KR20230066376A - 이종이식을 위한 유전자 변형 - Google Patents

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KR20230066376A
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메건 사익스
로버트 제이. 홀리
카즈히코 야마다
데이비드 에이치 삭스
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더 트러스티스 오브 콜롬비아 유니버시티 인 더 시티 오브 뉴욕
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Abstract

조직 특이적 방식으로 인간 CD47을 발현하는 재조합 미니 돼지가 본 명세서에서 제공된다. 또한 미니 돼지로부터 분리된 신장이 제공되며, 여기서 신장의 사구체는 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 또한, 재조합 미니 돼지 유래의 인간 CD47의 사구체-특이적 발현이 있는 이러한 돼지 신장을 인간 수용자에게 이식하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 특정 양태에서, 제1 공여자 동물(예를 들어, 미니 돼지) 유래의 인간 CD47을 발현하는 조혈 줄기 세포 및 제2 공여자 동물(예를 들어, 미니 돼지) 유래의 사구체에서 인간 CD47을 발현하는 신장을 수용자(예를 들어, 인간 수용자)에게 이식하는 단계를 포함하는 이식 방법이 본 명세서에서 제공된다.

Description

이종이식을 위한 유전자 변형
1. 정부 라이센스 권리
본 발명은 미국 국립보건원(National Institutes of Health: NIH)의 국립 알레르기 및 감염병 연구소(National Institute of Allergy and Infectious Diseases: NIAID)가 수여한 허가 번호 P01 AI045897 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
2. 관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 9월 7일자로 출원된 미국 일련 번호 제63/075,285호 및 2020년 11월 3일자로 출원된 미국 일련 번호 제63/108,986호의 이익을 주장하며, 이들 각각의 개시내용은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
3. 전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다. 2021년 8월 26일에 생성된 상기 ASCII 사본은 명칭이 14648-015-228_Sequence_Listing.txt이고 크기가 42,743 바이트이다.
4. 기술분야
조직 특이적 방식으로 인간 CD47을 발현하는 재조합 미니 돼지(예를 들어, GalT 녹아웃 미니 돼지)가 본 명세서에서 제공된다. 또한 미니 돼지로부터 분리된 신장이 제공되며, 여기서 신장의 사구체는 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 또한, 재조합 미니 돼지 유래의 인간 CD47의 사구체-특이적 발현이 있는 이러한 돼지 신장을 인간 수용자에게 이식하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 특정 양태에서, 제1 공여자 동물(예를 들어, 미니 돼지) 유래의 인간 CD47을 발현하는 조혈 줄기 세포 및 제2 공여자 동물(예를 들어, 미니 돼지) 유래의 사구체에서 인간 CD47을 발현하는 신장을 수용자(예를 들어, 인간 수용자)에게 이식하는 단계를 포함하는 이식 방법이 본 명세서에서 제공된다.
5. 배경기술
동종이계 공여자의 심각한 부족은 현재 수행되는 장기 이식의 수를 제한한다. 이러한 공급-수요 불균형은 다른 종 유래의 장기의 사용(이종이식)에 의해 조정될 수 있다. 비-인간 영장류의 사용과 연관된 윤리적 문제 및 비실용성을 고려하면, 돼지는 인간에게 가장 적합한 공여체 종으로 고려된다. 장기 크기 및 인간과의 생리학적 유사성에 추가적으로, 돼지를 빠르게 교배시키고 동종 번식시키는 능력은 특히 인간에 대한 이식 공여체로서 기능하는 능력을 개선시킬 수 있는 유전자 변형을 가능하게 한다. 예를 들어, 문헌[Sachs (1994), Path. Biol. 42:217-219 및 Piedrahita et al. (2004), Am. J. Transplant, 4 Suppl. 6:43-50]을 참조한다.
비특이적 면역억제 요법과 결합된 이식은 높은 초기 이식편 수용률과 연관이 있지만, 임상 장기 이식의 성공에 대한 주요 제한은 주로 이식의 만성 거부로 인한 후기 이식편 손실이었다. 따라서 면역 관용은 이식의 주요 목표이며 성공적인 임상 이종이식을 위해서는 훨씬 더 중요할 것인데, 이는 이식이식 거부를 예방하는 데 필요한 평생 면역억제 수준이 너무 독성이 강해서 허용할 수 없기 때문이다. 추가적으로, 환자에서 면역학적 내성이 달성되었는지 여부를 확실하게 나타내는 마커가 확인되지 않아, 면역억제 중단의 기초가 되는 실험실 매개변수가 없다.
따라서, 이종이식의 목표는 내성 달성을 포함한다. 이것은 이종 흉선 이식에 의해 또는 공여 동물의 건강과 생존력을 유지하는 것뿐만 아니라 이종 수용자에게 이식된 후 공여자 동물에서 유래한 혼합 키메라 세포의 내구성을 최적화함으로써 달성될 수 있다.
혼합 키메라 현상은 수용자의 T 세포, B 세포 및 자연 살해(NK) 세포 수준에서 공여자에 대한 내성을 유도할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Griesemer et al. (2014), Immunol. Rev. 258: 241-258; Sachs et al. (2014), Cold Spring Harb. Perspect. Med. 4:a015529]을 참조한다.
인테그린-연관 단백질(IAP)로도 알려진 CD47은 편재적으로 발현되는 50 kDa의 세포 표면 당단백질이며, 신호 조절 단백질 (SIRP)α(또한 CD172a 및 SHPS-1로도 알려짐)에 대한 리간드의 역할을 한다. 예를 들어, 문헌[Brown (2002), Curr. Opin. Cell. Biol., 14:603-7; 및 Brown and Frazier (2001), Trends Cell Biol., 111130-5]을 참조한다. CD47 및 SIRPα는 세포 이동, B 세포의 부착 및 T 세포 활성화를 포함한 다양한 세포 과정에서 중요한 역할을 하는 세포-세포 통신 시스템을 구성한다. 예를 들어, 문헌[Liu et al. (2002), J. Biol. Chem. 277: 10028; Motegi et al. (2003), EMBO 122:2634; Yoshida et al.(2002), J. lmmunol. 168:3213; 및 Latour et al. (2001), J. lmmunol. 167:2547]을 참조한다. 추가적으로, CD47-SIRPα 시스템은 대식세포에 의한 식세포작용의 음성 조절과 관련이 있다. 일부 세포 유형(즉, 적혈구, 혈소판 또는 백혈구) 표면의 CD47은 대식세포에 의한 식세포작용을 저해하였다. 식세포작용의 저해에서 CD47-SIRPα 상호작용의 역할은, 일차 야생형 마우스 대식세포가 CD47-결핍 마우스에서 얻은 비옵소닌화 적혈구(RBC)를 빠르게 식세포하지만 야생형 마우스 유래의 비옵소닌화 적혈구는 그렇지 않다는 관찰에 의해 설명되었다. 예를 들어, 문헌[Oldenborg et al.(2000), Science 288:2051]을 참조한다. 또한 이의 수용체인 SIRPα를 통해, CD47은 Fcγ 및 보체 수용체 매개 식세포작용을 둘 다 저해하는 것으로 보고되었다. 예를 들어, 문헌[Oldenborg et al. (2001), J. Exp. Med. 193:855]을 참조한다.
