WO2004006662A1

WO2004006662A1 - 異種ＰＰＡＲα遺伝子導入疾患モデル動物およびその用途

Info

Publication number: WO2004006662A1
Application number: PCT/JP2003/008921
Authority: WO
Inventors: Yuichiro Amano; Yasuo Sugiyama; Mayumi Nishida; Shigehisa Taketomi
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Company Limited
Priority date: 2002-07-15
Filing date: 2003-07-14
Publication date: 2004-01-22
Also published as: EP1535512A1; EP1535512A4; AU2003252504A1; US20060242716A1

Abstract

本発明は、異種ＰＰＡＲαをコードするＤＮＡを発現可能な状態で安定に保持し、且つＰＰＡＲαの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変、あるいはＰＰＲＥを有するプロモーターの制御下にある外来ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物またはその生体の一部、並びに該動物を用いた異種ＰＰＡＲα作動薬／拮抗薬のスクリーニング方法を提供する。

Description

明細書異種 P PARひ遺伝子導入疾患モデル動物およびその用途技術分野

本発明は異種 P P A R a遺伝子導入非ヒト哺乳動物に関する。より詳細には、本発明は、異種 P PARひ遺伝子が導入され、且つ P PAR αの活性調節が関与する疾患の実験的動物モデルとして使,用し得る表現型を示す遺伝子改変を有する非ヒト哺乳動物、およびそれを用いた異種 P PAR aの由来する動物における P P AR aの活性調節が関与する各種疾患の予防 ·治療薬のスクリーニング方法、該方法により得られうる該疾患の予防 ·治療薬に関する。背景技術

ペルォキシソ一ム増殖剤活性化レセプ夕一 (Peroxisome Prol i ferator-

Activated Receptor；以下、 P PARと略記する）ひは肝臓、心臓、腎臓等で高発現する核内レセプ夕一型転写因子であり、脂肪酸 iS酸化系酵素群ゃァポリポ蛋白などの種々の脂質代謝関連蛋白質をコードする遺伝子の発現を調節することにより、脂質のホメォスタシスにおいて中心的な役割を担っている。 P PAR αはレチノイド Xレセプ夕一（RXR) とへテロダイマーを形成し、リガンド存在下に標的遺伝子の 5' 上流に存在するペルォキシソーム増殖剤応答エレメント（PPRE) 配列に結合して遺伝子の転写を促進する。一方で、 PPARひによってリガンド存在下に発現が抑制される遺伝子も知られているが、これは他の転写因子との標的 DN Α配列への結合やコアクチベータ—をめぐる競合によるものと考えられている。

P P A Rひは長鎖不飽和脂肪酸やフイブレート系薬剤などの脂溶性分子によって活性化される。 P PAR «作動薬は肝臓において脂肪酸酸化活性を高める一方で、アポリポ蛋白 C- III (apoC- III；中性脂肪（TG) との主要な血漿リポ蛋白構成成分）の発現を抑制するため、血中 TG濃度を低下させる効果がある。また、 '高比重リポ蛋白—コレステロール（HDL— C) の主要構成成分であるアポリポ蛋白 A- 1 (apoA-I) およびアポリポ蛋白 A-II (apoA-II) の発現を促進するため、血中 HDL— C濃度を増加させる効果がある。したがって、？？八尺0!作動薬は高丁0血症ゃ低？101^—じ血症を含む高脂血症、および動脈硬化の予防 ·治療薬として実際に用いられている (例えば、ジヤン一シャルル ·フルシャール (Jean-Charles Fruchart) ら，カレント ·ァテロスクレローシス · リポーッ（Current Atherosclerosis Reports) , (米国）， 2001年，第 3巻（第 1号）， p. 83- 92を参照）。 P P A R α作動薬はまた、虚血に対して心臓保護効果を示すことも知られている（例えば、アントニア '夕ベルネ口（Antonia Tabernero) ら，ビ一ェムシー ·ファ一マコロジー (BMC Pharmacology). , (英国）， 2002年 4月 9日 (オンライン公開），バイオメッド 'セントラル（BioMed Central) ，インターネッ <http：〃 www. biomedcentral.com/147卜 2210/2/10>を参照）。新規 P PARひ作動薬の開発は、通常、例えばヒト P PAR αを用いた結合アツセィゃヒト細胞株における PPRE制御下にある遺伝子（例： apoA - 1、 PPRE-レポ一夕ーキメラ遺伝子等）の発現ァッセィなどのィンピトロでのスクリーニングを行ない、高活性が得られた化合物についてマウスゃラットなどの実験動物に投与してインビポでの効果を評価するといつた順序で進 ' められる。しかしながら、ヒトと他の哺乳動物との間には P PARひの構造に差異があるため（例えば、ヒトとマウスの間のアミノ酸同一性は 92%) 、薬物によってはヒト P PAR に対してしかァゴニスト活性を示さない場合もあり得る。そのような薬物は実験動物の内因性 P PAR αに対しては活性がないので、現存の動物モデルでは評価することが不可能であった。

したがって、本発明の目的は、ヒト PPAR に対してのみァゴニスト活性を示す P PAR α作動薬のィンビポでの効果を有効に評価することができる新規動物モデルを提供することであり、当該動物モデルを用いた、高脂血症、混合型脂質異常症、動脈硬化、高血圧症、血栓症、虚血性心疾患、虚血性脳疾患などの各種疾患の予防 ·治療薬のスクリ一ニング方法を提供することである。発明の開示

本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ヒト PP AR 0：をコードする DNAを発現可能な状態で安定に保持するトランスジェニックマウスを作製し、これにヒト P PAR aに対して活性を有するが、マウス P PAR aに対しては活性を有しない化合物を投与したところ、当該マウスはペルォキシソーム増殖や脂質代謝関連遺伝子の発現増強を含む、ペルォキシゾーム増殖剤により誘導される種々の特徴的応答を示すことを見出した。さらに、得られたヒト P PAR a発現トランスジエニックマウスと、高脂血症や動脈硬化をはじめとする P PARひの活性調節が関与し得る各種疾患の実験的動物モデルとを交配することにより、ヒ卜 PPARaを発現する, 当該疾患モデル動物を作製することに成功した。

本発明者らは、これらの知見を基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、

[ 1 ] 異種 P PAR aをコ一ドする DNAを発現可能な状態で安定に保持し、且つ 1以上の他の遺伝子改変を有する非ヒト哺乳動物またはその生体の一部、

[ 2 ] 他の遺伝子改変の少なくとも 1つが、 P P A R の活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせるものである、上記 [1] 記載の動物またはその生体の一部、

[3] 他の遺伝子改変の少なくとも 1つが、 PPREを有するプロモーターの制御下にある外来 DNAの導入である、上記 [1] 記載の動物またはその生体の一部、

[4] 異種 PPAR aがヒト由来 P PAR aである上記 [1] 記載の動物またはその生体の一部、

[5] 異種 P PAR が配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する上記 [1] 記載の動物またはその生体の一部、

[6] 非ヒト哺乳動物が、ゥサギ、ィヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウスまたはラットである上記 [1] 記載の動物またはその生体の一部、

[7] 非ヒト哺乳動物がマウスである上記 [1] 記載の動物またはその生体の一部、

[8] 内因性 P P AR αを欠損するかわりに異種 P P AR を発現させた動物である上記 [1] 記載の動物またはその生体の一部、

[9] 内因性 P PAR αを欠損する動物と、異種 P PAR αを発現する、該動物と同種の動物とを交配することにより得られうる、上記 [8] 記載の動物またはその生体の一部、

[10] 内因性 PPARaがマウス由来 PPARo!であり、異種 PPARa がヒト由来 P PAR である上記 [8] 記載の動物またはその生体の一部、 [1 1] P PAR αの活性調節が関与する疾患が、高脂血症、高トリグリセリド血症、混合型脂質異常症、低 HDL血症、動脈硬化症、末梢動脈閉塞症、間欠性跛行、壊疽、高血圧症、血栓症、虚血性心疾患、急性心筋梗塞、心不全、鬱血性心不全、不安定狭心症、 PTCA後の再狭窄、ステント留置後の再狭窄、高フイブリノ一ゲン血症、心筋症、脳出血、一過性脳虚血発作、脑梗塞、脳卒中、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎動脈硬化症、皮膚炎、免疫不全、低血糖、低ケトン血症、脂肪肝、糖尿病、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、肥満、アルツハイマー病、貧血性低酸素症、性腺障害、肝臓癌、乳癌および子宮内膜炎からなる群より選択される 1もしくは 2以上の疾患である上記 [2] 記載の動物またはその生体の一部、

[12] 異種 P PAR αが、肝臓、心臓、腎臓、副腎、血管、消化管および脳からなる群より選択される 1もしくは 2以上の部位で特異的に発現することを特徴とする上記 [1] 記載の動物またはその生体の一部、

[13] 異種 PPARaが、肝臓で特異的に発現することを特徴とする上記 [1] 記載の動物またはその生体の一部、

[14] 上記 [1] 記載の動物またはその生体の一部に被験物質を適用し、該物質の異種 P PAR に対するァゴニス卜またはアンタゴニスト活性を検定することを特徴とする異種 P P AR α作動薬または拮抗薬のスクリーニング方法、 [15] 上記 [3] 記載の動物またはその生体の一部に被験物質を適用し、該物質の異種 P P A Rひに対するァゴニストまたはアンタゴニスト活性を、 P PREを有するプロモーターの制御下にある外来 DNAの発現を指標にして検定することを特徴とする、異種 PPARa作動薬または拮抗薬のスクリ —ニング方法、および

[16] 上記 [2] 記載の動物に被験物質を投与し、該動物における PPA R の活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態に及ぼす該物質の効果を検定することを特徴とする、異種 P P AR の由来する動物における該 P PAR αの活性調節が関与する疾患に対して予防 ·治療活性を有する物質のスクリーニング方法を提供する。

さらに、本発明は、

[17] 上記 [14] または [15] 記載の方法により得られうる異種 ΡΡ AR a作動薬、

[18] 上記 [17] 記載の作動薬を含有してなる、異種 P PAR a;の由来する動物における高脂血症、高卜リグリセリド血症、混合型脂質異常症、低 HDL血症、動脈硬化症、末梢動脈閉塞症、間欠性跛行、壊疽、高血圧症、血栓症、虚血性心疾患、急性心筋梗塞、心不全、鬱血性心不全、不安定狭心症、 PTCA後の再狭窄、ステント留置後の再狭窄、高フイブリノ一ゲン血症、心筋症、脳出血、一過性脳虚血発作、脳梗塞、脳卒中、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎動脈硬化症、皮膚炎、..免疫不全、低血糖、低ケトン血症、脂肪肝、糖尿病、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、肥満、アルッ八イマ一病、貧血性低酸素症および性腺障害からなる群より選択される 1もしくは 2以上の疾患の予防 ·治療薬、

[19] 異種 P PARひの由来する動物がヒトである上記 [18] 記載の予防 ·治療薬、

[20] 上記 [17] 記載の作動薬の有効量を異種 P PARひの由来する動物に投与することを含む、該動物における高脂血症、高トリグリセリド血症、混合型脂質異常症、低 HDL血症、動脈硬化症、末梢動脈閉塞症、間欠性跛行、壊疽、高血圧症、血栓症、虚血性心疾患、急性心筋梗塞、心不全、鬱血性心不全、不安定狭心症、 PTCA後の再狭窄、ステント留置後の再狭窄、高フイブリノ一ゲン血症、心筋症、脳出血、一過性脳虚血発作、脳梗塞、脳卒中、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎動脈硬化症、皮膚炎、免疫不全、低血糖、低ケトン血症、脂肪肝、糖尿病、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、肥満、アルツハイマー病、貧血性低酸素症および性腺障害からなる群より選択される 1もしくは 2以上の疾患の予防 ·治療方法、

[21] 異種 P PAR αの由来する動物における高脂血症、高トリグリセリド血症、混合型脂質異常症、低 HDL血症、動脈硬化症、末梢動脈閉塞症、間欠性跛行、 .壊疽、高血圧症、血栓症、虚血性心疾患、急性心筋梗塞、心不全、鬱血性心不全、不安定狭心症、 PTCA後の再狭窄、ステント留置後の再狭窄、高フイブリノ一ゲン血症、心筋症、脳出血、一過性脳虚血発作、脳梗塞、脳卒中、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎動脈硬化症、皮膚炎、免疫不全、低血糖、低ケトン血症、脂肪肝、糖尿病、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、肥満、アルツハイマー病、貧血性低酸素症および性腺障害からなる群より選択される 1もしくは 2以上の疾患の予防 ·治療薬の製造のための、上記 [17] 記載の作動薬の使用、

