JP2002520023A - インフルエンザウイルスｍ２タンパク質の条件突然変異体 - Google Patents

インフルエンザウイルスｍ２タンパク質の条件突然変異体

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Abstract

(57)【要約】 哺乳動物細胞の増殖停止を誘導し得るインフルエンザウイルスM2タンパク質の突然変異体を記載する。条件細胞欠失系における、この突然変異体の使用を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、選択した細胞に条件致死突然変異を引き起こす方法に関する。特に
本発明は、in vivoにおいて生物の特定の組織の発生を停止させるまたは特定の
組織を破壊する手段に関する。
【０００２】 インフルエンザＡ型ウイルス・マトリックス(M)遺伝子のスプライスを受けた
セグメントであるM2は、１つの膜貫通領域を含む97個のアミノ酸からなる内在性
膜ポリペプチドである。ウイルスおよび感染細胞の細胞膜では、M2ポリペプチド
は四量体へ会合してプロトンチャネルを形成し、その結果、感染時の宿主エンド
ソームおよびウイルスタンパク質のプロセシング時のトランスゴルジネットワー
クにおけるプロトン輸送が可能になることで、ウイルス複製に必須の機能がもた
らされる[Holsinger, L.J.およびLamb, R.A.(1991), Virology 183:32-43; Sugr
ue R.L.およびHay, A.J.(1991), Virology 180:617-624; Pinto, L.ら(1992), C
ell 69:517-528]。
【０００３】 インフルエンザＡ型ウイルスに対して使用し得る治療薬であるアマンタジンと
リマンタジンは、M2のプロトンチャネル活性を阻止することにより作用するもの
である(Hay, A.(1992), Seminars in Virology 3:21-30)。
【０００４】 バキュロウイルスまたはXenopus oocytes(Schroederら(1994) J. Gen. Virol.
75:3477-3484)等の一定の系におけるM2の発現は、M2タンパク質発現の低下とし
て現れる増殖の低下、即ち細胞死を招く。このような有害作用は、アマンタジン
またはその類似体であるリマンタジンの投与によって覆すことが可能である。し
かしながら、有害作用は哺乳動物細胞では実証されておらず、M2タンパク質の存
在下でも哺乳動物細胞は増殖を続ける。
【０００５】 現在、細胞へトランスフェクト可能な唯一使用し得る条件致死系は、loxP-Cre
系である。Creリコンビナーゼと、このリコンビナーゼの標的となるloxP部位と
を組み合わせることにより、特定の遺伝子を切断することが可能となる(Guら(19
94) Science 265:103を参照)。
【０００６】発明の概要 本発明の第１の態様では、哺乳動物細胞の増殖を停止し得るインフルエンザウ
イルスM2タンパク質の突然変異体を提供する。
【０００７】 驚くべきことに、インフルエンザウイルスM2タンパク質の突然変異体でトラン
スフェクトした細胞は、増殖できないことが明らかとなった。観察された増殖停
止は、M2突然変異体の毒性によるのではなく、トランスフェクトされた細胞の細
胞周期が停止することにより、さらなる細胞の発生と増殖が抑制されるためと考
えられる。このような停止は、M2タンパク質がプロトンチャネルからイオンチャ
ネルへ変化することに起因すると考えられ、このことは、哺乳動物細胞にとって
不利に作用し、G0またはG1期における細胞周期の停止を招く。このような停止は
、アマンタジンまたはリマンタジン等のM2遮断剤を添加することにより救済可能
である。これらの分子およびその類似体は、イオン輸送を行う膜貫通孔を物理的
に遮断することによって野生型M2および突然変異体M2の機能を阻害することがで
きる。
【０００８】 第２の態様では、本発明はトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関するもので
あり、前記動物は、本発明の第１の態様のインフルエンザウイルスM2突然変異体
を発現するトランスジーンを少なくとも細胞のサブ集団内にコードしているもの
である。
【０００９】 好ましくは、M2突然変異体トランスジーンは組織特異的な制御下にあり、従っ
て、その発現は一定の組織に限られる。動物へのM2遮断剤の投与は、M2突然変異
体タンパク質の増殖停止作用を阻害するであろう。従って、M2遮断剤を取り除く
と組織増殖の停止が引き起こされる可能性がある。この事象は、組織特異的かつ
一過性に細胞増殖を停止させる目的で、望み通りの時期に行うことができる。こ
れにより、組織発生の研究に有用なツールが提供される。
【００１０】 第３の態様では、本発明は、本発明の第１の態様のインフルエンザウイルスM2
突然変異体をコードするトランスジーンを細胞へ挿入することを含んでなる、細
胞の増殖を停止させる方法に関する。
【００１１】 第４の態様では、本発明は、本発明の第１の態様のインフルエンザM2突然変異
体をコードする核酸を含んでなる遺伝子構築物に関するものである。
【００１２】発明の詳細な説明 本発明は、哺乳動物細胞の増殖を停止させる能力によって規定される、インフ
ルエンザウイルスM2タンパク質の突然変異体に関する。
【００１３】 本明細書中では、用語「突然変異体」は、野生型M2タンパク質の構造からの何
らかの逸脱を意味する。従って、アミノ酸配列の変異体並びに以下に詳述する他
の誘導体が含まれる。用語「M2」は、インフルエンザＡ型ウイルスのM2タンパク
質のことである。通常この用語は、インフルエンザＡ型ウイルスの任意の単離株
に由来するM2タンパク質のことをいう。好ましくは、単離株はトリ・インフルエ
ンザウイルスである。
【００１４】 インフルエンザウイルスM2の突然変異体は、本明細書に記載のインフルエンザ
ウイルスM2のイオンチャネル活性を維持する要件を満たすものであれば、アミノ
酸欠失、付加または置換を含んでいてもよい。このような突然変異としては、そ
れ自体では本発明で観察される作用の原因とはならない突然変異が挙げられる。
従って、5'または3'末端から末端切断を行う場合と同様、インフルエンザウイル
スM2の性質を実質的に変えることなく、保存的アミノ酸置換を行うことが可能で
ある。本発明に含まれるインフルエンザウイルスM2の断片に欠失および置換をさ
らに行ってもよい。M2突然変異体は、例えば１個以上のアミノ酸を付加、交換お
よび／または欠失させるin vitro突然変異誘発にかけた核酸から製造することが
可能である。
【００１５】 M2の断片、突然変異体および他の誘導体は、好ましくは、トリ・インフルエン
ザＡ型ウイルスのWeybridge単離株から取得した配列番号１記載のM2配列と実質
