einschränkung darauf kompetitive und nicht-kompetitive Assay-Systeme unter Verwendung von Techniken, wie Radioimmunoassays, ELISA (Enzym-gekoppelte Immunabsorptionsbestimmung), "Sandwich"-Immunoassays, immunoradiometrischen Assays, Geldiffusions-Präzipitin-Reaktionen, Immunodiffusions-Assays, in-situ-Immunoassays (unter Verwendung von z.B. kolloidalem Gold, enzymatischen Markierungen oder Markierungen mit radioaktiven Isotopen), Western-Blots, 2-dimensionaler Gelanalyse, Präzipitationsreaktionen, Immunfluoreszenz-Assays, Protein-A-Assays und Immunelektrophorese-Assays, ein.
Bevorzugte genetisch modifizierte tierische Zellen sind embryonale Stamm (ES)-Zellen und ES-artige Zellen. Diese Zellen stammen von den Präimplantationsembryonen und Blastozyten verschiedener Spezies, wie Mäuse (Evans et al., Nature, 129:154-156, 1981; Martin, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78: 7634-7638, 1981), Schweine und Schafe (Notanianni et al., J. Reprod. Fert. Suppl., 43: 255-260, 1991; Campbell et al., Nature, 380: 64-68, 1996) und Primaten, einschließlich Menschen (Thomson et al., US-Patent Nr. 5,843,780 , Thomson et al., Science, 282: 1145-1147, 1995; und Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 7844-7848, 1995).
Diese Zelltypen sind pluripotent. Das heißt unter geeigneten Bedingungen differenzieren sie sich in eine breite Vielfalt von Zelltypen, die von allen drei embryonalen Keimblättern abgeleitet sind: Ektoderm, Mesoderm und Endoderm. In Abhängigkeit von den Kulturbedingungen kann eine Probe von ES-Zellen unbegrenzt als Stammzellen kultiviert werden, die in eine breite Vielzahl von verschiedenen Zelltypen innerhalb einer einzelnen Probe differenzieren gelassen werden oder die so gesteuert werden, dass sie sich zu einem spezifischen Zelltyp differenzieren, wie Makrophagen-artige Zellen, neuronale Zellen, Kardiomyozyten, Adipozyten, Zellen der glatten Muskeln, Endothelzellen, Skelettmuskelzellen, Keratinozyten und hämatopoetische Zellen, wie Eosinophile, Mastzellen, erythroide Vorläuferzellen oder Megakaryozyten. Eine gesteuerte Differenzierung wird erreicht, indem spezifische Wachstumsfaktoren oder Matrixkomponenten in die Kulturbedingungen eingeschlossen werden, wie z.B. weiter bei Keller et al., Curr. Opin. Cell Biol., 7: 862-69, 1995; Li et al., Curr. Biol., 8: 971, 1998; Klug et al., J. Clin. Invest., 98: 216-24, 1996; Lieschke et al., Exp. Hematol., 23: 328-34, 1995; Yamane et al., Blood, 90: 3516-23, 1997; und Hirashima et al., Blood, 93: 1253-63, 1999, beschrieben.
Die spezielle embryonale Stammzelllinie, die zur genetischen Modifikation verwendet wird, ist nicht entscheidend; exemplarische murine ES-Zelllinien schließen AB-1 (McMahon und Bradley, Cell, 62:1073-85, 1990), E14 (Hooper et al., Nature, 326: 292-95, 1987), D3 (Doetschman et al., J. Embryol. Exp. Morph., 87: 27-45, 1985), CCE (Robertson et al., Nature, 323: 445-48, 1986), RW4 (Genome Systems, St. Louis, MO), und DBA/1lacJ (Roach et al., Exp. Cell Res., 221: 520-25, 1995) ein.
HERSTELLUNG DES POLYPEPTIDS
Die Herstellung des in der vorliegenden Erfindung verwendeten Polypeptids kann durch Kultivieren von eukaryotischen oder prokaryotischen Expressionswirten, welche mit einem oder mehreren Polynucleotiden, die das Polypeptid codieren, transformiert wurden, in einem Fermentationsmedium mit konventionellen Nährstoffen bewerkstelligt werden. Die Auswahl des geeigneten Mediums kann auf der Auswahl der Expressionswirte basieren und/oder sie kann auf den regulatorischen Anforderungen des Expressionskonstrukts basieren. Derartige Medien sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt. Das Medium kann, falls gewünscht, zusätzliche Komponenten enthalten, die die transformierten Expressionswirte gegenüber potentiell kontaminierenden Mikroorganismen begünstigen.
Somit beschreibt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids mit PFI-013-Aktivität, wobei das Verfahren die Stufen von (a) Transformieren einer Wirtszelle mit einer in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz oder einem Derivat, Homologen, einer Variante, einem Analogon oder Fragment davon; und (b) Kultivieren der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die zur Expression des Polypeptids geeignet sind, umfasst.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch ein Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids mit PFI-013-Aktivität, wobei das Verfahren die Stufen von (a) Kultivieren einer Wirtszelle, die mit einer in SEQ ID NO: 1 gezeigten Nucleotidsequenz oder einem Derivat, Homologen, einer Variante, einem Analogon oder Fragment davon transformiert wurde, unter Bedingungen, die zur Expression des Polypeptids geeignet sind; und (b) Gewinnen des Polypeptids aus der Wirtszellkultur umfasst.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch ein Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids mit PFI-013-Aktivität, wobei das Verfahren die Stufen von (a) Transformieren einer Wirtszelle mit einer in SEQ ID NO: 1 gezeigten Nucleotidsequenz oder einem Derivat, einem Homologen, einer Variante, einem Analogon oder Fragment davon; (b) Kultivieren der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die zur Expression des Polypeptids geeignet sind; und (c) Gewinnen des Polypeptids aus der Wirtszellkultur umfasst.
RIBOZYME
Ribozyme sind enzymatische RNA-Moleküle, die zur Katalyse der spezifischen Spaltung von RNA befähigt sind. Der Mechanismus der Ribozymwirkung beinhaltet eine Sequenz-spezifische Hybridisierung des Ribozymmoleküls zu einer komplementären Ziel-RNA, gefolgt von endonucleolytischer Spaltung. In der Erfindung beschrieben sind manipulierte Hammerhead-Motiv-Ribozymmoleküle, die spezifisch und effizient die endonucleolytische Spaltung von PFI-013-RNA-Sequenzen katalysieren.
Spezifische Ribozymspaltungsstellen innerhalb eines beliebigen potentiellen RNA-Ziels werden anfänglich durch Abtastung bzw. Scannen des Zielmoleküls auf Ribozymspaltungsstellen, die die folgenden Sequenzen einschließen: GUA, GUU und GUC, identifiziert. Sobald sie einmal identifiziert sind, können kurze RNA-Sequenzen von zwischen 15 und 20 Ribonucleotiden, korrespondierend zur Region des Zielgens, enthaltend die Spaltungsstelle, hinsichtlich sekundärer Strukturmerkmale evaluiert werden, welche die Oligonucleotidsequenz nicht-funktionsfähig ("inoperable") machen. Die Eignung von Kandidatenzielen kann auch durch Testen der Zugänglichkeit gegenüber Hybridisierung mit komplementären Oligonucleotiden unter Verwendung von Ribonuclease-Schutz-Assays ("ribonuclease protection assays") beurteilt werden.
Sowohl Antisense-RNA- als auch (-)DNA-Moleküle und Ribozyme können durch jedes beliebige Verfahren zur Synthese von RNA-Molekülen, das im Fachgebiet bekannt ist, hergestellt werden. Diese schließen Techniken zum chemischen Synthetisieren von Oligonucleotiden, wie die chemische Festphasen-Phosphoramidit-Synthese, ein. Alternativ können RNA-Moleküle durch in-vitro- oder in-vivo-Transkription von DNA-Sequenzen, die das Antisense-RNA-Molekül codieren, erzeugt werden. Derartige DNA-Sequenzen können in eine breite Vielfalt von Vektoren mit geeigneten RNA-Polymerase-Promotoren, wie T7 oder SP6, eingebaut werden. Alternativ können Antisense-cDNA-Konstrukte, die Antisense-RNA konstitutiv oder induzierbar synthetisieren, in Zelllinien, Zellen oder Gewebe eingeführt werden.
DETEKTION
Das Vorhandensein der codierenden Sequenz des PFI-013-Polynucleotids kann durch DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung oder Amplifikation unter Verwendung von Sonden, Teilen oder Fragmenten der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz detektiert werden. Nucleinsäure-Amplifikations-basierte Assays beinhalten die Verwendung von Oligonucleotiden oder Oligomeren, basierend auf der PFI-013-codierenden Sequenz, um Transformanten zu detektieren, die PFI-013-DNA oder -RNA enthalten. Wie hierin verwendet, kann sich "Oligonucleotide" oder "Oligomere" auf eine Nucleinsäuresequenz von mindestens etwa 10 Nucleotiden und soviel wie etwa 60 Nucleotiden, vorzugsweise etwa 15 bis 30 Nucleotiden und stärker bevorzugt etwa 20 bis 25 Nucleotiden, beziehen, die als eine Sonde oder ein Amplimer verwendet werden kann. Vorzugsweise sind die Oligonucleotide aus der 3'-Region der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Nucleotidsequenz abgeleitet.
Eine Vielfalt von Protokollen zum Detektieren und Messen der Expression des PFI-013-Polypeptids, wie unter Verwendung von entweder polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, die für das Protein spezifisch sind, ist im Fachgebiet bekannt. Beispiele schließen Enzym-gekoppelte Immunabsorptionsbestimmungen (ELISA), Radioimmunoassays (RIA) und Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortieren ("fluorescent activated cell sorting") (FACS) ein. Ein zweiseitiger Immunoassay auf Basis monoklonaler (Antikörper), der monoklonale Antikörper einsetzt, die gegenüber zwei nicht-interferierenden Epitopen auf einem PFI-013-Polypeptid reaktiv sind, ist bevorzugt, aber ein kompetitiver Bindungsassay kann ebenfalls eingesetzt werden. Diese und andere Assays werden unter anderem bei Hampton, R. et al. (1990, Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St. Paul, MN, USA) und Maddox D.E. et al. (1983, J. Exp. Med., 15, 8:1211) beschrieben.
Eine breite Vielfalt von Markierungs- und Konjugationstechniken ist Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und kann in verschiedenen Nucleinsäure- und Aminosäure-Assays verwendet werden. Mittel zum Herstellen markierter Hybridisierungs- oder PCR-Sonden zum Detektieren von PFI-013-Polynucleotidsequenzen schließen Oligomarkierung bzw. Oligolabeling, Nick-Translation, endständige Markierung oder PCR-Amplifikation unter Verwendung eines markierten Nucleotids ein. Alternativ kann die PFI-013-codierende Sequenz oder ein beliebiger Teil davon in einen Vektor zur Herstellung einer mRNA-Sonde kloniert werden. Derartige Vektoren sind im Fachgebiet bekannt, sie sind kommerziell erhältlich, und sie können verwendet werden, um RNA-Sonden in vitro durch Zugabe einer geeigneten RNA-Polymerase, wie T7, T3 oder SP6, und markierter Nucleotiden zu synthetisieren.
Eine Anzahl von Firmen, wie Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ, USA), Promega (Madison, WI, USA) und US Biochemical Corporation (Cleveland, OH, USA) liefern kommerzielle Kits und Protokolle für diese Vorgehensweisen. Geeignete Reportermoleküle oder -markierungen schließen Radionuklide, Enzyme, fluoreszierende, chemilumineszente oder chromogene Mittel sowie Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, magnetische Partikel und dergleichen ein. Patente, die die Verwendung derartiger Markierungen lehren, schließen US-A-3,817,837 ; US-A-3,850,752 ; US-A-3,939,350 ; US-A-3,996,345 ; US-A-4,277,437 ; US-A-4,275,149 und US-A-4,366,241 ein. Es können auch rekombinante Immunglobuline hergestellt werden, wie in US-A-4,816,567 gezeigt.
Zusätzliche Verfahren zum Quantifizieren der Expression eines speziellen Moleküls schließen radioaktive Markierung (Melby, P.C. et al., 1993, J. Immunol. Methods, Bd. 159, S. 235-44) oder Biotinylierung (Duplaa, C. et al., 1993, Anal. Biochem., Bd. 229, S. 36) von Nucleotiden, Coamplifikation einer Kontrollnucleinsäure und Standardkurven, auf denen die experimentellen Ergebnisse interpoliert werden, ein. Die Quantifizierung von Mehrfachproben bzw. mehreren Proben kann mittels Durchführung des Assays in einem ELISA-Format, in dem das Oligomer von Interesse in verschiedenen Verdünnungen präsentiert wird und in dem eine spektrophotometrische oder kalorimetrische Reaktion eine rasche Quantifizierung ergibt, beschleunigt werden.
Obwohl das Vorhandensein/Nichtvorhandensein von Markergenexpression nahe legt, dass das Gen von Interesse ebenfalls vorhanden ist, sollten sein Vorhandensein und seine Expression bestätigt werden. Wenn z.B. die PFI-013-codierende Sequenz innerhalb einer Markergensequenz inseriert ist, können rekombinante Zellen, die PFI-013-codierende Regionen enthalten, durch das Nichtvorhandensein der Markergenfunktion identifiziert werden. Alternativ kann ein Markergen als Tandem mit einer PFI-013-codierenden Sequenz unter der Kontrolle eines einzelnen Promotors platziert werden. Die Expression des Markergens als Reaktion auf Induktion oder Selektion zeigt gewöhnlich auch die Expression von PFI-013 an.
Alternativ können Wirtszellen, die die codierende Sequenz für PFI-013 enthalten und PFI-013-codierende Regionen exprimieren, durch eine Vielfalt von Vorgehensweisen, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, identifiziert werden. Diese Vorgehensweisen schließen ohne Einschränkung darauf die DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung und Protein-Bioassay- oder Immunoassay-Techniken ein, welche Technologien zur Detektion und/oder Quantifizierung der Nucleinsäure oder des Proteins auf Membranbasis, Lösungsbasis oder Chipbasis einschließen.
ANTIKÖRPER
Die hierin beschriebene Aminosäuresequenz kann auch verwendet werden, um Antikörper – wie durch Verwendung von Standardtechniken – gegen die Aminosäuresequenz zu erzeugen.
Vorgehensweisen, die im Fachgebiet gut bekannt sind, können zur Produktion von Antikörpern gegen PFI-013-Polypeptide verwendet werden. Derartige Antikörper schließen ohne Einschränkung darauf polyklonale, monoklonale, chimäre, einzelkettige, Fab-Fragmente und Fragmente, die mittels einer Fab-Expressionsbibliothek produziert wurden, ein. Neutralisierende Antikörper, d.h. jene, welche die biologische Aktivität von PFI-013-Polypeptiden antagonisieren, sind für Diagnostika und Therapeutika besonders bevorzugt.
Für die Herstellung von Antikörpern können verschiedene Wirte, einschließlich Ziegen, Kaninchen, Ratten, Mause etc., durch Injektion des PFI-013-Polypeptids oder eines beliebigen Teils, einer Variante, eines Homologen, Fragments, Analogons oder Derivates davon oder eines Oligopeptids, das die immunogenen Eigenschaften beibehält, immunisiert werden. In Abhängigkeit von der Wirtspezies können verschiedene Adjuvanzien verwendet werden, um die immunologische Reaktion zu erhöhen. Derartige Adjuvanzien schließen ohne Einschränkung darauf Freund(-Adjuvans), Mineralgele, wie Aluminiumhydroxid, und oberflächenaktive Substanzen, wie Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, Hämocyanin der Schlüssellochnapfschnecke ("keyhole limpet hemocyanin") und Dinitrophenol, ein. BCG (Bacilli Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum sind potentiell zweckmäßige Adjuvanzien beim Menschen ("human adjuvants"), welche eingesetzt werden können.
Monoklonale Antikörper gegen die Aminosäuresequenz können unter Verwendung jeglicher Technik hergestellt werden, die für die Produktion von Antikörpermolekülen mittels kontinuierlicher Zelllinien in Kultur sorgt. Diese schließen ohne Einschränkung darauf die Hybridomtechnik, ursprünglich beschrieben von Köhler und Milstein (1975, Nature, Bd. 256, S. 495-497), die humane B-Zell-Hybridomtechnik (Kosbor et al. (1983), Immunol. Today, Bd. 4, S. 72; Cote et al. (1983), Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), Bd. 80, S. 2026-2030) und die EBV-Hybridomtechnik (Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc., S. 77-96) ein. Zusätzlich können Techniken, die zur Produktion von "chimären Antikörpern" entwickelt wurden, das Spleißen von Maus-Antikörpergenen an humane Antikörpergene, um ein Molekül mit geeigneter Antigenspezifität und biologischer Aktivität zu erhalten, verwendet werden (Morrison et al. (1984), Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), Bd. 81, S. 6851-6855; Neuberger et al. (1984), Nature, Bd. 312, S. 604-608; Takeda et al. (1985), Nature, Bd. 314, S. 452-454). Alternativ können die Techniken, die zur Produktion von Einzelkettenantikörpern ( US-A-4,946,779 ) beschrieben wurden, adaptiert werden, um Polypeptid-spezifische Einzelkettenantikörper herzustellen.
Antikörper können auch durch Induzieren einer in-vivo-Produktion in der Lymphozyten-Population oder mittels Durchmustern von Bibliotheken rekombinanter Immunglobuline oder von Gruppen hoch-spezifischer Bindungsreagenzien, wie offenbart bei Orlandi et al. (1989, Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), Bd. 86, S. 3833-3837) und bei Winter, G. und Milstein, C. (1991, Nature, Bd. 349, S. 293-299), produziert werden.
Antikörperfragmente, die spezifische Bindungsstellen für PFI-013 enthalten, können ebenfalls erzeugt werden. Zum Beispielen schließen derartige Fragmente ohne Einschränkung darauf die F(ab')₂-Fragmente ein, die durch Pepsinverdau des Antikörpermoleküls produziert werden können, und die Fab-Fragmente, die durch Reduzieren der Disulfidbrücken der F(ab')₂-Fragmente erzeugt werden können, ein. Alternativ können Fab-Expressionsbibliotheken konstruiert werden, um eine rasche und leichte Identifizierung monoklonaler Fab-Fragmente mit der gewünschten Spezifität zu ermöglichen (Huse, W.D. et al. (1989), Science, Bd. 256, S. 1275-1281).
Eine alternative Technik beinhaltet das Durchmustern von Phagen-Display-Bibliotheken, wobei der Phage z.B. scFv-Fragmente auf der Oberfläche seiner Hülle mit einer gro ßen Vielfalt von Komplementaritäts-bestimmenden Regionen ("complementarity determining regions") (CDRs) exprimiert. Diese Technik ist im Fachgebiet gut bekannt.
PFI-013-spezifische Antikörper sind zur Diagnose von Zuständen und Erkrankungen, die mit der Expression des PFI-013-Rezeptors assoziiert sind, zweckmäßig. Eine Vielfalt von Protokollen für kompetitive Bindungs- oder immunradiometrische Assays unter Verwendung von entweder polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern mit etablierten Spezifitäten ist im Fachgebiet gut bekannt. Derartige Immunoassays behalten typischerweise die Bildung von Komplexen zwischen dem PFI-013-Polypeptid und seinem spezifischen Antikörper (oder einem ähnlichen PFI-013-Bindungsmolekül) und die Messung der Komplexbildung. Ein zweiseitiger Immunoassay auf Basis monoklonaler (Antikörper), der monoklonale Antikörper verwendet die gegenüber zwei nicht-interferierenden Epitopen auf einem spezifischen PFI-013-Protein reaktiv sind, ist bevorzugt, aber ein kompetitiver Bindungsassay kann ebenfalls verwendet werden. Diese Assays sind bei Maddox, D.E. et al. (1983, Journal of Experimental Medicine, Bd. 158, S. 1211) beschrieben.
Anti-PFI-013-Antikörper sind zur Diagnose von Störungen, die eine abnormale Signaltransduktion beinhalten, oder anderen Störungen oder Erkrankungen, die durch eine abnormale Expression eines PFI-013-Rezeptors gekennzeichnet sind, zweckmäßig. Diagnostische Assays für PFI-013 schließen Verfahren ein, die den Antikörper und eine Markierung verwenden, um ein PFI-013-Polypeptid in humanen Körperflüssigkeiten, Zellen, Geweben oder Sektionen oder Extrakten derartiger Gewebe zu detektieren. Die Polypeptide und Antikörper können mit oder ohne Modifikation verwendet werden. Häufig werden die Polypeptide und Antikörper markiert werden, indem sie entweder kovalent oder nicht-kovalent mit einem Reportermolekül verbunden werden. Eine breite Vielfalt von Reportermolekülen ist Fachleuten auf dem Gebiet bekannt.
Antikörper können in einem Verfahren zum Detektieren von Polypeptiden, die in biologischen Proben vorhanden sind, mittels eines Verfahrens verwendet werden, welches umfasst: (a) Bereitstellen eines erfindungsgemäßen Antikörpers, (b) Inkubieren einer biologischen Probe mit dem Antikörper unter Bedingungen, die die Bildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes ermöglichen, und (c) Bestimmen, ob der Antikörper-Antigen-Komplex, umfassend den genannten Antikörper, gebildet wird.