[22] 上記 [14] または [15] 記載の方法により得られうる異種 ΡΡ ARo!拮抗薬、

[23] 上記 [22] 記載の拮抗薬を含有してなる、異種 P PAR αの由来する動物における肝臓癌、乳癌および子宮内膜炎からなる群より選択される 1もしくは 2以上の疾患の予防 ·治療薬、

[24] 異種 P PARひの由来する動物がヒトである上記 [23] 記載の予防 ·治療薬、

[25] 上記 [22] 記載の拮抗薬の有効量を異種 P PARひの由来する動物に投与することを含む、該動物における肝臓癌、乳癌および子宮内膜炎からなる群より選択される 1もしくは 2以上の疾患の予防 ·治療方法、

[26] 異種 P PAR の由来する動物における肝臓癌、乳癌および子宮内膜炎からなる群より選択される 1もしくは 2以上の疾患の予防 ·治療薬を製造するための、上記 [22] 記載の拮抗薬の使用、 [27] 上記 [16] 記載の方法により得られうる、異種 PPARaの由来する動物における該 P PAR αの活性調節が関与する疾患に対して予防 ·治療活性を有する物質、

[28] 上記 [27] 記載の物質を含有してなる、異種 PPARaの由来する動物における該 PPAR αの活性調節が閧与する疾患の予防 ·治療薬、

[29] 異種 P PAR αの活性調節が関与する疾患が、高脂血症、高トリグリセリド血症、混合型脂質異常症、低 HDL血症、動脈硬化症、末梢動脈閉塞症、間欠性跛行、壊疽、高血圧症、血栓症、虚血性心疾患、急性心筋梗塞、心不全、鬱血性心不全、不安定狭心症、 PTCA後の再狭窄、ステント留置後の再狭窄、高フイブリノ一ゲン血症、心筋症、脳出血、一過性脳虚血発作、脳梗塞、脳卒中、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎動脈硬化症、皮膚炎、免疫不全、低血糖、低ケトン血症、脂肪肝、糖尿病、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、肥満、アルツハイマー病、貧血性低酸素症および性腺障害からなる群より選択される 1もしくは 2以上の疾患である上記 [28] 記載の予防 ·治療薬、

[30] 上記 [27] 記載の物質の有効量を異種 P PAR αの由来する動物に投与することを含む、該動物における P P AR αの活性調節が関与する疾患の予防 ·治療方法、および

[31] 異種 P PAR αの由来する動物における該 P PARひの活性調節が関与する疾患の予防 ·治療薬の製造のための、上記 [27] 記載の物質の使用

などを提供するものである。図面の簡単な説明

図 1は、ヒト P PAR Q!発現べクタ一 pKS— SEP P 2の制限酵素地図を示す図である。図中の矢印は転写方向を示す。発明を実施するための最良の形態

本発明の異種 P P A R α遺伝子導入非ヒト哺乳動物は、該異種 P P A R α に対しては作用するが、該非ヒト哺乳動物の内因性 P PAR αに対しては作用しない P P A R 作動薬もしくは拮抗薬の薬効をィンビポで評価し得る動物モデルである。

異種 PPARaをコードする DNAを発現可能な状態で安定に保持する非ヒト哺乳動物（以下、「本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物」または単に「本 , 発明の遺伝子導入動物」という場合もある）は、異種 PPARQ!をコードする DNAを発現可能な状態で「安定に保持」する。「安定に保持」するとは、該動物の細胞内に異種 P PARひをコ一ドする DNAが発現可能な状態で永続的に存在することを意味し、該 DN Aが宿主染色体上に組み込まれていても、あるいは染色体外 DNAとして安定に存在していてもよいが、好ましくは、該 DN Aは宿主染色体上に組み込まれた状態で保持される。

本発明の遺伝子導入動物は、非ヒト哺乳動物の受精卵や、未受精卵、精子およびその前駆細胞（始原生殖細胞、卵原細胞、卵母細胞、卵細胞、精原細胞、精母細胞、精細胞等）などに、好ましくは受精卵の胚発生の初期段階 (さらに好ましくは 8細胞期以前）において、リン酸カルシウム共沈殿法、電気穿孔（エレクト口ポレーシヨン）法、リポフエクシヨン法、凝集法、顕微注入（マイクロインジェクション）法、遺伝子銃（パ一ティクルガン）法、

DEAE—デキストラン法などの遺伝子導入法によって、目的とする異種 P PARo!をコードする DNAを導入することにより作製される。また、該遺伝子導入法により、非ヒト哺乳動物の体細胞、組織、臓器などに目的とする DNAを導入し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、この細胞を上述の胚（もしくは生殖）細胞と公知の細胞融合法を用いて融合させることにより遺伝子導入動物を作製することもできる。あるいは、ノックアウト動物を作製する場合と同様に、非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞（ES 細胞）に上記の遺伝子導入法を用いて目的とする DNAを導入し、予め該 D N Aが安定に組み込まれたクローンを選択した後に、該 ES細胞を胚盤胞に注入するかあるいは ES細胞塊と 8細胞期胚とを凝集させてキメラマウスを作製し、生殖系列に導入 DN Aが伝達されたものを選択することによつても遺伝子導入動物を得ることが可能である。また、このようにして作製された遺伝子導入動物の生体の一部（例えば、 ①異種 PPARaをコードする DNAを安定に保持する細胞、組織、臓器など、 ②これらに由来する細胞または組織を培養し、必要に応じて継代したも. のなど）も、本発明の「異種 P PAR αをコードする DNAを発現可能な状態で安定に保持する非ヒト哺乳動物の生 'の一部」として、本発明の「異種 P PARひをコ一ドする DNAを発現可能な状態で安定に保持する非ヒト哺乳動物」と同様な目的に用いることができる。

本発明の遺伝子導入動物の生体の一部としては、肝臓、心臓、腎臓、副腎、血管、消化管、脳などの臓器や、当該臓器由来の組織片および細胞などが好ましく例示される。

本発明で対象とし得る「非ヒト哺乳動物」は、トランスジエニック系が確立されたヒ卜以外の哺乳動物であれば特に制限はなく、例えば、ゥシ、サル、ブタ、ヒッジ、ャギ、ゥサギ、ィヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなどが挙げられる。好ましくは、ゥサギ、ィヌ、ネコ、モルモット、ハムス夕一、マウス、ラット等であり、なかでも疾患モデル動物作製の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、繁殖が容易な齧歯動物がより好ましく、とりわけマウス（例えば、純系として C 57 BLZ6系統、 DBA2系統など、交雑系として B6C3F ,系統、 BDF ,系統、 B6D 2 F ,系統、 BALB/c系統、 I CR系統など)' およびラット（例えば、 Wi s t a r, SDなど）が好ましい。

また、哺乳動物以外にも二ヮ卜リなどの鳥類が本発明で対象とする「非ヒト哺乳動物」と同様の目的に用いることができる。

「異種 P PAR をコードする DNA」とは、遺伝子導入の対象となる非ヒト哺乳動物（例えば、マウス）にとつて異種の哺乳動物（例えば、ヒト、ゥシ、サル、ブ夕、ヒッジ、ャギ、ゥサギ、ィヌ、ネコ、モルモット、ハムス夕一、ラットなど）由来の PPARo!もしくはそれと実質的に同一のァミノ酸配列を有する蛋白質をコードする DNAを意味する。好ましくは、本発明の異種 P PARひをコードする DN Aは、ヒト P PAR αもしくはそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする DNAである。ヒト PPAR a;をコードする DNAとしては、配列番号： 2で表わされるァミノ酸配列をコードする DNA、好ましくは配列番号： 1で表わされる塩基配列を有する DNAが挙げられる。「実質的に同一のアミノ酸配列」としては、例えばヒト P PAR αの場合、配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列と約 9 0%以上、好ましくは 95%以上、より好ましくは約 98%以上の同一性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。アミノ酸配列の同一性は、相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Center for Biotechnology

Information Basic Local Alignment Search Tool) を用い、以下の条件 (期待値 =10；ギヤップを許す；マトリクス^1^31]¾162；フィルタリング =0FF) にて計算することができる。

「実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質」としては、例えばヒト p p

ARo!の場合、配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のァ 'ミノ酸配列を有し、配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質が好ましい。「実質的に同質の活性」としては、例えば、リガンド（ァゴ二スト、アンタゴニストを含む) 結合活性、脂質代謝関連遺伝子の発現調節作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性や脂質代謝関連遺伝子の発現調節作用などの活性が同等（例、約 0. 0 1〜100倍、好ましくは約 0. 5〜20倍、より好ましくは約 0. 5〜2 倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。リガンド結合活性や脂質代謝関連遺伝子の発現調節作用などの活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、後に記載するスクリーニング方法に従って測定することが. できる。

異種 P PAR をコードする DN Aは、例えば配列番号： 1で表わされる塩基配列を有する DNAのように、イントロンを含まない形態（即ち、相補 DNA) であることが好ましいが、イントロンの 5' および 3' 末端配列はほとんどの真核生物遺伝子で共通であるので、別の実施態様においてはイントロンを含む形態（即ち、ゲノム DNA) もまた好ましく用いられ得る。異種 PPAR a;をコードする DNAは、ヒトゃ各種非ヒト哺乳動物（ゥシ、サル、ブタ、ヒッジ、ャギ、ゥサギ、ィヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）の肝臓、心臓、腎臓、副腎、血管、消化管などに由来する DN Aおよび市販の各種ゲノム DN Aライブラリ一に由来するゲノム D NAの全てあるいは一部を原料として用い、あるいはヒトゃ各種非ヒト哺乳動物の肝臓、心臓、腎臓、副腎、血管、消化管などに由来する RNAから公知の方法により調製された cDNAを原料として用い、公知の P PARひ遺伝子配列をもとに作製したオリゴヌクレオチドをプローブもしくはプライマ —として、ハイブリダィゼーシヨン法もしくは P C R法などにより単離することができる。

本発明の遺伝子導入動物は、異種 P PAR をコ一ドする DNAを「発現可能な状態で」保持している。したがって、当該 DNAを対象動物に導入するにあたっては、当該 DN Aを対象動物の細胞内で機能し得るプロモーターの下流に連結した発現カセットを含む形態（例、発現べクタ一など）で用いるのが一般に有利である。

異種 PPARひをコードする DNAを担持するべクタ一としては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、 λファージなどのバクテリオファージ、モロニ一白血病ウィルスなどのレトロゥィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物もしくは昆虫ウィルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられ、特に大腸菌由来のプラスミドが好ましい。

異種 P P A R の遺伝子発現調節を行うプロモーターとしては、例えばゥィルス（サイトメガロウィルス、モロニ一白血病ウィルス、 J Cウィルス、乳癌ウィルスなど）に由来する遺伝子のプロモータ一、各種哺乳動物（ヒト、ゥシ、サル、ブ夕、ヒッジ、ャギ、ゥサギ、ィヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）および鳥類（ニヮトリなど）に由来する遺伝子 [例えば、アルブミン、エンドセリン、ォステオカルシン、筋クレアチンキナーゼ、 I型および I I型コラーゲン、サイクリック AMP依存蛋白キナーゼ /3 Iサブュニット、心房ナトリゥム利尿性因子、ドーパミン i3—水酸化酵素、ニューロフィラメント軽鎖、メタ口チォネイン Iおよび I I A、メタ口プロティナ一ゼ 1組織インヒビ夕一、平滑筋 αァクチン、ポリペプチド鎖伸長因子 1 ひ (EF 1 - α) 、 βァクチン、 αおよび iSミオシン重鎖、ミオシン軽鎖 1および 2、ミエリン塩基性蛋白、血清アミロイド Pコンポーネント、レニンなど] のプロモーターなどが挙げられる。好ましくは、目的とする疾患モデルに応じて、標的組織で異種 P PAR aを特異的もしくは高発現させ得るプロモーター（例：肝臓で高発現可能な血清アミロイド Pコンポ一ネント（SAP) 、アルブミン、トランスフェリン、フイブリノ一ゲン、ァンチトロンビン III、 α 1—アンチトリプシンなどの遺伝子プロモータ一；心臓で高発現可能なひおよび /3ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖 1および 2などの遺伝子プロモーター；腎臓で高発現可能な PTHZPTH r Ρ受容体などの遺伝子プロモーター；副腎で高発現可能な AC TH受容体などの遺伝子プ口モーター；消化管で高発現可能な脂肪酸結合蛋白質などの遺伝子プロモーター；脳で高発現可能なミエリン塩基性蛋白、ダリァ線維性酸性蛋白などの遺伝子プロモータ一等）を適宜選択することができる。例えば、本発明の遺伝子導入動物が高脂血症や動脈硬化症のモデルである場合、肝臓で高発現可能なプロモータ一を用いることが好ましい。

