JP4749860B2 - 条件的自食作用欠損動物及び疾患モデル動物 - Google Patents

Description

本発明は、条件的にオートファジー（自食作用）能を欠損したノックアウト動物及び条件的オートファジー欠損に基づく疾患のモデル動物に関する。

オートファジー（自食作用：ａｕｔｏｐｈａｇｙ）は、非選択的な細胞内タンパク質分解機構の初発反応である。この生体応答は、細胞や個体が栄養飢餓（例えば絶食）に陥ったとき、より重要な成分を生合成するために自己の成分を破壊して栄養素を確保する基本的な生存戦略であると考えられる。例えて言うと、オートファジーは“細胞が自分を食べる”仕組みである。その分子機構は、図１に示したように、最初に、自己の細胞質成分（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）が細胞質中に出現した隔離膜と呼ばれる単膜構造（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ）によって取り囲まれる。これが内容物を包み込んで二重膜の小胞であるオートファゴソーム（Ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ、自食胞）が形成される。その後、多数の消化酵素を含んだリソソーム（液胞）が融合してオートリソソームとなると、オートファゴソームの内容物が消化される。膜動態の視点から考えると、オートファジーはメンブレントラフィック（能動輸送）の一種とみなされる。
オートファジー・液胞系は、全ての細胞内成分を破壊する装置であるが、タンパク質の場合には、リソソームに存在する数十のタンパク質分解酵素（総称名：カテプシン群）が作用して構成成分であるアミノ酸にまで完全分解され、生成されたアミノ酸は再利用される。従って、このオートファジー・リソソーム分解機構は、消耗した細胞内成分を分解して再生に供する効率の良いリサイクルシステムと位置づけられる。
このオートファジー現象は、酵母からヒトに至る全ての真核生物において進化的に保存された重要な生物応答反応である。初期の研究では、細胞を栄養飢餓に付置すると、多数のオートファゴソーム（直径が約１μｍの完全に閉ざされたほぼ球状の二重膜の構造）の出現が電子顕微鏡により形態観察で同定されていた。まず最初に、細胞質中に出現した隔離膜と呼ばれる単膜構造が婉曲し、細胞質の一部（酵素やリボソームなど）やオルガネラ（ミトコンドリア・ペルオキシソーム・エンドプラスミックレティキュラムなどの細胞内小器官）を囲い込んでオートファゴソームが形成される。分子機構は不明であるが、オートファゴソームはリソソームと直接融合することができる。その結果、リソソームの加水分解酵素がオートファゴソームの外膜と内膜の間に流れ込み、まず内膜を消化した後、囲い込まれた細胞質成分やオルガネラを消化する。オートファジーは、環境応答する大規模な誘導的異物処理装置である。例えば動物を絶食すると、まず肝細胞でオートファジーが誘導され、１時間あたり数％に及ぶ細胞質が分解され、その分解産物が栄養素材として他の組織の救済に使われる。言い換えれば、サバイバルのための緊急措置として文字通り“身を削って生存に不可欠な生合成反応に備える”のである。このことを反映して、オートファジーは種々のホルモンや細胞の状況によって促進又は抑制されてダイナミックに変動することで、細胞や個体の恒常性維持に迅速に対応することができる。
オートファジーの現象は四半世紀以前からよく知られていたが、その分子メカニズムは長い間謎であった。その突破口を切り開いたのは、酵母における遺伝学的研究であった。即ち、１９８０年代の中頃からオートファジーに欠陥を示す変異株が多数分離され（酵母のオートファジー不能変異株：ａｕｔｏｐｈａｇｙ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｍｕｔａｎｔ（ａｐｇ）１−１７）、その原因遺伝子はＡＰＧ１〜ＡＰＧ１７と名付けられた。その後のＡＰＧ遺伝子群の機能解析研究の中から、１９９８年にＡｐｇ１２が、そして２０００年にＡｐｇ８が新規なモディファイヤー（翻訳後修飾分子）として作用することが判明した。即ち、Ａｐｇ１２は活性化酵素（Ｅ１）であるＡｐｇ７で活性化された後、結合酵素（Ｅ２）であるＡｐｇ１０の触媒作用により標的タンパク質であるＡｐｇ５に共有結合（Ａｐｇ１２のカルボキシル末端グリシンのカルボキシル基とＡｐｇ５の１４９番目のリジンのイプシロンアミノ基が縮合してイソペプチド結合）することが判明したのである（図２）。
図２において、上図は、Ａｐｇ１２をリガンドとした翻訳後修飾システム（Ａｐｇ１２ ｓｙｓｔｅｍ）である。Ａｐｇ１２は、活性化酵素Ｅ１であるＡｐｇ７によりＡＴＰ依存的に活性化され、そのＣ末端グリシン（Ｇ）のカルボキシル基がＥ１の活性システイン（Ｃ）のチオール基とチオエステル結合する。活性化されたＡｐｇ１２は、結合酵素Ｅ２であるＡｐｇ１０に転移（Ａｐｇ７と同様にＡｐｇ１０の活性システイン残基とチオエステル結合する）された後、標的タンパク質であるＡｐｇ５の１４９番目のリジン残基（Ｋ）のイプシロンアミノ基とＡｐｇ１２のＣ末端グリシン残基（Ｇ）のカルボキシル基の間でイソペプチド結合する。このＡｐｇ１２−Ａｐｇ５結合体は、隔離膜に局在することから、オートファゴソーム形成に重要な役割を果たしていると考えられる。
一方、Ａｐｇ８は、Ａｐｇ１２修飾のためのＥ１と同じ活性化酵素Ａｐｇ７によって活性化された後、Ｅ２であるＡｐｇ３の作用でリン脂質（フォスファチジルエタノールアミン：ＰＥ）に共有結合する（図２）。図２において、下図は、Ａｐｇ８をリガンドとした翻訳後修飾システム（Ａｐｇ８ ｓｙｓｔｅｍ）である。Ａｐｇ８はカルボキシル末端に余分のアルギニン（Ｒ）も持った前駆体として生合成される。この前駆体Ａｐｇ８のアルギニン残基がシステインプロテアーゼＡｐｇ４の作用で取り除かれ成熟型Ａｐｇ８が生成される。成熟型Ａｐｇ８は、Ａｐｇ１２と同じように（上図参照）Ｅ１活性化酵素Ａｐｇ７で活性化されたのち、Ｅ２結合酵素Ａｐｇ３の作用によりそのＣ末端グリシン（Ｇ）を介して標的分子であるフォスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）とアミド結合する。Ａｐｇ８−ＰＥ結合体は、オートファゴソーム膜の形成に必須な役割を果たしている。オートファゴソーム形成の後、このＡｐｇ８−ＰＥ結合体は、Ａｐｇ４の作用で水解され、Ａｐｇ８は再利用される。
これらのいずれの分子が欠損してもオートファゴソームが形成されない。この二種の翻訳後修飾システムの発見によってオートファジーの機構、即ちダイナミックな膜の形成機構が分子レベルで解明されつつある。
これらのＡｐｇ修飾システムの機能解析研究は、主に出芽酵母での研究が主流であり、ヒトなどの高等生物においてはほとんど未解明である。しかし、最近の研究から、Ａｐｇ８およびＡｐｇ１２の翻訳後修飾反応システムは、ヒトにおいても高く保存されていることが判明した。興味深いことには、哺乳動物ではＡｐｇ８のホモローグとして三種の分子、即ち、ＬＣ３（ラット脳の微小官結合タンパク質ＭＡＰ１Ａ／Ｂのサブユニットとして同定）、ＧＡＢＡＲＡＰ（ＧＡＢＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ：神経細胞のＧＡＢＡ_Ａレセプターに結合してそのクラスタリングや輸送に関わる分子として同定）、ＧＡＴＥ１６（Ｇｏｌｇｉ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＡＴＰａｓｅ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｏｆ １６ ｋＤａ：ゴルジ層板内小胞輸送の促進因子として同定）が存在し、進化的に多様性を獲得したシステムとなっている。
