JP7169979B2 - 補体関連腎症および肝線維症の候補治療剤の治療有効性を評価する方法 - Google Patents

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関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年２月２７日出願の米国仮特許出願第６２／４６４，２６２号、２０１７年７月７日出願の米国仮特許出願第６２／５２９，９１６号、および２０１７年１１月９日出願の米国仮特許出願第６２／５８３，７８０号の利益を主張するものであり、これらの仮特許出願の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。

配列表の参照による組み込み
２０１８年２月１２日に作製され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して米国特許商標庁に提出された３５４６９＿１０２０７ＵＳ０１＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称の６ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルの配列表が、参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書では、特に、補体関連腎症および肝臓の線維症を治療するための候補治療剤または化合物をスクリーニングするために、全体的または部分的にヒトであるＣ３遺伝子を含む遺伝子組み換え非ヒト動物を使用する方法、ならびに補体関連腎症と診断されたかまたはこれを有すると考えられる個体を治療する方法を提供する。

補体タンパク質Ｃ３は、様々なヒト疾患、障害、および状態の治療のための治療標的である。特定のＣ３コンバターゼによるＣ３のタンパク質切断は、補体経路活性化に大きな役割を果たす。Ｃ３コンバターゼはＣ３ｂの形態を生成し、これは次に新しいＣ３コンダクターゼ分子の可能性のある成分であり、それによって補体カスケードを刺激および増幅する。

代替的な補体経路の不必要な活性化は、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）などの腎症ならびにデンスデポジット病（ＤＤＤ）およびＣ３糸球体腎炎（Ｃ３ＧＮ）を包含する膜性増殖性糸球体腎炎の形態であるＣ３糸球体症（Ｃ３Ｇ）の考えられる原因として提唱されてきた。進行すると、これらの疾患は腎機能を害し、劣化させる。糸球体膜には、補体経路活性化を阻害する可能性のある内因性補体調節膜タンパク質がないため、補体関連腎症を持つ個体のこの部位でＣ３の連続的かつ未制御の切断が起こり、補体活性化産物の沈着、糸球体基底膜のＣ３コンバターゼ媒介損傷、上皮細管および内皮細胞の損傷、細胞外マトリックスの沈着による膜の肥厚、補体系の成分の沈着（例えば、Ｃ３切断産物）ならびに最終的にはろ過不良（タンパク尿）および腎不全をもたらす。

補体関連腎症の治療のためのヒトＣ３タンパク質を特異的に標的とする候補治療用分子の薬物動態学（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）の評価は、非ヒト動物、例えば、齧歯類、例えば、マウスまたはラットでルーチンに遂行されている。しかしながら、ある特定の非ヒト動物では、これらの治療用分子は内因性Ｃ３タンパク質または遺伝子を標的としないため、かかる治療用分子のＰＤを適正に判定することができない。

従って、非ヒト動物のＣ３遺伝子が全体的または部分的にヒト化した、あるいはヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質をコードする配列を含むヒトＣ３遺伝子で（例えば、内因性非ヒト遺伝子座において）置換された非ヒト動物、例えば齧歯類、例えばネズミ科の動物、例えばマウスまたはラットに対するニーズがある。かかる動物は、腎臓の病理学的レベルのＣ３沈着による代替補体経路の過剰な活性化に関連するものなど、補体関連腎症の治療のための候補治療剤の有効性を評価するための理想的なモデルとして役立つ可能性があり、特に操作された非ヒト動物は、ヒト疾患で観察される症状に対応するこれらの症状を示す。

本明細書全体を通して、様々な特許、特許出願、およびその他の種類の刊行物（例えば、ジャーナル物品、電子データベース入力、など）が参照されている。
本明細書に引用されるすべての特許、特許出願、およびその他の出版物の開示は、全ての目的に対してその全体が参照により本明細書に援用される。

本明細書では、特に、スクリーニングのために補体関連腎症および／または肝線維症を有するヒトで観察される症状に対応する一つまたは複数の症状を示す、または補体関連腎症および／または肝線維症の治療のための候補治療化合物または治療剤を特定する、全体または一部がヒトであるＣ３遺伝子を含む遺伝子組み換え非ヒト動物を使用する方法を提供する。また、補体関連腎症と診断されたか、または補体関連腎症を有すると考えられる個体における腎機能を改善する方法が本明細書に提供される。

従って、一部の態様では、本明細書では、補体関連腎症の治療に使用するための薬剤のインビボでの治療有効性を評価する方法であって、（ａ）ゲノムがヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列とＣ３遺伝子のエクソンを含む齧歯類遺伝子配列の内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座での置換を含む齧歯類に薬剤を投与して、修飾Ｃ３遺伝子を形成することと、ここで修飾Ｃ３遺伝子の発現は、内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座での齧歯類調節エレメントの制御下にある、形成することと；および（ｂ）薬剤を投与されていない対照齧歯類と比較して、腎症の一つまたは複数の症状を阻害する（例えば、防止、改善、または軽減する）かどうかを評価することと、を含む、方法を提供する。一部の実施形態では、当該齧歯類はマウスまたはラットである。一部の実施形態では、ヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列は、ヒトＣ３遺伝子のエクソン１からエクソン４１を含む。一部の実施形態では、ヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列は、ヒトＣ３遺伝子のエクソン２からエクソン４１を含む。一部の実施形態では、齧歯類は、マウスＣ３タンパク質を発現する能力を有しないマウスである。一部の実施形態では、齧歯類は、内因性マウスＣ５遺伝子によってコードされたマウスＣ５タンパク質を発現するマウスである。一部の実施形態では、薬剤は、小分子化学物質、ペプチド、および抗体からなる群から選択される。一部の実施形態では、薬剤は抗体である。一部の実施形態では、薬剤はモノクローナル抗体またはその機能的結合断片である。一部の実施形態では、薬剤は阻害性核酸である。一部の実施形態では、阻害性核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、およびリボザイムからなる群から選択される。一部の実施形態では、腎症の一つまたは複数の症状が自然死を含む。一部の実施形態では、腎症の一つまたは複数の症状には、体重減少、骨密度の減少、体脂肪の減少、またはそれらの組み合わせが含まれる。一部の実施形態では、腎症の一つまたは複数の症状は、糸球体腎炎、好塩基球細管、硬化糸球体、蛋白円柱を有する拡張細管、メサンギウム基質増加、糸球体肥大、および単核間質炎症からなる群の一つまたは複数から選択される。一部の実施形態では、腎症の一つまたは複数の症状は、腎臓におけるＣ３タンパク質沈着を含む。一部の実施形態では、腎症の一つまたは複数の症状は、腎臓におけるＣ５ｂ－９膜侵襲複合体の形成を含む。一部の実施形態では、腎症の一つまたは複数の症状は、高血中尿素窒素（ＢＵＮ）、血清リパーゼ、血清シスタチンＣ、または血清非高密度リポタンパク質のうちの一つまたは複数を含む。一部の実施形態では、Ｃ３糸球体症の一つまたは複数の症状は、尿アルブミンまたは尿路Ｃ５ａの増加を含む。一部の実施形態では、補体関連腎症の一つまたは複数の症状は、一つまたは複数の疾患シグネチャー遺伝子、すなわち補体関連腎症を伴わない野生型齧歯類と比較して、補体関連腎症を有する齧歯類において、相補的に発現する遺伝子の発現を決定することによって評価される。

別の態様では、本明細書では、肝臓の線維症の治療に使用するための薬剤のインビボでの治療有効性を評価する方法であって、（ａ）ゲノムがヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列とＣ３遺伝子のエクソンを含む齧歯類遺伝子配列の内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座での置換を含む齧歯類に薬剤を投与して、修飾Ｃ３遺伝子を形成することと、ここで修飾Ｃ３遺伝子の発現は、内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座での齧歯類調節エレメントの制御下にある、形成することと；および（ｂ）薬剤を投与されていない対照齧歯類と比較して、肝線維症の一つまたはそれ以上の症状を阻害する（例えば、防止、改善、または軽減する）かどうかを評価することと、を含む、方法を提供する。一部の実施形態では、当該齧歯類はマウスまたはラットである。一部の実施形態では、ヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列は、ヒトＣ３遺伝子のエクソン１からエクソン４１を含む。一部の実施形態では、ヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列は、ヒトＣ３遺伝子のエクソン２からエクソン４１を含む。一部の実施形態では、齧歯類は、マウスＣ３タンパク質を発現する能力を有しないマウスである。一部の実施形態では、齧歯類は、内因性マウスＣ５遺伝子によってコードされたマウスＣ５タンパク質を発現するマウスである。一部の実施形態では、薬剤は、小分子化学物質、ペプチド、および抗体からなる群から選択される。一部の実施形態では、薬剤は抗体である。一部の実施形態では、薬剤はモノクローナル抗体またはその機能的結合断片である。一部の実施形態では、薬剤は阻害性核酸である。一部の実施形態では、阻害性核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、およびリボザイムからなる群から選択される。一部の実施形態では、肝線維症の一つまたは複数の症状が、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、またはアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）のうちの一つまたは複数を含む。一部の実施形態では、肝線維症の一つまたは複数の症状は、一つまたは複数の疾患シグネチャー遺伝子、すなわち肝線維症のない野生型齧歯類と比較して肝線維症を有する齧歯類で差次的に発現される遺伝子の発現を決定することにより評価される。

さらなる態様では、本明細書では、ゲノムがヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列を有するＣ３遺伝子のエクソンを含む齧歯類遺伝子配列の内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座での置換を含み、修飾Ｃ３遺伝子を形成する、齧歯類における補体関連腎症の症状を阻害する薬剤を特定するための方法であって、修飾Ｃ３遺伝子の発現が、内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座で齧歯類調節エレメントの制御下にあり、（ａ）齧歯類に薬剤を投与することと、（ｂ）薬剤が齧歯類における補体関連腎症の一つまたは複数の症状を阻害する場合、補体関連腎症の症状を阻害する薬剤としての薬剤を特定することと、を含む、方法を提供する。一部の実施形態では、当該齧歯類はマウスまたはラットである。一部の実施形態では、ヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列は、ヒトＣ３遺伝子のエクソン１からエクソン４１を含む。一部の実施形態では、ヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列は、ヒトＣ３遺伝子のエクソン２からエクソン４１を含む。一部の実施形態では、齧歯類は、マウスＣ３タンパク質を発現する能力を有しないマウスである。一部の実施形態では、齧歯類は、内因性マウスＣ５遺伝子によってコードされたマウスＣ５タンパク質を発現するマウスである。一部の実施形態では、薬剤は、小分子化学物質、ペプチド、および抗体からなる群から選択される。一部の実施形態では、薬剤は抗体である。一部の実施形態では、薬剤はモノクローナル抗体またはその機能的結合断片である。一部の実施形態では、薬剤は阻害性核酸である。一部の実施形態では、阻害性核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、およびリボザイムからなる群から選択される。一部の実施形態では、腎症の一つまたは複数の症状が自然死を含む。一部の実施形態では、腎症の一つまたは複数の症状には、体重減少、骨密度の減少、体脂肪の減少、またはそれらの組み合わせが含まれる。一部の実施形態では、腎症の一つまたは複数の症状は、糸球体腎炎、好塩基球細管、硬化糸球体、蛋白円柱を有する拡張細管、メサンギウム基質増加、糸球体肥大、および単核間質炎症からなる群の一つまたは複数から選択される。一部の実施形態では、腎症の一つまたは複数の症状は、腎臓におけるＣ３タンパク質沈着を含む。一部の実施形態では、腎症の一つまたは複数の症状は、腎臓におけるＣ５ｂ－９膜侵襲複合体の形成を含む。一部の実施形態では、腎症の一つまたは複数の症状は、高血中尿素窒素（ＢＵＮ）、血清リパーゼ、血清シスタチンＣ、または血清非高密度リポタンパク質のうちの一つまたは複数を含む。一部の実施形態では、Ｃ３糸球体症の一つまたは複数の症状は、尿アルブミンまたは尿路Ｃ５ａの増加を含む。一部の実施形態では、補体関連腎症の一つまたは複数の症状は、疾患シグネチャー遺伝子の一つまたは複数の発現を決定することによって評価される。

さらなる他の態様では、本明細書では、齧歯類のゲノムが内因性Ｃ３遺伝子で修飾Ｃ３遺伝子を含み、修飾Ｃ３遺伝子は、ヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列を含み、修飾Ｃ３の発現は、内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座での齧歯類調節エレメントの制御下にある、ヒト補体関連腎症の齧歯類モデルを提供する。一部の実施形態では、核酸配列は、齧歯類Ｃ３遺伝子座で内因性齧歯類Ｃ３プロモーターに動作可能に連結されている。一部の実施形態では、当該齧歯類はマウスまたはラットである。一部の実施形態では、ヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列は、ヒトＣ３遺伝子のエクソン１からエクソン４１を含む。一部の実施形態では、ヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列は、ヒトＣ３遺伝子のエクソン２からエクソン４１を含む。一部の実施形態では、齧歯類は、マウスＣ３タンパク質を発現する能力を有しないマウスである。一部の実施形態では、齧歯類は、内因性マウスＣ５遺伝子によってコードされたマウスＣ５タンパク質を発現するマウスである。一部の実施形態では、齧歯類は、自然死、体重の減少、骨密度の減少、体脂肪の減少、糸球体腎炎、好塩基球細管、硬化糸球体、蛋白円柱を有する拡張細管、メサンギウム基質増加、糸球体肥大、単核間質炎症、腎臓内Ｃ３タンパク質沈着、腎臓内Ｃ５ｂ－９膜侵襲複合体の形成、高血中尿素窒素（ＢＵＮ）、高血清リパーゼ、高血清シスタチンＣ、高血清非高密度リポタンパク質、尿アルブミンの増加、尿Ｃ５ａの増加、および疾患遺伝子シグネチャーからなる群から選択されるヒト補体関連腎症の一つまたは複数の症状を示す。

別の態様では、本明細書では、（ａ）ゲノムがヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列を有するＣ３遺伝子のエクソンを含む齧歯類遺伝子配列の内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座での置換を含み、修飾Ｃ３遺伝子を形成する齧歯類であって、修飾Ｃ３遺伝子の発現が、内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座で齧歯類調節エレメントの制御下にあり、齧歯類が補体関連腎症の一つまたは複数の症状を示す、齧歯類と、（ｂ）一つまたは複数の候補治療剤とを含む、補体関連腎症の症状を阻害する候補治療剤の治療効果を評価するための齧歯類モデルを提供する。一部の実施形態では、当該齧歯類はマウスまたはラットである。一部の実施形態では、ヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列は、ヒトＣ３遺伝子のエクソン１からエクソン４１を含む。一部の実施形態では、ヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列は、ヒトＣ３遺伝子のエクソン２からエクソン４１を含む。一部の実施形態では、齧歯類は、マウスＣ３タンパク質を発現する能力を有しないマウスである。一部の実施形態では、齧歯類は、内因性マウスＣ５遺伝子によってコードされたマウスＣ５タンパク質を発現するマウスである。一部の実施形態では、薬剤は、小分子化学物質、ペプチド、および抗体からなる群から選択される。一部の実施形態では、薬剤は抗体である。一部の実施形態では、薬剤はモノクローナル抗体またはその機能的結合断片である。一部の実施形態では、薬剤は阻害性核酸である。一部の実施形態では、阻害性核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、およびリボザイムからなる群から選択される。一部の実施形態では、腎症の一つまたは複数の症状が自然死を含む。一部の実施形態では、腎症の一つまたは複数の症状には、体重減少、骨密度の減少、体脂肪の減少、またはそれらの組み合わせが含まれる。一部の実施形態では、腎症の一つまたは複数の症状は、糸球体腎炎、好塩基球細管、硬化糸球体、蛋白円柱を有する拡張細管、メサンギウム基質増加、糸球体肥大、および単核間質炎症からなる群の一つまたは複数から選択される。一部の実施形態では、腎症の一つまたは複数の症状は、腎臓におけるＣ３タンパク質沈着を含む。一部の実施形態では、腎症の一つまたは複数の症状は、腎臓におけるＣ５ｂ－９膜侵襲複合体の形成を含む。一部の実施形態では、腎症の一つまたは複数の症状は、高血中尿素窒素（ＢＵＮ）、血清リパーゼ、血清シスタチンＣ、または血清非高密度リポタンパク質のうちの一つまたは複数を含む。一部の実施形態では、Ｃ３糸球体症の一つまたは複数の症状は、尿アルブミンまたは尿路Ｃ５ａの増加である。一部の実施形態では、補体関連腎症の一つまたは複数の症状は、疾患シグネチャー遺伝子の一つまたは複数の発現を決定することによって評価される。

さらなる態様では、本明細書では、ゲノムがヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列を有するＣ３遺伝子のエクソンを含む齧歯類遺伝子配列の内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座での置換を含み、修飾Ｃ３遺伝子を形成する、齧歯類における肝線維症を阻害する薬剤を特定するための方法であって、修飾Ｃ３遺伝子の発現が、内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座で齧歯類調節エレメントの制御下にあり、（ａ）齧歯類に薬剤を投与することと、（ｂ）薬剤が齧歯類中の肝線維症の一つまたは複数の症状を阻害する場合、肝線維症を阻害する薬剤としての薬剤を特定することと、を含む方法を提供する。一部の実施形態では、当該齧歯類はマウスまたはラットである。一部の実施形態では、ヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列は、ヒトＣ３遺伝子のエクソン１からエクソン４１を含む。一部の実施形態では、ヒトＣ３タンパク質をコードするヒトＣ３遺伝子は、ヒトＣ３遺伝子のエクソン２からエクソン４１までを含む。一部の実施形態では、齧歯類は、マウスＣ３タンパク質を発現する能力を有しないマウスである。本明細書に開示される実施形態のいずれかのうちの一部の実施形態では、齧歯類は、内因性マウスＣ５遺伝子によってコードされたマウスＣ５タンパク質を発現するマウスである。一部の実施形態では、薬剤は、小分子化学物質、ペプチド、および抗体からなる群から選択される。一部の実施形態では、薬剤は抗体である。一部の実施形態では、薬剤はモノクローナル抗体またはその機能的結合断片である。一部の実施形態では、薬剤は阻害性核酸である。一部の実施形態では、阻害性核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、およびリボザイムからなる群から選択される。一部の実施形態では、肝線維症の一つまたは複数の症状が、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、またはアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）のうちの一つまたは複数である。一部の実施形態では、肝線維症の一つまたは複数の症状は、疾患シグネチャー遺伝子の一つまたは複数の発現を決定することによって評価される。

別の態様では、本明細書では、齧歯類のゲノムが内因性Ｃ３遺伝子で修飾Ｃ３遺伝子を含み、修飾Ｃ３遺伝子は、ヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列を含み、修飾Ｃ３の発現は、内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座での齧歯類調節エレメントの制御下にある、ヒト肝線維症の齧歯類モデルを提供する。一部の実施形態では、核酸配列は、齧歯類Ｃ３遺伝子座で内因性マウスＣ３プロモーターに動作可能に連結されている。一部の実施形態では、核酸配列は、齧歯類Ｃ３遺伝子座で内因性齧歯類Ｃ３プロモーターに動作可能に連結されている。一部の実施形態では、当該齧歯類はマウスまたはラットである。一部の実施形態では、ヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列は、ヒトＣ３遺伝子のエクソン１からエクソン４１を含む。一部の実施形態では、ヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列は、ヒトＣ３遺伝子のエクソン２からエクソン４１を含む。一部の実施形態では、齧歯類は、マウスＣ３タンパク質を発現する能力を有しないマウスである。一部の実施形態では、齧歯類は、内因性マウスＣ５遺伝子によってコードされたマウスＣ５タンパク質を発現するマウスである。一部の実施形態では、齧歯類は、高アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、高アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、および高アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）からなる群から選択される肝線維症の一つまたは複数の症状を示す。一部の実施形態では、肝線維症の一つまたは複数の症状は、疾患シグネチャー遺伝子の一つまたは複数の発現を決定することによって評価される。