CD47KO 세포는 동계 야생형(WT) 마우스에 주입한 후에 대식세포에 의해 강력하게 거부되며, 이는 CD47이 대식세포에게 "나를 먹지 마시오"라는 신호를 제공한다는 것을 입증한다. 예를 들어, 문헌[Oldenborg PA, et al. (2000), Science, 288:2051-4; 및 Wang et al. (2007), Proc Natl Acad Sci U S A. 104:13744]을 참조한다. 이식 공급원으로 돼지를 사용하는 이종이식은 임상 이식의 주요 제한 요인인 인간 장기 공여자의 심각한 부족 문제를 해결할 수 있는 잠재력이 있다. 예를 들어, 문헌[Yang et al. (2007), Nature Reviews Immunology. 7:519-31]을 참조한다. 대식세포에 의한 이종 세포의 강력한 거부(예를 들어, 문헌[Abe (2002), The Journal of Immunology 168:621] 참조)는 주로 공여자 CD47과 수용자 SIRPα 사이의 기능적 상호작용의 결여에 의해 유발되며(예를 들어, 문헌[Wang et al. (2007), Blood; 109:836-42; Ide et al. (2007), Proc Natl Acad Sci USA 104:5062-6; 및 Navarro-Alvarez (2014), Cell transplantation, 23:345-54] 참조), 이는 인간 CD47 유전자이식 돼지의 개발로 이어진다(예를 들어, 문헌[Tena et al. (2017), Transplantation 101:316-21; 및 Nomura et al. (2020), Xenotransplantation 2020; 27:e12549] 참조). 대식세포에 추가적으로, DC의 하위 집단도 또한 SIRPα를 발현한다(예를 들어, 문헌[Wang et al. (2007), Proc Natl Acad Sci U S A. 104:13744-9; 및 Guilliams et al. (2016), Immunity. 45:669-84] 참조). CD47-SIRPα 신호전달은 또한 DC 활성화와 T 세포를 프라이밍하는 능력을 저해하고, 공여자-특이적 수혈(donor-specific transfusion; DST) 또는 간세포 이식에 의한 T 세포 내성 유도에 중요한 역할을 한다. 예를 들어, 문헌[Wang et al. (2007), Proc Natl Acad Sci U S A. 104:13744-9; Wang et al. (2014), Cell transplantation 23:355-63; 및 Zhang et al. (2016), Sci Rep. 6:26839]을 참조한다.
6. 발명의 내용
일 양태에서, 신장 이식 수용자에서 단백뇨를 예방하거나 이의 중증도를 감소시키는 방법이 본 명세서에서 제공되며, 여기서 상기 방법은 (i) 수용자에게 신장을 이식하되, 신장은 알파-1,3 갈락토실트랜스퍼라제-결핍 미니 돼지로부터 얻고 신장의 사구체는 수용자에서 단백뇨를 예방하거나 이의 중증도를 감소시키기에 충분한 수준으로 인간 CD47을 발현하는 것인 단계; 및 (ii) 수용자에게 돼지 조혈 줄기 세포를 이식하되, 돼지 조혈 줄기 세포는 인간 CD47을 발현하고 알파-1,3 갈락토실트랜스퍼라제-결핍 미니 돼지로부터 얻은 것인 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 신장의 사구체는 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 신장의 사구체는 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 2배 내지 10배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 알파-1,3 갈락토실트랜스퍼라제-결핍 미니 돼지는 MHC-동종 번식 콜롬비아/삭스(Columbia/Sachs) 미니 돼지이다. 일부 실시형태에서, 인간 CD47 발현 수준은 실시간 중합효소 연쇄 반응에 의해 측정된다.
일부 실시형태에서, 수용자는 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 수용자는 인간이다.
일부 실시형태에서, 돼지 조혈 줄기 세포는 골수, 말초 혈액, 제대혈 또는 태아 간 세포로부터 얻어진다.
일부 실시형태에서, 인간 CD47은 내인성 돼지 CD47과 동일한 조절 요소 하에 발현된다. 일부 실시형태에서, 인간 CD47은 알파-1,3 갈락토실트랜스퍼라제-결핍 미니 돼지에서 내인성 돼지 CD47을 대체한다. 일부 실시형태에서, 인간 CD47은 사구체-특이적 프로모터 하에 발현된다. 일부 실시형태에서, 사구체-특이적 프로모터는 네프린이다.
일부 실시형태에서, 단백뇨는 신장 단백뇨이다. 일부 실시형태에서, 단백뇨는 24시간당 3g 미만으로 감소된다. 일부 실시형태에서, 단백뇨는 24시간당 500㎎으로 감소된다. 일부 실시형태에서, 단백뇨는 24시간당 300㎎으로 감소된다. 일부 실시형태에서, 단백뇨는 24시간당 150㎎으로 감소된다. 일부 실시형태에서, 단백뇨는 이식 2주 이내에 해소된다. 일부 실시형태에서, 단백뇨는 이식 1개월 이내에 해소된다. 일부 실시형태에서, 단백뇨는 이식 2개월 이내에 해소된다. 일부 실시형태에서, 단백뇨는 이식 4개월 이내에 해소된다.
일부 실시형태에서, 신장은 흉선신장(thymokidney)이다.
다른 양태에서, 미니 돼지로부터 분리된 신장이 본 명세서에서 제공되며, 여기서 신장의 사구체는 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 신장의 사구체는 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 2배 내지 10배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 인간 CD47 발현 수준은 실시간 중합효소 연쇄 반응에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, 인간 CD47은 내인성 돼지 CD47과 동일한 조절 요소 하에 발현된다. 일부 실시형태에서, 인간 CD47은 사구체-특이적 프로모터 하에 발현된다. 일부 실시형태에서, 사구체-특이적 프로모터는 네프린이다. 일부 실시형태에서, 신장은 흉선신장이다. 일부 실시형태에서, 미니 돼지는 알파-1,3 갈락토실트랜스퍼라제-결핍 미니 돼지이다. 일부 실시형태에서, 알파-1,3 갈락토실트랜스퍼라제-결핍 미니 돼지는 MHC-동종 번식 콜롬비아/삭스 미니 돼지이다.
다른 양태에서, 미니 돼지 유래의 신장을 인간 수용자에게 이식하는 방법이 본 명세서에서 제공되며, 여기서 상기 방법은 (i) 골내 이식을 통해 제1 미니 돼지 유래의 골수를 수용자에게 이식하는 단계; 및 (ii) 제2 미니 돼지 유래의 신장을 수용자에게 이식하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 미니 돼지 유래의 신장을 이식하는 상기 제2 단계는 제1 미니 돼지 유래의 골수를 이식하는 제1 단계 후 적어도 28일 후에 수행된다.
일부 실시형태에서, 제1 미니 돼지 유래의 골수는 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 제2 미니 돼지 유래의 신장은 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 제1 미니 돼지 유래의 골수 및 제2 미니 돼지 유래의 신장은 인간 CD47을 발현한다.
일부 실시형태에서, 인간 CD47은 내인성 돼지 CD47과 동일한 조절 요소 하에 발현된다. 일부 실시형태에서, 인간 CD47은 사구체-특이적 프로모터 하에 발현된다. 일부 실시형태에서, 사구체-특이적 프로모터는 네프린이다.
일부 실시형태에서, 골수 및 신장은 동일한 미니 돼지로부터 유래한다. 일부 실시형태에서, 제1 미니 돼지 및 제2 미니 돼지는 고도로 동종 번식된 동일한 미니 돼지 무리로부터 유래한다. 일부 실시형태에서, 제1 미니 돼지 및 제2 미니 돼지는 알파-1,3 갈락토실트랜스퍼라제-결핍 미니 돼지이다. 일부 실시형태에서, 알파-1,3 갈락토실트랜스퍼라제-결핍 미니 돼지는 MHC-근친교배 콜롬비아/삭스 미니 돼지이다. 일부 실시형태에서, 제1 미니 돼지 및 제2 미니 돼지는 유전적으로 일치하는 미니 돼지이다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 미니 돼지는 MHC가 일치한다.
일부 실시형태에서, 방법은 하나 이상의 추가적인 치료를 수용자에게 투여하는 것을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 추가적인 치료는 전신 방사선 조사, 흉선 방사선 조사, 리툭시맙, 항흉선세포 글로불린(anti-thymocyte globulin: ATG), 타크로리무스, 마이코페놀레이트 모페틸(tacrolimus, mycophenolate mofetil: MMF), 항-CD154 항체, 코브라독 인자(cobra venom factor: CVF), 헤파린, 프로스타사이클린, 재조합 돼지 사이토카인, 돼지 줄기 세포 인자(prostacyclin, recombinant porcine cytokines, porcine stem cell factor: pCSF), 돼지 인터류킨-3(pIL-3), 간시클로버, 메틸프레드니솔론, 항-IL6 수용체 항체 및 항-CD40 항체를 포함하는 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 방법은 미니 돼지 유래의 랑게르한스섬 세포를 수용자에게 이식하는 단계를 더 포함한다.
