JP2023544333A - ヒトｃｒ１を発現する齧歯類動物 - Google Patents

Abstract

本明細書に開示されるのは、遺伝子修飾齧歯類動物であって、それらのゲノム中に、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含み、齧歯類動物が、ヒトＣＲ１ポリペプチドのヒト様発現を現す、遺伝子修飾齧歯類動物である。また本明細書に開示されるのは、齧歯類胚性幹細胞を含む単離齧歯類細胞、及び齧歯類組織である。更に本明細書に開示されるのは、遺伝子修飾齧歯類動物を作製するための核酸ベクター及び方法、並びに候補化合物をスクリーニング及び試験するためにかかる遺伝子修飾齧歯類動物を使用する方法である。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１０月１日に出願された米国仮特許出願第６３／０８６，１６７号の優先権の利益を主張するものであり、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

参照による配列表の援用
２０２１年９月２９日に作製され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して米国特許商標庁に提出された３８２２４＿１０７４７ＷＯ０１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇという名称の４２ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルの形態をとる配列表が、参照により本明細書に組み込まれる。

前臨床薬剤開発段階の間、候補薬剤は通常、その有効性、毒性、及びその他の薬物動態的特性、及び薬力学的特性に基づいて研究される。抗体などの候補薬剤は、典型的にはヒト抗原を標的とするが、これは研究の最終的なゴールがヒト療法を開発することだからである。補体経路を隔離する能力は、候補治療剤に有意な利点を提供する。補体経路は自然免疫応答の一部であり、マルクファージ及び食細胞の抗原性部位への動員における体液性免疫応答を補助する。補体経路の活性化により、サイトカイン放出、及び食細胞による抗体結合抗原のオプソニン化が発生する。ヒト疾患に対処するための補体経路及び自然免疫応答の活性化を目的とする治療薬の開発中、薬剤の作用機序及び／又は治療能力の研究を可能にするであろう非ヒト動物系のモデルは非常に重要であり得る。

一態様では、本明細書に開示されるのは、遺伝子修飾齧歯類動物であって、そのゲノム中に、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含み、齧歯類動物が、ヒトＣＲ１ポリペプチドのヒト様発現を現す、遺伝子修飾齧歯類動物である。

いくつかの実施形態では、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ配列である。

いくつかの実施形態では、核酸は、齧歯類ゲノム中の齧歯類Ｃｒ２遺伝子座と齧歯類Ｃｒ１様（Ｃｒ１１）遺伝子座との間に挿入される。いくつかの実施形態では、核酸は、例えば、齧歯類のＸ染色体へのランダムな組み込み（例えば、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子座以外の座位）を介して齧歯類ゲノムに挿入される。

いくつかの実施形態では、核酸は、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結された、ヒトＣＲ１遺伝子の５’制御領域を含む。いくつかの実施形態では、５’制御領域は、ヒトＣＲ１遺伝子のプロモーター領域を含む。いくつかの実施形態では、５’制御領域は、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結された、ヒトＣＲ１遺伝子の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含む。いくつかの実施形態では、５’制御領域は、ヒトＣＲ１遺伝子のプロモーター及び５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含む。

いくつかの実施形態では、核酸は、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結された、ヒトＣＲ１遺伝子の３’制御領域を含む。いくつかの実施形態では、３’制御領域は、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結された、ヒトＣＲ１遺伝子の３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、３’制御領域は、ヒトＣＲ１遺伝子の３’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲの下流に追加の配列を含む。

いくつかの実施形態では、核酸は、５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、並びに介在イントロンを有する、ＡＴＧからＳＴＯＰまでのヒトＣＲ１コード配列と、５’ＵＴＲのすぐ上流にある少なくとも４０００ｂｐの５’上流配列、及び３’ＵＴＲのすぐ下流にある少なくとも１５０ｂｐの配列と、を含む、ヒトゲノムＤＮＡ配列を含み、いくつかのかかる実施形態では、核酸は、齧歯類Ｃｒ２遺伝子座と齧歯類Ｃｒ１ｌ遺伝子座との間に挿入される。

いくつかの実施形態では、核酸は、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結された、異種性遺伝子（即ち、ヒトＣＲ１ではない遺伝子）の５’制御領域を含む。いくつかの実施形態では、５’制御領域は、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子の５’制御領域である。いくつかの実施形態では、５’制御領域は、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子のプロモーター領域を含む。いくつかの実施形態では、５’制御領域は、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子のＡＴＧコドンのすぐ上流に少なくとも１４Ｋｂのゲノム配列を含む。

いくつかの実施形態では、核酸は、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結された、異種性遺伝子（即ち、ヒトＣＲ１ではない遺伝子）の３’制御領域を含む。いくつかの実施形態では、３’制御領域は、異種性遺伝子の３’ＵＴＲ、例えば、ヒトベータ－１グロビン遺伝子の３’ＵＴＲ（ポリアデニル化配列を含む）を含む。

いくつかの実施形態では、核酸は、５’で、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子のＡＴＧのすぐ上流にある少なくとも１４Ｋｂのヌクレオチド配列（齧歯類Ｇａｔａ１遺伝子のプロモーターを含む）と、３’で、ヒトベータグロビン遺伝子からのポリ（Ａ）シグナルを含む３’ＵＴＲ配列と、それに続く、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子のＳＴＯＰコドンのすぐ下流にある少なくとも１．５Ｋｂのヌクレオチド配列と、作動可能に連結された、ヒトＣＲ１コード配列（ＡＴＧからＳＴＯＰまで）を（例えば、ｃＤＮＡの形態で）含み、いくつかのかかる実施形態では、核酸は、齧歯類のＸ染色体に（例えば、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子座以外の座位で）組み込まれる。

いくつかの実施形態では、遺伝子修飾齧歯類動物は、そのゲノム中に複数の核酸を含み得、各々がヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾齧歯類動物は、そのゲノム中に、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列を含む第１の核酸であって、第１の核酸が、齧歯類ゲノム中の齧歯類Ｃｒ２遺伝子座と齧歯類Ｃｒ１ｌ遺伝子座との間に挿入される、第１の核酸と、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子の５’制御領域、及びヒトベータ－１グロビン遺伝子のポリＡシグナルを含む３’制御領域と作動可能に連結されたヒトＣＲ１ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含む第２の核酸であって、第２の核酸が、齧歯類ゲノムのＸ染色体に組み込まれる、第２の核酸と、を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子修飾齧歯類動物は、そのゲノム中に、修飾Ｃ３遺伝子を形成するための、内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座での齧歯類Ｃ３遺伝子配列のヒトＣ３遺伝子配列による置換を更に含み、齧歯類Ｃ３遺伝子配列が、内因性齧歯類Ｃ３遺伝子のエクソンを含み、ヒトＣ３遺伝子配列が、ヒトＣ３遺伝子のエクソン２～エクソン４１、又はエクソン１～エクソン４１を含む。いくつかの実施形態では、修飾Ｃ３遺伝子の発現は、ヒトＣ３プロモーターの調節下にあるか、又は内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座での齧歯類制御性要素の調節下にある。

いくつかの実施形態では、齧歯類動物は、雄である。いくつかの実施形態では、齧歯類動物は、雌である。

いくつかの実施形態では、齧歯類動物は、外因的に導入され、ゲノムに組み込まれる核酸についてヘテロ接合性である。いくつかの実施形態では、齧歯類動物は、外因的に導入され、ゲノムに組み込まれる核酸についてホモ接合性である。

いくつかの実施形態では、齧歯類動物は、マウスである。いくつかの実施形態では、齧歯類動物は、ラットである。

いくつかの実施形態では、齧歯類動物は、赤血球上にヒトＣＲ１ポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、齧歯類動物は、好中球、例えば、血液、脾臓、又は肝臓からの好中球上でヒトＣＲ１ポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、齧歯類動物は、赤血球及び好中球上にヒトＣＲ１ポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、齧歯類動物は、赤血球及び／又は好中球上に、加えて、マクロファージ、単球、又は循環樹状細胞（ｃＤＣ）のうちの１つ以上の上にヒトＣＲ１ポリペプチドを発現する。

別の態様では、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の齧歯類から単離された細胞又は組織であって、細胞又は組織のゲノムが、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、細胞又は組織である。いくつかの実施形態では、齧歯類細胞は、齧歯類の卵である。

更なる態様では、本明細書に記載されるのは、齧歯類（例えば、マウス又はラット）胚性幹（ＥＳ）細胞であって、そのゲノム中に、本明細書に記載のヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞である。いくつかの実施形態では、核酸は、ＥＳ細胞の齧歯類ゲノム中の齧歯類Ｃｒ２遺伝子座と齧歯類Ｃｒ１ｌ遺伝子座との間に挿入され、５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、並びに介在イントロンを有する、ＡＴＧからＳＴＯＰまでのヒトＣＲ１コード配列と、５’ＵＴＲのすぐ上流にある少なくとも４０００ｂｐの５’上流配列、及び３’ＵＴＲのすぐ下流にある少なくとも１５０ｂｐの配列と、を含む、ヒトゲノムＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、齧歯類ＥＳ細胞のゲノム（例えば、Ｘ染色体）に挿入され、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結された、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子の５’制御領域、及びヒトベータ－１グロビン遺伝子の３’制御領域を含む。

更に別の態様では、本明細書に開示されるのは、遺伝子修飾齧歯類動物を作製する方法であって、齧歯類ＥＳ細胞のゲノムに核酸を挿入することであって、核酸が、本明細書に記載のヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、挿入することと、取得された齧歯類ＥＳ細胞を使用して遺伝子修飾齧歯類動物を作製することと、を含む、方法である。また本明細書に開示されるのは、遺伝子修飾齧歯類ＥＳ細胞を作製する方法であって、齧歯類ＥＳ細胞のゲノムに核酸を挿入することを含み、核酸が、本明細書に記載のヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、方法である。

いくつかの実施形態では、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ配列である。

いくつかの実施形態では、核酸は、齧歯類ゲノム中の齧歯類Ｃｒ２遺伝子座と齧歯類Ｃｒ１様（Ｃｒ１１）遺伝子座との間に挿入される。いくつかの実施形態では、核酸は、例えば、齧歯類のＸ染色体へのランダムな組み込み（例えば、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子座以外の座位）を介して齧歯類ゲノムに挿入される。

いくつかの実施形態では、核酸は、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結された、ヒトＣＲ１遺伝子の５’制御領域を含む。いくつかの実施形態では、５’制御領域は、ヒトＣＲ１遺伝子のプロモーター領域を含む。いくつかの実施形態では、５’制御領域は、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結された、ヒトＣＲ１遺伝子の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含む。いくつかの実施形態では、５’制御領域は、ヒトＣＲ１遺伝子のプロモーター及び５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含む。

いくつかの実施形態では、核酸は、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結された、ヒトＣＲ１遺伝子の３’制御領域を含む。いくつかの実施形態では、３’制御領域は、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結された、ヒトＣＲ１遺伝子の３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、３’制御領域は、ヒトＣＲ１遺伝子の３’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲの下流に追加の配列を含む。

いくつかの実施形態では、核酸は、５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、並びに介在イントロンを有する、ＡＴＧからＳＴＯＰまでのヒトＣＲ１コード配列と、５’ＵＴＲのすぐ上流にある少なくとも４０００ｂｐの５’上流配列、及び３’ＵＴＲのすぐ下流にある少なくとも１５０ｂｐの配列と、を含む、ヒトゲノムＤＮＡ配列を含み、いくつかのかかる実施形態では、核酸は、齧歯類Ｃｒ２遺伝子座と齧歯類Ｃｒ１ｌ遺伝子座との間に挿入される。

いくつかの実施形態では、核酸は、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結された、異種性遺伝子（即ち、ヒトＣＲ１ではない遺伝子）の５’制御領域を含む。いくつかの実施形態では、５’制御領域は、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子の５’制御領域である。いくつかの実施形態では、５’制御領域は、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子のプロモーター領域を含む。いくつかの実施形態では、５’制御領域は、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子のＡＴＧコドンのすぐ上流に少なくとも１４Ｋｂのゲノム配列を含む。

いくつかの実施形態では、核酸は、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結された、異種性遺伝子（即ち、ヒトＣＲ１ではない遺伝子）の３’制御領域を含む。いくつかの実施形態では、３’制御領域は、異種性遺伝子の３’ＵＴＲ、例えば、ヒトベータ－１グロビン遺伝子の３’ＵＴＲ（ポリアデニル化配列を含む）を含む。

いくつかの実施形態では、核酸は、５’で、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子のＡＴＧのすぐ上流にある少なくとも１４Ｋｂのヌクレオチド配列（齧歯類Ｇａｔａ１遺伝子のプロモーターを含む）と、３’で、ヒトベータグロビン遺伝子からのポリ（Ａ）シグナルを含む３’ＵＴＲ配列と、それに続く、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子のＳＴＯＰコドンのすぐ下流にある少なくとも１．５Ｋｂのヌクレオチド配列と、作動可能に連結された、ヒトＣＲ１コード配列（ＡＴＧからＳＴＯＰまで）を（例えば、ｃＤＮＡの形態で）含み、いくつかのかかる実施形態では、核酸は、齧歯類のＸ染色体に（例えば、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子座以外の座位で）組み込まれる。

別の態様では、本明細書に開示されるのは、標的化ベクターであって、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含み、齧歯類ゲノム中の齧歯類Ｃｒ２遺伝子座と齧歯類Ｃｒ１ｌ遺伝子座との間の核酸の標的挿入のための齧歯類ヌクレオチド配列と隣接する、標的化ベクターである。

更に別の態様では、本明細書に開示されるのは、核酸ベクターであって、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子の５’制御領域と作動可能に連結されたヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、核酸ベクターである。

更なる態様では、本明細書に開示されるのは、ヒトＣＲ１又はヒト補体系の別の成分（例えば、ヒトＣ３）を標的とする化合物の薬物動態特性を評価する方法であって、本明細書に開示される遺伝子修飾齧歯類動物に候補化合物を投与することと、化合物の１つ以上の薬物動態特性を決定するためのアッセイを実施することと、を含む、方法である。