さらなる態様では、本明細書では、（ａ）ゲノムがヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列を有するＣ３遺伝子のエクソンを含む齧歯類遺伝子配列の内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座での置換を含み、修飾Ｃ３遺伝子を形成する齧歯類であって、修飾Ｃ３遺伝子の発現が、内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座で齧歯類調節エレメントの制御下にあり、齧歯類が肝線維症の一つまたは複数の症状を示す、齧歯類と、（ｂ）一つまたは複数の候補治療剤とを含む、肝線維症の症状を阻害する候補治療剤の治療効果を評価するための齧歯類モデルを提供する。一部の実施形態では、当該齧歯類はマウスまたはラットである。一部の実施形態では、ヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列は、ヒトＣ３遺伝子のエクソン１からエクソン４１を含む。一部の実施形態では、ヒトＣ３タンパク質をコードするヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列は、ヒトＣ３遺伝子のエクソン２からエクソン４１を含む。一部の実施形態では、齧歯類は、マウスＣ３タンパク質を発現する能力を有しないマウスである。一部の実施形態では、齧歯類は、内因性マウスＣ５遺伝子によってコードされたマウスＣ５タンパク質を発現するマウスである。一部の実施形態では、薬剤は、小分子化学物質、ペプチド、および抗体からなる群から選択される。一部の実施形態では、薬剤は抗体である。一部の実施形態では、薬剤はモノクローナル抗体またはその機能的結合断片である。一部の実施形態では、薬剤は阻害性核酸である。一部の実施形態では、阻害性核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、およびリボザイムからなる群から選択される。一部の実施形態では、肝線維症の一つまたは複数の症状が、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、またはアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）のうちの一つまたは複数を含む。一部の実施形態では、肝線維症の一つまたは複数の症状は、疾患シグネチャー遺伝子の一つまたは複数の発現を決定することによって評価される。

さらなる態様では、本明細書では、個体に対する臨床的に有効な量の治療剤の投与を含む、補体関連腎症、または肝線維症と診断されたか、またはこれを有すると考えられる個体を治療するための方法を提供する。個体への治療的投与は、例えば、Ｃ５の発現または活性を阻害する薬剤、Ｃ３の発現または活性を阻害する薬剤、およびＣ３（Ｃ３ａまたはＣ３ｂ）のタンパク質切断産物の活性を阻害する薬剤を含む。投与は、腎機能または肝臓機能を改善し、補体関連腎症または肝線維症の一つまたは複数の症状を改善する。

一部の実施形態では、本明細書では、補体関連腎症と診断されたか、またはこれを有すると考えられる個体において、臨床的に有効な量の治療剤の投与を含む、腎機能を改善するための方法であって、投与が治療剤を投与されてこなかった補体関連腎症と診断された個体に対して腎機能を改善する方法が提供される。一部の実施形態では、改善された腎機能は、血中尿素窒素（ＢＵＮ）濃度の減少、血清シスタチンＣ濃度の減少、および／または尿Ｃ５ａ濃度の減少のうちの一つまたは複数を含む。一部の実施形態では、Ｃ５の発現または活性を阻害する治療剤が投与され、ＢＵＮは個体で約１０～５０％減少する。一部の実施形態では、Ｃ５の発現または活性を阻害する治療剤が投与され、血清シスタチンＣ濃度は個体で約１０～６０％減少する。一部の実施形態では、Ｃ５の発現または活性を阻害する治療剤が投与され、尿Ｃ５ａ濃度は個体で約４０～８５％減少する。

他の実施形態では、本明細書では、補体関連腎症と診断されたか、またはこれを有すると考えられる個体において、臨床的に有効な量の治療剤の投与を含む、糸球体膜侵襲複合体（ＭＡＣ）形成を減少させるための方法であって、投与が治療剤を投与されてこなかった補体関連腎症と診断された個体に対して糸球体ＭＡＣ形成を減少させる方法が提供される。一部の実施形態では、Ｃ５の発現または活性を阻害する治療剤が投与され、ＭＡＣ形成は個体で約５～２０％減少する。本明細書に開示される実施形態のいずれか一部の実施形態では、ＭＡＣ形成は、個体の糸球体係蹄のＣ９沈着によって決定される。

なお他の実施形態では、本明細書では、補体関連腎症と診断されたか、またはこれを有すると考えられる個体において、臨床的に有効な量の治療剤の投与を含む、腎糸球体または腎間質への免疫細胞浸潤を減少させるための方法であって、投与が治療剤を投与されてこなかった補体関連腎症と診断された個体に対して腎臓の免疫細胞浸潤を減少させる方法が提供される。一部の実施形態では、免疫細胞は、糸球体に浸潤する好中球である。一部の実施形態では、Ｃ５の発現または活性を阻害する治療剤が投与されると、糸球体の好中球浸潤は約５０～１００％減少する。一部の実施形態では、免疫細胞は、間質を浸潤するマクロファージである。一部の実施形態では、Ｃ５の発現または活性を阻害する治療剤が投与されると、間質のマクロファージ浸潤は約３０～７０％減少する。

一部の実施形態では、本明細書では、補体関連腎症と診断されたか、またはこれを有すると考えられる個体の腎臓において、臨床的に有効な量の治療剤の投与を含む、糸球体サイズおよび／またはメサンギウム基質増加を減少させるための方法であって、この投与が、治療剤を投与されてこなかった補体関連腎症と診断された個体に対して個体の腎臓における糸球体サイズおよび／またはメサンギウム基質増加を減少させる方法が提供される。一部の実施形態では、Ｃ５の発現または活性を阻害する治療剤が投与され、糸球体サイズおよび／またはメサンギウム基質増加が約１５～３０％減少する。

本明細書に開示される実施形態のいずれか一部の実施形態では、補体関連腎症は、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）またはＣ３糸球体症（Ｃ３Ｇ）である。一部の実施形態では、Ｃ３Ｇは、デンスデポジット病（ＤＤＤ）またはＣ３糸球体腎炎（Ｃ３ＧＮ）を含む。

本明細書に開示される実施形態のいずれか一部の実施形態では、治療剤（例えば、Ｃ５の発現もしくは活性を阻害する薬剤、Ｃ３の発現もしくは活性を阻害する薬剤、またはＣ３ａもしくはＣ３ｂの活性を阻害する薬剤）は、抗体、阻害性核酸、抗体結合ポリペプチド、または小分子化学物質のうちの一つまたは複数である。一部の実施形態では、阻害性核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、またはリボザイムからなる群から選択される。一部の実施形態では、治療剤は、抗体またはその機能的断片である。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｓｅｄ）抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ融合抗体、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合型Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、Ｆａｂ断片、およびＦ（ａｂ’）断片からなる群から選択される。一部の実施形態では、個体は、約５０ｍｇ／ｋｇの抗体（例えば、抗Ｃ５抗体または抗Ｃ３ｂ抗体）を投与される。一部の実施形態では、個体は週三回抗体を投与される。一部の実施形態では、個体は、抗体（例えば、抗Ｃ５抗体または抗Ｃ３ｂ抗体）を約９週間投与される。

さらなる態様では、補体関連腎症または肝線維症の治療における使用のための治療法が本明細書に開示されている。治療剤は、例えば、Ｃ５の発現または活性を阻害する薬剤、Ｃ３の発現または活性を阻害する薬剤、およびＣ３（Ｃ３ａまたはＣ３ｂ）のタンパク質切断産物の活性を阻害する薬剤を含む。一部の実施形態では、治療剤は抗Ｃ５抗体である。一部の実施形態では、治療剤は抗Ｃ３ｂ抗体である。一部の実施形態では、治療における治療剤の使用は、治療剤を使用しない治療と比較して、腎機能（例えば、血中尿素窒素（ＢＵＮ）濃度の減少、血清シスタチンＣ濃度の減少、および／または尿中Ｃ５ａ濃度の減少、またはそれらの組み合わせ）を改善する。一部の実施形態では、治療における治療剤の使用は、治療剤を使用しない治療と比較して、糸球体ＭＡＣ形成を減少させる。一部の実施形態では、治療における治療剤の使用は、治療剤を使用しない治療と比較して、腎臓内の免疫細胞浸潤を減少させる。一部の実施形態では、治療における治療剤の使用は、治療剤を使用しない治療と比較して、腎臓内の糸球体サイズおよび／またはメサンギウム基質増加を減少させる。

特許または出願の書類は、色付きで描かれた少なくとも一つの図面を含有する。色付きの図面（複数含む）を伴う本特許または特許出願公開の写しは、要求により、および必要な料金を支払うことにより当局から提供される。
図１Ａは、マウス（ｍＣ３）およびヒト化（ｈＣ３）Ｃ３ゲノム遺伝子座のノンスケールの例示を提供する。５’調節エレメントおよびエクソン１からエクソン４１までのコード領域にわたるマウスＣ３遺伝子は削除され、ヒトＣ３遺伝子の５’調節エレメントおよびエクソン１からエクソン４１までのコード領域およびｌｏｘＰ部位によって置換され、それぞれ太線および矢印で示される。図１Ｂは、マウス（ｍＣ３）およびヒト化（ｈＣ３）Ｃ３ゲノム遺伝子座のノンスケールの例示を提供する。イントロン１の一部およびエクソン２からエクソン４１までのコード領域にわたるマウスＣ３遺伝子は削除され、ヒトＣ３遺伝子のイントロン１の一部およびエクソン２からエクソン４１までのコード領域およびｌｏｘＰ部位によって置換され、それぞれ太線および矢印で示される。 図２Ａおよび図２Ｂは、マウスＣ３（図２Ａ）またはマウスＣ３ａ（図２Ｂ）に対して実施されたＭＡＩＤ６１５６およびＭＡＩＤ６１４９ホモ接合性マウスに由来する、血清および血漿のＥＬＩＳＡ分析の結果を示すグラフである。丸は６１４９または６１５６野生型（ＷＴ）対照を表し、正方形はＭＡＩＤ６１５６およびＭＡＩＤ６１４９ホモ接合性マウス（ＨＯ）を表し、ひし形はＣ３ノックアウト（ヌル）動物を表し、および三角形は、正常なヒト血漿（ＮＨＰ）または正常なヒト血清（ＮＨＳ）を表す。ＮＤ＝検出されず。 図３Ａおよび図３Ｂは、ヒトＣ３（図３Ａ）またはヒトＣ３ａ（図３Ｂ）に対して実施されたＭＡＩＤ６１５６およびＭＡＩＤ６１４９ホモ接合性マウスに由来する、血清および血漿のＥＬＩＳＡ分析の結果を示すグラフである。丸は６１４９または６１５６野生型（ＷＴ）対照を表し、正方形はＭＡＩＤ６１５６およびＭＡＩＤ６１４９ホモ接合性マウス（ＨＯ）を表し、ひし形はＣ３ノックアウト動物を表し、および三角形は、正常なヒト血漿（ＮＨＰ）または正常なヒト血清（ＮＨＳ）を表す。ＮＤ＝検出されず。 図４は、マウス血清アミロイドＡタンパク質（ｍＳＡＡ）に対して行われたＭＡＩＤ６１５６およびＭＡＩＤ６１４９ホモ接合性マウスに由来する血清および血漿のＥＬＩＳＡ分析の結果を示すグラフである。丸は６１４９または６１５６野生型（ＷＴ）対照を表し、正方形はＭＡＩＤ６１５６およびＭＡＩＤ６１４９ホモ接合性マウス（ＨＯ）を表し、ひし形はＣ３ノックアウト動物由来の血漿を表す。 図５は、ＭＡＩＤ６１４９（図５Ａ）およびＭＡＩＤ６１５６ホモ接合性マウス（図５Ｂ）由来の血清に対して実施されたウエスタンブロットを示す。本試験で使用される抗ヒトＣ３抗体は、マウスＣ３と交差反応性である。 図６は、ＭＡＩＤ６１４９（左）およびＭＡＩＤ６１５６ホモ接合性マウス（右）のＦ２、Ｆ３、およびＦ４世代の生存曲線を経時的に示す。 図７は、ＭＡＩＤ６１４９（左）およびＭＡＩＤ６１５６（右）ホモ接合性（ＨＯ）および野生型（ＷＴ）マウスの経時的な体重損失／獲得を表すグラフを示す。 図８Ａおよび図８Ｂは、野生型（ＷＴ）、ならびにＭＡＩＤ６１４９（図８Ａ）およびＭＡＩＤ６１５６（図８Ｂ）ホモ接合性（ＨＯ）マウスで実施された体脂肪分析の結果を表すグラフを示す。 図９Ａおよび図９Ｂは、野生型（ＷＴ）、ならびにＭＡＩＤ６１４９（図９Ａ）およびＭＡＩＤ６１５６（図９Ｂ）ホモ接合性（ＨＯ）マウスで実施された骨密度および骨塩量分析の結果を表すグラフを示す。 図１０Ａは、正常なマウスから得られた、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色された腎臓組織の断面を示す。図１０Ｂは、ＭＡＩＤ６１５６ホモ接合性（ＨＯ）マウスから得られたＨ＆Ｅ染色腎組織を示す。 図１１Ａは、野生型（ＷＴ）およびホモ接合性ヒト化Ｃ３マウス（ｈｕＣ３）ＭＡＩＤ６１４９マウスから得られた過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色腎組織の断面を示す。画像はその部分の平均的な病理を表す。矢印は硬化性糸球体の例を示す。図１１Ｂは、野生型（Ｃ３ｗｔ）マウスと比較して、ヒト化Ｃ３マウス（ｈｕＣ３）マウスの腎臓におけるメサンギウム基質増加の数量化を表すグラフを示す。糸球体係蹄領域の増加は、糸球体肥大を示していた。糸球体内のＰＡＳ染色領域の増加は、メサンギウム基質増加を示していた。 図１２は、野生型（ＷＴ）とＭＡＩＤ６１４９およびＭＡＩＤ６１５６ホモ接合性（ＨＯ）マウスとの間のナトリウム、カリウム、塩化物、カルシウム、グルコース、総タンパク質、クレアチニン、クレアチンキナーゼ、アルブミン、アミラーゼ、総ビリルビン、マグネシウム、無機リン酸、尿酸、リン、非エステル化脂肪酸、総コレステロール、トリグリセリド、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、および低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レベルの血清化学パネル分析の結果を表すグラフを示す。 同上。 同上。 図１３Ａは、野生型（ＷＴ）とＭＡＩＤ６１４９とＭＡＩＤ６１５６ホモ接合性（ＨＯ）マウスとの間の血中尿素窒素、非高密度リポタンパク質（非ＨＤＬ）、およびリパーゼレベルの血清化学パネル解析の結果を表すグラフを示す。図１３Ｂは、野生型（ＷＴ）とＭＡＩＤ６１４９とＭＡＩＤ６１５６ホモ接合性（ＨＯ）マウスとの間のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、ＡＬＴ／ＡＳＴ比、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）レベルの肝臓酵素分析の結果を表すグラフを示す。 図１４Ａは、野生型（ＷＴ）およびヒト化Ｃ３（ｈｕＣ３）ＭＡＩＤ６１４９マウスのアルブミンの尿パネル分析の結果を表すグラフを示す。図１４Ｂは、野生型（ＷＴ）およびヒト化Ｃ３（ｈｕＣ３）マウスの血清ＢＵＮおよびシスタチンＣの分析を示す。 図１５Ａは、ヒトＣ３タンパク質染色した、野生型（ＷＴ）およびホモ接合性（ＨＯ）ヒト化Ｃ３ ＭＡＩＤ６１４９マウスから得られた腎臓組織の断面を表す免疫蛍光顕微鏡写真を示す。図１５Ｂは、Ｃ５ｂ－９膜侵襲複合体（赤）染色した、野生型（ＷＴ）およびヒト化Ｃ３（ｈｕＣ３）マウスから得られた腎臓組織の断面を表す免疫蛍光顕微鏡写真を示す。ＤＮＡはＤＡＰＩで青に染色されている。 図１５Ｃは、野生型（ＷＴ）およびヒト化Ｃ３（ｈｕＣ３）ＭＡＩＤ６１４９マウスから得られた尿Ｃ５ａレベルを示す。 図１６は、ＭＡＩＤ６１４９およびＭＡＩＤ６１５６ホモ接合性（ＨＯ）マウスにおけるＲＮＡ発現の器官特異的大域変化を表す棒グラフを示す。 図１７は、ＭＡＩＤ６１４９およびＭＡＩＤ６１５６ホモ接合性（ＨＯ）マウスの肝臓対野生型（ＷＴ）マウスの肝臓におけるＲＮＡシグネチャーの重複を示す遺伝子シグネチャーマップおよび表を示す。 図１８は、ＭＡＩＤ６１４９およびＭＡＩＤ６１５６ホモ接合性マウスの肝臓における上位濃縮遺伝子発現経路を表す表を示す。 図１９は、ＭＡＩＤ６１５６ホモ接合性マウスの肝臓で上方制御（黄色で強調表示）または下方制御（青色で強調表示）された線維症遺伝子シグネチャーを表す表を示す。統計的有意性に達しなかった変化は、「－」で識別されている。 同上。 図２０は、ＭＡＩＤ６１４９およびＭＡＩＤ６１５６ホモ接合性（ＨＯ）マウスの腎臓対野生型（ＷＴ）マウスの腎臓におけるＲＮＡシグネチャーの重複を示す遺伝子シグネチャーマップおよび表を示す。 図２１Ａは、野生型（ＷＴ）マウスと比較して、ＭＡＩＤ６１４９ヒト化Ｃ３（ｈｕＣ３）マウスにおける腎臓特異的遺伝子発現の変化を表す棒グラフを示す。 図２１Ｂは、野生型（ＷＴ）マウスと比較して、ヒト化Ｃ３（ｈｕＣ３）マウスにおける腎毒性遺伝子発現の変化を示す。図２１Ｃは、野生型（ＷＴ）マウスと比較して、ヒト化Ｃ３（ｈｕＣ３）マウスにおける細胞外基質遺伝子発現の変化を示す。図２１Ｄは、野生型（ＷＴ）マウスと比較して、ヒト化Ｃ３（ｈｕＣ３）マウスにおけるサイトカイン遺伝子発現の変化を示す。図２１Ｅは、野生型（ＷＴ）マウスと比較して、ヒト化Ｃ３（ｈｕＣ３）マウスにおけるケモカイン遺伝子発現の変化を示す。図２１Ｂ～図２１Ｅは、黄色の強調表示の数値は、最新の発現を表し、青色の強調表示の数値は、下方制御された発現を表し、空白のままのセルは統計的有意性に達しなかった変化を表す。 同上。 同上。 同上。 図２２は、アイソタイプ対照で処置された野生型マウス（ＷＴ＋Ｃｔｌ Ａｂ）、およびアイソタイプ対照で処置されたＣ３ヒト化ＭＡＩＤ６１４９マウス（ＨｕｍＩｎ Ｃ３＋Ｃｔｌ Ａｂ）または抗Ｃ５抗体Ｍ１Ｍ１７６２８Ｎで処置されたＣ３ヒト化ＭＡＩＤ６１４９マウス（ＨｕｍＩｎ Ｃ３＋Ｍ１Ｍ１７６２８Ｎ）の生存曲線を示す。 図２３は、アイソタイプ対照で処置された野生型マウス（ＷＴ＋Ｃｔｌ Ａｂ）、およびアイソタイプ対照で処置されたＣ３ヒト化ＭＡＩＤ６１４９マウス（ＨｕｍＩｎ Ｃ３＋Ｃｔｌ Ａｂ）または抗Ｃ５抗体Ｍ１Ｍ１７６２８Ｎ（ＨｕｍＩｎ Ｃ３＋Ｍ１Ｍ１７６２８Ｎ）で処置されたＣ３ヒト化ＭＡＩＤ６１４９マウスの体重のグラフを示す。 図２４Ａおよび図２４Ｂは、アイソタイプ対照で処置された野生型マウス（ＷＴ＋Ｃｔｌ Ａｂ）、およびアイソタイプ対照で処置されたＣ３ヒト化ＭＡＩＤ６１４９マウス（ＨｕｍＩｎ Ｃ３＋Ｃｔｌ Ａｂ）または抗Ｃ５抗体Ｍ１Ｍ１７６２８Ｎ（ＨｕｍＩｎ Ｃ３＋Ｍ１Ｍ１７６２８Ｎ）で処置されたＣ３ヒト化ＭＡＩＤ６１４９マウスの腎機能のマーカーのレベルを示す。図２４Ａは、血中尿素窒素（ＢＵＮ）を、図２４Ｂは、血清シスタチンＣ濃度を示す。 図２５は、アイソタイプ対照で処置された野生型マウス（ＷＴ＋Ｃｔｌ Ａｂ）、およびアイソタイプ対照で処置されたＣ３ヒト化ＭＡＩＤ６１４９マウス（ＨｕｍＩｎ Ｃ３＋Ｃｔｌ Ａｂ）または抗Ｃ５抗体Ｍ１Ｍ１７６２８Ｎで処置されたＣ３ヒト化ＭＡＩＤ６１４９マウス（ＨｕｍＩｎ Ｃ３＋Ｍ１Ｍ１７６２８Ｎ）の尿中Ｃ５ａレベル（左）および正常化Ｃ５ａレベル（右）を表すグラフを示す。 図２６は、アイソタイプ対照で処置された野生型マウス（ＷＴ＋Ｃｔｌ Ａｂ）、およびアイソタイプ対照で処置されたＣ３ヒト化ＭＡＩＤ６１４９マウス（ＨｕｍＩｎ Ｃ３＋Ｃｔｌ Ａｂ）または抗Ｃ５抗体Ｍ１Ｍ１７６２８Ｎ（ＨｕｍＩｎ Ｃ３＋Ｍ１Ｍ１７６２８Ｎ）で処置されたＣ３ヒト化ＭＡＩＤ６１４９マウスの糸球体膜侵襲複合体（ＭＡＣ）含有量（Ｃ５ｂ－９）の免疫蛍光染色を数量化したグラフを示す。 図２７Ａは、アイソタイプ対照で処置した野生型マウス（ＷＴ＋Ｃｔｌ Ａｂ）、およびアイソタイプ対照で処置したＣ３ヒト化ＭＡＩＤ６１４９マウス（ＨｕｍＩｎ Ｃ３＋Ｃｔｌ Ａｂ）または抗Ｃ５抗体Ｍ１Ｍ１７６２８Ｎで処置したＣ３ヒト化ＭＡＩＤ６１４９マウス（ＨｕｍＩｎ Ｃ３＋Ｍ１Ｍ１７６２８Ｎ）における糸球体Ｇｒ－１^＋好中球浸潤を表すグラフ（上）、ならびにアイソタイプ対照で処置した野生型マウス（ＷＴ＋Ｃｔｌ Ａｂ）、およびアイソタイプ対照で処置したＣ３ヒト化ＭＡＩＤ６１４９マウス（ＨｕｍＩｎ Ｃ３＋Ｃｔｌ Ａｂ）または抗Ｃ５抗体Ｍ１Ｍ１７６２８Ｎで処置したＣ３ヒト化ＭＡＩＤ６１４９マウス（ＨｕｍＩｎ Ｃ３＋Ｍ１Ｍ１７６２８Ｎ）由来の腎組織中のＧｒ－１^＋好中球の免疫組織化学染色（下）を示す。 図２７Ｂは、アイソタイプ対照で処置した野生型マウス（ＷＴ＋Ｃｔｌ Ａｂ）、およびアイソタイプ対照で処置したＣ３ヒト化ＭＡＩＤ６１４９マウス（ＨｕｍＩｎ Ｃ３＋Ｃｔｌ Ａｂ）または抗Ｃ５抗体Ｍ１Ｍ１７６２８Ｎで処置したＣ３ヒト化ＭＡＩＤ６１４９マウス（ＨｕｍＩｎ Ｃ３＋Ｍ１Ｍ１７６２８Ｎ）における間質Ｆ４／８０＋マクロファージ浸潤を表すグラフ（上）、ならびにアイソタイプ対照で処置した野生型マウス（ＷＴ＋Ｃｔｌ Ａｂ）、およびアイソタイプ対照で処置したＣ３ヒト化ＭＡＩＤ６１４９マウス（ＨｕｍＩｎ Ｃ３＋Ｃｔｌ Ａｂ）または抗Ｃ５抗体Ｍ１Ｍ１７６２８Ｎで処置したＣ３ヒト化ＭＡＩＤ６１４９マウス（ＨｕｍＩｎ Ｃ３＋Ｍ１Ｍ１７６２８Ｎ）由来の腎組織中のＦ４／８０＋マクロファージの免疫組織化学染色（下）を示す。 図２８は、アイソタイプ対照で処置された野生型マウス（ＷＴ＋ＣｔｌＡｂ）、およびアイソタイプ対照で処置されたＣ３ヒト化ＭＡＩＤ６１４９マウス（ＨｕｍＩｎ Ｃ３＋Ｃｔｌ Ａｂ）または抗Ｃ５抗体Ｍ１Ｍ１７６２８Ｎで処置されたＣ３ヒト化ＭＡＩＤ６１４９マウス（ＨｕｍＩｎ Ｃ３＋Ｍ１Ｍ１７６２８Ｎ）の糸球体サイズ（左）およびメサンギウム基質増加（右、ＰＡＳにより評価）の数量化を表すグラフを示す。 図２９Ａ、２９Ｂ、および２９Ｃは、抗Ｃ５治療が、ヒト化Ｃ３マウス（ＭＡＩＤ６１４９）の疾患遺伝子シグネチャーの深部の救済をもたらしたことを示している。図２９Ａは、ヒト化Ｃ３マウスにおいて、抗Ｃ５抗体治療が、疾患シグネチャー遺伝子を逆転したことを示す。図２９Ｂは、救済された疾患シグネチャーは、免疫、細胞外基質、サイトカイン、補体、および代謝関連遺伝子が含まれることを示す。図２９Ｃは、ヒト化Ｃ３マウスにおいて上方制御された免疫細胞型マーカーが、その後、抗Ｃ５抗体処置によって弱毒化されることが表されていることを示す。 同上。 同上。 同上。 図３０は、Ｃ５の連続的遮断が、ヒト化Ｃ３ ＭＡＩＤ６１４９マウスの生存を延長することを示す。 図３１Ａ～３１Ｃは、Ｃ３ｂの遮断がまた、ヒト化Ｃ３ ＭＡＩＤ６１４９マウスにおける保護も提供していることを示す。図３１Ａは、抗Ｃ３ｂ遮断抗体がヒト化Ｃ３マウスの生存を改善することを示す。図３１Ｂ～３１Ｃは、抗Ｃ３ｂ遮断抗体がヒト化Ｃ３マウスにおける体重も改善したことを示す。 同上。 同上。