異種 P PAR aをコードする DN Aの下流には、遺伝子導入動物において目的とするメッセンジャー RN Aの転写を終結させる配列（ポリアデニレーシヨン（p o l yA) シグナル、ターミネ一ターとも呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウィルス遺伝子由来、あるいは各種哺乳動物または鳥類の遺伝子由来のターミネ一夕一配列を用いて、効率よい導入遺伝子の発現を達成することができる。好ましくは、シミアンウィルスの S V40 夕一ミネ一夕一などが用いられる。その他、目的の遺伝子をさらに高発現させる目的で、各遺伝子のスプライシングシグナル、ェンハンサー領域、真核遺伝子のイントロンの一部を、プロモ一夕一領域の 5，上流、プロモ一夕一領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の 3' 下流に連結することも目的により可能である。また、胚性幹細胞（E S細胞）を用いて遺伝子導入動物を作製する場合、上記のベクタ一は、導入 D N Aが安定に組み込まれたクローンを選択するための選択マーカー遺伝子（例：ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子）をさらに含むことが好ましい。さらに、相同組換えにより宿主染色体の特定の部位に導入 D NAを組み込むこと（即ち、ノックイン動物の作製）を意図する場合には、上記のベクターは、ランダムな揷入を排除するために、標的部位と相同な D N A配列の外側に単純へルぺスウィルス由来チミジンキナ一ゼ（HSV- tk) 遺伝子やジフテリア毒素遺伝子をネガティブ選択マーカー遺伝子としてさらに含むことが好ましい。これらの実施態様については後で詳述する。

上記のプロモーター、異種 P P A R Q!をコードする D NA、ターミネータ —などは、適当な制限酵素および D N Aリガ一ゼ等を用いた通常の遺伝子ェ学的手法により、上記のベクター中に正しい配置で、即ち遺伝子導入動物において異種 P P A R αを発現可能な配置で、揷入することができる。

好ましい一実施態様においては、上記のようにして得られる異種 P P A R αをコードする D Ν Αを含む発現べク夕一は、マイクロインジェクション法により対象となる非ヒ卜哺乳動物の初期胚に導入される。

対象非ヒト哺乳動物の初期胚は、同種の非ヒト哺乳動物の雌雄を交配させて得られる体内受精卵を採取するか、あるいは同種の非ヒト哺乳動物の雌雄からそれぞれ採取した卵と精子を体外受精させることにより得ることができる。

用いる非ヒト哺乳動物の齢や飼育条件等は動物種によつてそれぞれ異なるが、例えばマウス (好ましくは C 5 7 B L / 6 J (B 6 ) などの近交系マウス、 B 6と他の近交系との F _tなど）を用いる場合は、雌が約 4〜約 6週齢、雄が約 2〜約 8月齢程度のものが好ましく、また、約 1 2時間明期条件（例えば 7 : 0 0 - 1 9 : 0 0 ) で約 1週間飼育したものが好ましい。

体内受精は自然 ¾配によってもよいが、性周期の調節と 1個体から多数の初期胚を得ることを目的として、雌非ヒト哺乳動物に性腺刺激ホルモンを投与して過剰排卵を誘起した後、雄非ヒト哺乳動物と交配させる方法が好ましレ^ 雌非ヒト哺乳動物の排卵誘発法としては、例えば初めに卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性性腺刺激ホルモン、一般に PMSGと略する）、次いで黄体形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、一般に hCGと略する）を、例えば腹腔内注射などにより投与する方法が好ましいが、好ましいホルモンの投与量、投与間隔は非ヒ卜哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。例えば、非ヒト哺乳動物がマウス（好ましくは C 57 BLZ6 J (B 6) などの近交系マウス、 B 6と他の近交系との F iなど）の場合は、通常、卵胞刺激ホルモン投与後、約 48時間後に黄体形成ホルモンを投与し、直ちに雄マウスと交配させることにより受精卵を得る方法が好ましく、卵胞刺激ホルモンの投与量は約 20〜約 50 I UZ個体、好ましくは約 30 I U/個体、黄体形成ホルモンの投与量は約 0〜約 10 I U/個体、好ましくは約 5 I UZ個体である。

一定時間経過後、膣栓の検査等により交配を確認した雌非ヒト哺乳動物の腹腔を開き、卵管から受精卵を取り出して胚培養用培地（例： Ml 6培地、修正 Whitten培地、 BWW培地、 M2培地、 WM - HE PES培地、 BWW — HE PES培地等）中で洗って卵丘細胞を除き、微小滴培養法等により 5%炭酸ガス /95%大気下で DN A顕微注入まで培養する。直ちに顕微注入を行わない場合、採取した受精卵を緩慢法または超急速法等で凍結保存することも可能である。

一方、体外受精の場合は、採卵用雌非ヒト哺乳動物（体内受精の場合と同様のものが好ましく用いられる）に上記と同様に卵胞刺激ホルモンおよび黄体形成ホルモンを投与して排卵を誘発させた後、卵子を採取して受精用培地 ― (例： TYH培地）中で体外受精時まで微小滴培養法等により 5%炭酸ガス /95%大気下で培養する。他方、同種の雄非ヒト哺乳動物（体内受精の場合と同様のものが好ましく用いられる）から精巣上体尾部を取り出し、精子塊を採取して受精用培地中で前培養する。前培養終了後の精子を卵子を含む受精用培地に添加し、微小滴培養法等により 5 %炭酸ガス 95 %大気下で培養した後、 2個の前核を有する受精卵を顕微鏡下で選抜する。直ちに DN Aの顕微注入を行わない場合は、得られた受精卵を緩慢法または超急速法等で凍結保存することも可能である。

受精卵への D N Aの顕微注入は、マイクロマニピュレー夕一等の公知の装 ' 置を用いて常法に従って実施することができる。簡潔に言えば、胚培養用培地の微小滴中に入れた受精卵をホールディングピぺットで吸引して固定し、インジェクションピペットを用いて D N A溶液を雄性もしくは雌性前核、好 ' ましくは雄性前核内に直接注入する。導入 DNAは C s C 1密度勾配超遠心等で高度に精製したものを用いることが好ましい。また、導入 DNAは制限酵素を用いてベクター部分を切断し、直鎖状にしておくことが好ましい。 . DN A導入後の受精卵は胚培養用培地中で微小滴培養法等により 5 %炭酸 'ガス / 95%大気下で 1細胞期〜胚盤胞期まで培養した後、偽妊娠させた受胚用雌非ヒト哺乳動物の卵管または子宮内に移植される。受胚用雌非ヒト哺乳動物は移植される初期胚が由来する動物と同種のものであればよく、例えば、マウス初期胚移植する場合は、 I CR系の雌マウス（好ましくは約 8 〜約 10週齢）などが好ましく用いられる。受胚用雌非ヒト哺乳動物を偽妊娠状態にする方法としては、例えば、同種の精管切除（結紮）雄非ヒト哺乳動物（例えば、マウスの場合、 I CR系の雄マウス（好ましくは約 2月齢以上））と交配させて、膣栓の存在が確認されたものを選択する方法が知られている。

受胚用雌は自然排卵のものを用いてもよいし、あるいは精管切除（結紮）雄との交配に先立って、黄体形成ホルモン放出ホルモン（一般に LHRHと略する）もしくはその類縁体を投与し、受精能を誘起させたものを用いてもよい。 LHRH類縁体としては、例えば、 [3，5- Dil- Tyr⁵]- LH- RH、 [Gin⁸]- LH- RH、 [D- Ala⁶]- LH- RH、 [des-Gly¹⁰]-LH-RH, [D-His (Bzl)⁶]-LH-RHおよびそれらの Ethylamide などが挙げられる。 LHRHもしくはその類縁体の投与量、ならびにその投与後に雄非ヒト哺乳動物と交配させる時期は、非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。例えば、非ヒト哺乳動物がマウス（好ましくは I CR系のマウスなど）の場合には、通常、 LHRHもしくはその類縁体を投与した後、約 4日目に雄マウスと交配させることが好ましく、 L HRHあるいはその類縁体の投与量は、通常、約 10〜60 /2gZ個体、好ましくは約 4 0 {1 g Z個体である。

通常、移植される初期胚が桑実胚期以後の場合は受胚用雌の子宮に、それより前（例えば、 1細胞期〜 8細胞期胚）であれば卵管に胚移植される。受胚用雌は、移植胚の発生段階に応じて偽妊娠からある日数が経過したものが適宜使用される。例えばマウスの場合、 2細胞期胚を移植するには偽妊娠後約 0 . 5日の雌マウスが、胚盤胞期胚を移植するには偽妊娠後約 2 . 5日の雌マウスが好ましい。受胚用雌を麻酔（好ましくは Avert in、ネンブタール等が使用される）後、切開して卵巣を引き出し、胚培養用培地に懸濁した初期胚（約 5〜約 1 0個）を胚移植用ピペットを用いて、卵管腹腔口もしくは子宮角の卵管接合部付近に注入する。

移植胚が首尾よく着床し受胚雌が妊娠すれば、自然分娩もしくは帝王切開により仔非ヒト哺乳動物が得られる。自然分娩した受胚雌にはそのまま哺乳を継続させればよく、帝王切開により出産した場合は、産仔は別途用意した哺乳用雌（例えばマウスの場合、通常に交配 ·分娩した雌マウス（好ましくは I C R系の雌マウス等） ) に哺乳させることができる。

受精卵細胞段階における異種 P P A Rひをコードする D N Aの導入は、導入 D N Aが対象非ヒト哺乳動物の生殖系列細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。導入 D NAが染色体 D N Aに組み込まれているか否かは、例えば、産仔の尾部より分離抽出した染色体 D NAをサザンハイプリダイゼ一シヨンまたは P C R法によりスクリーニングすることにより検定することができる。上記のようにして得られる仔非ヒト哺乳動物（F 。）の生殖系列細胞において異種 P P A R αをコ一ドする D NAが存在することは、その後代（F !> の動物全てが、その生殖系列細胞および体細胞のすべてに異種 P P A R aをコードする D N Aが存在することを意味する。

'通常、 F 。動物は相同染色体の一方にのみ導入 D NAを有するヘテロ接合体として得られる。また、個々の F 。個体は相同組換えによらない限り異なる染色体上にランダムに揷入される。相同染色体の両方に異種 P P A R αをコードする D NAを有するホモ接合体を得るためには、 F _β動物と非トランスジエニック動物とを交雑して F ,動物を作製し、相同染色体の一方にのみ導入 DN Aを有するヘテロ接合体の兄妹同士を交雑すればよい。 1遺伝子座にのみ導入 DN Aが組み込まれていれば、得られる F ₂動物の 1Z4がホモ接合体となる。

別の好ましい一実施態様においては、異種 P PAR αをコードする DN A を含む発現ベクターは、エレクト口ポレーション法等の公知の遺伝子導入法により対象となる非ヒト哺乳動物の ES細胞に導入される。

ES細胞は胚盤胞期の受精卵の内部細胞塊（I CM) に由来し、インビト口で未分化状態を保ったまま培養維持できる細胞をいう。 I CMの細胞は将来、胚本体を形成する細胞であり、生殖細胞を含むすべての組織の基になる幹細胞である。 ES細胞としては、既に樹立された細胞株ものを用いてもよく、また、 Evans と Kaufman の方法（ネイチヤー（Nature) 第 292卷、 154 頁、 1981年）に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウス ES細胞の場合、現在、一般的には 129系マウス申来の ES細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかな ES細胞を取得するなどの目的で、例えば、 C 5 7 BL/6マウスや C 57 BLZ6の採卵数の少なさを DBAZ2との交雑により改善した BDF tマウス（C 57 BLZ6と DBA/2との F から樹立される ES細胞なども良好に用いることができる。 BDF ,マウスは、採卵数が多く、かつ卵が丈夫であるという利点に加えて、 C 57BL/6マウスを背景に持つので、これ由来の ES細胞は疾患モデルマウスを作製したとき、 C 57 BLZ6マウスと戻し交雑することでその遺伝的背景を C 57 BLZ 6マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。

ES細胞の調製は、例えば以下のようにして行うことができる。交配後の雌非ヒト哺乳動物 [例えばマウス（好ましくは C 57 BLZ6 J (B 6) などの近交系マウス、 B 6と他の近交系との F ,など) を用いる場合は、約 2 月齢以上の雄マウスと交配させた約 8〜約 10週齢程度の雌マウス（妊娠約 3. 5日）が好ましく用いられる] の子宮から胚盤胞期胚を採取して（あるいは桑実胚期以前の初期胚を卵管から採取した後、胚培養用培地中で上記と同様にして胚盤胞期まで培養してもよい）、適当なフィーダ一細胞（例えばマウスの場合、マウス胎仔から調製される初代繊維芽細胞や公知の S TO繊維芽細胞株等）層上で培養すると、胚盤胞の一部の細胞が集合して将来胚に分化する I CMを形成する。この内部細胞塊をトリプシン処理して単細胞を解離させ、適切な細胞密度を保ち、培地交換を行いながら、解離と継代を繰り返すことにより ES細胞が得られる。