本特許又は本特許出願のファイルには、カラーで制作された図面が少なくとも１つ含まれている。カラー図面を含む本特許のコピーは、要請時及び必要料金の支払時に特許商標庁から提供されることになる。

Ｃｒ２－Ｃｒ１ｌ遺伝子座を含むマウスゲノム断片及びＣＲ１遺伝子を含むヒトゲノム断片を示し、エクソンはバーティカルバーによって示される。ヒトＣＲ１ゲノム配列によって置換される２５１ｂｐのマウス配列の位置が示される。マウス配列の欠失（対立遺伝子の喪失又はＬＯＡ）（７２３８ｍＴＵ及び７２３８ｍＴＤ）及びヒト配列の挿入（対立遺伝子の獲得又はＧＯＡ）（７２３８ｈＴＵ及び７２３８ｈＴＤ）を検出するために設計されたプライマーセット及びプローブの位置も示される。 ２５１ｂｐのマウスゲノム配列を置換することによってマウスＣｒ２遺伝子とＣｒ１ｌ 遺伝子との間に挿入されたヒトＣＲ１ゲノム配列を有する７２３８及び７２３９対立遺伝子をそれぞれ示す。ヒト配列の挿入（対立遺伝子の獲得又はＧＯＡ）（７２３８ｈＴＵ及び７２３８ｈＴＤ）を検出するために設計されたプライマーセット及びプローブの位置も示される。７２３９対立遺伝子は、７２３８対立遺伝子内の自己欠失ハイグロマイシン耐性カセットの脱離から生じる。カセットの欠失後、ｌｏｘＰ部位を含む跡が残る。 ２５１ｂｐのマウスゲノム配列を置換することによってマウスＣｒ２遺伝子とＣｒ１ｌ 遺伝子との間に挿入されたヒトＣＲ１ゲノム配列を有する７２３８及び７２３９対立遺伝子をそれぞれ示す。ヒト配列の挿入（対立遺伝子の獲得又はＧＯＡ）（７２３８ｈＴＵ及び７２３８ｈＴＤ）を検出するために設計されたプライマーセット及びプローブの位置も示される。７２３９対立遺伝子は、７２３８対立遺伝子内の自己欠失ハイグロマイシン耐性カセットの脱離から生じる。カセットの欠失後、ｌｏｘＰ部位を含む跡が残る。 ヒトＣＲ１の標的挿入についてヘテロ接合性のマウスの血液骨髄細胞集団（ＭＡＩＤ７２３９ Ｈｅｔ、又は「Ｈｅｔ」）のフローサイトメトリー分析を、７５％Ｂ６ ２５％１２９バックグラウンドを有するＷＴ対照マウス（「７５／２５ ＷＴ」）（ＭＡＩＤ ７２３９と同じ遺伝的バックグラウンドを有するが、ヒトＣＲ１の標的挿入なし）と比較した。ヒトＣＲ１は、高レベルで好中球上で、及び非常に低レベルでマクロファージ上で検出された。 ヒトＣＲ１の標的挿入についてヘテロ接合性のマウスの骨髄性脾臓細胞集団（ＭＡＩＤ ７２３９、又は「Ｈｅｔ」）のフローサイトメトリー分析を、７５％Ｂ６ ２５％１２９バックグラウンドを有するＷＴ対照マウス（「７５／２５ ＷＴ」）（ＭＡＩＤ ７２３９と同じ遺伝的バックグラウンドを有するが、ヒトＣＲ１の標的挿入なし）と比較した。ヒトＣＲ１は、高レベルで好中球上で、マクロファージ及び炎症性単球上で非常に低いレベルで検出された。 ヒトＣＲ１の標的挿入についてホモ接合性のマウスの骨髄性血球集団（ＭＡＩＤ７２３９ ＨＯ、又は「ＨＯ」）のフローサイトメトリー分析を、７５％Ｂ６ ２５％１２９バックグラウンドを有するＷＴ対照マウス（「７５／２５ ＷＴ」）（ＭＡＩＤ ７２３９と同じ遺伝的バックグラウンドを有するが、ヒトＣＲ１の標的挿入なし）と比較した。ヒトＣＲ１は、高レベルで好中球上で、中程度のレベルで循環樹状細胞（ｃＤＣ）上で、及び非常に低いレベルでマクロファージ上で検出された。 ヒトＣＲ１の標的挿入についてホモ接合性のマウスの骨髄性脾臓細胞集団（ＭＡＩＤ７２３９ ＨＯ、又は「ＨＯ」）のフローサイトメトリー分析を、７５％Ｂ６ ２５％１２９バックグラウンドを有するＷＴ対照マウス（「７５／２５ ＷＴ」）（ＭＡＩＤ ７２３９と同じ遺伝的バックグラウンドを有するが、ヒトＣＲ１の標的挿入なし）と比較した。ヒトＣＲ１は、高レベルで脾臓の好中球上で、及び非常に低いレベルで循環樹状細胞（ｃＤＣ）、マクロファージ、及び炎症性単球上で検出された。 ヒトＣＲ１の標的挿入についてホモ接合性のマウスの腹腔内のマクロファージ集団（ＭＡＩＤ７２３９ ＨＯ、又は「ＨＯ」）のフローサイトメトリー分析を、７５％Ｂ６ ２５％１２９バックグラウンドを有する野生型対照マウス（「７５／２５ＷＴ」）と比較した。大きな腹腔マクロファージは、胎児肝臓由来の単球又は卵黄嚢に由来する。小さな腹膜マクロファージは、骨髄由来の単球に由来する。調査した３匹のＭＡＩＤ７２３９ ＨＯマウスのうち１匹において、いくつかの大きな（ただし小さなものではない）腹膜マクロファージ上でｈＣＲ１が検出された。 ヒトＣＲ１の標的挿入についてホモ接合性のマウスの肝臓におけるマクロファージ集団（ＭＡＩＤ７２３９ ＨＯ、又は「ＨＯ」）のフローサイトメトリー分析を、７５％Ｂ６ ２５％１２９バックグラウンドを有する野生型対照マウス（「７５／２５ＷＴ」）と比較した。ｈＣＲ１は、ＭＡＩＤ７２３９ ＨＯマウス由来の肝臓における全ての好中球、及び約５０％の運動性マクロファージ（おそらくｃＤＣ）上で検出されたが、クッパー細胞上では検出されなかった。 Ｃ３ Ｈｕｍｉｎ（６１４９ＨＯ ７２３９ＷＴ）雄マウスと比較した、Ｃ３ Ｈｕｍｉｎ ＣＲ１ Ｈｕｍｉｎ（６１４９ＨＯ ７２３９ＨＯ）雄マウスにおける血清ＢＵＮレベルの中程度の減少を示す。＊（マウスが死亡したことを示す）で示さない限り、マウスは犠牲にした。 Ｃ３ ＨｕｍＩｎ（６１４９ＨＯ ７２３９ＷＴ）雌マウスと比較した、Ｃ３ ＨｕｍＩｎ ＣＲ１ ＨｕｍＩｎ（６１４９ＨＯ ７２３９ＨＯ）雌マウスにおける血清ＢＵＮレベルの中程度の減少を示す。＊（マウスが死亡したことを示す）で示さない限り、マウスは屠殺した。 Ｃ３ ＨｕｍＩｎ（６１４９ＨＯ ７２３９ＷＴ）マウスと比較した、Ｃ３ ＨｕｍＩｎ ＣＲ１ ＨｕｍＩｎ（６１４９ＨＯ ７２３９ＨＯ）マウスにおけるｈＣ３血清レベルの有意な改善の欠如を示す。公表されている正常なヒト血清中のＣ３濃度は、約１２００μｇ／ｍｌである。水平バーは中央値を表す。 Ｃ３ ＨｕｍＩｎ ＣＲ１ ＨｕｍＩｎ（６１４９ＨＯ ７２３９ＨＯ）マウスが、Ｃ３ ＨｕｍＩｎ（６１４９ＨＯ ７２３９ＷＴ）マウスと比較してヒトｉＣ３ｂ血清レベルに変化を示さないことを示す。Ｃ３：ｉＣ３ｂの比率は、正常ヒト血清（ＮＨＳ）と６１４９ＨＯ ７２３９ＷＴ血清との間で類似していることが見出された。 Ｃ３ ＨｕｍＩｎ（６１４９ＨＯ ７２３９ＷＴ）マウスと比較して、Ｃ３ ＨｕｍＩｎ ＣＲ１ ＨｕｍＩｎ（６１４９ＨＯ ７２３９ＨＯ）マウスにおける肝臓損傷の増悪を示すが、腎臓損傷の改善を示す。 Ｃ３ ＨｕｍＩｎ（６１４９ＨＯ ７２３９ＷＴ）マウスと比較して、Ｃ３ ＨｕｍＩｎ ＣＲ１ ＨｕｍＩｎ（６１４９ＨＯ ７２３９ＨＯ）マウスにおける体重増加のわずかな改善を示す。Ｃ３ ＨｕｍＩｎ ＣＲ１ ＨｕｍＩｎ及びＣ３ ＨｕｍＩｎマウスはいずれも、７５／２５ＷＴ対照と比較して、年齢と共に体重増加に失敗した。 Ｃ３ ＨｕｍＩｎ（６１４９ＨＯ ７２３９ＷＴ）マウスと比較して、Ｃ３ ＨｕｍＩｎ ＣＲ１ ＨｕｍＩｎ（６１４９ＨＯ ７２３９ＨＯ）マウスにおける血清ＢＵＮレベルのわずかな減少を示す。Ｃ３ ＨｕｍＩｎ ＣＲ１ ＨｕｍＩｎ（６１４９ＨＯ ７２３９ＨＯ）及びＣ３ ＨｕｍＩｎ（６１４９ＨＯ ７２３９ＷＴ）マウスはいずれも、７２／２５ＷＴ対照と比較して、血清ＢＵＮレベルが上昇した。 Ｃ３ ＨｕｍＩｎ（６１４９ＨＯ ７２３９ＷＴ）マウスと比較して、Ｃ３ ＨｕｍＩｎ ＣＲ１ ＨｕｍＩｎ（６１４９ＨＯ ７２３９ＨＯ）マウスにおける改善された生存を示す。 マウスＧａｔａ１遺伝子座を示し、エクソンはバーティカルボックスで表される。欠失され、ヒトＣＲ１コード配列によって置換される６７２ｂｐのマウスゲノム配列の位置が示される。マウス配列の欠失（対立遺伝子の喪失又はＬＯＡ）を検出するため（７５０２ｍＴＵ及び７５０２ｍＴＤ）、マウスＧａｔａ１プロモーターの存在を確認するため（７５０２ｍＰＵ及び７５０２ｍＰＵ２）、及びマウスＧａｔａ１配列の保持のため（７５０２ｍｒｅｔＵ及び７５０２ｍｒｅｔＤ）に設計されたプライマーセット並びにプローブの位置も示される。 マウスＧａｔａ１プロモーター－ヒトＣＲ１コード配列がランダムに組み込まれ、自己欠失ネオマイシン耐性カセットを含む、７５０２対立遺伝子を示す。完全長のヒトＣＲ１コード配列（ＡＴＧから ＳＴＯＰ、６１１７ｂｐ）は、ＡＴＧ開始コドンの直後のマウスコードエクソン１配列とそれに続くマウスイントロンを含む６７２ｂｐのＧａｔａ１が置換されるように、Ｇａｔａ１ゲノム配列を含むマウスバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）に挿入した。マウスＢＡＣは、Ｇａｔａ１ ＡＴＧの上流に７Ｋｂを超える配列を含み、Ｇａｔａ１ＳＴＯＰコドンの下流に１．５Ｋｂを超える配列を含むように選択された。ヒトベータ－１グロビン遺伝子由来のポリ（Ａ）シグナル（１３５ｂｐ、配列番号４）を含む３’ＵＴＲ配列は、ヒトＣＲ１ＳＴＯＰの直後に、続いて自己欠失ネオマイシン耐性カセット（４８１０ｂｐ）が挿入された。ヒト配列の獲得を検出するため（７５０２ｈＴＵ及び７５０２ｈＴＤ）、マウスＧａｔａ１プロモーターの存在を確認するため（７５０２ｍＰＵ及び７５０２ｍＰＵ２）、及びマウスＧａｔａ１配列の保持のため（７５０２ｍｒｅｔＵ及び７５０２ｍｒｅｔＤ）に設計されたプライマーセット並びにプローブの位置も示される。 図４Ｂに示される７５０２対立遺伝子からのカセット欠失に起因する７５０３対立遺伝子を示す。カセットの欠失後、ｌｏｘＰ部位を含む７８ｂｐの跡が残る。 ７５／２５ＷＴ、７５０３ＨＥＴ雌、７５０３ＨＥＴ雄、及び７５０３ＨＯ雌由来の末梢血ＲＢＣ上のヒトＣＲ１のレベルを示す。ＭＡＩＤ７５０３ ＨＥＴ雄及びＨＯ雌マウスは、ＣＲ１ ＦＭＯ対照（アイソタイプ対照の代わりに）と比較して、同様のレベルのｈＣＲ１発現（７５０３ＨＥＴ雌で見られるよりも高い）を示す。全てのプロットは、Ｔｅｒ１１９＋マウスＲＢＣ上でゲーティングされた。 ＣＲ１ ＦＭＯ対照（アイソタイプ対照の代わりに）と比較した、７５／２５ＷＴ、７５０３ＨＥＴ雌、７５０３ＨＥＴ雄、及び７５０３ＨＯ雌の溶解血液由来の細胞集団上のヒトＣＲ１のレベルを示す。ＭＡＩＤ７５０３ ＨＥＴ雄及びＨＯ雌マウスは、いくらかのｈＣＲ１発現を示す（７５０３ＨＥＴ雌で見られるよりも高い）。 ＣＲ１ ＦＭＯ対照（アイソタイプ対照の代わりに）と比較した、７５／２５ＷＴ、７５０３ＨＥＴ雌、７５０３ＨＥＴ雄、及び７５０３ＨＯ雌の脾臓由来の細胞集団上のヒトＣＲ１のレベルを示す。ＭＡＩＤ７５０３ ＨＥＴ雄及びＨＯ雌マウスは、いくらかのｈＣＲ１発現を示す（７５０３ＨＥＴ雌で見られるよりも高い）。 ＣＲ１ ＦＭＯ対照（アイソタイプ対照の代わりに）と比較して、ヒト末梢血ＲＢＣ、好中球、及び単球上のヒトＣＲ１発現がＣＲ１を発現することを示す。 ＣＲ１ ＦＭＯ対照（アイソタイプ対照の代わりに）と比較した、７５／２５ＷＴ、Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（Ｇａｔａ１－ＣＲ１）１Ｒｗｆ／Ｊ雌、７５０３ＨＯ雌由来の末梢血ＲＢＣ上のヒトＣＲ１のレベルを示す。ＲＢＣは、ヒトＲＢＣと比較して同様のレベルのｈＣＲ１発現を示す（ＭＡＩＤ７５０３ ＨＯ ＲＢＣと同様）。 ＣＲ１ ＦＭＯ対照（アイソタイプ対照の代わりに）と比較した、７５／２５ＷＴ、Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（Ｇａｔａ１－ＣＲ１）１Ｒｗｆ／Ｊ雌、７５０３ＨＯ雌由来の末梢血の細胞集団上のヒトＣＲ１のレベルを示す。Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（Ｇａｔａ１－ＣＲ１）１Ｒｗｆ／Ｊ血液好中球は、ヒト血液好中球及び単球とは対照的に、非常に低いレベルのｈＣＲ１を発現する。