酵母などの下等単細胞生物においては、オートファジーは飢餓に応答した生存戦略が唯一のはたらきと考えられてきた。しかし、最近、高等な多細胞生物（植物やヒトなどの哺乳動物など）では、オートファジーは飢餓時の栄養素確保以外に多様な役割を担っていることが次第に判明してきた。例えば、オートファジーの生理的意義として、細胞内タンパク質やオルガネラの代謝回転、不要物の処理、分化に応答した細胞体制の再編成、２型プログラム細胞死、内在性抗原のクラスＩＩ ＭＨＣへの提示などへの関与が示唆されている（Ｏｈｓｕｍｉ．Ｙ．２００１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｐｈａｇｙ：ｔｗｏ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２：２１１−２１６、Ｋｌｉｏｎｓｋｙ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ Ｅｍｒ，Ｓ．Ｄ．２０００．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ａｓ ａ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９０：１７１７−１７２１．）。一方、疾病に関連しては、アルツハイマー病・パーキンソン病・ハンチントン舞踏病・プリオン病など２１世紀の高齢化社会において急増しつつある複数の神経変性疾患や激しい筋崩壊を伴うミオパチー（縁取り空砲型遠位性ミオパチー・封入体性筋症・クロロキン筋肉症・ＡＣＴＨ誘導性骨格筋萎縮症等）あるいは、α１アンチトリプシン欠損病（変異α１アンチトリプシンの肝細胞内蓄積）などの様々な疾患においてオートファゴソーム様構造の異常が観察されており、オートファジーがこれらの疾病の病態発症機構に関係する可能性が数多く示唆されてきている（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ．Ｎ．，Ｏｈｓｕｍｉ．Ｙ．，ａｎｄ Ｙｏｓｈｉｍｏｒｉ．Ｔ．２００２．Ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．，２７：４２１−４２９、Ａｂｅｌｉｏｖｉｃｈ．Ｈ．，ａｎｄ Ｋｌｉｏｎｓｋｙ．Ｄ．Ｊ．２００１．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｉｎ Ｙｅａｓｔ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ａｎｄ Ｐｈｉｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｍｉｃｒｏ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６５：４６３−４７９．）。しかし、高等動物におけるオートファジーの生理学的研究および病態医化学的研究は、全くなされていない。その理由は、オートファジーを個体レベルで解明する手段がなかったからである。
ところで、肝臓は、動物個体を健康に維持するための最も重要な臓器である。肝臓の主な役割は、例えば生体エネルギーの素材としてのグルコースをグリコーゲンとして貯蔵し、必要に応じて他の臓器にグルコースに分解して供給するというものである。また、多くの血清タンパク質は、肝臓で生合成され血中に分泌されている。もう一つの肝臓の大きな役割は、多臓器へのアミノ酸を供給することである。これらに適切に応答するために、肝臓は飢餓応答によりその臓器重量を大きく低下変動させることが知られている。例えば、マウスを１〜２日絶食すると、肝臓の質重量は大幅に低下する。このとき電子顕微鏡を用いて形態的に組織像を解析すると、肝細胞内に多数のオートファゴソーム（自食胞：細胞質成分やオルガネラを取り込んだ二重膜小胞）の出現が観察される。
ここで、肝臓の一つの特徴は、再生能力が旺盛なことであり、肝炎や肝硬変あるいは肝癌などの外科処置として部分的な肝切除を行っても容易に再生できる。この特性により生体肝移植が数多くなされている。にもかかわらず、肝臓は日常的にストレスに曝されており、その障害からしばしば肝炎に陥る。実際、ウイルス性肝炎やアルコール性肝炎など多くの例が知られている。従って、肝炎を治癒・防御する薬剤の開発は、社会的にも非常に重要な問題となっている。これまで肝炎のモデルは、腹腔内に肝毒素を注入するシステムが実験的モデルマウスとして汎用されてきた。しかしながら、このマウスは正常な肝機能の破綻によって発症するのではなく、いわば外科的に肝臓に障害を与え、肝細胞の崩壊を誘導するものであった。

本発明は、条件的自食作用欠損動物及び条件的に自食作用を欠損した疾患モデル動物を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行なった結果、マウスの発生工学的手法によりＡｐｇ７の機能を不活性化させたノックアウトマウスを作出することに成功し、二種のＡｐｇ８及びＡｐｇ１２修飾系を不活性化してオートファジー経路を完全に喪失させることに成功した。また、肝臓の多面的な生物学的重要性を考えることで、オートファジーは恒常的に重要な意義があることが予見された。このような背景から、本発明者は、さらに肝臓におけるオートファジー経路を条件的に欠損させるマウスを作製し、このマウスが疾患のモデル動物として利用し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）Ｃｒｅリコンビナーゼ依存的にオートファジー原因遺伝子の全部又は一部の機能を失わせることができる非ヒトノックアウト動物。
（２）オートファジー原因遺伝子の全部又は一部の機能が失われた非ヒトノックアウト動物からなる、疾患モデル動物。
上記（１）及び（２）の動物において、オートファジー原因遺伝子としては、例えばＡＰＧ７遺伝子が挙げられ、動物としては、例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ヒツジ及びヤギが挙げられ、好ましくはマウスである。また、疾患としては、肝炎、癌、神経変性疾患、筋疾患、及び免疫疾患からなる群から選択される少なくとも１つが挙げられ、肝炎が好ましい。
（３）実験動物のオートファジー原因遺伝子を破壊することを特徴とする、疾患モデル動物の製造方法。
（４）上記（２）記載の疾患モデル動物に候補物質を投与することを特徴とする、上記疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法。
オートファジー原因遺伝子は、組織又は臓器特異的なもの、例えば各種組織又は臓器特異的ＡＰＧ７遺伝子を使用することができる。また、動物としては例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ヒツジ及びヤギが挙げられ、好ましくはマウスである。また、疾患としては、肝炎、癌、神経変性疾患、筋疾患、及び免疫疾患からなる群から選択される少なくとも１つが挙げられ、肝炎が好ましい。

図１は、オートファジー（自食作用）による細胞内タンパク質分解機構の概要図である。
図２は、２種のモディファイヤーＡｐｇ８／１２による翻訳後修飾モデル経路を示す図である。