Antikörper können auch zur Anreicherung oder Isolierung von Eosinophilen aus Säuger-, vorzugsweise Human-, Blut verwendet werden. In einem bevorzugten Beispiel werden die Antikörper an einen festen Träger, z.B. magnetische Kügelchen, gebunden, mit den Leukozyten aus periphärem Blut inkubiert, dann werden die Kügelchen mit gebundenen Eosinophilen unter Verwendung eines Magneten von den nicht-gebundenen Zellen entfernt. Andere ähnliche Methoden zur Verwendung von Antikörpern zur Isolierung von spezifischen Zellen aus einem Gemisch von Zelltypen sind dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt.
Antikörper können an einen festen Träger gebunden werden und/oder in Kits in einem geeigneten Behälter zusammen mit geeigneten Reagenzien, Kontrollen, Anweisungen und dergleichen verpackt werden.
ASSAYS/IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch ein Assay-Verfahren zum Detektieren des Vorhandenseins von PFI-013 in Zellen (wie humanen Zellen), umfassend: (a) Durchführen einer Reverse-Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) an RNA (wie Gesamt-RNA) aus solchen Zellen unter Verwendung eines Paars von PCR-Primern, die für PFI-013 spezifisch sind, wie aus der DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, oder einer Allelvariante davon bestimmt, und (b) Untersuchen des Auftretens eines PCR-Fragments in geeigneter Größe – wie mittels Agarosegelelektrophorese.
Es gibt zahlreiche Assays, in denen das hierin beschriebene Polypeptid verwendet werden kann, um ein Screening auf Modulatoren (z.B. Antagonisten oder Agonisten) des Polypeptids durchzuführen. Beispiele für derartige Assays schließen Folgendes ein: Funktionsassay bzw. funktioneller Assay ("functional assay") – Ein Beispiel eines Verfahrens für ein Screening von Rezeptoren, um Modulatoren davon zu identifizieren, ist, die inhibierende oder stimulierende Wirkung bei cAMP- oder Adenylatcyclase-Akkumulation zu überwachen. Ein derartiger Assay beinhaltet das Transfizieren einer Säugerzelle mit dem Rezeptor der vorliegenden Erfindung zur Zelloberflächenexpression. Die Zelle wird dann gegenüber einem möglichen Modulator exponiert, und die Menge an cAMP-Akkumulation wird gemessen. Wenn der mögliche Modulator den Rezeptor bindet und eine funktionelle Wirkung aufweist, werden die Level von Rezeptor-vermitteltem/r cAMP oder Adenylatcyclase-Aktivität entweder zunehmen oder abnehmen.
Funktionsassay unter Verwendung eines Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Lesegeräts ("Fluorometric Imaging Plate Reader") (FLIPR^®) – Eine Technik, die für Screenings verwendet wird und die Verwendung von Zellen einschließt, die einen Rezeptor (z.B. transfizierte HEK293-Zellen) exprimieren, in einem System, das intrazelluläre Calcium- oder extrazelluläre pH- Änderungen misst, die durch eine Rezeptoraktivierung verursacht werden. Bei dieser Technik können Zellen, die den Rezeptor exprimieren, mit Verbindungen (z.B. kleine Moleküle, Peptide, Lipide, Nucleotide oder Glycoproteine) in Kontakt gebracht werden, die eine zweite(r) Messenger-Reaktion, z.B. Signaltransduktion, Veränderung bei den Calciumspiegeln oder pH-Änderungen, verursachen. Diese Veränderungen werden verwendet, um zu bestimmen, ob die potentielle Verbindung den Rezeptor aktiviert oder inhibiert. Ligandenbindungs-Assay – Dieser Assay-Typ kann auf die Bindung einer Kandidatenverbindung prüfen, wobei die Adhärenz an Zellen, die den hierin beschriebenen Rezeptor enthalten, mittels einer Markierung, die direkt oder indirekt mit der Kandidatenverbindung assoziiert ist, oder in einem Assay, der eine Konkurrenz mit einem markierten Konkurrenten bzw. Kompetitor umfasst, detektiert wird. Standardassays zum Durchführen von Screenings, die bestimmen, ob die Verbindung den Rezeptor aktiviert oder inhibiert, werden von Fachleuten auf dem Gebiet gut verstanden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Identifizieren von Mitteln bzw. Agenzien (wie Verbindungen, anderen Substanzen oder Zusammensetzungen, umfassend dieselben), die die Aktivität von PFI-013 und/oder die Expression davon beeinflussen (wie antagonisieren, agonisieren oder anderweitig modifizieren), wobei das Verfahren das Inkontaktbringen von PFI-013 oder der Nucleotidsequenz, die für dasselbe codiert, mit dem Mittel und anschließend das Messen der Aktivität von PFI-013 und/oder der Expression davon umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Identifizieren von Mitteln bzw. Agenzien (wie Verbindungen, anderen Substanzen oder Zusammensetzungen, umfassend dieselben), die die Aktivität von PFI-013 und/oder die Expression davon beeinflussen (wie antagonisieren, agonisieren oder anderweitig modifizieren), wobei das Verfahren das Messen der Aktivität von PFI-013 und/oder der Expression davon in Gegenwart des Mittels oder Agens oder nach Zugabe des Mittels oder Agens bei: (a) einer Zelllinie, in welche rekombinante DNA, umfassend die in SEQ ID NO: 1 gezeigte DNA-Sequenz, inkorporiert wurde, oder (b) einer Zellpopulation oder Zelllinie, die natürlicherweise PFI-013 selektiv exprimiert, umfasst. Vorzugsweise wird die Aktivität von PFI-013 mittels der oben beschriebenen Assay-Verfahren bestimmt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Screening auf ein Mittel zur Modulation (vorzugsweise zur spezifischen Modulation) der PFI-013-Aktivität oder der Expression der Nucleotidsequenz, die für dasselbe codiert, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst: (a) Bereitstellen eines Kandidatenmittels bzw. Kandidaten-Agens, (b) Kombinieren von PFI-013 oder der Nucleotidsequenz, die für dasselbe codiert, mit dem Kandidatenmittel für eine Zeit, die ausreichend ist, um eine Modulation unter geeigneten Bedingungen zu ermöglichen; und (c) Detektieren der Modulation des Kandidatenmittels bei PFI-013 oder der Nucleotidsequenz, die für dasselbe codiert, um sicherzustellen, ob das Kandidatenmittel die PFI-013-Aktivität oder die Expression der Nucleotidsequenz, die für dasselbe codiert, moduliert.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Screening auf ein Mittel hinsichtlich einer spezifischen Bindungsaffinität mit PFI-013 oder der Nucleotidsequenz, die für dasselbe codiert, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellen eines Kandidatenmittels bzw. Kandidaten-Agens, (b) Kombinieren von PFI-013 oder der Nucleotidsequenz, die für dasselbe codiert, mit dem Kandidatenmittel für eine Zeit, die ausreichend ist, um eine Bindung unter geeigneten Bedingungen zu ermöglichen, und (c) Detektieren der Bindung des Kandidatenmittels an PFI-013 oder die Nucleotidsequenz, die für dasselbe codiert, um sicherzustellen, ob das Kandidatenmittel an PFI-013 oder die Nucleotidsequenz, die für dasselbe codiert, bindet.
Somit können in bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung PFI-013 und/oder eine Zelllinie, die das PFI-013 exprimiert, verwendet werden, um ein Screening auf Antikörper, Peptide oder andere Mittel bzw. Agenzien, wie organische oder anorganische Moleküle, durchzuführen, die als Modulatoren (z.B. Antagonisten oder Agonisten) von PFI-013-Aktivität oder für die Expression davon wirken, wodurch ein therapeutisches Mittel identifiziert wird, das zur Modulation des Rezeptors befähigt ist. Alternativ kann ein Screening von Peptid-Bibliotheken oder Bibliotheken organischer Stoffe, die mittels kombinatorischer Chemie hergestellt wurden, mit rekombinant exprimierten PFI-013 oder Zelllinien, die PFI-013 exprimieren, zweckmäßig sein zur Identifizierung von therapeutischen Mitteln, die über eine Modulation des Rezeptors wirken. Synthetische Verbindungen, natürliche Produkte und andere Quellen von potentiell biologisch aktiven Materialien können in einer Anzahl von Weisen durchmustert werden, die für Fachleute auf dem Gebiet als Routine angesehen werden. Zum Beispiel können Nucleotidsequenzen, die die N-terminale Region von PFI-013 codieren, in einer Zelllinie exprimiert werden, welche für ein Screening von allosterischen Modulatoren, entweder Agonisten oder Antagonisten, der PFI-013-Aktivität verwendet werden kann.
Ein PFI-013-Polypeptid, seine immunogenen Fragmente oder Oligopeptide davon können für ein Screening von therapeutischen Verbindungen in einer Beliebigen einer Vielfalt von Wirkstoff-Screening-Techniken verwendet werden. Das Polypeptid, das in einem derartigen Test eingesetzt wird, kann frei in Lösung, gebunden an einen festen Träger, hervorgebracht auf einer Zelloberfläche oder intrazellulär lokalisiert vorliegen. Die Bildung von Bindungskomplexen zwischen einem PFI-013-Polypeptid und dem getesteten Mittel bzw. Agens kann gemessen werden.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Screening einer oder einer Vielzahl von Verbindungen hinsichtlich einer Modulation (vorzugsweise einer spezifischen Modulation, wie der spezifischen Bindungsaffinität) von PFI-013 oder der Expression davon, umfassend das Bereitstellen von einer oder einer Vielzahl von Verbindungen, das Kombinieren eines PFI-013 oder einer Nucleotidsequenz, die für dasselbe codiert, mit der Verbindung oder jeder einer Vielzahl von Verbindungen für eine Zeit, die ausreichend ist, um die Modulation unter geeigneten Bedingungen zu ermöglichen, und das Detektieren der Bindung eines PFI-013 an jede der Vielzahl von Verbindungen, wodurch die Verbindung oder die Verbindungen identifiziert wird/werden, welche ein PFI-013 oder eine Nucleotidsequenz, die für dasselbe codiert, moduliert/modulieren. Bei einem derartigen Assay kann die Vielzahl von Verbindungen mittels Techniken der kombinatorischen Chemie, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, hergestellt werden.
Eine andere Technik für das Wirkstoff-Screening sorgt für ein Screening mit hohem Probendurchsatz ("high throughput screening") (HTS) von Verbindungen mit geeigneter Bindungsaffinität für die PFI-013-Polypeptide und basiert auf dem Verfahren, das detailliert in Geysen, WO 84/03564 , veröffentlicht am 13. September 1984, beschrieben wurde. Zusammengefasst werden große Zahlen verschiedener kleiner Peptid-Testverbindungen an einem festen Substrat, wie Kunststoffnadeln oder einer anderen Oberfläche, synthetisiert. Die Peptid-Testverbindungen werden mit PFI-013-Fragmenten umgesetzt, und es wird gewaschen. Ein gebundenes PFI-013 wird dann detektiert – wie durch geeignetes Adaptieren von Verfahren, die im Fachgebiet gut bekannt sind. Zur Verwendung in den zuvor genannten Wirkstoff-Screening-Techniken können auch Platten direkt mit gereinigtem PFI-013 beschichtet werden. Alternativ können nicht-neutralisierende Antikörper verwendet werden, um das Peptid einzufangen bzw. zu binden und es auf einem festen Träger zu immobilisieren.
Diese Erfindung beschreibt auch die Verwendung kompetitiver Wirkstoff-Screening-Assays, in welchen neutralisierende Antikörper, die zum Binden eines PFI-013-Polypeptids befähigt sind, spezifisch mit einer Testverbindung um die Bindung an PFI-013 konkurrieren. In dieser Weise können die Antikörper verwendet werden, um das Vorhandensein jedes beliebigen Peptids zu detektieren, das eine oder mehrere antigene Determinanten mit einem PFI-013 teilt.
Das in der vorliegenden Erfindung beschriebene Assay-Verfahren kann ein Screening mit hohem Probendurchsatz (HTS) sein. In dieser Hinsicht können die Lehren von WO 84/03564 für das PFI-013 der vorliegenden Erfindung adaptiert werden.
Die Lehren von US-A-5,738,985 können ebenfalls für das Assay-Verfahren adaptiert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Mittels bzw. Agens, um PFI-013-Aktivität zu beeinflussen (wie seine GPCR-Aktivität zu antagonisieren, modulieren oder agonisieren).
DIAGNOSTIKA
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch eine diagnostische Zusammensetzung zur Detektion von PFI-013-Polynucleotidsequenzen. Die diagnostische Zusammensetzung kann die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Sequenz oder eine Variante, ein Homologes, Fragment, Analogon oder Derivat davon oder eine Sequenz, die zur Hybridisierung an die gesamte in SEQ ID NO: 1 gezeigte Nucleotidsequenz oder an einen Teil davon oder an eine Allelvariante davon befähigt ist, umfassen.
Um eine Grundlage für die Diagnose einer Erkrankung bereitzustellen, sollten normale oder Standardwerte einer PFI-013-Polypeptidexpression etabliert werden. Dies wird durch Kombinieren von Körperflüssigkeiten oder Zellextrakten, die von normalen Subjekten, entweder Tieren oder Menschen, entnommen wurden, mit einem Antikörper gegen ein PFI-013-Polypeptid unter Bedingungen, die für eine Komplexbildung geeignet sind, die im Fachgebiet gut bekannt sind, erreicht. Die Menge an Standardkomplexbildung kann quantifiziert werden, indem sie mit einer Verdünnungsreihe von Positivkontrollen verglichen wird, wobei eine bekannte Menge Antikörper mit bekannten Konzentrationen eines gereinigten PFI-013-Polypeptids kombiniert wird. Dann können die Standardwerte, die von normalen Proben erhalten wurden, mit den Werten verglichen werden, die von Proben von Subjekten erhalten wurden, die potentiell durch eine Störung oder Erkrankung, die mit einer PFI-013-Polypeptidexpression in Verbindung steht, beeinflusst wurden. Eine Abweichung zwischen Standard- und Subjektwerten etabliert das Vorhandensein des Erkrankungszustandes.
Ein PFI-013-Polynucleotid oder ein beliebiger Teil davon kann die Basis für eine diagnostische und/oder eine therapeutische Verbindung liefern. Für diagnostische Zwecke können PFI-013-Poylnucleotidsequenzen verwendet werden, um die Genexpression bei Zuständen, Störungen oder Erkrankungen, die mit der PFI-013-Aktivität in Verbindung gebracht werden können, zu detektieren und zu quantifizieren.
Eine PFI-013-codierende Polynucleotidsequenz kann für die Diagnose von Erkrankungen verwendet werden, die aus der Expression von PFI-013 resultieren. Zum Beispiel können Polynucleotidsequenzen, die PFI-013 codieren, in Hybridisierungs- oder PCR-Assays von Geweben aus Biopsien oder Autopsien oder biologischen Flüssigkeiten, wie Serum, Synovia, oder einer Tumorbiopsie verwendet werden, um Abnormalitäten bei der PFI-013-Expression zu detektieren. Die Form derartiger qualitativer oder quantitativer Verfahren kann Southern- oder Northern-Analyse, Dot-Blot oder andere Membran-basierte Technologien, PCR-Technologien, Diagnostikstreifen- bzw. Tauchstreifen-, Nadel- bzw. Pin- oder Chip-Technologien und ELISA oder andere Technologien mit Mehrfachprobenformat einschließen. Alle diese Techniken sind im Fachgebiet gut bekannt, und sie sind tatsächlich die Grundlage vieler kommerziell erhältlicher diagnostischer Kits.
Derartige Assays können maßgeschneidert sein, um die Effizienz eines speziellen therapeutischen Behandlungsregimens zu evaluieren, und sie können in Tierstudien, in klinischen Versuchen oder beim Überwachen der Behandlung eines individuellen Patienten verwendet werden. Um eine Grundlage für die Diagnose einer Erkrankung bereitzustellen, sollte ein normales oder Standardprofil für die PFI-013-Expression etabliert werden. Dieses wird durch Kombinieren von Körperflüssigkeiten oder Zellextrakten, die von normalen Subjekten, entweder Tier oder Mensch, entnommen wurden mit PFI-013 oder einem Teil davon unter Bedingungen, die zur Hybridisierung oder Amplifikation geeignet sind, erreicht. Die Standardhybridisierung kann durch Vergleichen der Werte, die von normalen Subjekten erhalten wurden, mit einer Verdünnungsreihe von Positivkontrollen, die in demselben bzw. gleichen Versuch mitgeführt wurden, wobei eine bekannte Menge an gereinigtem PFI-013 verwendet wird, quantifiziert werden. Die Standardwerte, die von normalen Proben erhalten wurden, können mit Werten verglichen werden, die von Proben von Subjekten erhalten wurden, die potentiell durch eine Störung oder Erkrankung, die mit der Expression der PFI-013-codierenden Sequenz in Verbindung steht, beeinflusst werden. Eine Abweichung zwischen Standard- und Subjektwerten stellt das Vorhandensein des Erkrankungszustands fest. Wenn eine Erkrankung festgestellt wurde, wird ein bestehendes therapeutisches Mittel verabreicht und ein Behandlungsprofil oder Behandlungswerte können erzeugt werden. Schließlich kann der Assay auf einer regelmäßigen Basis wiederholt werden, um zu beurteilen, ob die Werte in Richtung der normalen oder Standardmuster voranschreiten oder dorthin zurückkehren. Nachfolgende bzw. sukzessive Behandlungsprofile können verwendet werden, um die Wirksamkeit bzw. Effizienz der Behandlung über eine Dauer von mehreren Tagen oder mehreren Monaten zu zeigen.
Somit beschreibt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines PFI-013-Polypeptids oder einer Variante, eines Homologen, Fragments, Analogons oder Derivats davon, um Anti-PFI-013-Antikörper zu produzieren, welche z.B. diagnostisch verwendet werden können, um PFI-013-Spiegel bei Erkrankungszuständen zu detektieren und zu quantifizieren.
Die vorliegende Erfindung beschreibt weiterhin diagnostische Assays und Kits zur Detektion von PFI-013 in Zellen und Geweben, umfassend ein gereinigtes PFI-013, welches als Positivkontrolle verwendet werden kann, und Anti-PFI-013-Antikörper. Derartige Antikörper können in Lösungs-basierten, Membran-basierten oder Gewebe-basierten Technologien verwendet werden, um einen beliebigen Erkrankungszustand oder Zustand, der mit der Expression des PFI-013-Proteins oder der Expression von Deletionen oder einer Variante, eines Homologen, Fragments, Analogons oder Derivates davon in Verbindung steht, zu detektieren.
Alternativ beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Diagnostizieren einer Erkrankung oder einer Anfälligkeit für eine Erkrankung, die mit einer Unterexpression von PFI-013 in Verbindung steht, bei einem Patienten, umfassend: das Bestimmen einer Mutation in der Nucleinsäuresequenz, die PFI-013 codiert, oder die Menge des PFI-013 in einer Probe, die von einem Patienten stammt. Es wird auch ein diagnostisches Verfahren bereitgestellt, umfassend das Analysieren bzw. eine Untersuchung hinsichtlich des Vorhandenseins von PFI-013 in einer Probe, die von einem Wirt stammt.
SONDEN
Ein anderer hierin beschriebener Aspekt ist die Bereitstellung von Nucleinsäure-Hybridisierungs- oder -PCR-Sonden, die zum Detektieren von Polynucleotidsequenzen, einschließlich genomischer Sequenzen, die die PFI-013-codierende Region codieren, oder nahe verwandter Moleküle, wie Allelen, befähigt sind. Die Spezifität der Sonde, d.h., ob sie von einer hoch konservierten, konservierten oder nicht-konservierten Region oder Domäne abgeleitet ist, und die Stringenz der Hybridisierung oder Amplifikation (hoch, mittel oder gering) wird bestimmen, ob die Sonde nur die natürlich vorkommende PFI-013-codierende Sequenz oder verwandte Sequenzen identifiziert. Sonden zur Detektion von verwandten Nucleinsäuresequenzen werden aus konservierten oder hoch konservierten Nucleotidregionen von PFI-013-Polynucleotiden, wie der 3'-Region, ausgewählt und derartige Sonden können in einem Pool von degenerierten Sonden verwendet werden. Zur Detektion von identischen Nucleinsäuresequenzen oder wenn eine maximale Spezifität gewünscht ist, werden Nucleinsäuresonden aus den nicht-konservierten Nucleotidbereichen oder aus einzigartigen Bereichen von PFI-013-Polynucleotiden ausgewählt. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "nicht-konservierte Nucleotidregion" auf eine Nucleotidregion, die für die hierin offenbarte PFI-013-codierende Sequenz einzigartig ist und die in verwandten Sequenzen nicht auftritt.
Eine PCR, wie in US-A-4,683,195 , US-A-4,800,195 und US-A-4,965,188 beschrieben, stellt zusätzliche Verwendungen für Oligonucleotide, basierend auf der PFI-013-Sequenz, bereit. Derartige Oligomere werden allgemein chemisch synthetisiert, aber sie können auch enzymatisch erzeugt werden oder aus einer rekombinanten Quelle hergestellt werden. Die Oligomere umfassen allgemein zwei Nucleotidsequenzen, eine in Sense-Orientierung (5' → 3') und eine in Antisense(-Orientierung) (3' ← 5'), die unter optimierten Bedingungen zur Identifizierung eines speziellen Gens oder eines speziellen Zustandes eingesetzt werden. Die gleichen zwei Oligomere, verschachtelte Gruppen von Oligomeren oder sogar ein degenerierter Pool von Oligomeren können unter weniger stringenten Bedingungen zur Detektion und/oder Quantifizierung von nahe verwandten DNA- oder RNA-Sequenzen eingesetzt werden.