本明細書に開示されるのは、ゲノム中に組み込まれたヒトＣＲ１コード配列を含む核酸を含み、ヒトＣＲ１タンパク質のヒト様発現を示すような遺伝子修飾された齧歯類（例えば、マウス及びラット）である。また本明細書に開示されるのは、そのゲノムがヒトＣＲ１タンパク質をコードする核酸を含む、単離齧歯類組織及び細胞である。更に本明細書に開示されるのは、ヒトＣＲ１タンパク質のヒト様発現を示す遺伝子修飾齧歯類動物を作製するためのベクター及び方法、並びにヒトＣＲ１又はヒト補体系の別の成分（例えば、ｈｍａｎ Ｃ３）を標的とする候補化合物をスクリーニングするために遺伝子修飾齧歯類動物を使用する方法である。様々な態様及び実施形態が以下に更に記載される。

ヒトＣＲ１／ＣＤ３５
ヒトＣＲ１（ＣＤ３５としても知られる）は、ヒトＣＲ１遺伝子によってコードされ、補体被覆微生物表面及び粒子付着における機能を認識することが知られている。ＣＲ１は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂオプソニン化ＩＣをヒト赤血球に結合することによって、免疫複合体（ＩＣ）輸送／免疫付着クリアランスで機能し、それらを肝臓及び脾臓に輸送して、食細胞による取込み及び分解を行う。

ヒトＣＲ１は、約２００ｋＤａの１型膜貫通タンパク質であり、それが赤血球上に存在することに加えて、好中球、単球／マクロファージ、Ｂ細胞、一部のＴ細胞、濾胞性ＤＣ、糸球体ポドサイト、好酸球、マスト細胞、及びＮＫ細胞上にも見られる。ＣＲ１分子の数は、赤血球の老化と共に減少する。

ＣＲ１に加えて、ヒトにおいてはＣＲ２遺伝子も存在し、ＣＲ２／ＣＤ２１タンパク質をコードする。

マウスは、ヒトＣＲ１の機能的又は構造的相同体を有しないが、ＣＲ１様遺伝子、例えば、ヒトＣＲ１と１０％の配列同一性を共有するＣｒ１ｌタンパク質をコードするＣｒｒｙ遺伝子（別名Ｃｒ１様又はＣｒ１ｌ）、及びヒトＣＲ１と１７％の配列同一性を共有するＣｒ２タンパク質をコードするＣｒ２遺伝子を有する。マウスＣｒ２及びＣｒ１様タンパク質は、Ｂ細胞、濾胞性ＤＣ、腹膜マクロファージ、活性化顆粒球、及び血小板上で発現されるが、赤血球上では発現されない。マウスと同様に、ラットもＣｒ１ｌ遺伝子及びＣｒ２遺伝子を有する。

ヒトＣＲ１遺伝子は、ヒト染色体１上に位置し、例示的なゲノム配列は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号１３７８の下に見出すことができる。マウスＣｒ１ｌ及びＣｒ２遺伝子は、マウス染色体１上に位置し、これらの遺伝子の例示的なゲノム配列は、それぞれＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号１２９４６及び１２９０２の下に見出すことができる。ラットＣｒ１ｌ及びＣｒ２遺伝子は、ラット染色体１３上に位置し、これらの遺伝子の例示的なゲノム配列は、それぞれＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号５４２４３及び２８９３９５の下に見出すことができる。ＲｅｆＳｅｑ ｍＲＮＡ ＩＤ及びタンパク質ＩＤの例が以下の表１に列挙される。

ヒトＣＲ１を発現する遺伝子修飾動物
一態様では、本明細書に提供されるのは、遺伝子修飾齧歯類動物（例えば、マウス又はラット）であって、外因的に導入された核酸を含み、齧歯類ゲノム（即ち、齧歯類生殖系列）に組み込まれ、齧歯類におけるヒトＣＲ１ポリペプチドの発現をヒトと同様の方法で指示する、遺伝子修飾齧歯類動物である。

外因的に導入された核酸は、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された、５’制御領域及び／又は３’制御領域も含む。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、中でもレポーター遺伝子及び選択マーカー遺伝子などの追加の要素を含む。

「作動可能に連結」という用語には、機能的関係にある核酸要素の連結が含まれる。核酸配列は、他の核酸配列との機能的関係に置かれた場合に「作動可能に連結」している。例えば、プロモーター又はプロモーターを含む５’制御領域は、プロモーター又は５’制御領域がコード配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結しているとみなされる。

本明細書で使用される「５’制御領域」及び「３’制御領域」という用語は、遺伝子の５’上流領域及び３’下流領域に見られる制御要素を含む。「制御要素」という用語には転写調節配列が含まれ、これには５’転写制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、及びサプレッサー要素）及び３’転写制御配列（例えば、転写終結配列）が含まれる。また、「制御要素」という用語には、転写の効率や転写の安定性、更に翻訳の開始にも影響を与え得る、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）及び３’ＵＴＲにおける制御配列も含まれる。

ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
いくつかの実施形態では、齧歯類ゲノムに組み込まれる核酸は、配列番号２と実質的に同一のアミノ酸配列を含むヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。

所与のアミノ酸配列を、参照配列と「実質的に同一である」と言及する場合、所与のアミノ酸配列が、参照配列に少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９８．５％同一、少なくとも９９％同一、又は少なくとも９９．５％同一である実施形態を含み、例えば、所与のアミノ酸配列は、参照配列と１個、２個、３個、４個、又は５個のアミノ酸、又は５個、４個、３個、２個、若しくは１個以下のアミノ酸（複数可）だけ異なる。差異は、所与の分子に対して天然に存在する多型を表し得る。

いくつかの実施形態では、ヒトＣＲ１ポリペプチドは、配列番号２と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＣＲ１ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ配列である（即ち、イントロン配列を有する）。いくつかの実施形態では、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ配列である（即ち、イントロン配列を含まない）。本明細書での使用に好適なヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の例には、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ １３７８でＧｅｎＢａｎｋに記載されているゲノムＤＮＡ配列、及び受入番号ＮＭ＿０００５７３．４（配列番号１）でＧｅｎＢａｎｋに記載されているｃＤＮＡ配列が含まれる。

いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列のいずれかである、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ヒトＣＲ１遺伝子のＡＴＧ開始コドンから始まりＳＴＯＰコドンで終わるコード配列を含む。

５’及び３’制御領域
いくつかの実施形態では、齧歯類ゲノムに外因的に導入され、組み込まれる核酸は、核酸に含まれるヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結された５’制御領域を更に含むことができる。

いくつかの実施形態では、齧歯類ゲノムに外因的に導入され、組み込まれる核酸は、ヒトＣＲ１コードヌクレオチド配列と作動可能に連結された５’制御領域を含む。

いくつかの実施形態では、５’制御領域は、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含む。いくつかの実施形態では、５’制御領域は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ １３７８又は受入番号ＮＭ＿０００５７３．４でＧｅｎＢａｎｋに記載されているヒトＣＲ１遺伝子の５’ＵＴＲなどの、ヒトＣＲ１遺伝子の５’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、５’制御領域は、異種性遺伝子、即ち、例えば、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子などのヒトＣＲ１遺伝子ではない遺伝子の５’ＵＴＲを含む。

いくつかの実施形態では、５’制御領域は、プロモーター及び／又はエンハンサーなどの転写制御要素を含む。いくつかの実施形態では、５’制御領域は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ １３７８でＧｅｎＢａｎｋに記載されているヒトＣＲ１遺伝子などのヒトＣＲ１遺伝子の５’ＵＴＲの上流にヌクレオチド配列（プロモーター領域を含む）を含む。いくつかの実施形態では、５’制御領域は、ヒトＣＲ１遺伝子の５’ＵＴＲのすぐ上流にあり、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも２０００ｂｐ、少なくとも２５００ｂｐ、少なくとも３０００ｂｐ、少なくとも３５００ｂｐ、少なくとも４０００ｂｐ、少なくとも４５００ｂｐ、少なくとも５０００ｂｐ、少なくとも６０００ｂｐ、少なくとも７０００ｂｐ、少なくとも８０００ｂｐ、少なくとも９０００ｂｐ、少なくとも １０，０００ｂｐ、又はそれより長い（例えば、最大１５Ｋｂ～２０Ｋｂ）長さであるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、５’制御領域は、ヒトＣＲ１遺伝子の５’ＵＴＲのすぐ上流にあり、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ １３７８でＧｅｎＢａｎｋに記載されているヒトＣＲ１遺伝子の５’ＵＴＲの上流の４２３３ｂｐの配列（配列番号 ３）など、少なくとも４０００ｂｐの長さである、ヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、５’制御領域は、異種性遺伝子、即ち、ヒトＣＲ１遺伝子とは異なる遺伝子の５’ＵＴＲの上流にヌクレオチド配列（プロモーター領域を含む）を含む。いくつかの実施形態では、異種性遺伝子は、赤血球で発現を現す齧歯類遺伝子、例えば、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子である。いくつかの実施形態では、５’制御領域は、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子のプロモーターを含む、齧歯類（例えば、マウス）Ｇａｔａ－１遺伝子の５’ＵＴＲの上流に配列を含む。いくつかの実施形態では、例えば、５’制御領域は、少なくとも７０００ｂｐ、少なくとも８０００ｂｐ、少なくとも９０００ｂｐ、少なくとも１０，０００ｂｐ、少なくとも１１，０００ｂｐ、少なくとも１２，０００ｂｐ、少なくとも１３，０００ｂｐ、少なくとも１４，０００ｂｐ、又はそれより長い長さである、齧歯類（例えば、マウス）Ｇａｔａ－１遺伝子の５’ＵＴＲのすぐ上流にある配列を含む。いくつかの実施形態では、５’制御領域は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ １４４６０でＧｅｎＢａｎｋに記載されているマウスＧａｔａ－１遺伝子の５’ＵＴＲの上流にある配列を含む。いくつかの実施形態では、５’制御領域は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ １４４６０でＧｅｎＢａｎｋに記載されているマウスＧａｔａ－１遺伝子の５’ＵＴＲのすぐ上流にあり、少なくとも７０００ｂｐ、少なくとも８０００ｂｐ、少なくとも９０００ｂｐ、少なくとも１０，０００ｂｐ、少なくとも１１，０００ｂｐ、少なくとも１２，０００ｂｐ、少なくとも１３，０００ｂｐ、少なくとも１４，０００ｂｐ、少なくとも１５，０００ｂｐ、少なくとも１６，０００ｂｐ、少なくとも１７，０００ｂｐ、少なくとも１８，０００ｂｐ、少なくとも１９，０００ｂｐ、少なくとも２０，０００ｂｐ、又はそれより長い（例えば、最大２５～３５Ｋｂ）長さである配列を含む。

いくつかの実施形態では、齧歯類ゲノムに外因的に導入され、組み込まれる核酸は、核酸に含まれるヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結された３’制御領域を更に含むことができる。

いくつかの実施形態では、３’制御領域は、３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、３’制御領域は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ １３７８又は受入番号ＮＭ＿０００５７３．４でＧｅｎＢａｎｋに記載されているヒトＣＲ１遺伝子の３’ＵＴＲなどの、ヒトＣＲ１遺伝子の３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、３’制御領域は、異種性遺伝子、即ち、例えば、ヒトベータ－１グロビン遺伝子などのヒトＣＲ１遺伝子ではない遺伝子の３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、３’制御領域は、配列番号４に記載されているヒトベータ－１グロビン遺伝子の３’ＵＴＲ配列（ポリアデニル化シグナルを含む）を含む。