図３は、条件的ＡＰＧ７（ａｕｔｏｐｈａｇｙ活性化酵素）ノックアウトマウスを作製するためのターゲティングベクターの作製の概要（Ａ）、ＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}マウス尾から抽出したＤＮＡを用いたＳｏｕｔｈｅｒｎブロット解析の結果（Ｂ）、及び、ＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}マウスの肝臓及びＡｐｇ７抗体を用いて、Ａｐｇ７のＷｅｓｔｅｒｎブロット解析を行なった結果（Ｃ）を示す。
図４は、野性型ＡＰＧ７遺伝子、ｌｏｘＰ導入ＡＰＧ７遺伝子及びＡＰＧ７（エキソン１４）欠損遺伝子アレルの模式図（左上パネル）、インターフェロンγ誘導剤を注射したマウス肝臓から抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲ法により増幅したＡＰＧ７遺伝子ＤＮＡ断片（上右パネル）、正常飼育マウスと１日絶食マウス（右パネル：Ｆａｓｔｉｎｇ）からの肝臓のウエスタンブロット解析結果（下パネル）を示す図である。
図５は、ｐＩｐＣ処置したＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／＋}：Ｍｘ１Ｃｒｅヘテロマウス肝細胞の形態観察を示す図である。
図６は、ｐＩｐＣ処置したＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}：Ｍｘ１Ｃｒｅホモマウス肝細胞の形態を示す図である。
図７は、Ａｐｇ７欠損によって誘導される肝臓の肥大を示す図である。
図８は、Ａｐｇ７欠損における肝臓切片のＨＥ（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ＆ Ｅｏｓｉｎ）染色による組織像の解析結果を示す図である。
図９は、Ａｐｇ７欠損マウスの血清中における肝炎マーカーの測定結果を示す図である。
図１０は、ＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／＋}：Ｍｘ１ＣｒｅヘテロマウスとＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}：Ｍｘ１Ｃｒｅホモマウスの生存率を示す図である。

以下、本発明を詳細に説明する。
１．発明の概要
ノックアウトマウスの中には、目的遺伝子が破壊されたことにより、致死性となる場合、あるいは全身性の重篤な障害が生じるために遺伝子産物の機能を十分に解析することができない場合がある。このような場合は、通常は遺伝子機能を保持させておいて、遺伝子解析を行ないたいときに遺伝子を不活性化又は機能喪失させることが好ましい。そこで、本発明においては、オートファジーの原因遺伝子に着目した。
特に本発明では、マウスの発生工学的手法により二種のＡｐｇ８及びＡｐｇ１２修飾系を不活性化してオートファジー経路を喪失させるために、Ａｐｇ８及びＡｐｇ１２の共通の活性化酵素（Ｅ１）であるＡｐｇ７をコードする遺伝子（「ＡＰＧ７遺伝子」という。）をＣｒｅリコンビナーゼに依存して不活性化できる条件的（コンディショナル）ノックアウト動物を作製した（図３）。この動物は、ＡＰＧ７遺伝子の活性中心のシステイン残基をコードしているエクソン１４を含む染色体遺伝子領域を、薬剤投与により自由に欠損させることができる動物である。
本発明において、「非ヒトノックアウト動物」とは、ヒト以外の動物であって、Ｃｒｅリコンビナーゼに依存して不活性化できる条件的動物、Ｃｒｅリコンビナーゼの作用によりノックアウトし得る動物、又は遺伝子が既に破壊された状態の動物のいずれをも意味する。ヒト以外の動物の種類は特に限定されるものではなく、たとえば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ヒツジ及びヤギなどが挙げられ、これらの動物からいずれかの動物を選択することができる。
以下、適宜マウスを例に説明する。
コンディショナルノックアウトマウスを作製するための手法として、例えば遺伝子ターゲティング法のためにバクテリオファージＰ１由来の組換えシステムであるＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムを使用することができる。Ｃｒｅは組換え酵素であり、ｌｏｘＰと呼ばれる３４塩基の配列を認識して、この部位で組換えを起こさせることが可能となる。従って、ターゲティングしたい遺伝子（ＡＰＧ７遺伝子）をｌｏｘＰ配列とｌｏｘＰ配列との間にはさみ、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子を特異的プロモーター下流に組み込むことにより、部位特異的及び時期特異的にＣｒｅが産生されてｌｏｘＰで挟んだ遺伝子を切り取る（すなわち、ＡＰＧ７遺伝子の機能を喪失させる）ことができる。
次に、この条件的ＡＰＧ７ＫＯマウス（親ＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}マウスと言う）と、インターフェロンγ依存的にＣｒｅリコンビナーゼを発現するＭｘ１Ｃｒｅトランスジェニックマウスとを交配して、ＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}とＣｒｅリコンビナーゼ併せ持ったマウス（子ＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}：Ｍｘ１マウスと言う）を作製する。このマウスにインターフェロンγ誘導剤であるｐｏｌｙｉｎｏｓｉｎｉｃ ａｃｉｄ−ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｙｌｉｃ ａｃｉｄ（ｐＩｐＣ）を腹腔内に注射すると、肝臓におけるＣｒｅリコンビナーゼが強く発現する。その結果、Ｃｒｅリコンビナーゼの作用によって、ＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}：Ｍｘ１マウスのｌｏｘＰで挟み込んだＡＰＧ７のエキソン１４が相同組換えによって喪失する。即ち、条件的に（Ｃｒｅリコンビナーゼ依存的に）目的の肝臓におけるオートファジー欠損マウスが作製できることになる。このようにしてマウス肝臓においてＡｐｇ７を欠損させると、即ち、肝オートファジーを遮断させると、驚いたことにマウスは重篤な急性肝炎状態に陥り、その多くが最終的に死に至ることが初めて明らかになったのである。そこで、このマウスは典型的な「急性肝炎モデルマウス」とみなすことができる。
２．遺伝子機能喪失
本発明においてノックアウトの対象となるオートファジーの原因遺伝子は公知であり、ＡＰＧ７遺伝子、ＡＰＧ８遺伝子、ＡＰＧ１２遺伝子などが挙げられる。Ａｐｇ８及びＡｐｇ１２の共通の活性化酵素はＡｐｇ７であるため、本発明においてはＡＰＧ７遺伝子が好ましい。これらの遺伝子は、例えばマウス等のゲノムライブラリーから得ることができる。例えば、大腸菌のＦプラスミドを使用した細菌人工染色体（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ（ＢＡＣ））ライブラリーから、ハイブリダイゼーション法により目的クローンを得ることができる。なお、オートファジーの原因遺伝子の塩基配列情報は、Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ等の遺伝子データベースにアクセスすることで、容易に知ることが可能である（例えばＡＰＧ７遺伝子についてはアクセッション番号：ＥＮＳＭＵＳＧ００００００３０３１４（Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））。