的な相同性を保持するものである。本明細書中では、用語「相同性」は、２つの
独立体(entity)が、当業者によって起源および機能が類似していると判定し得る
程度に十分な特性を共有することを意味する。好ましくは、相同性は、配列同一
性を表すのに使用される。従って、M2の誘導体は、好ましくは、配列番号１(ま
たは、配列番号１にコードされている配列番号２記載のポリペプチド産物)と実
質的な配列同一性を保持するものである。
【００１６】 好ましくは、これらの配列は、26〜319位に及ぶ配列番号１のコード領域と実
質的な相同性を保持するものである。有利には、配列番号１由来の25個のヌクレ
オチドからなるオリゴヌクレオチドと実質的な相同性を保持する。
【００１７】 別の実施態様では、これらの配列は、トリ・インフルエンザＡ型ウイルスのRo
stock単離株から取得した配列番号３と相同であってよい。配列番号３のM2コー
ド配列は１〜26位および715〜982位の間に位置する。
【００１８】 さらなる実施形態では、本発明のM2配列は、配列番号２のポリペプチドをコー
ドする可能な全ての配列および配列番号３の上記コード領域にコードされるポリ
ペプチドをコードする可能な全ての配列からなる群より選択される配列と相同で
あってよい。
【００１９】 相同性が配列同一性を表す場合、「実質的な相同性」とは、直接的な配列アラ
イメントと配列比較で判定して40％を超える配列同一性、好ましくは45％を超え
る配列同一性、および最も好ましくは50％以上の配列同一性を意味する。
【００２０】 配列相同性(または同一性)は、さらに、任意の適切な相同性アルゴリズムを使
用して、例えばデフォルトパラメータを使用しても判定できる。有利には、デフ
ォルト値に設定したパラメータを用いるBLASTアルゴリズムを使用する。BLASTア
ルゴリズムは、http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast#help.htmlに詳述されて
いる(引用により本明細書に含まれるものとする)。検索パラメータを以下のよう
に定義し、有利には規定のデフォルトパラメータに設定する。
【００２１】 有利には、BLASTで評価した場合の「実質的な相同性」は、少なくとも約７、
好ましくは少なくとも約９、最も好ましくは10以上のEXPECT値と一致する配列に
相当する。BLAST検索におけるEXPECTのデフォルト閾値は通常10である。
【００２２】 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)は、プログラムblastp、blastn
、blastx、tblastnおよびtblastxによって使用される発見的検索アルゴリズムで
あり、これらのプログラムの有意性は、若干機能を強化させたKarlinおよびAlts
chulの統計的方法(http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast#help.htmlを参照)を
用いることで、その検索結果に反映される。BLASTプログラムは、例えば、問い
合せ配列に対する相同体を同定するよう、配列類似性検索に合わせたものである
。このプログラムは、モチーフ型検索(motif-style searching)には通常有用で
はない。配列データベースの類似性検索における基本的な点についての検討は、
Altschulら(1994) Nature Genetics 6:119-129を参照されたい。
【００２３】 http://www.ncbi.nlm.nih.govで入手可能な5種類のBLASTプログラムは以下の
タスクを実行するものである。
【００２４】 blastpは、アミノ酸の問い合せ配列をタンパク質配列データベースと比較し、 blastnは、ヌクレオチドの問い合せ配列をヌクレオチド配列データベースと比
較し、 blastxは、ヌクレオチドの問い合せ配列(両鎖とも)の6通りのフレームを概念
的に翻訳した産物を、タンパク質配列データベースと比較し、 tblastnは、タンパク質の問い合せ配列を、6通り全てのリーディングフレーム
(両鎖とも)において機能的に翻訳したヌクレオチド配列データベースと比較し、 tblastxは、ヌクレオチドの問い合せ配列の6通りのフレーム翻訳産物を、ヌク
レオチド配列データベースの6通りのフレーム翻訳産物と比較するものである。
【００２５】 BLASTには以下の検索パラメータが使用される。
【００２６】 HISTOGRAMは、各検索についてスコアのヒストグラムを表示する。デフォルト
はyesである。(BLASTマニュアルのパラメータHを参照。) DESCRIPTIONSは、報告される一致配列のshort descriptionsの数を特定の数に
制限する。制限のデフォルトは100 descriptionsである。(マニュアルページの
パラメータVを参照。)EXPECTおよびCUTOFFも参照されたい。
【００２７】 ALIGNMENTSは、HSP (high-scoring segment pair)が報告されるデータベース
配列を特定の数に制限する。制限のデフォルトは50である。これよりも多くのデ
ータベース配列が、報告に際して統計学的有意性の閾値を偶然満たした場合には
(下記のEXPECTおよびCUTOFF参照)、統計学的な有意性が最も高いとされる一致の
みを報告する。(BLASTマニュアルのパラメータBを参照。) EXPECTは、データベース配列に対する一致を報告する統計学的有意性の閾値で
ある。KarlinおよびAltschulの確率モデル(1990)に従うと、デフォルト値は10で
あり、10の一致が単なる偶然で見つかるものと期待される。一致の統計学的な有
意性がEXPECT閾値よりも高い場合には、その一致は報告されない。EXPECT閾値が
低いほど厳しさが増すため、一致はほとんど報告されなくなる。少数値を設定す
ることもできる。(BLASTマニュアルのパラメータEを参照。)
【００２８】 CUTOFFは、HSPを報告するスコアをカットオフする。デフォルト値は、EXPECT
値から計算される(上記参照)。HSPの統計学的な有意性が、CUTOFF値に等しいス
コアを有するHSPのみの場合の有意性と少なくとも同程度の高さである場合に限
り、データベース配列に対してHSPを報告する。CUTOFF値が高いほど厳しさが増
すため、一致はほとんど報告されなくなる。(BLASTマニュアルのパラメータSを
参照。)典型的には、EXPECTを用いて有意性の閾値をより直感的に管理すること
ができる。
【００２９】 MATRIXは、BLASTP、BLASTX、TBLASTNおよびTBLASTXの場合に代替スコア行列を
指定する。デフォルト行列はBLOSUM62である(HenikoffおよびHenikoff, 1992)。