いくつかの実施形態では、３’制御領域は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ １３７８でＧｅｎＢａｎｋに記載されているヒトＣＲ１遺伝子などのヒトＣＲ１遺伝子の３’ＵＴＲの下流に配列を含む。いくつかの実施形態では、３’制御領域は、ヒトＣＲ１遺伝子の３’ＵＴＲのすぐ上流にあり、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも１５０ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも７５０ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、又はそれより長い（例えば、最大２５００～４０００ｂｐ）長さであるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、３’制御領域は、ヒトＣＲ１遺伝子の３’ＵＴＲのすぐ下流にあり、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ １３７８でＧｅｎＢａｎｋに記載されているヒトＣＲ１遺伝子の３’ＵＴＲのすぐ下流の１５９ｂｐ（配列番号４１）など、少なくとも１５０ｂｐの長さである、ヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、３’制御領域は、異種性遺伝子の３’ＵＴＲの下流に配列を含む。いくつかの実施形態では、異種性遺伝子は、赤血球で発現を現す齧歯類遺伝子、例えば、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子である。いくつかの実施形態では、３’制御領域は、齧歯類（例えば、マウス）Ｇａｔａ－１遺伝子の３’ＵＴＲの下流に配列を含む。いくつかの実施形態では、３’制御領域は、少なくとも２５０ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも２０００ｂｐ、少なくとも３０００ｂｐ、又はそれより長い長さである、齧歯類（例えば、マウス）Ｇａｔａ－１遺伝子の３’ＵＴＲのすぐ下流にある配列を含む。いくつかの実施形態では、３’制御領域は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ １４４６０でＧｅｎＢａｎｋに記載されているマウスＧａｔａ－１遺伝子の３’ＵＴＲの下流にある配列を含む。いくつかの実施形態では、３’制御領域は、少なくとも２５０ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも２０００ｂｐ、少なくとも３０００ｂｐ、又はそれより長い（例えば、最大４０００～６０００ｂｐ）長さである、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ １４４６０でＧｅｎＢａｎｋに記載されているマウスＧａｔａ－１遺伝子の３’ＵＴＲのすぐ下流にある配列を含む。

外因的に導入された核酸の実施形態
いくつかの実施形態では、齧歯類ゲノム中に外因的に導入され、組み込まれた核酸は、５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、並びに介在イントロンを有する、ＡＴＧからＳＴＯＰまでのヒトＣＲ１コード配列全体と、５’ＵＴＲのすぐ上流にある少なくとも４０００ｂｐの５’上流配列、及び３’ＵＴＲのすぐ下流にある少なくとも１５０ｂｐの配列と、を含む、ヒトゲノムＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、齧歯類ゲノム中に組み込まれた核酸は、５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、並びに介在イントロンを有する、ＡＴＧからＳＴＯＰまでのヒトＣＲ１コード配列全体と、５’ＵＴＲのすぐ上流にある４２３３ｂｐの追加の配列、及び３’ＵＴＲのすぐ下流にある１５９ｂｐの配列と、を含む、ヒトゲノムＤＮＡ配列を含む。

いくつかの実施形態では、齧歯類ゲノム中に外因的に導入され、組み込まれた核酸は、５’で、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子のＡＴＧのすぐ上流にある少なくとも１４Ｋｂのヌクレオチド配列（齧歯類Ｇａｔａ１遺伝子のプロモーターを含む）と、３’で、ヒトベータグロビン遺伝子からのポリ（Ａ）シグナルを含む３’ＵＴＲ配列と、それに続く、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子のＳＴＯＰコドンのすぐ下流にある少なくとも１．５Ｋｂのヌクレオチド配列と、作動可能に連結された、ヒトＣＲ１コード配列（ＡＴＧからＳＴＯＰまで）を（例えば、ｃＤＮＡの形態で）含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子修飾齧歯類動物（例えば、マウス又はラット）は、齧歯類ゲノム中に組み込まれた複数（即ち、２つ以上）の外因的に導入された核酸を含み、各核酸は、上述の核酸のうちのいずれかであり、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードする。かかる齧歯類動物は、齧歯類ゲノム中に組み込まれた１つの核酸を含む齧歯類動物を交雑（即ち、交配）することによって作製することができる。

齧歯類ゲノムにおける外因的に導入された核酸の位置
いくつかの実施形態では、核酸は、齧歯類ゲノム中の選択された部位に組み込まれる。特定の部位への組み込みは、部位への標的挿入のために特異的に設計された核酸構築物を利用することによって達成することができる。いくつかの実施形態では、ヒトＣＲ１コード配列を含む核酸は、齧歯類Ｃｒ２遺伝子座と齧歯類Ｃｒ１ｌ遺伝子座との間の齧歯類ゲノム、即ち、齧歯類Ｃｒ２遺伝子の３’ＵＴＲからの３’（下流）の位置、及び齧歯類Ｃｒ１ｌ遺伝子の５’ＵＴＲまでの５’（上流）の位置で、組み込まれる。いくつかの実施形態では、核酸は、齧歯類Ｃｒ２遺伝子の３’ＵＴＲから３０００ｂｐ以下、２５００ｂｐ以下、２０００ｂｐ以下、１５００ｂｐ以下、１２５０ｂｐ以下、又は１０００ｂｐ以下の下流の位置で齧歯類ゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、核酸は、齧歯類Ｃｒ２遺伝子の３’ＵＴＲから約９００ｂｐ下流で齧歯類ゲノム中に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、齧歯類Ｃｒ２遺伝子座と齧歯類Ｃｒ１ｌ遺伝子座との間の齧歯類ゲノム中に組み込まれる核酸は、５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、並びに介在イントロンを有する、ＡＴＧからＳＴＯＰまでのヒトＣＲ１コード配列全体と、５’ＵＴＲのすぐ上流にある少なくとも４０００ｂｐの５’上流配列、及び３’ＵＴＲのすぐ下流にある少なくとも１５０ｂｐの配列と、を含む、ヒトゲノムＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、齧歯類Ｃｒ２遺伝子座と齧歯類Ｃｒ１ｌ遺伝子座との間の齧歯類ゲノム中に組み込まれた核酸は、５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、並びに介在イントロンを有する、ＡＴＧからＳＴＯＰまでのヒトＣＲ１コード配列全体と、５’ＵＴＲのすぐ上流にある４２２３ｂｐの追加の配列、及び３’ＵＴＲのすぐ下流にある１５９ｂｐの配列と、を含む、ヒトゲノムＤＮＡ配列を含む。

いくつかの実施形態では、核酸は、齧歯類ゲノム中の１つ以上の部位にランダムに組み込まれる。ランダムな組み込みの場合、核酸の複数のコピーは、齧歯類ゲノムの複数の部位で組み込まれ得るか、又は代替的に、核酸の複数のコピーは、ゲノムの１つの遺伝子座にタンデムに組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードする核酸の１つのコピーのみが、齧歯類ゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、核酸は、齧歯類ゲノムのＸ染色体へのランダムな組み込みを通して組み込まれる。いくつかの実施形態では、核酸の１つのコピーのみが、齧歯類ゲノムのＸ染色体へのランダムな組み込みを通して組み込まれる。いくつかの実施形態では、核酸の１つのコピーは、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子座ではないＸ染色体の遺伝子座へのランダムな組み込みによって組み込まれる。

いくつかの実施形態では、齧歯類ゲノム中にランダムに組み込まれる核酸は、５’で、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子のＡＴＧのすぐ上流にある少なくとも１４Ｋｂのヌクレオチド配列（齧歯類Ｇａｔａ１遺伝子プロモーターを含む）と、３’で、ヒトベータグロビン遺伝子からのポリ（Ａ）シグナルを含む３’ＵＴＲ配列と、それに続く、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子のＳＴＯＰコドンのすぐ下流にある少なくとも１．５Ｋｂのヌクレオチド配列と、作動可能に連結された、ヒトＣＲ１コード配列（ＡＴＧからＳＴＯＰまで）を（例えば、ｃＤＮＡの形態で）含み、いくつかのかかる実施形態では、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードする核酸の１つのコピーは、齧歯類ゲノムのＸ染色体へのランダムな組み込みを通じて組み込まれ、例えば、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子座ではない遺伝子座に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、遺伝子修飾齧歯類動物齧歯類は、齧歯類ゲノム中の特定の部位に組み込まれたヒトＣＲ１ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列を含む第１の核酸と、齧歯類ゲノム中にランダムに組み込まれたヒトＣＲ１ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含む第２の核酸と、を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾齧歯類動物は、齧歯類ゲノム中の齧歯類Ｃｒ２遺伝子座と齧歯類Ｃｒ１ｌ遺伝子座との間に組み込まれた第１の核酸と、齧歯類ゲノム中のＸ染色体上の遺伝子座に組み込まれた第２の核酸と、を含み、いくつかのかかる実施形態では、第１の核酸は、５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、並びに介在イントロンを有する、ＡＴＧからＳＴＯＰまでのヒトＣＲ１コード配列全体と、５’ＵＴＲのすぐ上流にある少なくとも４０００ｂｐ（例えば、４２２３ ｂｐの配列）の５’上流配列、及び３’ＵＴＲのすぐ下流にある少なくとも１５０ｂｐ（例えば、１５９ ｂｐの配列）の配列と、を含む、ヒトゲノムＤＮＡ配列を含み、第２の核酸は、５’で、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子のＡＴＧのすぐ上流にある少なくとも１４Ｋｂのヌクレオチド配列（齧歯類Ｇａｔａ１遺伝子プロモーターを含む）と、３’で、ヒトベータグロビン遺伝子からのポリ（Ａ）シグナルを含む３’ＵＴＲ配列と、それに続く、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子のＳＴＯＰコドンのすぐ下流にある少なくとも１．５Ｋｂのヌクレオチド配列と、作動可能に連結された、ヒトＣＲ１コード配列（ＡＴＧからＳＴＯＰまで）を（例えば、ｃＤＮＡの形態で）を含む。

ヘテロ接合性／ホモ接合性、性別及び系統的バックグラウンド
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾齧歯類動物は、齧歯類ゲノム中に外因的に導入され、組み込まれる核酸に関してヘテロ接合性である。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾齧歯類動物は、齧歯類ゲノム中に外因的に導入され、組み込まれる核酸に関してホモ接合性である。遺伝子修飾齧歯類動物が、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を各々含む複数の核酸を含む実施形態では、齧歯類動物は、１つの核酸についてヘテロ接合性又はホモ接合性であり、別の核酸について独立してヘテロ接合性又はホモ接合性であり得る。

いくつかの実施形態では、遺伝子修飾齧歯類動物は、雄動物である。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾齧歯類動物は、雌動物である。

いくつかの実施形態では、齧歯類は、マウスである。いくつかの実施形態では、齧歯類は、Ｃ５７ＢＬ系統、例えば、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、及びＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウスである。他の実施形態では、齧歯類は、１２９系統、例えば、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９／ＳｖＪａｅ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２から成る群から選択される１２９系統のマウスである（例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ １０：８３６； Ａｕｅｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２９（５）：１０２４－１０２８，１０３０，１０３２を参照されたい）。いくつかの実施形態では、齧歯類は、前述の１２９系統及び前述のＣ５７ＢＬ／６系統を混合したマウスである。特定の実施形態では、マウスは、前述の１２９系統の混合（すなわち、交雑）、又は前述のＣ５７ＢＬ系統の混合、又はＣ５７ＢＬ系統及び１２９系統の混合である。特定の実施形態では、マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６系統と１２９系統の混合である。特定の実施形態では、マウスは、ＶＧＦ１系統であり、これは、Ｃ５７ＢＬ／６及び１２９の交雑であるＦ１Ｈ４系統としても知られる。他の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統、例えばＢＡＬＢ／ｃ系統である。いくつかの実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統及び別の前述の系統の混合である。

いくつかの実施形態では、齧歯類は、ラットである。特定の実施形態では、ラットは、Ｗｉｓｔａｒラット、ＬＥＡ系統、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ系統、Ｆｉｓｃｈｅｒ系統、Ｆ３４４、Ｆ６、及びＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉから選択される。他の実施形態では、ラットは、Ｗｉｓｔａｒ、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆ３４４、Ｆ６、及びＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉから成る群から選択される２つ以上の系統の混合である。

遺伝子修飾齧歯類動物におけるヒトＣＲ１のヒト様発現
本明細書に提供される遺伝子修飾齧歯類動物は、ヒトＣＲ１をヒト様発現パターンで発現する。「ヒト様」発現パターンとは、ヒトＣＲ１ポリペプチドが、ヒトにおけるヒトＣＲ１を発現するヒト細胞の特徴を齧歯類の細胞で発現されることを意味する。例えば、ヒトＣＲ１は、他の細胞の中でも特に、ヒトにおいて赤血球及び好中球上に発現され、一方でマウスＣｒ２タンパク質は、マウスにおいて好中球上に発現されないが、マウスＣｒ１様タンパク質は、赤血球を含む全てのマウス細胞上に発現される。したがって、いくつかの実施形態では、ヒト様発現パターンは、齧歯類における赤血球上のヒトＣＲ１の発現を含む。いくつかの実施形態では、ヒト様発現パターンは、齧歯類における好中球上、例えば、血液、脾臓、及び／又は肝臓に見られる好中球上でのヒトＣＲ１の発現を含む。いくつかの実施形態では、ヒト様発現パターンは、齧歯類における赤血球及び好中球上、例えば、血液、脾臓、及び／又は肝臓に見られる好中球上でのヒトＣＲ１の発現を含む。いくつかの実施形態では、ヒト様発現パターンは、赤血球及び／又は好中球に加えて、マクロファージ（例えば、血液中のマクロファージ、大きな腹腔マクロファージ、脾臓におけるマクロファージ、肝臓における運動性マクロファージ）、単球（炎症性及び／又は常在性単球）、及び循環樹状細胞（ｃＤＣ）のうちの１つ以上の齧歯類におけるヒトＣＲ１の発現を含む。

遺伝子修飾齧歯類における他の遺伝子修飾
ゲノム中に組み込まれたヒトＣＲ１ポリペプチド修飾Ｃ３遺伝子をコードする核酸を含むことに加えて、遺伝子修飾齧歯類は、他の遺伝子修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子修飾齧歯類は、そのゲノム中に、例えば、米国特許第９，７９５，１２１ Ｂ１号（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）に記載され、その全体が本明細書に組み込まれるように、修飾Ｃ３遺伝子を形成するためのＣ３遺伝子のエクソンを含む齧歯類遺伝子配列の内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座における、ヒトＣ３遺伝子の少なくとも１つのエクソンを含む核酸配列による置換も含む。