以下、ＡＰＧ７遺伝子を例に説明する。本発明のＡＰＧ７遺伝子の機能を喪失させたマウスは、公知の遺伝子組換え法（ジーンターゲッティング法）により作製することができる。ジーンターゲッティング法は、ターゲティングベクターを用いる周知技術であり、本分野の種々の実験書（例えば、村松正實、山本雅編集、『実験医学別冊 新訂 遺伝子工学ハンドブック 改訂第３版』（１９９９年、羊土社発行）、２３９頁〜２５６頁；相沢慎一、実験医学別冊「ジーンターゲティング−ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製」（１９９５）；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２，１９８９等）の教示に従って行うことができる。ここで「ターゲティングベクター」とは、相同的組換えによって目的の遺伝子を破壊するためのＤＮＡ分子のことであり、ＥＳ細胞等の分化全能性細胞の選択をより容易にするために、通常、選択マーカー遺伝子の塩基配列を含んでいる。ＡＰＧ７遺伝子のターゲティングベクターは、ＡＰＧ７遺伝子を破壊することにより当該遺伝子の全部又は一部の機能を低下又は喪失させるものである。「全部」とは、ＡＰＧ７遺伝子の一部または全部を欠損させることにより、ＡＰＧ７遺伝子の発現産物がＡｐｇ７タンパク質として機能が発現しないよう機能が完全に失われることを意味し、「一部」とは、ＡＰＧ７遺伝子の一部を欠損させることにより、遺伝子の機能が野生型と比較して低下している状態にあることを意味する。
「喪失」とは、Ａｐｇ７タンパク質の発現自体が行なわれないようにするか、あるいは発現してもタンパク質の活性が失われていることを意味する。
ターゲティングベクターは、相同組換えを起こさせた後の組換え体のスクリーニングが容易となるように構築することが好ましい。例えば、ポジティブ−ネガティブ選択をするために、ベクターに薬剤耐性遺伝子又は毒素遺伝子などの選択マーカーを連結することができる。
選択マーカー遺伝子は、ポジティブ選択用として例えばネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子などを使用することができ、ネガティブ選択用として例えばチミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリア毒素Ａ遺伝子などを使用することができる。
上記の方法により作製したターゲティングベクターを用いて、相同組換えを行う。「相同組換え」とは、ＡＰＧ７遺伝子と同一または類似の塩基配列を有する改変されたＡＰＧ７遺伝子を、ゲノム中のＡＰＧ７遺伝子のＤＮＡ領域に人工的に組換えさせることをいう。
目的とする遺伝子の相同組換えが起こる頻度は低いことが知られており、目的とする相同組換え体を得るためには、多数の組換え体をスクリーニングする必要がある。しかし、受精卵では多数の組換え体のスクリーニングを行うことが技術的に困難である。そこで、受精卵と同様に多分化能を有し、かつｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することができる細胞を使用することが好ましい。現在確立されている遺伝子ターゲティング法では、ＥＳ細胞を使用することが望ましい。ＥＳ細胞として、ＴＴ２細胞、ＡＢ−１細胞、Ｊ１細胞、Ｒ１細胞などを適宜選択して使用することができる。これらのいずれのＥＳ細胞株を用いるかは、実験の目的や方法により適宜選択して決定することができる。また、ブタについてはＥＧ（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｒｍ）細胞が確立している。
ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３．５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚（受精後２．５日目頃の８細胞期胚が好ましい）を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することもできる。
このように、相同組換えを起こさせるために、ＡＰＧ７遺伝子の機能を喪失させたターゲティングベクターをＥＳ細胞中に導入する。ターゲティングベクターをＥＳ細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、レトロウイルス感染法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などを使用することができる。効率、作業の容易性などを考慮して、エレクトロポレーション法を用いることが好ましい。そしてＥＳ細胞中の目的とするゲノムＤＮＡ配列を、ターゲティングベクターの相同組換えによって置換する。
３．相同組換え体のスクリーニング
次に、得られた組換えＥＳ細胞につき、相同組換えが起こっているかどうかのスクリーニングを行う。相同組換え体をスクリーニングするために、ポジティブ−ネガティブ選別法を採用する。即ち、得られた組換えＥＳ細胞を、マイトマイシンＣ−処理したネオマイシン耐性などの薬剤耐性因子を初代培養細胞からなるフィーダー層上に播いた後、選択マーカーを用いて選択培養を行う。ベクターの遺伝子が組み込まれなかった細胞は、薬剤を含む培養液で培養したときに、耐性遺伝子を含まないために細胞は死ぬ。組み込みがランダムに起こった細胞では、ネガティブ選別用遺伝子が発現するために、やはり細胞は死ぬ。その結果、相同組換えを起こした細胞のみが生き残り、選別される。選択培養６〜８日目に生存するコロニーを耐性クローンとして採取する。
耐性クローンを採取し、さらに増殖させる。その後、更にスクリーニングを確実にする為にＰＣＲ法、サザンブロット法等により、目的とするＡＰＧ７遺伝子がターゲティングされているか否かを確認する。
ＰＣＲは、ターゲティングにより目的とするゲノムＤＮＡ領域を外来性の遺伝子により置換することができたか否かを効率的に確認するために行なう。従って、ＰＣＲプライマーは、例えばターゲティングベクターの外側のゲノムＤＮＡ領域上、及びターゲティングベクターの配列のうち薬剤耐性遺伝子上から設計することができる。
サザンブロット解析は、以下の通り行なう。すなわち、ターゲティングベクターに含まれないゲノム領域を認識する１又は２種類のプローブを設計し、ＥＳクローンから常法にしたがってＤＮＡを抽出する。ＡＰＧ７ゲノムクローンを制限酵素（例えばＥｃｏＲＶ）で処理することにより得られるゲノムＤＮＡ断片と、上記プローブとのハイブリダイゼーションを行なうことにより、ＡＰＧ７遺伝子が破壊されたか否かを確認することができる。
４．ノックアウト動物の作製
ノックアウト動物の作製は標準的な方法で行うことができる。本発明においてノックアウトするために使用される実験動物の種類は、特に限定されるものではない。例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等の実験動物を使用することができる。本発明においては、取り扱いが容易で繁殖もしやすいマウスが好ましい。以下、適宜マウスを例に説明する。
相同組換えの結果得られた組換えＥＳ細胞を、８細胞期又は胚盤胞の胚内に移植する。このＥＳ細胞移植胚を偽妊娠仮親の子宮内に移植して出産させることによりキメラ動物を作製することができる。