E S細胞は雌雄いずれを用いてもよいが、通常雄の E S細胞の方が生殖系列キメラを作製するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。 ES細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、 PCR法により Y染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その 1例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約 10 ⁶個の細胞数を要していたのに対して、 1コロニ一程度の ES細胞数（約 50個）で済むので、培養初期における E S細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。

また、第二次セレクションとして、例えば、 G—バンデイング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られる E S細胞の染色体数は正常数の 100%が望ましいが、細胞株樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、 ES細胞への遺伝子導入の後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が 2 n = 40である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。このようにして得られる E S細胞株は、未分化幹細胞の性質を維持するために注意深く継代培養することが必要である。例えば、 S TO繊維芽細胞のような適当なフィーダ一細胞上で、分化抑制因子として知られる L I F (1 〜10， 000 UZm 1 ) 存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、 5%炭酸ガス Z 95 %空気または 5 %酸素 Z 5 %炭酸ガス/ 90 %空気）で約 ·3 7°Cで培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン ZE DTA溶液（通常 001〜0.5%トリプシン Z0. l〜5mM EDTA, ' 好ましくは約 0.1 %トリプシン ZlmM EDTA) 処理により単細 β包ィ匕し、新たに用意したフィーダ一細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常 1〜3日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。

ES細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans 及び Μ· H. Kaufman, ネィチヤ一 (Nature) 第 292卷、 154頁、 1981年； G. R. Martin プロシ一ディングス ·ォブ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエンス 'ュ一エスエー（Pro atl. Acad. Sci. U.S.A.) 第 78巻、 7634頁、 1981 年；！：. C. Doetschman ら、ジャーナル ·ォブ ·ェンブリオロジ一 ·ァンド ·ェクスペリメンタル ·モルフォロジ一、第 87巻、 27頁、 1985年〕、本発明の異種 P PARひをコードする DNAを導入された ES細胞を分化させて得られる異種 PPARa発現非ヒト哺乳動物細胞は、インビトロにおける異種 P P A Rひの細胞生物学的検討において有用である。，

ES細胞への遺伝子導入には、リン酸カルシウム共沈殿法、電気穿孔（ェレクト口ポレーシヨン）法、リポフエクシヨン法、レトロウイルス感染法、凝集法、顕微注入（マイクロインジヱクシヨン）法、遺伝子銃（パーテイクルガン）法、 DEAE—デキストラン法などのいずれも用いることができるが、簡便に多数の細胞を処理できること等の点からエレクトロボレ一シヨン法が一般的に選択されている。エレクトロボレ一シヨンには通常の動物細胞への遺伝子導入に使用されている条件をそのまま用いればよく、例えば、対数増殖期にある E S細胞をトリプシン処理して単一細胞に分散させた後、 1 0 ⁶〜10⁸細胞/ m lとなるように培地に懸濁してキュベットに移し、異種 P PAR αをコードする DNAを含むベクターを 10〜100 g添加し、 200〜60 OVZ cmの電気パルスを印加することにより行なうことができる。

導入 DNAが組み込まれた E S細胞は、単一細胞をフィーダ一細胞上で培養して得られるコロニーから分離抽出した染色体 DN Aをサザンハイブリダィゼーションまたは PC R法によりスクリーニングすることによつても検定することができるが、 ES細胞を用いるトランスジエニック系の最大の長所は、薬剤耐性遺伝子やレポ一夕一遺伝子の発現を指標として細胞段階で形質転換体を選択できることである。したがって、ここで使用される導入べクタ —は、異種 P P A R ひをコードする D N Aを含む発現カセットに加えて、薬剤耐性遺伝子（例：ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ I I (npt l l) 遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（hpt) 遺伝子など）やレポ一夕一遺伝子（例： 3—ガラクトシダ一ゼ（lacZ) 遺伝子、クロラムフェニコールァセチルトランスフェラ一ゼ（cat) 遺伝子など）等の選択マーカー遺伝子をさらに含むことが望ましい。例えば、選択マーカー遺伝子として npt l l遺伝子を含むベクターを用いた場合、遺伝子導入処理後の E S細胞を G 4 1 8などのネオマイシン系抗生物質を含有する培地中で培養し、出現した耐性コロニーをそれぞれ培養プレートに移してトリプシン処理、培地交換を繰り返した後、一部を培養用として残し、残りを P C Rもしくはサザンハイプリダイゼーシヨンにかけて導入 D N Aの存在を確認する。

導入 D NAの組込みが確認された E S細胞を同種の非ヒト哺乳動物由来の胚内に戻すと、宿主胚の I C Mに組み込まれてキメラ胚が形成される。これを仮親（受胚用雌）に移植してさらに発生を続けさせることにより、キメラトランスジエニック動物が得られる。キメラ動物の中で E S細胞が将来卵や精子に分化する始原生殖細胞の形成に寄与した場合には、生殖系列キメラが得られることとなり、これを交配することにより導入 D N Aが遺伝的に固定された遺伝子導入非ヒ卜哺乳動物を作製することができる。

キメラ胚の作製方法としては、桑実胚期までの初期胚同士を接着させて集合させる方法（集合キメラ法）と、胚盤胞の割腔内に細胞を顕微注入する方法（注入キメラ法）とがある。 E S細胞によるキメラ胚の作製においては従来より後者が広く行なわれているが、最近では、 8細胞期胚の透明帯内への E S細胞の注入により集合キメラを作る方法や、マイクロマニピュレーターが不要で操作が容易な方法として、 E S細胞塊と透明帯を除去した 8細胞期胚とを共培養して凝集させることによって集合キメラを作製する方法も行われている。

いずれの場合も、宿主胚は受精卵への遺伝子導入における採卵用雌として使用され得る非ヒト哺乳動物から同様にして採取することができるが、例えばマウスの場合、キメラマウス形成への ES細胞の寄与率を毛色（コート力ラー）で判定し得るように、 ES細胞の由来する系統とは毛色の異なる系統のマウスから宿主胚を採取することが好ましい。例えば、 ES細胞が 129 系マウス（毛色：ァグーチ）由来であれば、採卵用雌として C 57 BLZ6 マウス（毛色：ブラック）や I CRマウス（毛色：アルビノ）を用い、 ES 細胞が C 57 BLZ6もしくは DBF ,マウス（毛色：ブラック）由来や T T 2細胞（C 57 BL/6と CBAとの F , (毛色：ァグーチ）由来）であれば、採卵用雌として I CRマウスや BALBZcマウス（毛色：アルビノ）を用いることができる。

また、生殖系列キメラ形成能は ES細胞と宿主胚との組み合わせに大きく依存するので、生殖系列キメラ形成能の高い組み合わせを選択することがより好ましい。例えばマウスの場合、 129系統由来の ES細胞に対しては C 57 BLZ 6系統由来の宿主胚等を用いることが好ましく、 C 57 BL/6 系統由来の ES細胞に対しては BALBZc系統由来の宿主胚等が好ましい。採卵用雌マウスは約 4〜約 6週齢程度が好ましく、交配用の雄マウスとしては約 2〜約 8月齢程度の同系統のものが好ましい。交配は自然交配によつてもよいが、好ましくは性腺刺激ホルモン（卵胞刺激ホルモン、次いで黄体形成ホルモン）を投与して過剰排卵を誘起した後に行なわれる。

胚盤注入法による場合は、胚盤胞期胚（例えばマウスの場合、交配後約 3. 5日）を採卵用雌の子宮から採取し（あるいは桑実胚期以前の初期胚を卵管から採取した後、上述の胚培養用培地中で胚盤胞期まで培養してもよい）、マイクロマニピュレ一タ一を用いて胚盤胞の割腔内に異種 P PAR をコ一ドする DNAが導入された ES細胞（約 10〜約 1 5個）を注入した後、偽妊娠させた受胚用雌非ヒト哺乳動物の子宮内に移植する。受胚用雌非ヒト哺乳動物は受精卵への遺伝子導入における受胚用雌として使用され得る非ヒト哺乳動物を同様に用いることができる。

共培養法による場合は、 8細胞期胚および桑実胚（例えばマウスの場合、交配後約 2. 5日）を採卵用雌の卵管および子宮から採取して（あるいは 8 細胞期以前の初期胚を卵管から採取した後、上述の胚培養用培地中で 8細胞期または桑実胚期まで培養してもよい）酸性タイロード液中で透明帯を溶解した後、ミネラルオイルを重層した胚培養用培地の微小滴中に異種 P P A R ひをコードする D NAが導入された E S細胞塊（細胞数約 1 0〜約 1 5個）を入れ、さらに上記 8細胞期胚または桑実胚（好ましくは 2個）を入れて一晚共培養する。得られた桑実胚または胚盤胞を上記と同様にして受胚用雌非ヒト哺乳動物の子宮内に移植する。

移植胚が首尾よく着床し受胚雌が妊娠すれば、自然分娩もしくは帝王切開によりキメラ非ヒト哺乳動物が得られる.。自然分娩した受胚雌にはそのまま哺乳を継続させればよく、帝王切開により出産した場合は、産仔は別途用意した哺乳用雌（通常に交配 ·分娩した雌非ヒト哺乳動物）に哺乳させることができる。

生殖系列キメラの選択は、まず E S細胞の雌雄が予め判別されている場合は E S細胞と同じ性別のキメラマウスを選択し（通常は雄性 E S細胞が使用されるので、雄キメラマウスが選択される）、次いで毛色等の表現型から E S細胞の寄与率が高いキメラマウス（例えば、 5 0 %以上）を選択する。例えば、 1 2 9系マウス由来の雄性 E S細胞である D 3細胞と C 5 7 B L / 6 マウス由来の宿主胚とのキメラ胚から得られるキメラマウスの場合、ァグーチの毛色の占める割合の高い雄マウスを選択するのが好ましい。選択されたキメラ非ヒト哺乳動物が生殖系列キメラであるか否かの確認は、適当な系統の同種動物との交雑により得られる F ,動物の表現型に基づいて行なうことができる。例えば、上記キメラマウスの場合、ァグーチはブラックに対して優性であるので、雌 C 5 7 B L Z 6マウスと交雑すると、選択された雄マウスが生殖系列キメラであれば得られる F iの毛色はァグーチとなる。

上記のようにして得られる異種 P P A Rひをコードする D NAが導入された生殖系列キメラ非ヒト哺乳動物（フアウンダ一）は、通常、相同染色体の一方にのみ導入 D N Aを有するヘテロ接合体として得られる。また、個々のフアウンダーは相同組換えによらない限り異なる染色体上にランダムに挿入される。相同染色体の両方に異種 P P A R をコードする D NAを有するホモ接合体を得るためには、上記のようにして得られる F ,動物のうち相同染色体の一方にのみ導入 DN Aを有するヘテロ接合体の兄妹同士を交雑すればよい。ヘテロ接合体の選択は、例えば F ₁動物の尾部より分離抽出した染色体 D N Aをサザンハイブリダイゼ一シヨンまたは P C R法によりスクリ一二ングすることにより検定することができる。 1遺伝子座にのみ導入 DN Aが組み込まれていれば、得られる F ₂動物の 1/4がホモ接合体となる。

本発明の遺伝子導入動物は、異種 P PAR αに対する被験物質の作用を定量的に測定可能な程度に異種 P PAR の発現量が確保される限り、内因性 PPARaの発現については特に制限はない。しかしながら、本発明の遺伝子導入動物を異種 P PARaだけでなく内因性 P P A R αにも作用し得る薬剤の評価にも使用する場合は、内因性 P PAR の発現を不活性化することが望ましい。内因性 P PAR αの発現が不活性化された本発明の遺伝子導入動物は、公知の方法 (例えば、 Lee S.S.ら、モレキュラー ·アンド ·セルラ一-バイオロジー（Mol. Cell. Biol.) 、第 15巻、第 3012頁、 1995年を参照）により選択される PPARa遺伝子がノックアウトされた ES細胞、あるいは該 E S細胞から上記の方法に従つて作製される PPARo!ノックァゥト動物由来の初期胚もしくは ES細胞に、上記の方法に従って異種 P PAR αをコ一ドする DNAを導入することによって得ることができる。 P PAR α遺伝子をノックァゥトする具体的な手段としては、対象非ヒト哺乳動物由来の P PAR a遺伝子を常法に従って単離し、例えば、そのェキソン部分に他の DNA断片（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、 l ac Z ( )3—ガラクトシダ一ゼ遺伝子）、 c a t (クロラムフエニコ一ルァセチルトランスフェラーゼ遺伝子）等のレポ一夕一遺伝子等）を揷入することによりェキソンの機能を破壌するか（この場合、前述のように導入 DNAの組込みは薬剤耐性やレポ一夕一遺伝子の発現を指標として選択され得る）、 Cre- ΙοχΡ系や Flp_frt系を用いて PPAR ひ遺伝子の全部または一部を切り出して該遺伝子を欠失させるか、蛋白質コ —ド領域内へ終止コドンを揷入して完全な蛋白質の翻訳を不能にするか、あるいは転写領域内部へ遺伝子の転写を終結させる DN A配列（例えば、 poly A付加シグナルなど）を揷入して、完全なメッセンジャー RNAの合成を不能にすることによって、結果的に遺伝子を不活性化するように構築した D N A配列を有する DNA鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、相同組換えにより対象非ヒト哺乳動物の P PAR 遺伝子座に組み込ませる方法が好ましく挙げられる。