いくつかの実施形態では、ヒトＣ３遺伝子の少なくとも１つのエクソンを含む核酸配列は、ヒトＣ３遺伝子のコードエクソン１からコードエクソン４１を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＣ３遺伝子の少なくとも１つのエクソンを含む核酸配列は、５’制御要素、及びヒトＣ３遺伝子のコードエクソン１からコードエクソン４１を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＣ３遺伝子の少なくとも１つのエクソンを含む核酸配列は、ヒトＣ３遺伝子のコードエクソン２からコードエクソン４１を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子修飾齧歯類は、マウスであり、そのゲノムは、５’制御要素、及び内因性マウスＣ３遺伝子のコードエクソン１から４１の全てを含むマウスＣ３ゲノム配列の、５’制御要素、及びヒトＣ３遺伝子のコードエクソン１から４１の全てを含むヒトＣ３ゲノム配列による置換を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾齧歯類は、マウスであり、そのゲノムは、内因性マウスＣ３遺伝子のコードエクソン２から４１を含むマウスＣ３ゲノム配列の、ヒトＣ３遺伝子のコードエクソン２から４１を含むヒトＣ３ゲノム配列による置換を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子修飾齧歯類は、内因性齧歯類Ｃ３タンパク質を発現しない。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾齧歯類は、内因性齧歯類Ｃ５タンパク質を発現する。

ヒトＣ３をコードする修飾Ｃ３遺伝子を含む遺伝子修飾齧歯類動物は、米国特許第１０，７６５，７６２号（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）に記載されているように、高い自然死率を有し、更に、補体関連腎症に類似する生理学的、形態学的、及び組織学的症状、並びに肝線維症と一致する症状を呈する。この開示によれば、ヒトＣＲ１ポリペプチドの発現は、齧歯類中の修飾Ｃ３遺伝子から発現されるヒトＣ３に起因する、腎臓への損傷及び補体関連腎症の症状を改善することができる。補体関連腎症は、（ｉ）糸球体腎炎、好塩基性尿細管、硬化性糸球体、タンパク質キャストを伴う拡張尿細管、メサンギウム基質拡張、糸球体肥大、単核間質性炎症のうちの１つ以上、（ｉｉ）腎臓におけるＣ３タンパク質堆積、（ｉｉｉ）腎臓における Ｃ５ｂ－９膜侵襲複合体の堆積、（ｉｖ）血中尿素窒素（ＢＵＮ）、血清リパーゼ、血清シスタチンＣ、若しくは血清非高密度リポタンパク質の１つ以上の上昇、（ｖ）尿中アルブミン若しくはＣ５ａの増加、（ｖｉ）自然死、（ｖｉｉ）体重の減少、骨密度の減少、及び／若しくは体脂肪の減少、又は（ｉ）～（ｖｉｉ）のいずれか１つの組み合わせから選択される１つ以上の症状により反映され得る。当業者は、関連するパラメータ又は症状の変化があれば、その変化を容易に評価し、変化が、ヒトＣＲ１発現の結果として、かつヒトＣＲ１発現を伴わない適切な対照齧歯類と比較して、齧歯類における腎症の改善を構成するために統計的に有意であるかを決定することができる。

ヒトＣＲ１を発現する齧歯類を作製する核酸ベクター及び方法
標的挿入のための標的化ベクター
ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む外因的に導入された核酸を含む齧歯類は、様々な方法を使用して作製することができる。いくつかの実施形態では、標的化核酸構築物（即ち、標的化ベクター）は、所望の核酸を担持するように構築される。本明細書で使用される「標的化ベクター」という用語は、齧歯類ゲノムの標的遺伝子座に挿入されるベクター上に担持される核酸を有するように設計されたベクターを指す。

標的化ベクター上に担持される核酸は、本明細書に記載される核酸のいずれかであり得る。サイズに応じ（例えば、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡのどちらが使用されるか）、核酸は、ｃＤＮＡ源から直接クローニングするか、又は合成的に作製することができる。或いは、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリは、ヒトＣＲ１核酸配列を提供し得る。

標的化ベクターは、ヒトＣＲ１をコードするヌクレオチド配列を含む核酸の内因性齧歯類遺伝子座への相同組換え及び組込みを媒介することができるように、ヒトＣＲ１をコードするヌクレオチド配列を含む、組み込まれる核酸に加えて、好適な長さであり、選択された内因性齧歯類遺伝子座（例えば、齧歯類Ｃｒ２遺伝子座と齧歯類Ｃｒ１ｌ遺伝子座との間の遺伝子座）で齧歯類配列に相同な隣接する核酸配列を含むことができる。隣接する核酸配列は、５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、５０ｋｂ、５５ｋｂ、６０ｋｂ、６５ｋｂ、７０ｋｂ、７５ｋｂの長さ、又は上記の長さの間の任意の値であり得る。

いくつかの実施形態では、標的化ベクターは、選択マーカー遺伝子（例えば、米国特許第８，６９７，８５１号、同第８，５１８，３９２号、及び同第８，３５４，３８９号に記載の選択マーカー遺伝子を含む自己欠失カセットであり、これらは全てが、参照により本明細書に組み込まれる）も含み、これらは、部位特異的組換え部位（例えば、ｌｏｘＰ、Ｆｒｔなど）に隣接するか、又はこれらを含むことができる。選択マーカー遺伝子は、トランスフェクタントの容易な選択を可能にするために、ヒトＣＲ１をコードするヌクレオチド配列を含む核酸と隣接する標的化ベクター上に配置することができる。

ランダム組み込みのためのトランスジェニックベクター
いくつかの実施形態では、ヒトＣＲ１をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、ランダム組み込みのために設計されたトランスジェニックベクターを使用して齧歯類ゲノムに挿入することができる。

トランスジェニックベクターは、上述のヒトＣＲ１ポリペプチドをコードする核酸のいずれかを含む。いくつかの実施形態では、トランスジェニックベクターは、５’で、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子のＡＴＧのすぐ上流にある少なくとも１４Ｋｂのヌクレオチド配列（齧歯類Ｇａｔａ１遺伝子プロモーターを含む）と、３’で、ヒトベータグロビン遺伝子からのポリ（Ａ）シグナルを含む３’ＵＴＲ配列と、それに続く、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子のＳＴＯＰコドンのすぐ下流にある少なくとも１．５Ｋｂのヌクレオチド配列と、作動可能に連結された、ヒトＣＲ１コード配列（ＡＴＧからＳＴＯＰまで）を（例えば、ｃＤＮＡの形態で）含む。

トランスジェニックベクターは、ヒトＣＲ１核酸と隣接するトランスジェニックベクター上に配置された、選択マーカー遺伝子などの追加の要素を含むことができる。選択マーカー遺伝子は、例えば、米国特許第８，６９７，８５１号、同第８，５１８，３９２号、及び同第８，３５４，３８９号に記載の選択マーカー遺伝子を含む自己欠失カセットであり得、これらは全てが、参照により本明細書に組み込まれ、これらは、部位特異的組換え部位（例えば、ｌｏｘＰ、Ｆｒｔなど）に隣接する、又はこれらを含むことができる。

本明細書に開示される導入遺伝子は、既知の方法を使用して作製することができる。例えば、導入遺伝子は、細菌相同組換え及びＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）の技術を使用して組み立てることができる（例えば、Ｕ．Ｓ．６，５８６，２５１及びＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ，２００３，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２－６５９を参照されたい）。ヒトＣＲ１核酸を担持するトランスジェニックベクターの例は、以下の実施例４に記載される。

ベクターの導入及びヒトＣＲ１核酸の齧歯類ゲノムへの組み込み
いくつかの実施形態では、組み込まれる所望の核酸を担持するベクター、標的化ベクター又はトランスジェニックベクターのいずれかは、例えば、エレクトロポレーションによって齧歯類胚性幹（ＥＳ）に導入することができる。マウスＥＳ細胞及びラットＥＳ細胞の両方が当技術分野で記載されている。例えば、ＵＳ７，５７６，２５９、ＵＳ７，６５９，４４２、ＵＳ７，２９４，７５４、及びＵＳ２００８－００７８０００ Ａ１（その全てが参照により本明細書に組み込まれる）は、マウスＥＳ細胞及び遺伝子修飾マウスを作製するためのＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法について記載しており、ＵＳ２０１４／０２３５９３３ Ａ１、ＵＳ２０１４／０３１０８２８ Ａ１、及びＵＳ２０１４／０３０９４８７ Ａ１（その全てが参照により本明細書に組み込まれる）は、ラットＥＳ細胞及び遺伝子修飾ラットを作製する方法について記載しているので参照されたい。

齧歯類ゲノム中に組み込まれた所望の核酸を有するＥＳ細胞が選択され得る。標的化ベクターが使用される実施形態では、標的遺伝子座に組み込まれた核酸を有するＥＳ細胞が選択される。トランスジェニックベクターが使用される実施形態では、ゲノムに組み込まれた核酸を有するＥＳ細胞が、組み込みが起こる部位に関係なく選択され、いくつかのかかる実施形態では、核酸の１つ以上のコピーが、１つ以上の部位に組み込まれ得、いくつかのかかる実施形態では、核酸の１つのコピーが、１つの部位に組み込まれ得る。

次に、ゲノムに組み込まれた所望の核酸を有するＥＳ細胞を、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法（例えば、ＵＳ７，５７６，２５９、ＵＳ７，６５９，４４２、ＵＳ７，２９４，７５４、及びＵＳ２００８－００７８０００ Ａ１を参照されたい）、又はＵＳ２０１４／０２３５９３３ Ａ１及びＵＳ２０１４／０３１０８２８ Ａ１に記載される方法を使用することにより、桑実期以前の胚（例えば、８細胞期胚）への注入のためのドナーＥＳ細胞として使用される。ドナーＥＳ細胞を含む胚を胚盤胞段階までインキュベートし、次に代理母へと移植して、完全にドナーＥＳ細胞に由来するＦ０齧歯類を産生する。外因性核酸を有する齧歯類の子は、外因性核酸配列の存在を検出する対立遺伝子の修飾（ＭＯＡ）アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら（上記））を用いて、尾切片から単離されたＤＮＡを遺伝子型判定することにより同定することができる。

他の実施形態では、ＥＳ細胞を使用することなく遺伝子修飾齧歯類が作製され得る。例えば、齧歯類の非ＥＳ細胞のゲノム（例えば、線維芽細胞又は誘導多能性細胞）は、従来の形質転換法（例えば、電子穿孔）に基づいて修飾することができ、このような非ＥＳ細胞の修飾ゲノムは、核移植手法を用いることにより、好適な受容細胞（例えば、卵母細胞）に移行させることができる。次に、修飾細胞（例えば、修飾卵母細胞）を好適な条件下で懐胎（ｇｅｓｔａｔｅｄ）させて胚を形成する。例えば、Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｕｃｌｅａｒ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｏｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｓ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４７６： １７１－１８４（２０１０）、及びＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅｒｔｉｌｅ Ｃｌｏｎｅｄ Ｒａｔｓ ｂｙ Ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ Ｏｏｃｙｔｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０２： １１７９（２００３）を参照されたい。

交配及び戻し交配
ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードする外因性核酸を含む遺伝子修飾齧歯類動物は、他の齧歯類動物と交配することができる。調製の方法は、一連の齧歯類動物を生成することであり、それぞれが所望の核酸又は導入遺伝子のうちの１つを含む。かかる齧歯類動物は、一連の交配、戻し交配、及び選択によって一緒に交配され、最終的には、全ての所望の核酸を含む単一の齧歯類動物を生成し、それ以外の場合、哺乳動物は、所望の核酸の存在を除いて、野生型に類遺伝子性（遺伝的に同一）である。一実施形態において、外因性核酸、ヒトＣＲ１コード配列を含み、ヒトＣ３遺伝子配列を含むマウスは、この方法で産生される。別の実施形態では、マウスは、（ｉ）ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、マウスＣｒ２遺伝子座位とマウスＣｒ１ｌ遺伝子座位の間に組み込まれた核酸、及び（ｉｉ）マウスＧａｔａ１プロモーターと作動可能に連結され、Ｘ染色体に組み込まれた、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むように、この方法で調製される。

典型的には、交配及び戻し交配は、育成経過の各特定の工程の目的に応じて、兄弟又は親株を子孫に交配することによって達成される。特定の場合、適切な染色体位置に各所望の核酸を含む、単一の子孫を生成するために、多数の子孫を生成することが必要であり得る。更に、最終的に望ましい遺伝子型を得るために、数世代にわたって交配又は戻し交配が必要となり得る。

ヒトＣＲ１を発現する遺伝子修飾齧歯類の使用
ヒトＣＲ１を発現する遺伝子修飾齧歯類動物は、ヒトＣＲ１を標的とする候補薬剤のスクリーニング及び試験に使用することができる。ＣＲ１は補体系の負の制御因子であるため、ヒトＣＲ１の発現は、Ｃ３ヒト化齧歯類において望ましくない腎臓及び肝臓の損傷を引き起こす補体過剰活性化を無効にするのに有用であり、それにより、完全に機能的なヒト補体活性を有する齧歯類動物の生成が促進される。ヒトＣＲ１及びヒトＣ３を発現する遺伝子修飾齧歯類動物を使用して、ヒトＣ３を標的とする、又はそうでなければヒト補体系を調節する候補薬剤をスクリーニング及び試験することもできる。