ＥＳ細胞を胚内に移植する方法として、マイクロインジェクション法、凝集法などの公知手法を用いることができる。マウスの場合、まず、ホルモン剤により過排卵処理を施した雌マウスを、雄マウスと交配させる。その後、８細胞期胚を用いる場合には受精から２．５日目に、胚盤胞を用いる場合には受精から３．５日目に、それぞれ卵管または子宮から初期発生胚を回収する。回収した胚に、相同組換えを行ったＥＳ細胞を注入し、キメラ胚を作製する。
一方、仮親にするための偽妊娠雌マウスは、正常性周期の雌マウスを、精管結紮などにより去勢した雄マウスと交配することにより得ることができる。作出した偽妊娠マウスに対して、上述の方法により作製したキメラ胚を子宮内移植し、その後出産させることによりキメラ動物を作製することができる。
このようなキメラマウスの中から、ＥＳ細胞移植胚由来の雄マウスを選択する。選択したＥＳ細胞移植胚由来のオスのキメラマウスが成熟した後、このマウスを純系マウス系統のメスマウスと交配させる。そして、誕生した子マウスに、ＥＳ細胞に由来するマウス（ＥＳ細胞に組み込まれたゲノムを有していたマウス）の被毛色が現れることにより、ＥＳ細胞がキメラマウスの生殖系列へ導入されたことを確認することができる。胚内に移植された組換えＥＳ細胞が生殖系列に導入されたＡＰＧ７遺伝子欠損ヘテロ接合体マウスを繁殖し、ＡＰＧ７遺伝子欠損ヘテロ接合体マウスどうしを交配させると、目的とする遺伝子欠損ホモ接合体マウスとなる（このマウスを「ＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}マウス」という）。
なお、ノックアウトマウスが得られたことの確認については、組織から染色体ＤＮＡを抽出しサザンブロット法で行う。また、外見上の異常の有無（例えば、被毛色の違いや骨変形の有無）及び解剖を行った際の諸組織−臓器の異常を観察することもできる。さらに、組織からＲＮＡを抽出し、ノーザンブロット解析により遺伝子の発現パターンを解析することもできる。Ａｐｇ７タンパク質に対する抗体を用いてウエスタンブロッティングを行なってもよい。さらに、必要に応じて血液を採取し、血液検査や血清生化学検査を実施することも可能である。
以上より、Ｃｒｅリコンビナーゼ依存的にＡＰＧ７遺伝子の活性化システインを含むエクソンを自在に欠失できるＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}マウス、即ち、ＡＰＧ７コンディショナルノックアウトマウスが作製される。このマウスは本発明では以下に述べる疾患モデルマウスを作製するための親マウスに相当する。また細胞レベルでは、Ｃｒｅを組み込んだアデノウイルスを組織培養液に導入することによって、全ての細胞でオートファジー経路を欠失させることもできる。
５．疾患モデルマウス
上記の本発明のノックアウトマウスと、各組織又は臓器においてＣｒｅを発現するトランスジェニックマウスとを交配させると、これにより生まれたマウスは、当該組織又は臓器特異的にＡＰＧ７遺伝子が欠損することとなる。その結果、当該組織又は臓器に対応した疾患モデルマウスをつくることができる。例えば、肝臓で発現するＡＰＧ７遺伝子の機能を破壊すると、肝臓におけるオートファジー欠損マウスが作製される。その結果、マウスは重篤な急性肝炎を発症する。
このように、Ｆｌｏｘを相同組換えで喪失させると、Ａｐｇ７の活性中心を欠いた不活性型酵素が発現して、Ａｐｇ７機能が不能になり、オートファジー経路を完全に喪失させることができる。即ち、条件的に（Ｃｒｅリコンビナーゼ依存的に）目的の肝臓におけるオートファジー欠損マウスが作製できることになる。
本発明の疾患モデルマウスは以下の通り利用することができる。
（１）本発明の親マウスであるＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}マウスと、肝臓においてＣｒｅを発現するトランスジェニックマウスとを交配させることによって作製した子マウスは、上記の通り、肝臓においてオートファジー・リソソーム経路が喪失しているマウスとなり、その結果、マウスは重篤な急性肝炎を発症する。
このマウスはα１アンチトリプシン欠損病（変異α１アンチトリプシンの肝細胞内蓄積）などの肝疾患の発症機構を解析するためのモデル動物として利用することが可能である。さらに、これらの疾患の発症を阻止又は予防するための新薬開発に利用することができる。
（２）本発明の親マウスであるＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}マウスと、脳においてＣｒｅを発現するトランスジェニックマウスとを交配させることによって、子マウスは、脳においてオートファジー・リソソーム経路が喪失しているマウスとなる。このマウスはアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、プリオン病など多数の神経変性疾患の発症機構を解析するためのモデル動物として利用することが可能である。さらに、これらの疾患の発症を阻止又は予防するための新薬開発に利用することができる。
（３）また、本発明の親マウスであるＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}マウスと、筋肉においてＣｒｅを発現するトランスジェニックマウスとを交配させることによって作製した子マウスは、筋崩壊を伴うミオパチー（縁取り空砲型遠位性ミオパチー、封入体性筋症、クロロキン筋肉症、ＡＣＴＨ誘導性骨格筋萎縮症等）など多数の筋タンパク質異常疾患の発症機構を解析するためのモデル動物として利用することが可能である。さらに、これらの疾患の発症を阻止又は予防するための新薬開発に利用することができる。
（４）本発明の親マウスであるＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}マウスと、胸腺においてＣｒｅを発現するトランスジェニックマウスとを交配させることによって作製した子マウスは、適応免疫におけるＴ細胞やＢ細胞の発生・分化を解析するためのモデル動物として、あるいは、抗原提示の異常に基づいた免疫疾患の発症機構を解析するためのモデル動物として利用することが可能である。さらに、これらの疾患の発症を阻止又は予防するための新薬開発に利用することができる。
（５）本発明の親マウスであるＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}マウスは、特定臓器の癌に関わる遺伝子異常のモデルマウスと交配することによって発癌の発症機構を解析するためのモデル動物として利用することが可能である。さらに、これらの疾患の発症を阻止又は予防するための新薬開発に利用することができる。
本発明においては、疾患モデルの対象となる臓器又は組織は上記したものに限定されるものではなく、上記以外にも、腎臓、腸、骨、上皮などを例示することができ、１つの臓器又は組織のみならず、複数の臓器又は組織において疾患を有する疾患併発モデルであってもよい。
６．薬剤候補物質のスクリーニング方法
本発明は、上記の通り作製された疾患モデル動物またはその一部に疾患治療または予防のための薬物の候補物質を投与することを特徴とする、疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法を提供する。