通常、哺乳動物における遺伝子組換えは大部分が非相同的であり、導入された DNAは染色体の任意の位置にランダムに挿入される。したがって、薬剤耐性やレポ一ター遺伝子の発現を検出するなどの選択によっては相同組換えにより標的となる内因性 PPARa遺伝子にタ一ゲッティングされたクロ —ンのみを効率よく選択することができず、選択されたすベてのクローンについてサザンハィうリダイゼーシヨン法もしくは P C R法による組み込み部位の確認が必要となる。そこで、夕ーゲッティングベクタ一の標的配列に相同な領域の外側に、例えば、ガンシクロビル感受性を付与する HSV- tk遺伝子を連結しておけば、該ベクターがランダムに挿入された細胞は HSV- tk遺伝子を有するため、ガンシクロビル含有培地では生育できないが、相同組換えにより内因性 P P A R a遺伝子座に夕一ゲッティングされた細胞は HSV- 1 k 遺伝子を有しないので、ガンシクロビル耐性となり選択される。あるいは、 HSV-tk遺伝子の代わりに、例えばジフテリア毒素遺伝子を連結すれば、該べクタ一がランダムに揷入された細胞は自身の産生する該毒素によって死滅するので、薬剤非存在下で相同組換え体を選択することもできる。

また、内因性 P PAR aの発現が不活性化された本発明の遺伝子導入動物は、このようにして作製される内因性 P PAR aをノックアウトされた動物と、上述の異種 P PAR aを導入された、該動物と同種の動物とを交配することによつても得ることができる。例えば、内因性 P PAR aホモ欠損マウスと、ヒト P PAR ホモトランスジエニック（Tg) マウスとを交配して得られる産仔（内因性 P PAR aヘテロ欠損 ·ヒト P PARひヘテロ Tgマウス）の雌雄同士をさらに交配して、 2コピーのヒト PPAR aおよびノックアウトされたマウス P P AR aの欠損部分のみが確認されたマウスを選択することにより、内因性 PPAR «ホモ欠損 ·ヒト PPARひホモ Tgマウスを作製することができる。

あるいは、内因性 P PAR αの発現が不活性化された本発明の遺伝子導入動物は、相同組換えを用いた遺伝子ターゲッティングにより異種 P PAR をコードする DNAで内因性 P P AR α遺伝子を置換したノックイン動物であってもよい。

ノックィン動物はノックアウト動物と基本的に同様の手法に従つて作製することができる。 P PARひの OR Fは第 3ェキソン〜第 8ェキソンに存在するので、例えば、対象非ヒト哺乳動物由来の P PAR α遺伝子のこれらの領域を適当な制限酵素を用いて切除し、代わりに異種 P PARひ遺伝子の対応する領域を挿入することにより得られる DNAを含むターゲッティングべ ■ クタ一を、上記の方法に従って対象非ヒト哺乳動物由来の ES細胞に導入し、相同組換えにより該動物の内因性 P PAR α遺伝子座に異種 P PAR aをコードする D N Aが組み込まれた E S細胞クローンを選択すればよい。クローン選択は PCR法やサザン法を用いて行なうこともできるが、例えば、夕一ゲッティングベクタ一め PPARo!遺伝子の 3 ' 非翻訳領域などにネオマイシン耐性遺伝子等のポジティブ選択用マーカ一遺伝子を挿入し、さらに標的配列と相同な領域の外側に HSV-tk遺伝子やジフテリア毒素遺伝子等のネガティブ選択用マーカー遺伝子を挿入すれば、薬剤耐性を指標にして相同組換え体を選択することができる。

また、ポジティブ選択用マーカー遺伝子が導入された異種 P PARひの発現を妨げる場合があるので、ポジティブ選択用マ一カー遺伝子の両端に ΙοχΡ 配列もしくは frt配列を配した夕ーゲッティングベクターを用い、相同組換え体選択後の適当な時期に Creもしくは Flpリコンビナーゼまたは該リコンピナ一ゼ発現べクタ一（例：アデノウイルスベクターなど）を作用させることにより、ポジティブ選択用マ一力一遺伝子を切り出すことが好ましい。あるいは、 Cre- ΙοχΡ系や Flp- frt系を用いる代わりに、ポジティブ選択用マ一カー遺伝子の両端に標的配列と相同な配列を同方向に繰り返して配置し、該配列間での遺伝子内組換えを利用してポジティブ選択用マ一カー遺伝子を切り出してもよい。本発明の遺伝子導入動物は、異種 PPAR o;をコードする DNAを発現可能な状態で安定に保持することに加えて、 1以上の他の遺伝子改変を有することをさらなる特徴とする。「他の遺伝子改変」とは、異種 PPAR aをコ一ドする DN Aが導入される以外の遺伝子改変を意味し、自然突然変異により内因性遺伝子が改変された自然発症疾患モデル動物、他の遺伝子をさらに導入されたトランスジエニック動物、内因性遺伝子を不活化されたノックァゥト動物（挿入突然変異等による遺伝子破壊のほか、アンチセンス DNAや中和抗体をコードする D N Aの導入により遺伝子発現が検出不可能もしくは無視し得る程度にまで低下したトランスジエニック動物を含む）、変異内因性遺伝子が導入されたドミナントネガティブ変異体などが含まれる。したがつて、内因性 PPAR o;遺伝子の改変もまた、本発明における「他の遺伝子改変」に該当する。

「他の遺伝子改変」は、異種 PPAR o;に特異的な作動薬もしくは拮抗薬の薬効評価用としての本発明の遺伝子導入動物の用途に有利なものであれば特に制限はないが、例えば、 P PAR の活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせるような遺伝子改変であることが好ましい。

「P PAR αの活性調節が関与する疾患」とは、 P P AR α活性の異常に起因するかもしくは結果的に P P A R α活性の異常を生じる疾患だけでなく、 PPAR 活性を調節することにより予防および/または治療効果が得られ得る疾患をも含めた概念として把握されるべきである。例えば、 PPAR o; を活性化することにより予防 ·治療可能な疾患として、高脂血症、高トリグリセリド（TG) 血症、混合型脂質異常症、低 HDL血症、動脈硬化症、末梢動脈閉塞症、間欠性跛行、壊疽、高血圧症、血栓症、虚血性心疾患、急性心筋梗塞、心不全、鬱血性心不全、不安定狭心症、 PTCA (経皮的冠動脈内腔拡張術）後の再狭窄、ステント留置後の再狭窄、高フイブリノ一ゲン血症、心筋症、脳出血、一過性脳虚血発作、脳梗塞、脳卒中、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎動脈硬化症、皮膚炎、免疫不全、低血糖、低ケトン血症、脂肪肝、糖尿病、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、肥満、アルッ八イマ一病、貧血性低酸素症および性腺障害等が、 PPAR o;を阻害することにより予防 ·治療可能な疾患として、肝臓癌、乳癌および子宮内膜炎等がそれぞれ挙げられる。 '

「P P AR αの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる 1以上の他の遺伝子改変を有する疾患モデル」としては、例えば、高脂血症もしくは動脈硬化症モデルとして WHHLゥサギ（低比重リポ蛋白レセプ夕一（LDLR) に変異を有する； Watanabe Υ.、ァテロ一スクレローシス (Atherosclerosis) 、第 36巻、第 261頁、 1980年）、 SHLM (apoE欠損変異を有する自然発症マウス； Matsushima Y.ら、マンマリアン ·ゲノム (Ma匪. Genome) 、第 10巻、第 352頁、 1999年）、 LDLRノックアウトマウス（Ishibashi S.ら、ジャーナル ·ォヴ ·クリニカル ·インヴエスティゲ一シヨン（J. Clin. Invest.) 、第 92巻、第 883頁、 1993年）、 apoEノックアウトマウス（Piedrahita J. A.ら、プロシーディングズ 'ォヴ ·ナショナル ·アカデミー ·ォヴ ·サイェンシズ ·ュ一エスェ一 (Pro atl. Acad. Sci. USA) 、第 89巻、第 4471頁、 1992年）、ヒト apo A，ヒト apoBダブルトランスジエニックマウス（Callow M.Lら、プロシーディングズ 'ォヴ' ナショナル ·アカデミー ·ォヴ ·サイエンシーズ ·ユーエスエー (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 、第 91巻、第 2130頁、 1994年）等が、虚血性心疾患モデルとして CD55 CD59ダブルトランスジエニックマウス（Cowan P. J.ら、 Xenotransplantation, 第 5巻、第 184-90頁、 1998年）等が、皮膚炎モデルとして interleukin 1 トランスジエニックマウス (Groves R.W. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 第 92巻、 11874頁、 1995年）等が、免疫不全モデルとして CD19ノックアウトマウス（Spielman J.ら、 Immunity, 第 3巻、 39 頁、 1995年）等が、低血糖モデルとして SPC2 ノックアウトマウス（Furuta M.ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 第 94巻、 6646頁、 1997年）等が、脂肪肝モデルとして ob/obマウス（Herberg L.及び Coleman D.L.、メタポリズム（Metabolism) 、第 26巻、第 59頁、 1977年）、 KKマウス（Nakamura M. 及び Yamada K.、ダイアベトロジァ（Diabetologia) 、第 3巻、第 212頁、 1967頁）、 FLS マウス（Soga M.ら、ラボラトリ一 'ォヴ'アニマル'サイエンス（Lab. Anim. Sci.) 、第 49巻、第 269頁、 1999年）、糖尿病モデルとして OD マウス (Makino S.ら、ェクスペリメンタル 'アニマル (Exp. Anim.) 、第 29巻、第 Γ頁、 1980年）、 BBラット（Crisa L.ら、ダイアビ —テイス ·メタポリズム ' レヴュー（Diabetes Metab. Rev.) 、第 8巻、第頁、 1992 年）、 ob/ob マウス、 db/db マウス（Hummel L.ら、サイエンス (Science) 、第 153 巻、第 1127 頁、 1966 年）、 KKマウス、 GK ラット (Goto Y.ら、トウホク ·ジャーナル ·ォヴ ·ェクスペリメンタル ·メディシン（Tohoku J. Exp. Med.) 、第 119 卷、第 85 頁、 1976 年）、 Zucker fattyラット（Zucker L.M.ら、ァニュアル ·ォヴ ·ニューヨーク ·ァカデミ — ·ォヴ 'サイエンス（Aim. NY Acad. Sci.) 、第 131卷、第 447頁、 1965 年）、 0LETF ラット（Kawano K.ら、ダイアビ一テイス， (Diabetes) 、第 41 巻、第 1422頁、 1992年）等が、肥満モデルとして ob/obマウス、 db/dbマウス、 KKマウス、 Zucker fattyラッ卜、 0LETFラット等が、アルツハイマー病モデルとして変異アミロイド前駆体蛋白質遺伝子導入マウス等が、貧血性低酸素症モデルとして beta SAD (beta S- Antilles- D Punjab)トランスジェニックマウス（Trudel M.ら、 EMBO J, 第 10巻、 3157頁、 1991 年）等が、性腺障害モデルとして Steroidogenic factor 1 ノックアウトマウス（Zhao L.ら、 Development, 第 128巻、 147頁、 2001 年）等が、肝臓癌モデルとして p53 ノックアウトマウス（Ke即 C. J. Molecular Carcinogenesis, 第 12 巻、 132頁、 1995年) 等が、乳癌モデルとして C- neu トランスジエニックマウス（Rao G.N.ら、 Breast Cancer Res Treat, 第 48巻、 265頁、 1998年）等が、子宮内膜炎モデルとして perforin Fas-ligandダブルノックアウトマウス（Spielman J.ら、 J Immunol. , 第 161 巻、 7063頁、 1998年）等が、知られている。