補体系は自然免疫系の必須成分であり、侵入する病原体に対する防御メカニズムとして重要な役割を果たし、適応免疫応答を刺激し、免疫複合体とアポトーシス細胞の除去を助ける。補体系は、多くの保護免疫機能において重要な役割を果たしているが、補体活性化は、補体関連腎症を含む多様な自己免疫性および炎症性疾患プロセスにおける組織損傷の重要なメディエータである。

本開示は、特に、血清中でヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質を発現する非ヒト動物を提供する。驚くべきことに、本発明者らは、ヒトまたはヒト化Ｃ３遺伝子に対してホモ接合性の齧歯類が高率で自然死する傾向があり、さらに腎臓における病理学的Ｃ３タンパク質蓄積、例えば、Ｃ３糸球体症などを特徴とする補体関連腎症によく似た生理学的、形態学的、および組織学的症状を示すことを発見した。従って、本明細書に記載の非ヒト動物は、ヒトで観察される補体関連腎症の症状を再現できる最初のモデル生物を表すと考えられ、これらの障害の治療のための候補化合物または薬剤の治療効果を評価するために使用できる。さらに、発明者らは、これらの齧歯類が肝線維症と一致する症状を呈することも発見した。従って、本開示は、ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質をコードする核酸配列を含む非ヒト動物を使用して、補体関連腎症および／または肝線維症の治療に使用する薬剤のインビボでの治療有効性を評価する方法を提供する。

Ｉ．用語の定義
「補体関連腎症」または「補体関連ネフローゼ」という用語は、本明細書で使用する場合、これらに限定されないが、腎組織におけるＣ３および／またはＣ５ｂ－９膜侵襲複合体、具体的にはネフロン、より具体的には糸球体などの望ましくない代替補体経路活性化および／または補体活性化産物の沈着に関連する疾患／障害を含む、腎臓の損傷、または疾患もしくは障害を指す。一部の実施形態では、補体関連腎症は、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）および／またはＣ３糸球体症（Ｃ３Ｇ）、デンスデポジット病（ＤＤＤ）およびＣ３糸球体炎（Ｃ３ＧＮ）を包含する膜性増殖性糸球体腎炎の形態として知られる一つまたは複数の状態を含む。

本明細書において使用される場合、「齧歯類」という用語は、分類学的に齧歯目の任意のメンバーを指す。齧歯類の例としては、限定されないが、マウス、ラット、リスル、プレーリードッグ、ヤマアラシ、ビーバー、モルモット、およびハムスターが挙げられる。一実施形態では、齧歯類はラットである。別の実施形態では、齧歯類はマウスである。

「個体」または「対象」は、脊椎動物、哺乳動物、またはヒトであり得る。哺乳類としては、限定されないが、家畜（ウシなど）、スポーツ動物、ペット、霊長類、マウスおよびラットが挙げられる。個体はまた、これに限定されないが、イヌおよびネコを含むコンパニオンアニマルも含む。一態様では、個体はヒトである。

「有効量」は、所望の治療的または予防的な結果を生成するために有効である、単回投与または一連の投与の一部として個体に投与される補体関連腎症の治療などの治療化合物の量を指す。

「治療有効量」または「臨床的に有効な量」は、特定の障害の測定可能な改善を示すために必要な、少なくとも最低濃度である。本明細書の治療有効量は、患者の病状、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する治療剤の能力などの要因によって異なり得る。治療有効量はまた、治療の毒作用または有害効果が、治療の有益効果を上回る量である可能性がある。補体関連腎症の場合、治療有効量は、全体的な腎機能を増加または改善し、腎細胞死を防止し、または腎細胞、糸球体、もしくはそれに関連する成分に対する損傷を改善または防止し得る。

ＩＩ．補体関連腎症
Ａ．Ｃ３および補体系
免疫系の必須成分である補体は、三つのリンクされた生化学的カスケード、古典的経路、レクチン経路および代替経路に関与する、３０を超える循環性タンパク質および細胞タンパク質からなる。補体は、免疫系を補助して、侵入した微生物を破壊し、組織のホメオスタシスを維持するために機能する。ヒトにおけるＣ３欠損症は、細菌感染症の感受性の増加と関連する。しかしながら、補体の過剰または未制御の活性化は、組織損傷に寄与し、異常な補体活性化によって特徴付けられる様々なヒトの疾患、障害、および状態に関連付けられる。

Ｃ３遺伝子は、血清補体タンパク質Ｃ３をコードし、これは古典的、レクチン、および代替補体活性化経路の活性化において中心的な役割を果たす。ヒトＣ３遺伝子は、染色体１９上で１９ｐ１３．３－ｐ１３．２に位置する。ヒトＣ３遺伝子は、４１個のエクソンを有し、２２個のアミノ酸シグナルペプチド、６４５固のアミノ酸β鎖および９９２個のアミノ酸α鎖を含む、１６６３個のアミノ酸の前駆体ポリペプチドをコードする。補体活性化の間、α鎖は切断され、それによって７７個のアミノ酸Ｃ３ａタンパク質を含む９種類のペプチドを生成し、これは強力な炎症誘発性アナフィラトキシンである。

Ｃ３遺伝子は、例えば、チンパンジー、アカゲザルなどの霊長類、例えば、イヌ、ウシなどの他の哺乳類、例えば、マウスなどの齧歯類、ニワトリ、ゼブラフィッシュおよびカエルを含む、いくつかの種間で保存される。マウスＣ３遺伝子は、染色体１７上で１７ ２９．７２ ｃＭ１９に位置する。マウスＣ３遺伝子は、４１個のエクソンを有し、２４個のアミノ酸シグナルペプチド、６４２固のアミノ酸β鎖および９９３個のアミノ酸α鎖を含む、１６６３個のアミノ酸の前駆体ポリペプチドをコードする。ヒトと同様に、マウスの補体活性化は、α鎖の切断をもたらし、それにより強力な炎症誘発性アナフィラトキシンである７８個のアミノ酸Ｃ３ａを含む９種類のペプチドを生成する。Ｃ３ノックアウトマウスは、当該技術分野で公知の標準的な手順に従って生成された（参照、例えば、Ｄｒｏｕｉｎら（２００１）Ｃｕｔｔｉｎｇ ｅｄｇｅ：ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ３ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｔｈ２ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｌｌｅｒｇｙＪ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６７：４１４１－４１４４）。

Ｂ．腎特異的、Ｃ３媒介性、補体関連疾患
いくつかの補体関連腎症は、腎臓、特にネフロンの糸球体に異常に高いレベルのＣ３沈着を伴うことが知られている。

１．非典型ＨＵＳ
溶血性尿毒症症候群（またはｈａｅｍｏｌｙｔｉｃ－ｕｒａｅｍｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）は、ＨＵＳと短縮され、溶血性貧血（赤血球の破壊によって生じる貧血）、急性腎不全（尿症）、および低血小板数（血小板減少）によって特徴付けられる疾患である。それは主に子どもたちに影響するが、子どもたちに限らない。ほとんどの症例の前には、食中毒として、または大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、その他の非Ｏ１５７：Ｈ７大腸菌血清型、赤痢菌、およびカンピロバクターによって引き起こされる汚染された給水から生じる感染性の、時には出血を伴う下痢が発症する。

患者の推定３３～４０％は、支持療法の使用にもかかわらず、死亡またはａＨＵＳの最初の臨床症状を伴う末期腎疾患（ＥＳＲＤ）になり、患者の６５％は、血漿交換または血漿注入（ＰＥ／ＰＩ）療法にもかかわらず、診断後一年以内に死亡、透析を要する、または持続性腎臓損傷を有する。ａＨＵＳの現在の兆候と症状を生き延びた患者は、慢性的な血栓および炎症状態に耐え、突然の血液凝固、腎不全、および早死を含むその他の重篤な合併症の高リスクに生涯にわたってさらされる。

２．ＤＤＤ、Ｃ３糸球体腎炎、およびＣ３糸球体症
デンスデポジット病（ＤＤＤ）は、腎糸球体中の大量のＣ３の蓄積によって特徴付けられる希少な障害である。この状態は、透過電子顕微鏡を使用して、糸球体基底膜（ＧＢＭ）中に過剰に蓄積された非常に高密度の沈着物にちなんで命名された。２０１３年には、コンセンサス会議の結果として、科学者らは新しい表題「Ｃ３糸球体症」の下でＤＤＤをサブグループ化することを推奨している（Ｃ３Ｇ；Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇら。Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｌ．、２０１３、８４：１０７９－８９）。この新しい用語は、ＤＤＤを思わせる腎生検で糸球体疾患を示す患者の別のグループがあるという認識によってもたらされた。これらの個体では、Ｃ３沈着は、電子顕微鏡を使用して見ると、より薄い色であり、より広範囲にある。しかしながら、免疫蛍光評価では、ＤＤＤ患者と同様に、腎糸球体に大量のＣ３が存在する。従って、これらの患者は、「Ｃ３糸球体腎炎」または「Ｃ３ＧＮ」と診断されている。それらの症候性類似性を認識すると、ＤＤＤおよびＣ３ＧＮの両方が、Ｃ３Ｇのサブタイプとして分類される。

ＩＩＩ．ヒト化Ｃ３非ヒト動物の生成
本明細書に開示される方法で使用されるヒト化Ｃ３動物は、当該技術分野で公知の方法論を使用して生成することができる（一般に、“Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”、Ｊｏｙｎｅｒ、ｅｄ．、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．（２０００）を参照のこと）。一実施形態では、マウスの生成は、マウスＣ３遺伝子の破壊、およびヒトまたはヒト化Ｃ３をコードする遺伝子のマウスゲノムへの導入を任意に含み得る。一実施形態では、ヒトまたはヒト化Ｃ３をコードする遺伝子の導入は、内因性マウスＣ３遺伝子と同じ位置にある。

本明細書に開示される方法で使用される遺伝子組み換え非ヒト動物（ヒト化Ｃ３動物）は、導入遺伝子を動物の生殖細胞系統に導入することによって生成することができる。様々な発達段階における胚性標的細胞を使用して導入遺伝子を導入することができる。胚性標的細胞の発達段階に応じて、異なる方法が使用される。本方法で使用される任意の動物の特定の系統は、一般的に良好な健康状態、良好な胚収量、胚における良好な前核視認性、および良好な生殖適合性のために選択される。遺伝子組み換えマウスを作製する場合、Ｃ５７ＢＬ／６またはＣ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ／２ Ｆ１またはＦＶＢ系統などの系統がよく使用される（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ社、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、Ｍｅ．、またはＴａｃｏｎｉｃ Ｌａｂｓから市販されている）。

導入遺伝子の胚の導入は、例えば、マイクロ注射、エレクトロポレーション、またはリポフェクションなど、当技術分野で公知の任意の手段によって達成することができる。例えば、導入遺伝子は、受精した哺乳動物の卵の前核に構築物をマイクロインジェクションすることにより哺乳動物に導入し、構築物の一つまたは複数のコピーを発達中の哺乳動物の細胞に保持させることができる。受精卵への導入遺伝子構築物の導入に続いて、卵をさまざまな時間インビトロ でインキュベートするか、代理宿主に再移植するか、またはその両方を行うことができる。インビトロでの成熟までのインキュベーションは、本開示の範囲内である。ある一般的な方法は、種に応じて約１～７日間、インビトロで、胚をインキュベートしてから、代理宿主に再移植することである。

再移植は、標準的な方法を使用して達成される。通常、代理宿主は麻酔され、胚は卵管に挿入される。特定の宿主に移植された胚の数は、種によって異なるが、通常、種が自然に生産する子孫の数に匹敵する。

レトロウイルス感染は、導入遺伝子を非ヒト動物に導入するためにも使用され得る。発達中の非ヒト胚をインビトロで胚盤胞期まで培養することができる。この間、卵割球はレトロウイルス感染の標的となり得る（Ｊａｅｎｉｃｈ、Ｒ．（１９７６）ＰＮＡＳ ７３：１２６０－１２６４）。卵割球の効率的な感染は、透明帯を除去する酵素処置によって得られる（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ、Ｈｏｇａｎ ｅｄｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８６）。導入遺伝子の導入に使用されるウイルスベクターシステムは、通常、導入遺伝子を運ぶ複製欠損レトロウイルスである（Ｊａｈｎｅｒら。（１９８５）。ＰＮＡＳ ８２：６９２７～６９３１；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら。（１９８５）ＰＮＡＳ ８２：６１４８－６１５２）。

導入遺伝子導入のための第三のタイプの標的細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞である。導入遺伝子は、ＤＮＡトランスフェクションによって、またはレトロウイルス媒介性形質導入によって、ＥＳ細胞に効率的に導入することができる。そのような形質転換されたＥＳ細胞を、その後、非ヒト動物から胚盤胞と組み合わせることができる。ＥＳ細胞はその後、胚をコロニー形成し、得られたキメラ動物の生殖系列に貢献する。