具体的には、本発明のモデル動物またはその一部に候補物質を投与し、標的とする疾患と関連する指標値を測定し、対照と比較する。この比較結果に基づき、候補物質のその疾患に対する効果を評価する。例えば、肝炎を発症しているノックアウトマウスに薬物候補物質を投与した場合に、肝炎の症状が軽減または消滅するか否かを確認することで、当該候補物質が肝炎治療の治療、予防、改善効果を有するかどうかを試験することができる。
候補物質としては、例えば、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の組織抽出物、細胞培養上清などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。これら候補物質は塩を形成していてもよく、候補物質の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
候補物質の投与方法は特に限定されるものではなく、例えば経口投与、非経口投与のいずれも可能である。非経口投与の場合は、吸引による経肺投与及び経鼻投与、塗布による経皮投与、注射（静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等）などが用いられる。いずれも、動物の症状、候補物質の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、候補物質の投与量は、投与方法、候補物質の性質などにあわせて適宜選択することができる。
例えば、肝炎の予防・治療・改善薬をスクリーニングする場合、本発明の動物等に薬剤投与を行い、処置前または処置後に候補物質を投与し、該動物の肝機能および体重変化などを経時的に測定することによりスクリーニングすることができる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕ＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}ノックアウトマウスの作製
本実施例では、Ｆｌｏｘ（ｆｌａｎｋｉｎｇ−ｌｏｘ）でＡｐｇ７の活性中心のシステイン残基をコードしているエクソン１４（Ａｐｇ８及びＡｐｇ１２の両者とチオエステル結合するシステイン残基を含む１１６ｂｐ、即ち３８個のアミノ酸をコードした翻訳領域）を含む染色体遺伝子断片を条件的に欠損させることができるマウスを作製した。
まず、完全長ＡＰＧ７染色体遺伝子を含むＢＡＣクローンは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ＢＡＣライブラリーよりハイブリダイゼーション法により単離した（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）。ＡＰＧ７ターゲティングベクターは、以下の通り構築した（図３Ａ）。
すなわち、ＡＰＧ７遺伝子イントロン１３内（エクソン１３と１４との間）にｌｏｘＰ配列を挿入し、エクソン１４にＡＰＧ７ ｃＤＮＡフラグメント（１７８６−２０９７塩基対）、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル配列を連結し、さらにネオマイシンカセット（ｍｃ１−ｎｅｏ−ｐＡ）を連結した。そして、イントロン１４内（エクソン１４と１５との間）にｌｏｘＰ配列を挿入し、さらに、非相同組換え体をｎｅｇａｔｉｖｅ選別するためのジフテリアトキシン−Ａ遺伝子（ＤＴ−Ａ）を連結させた（図３Ａ，第２段目の構築図）。
次に、このターゲティングベクターをマウスＴＴ２ ＥＳ細胞にエレクトロポレーション法により導入し、Ｇ４１８を用い耐性クローンを選択し、ＰＣＲ法、サザンブロット法により相同組換え体を単離した。
ＰＣＲは、以下の反応液組成を用いて、９８℃で２０秒、６８℃で５分の反応を１サイクルとして３０サイクル反応させた。
反応液組成：
ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）０．２μｌ
１０ｘＬＡ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（ｐｌｕｓ ＭｇＣｌ_２）２μｌ
ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（ｅａｃｈ ２．５ｍＭ）３．２μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ（各２０μＭ）各０．２μｌ
Ｄ_２Ｗ １４μｌ
プライマーの配列：

また、サザンブロッティングは、図３Ａ右上に「Ｐｒｏｂｅ」と示した領域のｃＤＮＡ配列をプローブ（図３Ａに示したＡＰＧ７遺伝子イントロン内（エクソン１４と１５の間）のＰｓｔＩ−ＳａｌＩフラグメント）として用い、常法により行なった。
上記の通り単離した相同組換え体を、ＩＣＲマウスの８細胞胚にマイクロインジェクションし、偽妊娠マウスの子宮に移植した。生じたキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配させ、ＥＳ細胞由来のＦ１マウス（ヘテロ接合体）を獲得した。このＦ１マウス同士を交配し、ＡＰＧ７遺伝子がノックアウトされたＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}マウスを作製した。バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅリコンビナーゼを発現させると、ｌｏｘＰ配列を認識して組換えを起こし、実際にはエクソン１４のみが欠損した不活性型のＡｐｇ７タンパク質が合成されるようになる。なお、Ｃｒｅの発現は、例えば種々の臓器でＣｒｅを発現しているトランスジェニックマウスと交配させて作製した子マウスの遺伝子が破壊されたか否かにより確認することができる。
〔実施例２〕 マウスの解析
マウスの尾より抽出したＤＮＡを用いたサザンブロット法による解析から、作製したヘテロ接合体では、野生型マウスのアレルとＦｌｏｘアレルが確認された（図３Ｂ）。ヘテロ接合体同士の交配により作製したＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}マウスでは、Ｆｌｏｘアレルのみが存在し、Ａｐｇ７をコードした染色体遺伝子の組換えが確認された（図３Ｂ）。
図３Ｂは、作製したＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}マウス尾から抽出したＤＮＡを用いたサザンブロット解析の結果である。
左レーンは、＋／＋野生型マウスを示す。野生型マウスのアレル（図３Ａに示した１７．５ｋｂのＤＮＡ断片）のみが検出された。
中央レーンはＦ／＋ヘテロ接合体を示す。野生型マウスのアレル（図３Ａに示した１７．５ｋｂのＤＮＡ断片）とＦｌｏｘアレル（図３Ａに示した７．５ｋｂのＤＮＡ断片）が検出された。
右レーンは、Ｆ／Ｆホモ接合体を示す。Ｆｌｏｘアレル（図３Ａに示した７．５ｋｂのＤＮＡ断片）のみが検出された。
さらに、野生型マウス（＋／＋）、ヘテロ接合体（Ｆ／＋）、ホモ接合体（Ｆ／Ｆ：ＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}マウス）の肝臓タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開したのち、Ａｐｇ７抗体を用いてＷｅｓｔｅｒｎブロット解析を行った。Ａｐｇ７抗体は、ウサギに免疫して作製した。