これらの「他の遺伝子改変を有する疾患モデル」は、例えば、米国の Jackson研究所などから購入可能であるか、あるいは周知の遺伝子改変技術を用いて容易に作製することができる。

本発明の遺伝子導入動物は、「P PAR の活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる 1以上の他の遺伝子改変」に加えて、同一もしくは他の疾患モデルを作製し得る非遺伝的処理を施されていてもよい。「非遺伝的処理」とは対象非ヒト哺乳動物における遺伝子改変を生じさせない処理を意味る。このような処理としては、例えば、高脂肪食負荷処理、糖負荷処理、飢餓処理、血管結紮 Z再灌流等が挙げられる。

P PAR Q!は哺乳動物の肝臓、心臓、腎臓、副腎、消化管、脳などで高発現しており、それらの臓器における疾患と関連している。従って、本発明の遺伝子導入動物は、肝臓、心臓、腎臓、副腎、消化管および脳のうちの 1もしくは 2以上の部位で異種 P P ARひを特異的に発現するものであることが好ましい。そのような部位特異的発現は、前記した標的組織で異種 P PAR を特異的もしくは高発現させ得るプロモータ一を用いることにより達成することができる。例えば、肝臓で高発現可能な血清アミロイド Pコンポーネント（SAP) プロモ一タ一を用いることにより、異種 PPAR を肝臓特異的に.、あるいは肝臓で高発現する本発明の遺伝子導入動物を作製することができる。

また、異種 P PAR αをコードする DNAを導入された非ヒト哺乳動物が PPARaを著しく高発現する場合、他の遺伝子改変を有することなく肝臓癌、乳癌、子宮内膜炎などの疾患を発症する表現型を示すものがある。したがって、本発明はまた、肝臓癌、乳癌および子宮内膜炎からなる群より選択される 1以上の疾患を発症する、異種 PPAR άをコードする DNAを導入された非ヒト哺乳動物を提供する。

異種 P P AR αに特異的な作動薬もしくは拮抗薬の薬効評価用としての本発明の遺伝子導入動物の用途に有利な「他の遺伝子改変」の別の好ましい態様としては、 P PREを有するプロモーターの制御下にある外来 DNAの導入が挙げられる。上述のように、 P PARひはリガンド存在下に標的遺伝子の 5 ' 上流に存在する P P RE配列に結合して該遺伝子の転写を促進する (遺伝子によっては抑制する場合もある（例： apoC- III等））。したがって、 P PREを有するプロモーターの制御下にある外来 DNAを導入された非ヒト哺乳動物では、該 DNAの発現に及ぼす被験物質の効果を検定することにより、該物質のァゴニストまたはアンタゴニスト活性を評価することができる。ここで「外来 DNA」とは、外部より人為的に遺伝子導入された DN A を意味し、異種 DNAだけでなく同種 DNAをも包含する。「PPREを有するプロモ一夕一の制御下にある外来 DNA」としては、 P PAR αの本来の標的遺伝子であり、 P PRE配列をプロモータ一領域に内在するヒトまたは他の哺乳動物由来遺伝子（ゲノム DNA) 、例えば、 CYP4A11、 CYP7AK PAI-K ApoA- 1、 ApoA-II, ApoC - III、 Acy卜 CoA等の遺伝子が挙げられる。あるいは、これらの遺伝子由来の P PRE配列を含む任意のプロモ一夕一（対象非ヒト哺乳動物の細胞内で機能的である）の下流に適当なリポーター遺伝子（例： ]3—ガラクトシダ一ゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールァセチルトランスフェラ一ゼ遣伝子、アルカリホスファターゼ遣伝子、ペルォキシダ一ゼ遺伝子等）を連結したキメラ DNAもまた好ましい。異種 P PAR αをコードする DNAを導入された非ヒト哺乳動物に、 P P AR αの活性調節が関与する'疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる 1 以上の他の遺伝子改変、あるいは P P R Εを有するプロモーターの制御下にある外来 DN Αを導入する方法は特に制限はなく、例えば、異種, PPARo! をコードする DNAを導入された非ヒト哺乳動物と、 P PARひの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる 1以上の他の遺伝子改変、あるいは P PREを有するプロモーターの制御下にある外来 DNAを有する同種の非ヒト哺乳動物とを交雑する方法； P PAR αの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる 1以上の他の遺伝子改変、あるいは P PREを有するプロモーターの制御下にある外来 DNAを有する非ヒト哺乳動物の初期胚ゃ E S細胞に、上述の方法により異種 P PAR をコードする DNAを導入してトランスジエニック動物を得る方法；異種 PP AR αをコードする DN Aを導入された非ヒト哺乳動物の初期胚ゃ E S細胞に、上述の方法により、あるいはノックアウト技術により、 P PAR の活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる 1以上の他の遺伝子改変、あるいは P PREを有するプロモーターの制御下にある外来 D NAを導入する方法等が挙げられる。また、 P PARひの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる 1以上の他の遺伝子改変が外来遺伝子やドミナント変異遺伝子の導入による場合、野生型非ヒト哺乳動物の初期胚ゃ E S細胞に、該外来遺伝子等と異種 P PAR αをコードする DN Aとを同時にもしくは順次導入してトランスジエニック動物を得てもよい。他の遺伝子改変が PPREを有するプロモーターの制御下にある外来 DNA の導入である場合も同様に、該外来 DNAと異種 P P AR aをコ一ドする D N Aとを同時にもしくは順次導入して卜ランスジエニック動物を得ることができる。さらに、 P PAR αの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる 1以上の他の遺伝子改変が内因性遺伝子の破壌による場合は、異種 P PAR αをコードする DNAを破壌すべき内因性遺伝子にターゲッティングされ樽るようにデザインして野生型非ヒト哺乳動物の ES細胞に導入してもよい。この場合、ターゲッティングベクタ一は、内因性 PPA R α遺伝子を破壊されるべき内因性遺伝子に置き換える以外は、上記のノックイン動物の作製に関して例示したものが好ましく使用され得る。

異種 P PAR a;をコードする DN Αを導入された非ヒ卜哺乳動物と、 PP A R αの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる 1 以上の他の遺伝子改変（あるいは P PREを有するプロモーターの制御下にある外来 DNA) を有する同種の疾患モデル非ヒト哺乳動物とを交雑する場合、ホモ接合体同士を交雑することが望ましい。例えば、異種 P PARひをコ一ドする DN Aが 1遺伝子座に組み込まれたホモ接合体と、 apoEホモ欠損高脂血症（動脈硬化）モデルとを交雑して得られる F ,は両遺伝子についてヘテロである。この F ,同士を兄妹交配して得られる F ₂個体の 1ノ 16は異種 PPARo!ホモ導入 · apoEホモ欠損となる。 ·

上記のようにして得られる「本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物」は、内因性 P PAR 0：に加えて（あるいはそれに代えて）異種 P PAR αを発現するので、異種 P PAR に対してァゴニストまたはアンタゴニスト活性を有するが、内因性 PPARaに対しては活性を有しない異種 PPARa特異的作動薬または拮抗薬について、その薬効をインビポで評価することを可能にする。したがって、本発明は、本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物またはその生体の一部に被験物質を適用し、該物質の異種 P PAR αに対するァゴニストまたはアンタゴニスト活性を検定することを特徴とする異種 P PAR 作動薬または拮抗薬のスクリ一ニング方法を提供する。

ここで「ァゴ二スト活性」とは、 P PARひに特異的に結合し、 PPAR の活性型（即ち、 RXRとのへテロダイマーとして P PREに結合し、標的遺伝子の転写を活性化し得る状態）と不活性型の平衡状態をより活性側にシフトさせる性質をいい、その程度は特に限定されない。従って、「ァゴ二スト活性を有する物質（作動薬）」には、いわゆるフルァゴニストの他、パ —シャルァゴ二ストも包含される。一方、「アンタゴニス卜活性」とは、 P P AR aのリガンド結合部位に拮抗的に結合するが、活性型と不活性型の平衡状態にほとんど又は全く影響を及ぼさない性質、あるいは P P A Rひの任意の部位に結合して、 P PARひの活性型と不活性型の平衡状態をより不活性側にシフトさせる性質をいう。従って、本明細書において「アンタゴニスト活性を有する物質（拮抗薬）」とは、いわゆるニュートラルアンタゴニストとィンバースァゴニストの両方を包含する概念として定義されるものとする。

具体的には、本発明のスクリーニング方法では、本発明の遺伝子導入非ヒ卜哺乳動物に被験物質を投与する。被験物質としてば、公知の合成化合物、ペプチド、タンパク質、 DNAライブラリ一などの他に、例えば哺乳動物 (例えば、マウス、ラット、ブタ、ゥシ、ヒッジ、サル、ヒトなど）の組織抽出物、細胞培養上清などが用いられる。該被験物質は、本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物の内因性 P P A R αおよぴ異種 P P A R αのそれぞれとィンビトロでの結合実験を行なって異種 P PAR のみに結合することを確認するか、あるいは、 P PREの制御下に置かれたレポ一夕一遺伝子をそれぞれ導入した非ヒト哺乳動物由来細胞および異種哺乳動物由来細胞における発現アツセィを行なって、後者でのみレポ一ター遺伝子の発現が活性化されることを確認することなどにより、予め異種 P PAR 特異的に作用することを確認しておくことが望ましい。本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物において内因性 P PARひがノックアウトされている場合は、この予備スクリー二ングを省略することができる。

被験物質の PPARo!ァゴニストノアン夕ゴニス卜活性は、例えば、脂肪酸 /3酸化活性またはそれに伴う血中 TG濃度の変化、 apoC-III産生またはそれに伴う血中 TG濃度の変化、 apoA- 1産生またはそれに伴う血中 HDL— C 濃度の変化、 apoA-II 産生またはそれに伴う血中 HDL— C濃度の変化などを指標として検定することができる。これらは自体公知の方法、えば、 Chung, B.H. , Segrest, J. P. , Ray, M. J. , Brunzel 1, J.D. , Hokanson, J.E., Krauss, R.M. , Beaudrie, K. , and Cone, J.T. 1986. Methods Enzymol. 128: 181-209 に記載の方法に準じて測定することができる。「他の遺伝子改変」が「P PREを有するプロモーターの制御下にある外来 DN Aの導入」である本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物においては、該外来 D NAの発現を調べることによって、被験物質の P PAR αァゴニスト Zアン夕ゴニスト活性を容易に測定することができる。

このようにして選択された異種 P P A R α作動薬は、該異種 P P A R a;の由来する動物における安全で低毒性な高脂血症、高トリグリセリド血症、混合型脂質異常症、低 HDL血症、動脈硬化症、末梢動脈閉塞症、間欠性跛行、壊疽、高血圧症、血栓症、虚血性心疾患、急性心筋梗塞、心不全、鬱血性心不全、不安定狭心症、 PTCA後の再狭窄、ステント留置後の再狭窄、高フイブリノ一ゲン血症、心筋症、脳出血、一過性脳虚血発作、脳梗塞、脳卒中、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎動脈硬化症、皮膚炎、免疫不全、低血糖、低ケトン血症、脂肪肝、糖尿病、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、肥満、アルツハイマー病、貧血性低酸素症および性腺障害などの疾患の予防 ·治療薬として使用することができる。

異種 P PARひ作動薬は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カブセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。該作動薬は、生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、べヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによつて製剤化することができる。これら製剤における有効成分量は後述する投与量を考慮して適宜選択されれる。錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、ァカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態が力プセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。

注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール (例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルペート 8 0 ^TM、 H C O— 5 0など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニゥム、塩酸プロ力インなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコ一ルなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フエノールなど) 、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。

また、異種 P P A R CK作動薬が D N A、 R N Aなどの核酸である場合、当該核酸を単独で、あるいは当該 D N A (または当該 R N Aに対応する D N A) をレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスァソシエーテツドウィルスベクタ一などの適当なベクタ一に挿入した後、常套手段に従って、ヒ卜または他の哺乳動物に投与することができる。当該核酸は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化した後、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。

このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、異種 PPARひと同一もしくは実質的に同一の P P A R αを有する哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ゥサギ、ヒッジ、ブタ、ゥシ、ゥマ、ネコ、ィヌ、サルなど；「実質的に同一」とは上記と同義である）、好ましくは異種 PPARaの由来する動物（好ましくはヒト）に対して投与することができる。