Die Nucleinsäuresequenz für PFI-013 kann auch verwendet werden, um Hybridisierungssonden, wie zuvor beschrieben, zur Kartierung der endogenen genomischen Sequenz zu erzeugen. Die Sequenz kann auf einem bestimmten Chromosom oder einer spezifischen Region des Chromosoms unter Verwendung gut bekannter Techniken kartiert werden. Diese schließen in-situ-Hybridisierung von Chromosomenbereichen (Verma et al. (1988), Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York City, USA), Durchfluss-sortierte ("flow sorted") Chromosomenpräparationen oder künstliche Chromosomenkonstruktionen, wie künstliche Hefechromosomen ("yeast artificial chromosomes") (YACs), künstliche Bakterienchromosomen ("bacterial artificial chromosomes") (BACs), bakterielle PI-Konstruktionen oder Einzelchromosomen-cDNA-Bibliotheken ein.
Die in-situ-Hybridisierung von Chromosomenpräparationen und physikalische Kartierungstechniken, wie Verknüpfungs- bzw. Kopplungsanalyse, unter Verwendung etablierter chromosomaler Marker bzw. Chromosomenmarker, sind bei der Erweiterung genetischer Karten bzw. von Chromosomenkarten von unschätzbarem Wert. Beispiele genetischer Karten können in Science (1995, 270:410f. und 1994, 265:1981f.) gefunden werden. Häufig kann die Platzierung eines Gens auf dem Chromosom einer anderen Säugerspezies assoziierte Marker enthüllen, sogar wenn die Nummer oder der Arm eines speziellen humanen Chromosoms nicht bekannt ist. Neue Sequenzen können Chromosomenarmen oder Teilen davon durch physikalische Kartierung zugeordnet werden. Dies stellt wertvolle Informationen für Forscher bereit, die nach Krankheitsgenen unter Verwendung von Positionsklonierung oder anderen Genermittlungstechniken suchen. Sobald eine Erkrankung oder ein Syndrom, wie Ataxia teleangiectasita (AT), über genetische Verknüpfung mit einer bestimmten genomischen Region, z.B. AT mit 11q22-23 (Gatti et al. (1988), Nature, 336:577-580), grob lokalisiert wurde, können jegliche Sequenzen, die in diesem Gebiet kartiert wurden, assoziierte oder regulatorische Gene für eine weitere Untersuchung darstellen. Die Nucleotidsequenz, des Gegenstands der Erfindung, kann auch verwendet werden, um Unterschiede in der chromosomalen Lokalisierung aufgrund von Translokation, Inversion etc. zwischen normalen, Träger- oder betroffenen Individuen zu detektieren.
PHARMAZEUTIKA
Hierin beschrieben wird eine pharmazeutische Zusammensetzung zum Behandeln eines Individuums, der derselben aufgrund der PFI-013-Aktivität bedarf, wobei die Zusammensetzung eine therapeutisch wirksame Menge eines Mittels bzw. Agens, das die Aktivität moduliert (wie antagonisiert oder agonisiert), und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel, Exzipiens oder Adjuvans umfasst.
Somit beschreibt die vorliegende Erfindung auch pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend die Mittel der vorliegenden Erfindung (ein Mittel, das zur Modulation der Expressionsmuster der Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung oder der Aktivität des Expressionsproduktes davon befähigt ist, und/oder ein Mittel, das mittels eines Assays gemäß der vorliegenden Erfindung identifiziert wurde). In dieser Hinsicht und insbesondere im Hinblick auf eine Humantherapie werden die Mittel, obwohl sie allein verabreicht werden können, allgemein in Mischung mit einem pharmazeutischen Träger, Adjuvans, Exzipiens oder Verdünnungsmittel, ausgewählt im Hinblick auf den beabsichtigten Verabreichungsweg und gemäß der pharmazeutischen Standardpraxis, verabreicht werden.
Beispielsweise können die Mittel in den pharmazeutischen Zusammensetzungen mit jeglichem/n geeignetem/n Bindemittel/n, Schmier- bzw. Gleitmittel/n, Suspendierungsmittel/n, Überzugsmittel/n oder Solubilisierungsmittel/n gemischt werden.
Im Allgemeinen liegt eine therapeutisch wirksame tägliche orale oder intravenöse Dosis der Mittel wahrscheinlich im Bereich von 0,01 bis 50 mg/kg Körpergewicht des zu behandelnden Subjekts, vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 20 mg/kg. Das Mittel kann auch mittels intravenöser Infusion mit einer Dosis, die wahrscheinlich im Bereich von 0,001 bis 10 mg/kg/h liegt, verabreicht werden.
Somit beschreibt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zum Behandeln eines Individuums, der desselben aufgrund der PFI-013-Aktivität bedarf, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung an das Individuum.
Typischerweise wird der Arzt die tatsächliche Dosierung bestimmen, die für einen individuellen Patienten am geeignetsten sein wird, und sie wird mit Alter, Gewicht, Geschlecht und Reaktion des speziellen Patienten variieren. Die obigen Dosierungen sind exemplarisch für den durchschnittlichen Fall. Es kann natürlich einzelne Fälle geben, in denen höhere oder niedrigere Dosierungsbereiche angemessen sind.
Wo geeignet, können die pharmazeutischen Zusammensetzungen mittels Inhalation, in Form eines Suppositoriums oder Pessars, topisch in Form einer Lotion, Lösung, Creme, Salbe oder eines Streupuders, durch Verwendung eines Hautpflasters, oral in Form von Tabletten, die Exzipienzien, wie Stärke oder Lactose, enthalten, oder in Kapseln oder Ovula, entweder allein oder in Beimischung mit Exzipienzien, oder in Form von Elixiren, Lösungen oder Suspensionen, die Aroma-gebende Mittel oder färbende Mittel enthalten, verabreicht werden, oder sie können parenteral, z.B. intrakavernosal, intravenös, intramuskulär oder subkutan, injiziert werden. Zur parenteralen Verabreichung können die Zusammensetzungen am besten in Form einer sterilen wässrigen Lösung verwendet werden, welche andere Substanzen, z.B. genügend Salze oder Monosaccharide, um die Lösung mit Blut isotonisch zu machen, enthalten können. Zur bukkalen oder sublingualen Verabreichung können die Zusammensetzungen in Form von Tabletten oder Pastillen verabreicht werden, die in einer konventionellen Weise formuliert werden können.
Zur oralen, parenteralen, bukkalen und sublingualen Verabreichung an Subjekte (wie Patienten) kann der tägliche Dosierungslevel der Mittel der vorliegenden Erfindung typischerweise von 10 bis 500 mg (in Einzel- oder geteilten Dosen) betragen. Somit und beispielsweise können Tabletten oder Kapseln von 5 bis 100 mg aktives Mittel bzw. Agens für eine einzelne oder zwei- oder mehrmalige Verabreichung zu einem Zeitpunkt, wie angemessen, enthalten. Es ist auch möglich, die Mittel in Formulierungen mit verzögerter bzw. verlängerter ("sustained") Freisetzung zu verabreichen.
In einigen Applikationen, allgemein bei Menschen, ist die orale Verabreichung der Mittel der bevorzugte Weg, da er der bequemste ist, und er kann in einigen Fällen Nachteile vermeiden, die mit anderen Verabreichungswegen assoziiert sind – wie jene, die mit intrakavernosaler (i.c.) Verabreichung assoziiert sind. Bei Zuständen, in denen der Empfänger an einer Schluckstörung oder einer Beeinträchtigung der Wirkstoffabsorption nach oraler Verabreichung leidet, kann der Wirkstoff parenteral, sublingual oder bukkal verabreicht werden.
Bei veterinärmedizinischer Verwendung wird ein Mittel typischerweise als eine entsprechend annehmbare Formulierung in Übereinstimmung mit der normalen veterinärmedizinischen Praxis verabreicht, und der Tierarzt wird das Dosierungsregimen und den Verabreichungsweg bestimmen, der für ein spezielles Tier am geeignetsten sein wird. Wie bei Humanbehandlungen kann es jedoch möglich sein, das Mittel allein für veterinärmedizinische Behandlungen zu verabreichen.
Typischerweise werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen – welche für Verwendung bei Mensch oder Tier sein können – ein beliebiges pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel, einen beliebigen pharmazeutisch annhembaren Träger, ein beliebiges pharmazeutisch annehmbares Exzipiens oder Adjuvans oder mehrere davon umfassen. Die Auswahl des pharmazeutischen Trägers, Exzipiens, Adjuvans oder Verdünnungsmittel kann im Hinblick auf den beabsichtigten Verabreichungsweg und gemäß der pharmazeutischen Standardpraxis ausgewählt werden. Wie oben angegeben, können die pharmazeutischen Zusammensetzungen als Träger, Exzipiens, Adjuvans oder Verdünnungsmittel – oder zu sätzlich dazu – jegliche/s geeignete/s Bindemittel, Schmier- bzw. Gleitmittel, Suspendierungsmittel, Überzugsmittel oder Solubiliserungsmittel umfassen.
In einigen hierin beschriebenen Beispielen werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen eines oder mehrere der Folgenden umfassen: ein Mittel, das mittels eines Assays der vorliegenden Erfindung gescreent wurde, ein Mittel, das zur Wechselwirkung mit SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 befähigt ist.
Ebenfalls beschrieben in der Erfindung sind Oligonucleotidsequenzen, Antisense-RNA- und (-)DNA-Moleküle und Ribozyme, welche so wirken, dass die PFI-013-mRNA destabilisiert wird oder die Translation von PFI-013 inhibiert wird.
Ein PFI-013-Antisense-Molekül kann die Grundlage für eine Behandlung verschiedener abnormaler Zustände, die z.B. in Verbindung mit einer erhöhten PFI-013-Aktivität stehen, bereitstellen.
Expressionsvektoren, die von Retroviren, Adenovirus, Herpes- oder Vaccinia-Viren oder von verschiedenen Bakterienplasmiden abgeleitet sind, können zur Abgabe von rekombinanten PFI-013-Sense- oder -Antisense-Molekülen an die Zielzellpopulation verwendet werden. Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt sind, können verwendet werden, um rekombinante Vektoren zu konstruieren, die PFI-013 enthalten. Alternativ kann das rekombinante PFI-013 in Liposomen an Zielzellen abgegeben werden.
Die cDNA-Sequenz der vollen Länge und/oder ihre regulatorischen Elemente ermöglichen es Forschern, PFI-013 als Werkzeug in Sense (Youssoufian, H. und H.F. Lodish (1993), Mol. Cell. Biol., 13:98-104)- oder Antisense (Eguchi et al. (1991), Annu. Rev. Biochem., 60:631-652)-Untersuchungen der Genfunktion zu verwenden. Oligonucleotide, die aus der cDNA oder Kontrollsequenzen, die aus der genomischen DNA erhalten wurden, konstruiert wurden, können in vitro oder in vivo verwendet werden, um die Expression zu inhibieren. Eine derartige Technologie ist im Fachgebiet gut bekannt und Sense- oder Antisense-Oligonucleotide oder größere Fragmente können aus verschiedenen Orten entlang der codierenden oder Kontrollregionen konstruiert werden. Geeignete Oligonucleotide, welche 20 Nucleotide lang sein können, können verwendet werden, um PFI-013-Sequenzen oder nahe verwandte Moleküle aus Human-Bibliotheken zu isolieren.
Zusätzlich kann die PFI-013-Expression moduliert werden, indem eine Zelle oder ein Gewebe mit Expressionsvektoren transfiziert wird, welche hohe Level eines PFI-013-Fragments exprimieren, und zwar bei Bedingungen, bei denen es bevorzugt wäre, die PFI- 013-Aktivität zu blockieren. Derartige Konstrukte können Zellen mit nicht-translatierbaren Sense- oder Antisense-Sequenzen überschwemmen. Sogar bei Fehlen der Integration in die DNA können derartige Vektoren damit fortfahren, RNA-Moleküle zu transkribieren, bis alle Kopien des Vektors durch endogene Nucleasen inaktiviert bzw. unwirksam gemacht sind. Eine derartige vorübergehende Expression kann bei einem nicht-replizierenden Vektor einen Monat oder länger dauern und sogar noch länger, wenn geeignete Replikationselemente Teil des Vektorsystems sind.
Modifikationen der Genexpression können erhalten werden, indem Antisense-Sequenzen zu den Kontrollregionen des PFI-013-Gens, wie Promotoren, Enhancer und Introns, konstruiert werden.
Oligonucleotide, die von der Transkriptionsstartstelle, z.B. von den zwischen -10- und +10-Regionen der Signal- bzw. Leitsequenz, abgeleitet sind, sind bevorzugt. Antisense-RNA- und -DNA-Moleküle können auch so konstruiert werden, dass sie die Translation der mRNA durch Verhinderung des Bindens des Transkripts an die Ribosomen blockieren. In ähnlicher Weise kann eine Inhibierung unter Verwendung der Hogeboom-Basenpaarungsmethodologie ("Hogeboom base-pairing methodology"), auch bekannt als "Tripelhelix"-Basenpaarung ("triple helix base-pairing"), erreicht werden. Die Tripelhelix-Paarung bzw. -Gruppierung ("triple helix pairing") beeinträchtigt die Fähigkeit der Doppelhelix, sich in ausreichender Weise für die Bindung von Polymerasen, Transkriptionsfaktoren oder regulatorischen Molekülen zu öffnen.
Somit beschreibt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Mittel (oder sogar ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon oder ein pharmazeutisch annehmbares Solvat davon), das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung identifiziert wurde, zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel, Adjuvans, Exzipiens oder einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Die pharmazeutische Zusammensetzung könnte zur veterinärmedizinischen (d.h. beim Tier) Verwendung oder zur Verwendung beim Menschen verwendet werden.
Somit beschreibt die vorliegende Erfindung auch pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend wirksame Mengen an Modulatoren (z.B. Antagonisten oder Agonisten) des PFI-013-Proteins (einschließlich Antisense-Nucleinsäuresequenzen) in Mischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel, Träger, Exzipiens oder Adjuvans (einschließlich Kombinationen davon).
Die vorliegende Beschreibung beschreibt pharmazeutische Zusammensetzungen, die alle bzw. eine gesamte der oder Teile von PFI-013-Polynucleotidsequenzen, PFI-013-Antisense-Molekülen, PFI-013-Polypeptiden, Protein-, Peptid- oder organischen Modulatoren der PFI-013-Bioaktivität, wie Antagonisten (einschließlich Antikörper) oder Agonisten, allein oder in Kombination mit mindestens einem anderen Mittel, wie einer stabilisierenden Verbindung, umfassen können und in einen beliebigen sterilen, biokompatiblen pharmazeutischen Träger, einschließlich, aber ohne Einschränkung darauf, Salzlösung, gepufferte Salzlösung, Dextrose und Wasser, verabreicht werden können.
LITERATURVERWEISE AUF DIE ALLGEMEINE METHODOLOGIE
Obwohl die hierin erwähnten Techniken im Allgemeinen im Fachgebiet gut bekannt sind, kann ein Literaturverweis insbesondere auf Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989), und Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999), 4. Auflage, John Wiley & Sons, Inc., erfolgen. Die PCR wird in US-A-4,683,195 , US-A-4,800,195 und US-A-4,965,188 beschrieben.
HINTERLEGUNGEN
Die folgende Probe wurde in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag bei der anerkannten Hinterlegungsstelle The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen, Schottland, AB2 1RY, Vereinigtes Königreich, am 23. August 2000 hinterlegt:
Die NCIMB-Nummer NCIMB 41073 ist Escherichia coli Pfi-013.
Die Hinterlegung erfolgte durch Pfizer Central Research, Pfizer Limited, Ramsgate Road, Sandwich, Kent, CT13 9NJ, Vereinigtes Königreich.
Ein Fachmann auf dem Gebiet könnte leicht den oben genannten E. coli-Klon (NCIMB 41073) in Luria-Nährbouillon, die Ampicillin enthält, wachsen lassen und die Plasmid-DNA aus dem Klon unter Verwendung des alkalischen Lyseverfahrens bzw. des Alkali-Lyse-Verfahrens ("akali lysis method"), wie bei Sambrook et al., Hrsg., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY, USA, beschrieben, isolieren. Das Didesoxy-Kettenabbruch-Verfahren, wie von Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) (Dez. 1977), 74(12):5463-5467) beschrieben und von Applied Biosystems (siehe Applied Biosystems, Literatur des Herstellers) zur Fluoreszenzdetektion modifiziert, könnte dann verwendet werden, um die DNA zu sequenzieren und um PFI-013 zu identifizieren.
Die vorliegende Erfindung setzt auch Sequenzen, die aus der Hinterlegung exprimierbar sind, und Ausführungsformen, die dieselben umfassen, ein. Die vorliegende Erfindung setzt auch Proteine, die Sequenzen umfassen, die aus der Hinterlegung exprimierbar sind, und Ausführungsformen, die dieselben umfassen, ein.
EINFÜHRUNG IN DEN ABSCHNITT BEISPIELE, DIE FIGUREN UND DAS SEQUENZPROTOKOLL
Die vorliegende Erfindung wird nun, nur beispielhaft, unter Bezugnahme auf die begleitenden Figuren und das Sequenzprotokoll beschrieben werden, wobei:
1 ein Schema zur bioinformatischen Analyse von PFI-013 zeigt (Db = Datenbank).
2 ein ClustalW-Alignment von PFI-013 mit dem humanen Histamin-H3-Rezeptor zeigt (eine vertikale Linie (I) zwischen Aminosäureresten bezeichnet Identität; ein Doppelpunkt (:) zwischen Aminosäureresten bezeichnet eine konservative Substitution).
3 diagrammatisch die genomische Strukturen des PFI-013-Gens und des humanen Histidin-H3-Rezeptor-Gens zeigt ("rechteckige Blöcke" = Exons; ^ = Introns; die Ziffern direkt unter den "rechteckigen Blöcken" bezeichnen (1) Aminosäurereste für die Human-H3-Darstellung und (2) Basenpaare innerhalb des Contigs für die PFI-013-Darstellung).
4 einen Northern-Blot zeigt, der die Gewebeverteilung von PFI-013-mRNA zeigt.
5 die Ergebnisse der quantitativen PCR-Analyse der mRNA aus verschiedenen Geweben mittels Taqman^® zeigt (P.B.Leukozyten = Leukozyten aus peripherem Blut; Skel. -muskel = Skelettmuskel).
6 die Ergebnisse eines Filter-Ligandenbindungs-Assays zeigt – ausgedrückt als der Unterschied an radioaktivem ³H-Histamin, das an die Membranen von PFI-013-transfizierten und zum Schein transfizierten Zellen gebunden ist (CPM = radioaktive Impulse pro Minute ("counts per minute of radioactivity"); [Ligand] = Konzentration an ³H-Histamin in nM).
7 die Aktivierung von PFI-013-exprimierenden HEK293-Zellen durch Histamin in einem Fluoreszenz-basierten Funktionsassay (FLIPR^®) zeigt. 7A zeigt einen Zell-basierten Assay, der die Wirkung von Histamin auf HEK293-Zellen (die Gα15 exprimieren), transfiziert mit einem PFI-013-Expressionskonstrukt, anzeigt. 7B zeigt den gleichen zellbasierten Assay, der in diesem Fall aber die Wirkung von Histamin auf HEK293-Zellen (die Gα15 exprimieren), transfiziert mit dem Vektor allein, anzeigt. Ein Peak in einem Quadrat zeigt eine vorübergehende Zunahme der intrazellulären Calciumkonzentration in dem entsprechenden Well an und er zeigt daher eine funktionelle Reaktion durch die Zellen, resultierend aus der entsprechenden Behandlung, an.
8 die Aktivierung von PFI-013-exprimierenden HEK293-Zellen durch verschiedene Histaminagonisten (histaminerge Liganden) in einem Fluoreszenz-basierten Funktionsassay (FLIPR^®) zeigt. 8A zeigt einen zellbasierten Assay, der die Wirkung von Histaminagonisten auf HEK293-Zellen (die Gα15 exprimieren), transfiziert mit einem PFI-013-Expressionskonstrukt, anzeigt. 8B zeigt den gleichen zellbasierten Assay, der in diesem Fall aber die Wirkung von Histaminagonisten auf HEK293-Zellen (die Gα15 exprimieren), transfiziert mit dem Vektor allein, anzeigt. Ein Peak in einem Quadrat zeigt eine vorübergehende Zunahme der intrazellulären Calciumkonzentration in dem entsprechenden Well an und er zeigt daher eine funktionelle Reaktion durch die Zellen, resultierend aus der entsprechenden Behandlung, an.
9 die Ergebnisse des humane Eosinophilen-Chemotaxis-Assays mit verschiedenen Histaminrezeptor-Subtyp-selektiven Agonisten zeigt.
10 die Wirkungen verschiedener Histaminrezeptor-Subtyp-selektiver Antagonisten auf Histamin-induzierte humane Eosinophilen-Chemotaxis zeigt. 10A zeigt die Histamin-induzierte Eosinophilen-Chemotaxis und die verstärkende Wirkung von Interleukin-5(IL-5)-Vorbehandlung auf die Eosinophilen. 10B zeigt die Inhibierung von Histamin-induzierter Chemotaxis durch verschiedene Histaminantagonisten (Vbg. = Verbindung). 10C zeigt eine Dosis-Reaktions-Kurve zweier Histaminantagonisten auf die Histamin-induzierte Eosinophilen-Chemotaxis.