妥当な代替選択肢としては、PAM40、PAM120、PAM250およびIDENTITYが挙げられ
る。BLASTNの場合には代替スコア行列を利用できないため、BLASTNをリクエスト
した場合にMATRIXを指定するとエラー応答が返される。
【００３０】 STRANDはTBLASTN検索をデータベース配列の上部鎖または下部鎖に制限するか
、またはBLASTN、BLASTXもしくはTBLASTX検索を問い合せ配列の上部鎖もしくは
下部鎖上のリーティングフレームに制限する。
【００３１】 FILTERは、WoottonおよびFederhenのSEGプログラム(1993) Computers and Che
mistry 17:149-163で判定した構成上の複雑度が低い問い合せ配列のセグメント
、またはClaverieおよびStates (1993) Computers and Chemistry 17:191-201の
XNUプログラムで判定した短い周期の内部反復からなるセグメント(BLASTNの場合
は、TatusovおよびLipmanのDUSTプログラムで判定；http://www.ncbi.nlm.nih.g
ovを参照)を除去(mask off)する。フィルタリングは、統計学的には有意である
が生物学的には意味のない報告をblast出力から排除できるため(例えば、共通す
る酸性領域、塩基性領域またはプロリンに富む領域に対するヒット)、データベ
ース配列に対する特定のマッチングに利用できる問い合せ配列の生物学的により
興味深い領域が残る。
【００３２】 フィルタープログラムで見出される複雑度の低い配列を、ヌクレオチド配列で
は文字「N」を用いて置換し(例えば、「NNNNNNNNNNNNN」)、タンパク質配列では
文字「X」を用いて置換する(例えば、「XXXXXXXXX」)。
【００３３】 フィルタリングは、問い合せ配列(またはその翻訳産物)に適用されるだけであ
って、データベース配列には適用されない。デフォルトフィルタリングはBLASTN
の場合にはDUSTであり、他のプログラムの場合にはSEGである。
【００３４】 SWISS-PROTの配列に適用した場合、SEG、XNUまたはその両方でマスクされる配
列が全くないということは珍しくはないため、フィルタリングによって常に効果
が得られると期待すべきではない。さらに、場合によっては、配列全体がマスク
されることで、未フィルタリングの問い合せ配列に対して報告される一致の統計
学的な有意性がいずれも信用できないことが示される場合もある。
【００３５】 NCBI-giは、受入れ名および／または遺伝子座名の他に、出力に示すべきNCBI
gi識別子を与えるものである。
【００３６】 最も好ましくは、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTにて得られる単純なBLA
ST検索アルゴリズムを用いて配列比較を行う。
【００３７】 本発明によって提供される突然変異体には、インフルエンザウイルスM2のアミ
ノ酸突然変異体、グリコシル化変異体および他の共有結合性誘導体である誘導体
も含まれる。これらの誘導体は、本明細書に記載するような増殖停止または細胞
傷害性等のM2の生理学的特性を保持するものである。具体的な誘導体としては、
インフルエンザウイルスM2が、置換、化学的、酵素的または他の適切な手段によ
って、天然に存在するアミノ酸以外の成分(moiety)で共有結合的に改変されてい
る分子が挙げられる。
【００３８】 好ましくは、本発明は、トリ・インフルエンザＡ型ウイルス(Weybridgeまたは
Rostock)から単離されたM2タンパク質に由来する突然変異体に関する。有利には
、WeybridgeインフルエンザＡ型ウイルスからM2を単離する。しかしながら、本
発明は、プロトンチャネルまたはイオンチャネルとして作用し得るM2の変異体の
いずれにも関する。従って、他のインフルエンザ単離株に見られるインフルエン
ザウイルスM2の天然に存在する変異体も含まれる。このような変異体は、同一の
遺伝子ファミリーの関連する遺伝子、特定の遺伝子の対立遺伝子変異体、M2遺伝
子のキメラによってコードされていてもよく、またはインフルエンザウイルスM2
遺伝子の選択的スプライシング変異体に該当するものであってもよい。
【００３９】 構造上共通する特徴を保持する変異体は、インフルエンザウイルスM2の断片で
あってもよい。インフルエンザウイルスM2の断片は、インフルエンザウイルスM2
を起源とするより小型のポリペプチドを含むものである。好ましくは、本発明の
インフルエンザウイルスM2由来の小型ポリペプチドは、インフルエンザウイルス
M2の特性を示す共通の特徴を規定するものである。断片は、本明細書に記載する
インフルエンザウイルスM2のイオンチャネル活性を保持する限り、理論上、ほぼ
どのようなサイズであってもよい。
【００４０】 哺乳動物細胞の増殖を停止させる特性をM2に付与する突然変異は、有利には、
野生型M2の場合に哺乳動物の細胞膜にプロトンチャネルを形成する(即ち、これ
に関与する)分子の一部に位置する。有利には、突然変異はM2の膜貫通ドメイン
に位置する。膜貫通ドメインは、Weybridge単離株M2のアミノ酸26〜43によって
コードされるM2ポリペプチドの一部、またはこれに相当するものと定義すること
ができる。
【００４１】 好ましくは、哺乳動物細胞におけるイオンチャネル活性をM2ポリペプチドに付
与する目的で、本発明のM2突然変異体に突然変異を生じさせる。「イオンチャネ
ル活性」については、M2タンパク質の活性が、野生型M2の場合のようなプロトン
チャネル活性からプロトン以外のイオンを通過させるチャネルの活性へと変化す
ることを意味するものとする。好ましくは、実質的に任意の無機イオン、有利に
は任意のイオンを通過させるものである。
【００４２】 有利には、膜貫通ドメインのαヘリックス構造の形成または維持に関与する残
基に突然変異を生じさせる。好ましくは、突然変異は37位または37位付近に生じ
させる。
【００４３】 突然変異させるために選択した位置を、有利にはアミノ酸置換によって変更す
る。好適な置換は、M2のプロトンチャネルにおけるイオン輸送に影響を及ぼす置
換である。例えば、膜貫通ドメインのH37のプロトン付加は、プロトンチャネル
機能にとって重要であると考えられている。この残基またはプロトン付加に作用
する他の残基を変えることにより、M2のイオン輸送に影響が及ぶことが予測され
る。
【００４４】 好ましくは、Ala残基で37位を置換する。しかしながら、グリシン、アルギニ
ン、グルタミン酸、グルタミンまたはセリン等の他の残基でこの位置または他の
位置を置換してもよい。37位をアラニン以外のアミノ酸で置換すれば、アラニン
突然変異体とは異なる表現型形質を突然変異体に付与することができる。従って
、アラニン突然変異体は、K+輸送を可能にする改変されたイオンチャネルとして