다른 양태에서, 비-인간 종 유래의 이종이식편이 본 명세서에서 제공되며, 여기서 이종이식편은 (a) 신장; 및 (b) 랑게르한스섬 세포를 포함하고, 신장은 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현하는 사구체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 신장의 사구체는 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 2배 내지 10배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 인간 CD47 발현 수준은 실시간 중합효소 연쇄 반응에 의해 측정된다. 일부 실시형태에서, 인간 CD47은 내인성 돼지 CD47과 동일한 조절 요소 하에 발현된다. 일부 실시형태에서, 인간 CD47은 사구체-특이적 프로모터 하에 발현된다. 일부 실시형태에서, 사구체-특이적 프로모터는 네프린이다. 일부 실시형태에서, 신장은 흉선신장이다.
7. 도면의 간단한 설명
도 1A 내지 도 1C는 인간 대식세포(도 1A) 또는 개코원숭이 대식세포(도 1B)에 의한 돼지 내피 세포("EC"), 및 개코원숭이 대식세포에 의한 족세포(도 1C)의 식세포작용을 나타낸다.
도 2A 내지 도 2D: 인간(도 2A), 개코원숭이(도 2B), 붉은털원숭이(도 2C) 및 사이노몰구스(도 2D) 대식세포를 사용한 GalT-KO EC의 식세포작용을 나타낸다.
도 3A 및 도 3B: 신장 이식 후 혈청 Cre 수준(도 3A) 및 신장 이식편의 조직학(도 3B)을 나타낸다.
도 4는 인간 CD47의 족세포-특이적 발현을 위한 벡터 작제물을 나타낸다. 돼지 네프린 유전자의 게놈 절편(빨간색으로 도시됨)은 엑손 2의 네프린 리더 서열 끝을 통해 프로모터 영역과 추가적인 게놈 서열을 포함한다. 인간 CD47 유전자(녹색으로 도시됨)는 엑손 2 내지 7(첫 번째 녹색 영역)의 성숙한 단백질-코딩 부분과 인트론 7에서 시작하여 엑손 11까지 계속되는 게놈 영역으로 구성된 하이브리드 단백질 코딩 서열/게놈 단편으로서 도입된다. 이 하이브리드 구조는 CD47의 4개의 대체 스플라이싱된 아이소형 모두를 생산할 수 있게 한다. PKG-GFP 카세트(주황색으로 도시됨)는 벡터를 전사 허용 부위에 포함한 형질감염된 섬유아세포의 양성 선택을 위해 포함된다.
8. 상세한 설명
인간 CD47을 발현하는 공여자 미니 돼지로부터 인간 수용자에게로의 신장 이식 방법이 본 명세서에서 제공된다. 구체적으로, 이러한 공여자 미니 돼지는 신장의 세뇨관에서보다 사구체에서 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 섹션 8.1에 기재된 바와 같이 유전자이식 공여자 미니 돼지를 생성할 수 있다. 섹션 8.1에 기재된 기법을 사용하여 공여자 미니 돼지에 유전자 변형을 도입할 수 있다. 이러한 공여자 미니 돼지는 섹션 8.1.4에 기재된 바와 같이 추가적인 유전자 변형(예컨대, 알파-1,3 갈락토실트랜스퍼라제-결핍)을 보유할 수 있다. 사구체 특이적 발현은 섹션 8.1.1에 기재된 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 인간 CD47의 발현 수준은 섹션 8.1.3에 기재된 방법을 사용하여 입증될 수 있다. 이식 절차는 섹션 8.2에 기재된 바와 같이 미니 돼지로부터 수용자에게로 골수 이식, 복합 섬-신장 이식, 또는 흉선 조직 이식과 같은 추가적인 단계를 포함할 수 있다. 섹션 8.2에 기재된 바와 같이 면역억제 및 추가적인 컨디셔닝이 이식의 일부가 될 수 있다. 이와 같이, 본 개시내용은 본 명세서에 제공된 구성요소의 임의의 조합 또는 치환과 함께 유전자이식 미니 돼지, 이의 제조 방법, 이의 사용 방법을 제공한다. 이론에 구속되고자 하지 않지만, 본 명세서에 제공된 이식 방법은 이식 수용자에서 신장 단백뇨의 위험 및/또는 중증도를 낮춘다.
8.1. 유전자이식 미니 돼지의 생성
인간 CD47이 신장의 신세뇨관에서보다 더 높은 수준으로 신장의 사구체에서 발현되는 유전자 변형된 돼지가 본 명세서에서 제공된다. 이러한 유전자 변형된 돼지의 신장은 인간 수용자에게 이식하는 데 사용될 수 있다. 임의의 특정 이론에 구속되고자 하지 않지만, 이식에서 인간 CD47의 이러한 발현 패턴은 이식 후 신장 수용자에서 단백뇨를 예방하거나 감소시킨다. 단백뇨를 평가하는 방법은 하기 섹션 8.2.4에 제공되어 있다.
인간 CD47의 사구체 특이적 발현은 섹션 8.1.1에 기재된 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 인간 CD47의 발현 수준은 섹션 8.1.3에 기재된 방법을 사용하여 입증될 수 있다. 섹션 8.1에 기재된 기법을 사용하여 공여자 미니 돼지에 유전자 변형을 도입할 수 있다. 이러한 공여자 미니 돼지는 섹션 8.1.4에 기재된 바와 같이 추가적인 유전자 변형(예컨대, 알파-1,3 갈락토실트랜스퍼라제-결핍)을 보유할 수 있다.
8.1.1. 조직-특이적 인간 CD47 발현
유전자이식 돼지에서 인간 CD47 이식유전자의 조직-특이적 발현(예를 들어, 사구체에서 인간 CD47의 발현)은 세포 유형-특이적 방식으로 유전자 발현을 제어하는 방식에 의해 달성될 수 있다. 일반적으로, 동물은 발현 카세트, 게놈 통합 및 선택을 위한 요소를 포함하는 작제물을 사용하여 유전적으로 변형될 수 있다. 발현 카세트는 이식 유전자, 예를 들어 인간 CD47을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 프로모터를 포함한다. 이들 각각의 요소는 하기에 상세히 기재되어 있다. 게놈 통합을 수반하지 않는 방법과 같은 조직-특이적 발현을 달성하기 위한 다른 방법이 또한 본 명세서에 제공된 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 인간 CD47은 내피 조직에서 검출 가능하다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47은 돼지의 내피 조직에서 검출 가능하지만 임의의 다른 조직에서는 검출 가능하지 않다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47은 돼지의 내피 조직에서 검출 가능하지만 돼지 신장의 세뇨관에서는 검출 가능하지 않다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47은 돼지 신장의 사구체에서 검출 가능하지만 하기 섹션 8.1.3에 기재된 기법을 사용하여 세뇨관에서는 검출 가능하지 않다. 예를 들어, 인간 CD47은 하나, 둘 또는 그 이상의 사구체 세포 유형에서 검출 가능할 수 있다. 사구체 세포 유형의 예는 족세포, 사구체 내피 세포 및 사구체간질 세포를 포함한다.
특정 실시형태에서, 인간 CD47은 돼지 신장의 사구체에서만 검출 가능하지만 돼지의 임의의 다른 조직에서는 검출 가능하지 않다. 다른 실시형태에서, 인간 CD47은 돼지 신장의 사구체 및 돼지 신체의 나머지 부분에서 검출 가능하지만, 세뇨관에서는 검출 가능하지 않다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47은 돼지의 골수 및 돼지 신장의 사구체에서 검출 가능하다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47은 돼지의 골수 및 돼지 신장의 사구체에서 검출 가능하지만, 돼지의 임의의 다른 조직에서는 검출 가능하지 않다.
일부 실시형태에서, 유전자이식 돼지 신장의 사구체는 하기 섹션 8.1.3에 기재된 기법을 사용하여 검출될 때 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 신장의 사구체는 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 2배 내지 500배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 신장의 사구체는 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 2배 내지 50배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 신장의 사구체는 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 51배 내지 100배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 신장의 사구체는 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 101배 내지 150배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 신장의 사구체는 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 151배 내지 200배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 신장의 사구체는 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 201배 내지 250배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 신장의 사구체는 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 251배 내지 300배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 신장의 사구체는 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 301배 내지 350배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 신장의 사구체는 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 351배 내지 400배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 신장의 사구체는 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 401배 내지 450배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 신장의 사구체는 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 451배 내지 500배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다.