SEQ ID NO: 1 die für PFI-013-codierende Nucleotidsequenz zeigt. Das ATG-Translationsstartcodon wird durch die ersten drei Buchstaben angezeigt. Das Stoppcodon wird durch die letzten drei Buchstaben angezeigt.
SEQ ID NO: 2 die zugehörige Aminosäuresequenz, codierend für PFI-013, zeigt.
SEQ ID NOS: 3-10 die in den Beispielen verwendeten PCR-Primer zeigen.

Das Polynucleotid, welches den hierin beschriebenen GPCR codiert, wurde kloniert und die DNA- und Aminosäuresequenzen wurden unter Verwendung verschiedener bio informatischer Werkzeuge analysiert. Der durch die hierin beschriebenen Sequenzen codierte GPCR wurde als PFI-013 bezeichnet.
Experimenteller Abschnitt
Beispiel 1
IDENTIFIZIERUNG VON PFI-013
PFI-013 wurde zuerst in einer Datenbank für exprimierte Sequenz-markierte Stellen ("expressed sequence tag") (EST) mit Sequenzen, die aus einer cDNA-Bibliothek von Eosinophilen stammten, die mit IL-5 stimuliert worden waren, identifiziert, aber nur als eine partielle Sequenz. Das Durchsuchen der öffentlichen Genomdatenbanken führte zur Identifizierung der PFI-013-Sequenz der vollen Länge und der Bestimmung ihrer Homologie mit den Histamin-H3-Rezeptoren unter Verwendung von inter alia dem BLAST-Algorithmus.
Beispiel 2
BIOINFORMATISCHE UNTERSUCHUNGEN
Um zu bestätigen, dass PFI-013 ein Mitglied der GPCR-Familie ist, wurde eine Anzahl von bioinformatischen Herangehensweisen durchgeführt (siehe 1).
(a) BLAST-Suche gegen Swissprot
PFI-013 wurde gegen Swissprot unter Verwendung des BLAST-Algorithmus (Basic Local Alignment Search Tool (Altschul, S.F. (1993), J. Mol. Evol., 36:290-300; Altschul, S.F. et al. (1990), J. Mol. Biol., 215:403-410; Altschul, S.F. et al. (1997), Nucleic Acids Res., 25:3389-3402)) gesucht, um das Protein mit der engsten Übereinstimmung zu identifizieren.
In diesem Fall war der Spitzentreffer:
AF140538-01 PRI AAD38151.1 Homo sapiens, Histamin-H3-Rezeptor-mRNA, vollständige codierende Sequenz (CDS) ("Homo sapiens histamine H3 receptor mRNA, complete coding sequence (CDS)").
Diese Ergebnisse zeigen, dass PFI-013 ein Mitglied der GPCR-Familie ist.
(b) ClustalW-Alignment von PFI-013 mit dem humanen Histamin-H3-Rezeptor
Diese Ergebnisse sind in 2 gezeigt.
(c) Genomorganisation der Gene für PFI-013 und humane Histamin-H3-Rezeptoren
Die Gene für PFI-013 und Histamin-H3-Rezeptoren haben eine sehr ähnliche Struktur, wie in 3 gezeigt ist. 3 zeigt auch den Teil der Sequenz, der ursprünglich als die EST in der Eosinophilen-cDNA-Bibliothek identifiziert wurde.
(d) BLAST-Suche gegen eine nicht-redundante humaner GPCR-Datenbank