一態様では、本明細書に提供されるのは、ヒトＣＲ１又はヒト補体系の別の成分（例えば、ヒトＣ３）を標的とする候補化合物を評価する方法である。方法は、本明細書に開示される遺伝子修飾齧歯類（例えば、マウス又はラット）のいずれかを利用する。候補化合物は、低分子化学化合物、抗体、タンパク質、阻害性核酸、又はそれらの任意の組み合わせであり得るが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトＣＲ１又はヒト補体系の別の成分（例えば、ヒトＣ３）を標的とする化合物の薬物動態特性を評価する方法を提供し、方法は、本明細書に開示される遺伝子修飾齧歯類動物に化合物を投与するステップと、化合物の１つ以上の薬物動態特性を決定するためのアッセイを実施するステップと、を含む。薬物動態特性には、動物がどのように化合物を処理して様々な代謝物にするか（又は、限定されないが有毒代謝物を含む１つ以上の薬剤代謝物の有無の検出）、化合物の半減期、投与後の化合物の循環レベル（例えば、化合物の血清濃度）、抗化合物応答（例えば、抗化合物抗体）、吸収及び分布、投与経路、排泄経路、並びに／又は化合物のクリアランスが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、化合物（例えば、ヒトＣＲ１モジュレーター）の薬物動態学的及び薬力学的特性は、本明細書に開示される遺伝子修正齧歯類動物において、又はその使用を通じてモニターされる。

本明細書に開示される遺伝子修飾齧歯類動物は、化合物（例えば、ヒトＣＲ１又はヒトＣ３を標的とする化合物）のオンターゲット毒性を評価するためのインビボシステムを提供する。いくつかの実施形態では、化合物は、本明細書に開示される１つ以上の遺伝子修飾齧歯類動物に送達又は投与され、その後、動物に対する化合物のオンターゲット毒性効果を決定するために、動物に対して１つ以上のアッセイをモニタリング又は実施することができる。例示的なオンターゲット効果には、高すぎる用量、慢性活性化／不活性化、及び正しい組織での正しい作用が含まれる。

本明細書に開示される遺伝子修飾齧歯類動物は、化合物（例えば、ヒトＣＲ１又はヒトＣ３を標的とする化合物）のオフターゲット毒性を評価するためのインビボシステムを提供する。いくつかの実施形態では、化合物は、本明細書に開示される１つ以上の遺伝子修飾齧歯類動物に送達又は投与され、その後、動物（又はそれらから単離された細胞）に対する化合物のオフターゲット毒性効果を決定するために、動物に対して１つ以上のアッセイをモニタリング又は実施することができる。オフターゲット効果は、化合物が意図しない標的と相互作用する時（例えば、共通エピトープに対する交差反応）に発生し得る。例示的なオフターゲット効果には、誤った標的がある組織の組織とは関係のない、誤った標的の誤った活性化／阻害が含まれる。いくつかの実施形態において、化合物のオフターゲット効果は、本発明の非ヒト動物への化合物の投与の効果を１つ以上の参照非ヒト動物と比較することによって決定される。

化合物の薬物動態特性、オンターゲット毒性、及び／又はオフターゲット毒性を評価するために、齧歯類動物において（又はそれから単離された細胞で、及び／又はそれを使用して）測定できるパラメータの例には、凝集、オートファジー、細胞分裂、細胞死、補体媒介溶血、ＤＮＡ完全性、化合物特異的抗体価、化合物代謝、遺伝子発現アレイ、代謝活性、ミトコンドリア活性、酸化ストレス、食作用、タンパク質生合成、タンパク質分解、タンパク質分泌、ストレス応答、標的組織化合物濃度、標的外組織化合物濃度、転写活性などが含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される齧歯類動物は、本明細書に記載の齧歯類動物のいずれかに化合物を投与することと、齧歯類における補体活性化が調節されるかをアッセイし、それによって補体活性化を調節できる化合物を同定することと、を含む補体活性化を調節できる化合物を同定するために使用される。いくつかの実施形態では、化合物は、補体活性を増加させることによって補体活性化を調節する。いくつかの実施形態では、化合物は、補体活性を減少させることによって補体活性化を調節する。

いくつかの実施形態では、候補化合物は、補体活性化の実験的誘導後（例えば、腎臓虚血／再灌流モデルにおける）にげっ歯類に直接投与され、ヒトに結合し、ヒトＣＲ１を調節する、及び／又は補体系を調節するそれらの能力に関する化合物の効果が評価される。他の実施形態では、候補化合物は、齧歯類から取得した血清と接触させ、補体活性は、一般的に使用される任意のインビトロ評価技術（例えば、ＣＨ_５０アッセイなどであるが、これに限定されない）を使用して評価される。

本発明は、例示のために提供される以下の実施例を参照することによって更に理解することができ、これは限定することを意味するものではない。

以下の実施例は、本明細書に特許請求される組成物、及び／又は方法がどのようになされて評価されるのかに関して、当業者に完全な開示及び説明を提供するように示されており、単に例示的であることを意図しており、本開示を限定することを意図していない。

実施例１．ヒトＣＲ１の標的挿入を含むマウスの生成
ヒトＣＲ１の標的挿入を有するマウスの生成－大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を、ヒト及びマウスバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡ及びＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を使用して生成した（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号、及びＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２－６５９を参照されたく、いずれも参照により本明細書に組み込まれる）。ＬＴＶＥＣは、マウスＣｒ２遺伝子座とＣｒ１ｌ遺伝子座との間の２５１ｂｐのゲノム配列を、５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、並びに介在イントロンを有する、ＡＴＧからＳＴＯＰまでのＣＲ１遺伝子座全体と、５’ＵＴＲのすぐ上流にある４，２３３ｂｐ（配列番号３）の追加の配列、及び３’ＵＴＲのすぐ下流にある１５９ｂｐ（配列番号４１）の配列と、を含む、１３１，４５６ｂｐのヒトゲノム配列に置き換えることによって構築した。置換される２５１ｂｐのマウス配列は、Ｃｒ１ ３’ＵＴＲの下流及びＣｒ１ｌ ５’ＵＴＲの上流である。自己欠失ハイグロマイシン耐性カセット（雄生殖細胞で欠失するプロタミンプロモーター駆動型Ｃｒｅを含む）を、１３１，４５６ｂｐのヒト挿入物のすぐ下流に配置した。図１Ａを参照されたい。

得られたベクターを使用して、交雑１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃ：Ｃ５７Ｂｌ／６Ｎｔａｃ Ｆ１マウス胚性幹（ＥＳ）細胞をエレクトロポレーションし、ハイグロマイシン耐性に基づいて正の選択を行った。適正に標的化されたＥＳ細胞を、対立遺伝子アッセイ（ＭＯＡ）の変化によって同定した。特異的プライマーセット及びプローブを、マウス配列の欠失（対立遺伝子の喪失又はＬＯＡ）、及びヒト配列の挿入（対立遺伝子の獲得又はＧＯＡ）を検出するために設計した。プライマー及びプローブの位置を図１Ａに示す。

適正に標的化されたＥＳクローンをドナーＥＳ細胞として使用し、８細胞期のＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ胚にマイクロインジェクションし、注入された修飾ＥＳＣに完全に由来するＦ０ ＶｅｌｏｃｉＭｉｃｅ（登録商標）を得た（Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ２００７； Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２５（１）：９１－９９）。ＭＡＩＤ ７２３８と命名したこれらのＦ０マウスを、その後１００％ Ｃ５７Ｂｌ／６ＮＴａｃマウスと交配した。ＭＡＩＤ ７２３８の耐性カセットを、自己欠失技術によって除去し、ＭＡＩＤ ７２３９を得た。

実施例２－ヒトＣＲ１の標的挿入を含むマウスの表現型解析
ＭＡＩＤ ７２３９ Ｈｅｔ（ＳＤＣ欠失を有するヒトＣＲ１の標的挿入に対してヘテロ接合性のＦ１マウス）の表現型解析－フローサイトメトリーを、ＭＡＩＤ ７２３９ Ｈｅｔマウス（Ｆ１：１０週齢、雄、ｎ＝３、７５％／２５％ Ｂ６／１２９バックグラウンド）、及びＭＡＩＤ ７２３８野生型マウス（１０週齢、雄、ｎ＝３、７５％／２５％ Ｂ６／１２９バックグラウンド）の全血、溶解血液、及び脾臓由来の細胞に対して実施した。ＭＡＩＤ ７２３９ Ｈｅｔマウスは、ＭＡＩＤ ７２３８野生型マウスと比較して、血液中及び脾臓中に正常な骨髄細胞集団を有していた。溶解血液由来の細胞について図２Ａに示すように、高レベルのｈＣＲ１が好中球上で検出され（ヒト血液で見られるのとほぼ同じ発現レベルで）、非常に低レベルのｈＣＲ１がマクロファージ上で検出された。しかしながら、ｈＣＲ１は、全血由来の赤血球（ＲＢＣ）上で検出不能であった。脾臓から単離された細胞について図２Ｂに示すように、高レベルのｈＣＲ１が好中球上で検出され、非常に低レベルのｈＣＲ１がマクロファージ及び炎症性単球上で検出された。

ＭＡＩＤ ７２３９ ＨＯ（ＳＤＣ欠失を有するヒトＣＲ１の標的挿入に対してホモ接合性のＦ２マウス）の表現型解析－フローサイトメトリーを、ＭＡＩＤ ７２３９ ＨＯマウス（Ｆ２：６～７週齢、雄、ｎ＝３（データは示さず）；１２週齢、雌、ｎ＝３；７５％Ｂ６ ２５％１２９バックグラウンド）、及びＭＡＩＤ ７２３９野生型マウス（６～７週齢、雄、ｎ＝３（データは示さず）：１２週齢、雌、ｎ＝３；７５％Ｂ６ ２５％１２９バックグラウンド）の全血、溶解血液、及び脾臓由来の細胞に対して実施した。ＭＡＩＤ ７２３９ ＨＯマウスは、ＭＡＩＤ ７２３９野生型マウスと比較して、血液中及び脾臓中に正常な骨髄細胞集団を有していた。溶解血液由来の細胞について図２Ｃに示すように、高レベルのｈＣＲ１が好中球上で検出され（ヒト血液で見られるのとほぼ同じ発現レベルで）、中程度のレベルのｈＣＲ１がｃＤＣ上で検出され、低レベルのｈＣＲ１がマクロファージ上で検出された。しかしながら、ｈＣＲ１は、全血由来の赤血球（ＲＢＣ）上で検出不能であった。脾臓から単離された細胞について図２Ｄに示すように、高レベルのｈＣＲ１が好中球上で検出され、非常に低レベルのｈＣＲ１がマクロファージ、炎症性単球、及びｃＤＣ上で検出された。フローサイトメトリーを、ＭＡＩＤ ７２３９ ＨＯマウス（７５％ Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ ２５％ １２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃバックグラウンド、雄 ｎ＝２、雌 ｎ＝１、１５週齢、Ｆ６）、及びＭＡＩＤ ７２３９野生型マウス（７５／２５ＷＴ（５０５００）：７５％ Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ ２５％ １２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃバックグラウンド、雄 ｎ＝２、雌 ｎ＝１、１５週齢、Ｆ１）の腹腔並びに消化された肝臓由来の細胞に対して実施した。ｈＣＲ１はまた、試験した３匹のマウスのうちの１匹において、いくつかの大きな（ただし小さなものではない）腹膜マクロファージ上で検出された（図２Ｅ）。ｈＣＲ１は、肝臓の全ての好中球上、及び約５０％の運動性マクロファージ（おそらくｃＤＣ）上で検出された（図２Ｆ）。

材料及び方法
全てのマウスは、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓの特定の病原体のない条件で収容及び交配された。マウスを犠牲にし、脾臓及び血液を採取した。ＥＤＴＡ（カタログ番号３６５９７３）を含むＢＤマイクロテイナーチューブに血液を採取した。脾臓及び血液調製物由来の赤血球を、ＡＣＫ溶解緩衝液で溶解し、続いて完全ＲＰＭＩ培地で洗浄した。いくつかの事例では、肝臓細胞及び腹膜細胞を採取した。肝臓を収集し、小片に刻んで、ＨＢＳＳ中のリベラーゼＴＨ（カタログ番号５４０１１５１００１、Ｒｏｃｈｅ、最終濃度０．７Ｕ／ｍｌで使用）及びＤＮａｓｅ（カタログ番号１０１０４１５９００１、Ｒｏｃｈｅ、最終濃度２０ｕｇ／ｍｌで使用）の混合物中で、３７℃で２０分間消化させ、その後、反応を１０ｍＭの最終濃度でＥＤＴＡで停止し、続いて完全ＲＰＭＩ培地で洗浄し、ＡＣＫ溶解緩衝液で赤血球溶解した。腹膜マクロファージを、１０ｍｌのシリンジを使用して、５～６ｍｌの氷冷ＰＢＳで、必要な２７ｇで腹腔内をフラッシングすることによって、腹膜洗浄を介して採取した。赤血球をＡＣＫで溶解し、続いて完全ＲＰＭＩ培地で洗浄した。

未溶解血液、溶解血液、及び脾臓に対するフローサイトメトリー：１ｘ１０^６個の細胞を、抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（２．４Ｇ２、ＢＤ）と共に氷上で１０分間インキュベートし、続いて以下の抗体パネルで、氷上で３０分間標識した。非溶解血液に対して使用されるパネル：抗マウスＰｅＣｙ７－ＴＥＲ１１９（ＴＥＲ１１９、ＢＤ）、抗ヒトＰＥ－ＣＲ１（Ｅ１１、ＢＤ）、又はＰＥ－ＩｇＧ１、Ｋアイソタイプ対照（ＭＯＰＣ－２１、ＢＤ）。溶解血液、脾臓、肝臓、腹腔洗浄に対して使用されるパネル：抗マウスＦＩＴＣ－Ｌｙ６Ｃ（ＨＫ１．４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰｅＣｙ７－Ｆ４／８０（ＢＭ８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５－Ｌｙ６Ｇ（１Ａ８、ＢＤ）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ－ＣＤ３（１７Ａ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ－ＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ－ｅＦｌｏｕｒ７８０－ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ａ７００－ＣＤ１９（１Ｄ３、ＢＤ）、及び抗ヒトＰＥ－ＣＲ１（Ｅ１１、ＢＤ）、又はＰＥ－ＩｇＧ１、Ｋアイソタイプ対照（ＭＯＰＣ－２１、ＢＤ）。