일부 실시형태에서, 신장의 사구체는 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 적어도 2배, 5배, 10배, 25배, 50배, 75배, 또는 적어도 100배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 신장의 사구체는 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 적어도 2배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 신장의 사구체는 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 적어도 5배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 신장의 사구체는 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 적어도 10배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 신장의 사구체는 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 적어도 25배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 신장의 사구체는 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 적어도 50배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 신장의 사구체는 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 적어도 75배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 신장의 사구체는 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 적어도 100배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다.
특정 실시형태에서, 신장의 사구체는 유전자이식 돼지의 임의의 다른 조직에서의 인간 CD47 발현 수준보다 2배 내지 500배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 신장의 사구체는 유전자이식 돼지의 임의의 다른 조직에서의 인간 CD47 발현 수준보다 2배 내지 50배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 신장의 사구체는 유전자이식 돼지의 임의의 다른 조직에서의 인간 CD47 발현 수준보다 51배 내지 100배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 신장의 사구체는 유전자이식 돼지의 임의의 다른 조직에서의 인간 CD47 발현 수준보다 101배 내지 150배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 신장의 사구체는 유전자이식 돼지의 임의의 다른 조직에서의 인간 CD47 발현 수준보다 151배 내지 200배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 신장의 사구체는 유전자이식 돼지의 임의의 다른 조직에서의 인간 CD47 발현 수준보다 201배 내지 250배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 신장의 사구체는 유전자이식 돼지의 임의의 다른 조직에서의 인간 CD47 발현 수준보다 251배 내지 300배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 신장의 사구체는 유전자이식 돼지의 임의의 다른 조직에서의 인간 CD47 발현 수준보다 301배 내지 350배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 신장의 사구체는 유전자이식 돼지의 임의의 다른 조직에서의 인간 CD47 발현 수준보다 351배 내지 400배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 신장의 사구체는 유전자이식 돼지의 임의의 다른 조직에서의 인간 CD47 발현 수준보다 401배 내지 450배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 신장의 사구체는 유전자이식 돼지의 임의의 다른 조직에서의 인간 CD47 발현 수준보다 451배 내지 500배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다.
일부 실시형태에서, 신장의 사구체는 유전자이식 돼지의 임의의 다른 조직에서의 인간 CD47 발현 수준보다 적어도 2배, 5배, 10배, 25배, 50배, 75배, 100배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 신장의 사구체는 유전자이식 돼지의 임의의 다른 조직에서의 인간 CD47 발현 수준의 적어도 2배 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 신장의 사구체는 유전자이식 돼지의 임의의 다른 조직에서의 인간 CD47 발현 수준의 적어도 5배 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 신장의 사구체는 유전자이식 돼지의 임의의 다른 조직에서의 인간 CD47 발현 수준의 적어도 10배 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 신장의 사구체는 유전자이식 돼지의 임의의 다른 조직에서의 인간 CD47 발현 수준의 적어도 25배 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 신장의 사구체는 유전자이식 돼지의 임의의 다른 조직에서의 인간 CD47 발현 수준의 적어도 50배 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 신장의 사구체는 유전자이식 돼지의 임의의 다른 조직에서의 인간 CD47 발현 수준의 적어도 75배 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 신장의 사구체는 유전자이식 돼지의 임의의 다른 조직에서의 인간 CD47 발현 수준의 적어도 100배 수준으로 인간 CD47을 발현한다.
특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%는 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 10%는 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 20%는 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 30%는 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 40%는 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 50%는 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 55%는 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 60%는 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 65%는 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 70%는 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 75%는 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 80%는 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 85%는 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 90%는 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 95%는 인간 CD47을 발현한다.
특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%는 신장의 세뇨관보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 10%는 신장의 세뇨관보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 20%는 신장의 세뇨관보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 30%는 신장의 세뇨관보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 40%는 신장의 세뇨관보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 50%는 신장의 세뇨관보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 55%는 신장의 세뇨관보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 60%는 신장의 세뇨관보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 65%는 신장의 세뇨관보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 70%는 신장의 세뇨관보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 75%는 신장의 세뇨관보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 80%는 신장의 세뇨관보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 85%는 신장의 세뇨관보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 90%는 신장의 세뇨관보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 95%는 신장의 세뇨관보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다.
특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%는 돼지의 임의의 다른 조직보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 10%는 돼지의 임의의 다른 조직보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 20%는 돼지의 임의의 다른 조직보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 30%는 돼지의 임의의 다른 조직보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 40%는 돼지의 임의의 다른 조직보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 50%는 돼지의 임의의 다른 조직보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 55%는 돼지의 임의의 다른 조직보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 60%는 돼지의 임의의 다른 조직보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 65%는 돼지의 임의의 다른 조직보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 70%는 돼지의 임의의 다른 조직보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 75%는 돼지의 임의의 다른 조직보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 80%는 돼지의 임의의 다른 조직보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 85%는 돼지의 임의의 다른 조직보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 90%는 돼지의 임의의 다른 조직보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 95%는 돼지의 임의의 다른 조직보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다.
특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%는 인간 CD47을 선택적으로 발현한다. 사구체에서의 CD47 수준은 당업계에 알려지거나 본 명세서에 기재된 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 10%는 인간 CD47을 선택적으로 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 20%는 인간 CD47을 선택적으로 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 30%는 인간 CD47을 선택적으로 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 40%는 인간 CD47을 선택적으로 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 50%는 인간 CD47을 선택적으로 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 55%는 인간 CD47을 선택적으로 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 60%는 인간 CD47을 선택적으로 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 65%는 인간 CD47을 선택적으로 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 70%는 인간 CD47을 선택적으로 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 75%는 인간 CD47을 선택적으로 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 80%는 인간 CD47을 선택적으로 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 85%는 인간 CD47을 선택적으로 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 90%는 인간 CD47을 선택적으로 발현한다. 특정 실시형태에서, 사구체의 적어도 95%는 인간 CD47을 선택적으로 발현한다.
특정 실시형태에서, 유전자이식 돼지의 신장의 사구체 및 골수는 둘 다 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 인간 돼지의 신장의 사구체 및 골수는, 인간 CD47의 발현이 검출 가능한, 예를 들어 하기 섹션 8.1.3에 기재된 방법에 의해 검출 가능한 유일한 2개의 조직이다.
당업자에게 알려진 임의의 방법이 인간 CD47의 수준(예를 들어, 인간 CD47 유전자 또는 단백질 발현 수준)을 검출하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 하기 섹션 8.1.3에 기재된 기법을 사용하여 검출될 때 사구체에서의 인간 CD47 발현 수준은 사구체에서의 하나 이상의 하우스키핑 유전자의 발현 수준을 사용하여 정규화된다. 다른 실시형태에서, 사구체에서의 인간 CD47 발현 수준은 사구체에서의 하나 이상의 하우스키핑 유전자의 역사적 발현 수준을 사용하여 정규화된다. 특정 실시형태에서, 하기 섹션 8.1.3에 기재된 기법을 사용하여 검출될 때 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준은 세뇨관에서의 하나 이상의 하우스키핑 유전자의 발현 수준을 사용하여 정규화된다. 다른 실시형태에서, 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준은 세뇨관에서의 하나 이상의 하우스키핑 유전자의 역사적 발현 수준을 사용하여 정규화된다. 하우스키핑 유전자는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 β-액틴, 글리세르알데하이드 3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH) 또는 히스톤을 포함한다.
일부 실시형태에서, 신장에 존재하는 모든 사구체는 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 신장의 사구체의 75% 초과는 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 신장의 사구체의 50% 초과는 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 일부 실시형태에서, 신장의 사구체의 25% 초과는 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다.
8.1.2. 유전자이식 공여자 동물의 생성을 위한 작제물
유전자이식 동물(예를 들어, 미니 돼지)을 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Hryhorowicz et al. (2020), Genes 2020, 11, 670.]을 참조한다. 이러한 방법의 예는 본 명세서에서 하기에 기재되어 있다. 특정 실시형태에서, 동종 번식된 미니 돼지 무리로부터의 미니 돼지가 사용된다. 유전자이식 동물은 당업계에 알려진 임의의 적합한 방법에 의해 생산될 수 있다. 따라서, 유전자 발현 작제물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 작제물)은, 예를 들어 체세포 핵 전달(SCNT), 전핵 미세주입, 정자-매개 유전자 전달(SMGT) 또는 바이러스-매개 형질전환(transgenesis)을 사용하여 동물의 생식세포계열로 도입될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Yum et al. (2016) J Vet Sci 2016, 17:261-268; Whyte and Prather (2011), Mol Reprod Dev 78:879-891; Sachs and Gali (2009)]을 참조한다.