機能し、かつトランスフェクトされた細胞の増殖をG1またはG0期で停止させるの
に対し、他の突然変異体は、増殖停止の異なる手段を示したり、トランスフェク
トされた細胞に対して毒性を示したりする可能性がある。組織特異的プロモータ
ーまたは適切な制御配列の制御下に置いた場合、このような突然変異体はさらに
、条件致死をもたらすことが可能である。
【００４５】 突然変異は、当業者に公知の任意の方法によって引き起こすことができる。し
かしながら、目的のキナーゼをコードする核酸配列の位置指定突然変異誘発が好
適である。M13等の一本鎖ファージを用いる方法からPCRを利用した技術("PCR Pr
otocols: A guide to methods and applications", M.A. Innis, D.H. Gelfand,
J.J. Sninsky, T.J. White(編) Academic Press, New York, 1990を参照)まで
、位置指定突然変異誘発を行う複数の方法が当該技術分野で公知である。好まし
くは、市販のAltered Site II Mutagenesis System (Promega)を、製造業者の指
示に従って使用すればよい。あるいは、Kunkelら(1987) Enzymology 159:367の
位置指定突然変異誘発法を利用してもよい。
【００４６】 本発明のM2突然変異体は、哺乳動物細胞の増殖停止を誘導し得るものである。
用語「増殖停止」には、増殖抑制の全ての形態が含まれる。例えば、この用語に
は、細胞増殖を遅らせて最終的には細胞死を招く毒性、細胞分裂の抑制、および
細胞増殖抑制の他の形態が含まれる。好ましくは、この用語は、細胞が細胞周期
の特定の期に移行するのを阻止し、その結果、細胞の増殖と分裂を阻止すること
をいう。有利には、増殖を停止させる細胞を、細胞周期のG0またはG1期で停止さ
せる。
【００４７】 従って、本発明は、本発明の上述の態様に従うM2突然変異体でトランスフェク
トされた哺乳動物細胞を提供する。有用な哺乳動物宿主細胞系の例は、チャイニ
ーズハムスター卵巣(CHO)細胞、NIH 3T3細胞、HeLa細胞または293T細胞といった
、上皮細胞系または線維芽細胞系である。本開示でいう宿主細胞には、in vitro
培養中の細胞並びに宿主動物内の細胞が含まれる。
【００４８】 DNAは、当該技術分野で公知の方法を用いて、安定的に細胞に取込ませること
もできるし、一過性に発現させることも可能である。安定的にトランスフェクト
された哺乳動物細胞は、選択マーカー遺伝子を有する発現ベクターで細胞をトラ
ンスフェクトし、トランスフェクトした細胞をマーカー遺伝子を発現する細胞に
対して選択的な条件下で培養して調製することができる。一過性トランスフェク
タントを調製するには、哺乳動物細胞をリポーター遺伝子でトランスフェクトし
てトランスフェクション効率をモニターする。
【００４９】 このような安定的または一過性にトランスフェクトされた細胞を作製するには
、M2を形成するのに十分な量のM2コード核酸で細胞をトランスフェクトしなけれ
ばならない。M2をコードするDNAの正確な量は、経験的に決めることができ、特
定の細胞およびアッセイについて最適化すればよい。
【００５０】 後述するような発現ベクターまたはクローニングベクターで宿主細胞をトラン
スフェクト、好ましくは形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、
所望の配列をコードする遺伝子の増幅に合わせて適宜改変した慣用の栄養培地中
で培養する。当該術分野で公知の任意の方法によって、例えば、リン酸カルシウ
ム共沈法またはエレクトロポレーションによって異種DNAをコードするベクター
でトランスフェクトすることにより、異種DNAを宿主細胞へ導入することが可能
である。多くのトランスフェクション方法が当業者には公知である。通常、この
ベクターのなんらかの作用が宿主細胞に見受けられれば、トランスフェクション
が成功したと認められる。形質転換は、使用する特定の宿主細胞に適した常法を
用いて行う。
【００５１】 適切な発現ベクターへのクローン化DNAの組込み、プラスミドベクターまたは
１つ以上の異なる遺伝子を各々コードするプラスミドベクターの組み合わせまた
は直鎖状DNAによる真核細胞のトランスフェクション、およびトランスフェクト
された細胞の選択は、当該技術分野で周知である(例えば、Sambrookら(1989) Mo
lecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor
Laboratory Pressを参照)。
【００５２】 当該技術分野で公知の培地および培養方法を用いて、好ましくは、DNAによっ
てコードされたM2を発現させる条件下で、トランスフェクトまたは形質転換され
た細胞を培養する。適切な培地の組成は当業者には公知であり、容易に調製可能
である。また、適切な培養培地は市販もされている。
【００５３】 本発明はさらに、トランスジェニック非ヒト哺乳動物に関するものであり、前
記動物は、本発明の上述の態様のインフルエンザウイルスM2突然変異体を発現す
るトランスジーンを少なくとも細胞のサブ集団内にコードしているものである。
当該トランスジェニック動物では、突然変異体が発現される細胞は増殖不能とな
る。
【００５４】 従って、好ましくは、トランスジーンは組織特異的制御エレメントの制御下に
ある。このようなエレメントには、１つ以上の組織特異的プロモーター、エンハ
ンサーまたは遺伝子座調節領域(LCR)が含まれていてもよい。さらに、宿主哺乳
動物のゲノムの特定の位置にトランスジーンを組込んでもよく、トランスジーン
を組込んだ環境に応じた組織特異性がもたらされる。
【００５５】 トランスジェニック動物は、核マイクロインジェクションおよびES細胞を使用
したキメラの作製といった当業者に公知の任意の適切な技術によって作製するこ
とが可能である。しかしながら、所望の組織の細胞全てをトランスジーンでトラ
ンスフェクトできる可能性が増すため、核マイクロインジェクションが好適であ
る。
【００５６】 本発明の突然変異体は、M2遮断剤の使用によって調節可能である。特定の薬剤
、典型的にはアマンタジン、リマンタジンおよびこれらと同等な薬剤が、プロト
ンチャネル孔を遮断することによって野生型M2の機能を抑制し得ることは公知で
ある。上記薬剤を本発明の突然変異体と併用してイオンチャネル活性をブロック
し、突然変異体の作用を打ち消すことが可能である。従って、リマンタジン、ア
マンタジンまたはこれらと同等な薬剤を、本発明の突然変異体を発現する細胞ま
たはトランスジェニック動物へ投与することで、増殖停止表現型を救済すること
ができる。遮断剤を除去すると、M2突然変異体が作動可能となり、M2突然変異体