異種 P PAR α作動薬の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ル一トなど, により異なるが、例えば、高 TG血症の治療目的で経口投与する場合、一般的に成人（体重 60 kg) においては、一日につき約 0., lmg〜： L 00m g、好ましくは約 1. 0〜5 Omg'、より好ましくは約 1. 0〜20mgで • 'ある。非経口投与の場合、当該作動薬の投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、高 TG血症の治療目的で注射剤として成人（体重 60 k g) に投与する場合、一日につき約 0. 01〜30mg程度、好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 .より好ましくは約 0. l〜10mg程度である。投与対象がヒト以外の動物の場合も、体重 6 O kg当たりに換算した量を投与することができる。

また、本発明のスクリーニング法により選択された異種 P PAR α拮抗薬は、哺乳動物（好ましくは異種 PPARaの由来する動物、さらに好ましくはヒト）における安全で低毒性な肝臓癌、乳癌または子宮内膜炎などの疾患の予防 ·治療薬として使用することができる。異種 P PAR α拮抗薬は、上記異種 P P A R 作動薬と同様の方法により製剤化され、経口的もしくは非経口的に哺乳動物（例えば、ヒ卜、ラット、マウス、モルモット、ゥサギ、ヒッジ、ブ夕、ゥシ、ゥマ、ネコ、ィヌ、サルなど；「実質的に同一」とは上記と同義である）に投与することができる。

異種 P PAR α拮抗薬の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより異なるが、例えば、臓癌の治療目的で経口投与する場合、一般的に成人（体重 6 O kg) においては、一日につき約 0. lmg〜l 0 Omg、好ましくは約 1. 0〜5 Omg、より好ましくは約 1. 0〜20mgである。非経口投与の場合、当該拮抗薬の投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、肝臓癌の治療目的で注射剤として成人（体重 6 O k g) に投与する場合、一日につき約 0. 01〜30mg程度、好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、より好ましくは約 0. 1〜 1 Omg程度である。投与対象がヒト以外の動物の場合も、体重 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。

「本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物」は P P AR aの活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を示すので、該動物に被験物質を投与してその病態に及ぼす該物質の効果を検定することによって、異種 P PARひの由来する哺乳動物（好ましくは、ヒト）における該 P PAR の活性調節が関与する疾患に対して予防 ·治療活性を有する物質をスクリーニングすることができる。指標となる病態は疾患モデルの種類に応じて適宜選択され得るが、例えば、本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物が高脂血症モデルであれば、血中コレステロール濃度（総コレステロール濃度、 TG濃度、 HDL— ^ 度等）の改善など、動脈硬化モデルであれば動脈硬化病変の退縮など、虚血性心疾患や脳血管疾患のモデルであれば血流の改善など、肝臓癌や乳癌のモデルであれば癌病巣の退縮などをそれぞれ指標として、被験物質の疾患予防 ·治療効果を評価することができる。，

上述のように、異種 PPAR.Q!をコードする DNAを導入された非ヒト哺乳動物が P PAR αを著しく高発現する場合、他の遺伝子改変を有することなく肝臓癌、乳癌、子宮内膜炎などの疾患を発症する表現型を示すものがある。したがって、このような異種 P PAR α導入非ヒト哺乳動物に同様に被 ' 験物質を投与して上記疾患の病態改善効果を検定することによつても、該疾患の予防 ·治療活性を有する物質をスクリーニングすることができる。

このようにして選択された物質は、安全で低毒性な高脂血症、高トリダリセリド血症、混合型脂質異常症、低 HDL血症、動 1硬化症、末梢動脈閉塞症、間欠性跛行、壊疽、高血圧症、血栓症、虚血性心疾患、急性心筋梗塞、心不全、鬱血性心不全、不安定狭心症、 PTCA後の再狭窄、ステント留置後の再狭窄、高フイブリノ一ゲン血症、心筋症、脳出血、一過性脳虚血発作、脳梗塞、脳卒中、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎動脈硬化症、皮膚炎、免疫不全、低血糖、低ケトン血症、脂肪肝、糖尿病、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、肥満、アルツハイマー病、貧血性低酸素症、性腺障害、肝臓癌、乳癌および子宮内膜炎などの疾患の予防 ·治療薬として使用することができる。選択された物質は、上記異種 P PAR a作動薬と同様の方法により製剤化され、経口的もしくは非経口的に哺乳動物 (例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ゥサギ、ヒッジ、ブ夕、ゥシ、ゥマ、ネコ、ィヌ、サルなど）に投与することができる。

選択された物質の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより異なるが、例えば、高 TG血症の治療目的で経口投与する場合、」般的に成人（体重 6 O kg) においては、一日につき約 0. lmg〜： L 0 Omg、好ましくは約 1. 0〜5 Omg、より好ましくは約 1. 0〜20mgである。非経口投与の場合、当該物質の投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、高 TG血症の治療目的で注射剤として成人（体重 6 O k g) に投与する場合、一日につき約 0. 01〜30mg程度、好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度である。投与対象がヒト以外の動物の場合も、体重 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。

本発明の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。

〔配列番号： 1〕ヒト P PAR αをコ一ドする cDN Aの塩基配列を示す。〔配列番号： 2〕ヒト P PARaのアミノ酸配列を示す。

〔配列番号： 3〕ヒト SAPプロモータ一を増幅するためのプライマ一として機能すべく設計されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。

〔配列番号： 4〕ヒト SAPプロモータ一を増幅するためのプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。

〔配列番号： 5〕ゥサギ ]3—グロビンェンハンサ一を増幅するためのブライマ一として機能すべく設計されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。

〔配列番号： 6〕ゥサギ j8—グロビンェンハンサ一を増幅するためのプラィマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。

〔配列番号： 7〕ヒト PPARa c DNAフラグメントを増幅するためのプライマ一として機能すべく設計されたォリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。

〔配列番号： 8〕ヒト PPARo! c DNAフラグメントを増幅するためのプライマ一として機能すべく設計されたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。

〔配列番号： 9〕 PCRにより増幅されたヒト P PARひ cDNAフラグメントを検出するための蛍光発生プローブとして機能すべく設計されたォリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。

本願明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 IUPAC - IUB Commission on Biochemical Nomenclature【こよる略号めるレま当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例'を次に挙げる。

DNA デォキシリポ核酸，

cDNA 相補的デォキシリポ核酸

A アデニン

T チミン

G グァニン

C

RNA リボ核酸

mRNA メッセンジャ一リポ核酸

dATP デォキシアデノシン三リン酸

dTTP デォキシチミジン三リン酸

dGTP デォキシグァノシン三リン酸

dCTP デォキシシチジン三リン酸

ATP アデノシン三リン酸

EDTA エチレンジァミン四酢酸

SDS ドデシル硫酸：

G 1 y ダリ A 1 a ァラニン

Va 1 バリン

Le u

l i e

S e r セリン

Th r スレオニン

Cy s

Me t メチォニン

G 1 u ダル夕ミン酸

As p

L y s リジン

A r g アルギニン

H i s ヒスチジン

P h e フエ二ルァラニン

Ty r チロシン

T r p トリブトファン

P r o プロリン

A s n ァスパラギン

G 1 n ダル夕ミン

p G 1 u ピログルタミン酸

Me メチル基

E t ェチル基

Bu ブチル基

Ph フエニル基

TC チアゾリジン一 4 (R) —カルポキサミド基以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。実施例 1 P PARひベクタ' 肝臓での導入遺伝子の高発現に必要な hSAP (human serum amyloid P cfMponent) プロモーターを PCRによりクローニングした。 GENBANKヒトゲノムデータより hSAPは第一番染色体上に存在することが公知である。 cDNA配列とのホモロジ一サーチにより 5' 上流域が特定できたため、文献 0. Biol'. Chem. , 111, 736, 1992; Dev. Genet., 10, 336, 1989) で使用されているプロモ一夕一領域のゲノム配列をもとにプライマー SA1 (5 ' - ACTGAGTAGAAGTAGCAGAA-3 ' (配列番号： 3 ) ) および SA4 ( 5 ' - CAGCGGCTTGTTCATATTCC-3' (配列番号： 4) ) を設計し、開始コドンに隣接する Hindi Π-AvrII断片 0.67Kbpを、 PCR (宝酒造： Ex Taq DNA polymerase 使用； 94°C、 2分間処理後、 94°C、 0.5分、 60 、 0.5分、 68°C 1 分を 30 サイクル）で増幅し、得られた断片を pCR2.1 'ベクター（invitrogen社）に TA cloning (invitrogen社）法にてクロ一ニングしてシーケンスの確認を行つた。 4 クローンの解析を行い、塩基置換のないクロ一ン 1 個を取得した (プラスミド名： CR2.1-SA4) 。

次に、宿主哺乳動物細胞における高発現に必要な rabbit ]3- globin ェンハンサ一のクローニングを以下の方法で行った。ゥサギの血液より調製したゲノム DNA を铸型にし、 5' 末端に発現べクタ一構築用の制限酵素サイトを付加したプライマー BG2 (5' -TCCTAGGTGAGAACTTCAGGGTGAGTTTG-3' (配列番号： 5 ) ； Avrll サイトが付加されたもの）および BG3 ( 5'- CGGTACCTTTGCCAAAATGATGAGACAGC-3' (配列番号： 6) ； Kpnlサイトが付加されたもの）を用いて PCR (宝酒造： Ex Taq DNA polymerase使用； 94 、 2分間処理後、 94°C、 0.5分、 60°C、 0.5分、 72°C 1分を 30サイクル）を行ない、増幅されたェンハンサー領域約 640bpを得た。増幅断片を PCR2.1-T0P0 ベクタ一に TA cloning (invitrogen社）し、 8クローンについてシーケンスの確認（ABI社 BigDye Terminator使用）を行った。 8クローンのシーゲンス解析結果をェンハンサ一配列と比較した結果、ほぼ既知の配列と一致したので PCRテンプレートのゥサギゲノム由来のものであると判断された。

PPAR cDNA は pMCMV- neo- hPPARo; (Biochem. Biophys. Res. Comraun. , 278: 704-711 (2000)) より切り出した 1.4Kbp Kpnl-Sall断片を使用した。 SV40 polyAは pTB399 (R. Sasad ら、 Cell Structure and Function, 12： 205, 1987) 由来の polyA付加シグナルを含む Bglllから Hindlll までの断片を PSP73 (stratagene社）にクローニングし、 Bgl 11サイトに Sal Iリンカ一を付与後、 0.27Kbp の Sail- Hindlll断片として使用した。

発現ベクターの構築にあたり、最初 PCR2.1- SA4 の Avrll- Kpnl サイトに pCR2. l-enh5 より回収した Avrll-Kpnl 断片を Takara ligation kit (宝酒造）を用いてライゲ一シヨンし、プロモーターとェンハンサ一が入った pCR2.1-SAPENH1 を作製した。一方、 pBluescripUI KS- (stratagene) の Kpnl- Hindi IIサイトに pMCMV-neo-hPPAR ο;より調製した約 1.4Kb の hPPAR cDNAと約 0.27Kbpの SV40 polyA断片（R. Sasada ら、 Cell Structure and Function, 12 : 205, 1987) をライゲ一シヨンし、 cDNA と polyAが入った pKS-PPARpolyAl を作製した。その後、 Bluescriptll KS- (stratagene) の Notlサイ卜に pCR2.卜 SAPENH1より回収した Notl- Kpnl断片 (約 1.3Kbp) と pMCMV-neo-hPPARo!より回収した Kpnl- Notl 断片（約 1.7Kbp) をライゲ一シヨンし、発現ベクターの構築を完了した（プラスミド名： pKS- SEPP2；本プラスミドを大腸菌 JM109 株にクローニングした形質転換体（Escherichia coli 】M109/pKS-SEPP2) は FERM BP - 8151 の受託番号を付され、'平成 14年 8月 14日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ一 (〒305_8566 茨城県つくば巿東 1-卜 1 中央第 6) に寄託されている。）。トランスジエニックマウス作製のため使用されるィンジェクション断片は Notl切断により切り出され、サイズは約 3.0Kbpである（図 1)。実施例 2 ヒト PPARaを導入したトランスジエニックマウスの作製採卵用雌マウス（C57BL/6J系統、 9〜13週齢）に 5IUの PMSGを腹腔内投与し、 12時間明期 Z12時間喑期の飼育室で 2日間飼育後、 5IUの hCGを腹腔内投与して雄マウス（C57BL/6J 系統、 15〜20週齢）と交配させた。別途、自然発情している受胚用雌マウス（ICR系統、 9〜20週齢）を精管結紮雄マウス（ICR系統、 15〜20週齢）と交配させた。翌日、膣栓形成により交尾を確認した採卵用雌マウスの腹腔を開いて卵管を取り出し、 M2培地中、実体顕微鏡下にピンセットで受精卵を取り出した。卵丘細胞がとれた受精卵をピぺットで吸い上げ、ミネラルオイルで覆われた Ml 6培地のドロップ中に入れて、インジェクションするまでの間 37° (：、 5% C0₂下で 2時間培養した。