SCNT는 공여자 세포의 핵을 염색체가 제거된 난모세포 또는 초기 배아로 전달하는 것을 수반한다. 예를 들어, 문헌[Wilmut and Taylor (2015), Phil.Trans. R. Soc. B 370:20140366]을 참조한다. 전핵 미세주입은 DNA를 전핵에 직접 주입하는 것을 수반한다. 이러한 목적을 위한 난자는 과배란시킨 암컷으로부터 채취한 다음, 수정란 이식에 의해 수용자 돼지에게 이식될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Whyte and Prather (2011), Mol Reprod Dev 78:879-891]을 참조한다. SMGT는 이후에 수정에 사용되는 정자와 함께 관심이 있는 이식유전자에 대한 유전자를 인큐베이션하는 것을 수반한다. 예를 들어, 문헌[Lavitrano et al., (2002), Proc Nat Acad Sci USA. 99:14230-14235]을 참조한다. 바이러스-매개 형질전환은 이식유전자를 운반하는 바이러스 벡터를 이용한 배아 또는 난모세포의 감염에 의존한다. 예시적인 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV), 자가-상보적 아데노-연관 바이러스(scAAV), 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스(예를 들어, 유인원 면역결핍 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 또는 변형된 인간 면역결핍 바이러스), 뉴캐슬병 바이러스(NDV), 헤르페스 바이러스(예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스), 알파바이러스, 백시나 바이러스 등)를 포함한다.
이식유전자의 발현을 위한 작제물은 일반적으로 게놈 통합 및 선택을 위한 요소뿐만 아니라 발현 카세트를 포함한다. 발현 카세트는 이식유전자, 예를 들어 인간 CD47을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 프로모터를 포함한다. 바이러스 벡터는 폴리(A) 부위, 전사 종결 부위, 또는 반전 말단 반복부와 같은 바이러스-특이적 요소와 같은 다른 요소를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Buard et al. (2009), British Journal of Pharmacology 157:153-165]을 참조한다.
8.1.2.1 게놈 통합을 위한 요소
공여자 미니 돼지의 게놈으로의 인간 CD47 이식유전자의 서열-특이적 삽입(또는 녹인)은 인간 CD47의 이식유전자를 포함하는 작제물을 이용하여 표적화된 염색체 유전자좌의 상동 재조합(HR)과 커플링된 서열-특이적 엔도뉴클레아제에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Meyer et al. (2010), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:15022-15026; Cui et al. (2010), Nat. Biotechnol. 29:64- 67; Moehle et al. (2007), Proc Natl Acad Sci USA 104:3055-3060]을 참조한다. 이 과정은 이러한 서열을 인식하고 결합하고 미니 돼지 세포의 핵산 분자에서 이중-가닥 절단을 유도하는 엔도뉴클레아제를 이용하여 특정 유전자 서열을 표적화하는 것에 의존한다. 그 다음 이중-가닥 파손은 상동 재조합에 의해 복구된다. 상동 재조합을 위한 주형(예를 들어, 인간 CD47을 포함하는 작제물)이 트랜스로 제공되는 경우, 제공된 주형을 사용하여 이중-가닥 파손이 복구될 수 있다. 엔도뉴클레아제의 비-제한적인 예는 징크 핑거 뉴클레아제(zinc finger nuclease; ZFN), ZFN 다이머, ZFN닉카제, 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(transcription activator-like effector nuclease; TALEN) 또는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제(예를 들어, CRISPR/Cas9)를 포함한다.
서열-특이적 엔도뉴클레아제의 다른 예는 RNA-가이드 DNA 뉴클레아제, 예를 들어 CRISPR/Cas 시스템을 포함한다. Cas9/CRISPR(Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats; 일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문 구조의 반복서열) 시스템은 표적 DNA의 RNA-가이드 DNA-결합 및 서열-특이적 절단을 활용한다. 가이드 RNA(gRNA)(예를 들어, 20개 뉴클레오타이드를 포함함)는 게놈 PAM(프로토스페이서 인접 모티프) 부위(NNG) 및 불변 RNA 스캐폴드 영역의 상류에 있는 표적 게놈 DNA 서열에 상보적이다. Cas(CRISPR-연관) 단백질은 gRNA 및 gRNA가 결합하는 표적 DNA에 결합하고 PAM 부위의 상류에 있는 한정된 위치에서 이중-가닥 절단을 도입한다. 예를 들어, 문헌[Geurts et al. (2009), Science 325:433; Mashimo et al. (2010), PLoS ONE 5, e8870; Carbery et al. (2010), Genetics 186:451-459; Tesson et al. (2011), Nat. Biotech. 29:695-696; Wiedenheft et al. (2012), Nature 482,331-338; Jinek et al. (2012), Science 337:816-821; Mali et al. (2013), Science 339:823-826; Cong et al. (2013), Science 339:819-823]을 참조한다.
일 실시형태에서, 서열-특이적 재조합 시스템은 표적 유전자(예를 들어, 돼지 CD47)의 조건부 녹아웃을 달성하는 데 사용될 수 있다. 재조합효소는 개재 폴리뉴클레오타이드에 측접하고 상호 가닥 교환을 촉매하여, 개재 폴리뉴클레오타이드의 반전 또는 절단을 초래하는 특이적 폴리뉴클레오타이드 서열(재조합효소 인식 부위)을 인식하는 효소이다. 예를 들어, 문헌[Araki et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:160-164]을 참조한다.
다른 양태에서, 이식유전자는, 예를 들어 비-상동 말단 연결을 사용하여 서열 비-특이적 방식으로 통합될 수 있다.
다른 실시형태에서, (예를 들어, 재조합효소, 또는 인간 CD47 이식유전자를 인코딩하는) 이식유전자의 조건부 발현은 외인성 자극에 의해 유도되거나 불활성화될 수 있는 조절 서열을 사용함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 조건부 녹-아웃 대립유전자의 서열-특이적 재조합 시스템은, 예를 들어 화학물질(약물)에 의해 유도 가능한 재조합효소의 활성을 가짐으로써 조절될 수 있다. 화학물질은 Cre 재조합효소 유전자의 전사를 활성화시킬 수 있거나, Cre 재조합효소 단백질의 핵으로의 수송을 활성화시킬 수 있다. 대안적으로, 재조합효소는 약물의 존재보다는 투여된 약물의 부재에 의해 활성화될 수 있다. 유도성 시스템을 조절하는(따라서, 예를 들어 조건부 녹아웃을 유도하는) 화학물질의 비-제한적인 예는 테트라사이클린, 타목시펜, RU-486, 독시사이클린 등을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Nagy A (2000), Genesis, 26: 99-109]을 참조한다. 예를 들어, 미국 특허 출원 제15/558,789호에 기재된 조건부 녹아웃 및 녹인 작제물을 참조한다.
다른 실시형태에서, 내인성 돼지 CD47은 내인성 유전자좌에서 인간 CD47로 대체된다(즉, 유전자 녹인). 당업계에 알려진 다양한 기법이 인간 CD47 녹-인 모델을 생성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 비-제한적인 예는 CRISPR/Cas9 및 체세포 핵 이식의 조합을 사용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Ruan J, et al.. Sci Rep. 2015 Sep 18;5:14253]을 참조한다.
8.1.2.2 발현 카세트
발현 카세트는 일반적으로 조절 요소 및 이식유전자를 포함한다. 조절 요소는, 예를 들어 프로모터일 수 있다. 따라서, 예를 들어 사구체에서 인간 CD47 이식유전자의 발현을 달성하기 위해, 이식유전자는 사구체-특이적 프로모터의 제어 하에 놓인다(섹션 8.1.2.4 참조).
8.1.2.3 이식유전자
인간 CD47의 아미노산 서열은 다음 NCBI 참조 서열(RefSeq) 수탁 번호로 확인될 수 있다: NP_001768; NP_001369235.1; NP_942088; 및 XP_005247966.1. 인간 CD47을 인코딩하는 핵산 서열은 다음 NCBI RefSeq 수탁 번호로 확인될 수 있다: NM_001777; NM_198793; XM_005247909.2 및 NM_001382306.1. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 이식유전자는 인간 CD47의 알려진 스플라이스 변이체를 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 이식유전자는 단일 유전자이식 작제물로부터 다중 스플라이스 형태의 생성을 제공하는 cDNA 및 게놈 DNA 형태의 혼성체이다(도 4).