PFI-013 wurde gegen eine nicht-redundante humaner GPCR-Datenbank gesucht, die hauptsächlich Sequenzen aus der Genbank- und der Geneseq Patents-Datenbank umfasst, um die Agonistenklasse für diesen Rezeptor zu identifizieren. Die zehn Spitzentreffer sind unten gezeigt:

				Punkt	E-
				zahl	Wert
				("Score")
				(Bits)
Sequenzen, die signifikante Alignments erzeugen
AF140538	GPCR0022	11	Histamin-H3-Rezeptor	268	7e-74	GO
			("Histamine H3 receptor")
A1AB_HUMAN	GPCR0007	8	Alpha-IB-adrenerger Rezeptor	145	8e-37	GO
			("Alpha-1B adrenergic receptor")
5H1D_HUMAN	GPCR0025	12	5-Hydroxytryptamin-1D-Rezeptor (5-HT...	136	4e-34	GO
			("5-hydroxytryptamine 1D receptor (5-HT...")
5H1F_HUMAN	GPCR0027	12	5-Hydroxytryptamin-1F-Rezeptor(5-HT...	134	2e-33	GO
			("5-hydroxytryptamine 1F receptor (5-HT...")
5H1B_HUMAN	GPCR0024	12	5-Hydroxytryptamin-1B-Rezeptor (5-HT...	132	6e-33	GO
			("5-hydroxytryptamine 1B receptor (5-HT...")
A1AD_HUMAN	GPCR0008	8	Alpha-1D-adrenerger Rezeptor	132	1e-32	GO
			("Alpha-1D adrenergic receptor")
D3DR_HUMAN	GPCR0016	10	D(3)-Dopaminrezeptor	127	2e-31	GO
			("D(3) dopamine receptor")
ACM3_HUMAN	GPCR0003	6	Muskarinischer Acetylcholinrezeptor M3	118	2e-28	GO
			("Muscarinic acetylcholine receptor M3")
ACM5_HUMAN	GPCR0005	6	Muskarinischer Acetylcholinrezeptor M5	109	6e-26	GO
			("Muscarinic acetylcholine receptor M5")
ACM2-HUMAN	GPCR0002	6	Muskarinischer Acetylcholinrezeptor M2	106	5e-25	GO
			("Muscarinic acetylcholine receptor M2")