受精卵をミネラルオイルで覆われた M2 培地のドロップ中に入れてホールデイングピペットで吸引固定した。実施例 1で調製したインジェクション断片溶液（0. 3〜1. 0 g/ml) をインジェクションピペットに吸引し、実体顕微鏡下にインジェクションピペットを受精卵の雄性前核に突き刺し、インジェクシヨン断片を注入した。インジェクション終了後、受精卵をミネラルオイルで覆われた M2 培地のドロップ中に入れて、受胚用雌への移植までの間 37°C、 5% C0₂下で培養した。

膣栓形成により偽妊娠状態を確認した受胚用雌マウスをネンブタールで麻酔後、後背部を切開して脂肪塊をピンセットで摘まんで引き出し、クレンメで固定した。実体顕微鏡下に卵巣嚢をピンセットで引き裂き、各卵管当たり 10〜15個の受精卵をトランスファ一ピぺットを用いて卵管開口部に注入した。卵巣と卵管を体内に戻して切り口を縫合した後、 12 時間明期 /12 時間暗期の飼育室で飼育を続けた。胚移植から 21 日後に仔マウス。）が産まれた。仔マウスへの導入 DNAの伝達は、尾部を l cm程度ハサミで切り取り、該組織抽出液から常法により DNAを単離して PCR法により確認した。

導入 DNA の伝達が確認された F。個体は、生殖可能になった段階で C57BL/6Jマウスと交配させて産仔（F を得た。上記と同様に導入 DNAの伝達を確認し、導入 DNAを有する個体同士を（兄妹)交配させ、導入 DNAに関してホモ接合体を得た。実施例 3 トランスジエニックマウスの遺伝子発現解析

実施例 2において得られたトランスジエニックマウスのヒト P P A R αの発現程度を調べるため、得られた 5〜6 週齢トランスジエニックマウスから肝臓を採取し、アイソジェン（二ツボンジーン社製）を使用して tot al RNA を抽出した。次に、 RNase- f ree DNase set (キアゲン社製）および RNeasy Mini Ki t (キアゲン社製）により精製した tot al RNAをもとにキット TaqMan Transcription Reagents (アプライドバイオシステムズ社製）を用いた逆転写反応により cDNAを調製した。 Real-time PCR (TaqMan PCR) のためのプライマ一としては 5' -CGCCAGCACGGACGA-3' (配列番号： 7) および 5' - TTGTCCCCACATATTCGACACTC-3 ' (配列番号： 8) を用い、 FAM (fluorescent 5-carboxyf luorescein ) 標識 TaqMan フローブとしては 5' - CCCCCGGCAGTGCCCTGAA-3' (配列番号： 9) を用いた。さらに TaqMan PCR Master Mix (アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、専用プレート中で各 20 1 の cDNAサンプルを鎵型として Real- time PCR反応を行った。反応は、 PCR装置 7700シークェンスディテクタ一（アプライドバイオシステムズ社製）により、 50° (：、 2分間； 95°C、 10分間処理後、 95°C、 15秒； 60t：、 1分のサイクルを 40回行った。反応後、解析マニュアルに従ってデ一夕解析を行った。以上の定量の標準として同じ， cMA サンプルを用いて TaqMan Rodent GAPDH Control Reagent (アプライドバイオシステムズ社製）を用いて GAPDH遺伝子発現の定量を行ってデータ値補正に用いた。実験の結果、ト

.ニックマウスの肝臓においてヒト P PAR αの発現が確認された。実施例 4 P PAR αホモ欠損マウスとの交配

実施例 2において作製されたヒト P PAR αホモ Tgマウスと P PAR α ホモ欠損マウス（Jackson研究所、米国）とを交配させて産仔を得る。マウス産仔の尾から DNAを抽出してサザン解析を行ない、ヒト PPARaおよびノックアウトされたマウス P PARひ遺伝子欠損部分が全ての産仔から検出された親マウスを、ヒト P PAR «ヘテロ Tg ·マウス P PAR «ヘテロ欠損マウスとして選択する。次にその雌雄同士を交配させる。遺伝子判定を同様の方法で行ってヒト P PAR が 2コピーおよびノックアウトされたマウス PP A 遺伝子の欠損部分のみが確認されるマウスをヒト PPARaホモ Tg -マウス P PAR ホモ欠損マウスとして選択する。実施例 5 各種高脂血症（動脈硬化）モデルマウスとの交配

(1) apoEホモ欠損マウスとの交配実施例 2において作製されたヒト P PAR αホモ Tg マウスと高脂血症 (動脈硬化）疾患モデルである apoE ホモ欠損マウス（lackson研究所、米国； C57BL/6Jを遺伝的背景とする）とを交配させて得られる産仔の雌雄同士を交配させる。得られるマウス産仔の尾から上記と同様にして DNAを抽出してサザン解析を行ない、ヒト PPARo!の DNAおよびノックアウトされた apoE遺伝子が全ての産仔から検出された親マウスを、ヒト P PARひへテロ Tg · apoEヘテロ欠損マウスとして選択する。次にその雌雄同士を交配させる。遺伝子判定を同様の方法で行ってヒト P PAROUS 2 コピーおよびノックァゥトされた apoE遺伝子の欠損部分のみが確認されたマウスをヒト P P AR a;ホモ Tg · apoEホモ欠損マウスとして選択する。

(2) LDL受容体ホモ欠損マウスとの交配

実施例 2において作製されたヒト P PAR α;ホモ Tg マウスと高脂血症 (動脈硬化）疾患モデルである LDL受容体ホモ欠損マウス [武田薬品工業株式会社において作製されたマウス（特開平 10-56915 号公報に記載）、あるいは Jackson研究所で保存されているマウス、米国；いずれも C57BL/6J を遺伝的背景とする] とを交配させて産仔を得る。得られるマウス産仔の尾から上記と同様にして DNAを抽出してサザン解析を行ない、ヒト P PARひの DNAおよびノックアウトされた LDL受容体遺伝子が全ての産仔から検出された親マウスを、ヒト P PAR ヘテロ Tg'LDL受容体へテロ欠損マウスとして選択する。次にその雌雄同士を交配させる。遺伝子判定を同様の方法で行つてヒト P PAR が 2コピ一およびノックアウトされた LDL受容体遺伝子の欠損部分のみが確認されたマウスをヒト P P ARひホモ Tg · LDL受容体ホモ欠損マウスとして選択する。

(3) ヒト apoA- 1ホモ Tgマウスとの交配

実施例 2において作製されたヒト P PARひホモ Tg マウスと高脂血症 (動脈硬化）疾患モデルであるヒト apoA- 1ホモ Tgマウス（Jackson研究所、米国； C57BL/6Jを遺伝的背景とする）とを交配させて得られる産仔の雌雄同士を交配させる。得られるマウス産仔の尾から上記と同様にして DNAを抽出してサザン解析を行ない、ヒト PPARo!の DNAおよびヒト apoA- I遺伝子が全ての産仔から検出された親マウスを、ヒト PPARa *ヒト apoA- Iへテロ Tgマウスとして選択する。次にその雌雄同士を交配させる。得られた産仔の遺伝子判定を同様の方法で行ってヒト KPARo!およびヒト apoA-Iがそれぞれ 2コピ一確認されたマウスをヒト P P AR α · ·ヒト apoA- Iホモ Tgマウスとして選択する。

(4) さらに、上記（1)〜（3)のそれぞれにおいて、実施例 2で作製されたヒト P PAR ホモ Tgマウスの代わりに、実施例 4において作製されたヒト P PARaホモ Tg'マウス P PARひホモ欠損マウスを用いて、同様の手順により apoEホモ欠損マウス、 LDL受容体ホモ欠損マウスおよび t ト apoA- 1 Tg マウスとそれぞれ交配させる。産業上の利用可能性

本発明の異種 P PARひ導入 ·疾患モデル非ヒト哺乳動物は、該異種 P P ARひに対しては作用するが、該非ヒト哺乳動物の内因性 P PAR αに対しては作用しない P P A R α作動薬もしくは拮抗薬のィンビポでの薬効を評価することができるので、 P PAR αの活性調節が関与する各種疾患の予防 · 治療薬の開発において有用なスクリーニング系を提供するものである。配列表フリ一テキスト

配列番号： 3

ヒト SAPプロモータ一を増幅するためのプライマ一として機能すベく設計されたオリゴヌクレオチド。

配列番号： 4 '

ヒト SAPプロモータ一を増幅するためのプライマ一として機能すべく設計されたォリゴヌクレオチド。

配列番号： 5

ゥサギ jS—グロビンェンハンサ一を増幅するためのプライマ一として機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。

配列番号： 6 ゥサギ i3_グロビンェンハンサ一を増幅するためのプライマ一として機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。

配列番号： 7

ヒト P PAR c DN Aフラグメントを増幅するためのプライマ一として機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。

配列番号： 8

ヒト P P AR a c DN Αフラグメントを増幅するためのプライマーとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。

配列番号： 9

PCRにより増幅されたヒト PPARa c D N Aフラグメントを検出するための蛍光発生プローブとして機能すべく設計されたオリゴヌクレオチド。

Claims

請求の範囲

1. 異種 PPARaをコードする DNAを発現可能な状態で安定に保持し、且つ 1以上の他の遺伝子改変を有する非ヒト哺乳動物またはその生体の一部。

2. 他の遺伝子改変の少なくとも 1つが、 P P A R 0；の活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせるものである、請求項 1記載の動物またはその生体の一部。

3. 他の遺伝子改変の少なくとも 1つが、 PPREを有するプロモーターの制御下にある外来 DNAの導入である、請求項 1記載の動物またはその生体の一部。

4. 異種 P PAR αがヒト由来 P PAR c¾である請求項 1記載の動物またはその生体の一部。

5. 異種 PPARひが配列番号： 2で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する請求項 1記載の動物またはその生体の一部。

6. 非ヒト哺乳動物が、ゥサギ、ィヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウスまたはラットである請求項 1記載の動物またはその生体の一部。

7. 非ヒト哺乳動物がマウスである請求項 1記載の動物またはその生体の一部。

8. 内因性 P PARひを欠損するかわりに異種 P PAR を発現させた動物である請求項 1記載の動物またはその生体の一部。

9. 内因性 P PARひを欠損する動物と、異種 PPAR CKを発現する、該動物と同種の動物とを交配することにより得られうる、請求項 8記載の動物またはその生体の一部。

10. 内因性 PPARaがマウス由来 PPARo;であり、異種 PPARo!がヒト由来 P P A R αである請求項 8記載の動物またはその生体の一部。

11. P PAR αの活性調節が関与する疾患が、高脂血症、高卜リグリセリド血症、混合型脂質異常症、低 HDL血症、動脈硬化症、末梢動脈閉塞症、間欠性跛行、壊疽、高血圧症、血栓症、虚血性心疾患、急性心筋梗塞、心不全、鬱血性心不全、不安定狭心症、 PTCA後の再狭窄、ステント留置後の再狭窄、高フイブリノ一ゲン血症、心筋症、脳出血、一過性脳虚血発作、脳梗塞、脳卒中、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎動脈硬化症、皮膚炎、免疫不全、低血糖、低ケトン血症、脂肪肝、糖尿病、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、肥満、アルツハイマー病、貧血性低酸素症、性腺障害、肝臓癌、乳癌および子宮内膜炎からなる群より選択される 1もしくは 2以上の疾患である請求項 2記載の動物またはその生体の一部。

12. 異種 P PARひが、肝臓、心臓、腎臓、副腎、血管、消化管および脳からなる群より選択される 1もしくは 2以上の部位で特異的に発現することを特徴とする請求項 1記載の動物またはその生体の一部。

13. 異種 PPAR が、肝臓で特異的に発現することを特徴とする請求項 1記載の動物またはその生体の一部。

14. 請求項 1記載の動物またはその生体の一部に被験物質を適用し、該物質の異種 P PAR αに対するァゴニストまたはアン夕ゴニスト活性を検定することを特徴とする異種 P PAR 作動薬または拮抗薬のスクリーニング方法。 -

15. 請求項 3記載の動物またはその生体の一部に被験物質を適用し、該物質の異種 P PAR αに対するァゴニストまたはアン夕ゴニスト活性を、 ΡΡ REを有するプロモータ一の制御下にある外来 DN Αの発現を指標にして検定することを特徴とする、異種 PPARa作動薬または拮抗薬のスクリ一二ング方法。

16. 請求項 2記載の動物に被験物質を投与し、該動物における PPARa の活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態に及ぼす該物質の効果を検定することを特徴とする、異種 P PAR αの由来する動物における該 P PARひの活性調節が関与する疾患に対して予防 ·治療活性を有する物質のスクリーニング方法。