図３Ｃは、作製したＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}マウスの肝臓及びＡｐｇ７抗体を用いて、Ａｐｇ７のＷｅｓｔｅｒｎブロット解析を行なった結果を示す図である。
図３Ｃに示すように、作製したＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}マウスにおいてもＡｐｇ７タンパク質には有意な変動がなく、染色体へのＦｌｏｘの導入にも関わらず健全なＡｐｇ７タンパク質を合成していることが判明した。
〔実施例３〕 ＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}：Ｍｘ１Ｃｒｅマウスの作製とインターフェロンγ刺激によるＡＰＧ７遺伝子の欠損（Ａｐｇ機能喪失マウスの作製）
本発明のノックアウトマウスは、Ｃｒｅリコンビナーゼの導入によってＦｌｏｘを相同組換えで喪失させると、Ａｐｇ７の活性中心を欠いた不活性型酵素が発現して、Ａｐｇ７機能が不能になり、オートファジー経路を完全に喪失させることができる。このことを確認するため、実施例１により作製したマウスにＣｒｅを発現させて、ＡＰＧ７遺伝子の機能を喪失させたマウスを作製した。
インターフェロンγ刺激によりＣｒｅリコンビナーゼを発現するＭｘ１Ｃｒｅトランスジェニックマウス（入手先：ジャクソン研究所）とＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}マウスを交配させ、ＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}：Ｍｘ１マウスを作製した。このマウスにインターフェロンγ誘導剤であるｐｏｌｙｉｎｏｓｉｎｉｃ ａｃｉｄ−ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｙｌｉｃ ａｃｉｄ（ｐＩｐＣ）を４８時間間隔にて３回腹空内に注射することにより、刺激依存性に肝臓のＡＰＧ７遺伝子を欠失させた。
結果を以下に示す。
（１）肝細胞においてＡＰＧ７遺伝子は完全に欠損し、Ａｐｇ７蛋白質は最後のｐＩｐＣ注射後約７日で検出されなかった。また、Ａｐｇ１２とＬＣ３の翻訳後修飾は認められずＡＰＧ修飾経路は遮断されていることが確認された（図４）。
肝臓におけるＡＰＧ７アリルをＰＣＲ法にて検出したところ、変異アレルのみが観察され、ＡＰＧ７遺伝子のエキソン１４の欠損が観察された（図４上：右パネル）。加えて、その肝臓では、Ａｐｇ７蛋白質がほぼ完全に欠失していた。一方、ｐＩｐＣを注入したＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／＋}：Ｍｘ１ヘテロマウスでは、Ａｐｇ７は全て細胞質画分に検出された（図４下パネル）。この時、このマウスにおいてＡｐｇ１２−Ａｐｇ５結合体は、細胞質画分と膜画分の両方に観察されたのに対し、ＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}：Ｍｘ１ホモマウスでは観察されず、非結合体のＡｐｇ５が細胞質画分と膜画分に観察された。なお、Ａｐｇ１２は、Ａｐｇ７で活性化されるモディファイヤー分子であり、Ａｐｇ５はその標的タンパク質である。もう一つのモディファイヤー分子であるＬＣ３（酵母Ａｐｇ８のマウスホモローグ）も、ＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／＋}：Ｍｘ１ヘテロマウスでは最終的な翻訳後修飾型であるＬＣ３−ＩＩが膜画分に観察されたのに対し、ＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}：Ｍｘ１ホモマウスではＬＣ３−ＩＩが全く検出されず、第一修飾型であるＬＣ３−Ｉのみが細胞質画分と膜画分に観察された（図４下パネル）。これらは、マウスを１日絶食させた場合（Ｆａｓｔｉｎｇ）でも、正常に飼育した場合（Ｆｅｄ）にも変わらなかった。この結果、ＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}：Ｍｘ１マウスの肝臓では、ｐＩｐＣ処理により二種のＡＰＧ修飾システム（Ａｐｇ８−ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ経路とＡｐｇ１２−ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ経路）がほぼ完璧に喪失することが判明した。
図４において、上左パネルは、野性型ＡＰＧ７遺伝子、ｌｏｘＰ導入ＡＰＧ７遺伝子及びＡＰＧ７（エキソン１４）欠損遺伝子アレルの模式図である。上右パネルは、インターフェロンγ誘導剤であるｐｏｌｙｉｎｏｓｉｎｉｃ ａｃｉｄ−ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｙｌｉｃ ａｃｉｄ（ｐＩｐＣ）を４８時間間隔にて３回腹空内に注射したマウス肝臓からＤＮＡを抽出し、上左パネルにおいて矢印で示した領域から設計したプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅したＡＰＧ７遺伝子ＤＮＡ断片である。インターフェロンγ刺激によりＭｘ１Ｃｒｅが遺伝子導入されたマウスでは、Ｃｒｅリコンビナーゼが発現し、ｌｏｘＰで挟んだ挿入領域が相同組換えをおこしてＡＰＧ７遺伝子のエキソン１４が欠損する。Ｆ／Ｆ（ＡＰＧ７^Ｆｌｏｘホモ接合体）、Ｆ／＋：Ｍｘ１（Ｍｘ１Ｃｒｅが遺伝子導入されたＡＰＧ７^Ｆｌｏｘのヘテロ接合体）、Ｆ／Ｆ：Ｍｘ１（Ｍｘ１Ｃｒｅが遺伝子導入されたＡＰＧ７^Ｆｌｏｘのホモ接合体）。下パネルは、正常飼育マウス（左パネル：Ｆｅｄ）と１日絶食マウス（右パネル：Ｆａｓｔｉｎｇ）からの肝臓のウエスタンブロット解析結果である。肝臓の細胞質画分（Ｃ）と膜画分（Ｍ）を調整してＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開後、Ａｐｇ７抗体、Ａｐｇ５抗体、ＬＣ３（酵母Ａｐｇ８のマウスホモローグ）抗体でウエスタンブロットした。ＬＣ３−Ｉは第一修飾型、ＬＣ３−ＩＩは最終的な翻訳後修飾型を示す。
以上より、Ｃｒｅリコンビナーゼ依存的にＡＰＧ７遺伝子の活性化システインを含むエクソンを自在に欠失できるＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}マウス、即ち、ＡＰＧ７コンディショナルノックアウトマウスが作製できた。また細胞レベルでは、Ｃｒｅを組み込んだアデノウイルスを組織培養液に導入することによって、全ての細胞でオートファジー経路を欠失させることもできる。
（２）ＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／＋}：Ｍｘ１ＣｒｅヘテロマウスにｐＩｐＣを処置したときの肝臓の微細構造を電子顕微鏡で観察した結果を図５に示す。
図５において、パネルＡは、正常飼育マウス肝臓、パネルＢは、１日絶食したときのマウスの肝臓である。多数のオートファゴソームの出現が観察される。パネルＣ、Ｄ、Ｅは、Ｂで観察された肝切片におけるオートファゴソーム構造を拡大したものである（Ｃ、Ｄ、Ｅは典型的な構造）。
肝臓では、１日絶食させると細胞質やミトコンドリアを取り囲んだオートファゴゾーム（図５パネルＣ及びＤ）、あるいはオートファゴゾーム膜を形成中の構造（図５パネルＥ）が観察された。