ヒト化Ｃ３を含む遺伝子組み換え動物は、他の動物と交配することができる。調製の方法は、一連の哺乳動物を生成することであり、それぞれが所望の構築物または導入遺伝子の一つを含む。このような哺乳動物は、一連の交配、戻し交配、および選択によって一緒に交配され、最終的には、すべての所望の構築物および／または導入遺伝子を含む単一の哺乳類を生成し、それ以外の場合、哺乳動物は、所望の構築物および／または導入遺伝子の存在を除いて、野生型に類遺伝子性（遺伝的に同一）である。一実施形態では、ヒトまたはヒト化Ｃ３遺伝子を含むマウスはこの方法で生成される。

典型的には、交配および戻し交配は、育成経過の各特定の工程の目的に応じて、兄弟または親株を子孫に交配することによって達成される。特定の場合、適切な染色体位置に各ノックアウト構築物および／または導入遺伝子を含む、単一の子孫を生成するために、多数の子孫を生成することが必要であり得る。さらに、最終的に望ましい遺伝子型を得るために、数世代にわたって交配または戻し交配が必要になる場合がある。

一態様では、ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質を発現する例えば、マウスまたはラットなどの遺伝子組み換え齧歯類が提供され、ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質を発現する齧歯類は、正常な補体系を含む。すなわち、ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質を発現する齧歯類の血液、血漿または血清中の補体タンパク質のレベルは、機能的な内因性Ｃ３タンパク質を発現する齧歯類の血液、血漿または血清中の補体タンパク質のレベルに類似している。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。

一態様では、本明細書に記載されるような遺伝子組み換えを含む、多能性または全能性の非ヒト動物、例えば、齧歯類、例えば、マウスまたはラットなどの細胞が提供される。一実施形態では、細胞は齧歯類細胞である。一実施形態では、細胞はマウス細胞である。一実施形態では、細胞は齧歯類ＥＳ細胞である。一実施形態では、細胞はマウスＥＳ細胞である。

一態様では、非ヒト動物、例えば、齧歯類、例えば、マウスまたはラットなどの卵子が提供され、非ヒト動物の卵子は異所性非ヒト動物染色体を含み、異所性非ヒト動物染色体は本明細書に記載されるような遺伝子組み換えを含む。一実施形態では、非ヒト動物は齧歯類である。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。

一態様では、ヒトＣ３遺伝子を含むように遺伝子組み換えされたマウスの胚、卵子、または細胞は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＵ６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウスのものである。別の実施形態では、マウスは１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／Ｓｖｌｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２の系統からなる群から選択される１２９系統である（参照、例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇら。（１９９９）Ｒｅｖｉｓｅｄ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｓｔｒａｉｎ １２９ ｍｉｃｅ、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ １０：８３６、Ａｕｂａｌａｃｈら（２０００）Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １２９／ＳｖＥｖ－ ａｎｄ Ｃ５７ＢＬ／６－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓも参照のこと）。特定の実施形態では、遺伝子組み換えマウスは、前述の１２９系統と前述のＣ５７ＢＬ／６系統との混合である。別の特定の実施形態では、マウスは前述の１２９系統の混合、または前述のＢＬ／６系統の混合である。特定の実施形態では、上記混合の１２９系統は１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。別の実施形態では、マウスはＢＡＬＢ系統、例えばＢＡＬＢ／ｃ系統、である。さらに別の実施形態では、マウスはＢＡＬＢ系統と別の前述の系統との混合である。一実施形態では、マウスはスイスマウスまたはスイスウェブスターマウスである。

ヒト化Ｃ３齧歯類および同じ作製方法に関するさらなる情報は、米国特許出願公開第２０１５０３１３１９４号に見出すことができ、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。

このように、本明細書では、ヒト化Ｃ３遺伝子からＣ３タンパク質を発現する遺伝子組み換え齧歯類、例えば、マウスまたはラットが提供され、齧歯類はその血清中にヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質を発現する。一実施形態では、齧歯類はマウスである。一実施形態では、齧歯類はラットである。ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質を発現する齧歯類の血清は、機能性内因性Ｃ３タンパク質を発現する齧歯類、例えば、野生型のマウスまたはラットとほぼ同じレベルのＣ３タンパク質を有することができる。一実施形態では、マウスは血清中にヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質（ｈＣ３）を、機能性内因性Ｃ３タンパク質を発現するが内因性マウスＣ３遺伝子座における内因性Ｃ３遺伝子のヒトＣ３遺伝子またはその断片による置換を含まない同齢のマウスの血清中に存在するＣ３タンパク質のレベルの少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％または２００％の濃度で発現する。

一実施形態では、齧歯類は血清中にヒトＣ３タンパク質を、機能性内因性Ｃ３タンパク質を発現するが内因性マウスＣ３遺伝子座における内因性Ｃ３遺伝子のヒトＣ３遺伝子またはその断片による置換を含まない同齢のマウスの血清中に存在するマウスＣ３タンパク質のレベルの約１％～約５％、約３％～約７％、約５％～約１５％、約１０％～約２０％、約１０％～約２００％、約２０％～約１５０％、または約３０％～約１００％の濃度で発現する。

一実施形態では、齧歯類は血清中にヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質を、約１μｇ／ｍｌ～約５μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ～約７μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ～約１５μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ～約２０μｇ／ｍｌ、約１５μｇ／ｍｌ～約３０μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ～約４０μｇ／ｍｌ、約３０μｇ／ｍｌ～約６０μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌ、約７５μｇ／ｍｌ～約１２５μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ～約１５００μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ～約１５００μｇ／ｍｌ、約２００μｇ／ｍｌ～約１２５０μｇ／ｍｌ、または約３００μｇ／ｍｌ～約１０００μｇ／ｍｌの濃度で発現する。別の実施形態では、マウスは血清中にヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質を、少なくとも約１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ、７μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、９μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１１μｇ／ｍｌ、１２μｇ／ｍｌ、１３μｇ／ｍｌ、１４μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、１６μｇ／ｍｌ、１７μｇ／ｍｌ、１８μｇ／ｍｌ、１９μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、７０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、９０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌ、１２５０μｇ／ｍｌ、または１５００μｇ／ｍｌ、これらの濃度の間に入る値と範囲を含めた濃度で発現する。

ＩＶ．補体関連腎症を治療することができる薬剤の治療有効性をインビボで特定または評価するためのヒト化Ｃ３非ヒト動物の使用
Ａ．補体関連腎症または肝線維症を改善する薬剤の特定
一部の態様では、１）候補薬剤を特定する方法（すなわち、化合物または治療剤分子）または２）補体関連腎症、例えば、これらに限定されないが、ａＨＵＳ、ＤＤＤ、Ｃ３糸球体腎炎、および／またはＣ３糸球体症などの治療における使用のための候補薬剤の治療有効性をインビボで評価する方法が本明細書に提供される。本方法は、本明細書に開示されるヒト化Ｃ３非ヒト動物（例えば、マウスまたはラット）のいずれかを利用する。一部の実施形態では、候補化合物は、補体関連腎症の症状を示す非ヒト動物に直接投与され、薬剤または化合物が補体関連腎症および／または肝線維症の一つまたは複数の症状を軽減できるかどうかを決定する。その他の実施形態では、候補化合物は、これら非ヒト動物から得られた血清と接触し、補体活性は、一般的に使用されるいかなるインビトロでの評価技術（ＣＨ５０アッセイなどがあるがこれに限定されない）を用いて評価される。

一部の実施形態では、候補化合物または薬剤は、本明細書に記載されるヒト化Ｃ３非ヒト動物（例えば、齧歯類、例えばマウスまたはラット）の腎臓または肝臓における、補体活性化（例えば、代替経路補体活性化および／またはＣ３介在性補体経路活性化などがあるがこれらに限定されない）またはＣ３タンパク質の切断および／または沈着を、縮小、減少、または阻害することによって、補体活性化を調節することができる。化合物または薬剤は、本明細書に開示される非ヒト動物のいずれかにおける補体活性化またはＣ３タンパク質切断および／または沈着を、候補化合物または薬剤で処置しない対照非ヒト動物と比較して、約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％縮小することができる。

別の実施形態では、候補化合物は、本明細書に記載されるヒト化Ｃ３非ヒト動物（例えば、齧歯類、例えばマウスまたはラット）のいずれかの腎臓または肝臓における、補体活性化（例えば、代替経路補体活性化またはＣ３介在性補体経路活性化などがあるがこれらに限定されない）またはＣ３タンパク質の切断および／または沈着を、最大１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、５４時間、６０時間、６６時間、７２時間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、または三週間（これらの値の間のいかなる期間も含む）縮小、減少、または阻害することができる。

候補化合物は、さらに、本明細書に記載されるヒト化Ｃ３非ヒト動物（例えば、齧歯類、例えばマウスまたはラット）のいずれかの腎臓または肝臓における、補体活性化（例えば、代替経路補体活性化またはＣ３介在性補体経路活性化などがあるがこれらに限定されない）を、増加、増幅、または活性化することによって、他の実施形態において補体活性化を調節することができる。化合物は、本明細書に開示されるいずれかの齧歯類における補体活性化を、候補化合物または薬剤で処置しない対照非ヒト動物と比較して、約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％増加させることができる。

別の実施形態では、候補化合物は、本明細書に記載されるヒト化Ｃ３非ヒト動物（例えば、齧歯類、例えばマウスまたはラット）のいずれかの腎臓または肝臓における、補体活性（例えば、代替経路補体活性またはＣ３介在性補体経路活性などがあるがこれらに限定されない）を、最大１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、５４時間、６０時間、６６時間、７２時間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、または三週間（これらの値の間のいかなる期間も含む）増加、増幅、または活性化することができる。

その他の実施形態では、候補薬剤または化合物は、候補薬剤または化合物を投与されていない対照非ヒト動物と比較して、非ヒト動物（例えば、齧歯類、例えばマウスまたはラット）における補体関連腎症または肝線維症の一つまたは複数の症状を改善または治療する。「改善する」または「治療する」という用語は、別段の指定がない限り、補体関連腎症（ａＨＵＳ、ＤＤＤ、Ｃ３糸球体腎炎、および／またはＣ３糸球体症などがあるがこれらに限定されない）または肝線維症に関連する一つまたは複数の症状を、除去する、発症を遅延する、または罹患率、頻度、もしくは重症度を低減することを意味する。

一部の実施形態では、補体関連腎症（例えば、ａＨＵＳ、ＤＤＤ、Ｃ３糸球体腎炎、および／またはＣ３糸球体症などがあるがこれらに限定されない）の一つまたは複数の症状は、自然死である。よって、候補化合物または薬剤は、本明細書に記載されるヒト化Ｃ３非ヒト動物（例えば、齧歯類、例えばマウスまたはラット）のいずれかにおける自然死の発生を、候補化合物または薬剤で処置しない対照非ヒト動物と比較して、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％改善することができる。

下記の実施例２に示すように、本明細書に記載のホモ接合性ヒト化Ｃ３齧歯類は、ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質を発現しない野生型同腹子または齧歯類と比較して、体重の減少（すなわち、正常に体重を増やすことができない）、骨密度および／またはミネラル含有量の減少、および／または体脂肪の減少を示す。従って、一部の実施形態では、候補薬剤または化合物によって改善された補体関連腎症（例えば、ａＨＵＳ、ＤＤＤ、Ｃ３糸球体腎炎、および／またはＣ３糸球体症などがあるがこれらに限定されない）の一つまたは複数の症状は、体重減少、骨密度減少、または体脂肪減少の一つまたは複数である。よって、候補化合物または薬剤は、本明細書に記載のヒト化Ｃ３非ヒト動物（マウスまたはラットなど）のいずれかにおける、低体重、骨密度またはミネラル含有量の減少、および／または体脂肪の減少のうちの一つまたは複数を、候補化合物または薬剤で処置されない対照非ヒト動物と比較して、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％改善することができる。体重減少または増加、骨密度またはミネラル含有量、および体脂肪の決定は、ルーチンであり、当技術分野で周知の方法に従って達成できる。

さらに、以下の実施例４に記載されるように、本明細書に記載のホモ接合性ヒト化Ｃ３齧歯類は、ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質を発現しない野生型同腹子または齧歯類と比較して、腎臓内、特にネフロン内（例えば、糸球体）で高レベルのＣ３タンパク質沈着を示す。従って、一部の実施形態では、候補薬剤または化合物によって改善された補体関連腎症（例えば、ａＨＵＳ、ＤＤＤ、Ｃ３糸球体腎炎、および／またはＣ３糸球体症などがあるがこれらに限定されない）の一つまたは複数の症状は、腎臓内のＣ３タンパク質沈着である。よって、候補化合物または薬剤は、本明細書に記載のヒト化Ｃ３非ヒト動物（マウスまたはラットなど）のいずれかにおける腎臓Ｃ３タンパク質沈着を、候補化合物または薬剤で処置されない対照非ヒト動物と比較して、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％改善することができる。腎臓Ｃ３タンパク質沈着の決定は、免疫組織化学、免疫蛍光法、および電子顕微鏡（免疫電子顕微鏡を含む）を含むがこれに限定されない、当技術分野で公知の任意の数の手段によって解析することができる。

実施例４はまた、活性化された補体経路を示す、ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質を発現しない野生型同腹子または齧歯類に対するヒト化Ｃ３齧歯類の腎糸球体における増加したＣ５ｂ－９膜侵襲複合体の沈着も示した。従って、一部の実施形態では、候補薬剤または化合物によって改善された補体関連腎症（例えば、ａＨＵＳ、ＤＤＤ、Ｃ３糸球体腎炎、および／またはＣ３糸球体症などがあるがこれらに限定されない）の一つまたは複数の症状は、Ｃ５ｂ－９膜侵襲複合体形成の増加である。よって、候補化合物または薬剤は、本明細書に記載のヒト化Ｃ３非ヒト動物（マウスまたはラットなど）のいずれかにおけるＣ５ｂ－９膜侵襲複合体形成を、候補化合物または薬剤で処置されない対照非ヒト動物と比較して、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％改善することができる。Ｃ５ｂ－９膜侵襲複合体形成は、免疫組織化学、免疫蛍光法（免疫蛍光標識抗Ｃ９抗体など）、および電子顕微鏡（免疫電子顕微鏡を含む）を含むがこれに限定されない、当技術分野で公知の任意の数の手段によって決定され得る。

実施例３に示すように、本明細書に記載のホモ接合性ヒト化Ｃ３齧歯類は、ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質を発現しない野生型同腹子または齧歯類と比較して、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、リパーゼ、シスタチン、および非高密度リポタンパク質の血清および／または血漿レベルの上昇を示す。従って、一部の実施形態では、候補薬剤または化合物によって改善された補体関連腎症（例えば、ａＨＵＳ、ＤＤＤ、Ｃ３糸球体腎炎、および／またはＣ３糸球体症などがあるがこれらに限定されない）の一つまたは複数の症状は、ＢＵＮ、リパーゼ、シスタチン、および非高密度リポタンパク質の血清および／または血漿レベルの上昇である。よって、候補化合物または薬剤は、本明細書に記載のヒト化Ｃ３非ヒト動物（マウスまたはラットなど）のいずれかにおけるＢＵＮ、リパーゼ、シスタチン、および非高密度リポタンパク質の血清および／または血漿レベルの上昇を、候補化合物または薬剤で処置されない対照非ヒト動物と比較して、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％改善することができる。ＢＵＮ、リパーゼ、シスタチン、および非高密度リポタンパク質の血清および／または血漿レベルを評価することは、当技術分野で周知の任意の数の方法を使用して達成できる。

実施例３は、本明細書に記載されるホモ接合性ヒト化Ｃ３齧歯類が、ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質を発現しない野生型同腹子または齧歯類と比較して、尿アルブミン濃度の上昇を示すことをさらに示す。実施例４は、本明細書に記載されるホモ接合性ヒト化Ｃ３齧歯類が、ヒトまたはヒト化Ｃ３タンパク質を発現しない野生型同腹子または齧歯類と比較して、尿中Ｃ５ａレベルの上昇を示すことを示す。従って、一部の実施形態では、候補薬剤または化合物によって改善された補体関連腎症（例えば、ａＨＵＳ、ＤＤＤ、Ｃ３糸球体腎炎、および／またはＣ３糸球体症などがあるがこれらに限定されない）の一つまたは複数の症状は、尿アルブミンおよび／またはＣ５ａの増加である。よって、候補化合物または薬剤は、本明細書に記載のヒト化Ｃ３非ヒト動物（マウスまたはラットなど）のいずれかにおける尿アルブミンおよび／またはＣ５ａのレベルの上昇を、候補化合物または薬剤で処置されない対照非ヒト動物と比較して、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％改善することができる。尿アルブミンレベルの評価は、当技術分野で周知の任意の数の方法を使用して達成することができる。

本明細書に記載されるホモ接合性ヒト化Ｃ３齧歯類は、肝損傷または線維症と一致する症状をさらに呈する。線維症は、修復または反応プロセスの器官または組織における過剰な繊維結合組織の形成である。生理学的に、線維症は結合組織を沈着する働きをし、結合組織は基礎となる器官または組織の構造および機能を消滅させる可能性がある。細胞外基質（ＥＣＭ）タンパク質の病理学的蓄積によって定義される線維症は、患部組織の瘢痕化および肥厚をもたらし、本質的に正常臓器機能を妨害する誇張された創傷治癒反応である。肝臓の線維症は多くの場合、肝硬変と呼ばれ、アルコール肝疾患（ＡＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、慢性Ｃ型肝炎、慢性Ｂ型肝炎、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、遺伝性ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、α１アンチトリプシン欠損症、ガラクトース血症、糖原病ＩＶ型、嚢胞性繊維症、または肝毒性の薬物または毒素への暴露など、他にも多数あるが、これら多くの症状を引き起こし得る。

実施例３は、本明細書に記載されるホモ接合性ヒト化Ｃ３齧歯類が、肝臓酵素アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、またはアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）のレベルの上昇を示すことをさらに示す。従って、一部の実施形態では、候補薬剤または化合物によって改善された肝線維症の一つまたは複数の症状は、ＡＬＴ、ＡＳＴ、またはＡＬＰのレベルの上昇である。よって、候補化合物または薬剤は、本明細書に記載のヒト化Ｃ３非ヒト動物（マウスまたはラットなど）のいずれかにおけるＡＬＴ、ＡＳＴ、および／またはＡＬＰのレベルの上昇を、候補化合物または薬剤で処置されない対照非ヒト動物と比較して、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％改善することができる。ＡＬＴ、ＡＳＴ、またはＡＬＰ肝酵素レベルの評価は、当技術分野で周知の任意の数の方法を使用して達成することができる。