肝臓及び腹膜洗浄に対するフローサイトメトリー：１×１０^６個の細胞をまずＰＢＳで洗浄し、次いでＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｙｅｌｌｏｗ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（カタログ番号Ｌ３４９５９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、氷上で３０分間インキュベートし、続いてＰＢＳで洗浄し、次いで、抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（２．４Ｇ２、ＢＤ）で、氷上で１０分間インキュベートし、続いて氷上で３０分間、以下の抗体パネルで標識する。

染色した後に、細胞を洗浄し、２％のホルムアルデヒドで固定した。データ収集をＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）フローサイトメーターで行い、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて解析した。

マクロファージ（Ｆ４／８０＋ＣＤ１１ｂ－及びＦ４／８０＋ＣＤ１１ｂ＋）、炎症性単球（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃ＋Ｌｙ６Ｇ－）、常在性単球及びＮＫ細胞（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃ－Ｌｙ６Ｇ－）、好中球ＣＤ１１ｂ＋ Ｌｙ６Ｃ－Ｌｙ６Ｇ＋）、ｃＤＣ（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ）。腹腔内では、小さな腹膜マクロファージ（Ｆ４／８０ｌｏｗＣＤ１１ｂ低）、大きな腹膜マクロファージ（Ｆ４／８０高ＣＤ１１ｂ高）、ｃＤＣ（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋）。肝臓では、運動性マクロファージ（Ｆ４／８０＋ ＣＤ１１ｂ高）、クッパー細胞マクロファージ（Ｆ４／８０高ＣＤ１１ｂ低）、好中球（ＣＤ１１ｂ＋ Ｌｙ６Ｃ－Ｌｙ６Ｇ＋）。

実施例３．ヒトＣＲ１及びヒトＣ３の標的挿入を含むマウスの生成及び表現型解析
ＭＡＩＤ ６１４９マウスを、５’制御要素及びコードエクソン１～４１の全てにわたるマウスＣ３遺伝子座を、５’制御要素及びヒトＣ３遺伝子のコードエクソン１～４１の全てを含むヒトゲノム断片で置換することによって作製した（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９７９５１２１ Ｂ１号を参照されたい）。ＭＡＩＤ ６１４９マウスは、高い自然死率、並びに補体関連腎症及び肝線維症に極めて類似した生理学的、形態学的、及び組織学的症状を示す傾向があることを示した。実施例１に記載のＭＡＩＤ７２３９ ＨＯマウスを、ＭＡＩＤ６１４９マウスと交配して二重ホモ接合性マウスを作製し、ＭＡＩＤ６１４９マウスの疾患表現型に対するＣＲ１ヒト化の効果を評価した。

本実施例に記載される実験では、以下のマウスを使用した：Ｃ３ ＨｕｍＩｎ ＣＲ１ ＨｕｍＩｎ（６１４９ＨＯ ７２３９ＨＯ）マウス： ７５％ Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ ２５％ １２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃバックグラウンド、雄、ｎ＝９、Ｆ２、及び雌、ｎ＝６、Ｆ２；Ｃ３ ＨｕｍＩｎ（６１４９ＨＯ ７２３９ＷＴ）－７５％ Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ ２５％ １２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃバックグラウンド、雄、ｎ＝５、Ｆ２、及び雌、ｎ＝２、Ｆ２；７５／２５ ＷＴ（５０５００）： ７５％ Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ ２５％ １２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃバックグラウンド、雄、ｎ＝１０、Ｆ１、及び雌、ｎ＝４、Ｆ１。

材料及び方法
マウスを犠牲にし、血清をＢＤチューブ＃３６５９６７に採取した。

マウスＣ３を、補体Ｃ３マウスＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ａｂ１５７７１１、Ａｂｃａｍ）を使用して、製造元の指示に従って測定した。４５０ｎｍでの吸光度を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５で測定した。データをＰｒｉｓｍソフトウェアで解析した。

ヒトＣ３を、補体Ｃ３ヒトＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ａｂ１０８８２２、Ａｂｃａｍ）を使用して、製造元の指示に従って測定した。４５０ｎｍでの吸光度を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５で測定した。データをＰｒｉｓｍソフトウェアで解析した。

ヒトｉＣ３ｂを、補体ｉＣ３ｂヒトＥＩＡキット（カタログ番号ａｂ１０８８２２、Ｑｕｉｄｅｌ）を使用して、製造元の指示に従って測定した。４５０ｎｍでの吸光度を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５で測定した。データをＰｒｉｓｍソフトウェアで解析した。

血中尿素窒素を、ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ尿素アッセイキット（カタログ番号ＤＩＵＲ－１００、Ｂｉｏａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、製造元の指示に従って測定した。

コホート１：
目視検査及び血清ＢＵＮレベル（腎臓損傷の血清バイオマーカー）を、ＷＴ対照と比較して、Ｃ３ ＨｕｍＩｎ（ＭＡＩＤ６１４９ＨＯ）マウス、及びＣ３ ＨｕｍＩｎ ＣＲ１ ＨｕｍＩｎ（ＭＡＩＤ ６１４９ＨＯ ７２３９ＨＯ）マウスにおける疾患進行の指標として使用した。ＢＵＮレベルが上昇した病気のマウスを発見すると、マウスを犠牲にして血清及び組織を収集した。解析は、ｈＣ３レベルにおける改善がないにもかかわらず、Ｃ３ ＨｕｍＩｎ（６１４９ＨＯ）マウスと比較して、Ｃ３ ＨｕｍＩｎ ＣＲ１ ＨｕｍＩｎ（６１４９ＨＯ ７２３９ＨＯ）マウスのＢＵＮレベルの中程度の改善を示し、Ｃ３ ＨｕｍＩｎ（６１４９ＨＯ）マウスと比較して、Ｃ３ ＨｕｍＩｎ ＣＲ１ ＨｕｍＩｎ（６１４９ＨＯ ７２３９ＨＯ）マウスにおいて、腎臓損傷の改善を伴う肝臓損傷の増悪の可能性のある兆候を示す。図３Ａ～図３Ｅを参照されたい。

コホート２：
体重増加、ＢＵＮレベル（腎臓損傷の血清バイオマーカー）、及び生存を、ＷＴ対照と比較して、Ｃ３ ＨｕｍＩｎ（ＭＡＩＤ６１４９ＨＯ）マウス、及びＣ３ ＨｕｍＩｎ ＣＲ１ ＨｕｍＩｎ（ＭＡＩＤ ６１４９ＨＯ ７２３９ＨＯ）マウスで調査した。図３Ｆ～３Ｈに示すように、Ｃ３ ＨｕｍＩｎ（６１４９ＨＯ）マウスと比較して、Ｃ３ ＨｕｍＩｎ ＣＲ１ ＨｕｍＩｎ（６１４９ＨＯ ７２３９ＨＯ）マウスでは、体重増加／ＢＵＮレベルのわずかな改善、及び生存の有意な改善が観察された。

実施例４．マウスＧＡＴＡ－１プロモーターによって駆動されるトランスジェニックヒトＣＲ１を含むマウスの生成
マウスＧａｔａ１遺伝子はＸ染色体に位置し、そのゲノム配列はＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号１４４６０で見出すことができる。ＲｅｆＳｅｑ ｍＲＮＡ ＩＤ及びＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤの例は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００８０８９．２及びＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ番号Ｐ１７６７９でそれぞれ見出すことができる。

マウスＧａｔａ１プロモーター－ヒトＣＲ１ ｃＤＮＡ－ヒトベータグロビンポリＡ配列のランダムに挿入されたコピーを含む遺伝子操作されたＴＧ^{Ｇａｔａ１－ＣＲ１}マウス系統を、ＲｅｇｅｎｅｒｏｎのＶｅｌｏｃｉＧｅｎｅ（登録商標）技術を使用して作製した（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ２００３（上記）； Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ２００７（上記））。交雑１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃ：Ｃ５７Ｂｌ／６ＮＴａｃ Ｆ１胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、Ｇａｔａ１ゲノム配列（ＡＴＧの３３Ｋｂ上流を含む）を含むマウスバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）のランダム挿入を標的とし、完全長ヒトＣＲ１コード配列（ＡＴＧからＳＴＯＰ）がＧａｔａ１のコードエクソン１とそれに続くイントロンを置換するように修飾した。配列番号４に記載されているヒトベータグロビン遺伝子由来のポリ（Ａ）シグナルを含む３’ＵＴＲ配列は、ヒトＣＲ１ ＳＴＯＰコドンの３’に配置され、ＥＳＣにおける選択のためのネオマイシン耐性カセットがそれに続く。図４Ａ～図４Ｂを参照されたい。

ヒトＣＲ１タンパク質がＧａｔａ１依存的な様式で発現することを確実にするために、ＥＳＣクローンをスクリーニングして、ＡＴＧ（Ｇａｔａ１プロモーターを含む）の上流の少なくとも１４Ｋｂ（及び場合によっては３３Ｋｂ全体）（ＴａｑＭａｎ アッセイによって決定）、及び１．５Ｋｂの３’ＵＴＲ（標的遺伝子座増幅（「ＴＬＡ」）解析によって決定）が導入遺伝子挿入物に含まれていることを確認した。導入遺伝子が内因性Ｇａｔａ１（Ｘ染色体上に位置する）を標的としていないことを保証するために、クローンもＴａｑＭａｎによりスクリーニングした。プライマーセット及びプローブの配列を以下の表３に示し、それらの位置を図４Ａに示す。

トランスジェニックＥＳＣクローンを、８細胞Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ胚にマイクロインジェクションし、注入された修飾ＥＳＣ（Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ２００７）に完全に由来するＦ０ ＶｅｌｏｃｉＭｉｃｅ（登録商標）を得た。その後、これらのＦ０マウスを、１００％のＣ５７Ｂｌ／６ＮＴａｃバックグラウンドでホモ接合性に交配し、ＭＡＩＤ７５０２として命名した。耐性カセットは、自己欠失技術によって除去され、それによって株ＭＡＩＤ７５０３を生成した。標的遺伝子座増幅（ＴＬＡ；Ｃｅｒｇｅｎｔｉｓ）を使用した後続の解析により、導入遺伝子はＸ染色体上の単一コピーとして存在するが、内因性Ｇａｔａ１遺伝子座を標的としていないことが判明した。全ての動物は、全試験期間中、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ動物施設で維持された。

実施例５．マウスＧＡＴＡ－１プロモーターによって駆動されるトランスジェニックヒトＣＲ１を含むマウスの表現型解析
ＭＡＩＤ ７５０３マウスの血液及び脾臓由来の細胞に対してフローサイトメトリーを実施し、結果を図５Ａ～５Ｃに示す。ＭＡＩＤ７５０３ ＨＥＴ雄及びＨＯ雌マウス由来のＲＢＣは、同様のレベルのｈＣＲ１発現を示した（７５０３ＨＥＴ雌で見られるよりも高い（図５Ａ）。ＭＡＩＤ７５０３ ＨＥＴ雄及びＨＯ雌マウスは、血液及び脾臓細胞集団の両方について、いくらかのｈＣＲ１発現（７５０３ＨＥＴ雌で見られるよりも高い）を示した（図５Ｂ～５Ｃ）。要約すると、ｈＣＲ１発現は、ＭＡＩＤ７５０３ ＨＥＴ雄及び７５０３ＨＯ雌マウスにおけるＲＢＣの表面上で最も観察された。ヒト血液白血球とは異なり、ｈＣＲ１は、ＭＡＩＤ７５０３ ＨＥＴ雄／雌及びＨＯマウスにおけるマウス血液並びに脾臓単球／好中球で弱く発現された（変動性が大きい）。

ＲＢＣ及び血液／脾臓白血球上でのｈＣＲ１発現を、Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（Ｇａｔａ１－ＣＲ１）１Ｒｗｆ／Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ、Ｒｅｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４０：２３０－２４０，２００５に記載されているように、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ大学のＲｏｂｅｒｔ Ｗ．Ｆｉｎｂｅｒｇによって生成された）及びヒト血液でも調査した。ｈＣＲ１発現は、Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（Ｇａｔａ１－ＣＲ１）１Ｒｗｆ／Ｊ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）及びＭＡＩＤ７５０３ ＨＯマウスの両方において、ＲＢＣの表面上で観察された（図５Ｅ）。ヒト血液白血球（図５Ｄ）とは異なり、ｈＣＲ１は、Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（Ｇａｔａ１－ＣＲ１）１Ｒｗｆ／Ｊマウスのマウス血液単球／好中球において非常にわずかに発現した（図５Ｆ）。血中単球／好中球におけるｈＣＲ１発現は、ＭＡＩＤ７５０３ ＨＯマウスにおいて以前に観察された（図５Ｂ参照されたい）。いずれのマウス系統でも、脾臓の単球／好中球ではｈＣＲ１発現は観察されなかった。

Claims (75)