一方、ｐＩｐＣ処置したＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}：Ｍｘ１Ｃｒｅホモマウスを１日絶食させた後に形態観察したマウスの肝臓では、オートファゴソームが全く観察されなかった（図６）。図６Ａ−Ｅは、いずれも１日絶食したマウスの肝臓の微細構造である。そして、この肝臓では、小胞体からなる異常な構造体が観察された（図６Ａ−Ｃ）。飢餓にも関わらず、肝臓におけるオートファゴソームの出現は、全く観察されなかった。また、小さなオートファゴゾーム様構造（図６Ｄ，Ｅ）も一部観察されるが、その数は少なく、飢餓に応答した誘導も確認されなかった。
（３）驚いたことに、ｐＩｐＣ処置したＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}：Ｍｘ１Ｃｒｅホモマウスの肝臓に顕著な肥大が観察された（図７Ａ）。この結果は、肝質重量（図７Ｂ）および肝タンパク質量（図７Ｃ）の測定でも確認された。この現象は、正常飼育（Ｆｅｄ）マウスよりも１日絶食したマウス（Ｆａｓｔｉｎｇ）でより顕著に観察された。図７において、ＡはｐＩｐＣ処置したＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／＋}：Ｍｘ１Ｃｒｅヘテロマウス及びＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}：Ｍｘ１Ｃｒｅホモマウス肝臓の形態、Ｂは肝質重量、並びにＣは肝タンパク質量である。肝質重量及びは肝タンパク質量は、正常飼育及び１日絶食マウスで比較した。肝質重量（Ｂ）は体重当たりの数値で示した。
また、ＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／＋}：Ｍｘ１ＣｒｅヘテロマウスとＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}：Ｍｘ１ＣｒｅホモマウスをｐＩｐＣで処置した後に肝臓の切片を作製し、ＨＥ（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ＆ Ｅｏｓｉｎ）で染色した。
その結果、Ａｐｇ７欠損マウスでは、肝細胞が極度に膨潤していることが観察された（図８）。
図８において、左側２列のパネルは正常飼育マウス、右側２列のパネルは１日絶食したマウスである。下パネルは、上パネルを拡大した微細組織像である。
上記膨潤傾向は、絶食飢餓により激しく亢進していたが、正常飼料で飼育したマウスでも有意に観察された。このことは、オートファジー・リソソーム系によるタンパク質分解が、肝臓において恒常的に重要な役割を果たしていることを示している。
（４）そこで、ＧＰＴやＧＯＴなどの典型的な肝炎マーカーを、ｐＩｐＣ処置したＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／＋}：Ｍｘ１Ｃｒｅヘテロマウス及びＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}：Ｍｘ１Ｃｒｅホモマウス（正常飼料で飼育）の血清で観察した。
その結果、Ａｐｇ７欠損マウスにおいて顕著な増大が観察された。即ち、Ａｐｇ７欠損マウスは、重篤な急性の肝炎を発症していることが判明した（図９）。各パネルに示すマーカーは、ＡＳＴ／ＧＯＴ（Ａ）、ＡＬＴ／ＧＰＴ（Ｂ）、ＡＬＰ（Ｃ）、血清アルブミン（Ｄ）である。
他方、慢性肝疾患のマーカーであるアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）や血清アルブミン量を血清中で測定した結果、これらの値は大きく変動しなかった。そこで、この急性肝炎の発症が、マウスの生存に影響するか否かを調べた。
ｐＩｐＣで処置したＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／＋}：Ｍｘ１ＣｒｅヘテロマウスとＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}：Ｍｘ１Ｃｒｅホモマウスの生存日数を測定した。マウスは、各々８匹を使用し、正常飼料で飼育した。
その結果、ＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}：Ｍｘ１Ｃｒｅホモマウスにおいて、ｐＩｐＣ処置後２０日頃から死亡しはじめ、３０日経過後では、半数以上のマウスが死亡した（図１０、「□」）。しかし、ＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／＋}：Ｍｘ１Ｃｒｅヘテロマウスは、ｐＩｐＣの処置にも関わらず全く致死には至らなかった（図１０、「○」）。
本発明において、Ａｐｇ７の欠損を誘導することによって、即ちオートファジー依存的なタンパク質分解系の機能不全によって急性肝炎が誘導できたことは、意外であり、驚くべき発見であった。このことは、これまで謎とされてきた内因性ファクターによって誘起される肝炎の発症機構解明に、本発明において明らかになったオートファジー経路が関与する可能性が示されたことを意味する。
産業上利用の可能性
本発明により、ノックアウトマウス及び肝炎などの疾患モデル動物が提供される。本発明において作製したＡＰＧ７^{Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ}マウスは、全ての標的器官においてオートファジー経路を欠失させることができる普遍的な親マウスであり、オートファジー・リソソーム系の生理的解析及び病理的解析をするためのモデル動物として有用である。そして、例えばＣｒｅを組織特異的に発現するトランスジェニックマウスと交配させることにより、標的器官において自在にオートファジーの誘導を完全に阻止できるマウスを作製することが可能である。また、この新しい急性“肝炎モデルマウス”を利用することによって、肝炎発症を予防する新薬開発をすることができる。また、Ａｐｇ７の欠損を条件的に誘発することによって、肝硬変や肝癌の発症機構に関係した新しい分子機構を解析することもできる。更に、このマウスを他の病態マウスと交配させることによって作製したマウスを利用し、多因子疾患の病態解明とその予防、阻止、治療に貢献する薬剤の開発に利用することができる。

Claims (9)

1. Creリコンビナーゼ依存的にAPG7遺伝子の全部又は一部の機能が失われたノックアウトマウス、ラット及びモルモットから選ばれる、肝炎又は肝癌の疾患モデル動物。
2. APG7遺伝子が組織又は臓器特異的なものである請求項１記載の動物。
3. 動物がマウスである請求項１又は２記載の動物。
4. Creリコンビナーゼ依存的にマウス、ラット又はモルモットのAPG7遺伝子の全部又は一部の機能を失わせることを特徴とする、肝炎又は肝癌の疾患モデル動物の製造方法。
5. APG7遺伝子が組織又は臓器特異的なものである請求項４記載の方法。
6. 動物がマウスである請求項４又は５記載の方法。
7. Creリコンビナーゼ依存的にAPG7遺伝子の全部又は一部の機能が失われたノックアウトマウス、ラット及びモルモットから選ばれる肝炎又は肝癌の疾患モデル動物に、候補物質を投与することを特徴とする、肝炎又は肝癌の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法。
8. APG7遺伝子が組織又は臓器特異的なものである請求項７記載の方法。
9. 動物がマウスである請求項７又は８記載の方法。

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