を発現する細胞において増殖停止表現型が誘導される。
【００５７】 従って本発明は、トランスジェニック動物における組織発生、特に、通常は扱
いにくい組織の発生を研究するのに有用である。例えば、本発明は、免疫系組織
の研究に適用可能である。
【００５８】 さらなる態様では、本発明は、本発明の上述の態様のインフルエンザM2突然変
異体をコードする核酸を含んでなる遺伝子構築物に関する。本明細書中、用語「
遺伝子構築物」とは、指定された構成要素をコードする核酸分子のことをいう。
特に、この用語には、異種DNAを発現または複製させるために細胞へ導入するの
に使用されるベクターまたはプラスミド等の独立性のエレメントが含まれる。こ
のような輸送媒体の選択と使用は、当業者の技術の範囲内である。多くのベクタ
ーが利用可能であり、適切なベクターの選択は、ベクターの使用目的(即ち、DNA
増幅またはDNA発現のいずれに使用するのか)、ベクターへ挿入すべきDNAのサイ
ズ、およびベクターで形質転換すべき宿主細胞に依存するであろう。各ベクター
には、その機能(DNAの増幅またはDNAの発現)および和合させる宿主細胞に応じて
各種成分が含まれる。
【００５９】 発現ベクターおよびクローニングベクターはいずれも、通常、１個以上の選択
された宿主細胞内でベクターを複製可能にする核酸配列を含む。典型的には、ク
ローニングベクターでは、この配列は宿主の染色体DNAとは独立にベクターの複
製を可能にするものであり、複製起点または自律複製配列が挙げられる。このよ
うな配列は様々な細菌、酵母およびウイルスについて周知である。プラスミドpB
R322由来の複製起点は大部分のグラム陰性菌に適しており、２mプラスミドの複
製起点は酵母に適しており、各種ウイルスの複製起点(例えば、SV40、ポリオー
マ、アデノウイルス)は哺乳動物細胞の場合のクローニングベクターに適してい
る。一般に、COS細胞等の高レベルのDNA複製が可能な哺乳動物細胞で使用される
のでなければ、複製起点成分は哺乳動物発現ベクターにとっては必要なものでは
ない。
【００６０】 ほとんどの発現ベクターはシャトルベクターである。即ち、少なくとも１種類
の生物で複製可能であるが、別の種類の生物へトランスフェクトして発現させる
こともできる。例えば、宿主細胞の染色体とは独立して複製できないベクターで
あっても、そのようなベクターを大腸菌内でクローニングし、次いで同じベクタ
ーを酵母または哺乳動物細胞中へトランスフェクトすることが可能である。従っ
て、このようなベクターは、哺乳動物宿主細胞のゲノムへDNAを組込むのに適し
ている。
【００６１】 有利には、発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択遺伝子(選択マ
ーカーともいう)を含んでいてもよい。この遺伝子は、選択培養培地で培養した
形質転換宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードするものである
。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されていない宿主細胞は、選択培養培地
中で生存することはできない。典型的な選択遺伝子は、抗生物質や他の毒素(例
えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリン
)に対する耐性を付与するタンパク質、栄養要求性欠損を補足するタンパク質、
または合成培地からは得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードす
る。
【００６２】 酵母に適した選択遺伝子マーカーについては、マーカー遺伝子の表現型が発現
されることで形質転換体の選択が容易になる任意のマーカー遺伝子を使用するこ
とができる。酵母に適したマーカーは、例えば、抗生物質G418、ハイグロマイシ
ンまたはブレオマイシンに対する耐性を付与するか、栄養要求性酵母突然変異体
に原栄養性を付与するものであり、URA3、LEU2、LYS2、TRP1またはHIS3遺伝子等
が挙げられる。
【００６３】 ベクターの複製は大腸菌内で行うのが便利であるため、有利には大腸菌の遺伝
子マーカーおよび大腸菌の複製起点が含まれる。これらは、大腸菌の複製起点お
よびアンピシリン等の抗生物質に対する耐性を付与する大腸菌の遺伝子マーカー
の双方を含むpBR322、Bluescript(著作権)ベクターまたはpUCプラスミド(例えば
pUC18もしくはpUC19)等の大腸菌プラスミドから取得することができる。 本発明の遺伝子構築物は、好ましくは、宿主生物に認識され、またM2核酸に機能
し得る形で連結したプロモーターを含む。このようなプロモーターは、誘導性ま
たは構成的であってよい。好ましくは、プロモーターを供給源から取り出し、単
離したプロモーター配列をベクターへ挿入することにより、M2をコードするDNA
へプロモーターを機能し得る形で連結させる。用語「機能し得る形で連結する」
とは、記載の構成要素が、予定した通りに機能し得る関係にある近位(juxtaposi
tion)のことをいう。コード配列に「機能し得る形で連結した」制御配列は、制
御配列に適合した条件下でコード配列の発現が達成されるようにライゲートされ
ている。
【００６４】 好適な発現ベクターは、細菌中で機能可能なバクテリオファージ(ファージxま
たはT7等)のプロモーターを含んでなる細菌性発現ベクターである。最も広く使
用されている発現系の一つでは、T7 RNAポリメラーゼによって、融合タンパク質
をコードする核酸をベクターから転写することができる(Studierら, Methods in
Enzymol. 185:60-89, 1990)。大腸菌BL21(DE3)宿主株では、pETベクターと併用
して、T7 RNAポリメラーゼを宿主細菌中のλ溶原ファージDE3から産生させ、そ
の発現をIPTG誘導性lac UV5プロモーターの制御下に置く。この系を使用して、
多くのタンパク質を過剰産生させることに成功している。あるいは、市販されて
いるCE6ファージ(Novagen, Madison, USA)等のint-ファージを感染させてポリメ
ラーゼ遺伝子をλファージへ導入してもよい。他のベクターとしては、PLEX (In
vitrogen, NL)等のλPLプロモーターを含むベクター、pTrcHisXpressTm (Invitr
ogen)もしくはpTrc99 (Pharmacia Biotech, SE)等のtrcプロモーターを含むベク
ター、またはpKK223-3 (Pharmacia Biotech)もしくはPMAL (New England Biolab
s, MA, USA)等のtacプロモーターを含むベクターが挙げられる。
【００６５】 哺乳動物宿主におけるベクターからのM2遺伝子の転写は、ポリオーマウイルス