(E-Wert = statistische Wahrscheinlichkeit, dass der Treffer zufällig auftritt) Diese Ergebnisse zeigen, dass PFI-013 am ähnlichsten zu den Histaminrezeptoren ist, und sie legen nahe, dass PFI-013 einen neuen GPCR codiert, dessen Ligand wahrscheinlich ein Amin ist.
Beispiel 3
ISOLIERUNG VON PFI-013

Die Gesamt-RNA wurde aus 1 × 10⁸ AML14.3D10-Zellen, erhalten von Dr. C.C. Paul, VA Medical Center, Dayton, Ohio, USA (Baumann, M.A. & Paul, C.C. (1998), Stem Cells, 16: 16-24), unter Verwendung des Qiagen RNeasy Maxi-Kits gemäß den Empfehlungen des Herstellers extrahiert. mRNA wurde nachfolgend aus der zuvor genannten Gesamt-RNA unter Verwendung eines Aufreinigungskits, Qiagen Oligotex mRNA-Purification-Kit, gemäß den Empfehlungen des Herstellers, isoliert. 1 μg AML14.3D10-mRNA wurde revers in cDNA unter Verwendung von Display Thermo-RT^® (Display Systems Biotech) gemäß dem bereitgestellten Protokoll unter Verwendung eines PFI-013-Gen-spezifischen Primers, PFI-013-rt (SEQ ID NO: 5), transkribiert. PFI-013-spezifische Primer (PFI-013-Vorwärts und PFI-013-Rückwärts, SEQ ID NO: 3 bzw. 4) wurden in einer PCR eingesetzt, um die PFI-013-codierende Region aus der AML14.3D10-cDNA zu amplifizieren, wobei die Bedingungen wie folgt waren: PCR-Gemisch:

PFI-013-Primer	1 μl (1 μM Endkonzentration)
AML14.3D10-cDNA	2 μl (1/10 der cDNA-Stammlösung)
dNTPs (Konzentration wie durch Kit)	1 μl
Elongase-Polymerase (LTI, Inc.)	I μl
Puffer B (aus Elongase-Kit)	10 μl
DMSO	5 μl
dH₂O	30 μl

PCR-Primer:

Vorwärtsprimer (= PFI-013-Vorwärts):
5'-ACCATGCCAGATACTAATAGCACAATC-3' (SEQ ID NO: 3)
Rückwärtsprimer (= PFI-013-Rückwärts):
5'-TTAAGAAGATACTGACCGACTGTG-3' (SEQ ID NO: 4)
Reverser Transkriptionsprimer:
5'-GGGCAAGATAAAGGGCAGACCAGAT-3' (SEQ ID NO: 5)

PCR-Zyklus:

(1) 94°C 1 min
(2) 60°C 1,5 min
(3) 68°C 3 min Die Schritte (1) bis (3) wurden für weitere 34 Zyklen wiederholt.
(4) 68°C 10 min
(5) 4°C Haltezeit.