一部の実施形態では、補体関連腎症または肝線維症の一つまたは複数の症状は、疾患遺伝子シグネチャー、すなわち、疾患の遺伝子シグネチャー特性、すなわち、補体関連腎症または肝線維症によって反映される。疾患遺伝子シグネチャーは、疾患のない野生型対照対象と比較して、疾患を有する対象（例えば、齧歯類）では差次的に発現する遺伝子のセットを含む。「差次的に発現する」とは、シグネチャー遺伝子の発現が、疾患を伴わない野生型対照のシグネチャー遺伝子の発現と比較して、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれ以上増加もしくは減少することを意味する。一部の実施形態では、補体関連肝線維症の遺伝子シグネチャーは、図１７に列挙された遺伝子の一つもしくは複数、または図１９の差次的に発現する遺伝子の一つもしくは複数を含む。一部の実施形態では、補体関連腎症の遺伝子シグネチャーは、図２１Ｂに列挙された腎毒性遺伝子の一つもしくは複数、図２１Ｃに列挙された細胞外基質（ＥＣＭ）遺伝子の一つもしくは複数、図２１Ｄに列挙されたサイトカイン遺伝子の一つもしくは複数、図２１Ｅに列挙されたケモカイン遺伝子の一つもしくは複数、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、補体関連腎症および肝線維症の遺伝子シグネチャーは、例えば、Ｔｉｍｐ１、Ｓｐｐ１、Ｃｏｌ１３ａ１、Ｍｍｐ１４、Ｔｇｆｂｉ、Ｍｍｐ２、Ｃｏｌ１ａ１、およびＴｎｃからなる群から選択される一つまたは複数のＥＣＭ遺伝子、Ｃｃｌ２２、Ｃｃｒ１、Ｔｎｆｓｆ８、Ｉｌ１ｆ６、Ｃｃｌ５、Ｉｌ１ｒｎ、Ｔｌｒ１、Ｉｔｇｂ２、Ｃｃｒ２、Ｃ３ａｒ１、およびＦｏｓからなる群から選択される一つまたは複数のサイトカイン遺伝子および受容体遺伝子、Ｂｔｌａ、Ｃｄ８６、Ｃｄ３ｅ、Ｉｃｏｓ、Ｈ２－Ａｂ１、Ｃｄ１４、Ｃｄ２８、Ｈ２－Ｅｂ１、Ｔｙｒｏｂｐ、Ｔｌｒ８、Ｃｄ２００ｒ１、Ｉｔｇａｍ、Ｃｄ２、Ｃｄ８４、Ｋｌｒｋ１、Ｃ１ｑｃ、Ｈ２－Ｏａ、およびＨ２－Ａａからなる群から選択される一つまたは複数の免疫シグナル伝達分子、Ｃｄ４、Ｃｄ３ｇ、Ｌｃｐ２、Ｈ２－Ｏａ、Ｈ２－Ａａ、Ｃｄ２４７、Ｐｔｐｒｃ、およびＬｃｋからなる群から選択される一つまたは複数のＴ細胞関連遺伝子、Ｃ５ａｒ１、Ｃｆｉ、Ｃ３ａｒ１、Ｃ６、Ｃ１ｑｃ、Ｃ７、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、Ｓｅｒｐｉｎｅ１、Ｆ１３ａ１、およびＣｆｈからなる群から選択される一つまたは複数の補体および凝固遺伝子、Ｃｙｐ７ｂ１、Ａｋｒ１ｃ１８８、Ａｇｐｓ、およびＬｐｌからなる群から選択される一つまたは複数の脂質代謝遺伝子などの図２９Ｃに列挙された一つまたは複数の遺伝子を含む。一部の実施形態では、補体関連腎症および肝線維症の遺伝子シグネチャーは、例えば、Ｍｓ４ａ１、Ｃｄ７９ａ、Ｃｄ７９ｂ、Ｃｄ１９、Ｃｄ３ｄ、Ｃｄ３ｅ、Ｃｄ３ｇ、Ｃｄ８ａ、Ｃｄ８ｂ１、Ｃｄ４、Ｆｏｘｐ３、Ｐｒｆ１、Ｇｚｍａ、Ｋｉｒｄ１、Ｋｉｒｋ１、Ｎｃｒ１、Ｃｃｌ２２、Ｃｌｅｃ９ａ、Ｃｄ２０７、Ａｄａｍ２３、Ｍａｒｃｏ、Ｍｓｒ１、Ｃ１ｑｂ、Ｍｓ４ａ７、Ｃｘｃｒ２、Ｃｓｆ３ｒ、Ｒｏｂｏ４、Ｔｅｋ、Ｔｉｅ１、Ｃｄｈ５、Ｋｄｒ、Ｅｓａｍ、Ｔａｇｌｎ、Ａｃｔａ２、Ｆａｐ、およびＴｎｃからなる群から選択されるマーカーなどの図２９Ｂに列挙される一つまたは複数の免疫細胞型マーカーを含む。

一部の実施形態では、補体関連腎症または肝線維症の一つまたは複数の症状は、疾患シグネチャー遺伝子の一つまたは複数、例えば、複数または集団の発現を決定することによって評価される。候補化合物は、実施例７に示すように、疾患シグネチャー遺伝子の発現の上昇または低下を改善する、すなわち完全にまたは部分的に逆転させる能力において評価することができる。例えば、候補化合物または薬剤は、本明細書に記載のヒト化Ｃ３非ヒト動物（マウスまたはラットなど）のいずれかにおける疾患遺伝子シグネチャーのセットにおける一つまたは複数の遺伝子の発現レベルの上昇または低下を、候補化合物または薬剤で処置されない対照非ヒト動物と比較して、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％改善することができる。

Ｂ．候補薬剤または化合物
候補治療剤または化合物は、限定されないが、小分子化学物質、抗体、タンパク質、阻害性核酸、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。

１．抗体
一部の態様では、候補薬剤または化合物は、補体タンパク質（Ｃ５、Ｃ３、またはそのタンパク質分解産物（例えば、Ｃ３ａまたはＣ３ｂ）など）および抗体に結合（例えば、優先的に結合）する。「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」および「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｓｅｄ）抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ融合抗体、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合型Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ′）断片、および前述のいずれかの抗原結合断片を指す。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の抗原結合活性断片、すなわち抗原結合部位を含有する分子を含む。こうした断片は、それに限定されないが、Ｆｃ領域またはその断片を含む別の免疫グロブリンドメインに融合されてもよく、または融合されなくてもよい。当業者であれば、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合物、可変領域（例えばＶＬおよびＶＨ）－Ｆｃ融合物、およびｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合物を含むがこれらに限定されない、その他の融合生成物が生成され得ることを理解するであろう。免疫グロブリン分子は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹを含む任意のタイプ、ならびにＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１およびＩｇＡ_２を含む任意のクラス、または任意のサブクラスであり得る。一部の実施形態では、抗体はＣ５および／またはＣ３拮抗薬であり、補体活性化（例えば、腎臓または肝臓における代替的補体経路活性化など）を減少させ得る。その他の実施形態では、抗体はＣ５および／またはＣ３作動薬であり、補体活性化を増加させ得る。

抗体の変異体は、抗体の活性に実質的に影響を与えることなく、当技術分野で知られている情報に基づいても作製され得る。例えば、抗体変異体は、異なる残基によって置換された抗体分子において少なくとも一つのアミノ酸残基を有することができる。抗体の場合、置換変異誘発に最も関心のある部位には一般的に超可変領域が含まれるが、フレームワーク領域（ＦＲ）の変更も考えられる。

抗体の場合、置換変異体の一つのタイプは、親抗体の一つまたは複数の超可変領域残基を置換することを含む（例えばヒト化またはヒト抗体）。一般的に、さらなる開発のために選択された結果として得られる変異体は、それらが生成される親抗体と比較して改善された生物学的特性を有する。このような置換変異体を生成するための都合の良い方法は、ファージディスプレイを使用する親和性成熟を伴う。簡潔に述べると、いくつかの超可変領域部位（例えば６～７部位）を変異させて、各部位での可能性のあるすべてのアミノ酸置換を生成する。こうして生成された抗体は、各粒子内に包装されたＭ１３の遺伝子産物への融合物として繊維状ファージ粒子から表示される。次に、ファージディスプレイされた変異体は、本明細書に開示されるように、それらの生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングされる。修飾のための候補超可変領域部位を識別するために、アラニンスキャニング変異誘発を実行して、抗原結合に著しく寄与する超可変領域残基を識別することができる。

抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該技術分野で公知の様々な方法によって調製され得る。これらの方法には、天然源からの単離（天然発生アミノ酸配列変異体の場合）またはオリゴヌクレオチド媒介性（または部位特異的）変異誘発による調製、ＰＣＲ変異誘発、および以前に調製された抗体の変異体または非変異体バージョンのカセット変異誘発が含まれるが、これらに限定されない。

免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域に一つまたは複数のアミノ酸修飾を導入することによって、Ｆｃ領域変異体を生成することが望ましい場合がある。Ｆｃ領域変異体は、ヒンジシステインのアミノ酸位置を含む一つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば置換）を含む、ヒトＦｃ領域配列（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含み得る。

修飾（改善または縮小）Ｃｌｑ結合および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を伴うＦｃ領域変異体は、国際特許出願公開番号ＷＯ９９／５１６４２（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。かかる変異体は、Ｆｃ領域の一つまたは複数のアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を含み得る。Ｆｃ領域変異体に関しては、Ｄｕｎｃａｎ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８－４０（１９８８）、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、および国際特許出願公開番号ＷＯ９４／２９３５１も参照のこと。それぞれの開示は本明細書に参照により組み込まれる。

２．非抗体結合ポリペプチド
一部の態様では、候補化合物は、補体タンパク質（Ｃ５、Ｃ３、またはそのタンパク質分解産物（例えば、Ｃ３ａまたはＣ３ｂ）など）に結合（例えば、優先的に結合）し、非抗体結合ポリペプチドである。一部の実施形態では、非抗体結合ポリペプチドは、Ｃ５および／またはＣ３拮抗薬であり、補体活性化（例えば、腎臓または肝臓における代替的補体経路活性化など）を減少させ得る。その他の実施形態では、非抗体結合ポリペプチドは、Ｃ５および／またはＣ３作動薬であり、補体活性化を増加させ得る。

結合ポリペプチドは、公知のポリペプチド合成方法を用いて化学的に合成されてもよく、または組み換え型技術を用いて調製および精製されてもよい。結合ポリペプチドは、通常、少なくとも約５アミノ酸長、別の方法として、少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００アミノ酸長もしくはそれ以上であり、かかる結合ポリペプチドは、本明細書に記載する任意の補体タンパク質（例えばＣ５、Ｃ３、Ｃ３ａ、またはＣ３ｂなど）などの標的に結合することができる。

結合ポリペプチドは、公知の技術を使用して過度の実験なしに特定され得る。これに関して、ポリペプチド標的に結合することができるポリペプチドを結合するためのポリペプチドライブラリーのスクリーニング技術は、当技術分野で公知であることに留意されたい（例えば、米国特許第５，５５６，７６２号、第５，７５０，３７３号、第４，７０８，８７１号、第４，８３３，０９２号、第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、第５，５７１．６８９号、第５，６６３，１４３号；ＰＣＴ出願公開ＷＯ８４／０３５０６およびＷＯ８４／０３５６４、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、８１：３９９８－４００２（１９８４）；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、８２：１７８－１８２（１９８５）；Ｇｅｙｓｅｎら。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ、１０２：２５９－２７４（１９８７）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ、Ｔ．ら、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４；Ｋａｎｇ、Ａ．Ｓ．ら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、８８：８３６３、およびＳｍｉｔｈ、Ｇ．Ｐ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２：６６８を参照のこと）。それぞれの開示は本明細書に組み込まれる。

ペプチドライブラリーを生成し、これらライブラリーをスクリーニングする方法については、米国特許第５，７２３，２８６号、第５，４３２，０１８号、第５，５８０，７１７号、第５，４２７，９０８号、第５，４９８，５３０号、第５，７７０，４３４号、第５，７３４，０１８号、第５，６９８，４２６号、第５，７６３，１９２号、および第５，７２３，３２３号に開示されており、それぞれの開示は参照により本明細書に組み込まれる。

結合ポリペプチドは、阻害性および／または治療効果（例えば、親和性の向上、半減期、安定性、およびクリアランス率などの薬物動態特性の改善、毒性の低下など）を高めるために修飾され得る。このような修飾には、グリコシル化、ペグ化、非天然であるが機能的に同等なアミノ酸による置換、連結基などが含まれるがこれらに限定されない。

３．小分子化学物質
一部の態様では、候補化合物は、補体タンパク質（Ｃ５、Ｃ３、またはそのタンパク質分解産物（例えば、Ｃ３ａまたはＣ３ｂ）など）に結合（例えば、優先的に結合）し、小分子である。一部の実施形態では、小分子はＣ５および／またはＣ３であり、補体活性化（例えば、腎臓または肝臓における代替的補体経路活性化など）を減少させ得る。その他の実施形態では、小分子はＣ５および／またはＣ３作動薬であり、補体活性化を増加させ得る。

小分子は、本明細書に定義される結合ポリペプチドまたは抗体以外の有機分子であることが好ましい。有機小分子は、公知の方法を使用して特定および化学的に合成され得る（例えば、ＰＣＴ出願公開ＷＯ００／００８２３およびＷＯ００／３９５８５を参照のこと）。有機小分子は、通常、サイズが約２０００ダルトン未満であり、代替的に約１５００、７５０、５００、２５０または２００ダルトン未満のサイズであり、本明細書に記載されるポリペプチドに結合することができる有機小分子は、公知の技術を使用して過度の実験なしに特定され得る。これに関して、ポリペプチド標的に結合することができる分子用の有機小分子ライブラリーをスクリーニングするための技術は、当該技術分野で公知であることに留意されたい（例えば、ＰＣＴ出願公開ＷＯ００／００８２３およびＷＯ００／３９５８５を参照のこと）。

有機小分子は、例えば、アルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、三級アミン、Ｎ置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバミン酸、炭酸塩、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、ハロゲン化アリール、アリールスルホン酸、ハロゲン化アルキル、スルホン酸アルキル、芳香族化合物、複素環化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアン酸、塩化スルホニル、ジアゾ化合物、酸塩化物などであり得る。

一部の態様では、小分子化学物質は、コンビナトリアル化学ライブラリーの成分である。コンビナトリアル化学ライブラリーは、より小さなサブユニットまたはモノマーからなる複数種の化学物質の集合である。コンビナトリアルライブラリーには、数百から数十万種類の化学物質の範囲の様々なサイズがある。また、炭水化物、オリゴヌクレオチド、および有機小分子などの化合物からなるオリゴマーおよびポリマーライブラリーを含む、様々なライブラリータイプもある。こうしたライブラリーは、化学物質の固定化およびクロマトグラフィー分離、ならびに標的分子（例えば、Ｃ５、Ｃ３、Ｃ３ａまたはＣ３ｂ）を結合することができるリガンドを特定および特徴付けるための使用、または対象の生物学的活性（例えば、補体活性の阻害または活性化などがあるがこれらに限定されない）を媒介するための使用など、様々な用途を持つ。

固相サポート上で化合物のライブラリーを合成するための様々な技術が当技術分野で公知である。固相サポートは、通常、表面がサブユニットまたはモノマーと結合してライブラリーの化合物を形成するように機能化された表面を持つ高分子体である。一つのライブラリーの合成は一般に、多数の固相サポートを伴う。コンビナトリアルライブラリーを作るには、固相サポートを、注意深く制御された所定の化学反応の配列で、化合物の一つまたは複数のサブユニットおよび一つまたは複数の試薬と反応させる。言い換えれば、ライブラリーサブユニットは、固相サポート上で「成長」する。ライブラリーが大きいほど、必要とされる反応数が大きくなり、ライブラリーを構成する化合物の複数種の化学組成を追跡する作業を複雑にする。一部の実施形態では、小分子は、サイズが約２０００ダルトン未満であり、代替的に約１５００、７５０、５００、２５０または２００ダルトン未満のサイズである。

本明細書のいずれかの態様に記載された小分子剤は、固相サポート上で実施できる任意のタイプの化学反応から誘導され得る。こうした化学反応には、ブタジエンの捕捉を含む２＋２環化付加、イソキサゾリン、フランおよび修飾ペプチドの合成を含む［２＋３］環化付加、ジオール、アルデヒドおよびケトンの固定化を含むアセタール形成、アルデヒドの誘導体化、プロパンジオールの合成を含むアルドール凝縮、アルデヒドの誘導体化を含むベンゾイン縮合、ベンゾジアゼピンおよびヒダントイン、チアゾリジン、ターンミメティクス、ポルフィリン、フタロシアニンを含む環化縮合、ジエステルの環化を含むディークマン環化、アクリル酸の誘導体化を含むデス・アルダー（Ｄｅｓ－Ａｌｄｅｒ）反応、アルコールのアルケンへの添加を含む求電子付加、アルデヒドの誘導体化を含むグリニヤール反応、二置換アルケンの合成を含むヘック反応、ｉｎ ｓｉｔｕでのニトリル酸化物の合成を含むヘンリー反応（２＋３環化付加を参照）、フェロモンおよびペプチドの合成を含む触媒水素化（アルケンの水素化）、スルファニルケトン、ビシクロ［２．２．２］オクタンの合成を含むマイケル反応、アリールエーテル、ペプチジルホスホナート、およびチオエーテルの合成を含むミツノブ反応、キノロンの合成を含む核性芳香族置換、アルデヒドおよびケトンの合成を含む酸化、ペンティノールを用いたノルボルエナジンの環化を含む、Ｐａｕｓｅｎ－Ｋｈａｎｄ 環化付加、ヘリセンの合成を含む光化学環化、アルデヒドおよび塩化アシルの誘導体化を含む有機金属化合物との反応、カルボニル、カルボン酸、エステルおよびニトロ基の減少を含む複雑な水素化合物および錫化合物を用いた減少、カルボキシル基の減少を含むＳｏａｉ反応、ビフェニル誘導体の合成を含むＳｔｉｌｌｅ反応、置換シクロヘキサノンの合成を含むＳｔｏｒｋ反応、キノロンの合成を含む還元的アミノ化、フェニル酢酸誘導体の合成を含むスズキ反応、アルデヒド、フェロモンおよびスルファニルケトンの反応を含む、ウイット・ホーナー（Ｗｉｔｔｉｇ－Ｈｏｒｎｅｒ）反応が含まれるが、これらに限定されない。

化学ライブラリーの合成およびそれらのライブラリーの個々の化合物の個々の固相サポートへの逆重畳積分を開示する参考文献は、米国特許出願番号第２００９／００３２５９２号、Ｎｅｅｄｅｌｓら、（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国９０：１０７００～１０７０４、およびＰＣＴ出願公開ＷＯ９７／１５３９０に見出すことができ、その開示は本明細書に参照により組み込まれる。

４．阻害性核酸
本開示の一態様では、候補補体調節化合物は、補体系の成分（ｍＲＮＡなど）を標的とする一つまたは複数のオリゴヌクレオチドである。阻害性核酸は、限定されないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小型の抑制性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはリボザイムとすることができる。

本開示のオリゴヌクレオチドは、補体系のタンパク質成分をコードするｍＲＮＡであってもよい。オリゴヌクレオチドは、それらの破壊を媒介することによって、またはタンパク質への翻訳を防止することによって、ｍＲＮＡに結合し、それらの機能に干渉する。絶対的な相補性は好ましいが、必須ではない。本明細書で言及されるＲＮＡの一部に「相補的」なオリゴヌクレオチド配列は、ＲＮＡとハイブリダイズして安定な二重鎖を形成できる十分な相補性を有する配列を意味する。ハイブリダイズする能力は、オリゴヌクレオチドの相補性および長さの両方に依存する。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長ければ長いほど、それが含むＲＮＡとの塩基ミスマッチが多くなり、それでも安定した二重鎖を形成する。当業者であれば、ハイブリダイズされた複合体の融点を決定する標準的手順を使用することによって、許容可能な程度の不一致を確認することができる。

一般的に、補体系のタンパク質のｍＲＮＡとハイブリダイズするように製造された相補的オリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの５つの非翻訳領域、ＡＵＧ開始コドンの補体、または３’非翻訳領域を含む、ｍＲＮＡの任意の領域に対して標的化される。

オリゴヌクレオチドは、限定されないが、ホスホロチオエート（Ｍａｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：１４３７－１４４１、１９９１；および米国特許第５，６４４，０４８号）、ペプチド核酸またはＰＮＡ（Ｅｇｈｏｌｍ、Ｎａｔｕｒｅ、３６８５：５６６－５６８、１９９３；および米国特許第６，６５６，６８７号）、ホスホラミド（Ｂｅａｕｃａｇｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：３３－６１，１９９３）、ジオチリン酸（Ｃａｐａｌｄｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２８：Ｅ４０、２０００）などのヌクレオシド間の結合を交互に有することができる。その他のオリゴヌクレオチド類似体には、限定されないが、モルホリノ（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１４８９：１４１－１５８、１９９９）、ロックされたオリゴヌクレオチド（Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７：５６３３－５６３８、２０００）、ペプチド核酸追加またはＰＮＡ（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９３、ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ、１９９６）または２－ｏ－（２－メトキシル）エチル修飾５′および３′末端オリゴヌクレオチド（Ｍｃｋａｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４：１７１５－１７２２，１９９９）が含まれる。これらの参考文献のすべては、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。核酸は、デオキシリボおよびリボヌクレオチドの任意の組み合わせ、およびウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサタニンヒポキサタニン（ｘａｔｈａｎｉｎｅ ｈｙｐｏｘａｔｈａｎｉｎｅ）、イソシトシン、イソグアニンなどを含む塩基の任意の組み合わせを含み得る。