、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サ
イトメガロウイルス(CMV)、レトロウイルスおよびシミアンウイルス40 (SV40)等
のウイルスのゲノムに由来するプロモーター、アクチンプロモーター等の異種哺
乳動物プロモーターに由来するプロモーター、またはリボソームタンパク質プロ
モーター等の非常に強力なプロモーターによって制御することが可能である(但
し、これらのプロモーターは宿主細胞系に適合するものでなければならない）。
しかしながら、好ましくは、組織特異的プロモーターを使用する。組織特異的プ
ロモーターとしては、CD2プロモーターおよびLckプロモーターといった免疫系の
組織に特異的なものが挙げられる。
【００６６】 M2をコードするDNAの転写は、エンハンサー配列をベクターへ挿入することに
よって増加させることが可能である。エンハンサーは向きおよび位置には比較的
依存しないものである。哺乳動物遺伝子(例えば、エラスターゼおよびグロビン)
から多くのエンハンサー配列が公知である。本発明に用いるエンハンサーは、有
利には組織特異的であって、M2発現ユニットへの組織特異性の付与を促進するも
のである。エンハンサーはベクターのM2 DNAの5'または3'側へ接続させることが
できるが、好ましくはプロモーターの5'側に配置する。
【００６７】 有利には、M2をコードする真核生物発現ベクターは、遺伝子座調節領域(LCR)
を含んでいてもよい。LCRは、宿主細胞のクロマチンに組込まれたトランスジー
ンが組込み部位に関係なく高レベルで発現されるように指令し得るものであり、
これはベクターが染色体に組込まれた永久トランスフェクト真核細胞系またはト
ランスジェニック動物においてM2遺伝子を発現させる場合には、特に重要である
。本発明では、CD2 LCRを使用するのが有利であり、例えばCD2プロモーターと組
み合わせて使用する。
【００６８】 真核生物発現ベクターにはまた、転写の終結およびmRNAの安定化に必要な配列
も含まれる。このような配列は、一般に、真核生物またはウイルスのDNAもしく
はcDNAの5'および3'非翻訳領域より取得可能である。このような領域には、M2を
コードするmRNAの非翻訳部分においてポリアデニル化断片として転写されるヌク
レオチドセグメントが含まれる。
【００６９】 発現ベクターとしては、このようなDNAの発現が可能な、プロモーター領域等
の調節配列に機能し得る形で連結されたM2核酸を発現し得る任意のベクターが挙
げられる。従って、発現ベクターとは、プラスミド、ファージ、組換えウイルス
または他のベクター等の組換えDNAまたはRNA構築物のことをいい、適切な宿主細
胞へ導入するとクローン化DNAの発現を引き起こすものをいう。適切な発現ベク
ターは当業者には周知であり、真核細胞および／または原核細胞中で複製可能な
もの、エピソームのままでいるもの、または宿主細胞ゲノムへ組込まれるものが
挙げられる。例えば、M2をコードするDNAを、哺乳動物細胞でのcDNAの発現に適
したベクター(例えば、pEVRF(Matthiasら(1989) NAR 17, 6418)等のCMVエンハン
サー系ベクター)へ挿入することが可能である。
【００７０】 本発明のベクターの構築には、従来のライゲーション技術を使用する。単離し
たプラスミドまたはDNA断片を切断し、調整し、必要なプラスミドを生成するの
に望ましい形態に再度ライゲートする。必要であれば、構築されたプラスミド中
の正しい配列を確認する分析を公知の方法で行う。発現ベクターの構築、in vit
ro転写産物の調製、DNAの宿主細胞への導入、およびM2の発現と機能を評価する
分析の実施に適した方法は、当業者には公知である。遺伝子の有無、増幅および
／または発現は、例えば、本発明で提供される配列に基づく適当に標識されたプ
ローブを用いて、従来のサザンブロッティング、mRNAの転写を定量するノーザン
ブロッティング、ドットブロッティング(DNAもしくはRNA分析)、またはin situ
ハイブリダイゼーションによってサンプル中で直接測定することができる。当業
者であれば、必要に応じてこれらの方法をどのように改変すればよいか容易に想
像できるであろう。
【００７１】 さらに別の態様では、本発明は、本発明の上述の態様のインフルエンザウイル
スM2突然変異体をコードするトランスジーンを細胞へ挿入することを含んでなる
、細胞の増殖を停止させる方法に関する。
【００７２】 好ましくは、この方法には、 (a)本発明のインフルエンザウイルスM2突然変異体をコードするトランスジー
ンを組織特異的な制御下にて細胞中で発現させ、 (b)M2遮断剤の存在下で細胞を培養し、 (c)増殖停止を誘導するために、前記遮断剤の不在下で細胞を培養する 工程が含まれる。
【００７３】 アマンタジンまたはリマンタジン等の遮断剤を使用することにより、本発明の
突然変異体が条件致死因子として機能し得るようになる。細胞中で本発明の突然
変異体が発現されている動物または患者へ遮断剤を投与することにより、目的の
細胞の増殖を調節することが可能になる。従って、アマンタジンもしくはリマン
タジンまたはこれらの類似体といった低分子薬剤を投与することで、選択した組
織の増殖を調節することができる。
【００７４】 本発明のさらなる態様では、リマンタジンおよびその類似体が血液脳関門と胎
盤を通過し得ることに注目されたい。従って、本発明の突然変異体を使用してニ
ューロン機能をターゲティングすることが可能であり、具体的には、神経学的現
象の研究または神経障害の治療を行うために神経集団を破壊することによるもの
である。
【００７５】 以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、以下の実施例は単に例示を目的と
したものに過ぎない。
【００７６】実施例１ M2 H37A突然変異体の調製 実施例中で使用する一般的な生化学技術および分子技術は、Sambrookら, Mole
cular Cloning: A Laboratory Manual, (1989) Cold Spring Harbor, USAに記載
されている。
【００７７】 配列番号１には、インフルエンザＡ型ウイルスのWeybridge単離株由来のM2タ
ンパク質の配列を示す。このポリペプチドのHis37は、Kunkelら(1987) Enzymolo
gy 159:367の方法を利用したPCRによって37位をコードするコドンをGACからGCC
へ突然変異させることにより、Alaに変更されている。
【００７８】 突然変異M2遺伝子をマウスMEL細胞(Needhamら(1992) NAR 20:997-1003; Deiss
erothら(1975) PNAS (USA) 72:2682-2686)へ挿入する。