Das PFI-013-PCR-Produkt wurde unter Verwendung des Gelextraktionskits von QIAgen gemäß den Anweisungen des Herstellers aus einem Gel extrahiert. Das resultierende Produkt wurde TA-kloniert (Invitrogen TA-Klonierungs-Methodologie), und zwar in den Vektor pcDNA3.1/V5-His-TOPO (Invitrogen) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Sequenz des resultierenden Inserts wurde nachfolgend für beide Stränge unter Verwendung der ABI-DNA-Sequenziermethodologie entsprechend dem Protokoll des Herstellers verifiziert.
Beispiel 4
GEWEBEVERTEILUNG VON PFI-013
(a) Northern-Blot
(i) Sondenherstellung

Ein Fragment von 261 bp in Richtung des 3'-Endes des PFI-013-Gens wurde mittels PCR unter Verwendung der folgenden Primer amplifiziert:
PFI-013F: 5'-TCCTTCTCCCAATCAGATTCTGTAGC-3' (SEQ ID NO: 6)
PFI-013B: 5'-GTATCCATTGTGTCACAAGCGC-3' (SEQ ID NO: 7) PCR-Gemisch:

PFI-013-Primer	5 μl jeweils (1 μM
	Endkonzentration)
PFI-013-Plasmid	1 μl (50 ng)
dNTPs (Konzentration wie durch Kit)	1 μl
Advantage-Polymerase (Clontech)	1 μl
Puffer N (aus Optimierungskit ("optimiser kit") von	10 μl
Invitrogen)
dH₂O	28 μl

PCR-Zyklus:

(1) 94°C 1 min
(2) 68°C 1,5 min Die Schritte (1) bis (2) wurden für weitere 29 Zyklen wiederholt.
(4) 68°C 10 min
(5) 4°C Haltezeit.

Der PCR-Reaktion(sansatz) wurde einer Elektrophorese über ein 0,8%-Agarosegel unterzogen, durchgeführt in 1 × TAE-Puffer (Tris-Acetat-EDTA-Puffer, pH 8,3; Sigma). Die resultierende Bande wurde aus dem Gel unter Verwendung eines Gelextraktionskits, Qiaquick^® Extraction Kit (Qiagen), gemäß den Empfehlungen des Herstellers, ausgeschnitten und in ein 50 μl-Volumen 10 mM Tris-Cl, pH 8,0, (extrahiert). 5 μl des gereinigten PCR-Produktes wurden mit ³²P-dCTP unter Verwendung des Amersham Random Prime-Kit (Amersham Pharmacia Biotech) gemäß den Empfehlungen des Herstellers markiert und nachfolgend unter Verwendung einer Chromaspin Spin + TE-30-Säule (Clontech) gereinigt.
(ii) Hybridisierung
Northern-Blots für mehrere Humangewebe, Human & Human II-Multiple tissue Northern Blots (MTNs-Clontech), wurden bei 68°C 1 h lang mit 25 ml der Express-Hyb-Lösung (Clontech) vorhybridisiert bzw. prähybridisiert. Die PFI-013-Sonde wurde zu weiteren 25 ml der im Voraus erwärmten (68°C) Express-Hyb-Lösung zugegeben. Die Vorhybridisierungslösung wurde von den Membranen abdekantiert, und die Hybridisierungslösung wurde zu den Membranen zugegeben. Die Membranen wurden bei 68°C 16 Stunden inkubiert. Die Membranen wurden zweimal mit 0,5 × SSPE/0,1% SDS bei 68°C gewaschen und anschließend wurde ein BioMAX-Autoradiographiefilm (Kodak) 1 Woche lang bei -80°C gegenüber den Membranen exponiert.
Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt. Der höchste Level der PFI-013-mRNA-Expression wurde bei Leukozyten aus peripherem Blut ("peripheral blond leucocytes") (PBLs) bei detektierbarer Expression in Milz, Testis und Colon beobachtet.
(b) Quantitative PCR-Analyse mittels Tagman^®
Eine Standardkurve für die Reaktion ("standard curve reaction") wurde verwendet, um die PFI-013-Expression unter Verwendung einer 0,55 μg/μl Plasmidlösung von pcDNA3.1, enthaltend die PFI-013-codierende Sequenz, zu quantifizieren. Die Plasmidlösung wurde seriell in logarithmischen Stufen ("log steps") auf 10^-12 verdünnt. Die Standardkurve wurde unter Verwendung dieser Verdünnung für 2-200.000 Kopien/Well aufgestellt. 300 nM jedes Primers (PFI-013F-taq (SEQ ID NO: 8) und PFI-013R-taq (SEQ ID NO: 9)) und 150 nM von PFI-013CP (SEQ ID NO: 10) wurden mit 2 × TagMan^® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) verwendet. 1 ng cDNA aus den Multiple Tissue cDNA (MTC^TM)-Panels, Human I und Human II (Clontech) wurde als Matrize verwendet. Die Reaktion wurde auf dem TagMan^®7700 Sequence Detection System als Real-Time-Quantifizierung mit einer einzelnen Reportersubstanz ("single reporter, real time quantitation") in 25 μl Reaktionsvolumen und mit Dreifachbestimmung bei jedem Punkt durchgeführt. Die PCR-Bedingungen waren: 50°C für 2 min, 95°C für 10 min, anschließend 95°C für 15 s, 60°C für 1 min für 40 Zyklen. Die Ergebnisse wurden mittels der Sequenzdetektions-Software analysiert. Die Basislinie, d.h. der Hintergrund für die Fluoreszenzablesungen, wurde auf 3-12 Zyklen eingestellt. Der Ergebnisdatensatz wurde nach Excel (Microsoft) exportiert, und die Standardkurve wurde mit den Detektionsparametern aus dem Ergebnisdatensatz erzeugt. Die Ergebnisse werden als Kopienzahl von PFI-013-Trankripten pro 1 ng Gewebe-cDNA ausgedrückt, wobei die Fehlerbalken die Standardabweichung darstellen (siehe 5).
Verwendete PCR-Primer:

PFI-013F-taq: 5'-AATATTTTATTGGAGCCTGTGGAA-3' (SEQ ID NO: 8)
PFI-013R-taq: 5'-GGAAGAGACAGCAGTCAGTCCA-3 (SEQ ID NO: 9)
sPFI-013CP: 5'-FAM-ACACAAAGGATATCAGCGAAAGGCAAGCC-TAMRA-3' (SEQ ID NO: 10)

Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt. Die Ergebnisse der quantitativen PCR unterstützen die Northern-Blot-Daten dahingehend, dass der höchste Expressionslevel bei Leukozyten aus peripherem Blut (P. B. Leukozyten) beobachtet wurde, gefolgt von Milz und Testis, wobei in den verbleibenden Proben geringe Expressionslevel detektiert wurden.
Beispiel 5
LIGANDEN-BINDUNGSASSAY
2 × 10⁸ CHO-K1-Zellen wurden mit pcDNA3.1/V5-His-TOPO-PFI-013 transfiziert oder sie wurden zum Schein transfiziert, wobei Lipofectamine Plus (Gibco-BRL) gemäß den Empfehlungen des Herstellers angewendet wurde. Nach 48-ständiger Inkubation nach der Transfektion wurden Rohmembranpräparate wie folgt hergestellt: Die Zellen wurden durch Abkratzen geerntet, in 20 ml eiskaltem Assay-Puffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,4)) resuspendiert, homogenisiert und die resultierende Suspension wurde bei 20.000 g 30 min lang bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde abdekantiert, das Pellet wurde 3 ml Assay-Puffer resuspendiert und erneut homogenisiert (50 mM Tris-HCl, pH 7,4). Die Proteinkonzentration wurde mittels des Bradford-Assays (Biorad) gemäß den Empfehlungen des Herstellers bestimmt.
Aliquots dieser Membranpräparation, die 200 μg Protein enthielten, wurden dann mit verschiedenen Konzentrationen von ³H-Histamin (z.B. 0,72-1.500 nM, ³H-Histamin wurde von Amersham Pharmacia Biotech erhalten) 2 h lang bei 30°C inkubiert. Um die Inkubationen zu beenden, wurden die Proben rasch unter Verwendung einer Vorrichtung zum Abernten von Zellen, dem Brandell Cell Harvester, auf Wallac-Filtermatten ("Wallac Filtermats") (Perkin Elmer) (welche zuvor (für 1 h) in einer 0,3%igen (V/V) Lösung von PEI (Polyethylenimin, Sigma) in Assay-Puffer eingeweicht worden waren, um das Binden an die Filtermatte zu verringern) filtriert. Die Filtermatten/Wells wurden sofort viermal in rascher Folge mit 2 ml Assay-Puffer pro Well gewaschen. Die Filtermatten wurden unter Verwendung eines Mikrowellenofens getrocknet und eine Szintillationssubstanz, Meltilex (Perkin Elmer), wurde unter Verwendung einer Heißversiegelungsvorrichtung, Wallac Meltilex Heat Sealer, auf die Filtermatten aufgeschmolzen. Die auf den Filtermatten gebundene Radioaktivität wurde unter Verwendung eines Szintillationszählers, Wallac Betaplate Scintillation Counter, bestimmt.
Die Daten wurden als der Unterschied zwischen der an die Membranen gebundenen Radioaktivität von PFI-013-transfizierten Zellen und von zum Schein transfizierten Zellen ausgedrückt.
Vorläufige Daten, die in 6 gezeigt sind, legen nahe, dass Histamin an PFI-013 bindet, wenn auch mit relativ geringer Affinität.
Beispiel 6
ZELL BASIERTE FUNKTIONSASSAYS ("FUNCTIONAL CELL-BASED ASSAYS") AUF HISTAMIN- UND HISTAMINAGONISTEN-AKTIVIERUNG VON PFI-013
Die Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Lesegerät ("Fluorescence Imaging Plate Reader") (FLIPR^®)-Technologie wurde als Mittel eingesetzt, um die Aktivierung von PFI-013 durch Histamin oder Histaminagonisten in einem Zell-basierten Assay zu detektieren.
5 × 10⁶ humane embryonale Nieren ("Human Embryonic Kidney") (HEK)-293-Zellen, die das Maus-Gα15-Gen exprimieren, (ab hier "293-Zellen" genannt) wurden vorübergehend mit 7,5 μg PFI-013-Vektor (enthalten innerhalb des pcDNA4HISmaxB (Invitrogen)-Plasmids) oder Vektor allein unter Verwendung des Lipofectamine Plus^®-Reagenzes (Gibco BRL) entsprechend dem Protokoll des Herstellers transfiziert. Die PFI-013-cDNA wurde in pcDNA4HISmaxB unter Verwendung der Restriktionsschnittstellen KpnI und NotI, um die PFI-013-cDNA aus pcDNA3.1/V5-His-TOPO auszuschneiden und die cDNA in pcDNA4HISmaxB zu inserieren, kloniert, wobei molekularbiologische Standardtechniken angewendet wurden (z.B. gemäß Sambrook et al., Hrsg., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY, USA) und wobei T4-DNA-Ligase verwendet wurde, um die Fragmente zu verbinden; pcDNA4HISmaxB wurde verwendet, da es Elemente enthält, die den Gentranskriptionslevel gegenüber Standard-pcDNA3.1-Vektoren heraufregulieren). 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen von der Flasche unter Verwendung von Trypsin/EDTA-Lösung (LTI) abgelöst und in Poly-D-lysin-behandelte 96-Well-Platten mit schwarzen Seiten (Becton Dickinson) mit einer Dichte von 5 × 10⁴ Zellen/Well ausplattiert bzw. überimpft. Die Platten wurden über Nacht stehen gelassen, um die Adhäsion der Zellen an die Böden der Wells zu ermöglichen. Das Medium wurde von den Zellen entfernt und durch 100 μl warme (37°C) Farbstoff-Beladungslösung ("dye loading solution") (50 μg Fluo3 (Molecular Probes) in 20 μl DMSO + 20% Pluronsäure in DMSO, zugegeben zu 11 ml Dubecco's modifiziertem Eagles-Medium ("Dulbecco's Modified Eagles Medium"), enthaltend 1 × Probenecid (100 × Probenecid – 0,71 g Probenecid, wurden in 5 ml 1 M NaOH und 5 ml Dulbecco's Phosphat-gepufferter Salzlösung ("Phosphate Buffered Saline") (PBS) gelöst, pro Platte; Probenecid (Molecular Devices) inhibiert die Aktivität des Anionentransportproteins und verbessert somit die Farbstoffbeladung) ersetzt. Die Platten wurden anschließend 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden nachfolgend mit 250 μl Waschpuffer pro Well (5 ml 100 × Probenecid-Stammlösung + 495 ml PBS, pH 7,4) 4-mal gewaschen. Die Platten wurden in den 37°C/5% CO₂-Inkubator 30 min vor der Verarbeitung innerhalb des FLIPR^®-Instruments zurückgebracht. Die FLIPR^®-Verarbeitung beinhaltete das Ablesen der Fluoreszenz für alle Proben für 2 Minuten; während dieser Zeit wurde die Fluoreszenzbasislinie für 10 Sekunden bestimmt. Die gewünschte Menge der Verbindung (d.h. Histamin oder Histaminagonisten) wurde anschließend automatisch in die Wells transferiert und die Fluoreszenz wurde kontinuierlich für die verbleibende Zeit überwacht. Alle Verbindungen wurden in Waschpuffer verdünnt.
(a) Histamin-Aktivierung von PFI-013 in einem Zell-basierten FLIPR^®-Assay
Unter Verwendung der oben im Detail beschriebenen Methodologie wurde die Wirkung von Histamin auf die funktionelle Aktivierung von PFI-013 untersucht.
7 stellt die Wirkung von 10 μM Histamin-Dihydrochlorid, seriell verdünnt in logarithmischen Konzentrationen ("log concentrations") bis hinunter auf 10 pM (Spalten 2 bis 8) als Doppelbestimmungen (Zeilen B und C), auf PFI-013-transfizierte 293-Zellen (7A) oder auf 293-Zellen, die nur mit Vektor transfiziert worden waren, (7B) dar. Die verbleibenden Wells enthielten nur Puffer ohne eine Verbindung. Eine spezifische Aktivierung von PFI-013 durch Histamin wurde bei der Konzentration 10 μM gefunden.
(b) Analyse der PFI-013-Aktivierung durch verschiedene histaminerge Verbindungen in einem Zell-basierten FLIPR^®-Assay
Unter Verwendung der oben im Detail beschriebenen Methodologie wurde die Wirkung von histaminergen Verbindungen auf die funktionelle Aktivierung von PFI-013 untersucht.
8 stellt die Wirkung verschiedener histaminerger Verbindungen (Spalten 2 bis 10), seriell verdünnt von 10 μM (Zeilen A und B) bis hinter auf 0,5 μM in Doppelbestimmung (Zeilen G und H), auf PFI-013-transfizierte 293-Zellen (8A) oder 293-Zellen, die nur mit Vektor transfiziert wurden, (8B) dar. Die verbleibenden Wells enthielten nur Puffer ohne eine Verbindung.
Die Ergebnisse zeigen an, dass PFI-013 in einer Reihenfolge der Wirksamkeit aktiviert wird, nämlich durch N-α-Methylhistamin (Spalte 6) > Histamin (Spalte 4) > R-α-Methylhistamin (Spalte 5) = Histamin-1-Methyl (Spalte 8). Bei den verbleibenden getesteten Verbindungen (Dimaprit, L-Histidin, Imetit, Noscapin und Clobenpropit entsprechend den Spalten 2, 3, 7, 9 und 10) konnte in diesem Assay keine Aktivierung von PFI-013 festgestellt werden.
Beispiel 7
EOSINOPHILEN-CHEMOTAXIS-UNTERSUCHUNGEN
Die Eosinophilen wurden aus peripherem Blut, wie früher beschrieben, isoliert (Hansel, T.T., De Vris, I.J., Iff, T., Rihs, S., Wandzilak, M., Betz, S., Glaser, K. und Walker, C. (1991)). Die Chemotaxis wurde unter Verwendung einer 48-Well-Boyden-Kammer (Neuro Probe Inc., Cabin John, MD, USA) gemessen. Die Agonisten wurden in RPMI-Medium (BioWhittaker, Walkersville, MD, USA), enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA), verdünnt und auf die Böden der Wells der Chemotaxis-Kammer zugegeben. Ein PVP-freier 5 μm-Polycarbonatfilter wurde verwendet, um die Wells der Kammer zu separieren (Neuro Probe Inc., Cabin John, MD, USA). Die Eosinophilen wurden in RPMI/BSA-Medium mit einer Konzentration von 2,5 × 10⁶ Zellen pro ml resuspendiert. 50 μl dieser Zellsuspension wurden anschließend zu der oberen Kammer zugegeben. Die Kammern wurden anschließend 45 Minuten in einer 5% CO₂-befeuchteten Atmosphäre bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubationsdauer wurden die Filter entfernt, die obere Seite wurde abgeschabt, um nicht-migrierende Zellen zu entfernen, und die Filter wurden mit Diff-Quik-Farbstoff (Dade Behring AG, Dudingen, Schweiz) gefärbt. Die Anzahl der migrierenden Zellen (Boden des Filters) wurde mittels Lichtmikroskopie ausgezählt. Der Mittelwert dreier Felder bei hoher Vergrößerung ("high-powered fields") wurde dann bestimmt. Die Anzahl migrierender Zellen wurde durch Subtrahieren dieser Zahl von der Zellzahl pro Feld bei hoher Vergrößerung in jenen Wells, die keinen Agonisten enthielten, berechnet. Alle Verbindungen wurden von Sigma-RBI erworben.
(a) Wirkung von Histaminrezeptor-Subtyp-selektiven Agonisten auf humane Eosinophilen-Chemotaxis
Die Versuche wurden durchgeführt, um den Histaminrezeptor-Subtyp zu charakterisieren, der an der chemotaktischen Reaktion der Eosinophilen auf Histamin beteiligt ist. Die Methodologie war wie im Detail oben beschrieben. Die getesteten Verbindungen waren: Histamin-Dihydrochlorid (nicht-selektiver Histaminrezeptoragonist), Histamin, freie Base, HTMT-Dimaleat (Histamin-H1-Agonist), Dimaprit (Histamin-H2-Agonist) und Imetit (Histamin-H3-Agonist). Eotaxin war als Positivkontrolle für die Eosinophilen-Chemotaxis eingeschlossen. Burimanid wurde in die Studie eingeschlossen, da Raible et al. zuvor eine partielle Agonistenwirkung dieser Verbindung auf die intrazelluläre Ca² ⁺-Produktion bei isolierten humanen Eosinophilen beschrieben hatten (Raible, D.G. et al. (1994), Pharmacological characterisation of a novel histamine receptor an human eosinophils, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 149, S. 1506-1511).
Die Ergebnisse sind in 9 gezeigt. Nur der nicht-selektive Histaminrezeptoragonist, Histamin-Dihydrochlorid, induzierte eine signifikante chemotaktische Reaktion von isolierten humanen Eosinophilen in einem in-vitro-Assay. Der H2-Agonist, Dimaprit, und die H3-Agonisten, Imetit und Burimamid, zeigten keine chemotaktische Aktivität, während der H1-Agonist, HTMT, eine sehr schwache chemotaktische Reaktion nur bei der höchsten getesteten Konzentration (1 μM) zeigte.
(b) Wirkung von Histaminrezeptor-Subtyp-selektiven Antagonisten auf Histamin induzierte humane Eosinophilen-Chemotaxis
Die Antagonistenversuche wurden durchgeführt, um den Histaminrezeptor-Subtyp, der an der chemotaktischen Reaktion der Eosinophilen auf Histamin beteiligt ist, weiter zu charakterisieren. Die Methodologie war wie oben im Detail beschrieben, mit der Ausnahme, dass IL-5 verwendet wurde, um die Eosinophilen für die Chemotaxis-Untersuchungen vorzubereiten ("prime"), wie dies gezeigt wurde, um die chemotaktische Reaktion auf Histamin zu erhöhen (siehe 10A). Die Antagonisten wurden in einer Einzelkonzentration von 10 μM verwendet. Die getesteten Antagonisten waren: Mepyramin-Maleat (Histamin-H1-Antago nist), Cimetidin (Histamin-H2-Antagonist), Thioperamid (Histamin-H3-Antagonist) und Clobenpropit (Histamin-H3-Antagonist).
Die in 10B gezeigten Ergebnisse zeigen an, dass zwei H3-Antagonisten, Thioperamid und Clobenpropit, die größte Wirkung auf die Verringerung der chemotaktischen Reaktion von isolierten humanen Eosinophilen auf Histamin-Dihydrochlorid hatten.
(c) Bestimmung des IC₅₀(-Wertes) von Histamin-H3-Rezeptor-Antagonisten zum Inhibieren der in-vitro-Chemotaxis von isolierten humanen Eosinophilen
Ein weiterer Versuch wurde durchgeführt, um den IC₅₀(-Wert) von sowohl Thioperamid als auch Clobenpropit (Histamin-H3-Antagonisten) für das Inhibieren der in-vitro-Chemotaxis von isolierten humanen Eosinophilen zu bestimmen. Die Methodologie war wie oben beschrieben, wobei Thioperamid und Clobenpropit in Konzentrationen von 10 μM, 1 μM und 0,1 μM verwendet wurden (Histamin, als der Agonist, wurde mit 30 nM verwendet).
Die in 10C gezeigten vorläufigen Ergebnisse zeigen an, dass Clobenpropit und Thioperamid die Histamin-induzierte Chemotaxis von humanen Eosinophilen mit einem IC₅₀(-Wert) von 1,5 μM bzw. 0,83 μM antagonisieren.
Es wird anerkannt werden, dass das Vorstehende nur beispielhaft bereitgestellt wird und dass eine Modifikation von Details durchgeführt werden kann, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, welche die Eosinophilen-Chemotaxis moduliert, umfassend das Inkontaktbringen eines Polypeptids, umfassend: (i) ein Polypeptid, translatiert aus der Polynucleotidsequenz in SEQ ID NO: 1; (ii) ein Polypeptid von SEQ ID NO: 2; (iii) ein Polypeptid, codiert durch die cDNA von NCIMB 41073; mit einer Kandidatenverbindung und bestimmen, ob die Modulation des Polypeptids auftritt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, welches umfasst: (a) Inkontaktbringen einer Verbindung mit Zellen, die das Polypeptid, wie in Anspruch 1 definiert, auf ihrer Oberfläche exprimieren, wobei das Polypeptid mit einer zweiten Komponente assoziiert ist, die befähigt ist, ein detektierbares Signal als Reaktion auf das Binden einer Verbindung an das Polypeptid bereitzustellen, wobei das Inkontaktbringen unter Bedingungen erfolgt, die ausreichend sind, um das Binden von Verbindungen an das Polypeptid zu ermöglichen; und (b) Identifizieren einer Verbindung, die befähigt ist, an das Polypeptid zu binden, durch Detektieren des Signals, das durch die zweite Komponente erzeugt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Verbindung zweckmäßig ist bei der Behandlung von allergischen Störungen, granulomatösen vaskulitischen Erkrankungen, immunologischen Störungen, interstitiellen und anderen Lungenerkrankungen, Infektionserkrankungen, Entzündungszuständen und neoplastischen und myeloproliferativen Erkrankungen.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die allergische Störung extrinsisches Asthma ist, die immunologische Störung intrinsisches Asthma ist, die Lungenerkrankung chronischobstruktive Lungenerkrankung (COPD) ist und die Entzündungserkrankungen entzündliche Darmerkrankungen sind.
Verfahren gemäß Anspruch 1, welches umfasst: (a) Inkontaktbringen (i) einer detektierbaren ersten Komponente, von der bekannt ist, dass sie an das Polypeptid, wie in Anspruch 1 definiert, bindet und (ii) einer Verbindung mit Zellen, die das Polypeptid auf ihrer Zelloberfläche exprimieren, wobei das Polypeptid mit einer zweiten Komponente assoziiert ist, die befähigt ist, ein detektierbares Signal als Reaktion auf das Binden einer Verbindung an das Polypeptid bereitzustellen, wobei das Inkontaktbringen unter Bedingungen erfolgt, die ausreichend sind, um das Binden von Verbindungen an das Polypeptid zu ermöglichen; und (b) Bestimmen, ob die erste Komponente an das Polypeptid bindet, durch Detektieren des Fehlens oder andernfalls eines Signals, das aus der Wechselwirkung der ersten Komponente mit dem Polypeptid erzeugt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Verbindung an das Polypeptid, wie in Anspruch 1 definiert, bindet und dieses antagonisiert oder selektiv antagonisiert.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Verbindung an das Polypeptid, wie in Anspruch 1 definiert, bindet und dieses antagonisiert.