다른 종의 CD47 서열도 또한 알려져 있다. 예를 들어, 다음 NCBI RefSeq 번호 하의 아미노산 서열을 참조하며: XP 516636(침팬지); 및 XP 535729(개); CD47의 세포외 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩타이드가 본 명세서에서 고려된다. 예를 들어, 인간 CD47-Fc 융합 단백질의 작제를 기재하는 문헌[Motegi et al. (2003), EMBO J., 22: 2634-2644]을 참조한다. 본 명세서에서 제공되는 일부 실시형태에서, 인간 CD47의 대체 스플라이싱된 형태가 사용된다. 예를 들어, 문헌[Reinhold et al. (1999), Journal of Cell Science, 108:3419-3425]을 참조한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 작제물에 사용되는 인간 CD47을 인코딩하는 이식유전자는 하기 표 1에 열거된 이식유전자이다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47을 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 인간 CD47을 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 인간 CD47을 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 3과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47을 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 3과 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47을 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 3과 적어도 75% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47을 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 3과 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47을 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 3과 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47을 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 3과 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47을 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 3과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47을 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 3과 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
다른 실시형태에서, 인간 CD47을 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 4와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47을 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 4와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47을 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 4와 적어도 75% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47을 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 4와 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47을 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 4와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47을 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 4와 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47을 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 4와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47을 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 4와 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 이식유전자는 서열번호 1의 폴리펩타이드를 인코딩한다. 특정 실시형태에서, 이식유전자는 서열번호 1과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 폴리펩타이드를 인코딩한다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47을 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 1과 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47을 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 1과 적어도 75% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47을 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 1과 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47을 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 1과 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47을 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 1과 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47을 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 1과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47을 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 1과 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
다른 실시형태에서, 이식유전자는 서열번호 2의 폴리펩타이드를 인코딩한다. 특정 실시형태에서, 이식유전자는 서열번호 2와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 동일한 폴리펩타이드를 인코딩한다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47을 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 2와 적어도 70% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47을 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 2와 적어도 75% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47을 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 2와 적어도 80% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47을 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 2와 적어도 85% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47을 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 2와 적어도 90% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47을 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 2와 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47을 인코딩하는 이식유전자는 서열번호 2와 적어도 98% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간 CD47 이식유전자는 유전자이식 공여자 동물에서 돼지 CD47 유전자의 천연 유전자좌 이외의 유전자좌에 삽입된다.
8.1.2.4 조절 요소
특정 실시형태에서, 인간 CD47 이식유전자는 사구체-특이적 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 실시형태에서, 사구체-특이적 프로모터는 하나 이상의 사구체 세포 유형에 특이적이다. 사구체 세포 유형의 예는 족세포, 사구체간질 세포 및 사구체 내피 세포를 포함한다. 특정 실시형태에서, 사구체-특이적 프로모터는 족세포-특이적 프로모터이다. 특정 실시형태에서, 사구체-특이적 프로모터는 네프린 프로모터이다. 특정 실시형태에서, 사구체-특이적 프로모터는 포도신 프로모터이다. 특정 실시형태에서, 사구체-특이적 프로모터는 FGF1 프로모터이다. 특정 실시형태에서, 사구체-특이적 프로모터는 사구체간질 세포-특이적 프로모터이다. 특정 실시형태에서, 사구체-특이적 프로모터는 내피 세포-특이적 프로모터이다. 특정 실시형태에서, 사구체-특이적 프로모터는 CD31 프로모터이다. 특정 실시형태에서, 사구체-특이적 프로모터는 vWF 프로모터이다.
프로모터는 하나 초과의 세포 유형에서 유전자 발현을 제어할 수 있다. 특정 실시형태에서, 프로모터는 사구체 세포에서 유전자 발현을 제어한다. 특정 실시형태에서, 프로모터는 사구체 세포 유형 족세포에서 유전자 발현을 제어한다.
특정 실시형태에서, 사구에체서 발현되는 임의의 유전자의 프로모터가 분석될 수 있고 사구체에서 발현을 부여하는 조절 요소는 본 명세서에서 제공되는 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 프로모터 분석은 관심이 있는 유전자 단편의 조절 제어 하에 리포터 유전자(예컨대, 형광 단백질)를 재조합적으로 배치함으로써 수행될 수 있다. 그 다음 생성된 작제물은 사구체에서 리포터 유전자의 발현에 대해 테스트될 수 있다.
특정 실시형태에서, 프로모터는 유도성일 수 있다. 구체적으로 프로모터는 유도성이고 조직-특이적일 수 있다. 수많은 유도성 프로모터 및 유전자 발현 시스템이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 프로모터는 화학물질에 의해, 예를 들어 테트라사이클린, 타목시펜, 또는 쿠메이트에 의해 유도될 수 있다. 유전자 발현은 또한 단백질-단백질 상호작용(예를 들어, 라파마이신에 의해 제어되는 FKBP12와 mTOR 사이의 상호작용)에 의해 제어될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Kallunki et al. (2019), Cells 8:796]을 참조한다.
8.1.3. 인간 CD47 수준을 측정하는 방법
특정 실시형태에서, 인간 CD47 발현의 수준은 하기 섹션 8.1.3.1에서 논의된 바와 같이 RNA(예를 들어, mRNA 수준)에서 결정될 수 있다. 특정 실시형태에서, 인간 CD47 발현의 수준은 섹션 8.1.3.2에서 논의된 바와 같이 단백질 수준에서 셜정될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 방법은 공여자 미니 돼지의 신장 사구체 조직 대 신장 세뇨관 조직에서의 차등적인 유전자 발현을 검출하고 측정하는 방법을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 방법은 공여자 미니 돼지의 신장 사구체 조직 대 신장 세뇨관 조직에서의 인간 CD47의 차등적인 mRNA 수준을 검출하고 측정하는 방법을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 방법은 공여체 미니 돼지의 신장 사구체 조직 대 신장 세뇨관 조직에서의 인간 CD47의 차등적인 단백질 수준을 검출하고 측정하는 방법을 포함한다.
조직-특이적 발현은 인간 CD47 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하기 전에 관심이 있는 조직을 물리적으로 분리함으로써(예를 들어, 사구체-특이적 세포의, 예를 들어 신장 생검에 의해 또는 유세포 분석-기반 분리에 의해) 그리고 하기 것과 같은 인간 CD47 단백질 또는 mRNA 수준을 시험관내에서 측정하는 방법을 적용함으로써 결정될 수 있다. 대안적으로, 형광 현미경과 같은 이미징 기법을 사용하여 특정 조직(예를 들어, 사구체 또는 세뇨관)에서 인간 CD47 단백질 발현을 시각화하고 측정할 수 있다. 단일 세포 qPCR을 사용하여 특정 조직에서 인간 CD47 유전자 발현을 측정할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 방법은 (i) 공여자 미니 돼지의 신장 생검을 수행하는 단계; (ii) 공여자 미니 돼지의 신장으로부터 사구체를 분리하는 단계; 및/또는 (iii) 공여자 미니 돼지의 신장으로부터 세뇨관을 분리하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 방법은 (i) 공여자 미니 돼지의 신장 생검을 수행하는 단계; 및 (ii) 공여자 미니 돼지의 신장을 네프론 개별 또는 그룹 수준으로 해부하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 조합하여 수행된다.
8.1.3.1 샘플에서 mRNA 수준을 검출하는 방법
특정 실시형태에서, 인간 CD47의 mRNA는 본 명세서에 기재된 기법에 의해 돼지 신장의 사구체에서 검출되지만 세뇨관에서는 검출되지 않는다. 일부 실시형태에서, 신장의 사구체는 본 명세서에 기재된 기법을 사용하여 검출될 때 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 mRNA 수준보다 더 높은 수준의 인간 CD47 mRNA를 갖는다.
mRNA 수준을 검출 및 정량화하는 여러 방법이 당업계에 알려져 있다. 예시적인 방법은 노던 블롯, 리보뉴클레아제 보호 분석, PCR-기반 방법(예를 들어, 정량적 PCR), RNA 서열결정, Fluidigm® 분석 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 인간 CD47의 mRNA 서열은 mRNA 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 프로브를 제조하는 데 사용될 수 있다. 그 다음 프로브는 임의의 적합한 분석법, 예컨대, PCR-기반 방법, 노던 블롯팅, 딥스틱 분석법(dipstick assay), TaqManTM 분석법 등을 사용하여 샘플에서 mRNA를 검출하는 데 사용될 수 있다.