【００７９】 MEL細胞を、10％FCSおよび200μg/mlジェネティシンを含むαMEM培地中で37℃
にて培養する。突然変異体M2タンパク質をマウスβ-グロビンプロモーターの制
御下で一過性に発現させる。このプロモーターは漏出性であるため、誘導されな
くてもM2発現が生じる。このような条件下では細胞は増殖できず、リマンタジン
の不在下ではM2(H37A)突然変異体の複製が妨げられる。
【００８０】 しかしながら、リマンタジンの存在下では、突然変異体は複製可能である。構
築物でトランスフェクトした細胞へ誘導剤(DMSO)を添加すれば、直ちに増殖が停
止されるものの、リマンタジンが存在すると、最終的な分化と増殖停止が生じる
前に２細胞倍加が先行する。リマンタジンとDMSOの存在下におけるM2(H37A)発現
細胞の細胞動態は、DMSO単独の存在下における野生型M2発現細胞の場合と同様で
ある。
【００８１】実施例２ Lck/M2 H37Aトランスジーンの構築 組織特異的Lckプロモーターの制御下にあるM2 H37A配列を含んでなる構築物を
作製する。
【００８２】 Lckプロモーターは、Ｔリンパ球が多分化能性造血幹細胞から分化する際に活
性化されるものである。胸腺細胞発生の初期に、CD3- CD4- CD8-からCD3- CD4+
CD8+へ移行する際に、Lck「近位」プロモーターがオンになり、シングルポジテ
ィブ段階(CD4+またはCD8+)で静止するまで活性状態が持続するため、Ｔ細胞発生
が狭い範囲に限られる。このプロモーターをCre/lox遺伝子切断系と併用しよう
とする従前の試みは失敗に終わっている。
【００８３】 Lckプロモーターは、Chaffinら(1990)EMBO J. 9:3821-3829より取得されたベ
クターp1017に含まれており、このベクターは、3.2kbのマウス近位lckプロモー
ター(Gravinら(1990) Int. Immunol. 2:173-180)を、pUC19のEcoRI部位とSmaI部
位との間に挿入して構築されている。このベクターはさらにポリリンカーを含ん
でおり、SpeI、SacII、SfiIおよびNotI配列が導入されている。突然変異体M2ポ
リペプチドをコードする配列をp1017のBamHI部位へ挿入する。
【００８４】 次いで構築物をマウスの卵へマイクロインジェクションしてトランスジェニッ
クマウス系統を作製する。
【００８５】実施例３ M2 H37Aを発現するトランスジェニックマウス １代目の動物全てを繁殖させてトランスジェニック系統を作製する。次いで、
一部のヘミ接合型の１代目を検査する。検査した動物はいずれも胸腺を欠損して
おり、胸腺原基と少数の未成熟末梢Ｔ細胞のみを有しているため、末梢Ｔ細胞の
数が激減しているか、または胸腺腫を発症している。
【００８６】 ヘミ接合型トランスジェニック動物を繁殖させてホモ接合型トランスジェニッ
ク系統を作製する。これらの動物は、ごくわずかの胸腺原基のみを有している。
【００８７】 ホモ接合型またはヘミ接合型のトランスジェニック動物および対照動物のリン
パ器官から細胞を回収し、イソチオシアン酸フルオレセイン(FITC)またはフィコ
エリトリン(PE)で染色した抗CD3、CD4およびCD8抗体を用いるフローサイトメト
リー(FACS分析)でそれらの細胞を分析する。ホモ接合型トランスジェニック動物
に対する結果を表１に示す。
【００８８】
【表１】
【００８９】 表１に示した結果から、トランスジェニック胸腺由来の細胞がCD4- CD8-優勢
であって未成熟表現型を示唆しているのに対し、対照動物がCD4+ CD8+であるこ
とが明らかである。トランスジェニック胸腺組織に見られるCD4- CD8-細胞(対照
組織での４％に対し95％)は、胸腺発生時の最も初期の胸腺移入細胞に該当する
。これは、胸腺組織の発生が発生の初期段階で停止した結果であると考えられる
。
【００９０】 脾臓で見られるCD4- CD8-細胞はＴ細胞ではないため、このパーセンテージは
本分析には関与しない。
【００９１】実施例４ 器官培養実験 実施例３に記載したトランスジェニックマウスでは、胎児発生の初期段階にお
いてLckプロモーターの制御下でM2突然変異体が活性化された結果、初期Ｔ細胞
が形成されず、またＴ細胞発生を支持する細胞(T-cell feeder)がマウス中に存
在しないため、実質的に胸腺組織が完全に欠損している。その結果、M2突然変異
体を不活化しても、適切な前駆細胞が存在しないためにＴ細胞生成が誘導されな
いことから、このＴ細胞の欠損はリマンタジンの投与によっても救済することは
できない。
【００９２】 Ｔ細胞発生の救済を実証するために、実質的にJenkinsonおよびAnderson, (19
94) Curr. Opin. Immunol. 6:293-297の記載に従って、15日齢のマウス胚からの
器官培養を確認する。
【００９３】 妊娠15日目のマウスから胚嚢を取り出し、臍帯を切断して胚を切り離す。胚を
氷上に置き、胚以外の組織を廃棄する。異常な胚(即ち、大きさから判断して非
同調成長にある胚)は全て、この段階で同様に廃棄する。
【００９４】 胎児胸腺葉を胚から切り離し、RPMI培地中、Costarフィルター(Corning)上で
培養する。実験期間中、フィルターを毎日新しい培地の入ったウェルへ移す。
【００９５】 ７〜10日目に、胸腺葉を回収し、200μlの培地を含むエッペンドルフチューブ
へ移し、細胞を機械的にほぐしてバラバラにする。次いで上述のFACSによって細
胞を分析する。
【００９６】 別の実験では、リマンタジンの存在下で胸腺原基を培養し、上述のFACSによっ
て細胞を分析する。
【００９７】 リマンタジンの存在下で培養することにより、胸腺原基におけるＴ細胞生成を
救済することが可能である。別のプロモーターをトランスジェニック動物へ使用
して初期Ｔ細胞とＴ細胞を支持する細胞が形成された後に胸腺発生を停止させる
ことができれば、救済可能な表現型が得られるであろう。
【配列表】
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年８月４日（２０００．８．４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 ヘイ，アラン，ジェームズ イギリス国 エヌダブリュ７ ２エイチデ ィー ロンドン，ミル ヒル，エンゲル パーク ４

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 哺乳動物細胞の増殖を停止し得るインフルエンザウイルスM2
    タンパク質の突然変異体。
  2. 【請求項２】 インフルエンザＡ型ウイルスのWeybridge単離株に由来する
    、請求項１記載のタンパク質。
  3. 【請求項３】 インフルエンザウイルスM2の膜貫通ドメインの一部である残
    基に突然変異が生じている、請求項１または２記載の突然変異体。