本開示による相補的オリゴヌクレオチドは、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシン、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ－Ｄ－ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルケオシン、５′－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、偽性ウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、ケオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオルウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ２－カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６－ジアミノプリンを含むが、これらに限定されない群から選択される少なくとも一つの修飾塩基部分を含んでもよい。

相補的オリゴヌクレオチドはまた、アラビノース、２－フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースを含むがこれに限定されない群から選択される少なくとも一つの修飾糖部分も含み得る。

相補的オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド長でなければならず、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０ヌクレオチド長などの１０～約５０ヌクレオチド長の範囲であってもよい。

Ｖ．補体関連腎症の治療
さらに、本明細書には、一つまたは複数の補体関連神経障害（例えば、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）またはＣ３糸球体症（デンスデポジット病（ＤＤＤ）またはＣ３糸球体腎炎（Ｃ３ＧＮ）などのＣ３Ｇなど）を治療するための方法が提供される。実施例６～７に示されるように、Ｃ５の発現または活性を阻害する臨床的に有効な量の治療剤による補体関連腎症の一つまたは複数の症状を示すヒト化Ｃ３マウスの治療は、生存率および腎機能の改善、腎臓の組織学的徴候および補体関連神経障害に関連する糸球体損傷の減少、および疾患シグネチャー遺伝子発現の完全または部分的な逆転をもたらし得る。さらに、実施例９に示すように、Ｃ３の活性の発現、またはそのタンパク質切断産物（Ｃ３ａまたはＣ３ｂ）の活性を阻害する臨床的に有効な量の治療剤を伴う補体関連神経障害の一つまたは複数の症状を示すヒト化Ｃ３マウスの治療は、生存率の改善にもつながり得る。

本明細書で使用される場合、「Ｃ５の発現または活性を阻害する治療剤」は、補体因子５（Ｃ５）の生物学的機能または活性を阻害する能力を有する任意の薬剤を指す。これには、補体経路で通常行われるようにＣ５タンパク質が機能するのを防ぐ、Ｃ５遺伝子の発現を防ぐ、Ｃ５ ｐｒｅ－ＲＮＡの成熟ｍＲＮＡへのプロセシングを防ぐ、Ｃ５ ｍＲＮＡのＣ５ポリペプチドへの翻訳を防ぐ、その正常な生理学的機能に必要なＣ５ポリペプチドの翻訳後修飾またはプロセシングを防ぐ、および／またはＣ５タンパク質の活性をブロックまたは妨害する薬剤、物質、または化合物が含まれる。

本明細書で使用される場合、「Ｃ３の発現または活性を阻害する治療剤」は、補体因子３（Ｃ３）の生物学的機能または活性を阻害する能力を有する任意の薬剤を指す。これには、補体経路で通常行われるようにＣ３タンパク質が機能するのを防ぐ、Ｃ３遺伝子の発現を防ぐ、Ｃ３ ｐｒｅ－ＲＮＡの成熟ｍＲＮＡへのプロセシングを防ぐ、Ｃ３ ｍＲＮＡのＣ３ポリペプチドへの翻訳を防ぐ、その正常な生理学的機能に必要なＣ３ポリペプチドの翻訳後修飾またはプロセシングを防ぐ、および／またはＣ３タンパク質の活性をブロックまたは妨害する薬剤、物質、または化合物が含まれる。

「Ｃ３ａまたはＣ３ｂの活性を阻害する治療剤」は、Ｃ３ａまたはＣ３ｂの生物学的機能または活性を阻害する能力を有する任意の薬剤を指す。
一部の実施形態では、治療剤は、本明細書で議論される、抗体、阻害性核酸（アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、またはリボザイムなどがあるがこれらに限定されない）、もしくは非抗体結合ポリペプチドなどの阻害性核酸、非抗体結合ポリペプチド、または小分子化学物質のうちの一つまたは複数である。

その他の実施形態では、治療剤は、抗体またはその機能的断片（例えば、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｓｅｄ）抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ融合抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆａｂ断片、またはＦ（ａｂ’）断片）である。抗体は個体に、毎日、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、週に一回、または二週間に一回投与することができる。一部の例では、抗体の約４０ｍｇ／ｋｇ～約６０ｍｇ／ｋｇを、補体関連腎症と診断された、または補体関連腎症を有すると考えられる個体に（約４０ｍｇ／ｋｇ、４１ｍｇ／ｋｇ、４２ｍｇ／ｋｇ、４３ｍｇ／ｋｇ、４４ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、４６ｍｇ／ｋｇ、４７ｍｇ／ｋｇ、４８ｍｇ／ｋｇ、４９ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、５１ｍｇ／ｋｇ、５２ｍｇ／ｋｇ、５３ｍｇ／ｋｇ、５４ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、５６ｍｇ／ｋｇ、５７ｍｇ／ｋｇ、５８ｍｇ／ｋｇ、５９ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、またはそれ以上のいずれかなど）投与することができる。抗体投与は、限定されないが、注射、動脈送達、ガス注入、摂取、または坐薬を介して、当該技術分野で公知の任意の手段を介して行うことができる。抗Ｃ５抗体療法は、８～５６週間（約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または５６週間）、１～５年間または無期限に継続することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示される治療方法のいずれかにおける使用に適した抗Ｃ５抗体は、例えば、米国特許出願第１５／６２１，６８９号に記載されるように、公知の方法を用いて作製することができ、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、本明細書に開示される治療方法のいずれかにおける使用に適した抗Ｃ３、抗Ｃ３ａ、または抗Ｃ３ｂ抗体は、公知の方法を使用して作製することができる。

補体関連腎症と診断されたか、または補体関連腎症を有すると考えられる個体における腎機能を改善する方法が本明細書に提供される。方法は、上述の治療剤のいずれかなど、臨床的に有効な量の治療剤を投与することを含む。治療剤の投与は、治療剤を投与されていない補体関連腎症と診断された個体と比較して、腎機能改善をもたらす。一部の実施形態では、腎機能の改善は、血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベルの減少によって示されることがある。具体的には、補体関連腎症と診断されたか、または補体関連腎症を有すると考えられる個体に、Ｃ５の発現または活性を阻害する臨床的に有効な量の治療剤を投与することにより、Ｃ５の発現または活性を阻害する治療剤を投与しなかった補体関連腎症と診断された個体のＢＵＮレベルと比較して、約１０％～５０％のＢＵＮレベルが減少した（約１０％、１１％、１２％、１３％、１５％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、または５０％のいずれかのＢＵＮレベル減少など）。ＢＵＮの測定は、当技術分野ではルーチンであり、公知の手段によって実施され得る。

他の実施形態では、腎機能の改善は、血清シスタチンＣ濃度の減少によって示され得る。例えば、補体関連腎症と診断されたか、または補体関連腎症を有すると考えられる個体に、Ｃ５の発現または活性を阻害する臨床的に有効な量の治療剤を投与することにより、Ｃ５の発現または活性を阻害する治療剤を投与しなかった補体関連腎症と診断された個体の血清シスタチンＣ濃度と比較して、約１０％～６０％の血清シスタチンＣ濃度が減少した（約１０％、１１％、１２％、１３％、１５％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、または６０％のいずれかの血清シスタチンＣ濃度の減少など）。血清シスタチンＣ濃度の測定は、当技術分野ではルーチンであり、公知の手段によって実施され得る。

さらなる実施形態では、腎機能の改善は、尿Ｃ５ａ濃度の減少によって示され得る。具体的には、補体関連腎症と診断されたか、または補体関連腎症を有すると考えられる個体に、Ｃ５の発現または活性を阻害する臨床的に有効な量の治療剤を投与することにより、Ｃ５の発現または活性を阻害する治療剤を投与しなかった補体関連腎症と診断された個体の尿Ｃ５ａ濃度と比較して、約４０％～８５％の尿Ｃ５ａ濃度が減少した（約４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、５６％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、または８５％のいずれかの尿Ｃ５ａ濃度の減少など）。尿Ｃ５ａ濃度の測定は、当技術分野ではルーチンであり、公知の手段によって実施され得る。

また、補体関連腎症と診断されたか、または補体関連腎症を有すると考えられる個体における糸球体膜侵襲複合体（ＭＡＣ）形成の減少方法も本明細書に提供される。方法は、上述の治療剤のいずれかなど、臨床的に有効な量の治療剤を投与することを含む。治療剤の投与は、治療剤を投与されていない補体関連腎症と診断された個体における糸球体ＭＡＣ形成と比較して、糸球体ＭＡＣ形成の減少をもたらす。例えば、補体関連腎症と診断されたか、または補体関連腎症を有すると考えられる個体に、Ｃ５の発現または活性を阻害する臨床的に有効な量の治療剤を投与することにより、Ｃ５の発現または活性を阻害する治療剤を投与しなかった補体関連腎症と診断された個体のＭＡＣ形成と比較して、約５％～２０％のＭＡＣ形成が減少した（約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１５％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％のいずれかのＭＡＣ形成の減少など）。ＭＡＣ形成の測定は、当技術分野ではルーチンであり、任意の公知の手段（例えば、個体から腎臓組織における糸球体係蹄のＭＡＣのＣ９成分の免疫組織化学染色などがあるが、これに限定されない）によって実施され得る。

さらに、補体関連腎症と診断されたか、または補体関連腎症を有すると考えられる個体の腎臓の糸球体または間質の中への免疫細胞浸潤を減少するための方法が提供されている。方法は、上述の治療剤のいずれかなど、臨床的に有効な量の治療剤を投与することを必要とする。治療の投与は、治療剤を投与されていない補体関連腎症と診断された個体の腎臓における免疫細胞浸潤と比較して、個体の腎臓における免疫細胞浸潤の減少につながる。一部の実施形態では、免疫細胞は、糸球体に浸潤する好中球である。免疫細胞はまた、間質を浸潤するマクロファージであってもよい。例えば、補体関連腎症と診断されたか、または補体関連腎症を有すると考えられる個体に、Ｃ５の発現または活性を阻害する臨床的に有効な量の治療剤を投与することにより、Ｃ５の発現または活性を阻害する治療剤を投与しなかった補体関連腎症と診断された個体の腎臓における糸球体好中球浸潤と比較して、約５０％～１００％の糸球体好中球浸潤が減少した（約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、５６％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％のいずれかの糸球体好中球浸潤の減少など）。別の例として、補体関連腎症と診断されたか、または補体関連腎症を有すると考えられる個体に、Ｃ５の発現または活性を阻害する臨床的に有効な量の治療剤を投与することにより、Ｃ５の発現または活性を阻害する治療剤を投与しなかった補体関連腎症と診断された個体の腎臓における間質マクロファージ浸潤と比較して、約３０％～７０％の間質マクロファージ浸潤が減少した（約３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、５６％、６６％、６７％、６８％、６９％、または７０％のいずれかの間質マクロファージ浸潤の減少など）。免疫細胞浸潤の測定は、当該技術分野で一般的に知られており、任意の公知の手段（例えば、限定されないが、好中球の表面上のＧｒ－１の免疫組織化学的染色またはマクロファージの表面上のＦ４／８０の染色）によって実施されてもよい。

さらに、補体関連腎症と診断されたか、または補体関連腎症を有すると考えられる個体の腎臓における、糸球体サイズおよび／またはメサンギウム基質増加を減少させる方法が本明細書に提供される。方法は、上述の治療剤のいずれかなど、臨床的に有効な量の治療剤を投与することを含む。治療剤の投与により、治療剤を投与されていない補体関連腎症と診断された個体の腎臓における糸球体サイズおよび／またはメサンギウム基質増加と比較して、糸球体サイズおよび／またはメサンギウム基質増加の減少につながる。具体的には、補体関連腎症と診断されたか、または補体関連腎症を有すると考えられる個体に、Ｃ５の発現または活性を阻害する臨床的に有効な量の治療剤を投与することにより、Ｃ５の発現または活性を阻害する治療剤を投与しなかった補体関連腎症と診断された個体の糸球体サイズおよび／またはメサンギウム基質増加と比較して、約１５％～３０％の糸球体サイズおよび／またはメサンギウム基質増加が減少した（約１５％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、または３０％のいずれかの糸球体サイズおよび／またはメサンギウム基質増加の減少など）。糸球体サイズおよび／またはメサンギウム基質増加の測定は、当技術分野ではルーチンであり、任意の公知の手段（個体に由来する腎臓組織の染色および光顕微鏡的評価によるなど）によって実施され得る。

また、補体関連腎症と診断されたか、または補体関連腎症を有すると考えられる個人における平均余命を改善する方法が本明細書に提供される。方法は、上述の治療剤のいずれかなど、臨床的に有効な量の治療剤を投与することを含む。治療剤の投与は、治療剤を投与されていない補体関連腎症と診断された個体の平均余命と比較して、平均余命の増加をもたらす。具体的には、補体関連腎症と診断されたか、または補体関連腎症を有すると考えられる個体に、Ｃ５の発現または活性を阻害する臨床的に有効な量の治療剤を投与することにより、Ｃ５の発現または活性を阻害する治療剤を投与しなかった補体関連腎症と診断された個体の平均余命と比較して、約１０％～７０％の平均余命が増加した（約１０％、１１％、１２％、１３％、１５％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、５６％、６６％、６７％、６８％、６９％、または７０％のいずれかの平均余命の増加など）。

補体関連腎症と診断されたか、または補体関連腎症を有すると考えられる個体における体重損失を減少する方法が本明細書にさらに提供される。方法は、上述の治療剤のいずれかなど、臨床的に有効な量の治療剤を投与することを含む。治療剤の投与は、治療剤を投与されていない補体関連腎症と診断された個体と比較して、体重損失の減少をもたらす。具体的には、補体関連腎症と診断されたか、または補体関連腎症を有すると考えられる個体に、Ｃ５の発現または活性を阻害する臨床的に有効な量の治療剤を投与することにより、Ｃ５の発現または活性を阻害する治療剤を投与しなかった補体関連腎症と診断された個体の体重損失と比較して、約１０％～７０％の体重損失が減少した（約１０％、１１％、１２％、１３％、１５％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、５６％、６６％、６７％、６８％、６９％、または７０％のいずれかの体重損失の減少など）。

本明細書に開示される方法は、例示のために提供される以下の実施例を参照することによってさらに理解することができ、これは限定することを意味するものではない。

実施例１：ヒトＣ３遺伝子による内因性マウスＣ３遺伝子の置換
（Ｉ）ＭＡＩＤ６１４９ ＨＯおよびＭＡＩＤ６１５６ ＨＯマウスの作製
ＭＡＩＤ６１４９マウス－ヒトＣ３プロモーターおよびコーディングエクソン１～４１を用いた置換：５’調節エレメントおよびヒトＣ３遺伝子のコーディングエクソン１～４１のすべてを含むヒトＣ３遺伝子は、５’調節エレメントおよびコーディングエクソン１～４１のすべてにわたるマウスＣ３遺伝子座を置換した（図１Ａ）。

予備的に、２５ｋｂのマウスＣ３遺伝子の標的化欠失は、ポリアデニル化部位へ９００ｂｐ ３’を含むコーディングエクソン２～４１を、フロックス化（ｆｌｏｘｅｄ）されたネオカセットで置換することによって、マウスＥＳ細胞で生じた。結果として得られるマウスＥＳ細胞、１２１３２ＥＳ細胞は、ヘテロ接合性Ｃ３ノックアウトである。１２１３２細胞を使用して、当該技術分野で公知の手順に従ってＣ３ノックアウトマウスを生成した。

コーディングエクソン１からコーディングエクソン４１の上流の５′調節エレメントから延びるヒトＣ３配列に隣接するマウスＣ３上流および下流相同アーム、および３’非翻訳領域、およびフロックス化されたｈｙｇｒｏ選択カセットを含む標的化構築物が生成され、１２１３２ＥＳ細胞に電気穿孔された。適正に標的化されたＥＳ細胞（ＭＡＩＤ６１４８）を、薬剤選択カセットを除去するために一過性Ｃｒｅ発現ベクターを用いてさらに電気穿孔した。薬剤カセット（ＭＡＩＤ６１４９）を有しない標的化されたＥＳ細胞クローンを、８細胞期のマウス胚に導入した。ヒト化Ｃ３遺伝子を有するドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウスを、対立遺伝子アッセイの修飾を用いてマウス対立遺伝子の消失およびヒト対立遺伝子の獲得について遺伝子型を決定することによって同定した（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら（２００３））。ＭＡＩＤ６１４９マウスは、ヒトＣ３エクソン１の上流約９ｋｂ、約４２．８ｋｂのヒトＣ３遺伝子全体、およびポリＡシグナルの下流のヒト配列約１．５ｋｂを含む、約５３．４ｋｂのヒト配列を含有し、この５３．４ｋｂのヒト配列は、マウスＣ３エクソン１の上流の約６．５ｋｂのマウス配列を含む約３０．６ｋｂのマウス配列、およびエクソン１の開始から終止コドンまでの約２４．１ｋｂのマウスＣ３遺伝子を置換した。

フロックス化されたネオカセットがＣ３ノックアウト１２１３２ＥＳ細胞内の欠失マウスＣ３遺伝子配列を置換したことを確認することは、以下のプライマープローブセット（５’から３’に記載される）を含むＴａｑＭａｎ（商標）ｑＰＣＲアッセイによって確認された：１２１３２ＴＵ、マウスＣ３ イントロン１：フォワードプライマー、ＧＧＣＣＴＧＡＴＴＡ ＣＡＴＧＧＡＣＣＴＧ ＴＣ（配列番号１）；リバースプライマー、ＣＣＣＡＧＧＣＴＴＧ ＧＣＴＧＧＡＡＴＧ（配列番号２）；プローブ、ＦＡＭ－ＴＧＴＣＣＡＣＴＣＴ ＧＧＡＡＧＣＣＣＡＧ ＧＣ－ＢＨＱ（配列番号３）；１２１３２ ＴＤ、マウスＣ３エクソン４１の３’：フォワードプライマー、ＧＣＣＡＧＧＡＧＡＧ ＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧ（配列番号４）；リバースプライマー、ＴＧＧＣＴＣＡＧＣＡ ＧＴＡＡＡＧＡＡＣＡ Ｃ（配列番号５）；プローブ、ＦＡＭ－ＡＣＡＧＡＴＴＧＣＴ ＧＴＧＡＧＣＴＧＣＣ ＣＡＡＡ－ＢＨＱ（配列番号６）；ネオカセット：フォワードプライマー、ＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧ ＣＴＡＴＴＣＧＧＣ（配列番号７）；リバースプライマー、ＧＡＡＣＡＣＧＧＣＧ ＧＣＡＴＣＡＧ（配列番号８）；プローブ、ＦＡＭ－ＴＧＧＧＣＡＣＡＡＣ ＡＧＡＣＡＡＴＣＧＧ ＣＴＧ－ＢＨＱ（配列番号９）。