다른 실시형태에서, 생물학적 샘플에서 인간 CD47 발현을 테스트하기 위한 핵산 분석법이 준비될 수 있다. 분석법은 전형적으로 고체 지지체 및 지지체와 접촉하는 적어도 하나의 핵산을 포함하며, 여기서 핵산은 mRNA의 적어도 일부분에 해당한다. 분석법은 또한 샘플에서 mRNA의 변경된 발현을 검출하기 위한 수단을 가질 수 있다. 분석 방법은 원하는 mRNA 정보 유형에 따라 달라질 수 있다. 예시적인 방법은 노던 블롯 및 PCR-기반 방법(예를 들어, qRT-PCR)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. qRT-PCR과 같은 방법은 또한 샘플에서 mRNA의 양을 정확하게 정량화할 수 있다.
전형적인 mRNA 분석 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다: (1) 표면-결합 대상 프로브를 얻는 단계; (2) 특이적 결합을 제공하기에 충분한 조건 하에서 표면-결합 프로브에 mRNA의 집단을 혼성화시키기는 단계; (3) 혼성화 후 세척하여 표면-결합 프로브에 특이적으로 결합하지 않은 핵산을 제거하는 단계; 및 (4) 혼성화된 mRNA를 검출하는 단계. 이러한 단계 각각에서 사용되는 시약 및 이들의 사용 조건은 특정 적용에 따라 다를 수 있다.
PCR-기반 방법과 같은 다른 방법이 또한 인간 CD47의 발현을 검출하는 데 사용될 수 있다. PCR 방법의 예는 미국 특허 제6,927,024호에서 확인될 수 있으며, 이는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다. RT-PCR 방법의 예는 미국 특허 제7,122,799호에서 확인될 수 있으며, 이는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다. 형광 제자리(in situ) PCR 방법은 미국 특허 제7,186,507호에 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
일부 실시형태에서, 정량적 역전사-PCR(qRT-PCR)은 RNA 표적의 검출 및 정량화 둘 다에 사용될 수 있다(Bustin et al., Clin. Sci. 2005, 109:365-379). 일부 실시형태에서, qRT-PCR-기반 분석법은 세포-기반 분석법 동안 mRNA 수준을 측정하는 데 유용할 수 있다. qRT-PCR-기반 방법의 예는, 예를 들어 미국 특허 제7,101,663호에서 확인될 수 있으며, 이는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
일반적인 역전사효소-PCR 및 아가로스 겔에 의한 분석과 달리, qRT-PCR은 정량적 결과를 제공한다. qRT-PCR의 추가적인 이점은 사용이 상대적으로 쉽고 편리하다는 것이다. qRT-PCR에 대한 기기, 예컨대, Applied Biosystems 7500은 상업적으로 입수 가능하며, 따라서 TaqMan® Sequence Detection Chemistry와 같은 시약도 입수 가능하다. 예를 들어, TaqMan® Gene Expression Assays이 제조업체의 지침에 따라 사용될 수 있다. 이들 키트는 인간, 마우스, 및 래트 mRNA 전사물의 신속하고 신뢰성있는 검출 및 정량화를 위한 사전-제형화된 유전자 발현 분석법이다. 예시적인 qRT-PCR 프로그램은, 예를 들어 50℃에서 2분, 95℃에서 10분, 95℃에서 15초, 그 다음 60℃에서 1분의 40 사이클이다.
8.1.3.2 샘플에서 폴리펩타이드 또는 단백질 수준을 검출하는 방법
본 명세서에서 제공되는 특정 실시형태에서, 인간 CD47 폴리펩타이드 또는 단백질은 본 명세서에 기재된 기법에 의해 돼지 신장의 사구체에서 검출되지만 세뇨관에서는 검출되지 않는다. 일부 실시형태에서, 신장의 사구체는 본 명세서에 기재된 기법을 사용하여 검출될 때 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 폴리펩타이드 또는 단백질 수준보다 더 높은 수준의 인간 CD47 폴리펩타이드 또는 단백질을 갖는다.
여러 단백질 검출 및 정량화 방법을 사용하여 인간 CD47의 수준을 측정할 수 있다. 임의의 적합한 단백질 정량화 방법이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체-기반 방법이 사용된다. 사용될 수 있는 예시적인 방법은 면역블롯팅(웨스턴 블롯), ELISA, 면역조직화학법, 면역형광법, 유세포 분석법, 세포계수 비드 어레이, 질량 분광법 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 직접 ELISA, 간접 ELISA, 및 샌드위치 ELISA를 포함하여 여러 유형의 ELISA가 일반적으로 사용된다.
8.1.4. 기타 유전자 변형
본 명세서에서 제공되는 재조합 미니 돼지(예를 들어, 본 명세서에 기재된 이식 방법에서 사용되는 제1 미니 돼지 및/또는 제2 미니 돼지)는 인간 CD47의 발현에 대해 추가적인 방식으로 변형될 수 있다. 이러한 추가적인 변형은, 예를 들어 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제의 녹아웃 및 사이토카인 수용체의 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 미니 돼지는 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제를 발현하지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 미니 돼지는 인간 CD55, 인간 CD46, 인간 CD59, IL-3R, 또는 이들의 일부 조합을 추가적으로 발현한다. 예를 들어, 문헌[Nomura et al. (2020), Xenotransplantation. 2020;27:e12549], 미국 특허 제9,883,939호 및 미국 특허 제9,980,471 B2호를 참조한다.
섹션 8.2의 이식 방법을 참조하면, 이러한 추가적인 유전자 변형은 신장 이식을 위한 공여자인 미니 돼지와 관련하여 사용될 수 있으며, 이러한 추가적인 변형은 또한 조혈 줄기 세포를 위한(예를 들어, 골수 이식을 위한) 공여자인 미니 돼지와 관련하여 사용될 수 있다.
8.2 이식 방법
유전자이식 공여자 미니 돼지의 세포, 조직, 장기 또는 체액은 이식 방법(예를 들어, 이종이식)에 사용될 수 있다.