1. 遺伝子修飾齧歯類動物であって、そのゲノム中に、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含み、前記齧歯類動物が、前記ヒトＣＲ１ポリペプチドのヒト様発現を現す、遺伝子修飾齧歯類動物。
2. 前記ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、ヒトゲノムＤＮＡ配列である、請求項１に記載の齧歯類動物。
3. 前記ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、ｃＤＮＡ配列である、請求項１に記載の齧歯類動物。
4. 前記核酸が、前記齧歯類ゲノム中の前記齧歯類Ｃｒ２遺伝子座と前記齧歯類Ｃｒ１様（Ｃｒ１１）遺伝子座との間に挿入される、請求項１～３のいずれか一項に記載の齧歯類動物。
5. 前記核酸が、前記齧歯類ゲノムのＸ染色体に挿入される、請求項１～３のいずれか一項に記載の齧歯類動物。
6. 前記核酸が、前記ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列と作動可能に連結された、ヒトＣＲ１遺伝子のプロモーターを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の齧歯類動物。
7. 前記核酸が、前記ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列と作動可能に連結された、ヒトＣＲ１遺伝子の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の齧歯類動物。
8. 前記核酸が、ヒトＣＲ１遺伝子の３’ＵＴＲを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の齧歯類動物。
9. 前記核酸が、前記ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列と作動可能に連結された、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子の５’制御領域を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の齧歯類動物。
10. 前記５’制御領域が、前記齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子のプロモーター領域を含む、請求項９に記載の齧歯類動物。
11. 前記５’制御領域が、前記齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子のＡＴＧコドンのすぐ上流に少なくとも１４Ｋｂのゲノム配列を含む、請求項１０に記載の齧歯類。
12. 前記核酸が、前記ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列と作動可能に連結された、ヒトベータ－１グロビン遺伝子由来のポリアデニル化配列を含む３’ＵＴＲを含む、請求項１～５又は９～１１のいずれか一項に記載の齧歯類動物。
13. 前記核酸が、前記５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、並びに介在イントロンを有する、ＡＴＧからＳＴＯＰまでの前記ヒトＣＲ１コード配列と、前記５’ＵＴＲのすぐ上流にある少なくとも４０００ｂｐの５’上流配列、及び前記３’ＵＴＲのすぐ下流にある少なくとも１５０ｂｐの配列と、を含む、ヒトゲノムＤＮＡ配列を含み、前記核酸が、前記齧歯類Ｃｒ２遺伝子座と前記齧歯類Ｃｒ１ｌ遺伝子座との間に挿入される、請求項１に記載の齧歯類動物。
14. 前記核酸が、前記５’で、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子のＡＴＧのすぐ上流にある少なくとも１４Ｋｂのヌクレオチド配列と、前記３’で、ヒトベータグロビン遺伝子の３’ＵＴＲ配列と、作動可能に連結された、ＡＴＧからＳＴＯＰまでのヒトＣＲ１コードｃＤＮＡ配列を含み、前記核酸が、前記齧歯類のＸ染色体に組み込まれる、請求項１に記載の齧歯類動物。
15. 前記齧歯類動物が、雄である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の齧歯類動物。
16. 前記齧歯類動物が、雌である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の齧歯類動物。
17. 前記齧歯類動物が、前記核酸についてヘテロ接合性である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の齧歯類動物。
18. 前記齧歯類動物が、前記核酸についてホモ接合性である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の齧歯類動物。
19. 前記ヒトＣＲ１ポリペプチドが、前記齧歯類動物において赤血球及び／又は好中球上で発現される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の齧歯類動物。
20. 前記齧歯類動物が、マウス又はラットである、請求項１～１９のいずれか一項に記載の齧歯類動物。
21. 遺伝子修飾齧歯類動物であって、そのゲノム中に、
    ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列を含む第１の核酸であって、前記第１の核酸が、前記齧歯類ゲノム中の前記齧歯類Ｃｒ２遺伝子座と前記齧歯類Ｃｒ１ｌ遺伝子座との間に挿入される、第１の核酸と、
    齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子の５’制御領域と作動可能に連結されたヒトＣＲ１ポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含む第２の核酸であって、前記第２の核酸が、前記齧歯類ゲノムのＸ染色体に組み込まれる、第２の核酸と、を含む、遺伝子修飾齧歯類動物。
22. 前記第１の核酸が、前記第１のヌクレオチド配列と作動可能に連結された、ヒトＣＲ１遺伝子のプロモーターを含む、請求項２１に記載の齧歯類動物。
23. 前記第１の核酸が、前記第１のヌクレオチド配列と作動可能に連結された、ヒトＣＲ１遺伝子の５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲを含む、請求項２１又は２２に記載の齧歯類動物。
24. 前記第１のヌクレオチド配列が、ヒトゲノムＤＮＡ配列である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の齧歯類動物。
25. 前記齧歯類動物が、前記第１の核酸についてヘテロ接合性である、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の齧歯類動物。
26. 前記齧歯類動物が、前記第１の核酸についてホモ接合性である、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の齧歯類動物。
27. 前記第２の核酸が、前記第２のヌクレオチド配列と作動可能に連結された、ヒトベータ－１グロビン遺伝子由来のポリアデニル化配列を含む３’ＵＴＲを含む、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の齧歯類動物。
28. 前記第２のヌクレオチド配列が、ｃＤＮＡ配列である、請求項２１～２７のいずれか一項に記載の齧歯類動物。
29. 前記齧歯類動物が、雄である、請求項２１～２８のいずれか一項に記載の齧歯類動物。
30. 前記齧歯類動物が、雌である、請求項２１～２８のいずれか一項に記載の齧歯類動物。
31. 前記齧歯類類動物が、前記第２の核酸についてヘテロ接合性である、請求項３０に記載の齧歯類動物。
32. 前記齧歯類類動物が、前記第２の核酸についてホモ接合性である、請求項３０に記載の齧歯類動物。
33. 前記ヒトＣＲ１ポリペプチドが、前記齧歯類動物において赤血球、好中球、マクロファージ、単球、又はｃＤＣ上で発現される、請求項２１～３２のいずれか一項に記載の齧歯類動物。
34. 前記齧歯類動物が、マウス又はラットである、請求項２１～３３のいずれか一項に記載の齧歯類動物。
35. そのゲノム中に、修飾Ｃ３遺伝子を形成するための、内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座での齧歯類Ｃ３遺伝子配列のヒトＣ３遺伝子配列による置換を更に含み、前記齧歯類Ｃ３遺伝子配列が、前記内因性齧歯類Ｃ３遺伝子のエクソンを含み、前記ヒトＣ３遺伝子配列が、前記ヒトＣ３遺伝子のエクソン２～エクソン４１、又はエクソン１～エクソン４１を含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載の齧歯類動物。
36. 前記修飾Ｃ３遺伝子の発現が、ヒトＣ３プロモーターの調節下にあるか、又は前記内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座での齧歯類制御性要素の調節下にある、請求項３５に記載の齧歯類動物。
37. 前記齧歯類動物が、ヒトＣＲ１なしでヒトＣ３を発現する齧歯類類動物と比較して、改善された生存及び／又は改善された腎臓損傷を示す、請求項３５又は３６に記載の齧歯類類動物。
38. 請求項１～３７のいずれか一項に記載の齧歯類から単離された細胞又は組織であって、そのゲノムが、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含み、任意に、前記細胞が、卵である、細胞又は組織。
39. 齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞であって、そのゲノム中に、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞。
40. 前記核酸が、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、前記核酸が、前記齧歯類ゲノム中の前記齧歯類Ｃｒ２遺伝子座と前記齧歯類Ｃｒ１ｌ遺伝子座との間に挿入される、請求項３９に記載の齧歯類ＥＳ細胞。
41. 前記核酸が、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子の５’転写制御領域と作動可能に連結されたヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含み、前記核酸が、前記齧歯類ゲノムのＸ染色体に組み込まれる、請求項３９に記載の齧歯類ＥＳ細胞。
42. 遺伝子修飾齧歯類動物を作製する方法であって、
    ａ）齧歯類ＥＳ細胞のゲノムに核酸を挿入することであって、前記核酸が、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、挿入することと、
    ｂ）ステップａ）から取得された齧歯類ＥＳ細胞を使用して遺伝子修飾齧歯類動物を作製することと、を含む、方法。
43. 前記ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、ヒトゲノムＤＮＡ配列である、請求項４２に記載の方法。
44. 前記ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、ｃＤＮＡ配列である、請求項４２に記載の方法。
45. 前記核酸が、前記齧歯類ゲノム中の前記齧歯類Ｃｒ２遺伝子座と前記齧歯類Ｃｒ１様（Ｃｒ１１）遺伝子座との間に挿入される、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の方法。
46. 前記核酸が、前記齧歯類ゲノムのＸ染色体に挿入される、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の方法。
47. 前記核酸が、前記ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列と作動可能に連結された、ヒトＣＲ１遺伝子のプロモーターを含む、請求項４２～４６のいずれか一項に記載の方法。
48. 前記核酸が、前記ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列と作動可能に連結された、ヒトＣＲ１遺伝子の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含む、請求項４２～４７のいずれか一項に記載の方法。
49. 前記核酸が、ヒトＣＲ１遺伝子の３’ＵＴＲを含む、請求項４２～４８のいずれか一項に記載の方法。
50. 前記核酸が、前記ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列と作動可能に連結された、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子の５’制御領域を含む、請求項４２～４７のいずれか一項に記載の方法。
51. 前記５’制御領域が、前記齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子のプロモーター領域を含む、請求項５０に記載の方法。
52. 前記５’制御領域が、前記齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子のＡＴＧコドンのすぐ上流に少なくとも１４Ｋｂのゲノム配列を含む、請求項５１に記載の方法。
53. 前記核酸が、前記ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列と作動可能に連結された、ヒトベータ－１グロビン遺伝子由来のポリアデニル化配列を含む３’ＵＴＲを含む、請求項４２～４６又は５０～５２のいずれか一項に記載の方法。
54. 前記核酸が、前記５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、並びに介在イントロンを有する、ＡＴＧからＳＴＯＰまでの前記ヒトＣＲ１コード配列と、前記５’ＵＴＲのすぐ上流にある少なくとも４０００ｂｐの５’上流配列、及び前記３’ＵＴＲのすぐ下流にある少なくとも１５０ｂｐの配列と、を含む、ヒトゲノムＤＮＡ配列を含み、前記核酸が、前記齧歯類Ｃｒ２遺伝子座と前記齧歯類Ｃｒ１ｌ遺伝子座との間に挿入される、請求項４２に記載の方法。
55. 前記核酸が、前記５’で、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子のＡＴＧのすぐ上流にある少なくとも１４Ｋｂのヌクレオチド配列と、前記３’で、ヒトベータグロビン遺伝子の３’ＵＴＲ配列と、作動可能に連結された、ＡＴＧからＳＴＯＰまでのヒトＣＲ１コードｃＤＮＡ配列を含み、前記核酸が、前記齧歯類のＸ染色体に組み込まれる、請求項４２に記載の方法。
56. 前記齧歯類動物が、マウス又はラットである、請求項４２～５５のいずれか一項に記載の方法。
57. ヒトＣＲ１を標的とする化合物の薬物動態特性を評価する方法であって、請求項１～３７のいずれか一項に記載の遺伝子修飾齧歯類動物に候補化合物を投与することと、前記化合物の１つ以上の薬物動態特性を決定するためのアッセイを実施することと、を含む、方法。
58. ヒトＣ３を標的とする化合物の薬物動態特性を評価する方法であって、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の遺伝子修飾齧歯類動物に候補化合物を投与することと、前記化合物の１つ以上の薬物動態特性を決定するためのアッセイを実施することと、を含む、方法。
59. 標的化ベクターであって、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含み、前記齧歯類ゲノム中の前記齧歯類Ｃｒ２遺伝子座と前記齧歯類Ｃｒ１ｌ遺伝子座との間の前記核酸の標的挿入のための齧歯類ヌクレオチド配列と隣接する、標的化ベクター。
60. 核酸ベクターであって、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子の５’制御領域と作動可能に連結されたヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、核酸ベクター。
61. 遺伝子修飾齧歯類ＥＳ細胞を作製する方法であって、
    齧歯類ＥＳ細胞のゲノムに核酸を挿入することであって、前記核酸が、ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、挿入すること、を含む、方法。
62. 前記ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、ヒトゲノムＤＮＡ配列である、請求項６１に記載の方法。
63. 前記ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、ｃＤＮＡ配列である、請求項６１に記載の方法。
64. 前記核酸が、前記齧歯類ゲノム中の前記齧歯類Ｃｒ２遺伝子座と前記齧歯類Ｃｒ１様（Ｃｒ１１）遺伝子座との間に挿入される、請求項６１～６３のいずれか一項に記載の方法。
65. 前記核酸が、前記齧歯類ゲノムのＸ染色体に挿入される、請求項６１～６３のいずれか一項に記載の方法。
66. 前記核酸が、前記ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列と作動可能に連結された、ヒトＣＲ１遺伝子のプロモーターを含む、請求項６１～６５のいずれか一項に記載の方法。
67. 前記核酸が、前記ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列と作動可能に連結された、ヒトＣＲ１遺伝子の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含む、請求項６１～６６のいずれか一項に記載の方法。
68. 前記核酸が、ヒトＣＲ１遺伝子の３’ＵＴＲを含む、請求項６１～６７のいずれか一項に記載の方法。
69. 前記核酸が、前記ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列と作動可能に連結された、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子の５’制御領域を含む、請求項６１～６５のいずれか一項に記載の方法。
70. 前記５’制御領域が、前記齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子のプロモーター領域を含む、請求項６９に記載の方法。
71. 前記５’制御領域が、前記齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子のＡＴＧコドンのすぐ上流に少なくとも１４Ｋｂのゲノム配列を含む、請求項７０に記載の方法。
72. 前記核酸が、前記ヒトＣＲ１ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列と作動可能に連結された、ヒトベータ－１グロビン遺伝子由来のポリアデニル化配列を含む３’ＵＴＲを含む、請求項６１～６５又は６９～７１のいずれかに記載の方法。
73. 前記核酸が、前記５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、並びに介在イントロンを有する、ＡＴＧからＳＴＯＰまでの前記ヒトＣＲ１コード配列と、前記５’ＵＴＲのすぐ上流にある少なくとも４０００ｂｐの５’上流配列、及び前記３’ＵＴＲのすぐ下流にある少なくとも１５０ｂｐの配列と、を含む、ヒトゲノムＤＮＡ配列を含み、前記核酸が、前記齧歯類Ｃｒ２遺伝子座と前記齧歯類Ｃｒ１ｌ遺伝子座との間に挿入される、請求項６１に記載の方法。
74. 前記核酸が、前記５’で、齧歯類Ｇａｔａ－１遺伝子のＡＴＧのすぐ上流にある少なくとも１４Ｋｂのヌクレオチド配列と、前記３’で、ヒトベータグロビン遺伝子の３’ＵＴＲ配列と、作動可能に連結された、ＡＴＧからＳＴＯＰまでのヒトＣＲ１コードｃＤＮＡ配列を含み、前記核酸が、前記齧歯類のＸ染色体に組み込まれる、請求項６１に記載の方法。
75. 前記齧歯類ＥＳ細胞が、マウスＥＳ細胞又はラットＥＳ細胞である、請求項６１～７４のいずれか一項に記載の方法。