  4. 【請求項４】
  5. 【請求項５】 37位に突然変異が生じている、請求項４記載の突然変異体。
  6. 【請求項６】 突然変異がHis37に生じており、His37がAla、Gly、Ser、Arg
    およびGlxからなる群より選択される残基で置換されている、請求項５記載の突
    然変異体。
  7. 【請求項７】 トランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、請求項１〜６
    のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルスM2突然変異体を発現するトラン
    スジーンを、少なくとも細胞のサブ集団内にコードしている前記動物。
  8. 【請求項８】 トランスジーンが組織特異的な制御下にある、請求項７記載
    のトランスジェニック動物。
  9. 【請求項９】 トランスジーンが１つ以上の組織特異的エンハンサー、組織
    特異的プロモーターおよび組織特異的LCRの制御下にある、請求項８記載のトラ
    ンスジェニック動物。
  10. 【請求項１０】 M2トランスジーンによって細胞の増殖停止が引き起こされ
    る、請求項７〜９のいずれか一項に記載のトランスジェニック動物。
  11. 【請求項１１】 前記停止が組織特異的である、請求項１０記載のトランス
    ジェニック動物。
  12. 【請求項１２】 M2遮断剤を前記動物へ投与することにより前記停止が阻止
    される、請求項１０または１１記載のトランスジェニック動物。
  13. 【請求項１３】 請求項１〜６のいずれか一項に記載のインフルエンザウイ
    ルスM2突然変異体をコードするトランスジーンを細胞へ挿入することを含んでな
    る、細胞の増殖を停止させる方法。
  14. 【請求項１４】 (a)請求項１〜６のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルスM2突然変異
    体をコードするトランスジーンを組織特異的な制御下にて細胞中で発現させ、 (b)M2遮断剤の存在下で細胞を培養し、 (c)増殖停止を誘導するために、前記遮断剤の不在下で細胞を培養する 工程を含んでなる、請求項１３記載の方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１〜６のいずれか一項に記載のインフルエンザM2突
    然変異体をコードする核酸を含んでなる遺伝子構築物。
  16. 【請求項１６】 インフルエンザウイルスM2タンパク質をコードする核酸が
    、組織特異的な制御配列に機能し得る形で連結している、請求項１５記載の遺伝
    子構築物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7465456B2 (en) 2002-04-26 2008-12-16 Medimmune, Llc Multi plasmid system for the production of influenza virus
AU2004308328B2 (en) 2003-12-23 2009-06-04 Medimmune, Llc Multi plasmid system for the production of influenza virus
US8691781B2 (en) * 2004-11-05 2014-04-08 Sirnaomics, Inc. Compositions for treating respiratory viral infections and their use
AU2007297801A1 (en) 2006-07-14 2008-03-27 Sanofi Pasteur Biologics Co. Construction of recombinant virus vaccines by direct transposon-mediated insertion of foreign immunologic determinants into vector virus proteins
EP2069483A4 (en) * 2006-09-29 2010-10-27 Sanofi Pasteur Biologics Co RECOMBINANT RHINOVIRAL VECTORS
EP2674486A1 (en) 2007-06-18 2013-12-18 MedImmune, LLC Influenza B viruses having alterations in the hemaglutinin polypeptide
US20130053277A1 (en) * 2010-05-04 2013-02-28 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Methods of identifying inhibitors of polypeptides-of-interest
KR102080061B1 (ko) 2011-06-24 2020-02-21 플루젠, 인코퍼레이티드 인플루엔자 바이러스 돌연변이체들 및 그들의 용도들
US9868952B2 (en) 2012-07-08 2018-01-16 Sirnaomics, Inc. Compositions and methods for “resistance-proof” SiRNA therapeutics for influenza
CN114381438B (zh) * 2022-01-27 2024-02-02 浙江迪福润丝生物科技有限公司 一种流感病毒的致弱方法及流感致弱病毒株和应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5290686A (en) * 1991-07-31 1994-03-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Expression of influenza a M2 protein in baculovirus
US5691189A (en) * 1994-01-19 1997-11-25 Bristol-Myers Squibb Company Saccharomyces cerevisiae expressing M2 protein of influenza A virus
AU702915B2 (en) * 1994-05-26 1999-03-11 Heska Corporation Novel parasite protease genes and proteins

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