ヒトＣ３遺伝子配列が、ヒト化対立遺伝子内の欠失マウスＣ３遺伝子配列を置換したことを確認することは、以下のプライマープローブセット（５’から３’に記載される）を含むＴａｑＭａｎ（商標）ｑＰＣＲアッセイによって確認された：ｍＣ３－１、マウスＣ３プロモーター：フォワードプライマー、ＧＣＣＡＧＣＣＴＴＡＣＣＣＴＴＴＣＡ（配列番号１０）；リバースプライマー、ＧＣＣＡＣＣＣＡＴＣ ＣＣＡＧＴＴＣＴ（配列番号１１）；プローブ、ＦＡＭ－ＣＡＧＣＣＣＡＧＧＣ ＣＣＴＴＴＡＧＡＴＴ ＧＣＡ－ＢＨＱ（配列番号１２）；ｍＣ３－２、マウス Ｃ３ ３’非翻訳領域、フォワードプライマー、ＴＡＣＧＧＴＧＴＴＡ ＧＧＴＴＣＡＣＴＡＴ ＴＧＧＴ（配列番号１３）；リバースプライマー、ＧＴＣＧＣＣＡＧＣＡ ＧＴＣＴＣＡＴＡＣＡ Ｇ（配列番号１４）；、ＣＡＬ Ｏｒａｎｇｅ－ＡＧＴＧＧＧＣＡＴＣ ＣＣＴＴＧＣＣＡＧＧ Ｃ－ＢＨＱ（配列番号２６）；ｈｙｇｒｏ カセット：フォワードプライマー、ＴＧＣＧＧＣＣＧＡＴ ＣＴＴＡＧＣＣ（配列番号１５）；リバースプライマー、ＴＴＧＡＣＣＧＡＴＴ ＣＣＴＴＧＣＧＧ（配列番号１６）；プローブ、ＦＡＭ－ＡＣＧＡＧＣＧＧＧＴ ＴＣＧＧＣＣＣＡＴＴ Ｃ－ＢＨＱ（配列番号２７）；ｈＣ３－１、ヒトＣ３プロモーター：フォワードプライマー、ＧＧＧＣＣＴＣＣＴＡ ＡＧＴＴＴＧＴＴＧＡ ＧＴＡＴＣ（配列番号１７）；リバースプライマー、ＣＡＧＧＧＣＴＧＧＴ ＴＣＣＣＴＡＧＡＡＡ ＴＣ（配列番号１８）；プローブ、ＦＡＭ－ＴＡＣＡＡＴＡＧＣＡ ＧＧＣＡＣＡＧＣＡＣ ＣＣＡ－ＢＨＱ（配列番号１９）；ｈＣ３－２、ヒトＣ３ イントロン１：フォワードプライマー、ＧＧＣＴＧＡＧＡＧＴ ＧＧＧＡＧＴＣＡＴＧ（配列番号２０）；リバースプライマー、ＧＣＡＣＴＴＧＣＣＡ ＡＴＧＣＣＡＴＴＡＴ Ｃ（配列番号２１）；プローブ、ＦＡＭ－ＣＴＧＣＴＧＴＣＣＴ ＧＣＣＣＡＴＧＴＧＧ ＴＴＧ－ＢＨＱ（配列番号２２）；ｈＣ３－３、ヒトＣ３ エクソン４１：フォワードプライマー、ＣＧＡＡＴＧＣＣＡＡ ＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡ ＡＣ（配列番号２３）；リバースプライマー、ＧＧＧＣＡＣＣＣＡＡ ＡＧＡＣＡＡＣＣＡＴ（配列番号２４）；プローブ、ＣＡＬ Ｏｒａｎｇｅ－ＣＡＧＡＡＡＣＡＡＴ ＧＣＣＡＧＧＡＣＣＴ ＣＧＧＣ－ＢＨＱ（配列番号２５）。

標的化されたＥＳ細胞に由来するマウスについて、尾部の生検から精製されたＤＮＡをアッセイして、それらのＣ３遺伝子型を決定し、ヒト化Ｃ３対立遺伝子が生殖系列を通じて伝達されたことを確認するために、同一のＬＯＮＡアッセイを使用する。置換についてヘテロ接合性の二匹の子を交配して、ヒトＣ３遺伝子による内因性マウスＣ３遺伝子の置換についてホモ接合性であるマウスを生じさせる。表現型決定のために、置換についてホモ接合性である子を使用する。

米国特許出願公開第２０１５０３１３１９４号に記載されるように、マウスＣ３遺伝子座の接合部の配列とヒトＣ３遺伝子を含む配列、ヒトＣ３遺伝子とフロックス化されたｈｙｇｒｏ選択カセットを含む配列の接合部、およびフロックス化されたｈｙｇｒｏ選択カセットとマウスＣ３遺伝子座の配列の接合部が決定され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。

ＭＡＩＤ６１５６マウス－ヒトＣ３コーディングエクソン２～４１を用いた置換：ヒトＣ３遺伝子のコーディングエクソン２～４１を含むヒトＣ３遺伝子は、コーディングエクソン２～４１にわたるマウスＣ３遺伝子座を置換した。上述の方法は、マウスＣ３遺伝子配列をヒトＣ３遺伝子配列と置換するために基本的に使用された（図１Ｂ）。

予備的に、２５ｋｂのマウスＣ３遺伝子の標的化欠失は、ポリアデニル化部位へ９００ｂｐ ３’を含むコーディングエクソン２～４１を、フロックス化（ｆｌｏｘｅｄ）されたネオカセットで置換することによって、マウスＥＳ細胞で生じた。結果として得られるマウスＥＳ細胞、１２１３２ＥＳ細胞は、ヘテロ接合性Ｃ３ノックアウトである。

コーディングエクソン２からコーディングエクソン４１の上流から延びるヒトＣ３配列に隣接するマウスＣ３上流および下流相同アーム、および３’非翻訳領域、およびフロックス化されたｈｙｇｒｏ選択カセットを含む標的化構築物が生成され、１２１３２ＥＳ細胞に電気穿孔された。適正に標的化されたＥＳ細胞（ＭＡＩＤ６１５５）を、薬剤選択カセットを除去するために一過性Ｃｒｅ発現ベクターを用いてさらに電気穿孔した。薬剤カセット（ＭＡＩＤ６１５６）を有しない標的化されたＥＳ細胞クローンを、８細胞期のマウス胚に導入した。ヒト化Ｃ３遺伝子を有するドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウスを、マウス対立遺伝子の消失およびヒト対立遺伝子の獲得について遺伝子型を決定することによって上記のように同定した。

フロックス化されたネオカセットが、Ｃ３ノックアウト１２１３２ＥＳ細胞内の欠失マウスＣ３遺伝子配列を置換したこと、およびヒトＣ３遺伝子配列が、ヒト化対立遺伝子内の欠失マウスＣ３遺伝子を置換したことを確認することは、ＭＡＩＤ６１４９マウスについて上述したとおり、同じプライマープローブセット（５’から３’に記載される）を含むＴａｑＭａｎ（商標）ｑＰＣＲアッセイによって確認された。

標的化されたＥＳ細胞に由来するマウスについて、尾部の生検から精製されたＤＮＡをアッセイして、それらのＣ３遺伝子型を決定し、ヒト化Ｃ３対立遺伝子が生殖系列を通じて伝達されたことを確認するために、同一のＬＯＮＡアッセイを使用する。置換についてヘテロ接合性の二匹の子を交配して、ヒトＣ３遺伝子による内因性マウスＣ３遺伝子の置換についてホモ接合性であるマウスを生じさせる。表現型決定のために、置換についてホモ接合性である子を使用する。

マウスＣ３遺伝子座とヒトＣ３遺伝子を含有する配列との接合部、ヒトＣ３遺伝子を含む配列とフロックス化されたｈｙｇｒｏ選択カセットとの接合部、およびフロックス化されたｈｙｇｒｏ選択カセットの配列とマウスＣ３遺伝子座との接合部の配列が上述のように決定される。

（ＩＩ）Ｃ３血清濃度のアッセイ。
ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットを使用して、血清Ｃ３濃度をＭＡＩＤ６１４９マウスおよびＭＡＩＤ６１５６マウスに分析した。簡潔に述べると、ウエスタンブロット分析を以下のように行った：マウスまたは正常なヒト血清（ＮＨＳ）をＰＢＳ中で希釈した。精製ヒトＣ３ｂタンパク質（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を陽性対照として使用した。マウスＣ３欠損血清を陰性対照として使用した。血清または精製されたｈＣ３タンパク質を、メルカプトエタノールおよびＳＤＳを含む電気泳動サンプルロード緩衝液に加え、還元／変性条件下でポリアクリルアミドゲル上で処理し、次いでニトロセルロース膜上に移した。ブロットをブロックし、ポリクローナルヤギ抗マウスＣ３一次抗体（Ａｂｎｏｖａ）またはヒトＣ３（Ｑｕｉｄｅｌ）に対するポリクローナルヤギ抗血清のいずれかでプローブし、その後、抗ヤギＩｇＧ ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を検出した。ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを使用してブロットを展開した。イメージングには、ＧＥ Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ ＬＡＳ４０００を使用した。血清Ｃ３濃度は、製造業者の指示に従って、補体Ｃ３ヒトＥＬＩＳＡキットおよび補体Ｃ３マウスＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ）で決定された。以下のように、ＥＬＩＳＡによりタンパク質レベルをアッセイした：マウスおよびヒトＣ３は、それぞれ製造業者の指示に従って、補体Ｃ３マウスＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ）および補体Ｃ３ ヒトＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ）で測定された。ヒトＣ３ａを、ＢＤ ＯｐｔＥＩＡ（商標）ヒトＣ３ａ ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定した。マウスＣ３ａは、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの以下の試薬で測定した。製造業者の指示に従って、精製ラット抗マウスＣ３ａ抗体、ビオチンラット抗マウスＣ３ａ抗体、および精製マウスＣ３ａタンパク質（未変性）。

図２に示されるように、ＥＬＩＳＡアッセイにより、マウスＣ３（図２Ａ）とマウスＣ３ａ（図２Ｂ）の両方が、野生型対照と比較して、６週齢と１０週齢の６１５６ホモ接合性マウスと６１４９ホモ接合性マウスに由来する血清と血漿から検出不能であったことが明らかになった。対照的に、図３は、ヒトＣ３（図３Ａ）およびヒトＣ３ａ（図３Ｂ）が、正常なヒト血漿または血清中のこれらのタンパク質について観察されたものよりも低濃度であるが、６１５６のホモ接合性マウスおよび６１４９ホモ接合性マウスからに由来する血漿および血清で検出されたことを示す。マウス血清アミロイドＡタンパク質（ｍＳＡＡ）の存在についてアッセイした対照実験では、Ｃ３ヒト化ホモ接合性マウスで発現する匹敵するレベルが、対応する野生型と比較して見つかった。ＭＡＩＤ６１４９およびＭＡＩＤ６１５６ホモ接合性動物の両方から由来の血清で実施されたウエスタンブロットは、ヒトＣ３タンパク質を発現するが、マウスＣ３タンパク質は発現しないことを示した。これらの実験で使用される抗ｈＣ３抗体は、マウスＣ３タンパク質と相互反応している（図５Ａおよび図５Ｂ）。

まとめると、本実施例は、ヒト化Ｃ３マウスの作成を示す。ＭＡＩＤ６１５６ホモ接合性マウスおよびＭＡＩＤ６１４９ホモ接合性マウスの両方が、ヒトＣ３タンパク質を発現し、マウスＣ３タンパク質を発現しない。

実施例２：Ｃ３ヒト化マウスの寿命と肉眼形態
（Ｉ）Ｃ３ヒト化マウス対野生型の平均死亡年齢および体重。
これらの実験については、死亡率および死亡年齢を動物施設の記録から取得した。さらに、ＭＡＩＤ６１５６ホモ接合性マウスおよびＭＡＩＤ６１４９ホモ接合性マウスの体重は、マウスのコホートでモニターされた。最後に、除脂肪組織体積、全身脂肪体積、および脂肪体積％は、以下のように決定された：マウスをインビボＱｕａｎｔｕｍ μＣＴシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いてスキャンした。Ｘ線源は、電流１６０μＡ、電圧９０ｋＶｐに設定された。マウスをイソフルランで麻酔し、頭部を除いた全身を６０ｍｍ×１２０ｍｍの視野でスキャンした。スキャンは３４秒かかり、ボクセルサイズは２４０μｍであった。結像を解析ソフトウェア（Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ）により解析した。骨、脂肪、および除脂肪組織を灰色の値で区分し、組織体積、脂肪体積画分、骨ミネラル密度（ＢＭＤ）および骨ミネラル含有量を計算した。

ＭＡＩＤ６１５６ホモ接合性マウスおよびＭＡＩＤ６１４９ホモ接合性マウスの両方が、特にＦ２世代において高い自然死の発生率を示した。ただし、生存率は後続世代で増加することが観察された（Ｆ３およびＦ４、図６）。

さらに、マウスの両方の系統は、同年齢の野生型マウスと比較して体重の減少を示した（図７）。特に、ＭＡＩＤ６１４９マウスは２０週目頃に体重が減少し始めた。同様に、マウスの両方の系統は、野生型と比較して、除脂肪組織体積、全身脂肪体積、および体脂肪率の減少を示した（図８Ａおよび図８Ｂ）。図９に示されるように、ＭＡＩＤ６１４９（図９Ａ）およびＭＡＩＤ６１５６（図９Ｂ）ホモ接合性マウスの両方は、野生型と比較して、骨密度の低下と骨ミネラル含有量の減少の両方を示した。

まとめると、この実施例は、ヒト化Ｃ３マウスが、野生型と比較して、高い自然死発生率、体重減少、体脂肪率、骨密度および骨ミネラル含有量の減少を示すことを実証する。
（ＩＩ）Ｃ３ヒト化マウス対野生型の肉眼形態
ＭＡＩＤ６１５６ホモ接合性Ｃ３ヒト化マウスにおいて肉眼形態を評価したのち、有資格獣医師により自然死が判断された。死後検査により、ホモ接合性マウスは脆い骨（肋骨、頭蓋骨およびその他すべての骨）を呈し、野生型と比較して皮下脂肪の顕著な欠如が明らかになった。

実施例３：Ｃ３ヒト化マウスにおける腎臓および肝臓の損傷の特徴付け
（Ｉ）腎病理組織学
簡潔に述べると、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色には、ヘマトキシリンでの染色、酸アルコールでの分化、それに続くエオシンでの染色が含まれる。腎臓切片の過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色は、商業ベンダー（Ｈｉｓｔｏｓｅｒｖ Ｉｎｃ．）を使用して実施した。簡潔に述べると、５ミクロンの薄い切片を、腎臓のすべての解剖学的領域を含むように、矢状面に沿ってホルマリン固定、パラフィン包埋されたマウス腎臓組織から作製した。切片を脱パラフィンし、ＰＡＳで染色して、組織中の糖タンパク質、糖脂質、およびムチンを検出した。ＰＡＳ染色切片におけるメサンギウム基質増加の定量決定を以下のように行った。簡潔に述べると、ＰＡＳ染色された切片を、４０倍の対物レンズのＡｐｅｒｉｏ ＡＴ２スライドスキャナーで撮像した。メサンギウム細胞基質増加の測定については、切片あたり少なくとも２５個の糸球体をＰＡＳ陽性領域の測定に供した。Ｉｎｄｉｃａ Ｌａｂｓ Ａｒｅａ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎアルゴリズムの修飾を使用して、各糸球体係蹄に光学密度ベースの閾値が適用し、シッフ陽性基質（明るい紫）から核染色（暗い青色）および背景（薄いピンク）を分離した。基質および総係蹄の面積を測定し、係蹄面積の割合としてのメサンギウム細胞基質とともに報告した。

通常の腎臓（図１０Ａ）とＭＡＩＤ６１５６ホモ接合性マウス（図１０Ｂ）の腎臓との間の組織学的比較により、単核間質炎症と関連付けられた、好塩基球細管、硬化糸球体、および蛋白円柱を有する拡張細管を含む糸球体腎炎の証拠が明らかになった。自発性腎症は、観察したマウスの６／７に存在した。これらのマウスのうち３匹は、糸球体腎炎が有意であり、マウスの若い年齢を考えると、この状態の早期発症と考えられた。さらに、ホモ接合性マウスは、脾臓およびパイエル板でリンパ球数の減少が観察され、免疫抑制の証拠を示した。さらに、図１１Ａに示し、図１１Ｂに定量化するように、ヒト化Ｃ３マウス由来の過ヨウ素酸－シッフ（ＰＡＳ）染色腎臓は、野生型マウスと比較してメサンギウム基質増加を示した。図１１Ｂに示す定量に関して、増加した糸球体係蹄領域は糸球体肥大を示していた。糸球体内のＰＡＳ染色領域の増加は、メサンギウム基質増加を示していた。

（ＩＩ）血清、肝臓、および尿の化学
ナトリウム、カリウム、塩化物、カルシウム、グルコース、ＢＵＮ、リパーゼ、総タンパク質、クレアチニン、クレアチンキナーゼ、アルブミン、アミラーゼ、ビリルビン、マグネシウム、リン酸、尿酸、亜リン酸、遊離脂肪酸、コレステロール、トリグリセリド、ＨＤＬ、非ＨＤＬ、およびＬＤＬの血清レベルが以下のように決定された。簡潔に述べると、製造業者の指示に従って、ＡＤＶＩＡ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍで血清を試験した。同様に、製造業者の指示に従って、ＡＤＶＩＡ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍで血清肝酵素を試験した。

尿アルブミン、尿クレアチニン（Ｅｘｏｃｅｌｌ Ｉｎｃ．）、ＢＵＮ（ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および血清シスタチンＣ（ＢｉｏＶｅｎｄｏｒ）をメーカーの指示に従って測定した。

野生型とヒト化Ｃ３マウスの間で、ナトリウム、カリウム、塩化物、カルシウム、グルコース、総タンパク質、クレアチニン、クレアチンキナーゼ、アルブミン、アミラーゼ、総ビリルビン、マグネシウム、無機リン酸、尿酸、リン、非エステル化脂肪酸、総コレステロール、トリグリセリド、ＨＤＬ、およびＬＤＬの血清化学パネル解析に差異は見出されなかった（図１２）。しかしながら、野生型と比較して、ヒト化Ｃ３マウスから得られた血清では、血中尿素窒素（ＢＵＮ）の上昇ならびにリパーゼおよび非ＨＤＬのレベルの上昇が観察された（図１３Ａ）。これらの結果は、腎機能障害を示しており、うっ血性心不全または最近の心筋梗塞などの心血管状態にも関連している。さらに、肝臓酵素パネルの結果は、肝臓損傷を示す、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、およびアルカリホスファターゼレベルの上昇を示した（図１３Ｂ）。尿解析は、野生型と比較して、ヒト化Ｃ３マウスでアルブミンが上昇したことを示し、腎機能障害を示唆した（図１４Ａ）。さらなる経時的な血清分析によって、腎不全を示すヒト化Ｃ３マウスで、血清ＢＵＮおよびシスタチンＣが増加したことが明らかになった（図１４Ｂ）。

結論として、ヒト化Ｃ３マウスの血清、肝臓酵素、および尿解析の結果は、腎機能障害および／または不全、ならびに線維症と一致する肝障害を示す。
実施例４：Ｃ３ヒト化マウスにおける腎臓内の異常な補体沈着
ＭＡＩＤ６１４９ホモ接合性および野生型のマウスからの腎臓組織の断面を、以下のプロトコルに従い、Ｃ３沈着およびＣ５ｂ－９膜侵襲複合体の存在について免疫蛍光性で評価した。簡潔に述べると、矢状切片は、凍結ＯＣＴ組み込み腎臓から作製され、ラット－抗マウスＣ３モノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）またはウサギポリクローナルＣ５ｂ－９抗体（Ａｂｃａｍ）のどちらかで染色された。Ｃｙ３ロバ抗ラット（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎＯｒｅｓｅａｒｃｈ）またはＣｙ３ロバ抗ウサギ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎＯｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、染色をそれぞれ可視化した。蛍光画像はそれぞれ、Ｌｅｉｃａ ＤＭ５５００またはＤＭ６０００顕微鏡を使用して撮影された。

蛍光染色により、ヒト化Ｃ３マウスの腎臓におけるＣ３沈着の大きなポケットが見られた（図１５Ａ）。追加染色は、ｈｕＣ３マウスの腎糸球体におけるＣ３ｂ－９膜侵襲複合体沈着の増加を示し、これは活性化された補体経路を示す（図１５Ｂ）。これらの所見によって示唆された代替的な補体経路の異常な調節、ならびに糸球体Ｃ３断片の沈着、および前述のメサンギウム基質および電子密度沈着物の増加は、Ｃ３糸球体症などの腎症と相関する。尿Ｃ５ａレベルは、メーカーのプロトコルに従い、Ｍｏｕｓｅ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｃ５ａ ＤｕｏＳｅｔ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｈｕＣ３マウスで測定された。尿Ｃ５ａレベルは、ＷＴマウスと比較して、ｈｕＣ３マウスで高度に上昇する（図１５Ｃ）。

尿Ｃ５ａレベルの上昇に加えて腎臓内のＣ５ｂ－９染色の増加は、ｈｕＣ３マウスの腎臓における補体経路の局所活性化を示唆する。
実施例５：Ｃ３ヒト化マウスのＲＮＡ配列シグネチャー
ＭＡＩＤ６１４９とＭＡＩＤ６１５６の両方のホモ接合性マウスを互いに比較するとともに、野生型と比較する発現ＲＮＡ配列シグネチャーの決定を以下のように行った。

トランスクリプトームシーケンシングデータ生成およびマッピングの読み取り：総ＲＮＡを、ＭａｇＭＡＸキット（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いてマウスの組織試料から抽出した。ｍＲＮＡをＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ｍＲＮＡ精製キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、４μｇの総ＲＮＡから精製した。鎖特異的ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーは、ＳｃｒｉｐｔＳｅｑ（商標）ｍＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリー調製キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用して調製し、その後１２回のＰＣＲ増幅サイクルを行った。シークエンシングを、３３サイクルで多重化された単一読み取り実行により、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ（登録商標）２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で実施した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑ２０００イメージファイル（ＢＣＬファイル）のシーケンス読み取りは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｃａｓａｖａ １．８．２を介してＦＡＳＴＱ形式に変換した。読み取りはバーコードに基づいてデコードされ、個々のサンプルごとにマージされた。サンプルごとの全体的な読み取り品質をＦａｓｔＱＣで評価し、十分な品質を持つサンプルのみを保持した。続いて、市販のソフトウェアＣＬＣＢｉｏを使用して、一つのミスマッチを含むマウスゲノム（ビルドｍｍ１０）に読み取りをマッピングした。

差次的に発現する遺伝子の統計解析：各遺伝子について、遺伝子のセンス鎖エクソンにマッピングされたリードを特定し、カウントした。検出可能な遺伝子は、遺伝子レベルで要約された総エクソンセンス鎖読み取りカウントに基づいてフラグが付けられる。１０の経験的最小エクソン読み取りカウントを適用して、各サンプルの遺伝子の有無を判定した。サンプルの二つのグループ間の比較のために、遺伝子は、高発現グループのすべてのサンプルに存在するものとしてフラグが付けられていない場合、排除された。次に、比較に関連付けられた倍数変化およびｐ値は、ＤＥＳｅｑパッケージ［Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１０、１１：Ｒ１０６］を使用して計算された。有意に攪乱した遺伝子シグネチャーとして、両方向の倍率変化（すなわち、比率）が≧１．５で、ｐ値が＜０．０１の遺伝子を選択した。

図１６に示すように、ＲＮＡ発現の器官特異的解析では、野生型と比較して、ヒト化Ｃ３マウスでは、肝臓で最も多くの、また数は少ないが腎臓でも遺伝子発現の変化があったことを示す。また分析は、ＭＡＩＤ６１５６マウスで観察されたものと比較して、ＭＡＩＤ６１４９マウスの方が、心臓での遺伝子発現の変化が多いことも示した。

ＭＡＩＤ６１４９とＭＡＩＤ６１５６マウスとの間の肝臓遺伝子発現シグネチャーの比較は、二つのマウス系統の間で上方制御または下方制御される遺伝子数で顕著な重複を示した（図１７）。二つの系統の間で最も攪乱している遺伝子発現経路は、細胞外基質の産生、創傷に対する応答、および小分子の膜透過輸送に関連するものである（図１８）。特に、肝臓の線維症に関連する遺伝子発現パターンは、ＭＡＩＤ６１５６ホモ接合性マウスにおいて特に高いことが示された（図１９）。

腎臓に対して実施された類似の比較は、限定的な遺伝子シグネチャー重複を示したが、全体的にＭＡＩＤ６１４９およびＭＡＩＤ６１５６マウスは、ＲＮＡ発現の攪乱傾向／パターンの一貫性を共有した（図２０）。特に、腎臓損傷に関連する遺伝子は、ヒト化Ｃ３系統の両方で濃縮された。

全体的に、ＲＮＡ発現の分析は、肝臓遺伝子が、ＭＡＩＤ６１４９およびＭＡＩＤ６１５６ホモ接合性マウス系統の両方で最も攪乱していることを示す。ＭＡＩＤ６１５６系統に関しては、細胞サイクルおよび線維症、ならびに炎症に関連する遺伝子が、最も有意なシグネチャーを有していた。炎症およびステロイド代謝遺伝子シグネチャーを、ＭＡＩＤ６１４９ホモ接合性マウスで濃縮した。特に、Ｔｎｆｓｆ１４遺伝子は、ヒト化Ｃ３マウスの両系統の肝臓で高度に上方制御された。このＴｎｆｓｆ１４遺伝子は、ＴＮＦスーパーファミリーの分泌タンパク質である、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＳＦ１４）としても知られるＬＩＧＨＴタンパク質をコードする。しかしながら、この遺伝子は、マウスゲノムのＣ３の３’近傍にあるため、その過剰発現はアーチファクトである可能性がある。血管新生および発達に関連するタンパク質をコードする遺伝子であるＰｒｏｋ１は、これはホモ接合性マウス系統間の上方下方制御された遺伝子であった。

進行腎症（これらのマウスのＢＵＮレベルは、ＷＴマウスの２０～３５ｍｇ／ｄｌと比較して、６０～１２０ｍｇ／ｄｌである）を有するｈｕＣ３マウスの腎臓における遺伝子発現のさらなる特徴付けは、ＲＮＡＳｅｑによって実施された。ｈｕＣ３マウスは、いくつかの上方制御または下方制御された遺伝子発現の変化を示した（図２１Ａ）。データのさらなる分析により、いくつかの腎毒性遺伝子（図２１Ｂ）、ＥＣＭ遺伝子（図２１Ｃ）、サイトカイン（図２１Ｄ）およびケモカイン（図２１Ｅ）の上方制御された発現が明らかになった。

全体的に、進行腎症を有するｈｕＣ３マウスの腎臓の遺伝子発現データは、継続的な傷害および炎症を示す。
実施例６：補体関連腎症の治療における抗Ｃ５抗体の有効性
上述のように、Ｃ３にヒト化されたマウスは、自然死、正常から低い溶血活性、低循環Ｃ３（正常なマウスで見られる１０００ｕｇ／ｍＬに対して約４０ｕｇ／ｍＬ）、ならびに腎臓炎症および腎臓内のＣ３沈着の存在を含む多臓器病理を有することが見いだされた。

この実施例では、８週齢のＣ３ヒト化マウスを、５０ｍｇ／ｋｇの抗Ｃ５抗体Ｍ１Ｍ１７６２８Ｎまたはアイソタイプ対照で、週三回、９週間、皮下処置した。上述のように、死亡率、血中尿素窒素、血清シスタチンＣ、尿アルブミンおよびＣ５ａレベルが試験された。Ｃ３およびＣ５ｂ－９は、上述のように病理組織学的染色によって試験された。

抗Ｃ５抗体での治療により、ヒト化Ｃ３マウスにおける生存率が著しく改善され、抗Ｃ５抗体で処置したマウスは、アイソタイプ対照で処置したマウスの８１％の死亡率と比較して、たったの２０％の死亡率しか示さなかった（図２２）。抗Ｃ５抗体での治療は、ヒト化Ｃ３マウスにおける体重を改善し（図２３）、ＢＵＮ（図２４Ａ）および血清シスタチンＣ（図２４Ｂ）などの腎機能のマーカーを改善した。尿アルブミンには効果は見られなかった（データ非表示）が、抗Ｃ５抗体を用いた治療において、尿Ｃ５ａレベルは減少した（図２５）。

病理組織学的染色は、抗Ｃ５抗体で処置したＣ３ヒト化マウスおよびアイソタイプ対照で処置した野生型マウスと比較して、アイソタイプ対照で処置したＣ３ヒト化マウスにおける糸球体膜侵襲複合体（ＭＡＣ）含有量（Ｃ５ｂ－９）の増加を示した（図２６）。抗Ｃ５抗体を用いた処置は、ヒト化Ｃ３動物の腎臓への糸球体好中球（図２７Ａ）および間質マクロファージ浸潤（図２７Ｂ）を有意に減少させた。さらに、抗Ｃ５抗体で処置したＣ３ヒト化マウスおよびアイソタイプ対照で処置した野生型マウスと比較して、アイソタイプ対照で処置したＣ３ヒト化マウスは、糸球体サイズの増加とメサンギウム基質増加を示した（図２８）。

結論として、結果は、抗Ｃ５療法が死亡率および腎機能を著しく改善でき、補体関連腎症の症状を呈する齧歯類の腎臓における損傷の組織学的兆候を減少させ得ることを示す。
実施例７：抗Ｃ５治療が、ヒト化Ｃ３マウス（ＭＡＩＤ６１４９）の疾患遺伝子シグネチャーの深部の救済をもたらした。

ヒト化Ｃ３マウス（ＭＡＩＤ６１４９）を、マウス抗マウスＣ５抗体、またはアイソタイプ対照抗体（ｎ＝１６）のいずれかで処置し、８週齢から開始した。野生型マウスをアイソタイプ対照（ｎ＝５）で処置した。抗体を５０ｍｇ／ｋｇで、週三回、皮下投与した。治療は１７週齢まで続けた。試験終了時に生存したマウスの腎臓における次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって遺伝子発現を調べた。

図２９Ａに示されるように、ヒト化Ｃ３ ＭＡＩＤ６１４９マウスにおいて、抗Ｃ５抗体治療が、疾患シグネチャー遺伝子を逆転した。救済された疾患シグネチャーには、免疫、細胞外基質、サイトカイン、補体、および代謝関連遺伝子が含まれる（図２９Ｂ）。ヒト化Ｃ３マウスにおいて上方制御された免疫細胞型マーカーが、その後、抗Ｃ５抗体処置によって弱毒化されることが示された（図２９Ｃ）。

実施例８：Ｃ５の連続的遮断は、ヒト化Ｃ３マウスの生存を延長するために必要とされ得る（ＭＡＩＤ６１４９）。
ヒト化Ｃ３マウスを、マウス抗マウスＣ５抗体、またはアイソタイプ対照抗体（ｎ＝１５）のいずれかで処置し、８週齢から開始した。抗体を５０ｍｇ／ｋｇで、週三回、皮下投与した。治療は２４週齢で停止した。

１６週間の治療期間中（８～２４週齢）、１５匹のマウスのうち２匹のみが抗Ｃ５抗体で死亡した。同時期に、アイソタイプ対照群の１６匹中１３匹が死亡した（図３０）。治療中止後四週間以内に、抗Ｃ５抗体治療中の数匹のマウスが死亡した（残り１３匹中１２匹）。このデータは、Ｃ５の連続的遮断は、ヒト化Ｃ３ＭＡＩＤ６１４９マウスの生存を延長するために必要とされ得ることを示唆する。

実施例９：Ｃ３ｂの遮断はまた、ヒト化Ｃ３マウスにおける保護も提供している。
ヒト化Ｃ３マウス（ＭＡＩＤ６１４９）を、抗Ｃ３ｂ結合／遮断抗体（ｎ＝１４）またはアイソタイプ対照抗体（ｎ＝１４）のいずれかで処置し、８週齢から開始した。抗体を５０ｍｇ／ｋｇで、週三回、皮下投与した。治療は、１８週齢まで続く（合計１０週間の治療期間）。

１０週間の試験期間中、アイソタイプ対照を用いて１４匹中１１匹のマウスが死亡した（図３１Ａ）。同時期に抗３ｂ抗体を用いて１４匹中１匹のみが死亡したことから、Ｃ３ｂ遮断がヒト化Ｃ３ＭＡＩＤ６１４９マウスにおいて有意な生存率を提供したことを示唆する。抗Ｃ３ｂ遮断抗体は、ヒト化Ｃ３マウスの体重も改善し、健康状態の改善を示唆した（図３１Ｂおよび図３１Ｃ）。全体的に、これらのデータは、Ｃ５の上流のＣ３ｂの阻害を示し、ヒト化Ｃ３マウスにおける保護も提供する。

Claims (28)

1. 補体関連腎症の治療に使用するための薬剤のインビボでの治療有効性を評価する方法であって、前記方法が、
   （ａ）ゲノムがＣ３遺伝子のエクソンを含む齧歯類遺伝子配列の内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座において、ヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列による置換を含むことで修飾Ｃ３遺伝子を形成している齧歯類に前記薬剤を投与することであって、
   （ｉ）前記ヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列は、前記ヒトＣ３遺伝子のエクソン２からエクソン４１を含み、かつ前記修飾Ｃ３遺伝子の発現が、前記内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座で齧歯類調節エレメントの制御下にあるか、または
   （ｉｉ）前記ヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列は、前記ヒトＣ３遺伝子のエクソン１からエクソン４１を含み、
   前記齧歯類はマウスまたはラットであり、かつ前記腎症の一つまたは複数の症状を示す、投与することと、
   （ｂ）前記薬剤が投与されていない対照齧歯類と比較して、前記腎症の一つまたは複数の症状を阻害するかどうかを評価することと、を含む方法。
2. 前記齧歯類が、マウスＣ３タンパク質を発現する能力を有しないマウスである、請求項１に記載の方法。
3. 前記齧歯類が、内因性マウスＣ５遺伝子によってコードされたマウスＣ５タンパク質を発現するマウスである、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記薬剤が、小分子化学物質、ペプチド、および抗体からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記薬剤が、抗体である、請求項４に記載の方法。
6. 前記薬剤が、モノクローナル抗体またはその機能的結合断片である、請求項５に記載の方法。
7. 前記薬剤が、阻害性核酸である、請求項４に記載の方法。
8. 前記阻害性核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、およびリボザイムからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
9. 前記腎症の一つまたは複数の症状が自然死を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記腎症の一つまたは複数の症状が、体重減少、骨密度の減少、体脂肪の減少、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記腎症の一つまたは複数の症状が、糸球体腎炎、好塩基球細管、硬化糸球体、蛋白円柱を有する拡張細管、メサンギウム基質増加、糸球体肥大、および単核間質性炎症からなる群の一つまたは複数から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記腎症の一つまたは複数の症状が、腎臓におけるＣ３タンパク質沈着を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記腎症の一つまたは複数の症状が、腎臓におけるＣ５ｂ－９膜侵襲複合体沈着を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記腎症の一つまたは複数の症状が、高血中尿素窒素（ＢＵＮ）、血清リパーゼ、血清シスタチンＣ、または血清非高密度リポタンパク質のうちの一つまたは複数を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記腎症の一つまたは複数の症状が、尿アルブミンまたはＣ５ａの増加を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記腎症の一つまたは複数の症状が、腎症シグネチャー遺伝子の一つまたは複数の発現を決定することに基づいて評価される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
17. 肝線維症の治療に使用するための薬剤のインビボでの治療有効性を評価する方法であって、前記方法が、
    （ａ）Ｃ３遺伝子のエクソンを含む齧歯類遺伝子配列の内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座において、ヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列による置換を含むことで修飾Ｃ３遺伝子を形成している齧歯類に前記薬剤を投与することであって、
    （ｉ）前記ヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列は、前記ヒトＣ３遺伝子のエクソン２からエクソン４１を含み、かつ前記修飾Ｃ３遺伝子の発現が、前記内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座で齧歯類調節エレメントの制御下にあるか、または
    （ｉｉ）前記ヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列は、前記ヒトＣ３遺伝子のエクソン１からエクソン４１を含み、
    前記齧歯類はマウスまたはラットであり、かつ肝線維症の一つまたは複数の症状を示す、投与することと、
    （ｂ）前記薬剤が投与されていない対照齧歯類と比較して、前記肝線維症の一つまたは複数の症状を阻害するかどうかを評価することと、を含む方法。
18. 前記齧歯類が、マウスＣ３タンパク質を発現する能力を有しないマウスである、請求項１７に記載の方法。
19. 前記齧歯類が、内因性マウスＣ５遺伝子によってコードされたマウスＣ５タンパク質を発現するマウスである、請求項１７に記載の方法。
20. 前記薬剤が、小分子化学物質、ペプチド、および抗体からなる群から選択される、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記薬剤が、抗体である、請求項２０に記載の方法。
22. 前記薬剤が、モノクローナル抗体またはその機能的結合断片である、請求項２１に記載の方法。
23. 前記薬剤が、阻害性核酸である、請求項２０に記載の方法。
24. 前記阻害性核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、およびリボザイムからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
25. 前記肝線維症の一つまたは複数の症状が、高アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、高アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、または高アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）のうちの一つまたは複数である、請求項１７～２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記肝線維症の一つまたは複数の症状が、肝線維症シグネチャー遺伝子の一つまたは複数の発現を決定することに基づいて評価される、請求項１７～２４のいずれか一項に記載の方法。
27. ゲノムがＣ３遺伝子のエクソンを含む齧歯類遺伝子配列の内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座において、ヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列による置換を含むことで修飾Ｃ３遺伝子を形成している齧歯類における補体関連腎症の症状を阻害する薬剤を特定するための方法であって、（ｉ）前記ヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列は、前記ヒトＣ３遺伝子のエクソン２からエクソン４１を含み、かつ前記修飾Ｃ３遺伝子の発現が、前記内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座で齧歯類調節エレメントの制御下にあるか、または（ｉｉ）前記ヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列は、前記ヒトＣ３遺伝子のエクソン１からエクソン４１を含み、前記齧歯類はマウスまたはラットであり、かつ補体関連腎症の一つまたは複数の症状を示し、前記方法が、（ａ）前記齧歯類に前記薬剤を投与することと、（ｂ）前記薬剤が前記齧歯類における前記補体関連腎症の一つまたは複数の症状を阻害する場合、補体関連腎症の症状を阻害する薬剤として前記薬剤を特定することと、を含む方法。
28. ゲノムがＣ３遺伝子のエクソンを含む齧歯類遺伝子配列の内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座において、ヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列による置換を含むことで修飾Ｃ３遺伝子を形成している齧歯類における肝線維症を阻害する薬剤を特定するための方法であって、（ｉ）前記ヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列は、前記ヒトＣ３遺伝子のエクソン２からエクソン４１を含み、かつ前記修飾Ｃ３遺伝子の発現が、前記内因性齧歯類Ｃ３遺伝子座で齧歯類調節エレメントの制御下にあるか、または（ｉｉ）前記ヒトＣ３遺伝子の少なくとも一つのエクソンを含む核酸配列は、前記ヒトＣ３遺伝子のエクソン１からエクソン４１を含み、前記齧歯類はマウスまたはラットであり、かつ肝線維症の一つまたは複数の症状を示し、前記方法が、（ａ）前記齧歯類に前記薬剤を投与することと、（ｂ）前記薬剤が前記齧歯類中の前記肝線維症の一つまたは複数の症状を阻害する場合、肝線維症を阻害する薬剤として前記薬剤を特定することと、を含む方法。

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