수용자는 1마리 또는 2마리의 동물 유래의 제1 및 제2 이식편을 이식받을 수 있다. 일부 실시형태에서, 공여자 동물로부터 수확된 제2 이식편은 공여자 동물 유래의 제1 이식편의 이식 후 적어도 7일 후에 이식된다. 일부 실시형태에서, 공여자 동물로부터 수확된 제2 이식편은 공여자 동물 유래의 제1 이식편의 이식 후 적어도 14일 후에 이식된다. 일부 실시형태에서, 공여자 동물로부터 수확된 제2 이식편은 공여자 동물 유래의 제1 이식편의 이식 후 적어도 21일 후에 이식된다. 일부 실시형태에서, 공여자 동물로부터 수확된 제2 이식편은 공여자 동물 유래의 제1 이식편의 이식 후 적어도 28일 후에 이식된다. 일부 실시형태에서, 공여자 동물로부터 수확된 제2 이식편은 공여자 동물 유래의 제1 이식편의 이식 후 적어도 35일 후에 이식된다. 일부 실시형태에서, 공여자 동물로부터 수확된 제2 이식편은 공여자 동물 유래의 제1 이식편의 이식 후 적어도 49일 후에 이식된다. 일부 실시형태에서, 공여자 동물로부터 수확된 제2 이식편은 공여자 동물 유래의 제1 이식편의 이식 후 적어도 54일 후에 이식된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 이식 방법은 공여자 동물 유래의 섹션 8.1에 기재된 유전자 변형이 있는 신장 이식을 포함한다. 특정 양태에서, 본 명세서에서 제공되는 이식 방법은, 예를 들어 혼합 키메라 현상을 유도함으로써, 수용자에서 내성을 유도하는 단계를 포함한다. "혼합 키메라 현상"은 일반적으로 동종이계 조혈 줄기 세포의 수용자의 림프구 조혈 세포(lymphohematopoietic) 시스템이 숙주 및 공여자 세포의 혼합물을 포함하는 상태를 설명하는 것으로 이해된다. 이러한 상태는 보통 골수 또는 동원된 말초 혈액 줄기 세포 이식을 통해 달성된다. 혼합 키메라 현상은 일시적이거나 안정적일 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sachs et al. (2014), Cold Spring Harb Perspect Med 2014;4:a015529]; 미국 특허 제6,296,846호 및 미국 특허 제6,306,651호를 참조한다. 혼합 키메라 현상은 또한 공여자 동물 유래의 흉선 조직을 동시에 이식함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2020/061272를 참조한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 제2 공여자 동물 유래의 신장을 인간 수용자에게 이식하는 방법을 포함하며, 여기서 상기 방법은 (a) 제1 공여자 동물 유래의 조혈 줄기 세포를 수용자에게 이식하는 단계; 및 (b) 제2 공여자 동물 유래의 신장을 수용자에게 이식하는 단계를 포함하며, 여기서 제1 공여자 동물은 조혈 줄기 세포에서 인간 CD47을 발현하고 제2 공여자 동물은 신장의 사구체에서 인간 CD47을 선택적으로 발현한다. 특정 실시형태에서, 제1 공여자 동물은 미니 돼지이다. 특정 실시형태에서, 제2 공여자 동물은 미니 돼지이다. 특정 실시형태에서, 제1 및 제2 공여자 동물은 미니 돼지이다. 다른 특정 실시형태에서, 제2 공여자 동물은 미니 돼지이고 제1 공여자 동물은 미니 돼지가 아니다. 일부 실시형태에서, 이식 방법은 선택적으로 제3 공여자 동물 유래의 흉선 조직의 이식을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 제2 공여자 동물 유래의 신장을 인간 수용자에게 이식하는 방법을 포함하며, 여기서 상기 방법은 (a) 제1 공여자 동물 유래의 조혈 줄기 세포 및 흉선 조직을 수용자에게 이식하는 단계; 및 (b) 제2 공여자 동물 유래의 신장을 수용자에게 이식하는 단계를 포함하며, 여기서 제1 공여자 동물은 조혈 줄기 세포에서 인간 CD47을 발현하고 제2 공여자 동물은 신장의 사구체에서 인간 CD47을 선택적으로 발현한다. 특정 실시형태에서, 제1 공여자 동물은 미니 돼지이다. 특정 실시형태에서, 제2 공여자 동물은 미니 돼지이다. 특정 실시형태에서, 제1 및 제2 공여자 동물은 미니 돼지이다. 다른 특정 실시형태에서, 제2 공여자 동물은 미니 돼지이고 제1 공여자 동물은 미니 돼지가 아니다. 일부 실시형태에서, 제1 공여자 동물 유래의 흉선 조직은 인간 CD47을 발현한다. 흉선 조직의 예는 혈관화된 흉선 조직 및 흉선신장을 포함한다(섹션 8.2.1.2 참조). 일 실시형태에서, 본 개시내용은 미니 돼지 유래의 신장을 인간 수용자에게 이식하는 방법을 포함하며, 여기서 상기 방법은 (a) 제1 미니 돼지 유래의 조혈 줄기 세포를 수용자에게 이식하는 단계; 및 (b) 제2 미니 돼지 유래의 신장을 수용자에게 이식하는 단계를 포함하며, 여기서 제1 돼지는 조혈 줄기 세포에서 인간 CD47을 발현하고 제2 돼지는 신장의 사구체에서 인간 CD47을 선택적으로 발현한다. 제1 돼지는 또한 조혈 줄기 세포 이외의 조직에서 인간 CD47을 발현할 수 있다.
상기 방법의 특정 실시형태에서, 제2 미니 돼지 유래의 신장을 이식하는 상기 제2 단계는 제1 미니 돼지 유래의 조혈 줄기 세포를 이식하는 제1 단계 후 적어도 28일 후에 수행된다. 본 개시내용은 공여자 세포에서 인간 CD47의 유전자이식 발현에 대한 문헌[Watanabe et al., Xenotransplantation, 2020, 27:e12552 및 Nomura et al., Xenotransplantation, 2020, 27:e12549]에 기재된 방법 및 기법을 포함한다.
조혈 줄기 세포는 임의의 유형의 세포일 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포는 조혈 줄기 세포, 림프구, 또는 골수 세포이다. 일부 실시형태에서, 조혈 세포의 혼합 집단은 제1 공여자 동물(예를 들어, 미니 돼지)로부터 수용자에게 이식된다. 특정 실시형태에서, 돼지 조혈 줄기 세포는 골수, 말초 혈액, 제대혈, 태아 간 또는 배아 줄기 세포로부터 얻어진다. 조혈 줄기 세포는 당업계에 알려진 임의의 적합한 방법에 의해, 예를 들어 하기 섹션 8.2.1.3에 기재된 방법에 의해 이식될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조혈 줄기 세포는, 예를 들어 문헌[Watanabe et al. (2019), Xenotransplantation. 2019;00:e12552]에 기재된 바와 같이 골 내-골수 이식에 의해 수용자에게 이식된다.
일부 실시형태에서, 조혈 줄기 세포 및 공여자 신장은 동일한 공여자로부터 채취된다. 조혈 줄기 세포 및 신장이 동일한 공여자로부터 채취되는 일부 실시형태에서, 공여자 조혈 줄기 세포 및 공여자 신장의 사구체는 인간 CD47을 발현한다. 조혈 줄기 세포 및 신장이 동일한 공여자로부터 채취되는 일부 실시형태에서, 공여자 조혈 줄기 세포 및 공여자 신장의 사구체는 신장 세뇨관보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다. 조혈 줄기 세포 및 신장이 동일한 공여자로부터 채취되는 일부 실시형태에서, 공여자 조혈 줄기 세포 및 공여자 신장의 사구체는 공여자 동물의 임의의 다른 조직보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현한다.
일부 실시형태에서, 조혈 줄기 세포 및 공여자 신장은 2마리의 상이하지만, 유전적으로 일치하는 공여자 동물로부터 채취된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "유전적으로 일치하는"은 유전자, 예를 들어 MHC 유전자 사이의 상동성을 지칭할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전적으로 일치하는 공여자 동물은 MHC에 대해 완벽하게 일치한다. 일부 실시형태에서, 조혈 줄기 세포 및 공여자 신장은 고도로 동종 번식된 동일한 무리로부터 유래된 2마리의 상이한 동물로부터 채취된다.
8.2.1. 추가적인 처리
추가적인 처리가 본 명세서에 기재된 이식 방법 전, 이와 동시에, 또는 이후에 사용될 수 있다. 추가적인 처리는 일반적으로 수용자에서 이종이식편의 내성을 개선시키기 위한 것으로 의도되지만, 다른 처리도 고려된다. 따라서 본 명세서에서 제공되는 이식 방법은 하나 이상의 추가적인 처리, 예를 들어 T 세포를 저해하거나, 보체를 차단하거나, 그렇지 않으면 이식편에 대한 수용자 면역 반응을 하향 조절하는 처리를 실시하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 수용자는 흉선절제 및/또는 비장절제를 받는다.
일부 실시형태에서, 수용자는 방사선, 예를 들어 전신 방사선 조사를 받는다. 특정 실시형태에서, 수용자는 5 내지 10Gy 또는 10 내지 15Gy의 조사를 받는다. 일부 실시형태에서, 흉선 방사선 조사가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 수용자는 저선량 방사선(예를 들어, 치사량 이하 선량의 100rad 내지 400rad 전신 방사선)을 투여받는다. 국부 흉선 방사선도 또한 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법에 의해 이식을 받은 대상체의 혈액은 이종이식편을 표적으로 하는 항체를 포함할 수 있다. 이러한 항체는 장기 관류, 및/또는 내성-유도 골수의 이식에 의해 제거될 수 있다. 천연 항체는 공여자 종의 간의 혈액관류에 의해 수용자 혈액으로부터 흡수될 수 있다. 유사하게, 항체-생산 세포가 수용자에 존재할 수 있다. 이러한 항체 생산 세포는, 예를 들어 방사선 조사 또는 약물 처리에 의해 제거될 수 있다. 특정 실시형태에서, 섹션 8.1.4에 따라 이식에 사용되는 이식편, 세포, 조직, 또는 장기는 숙주에 존재하는 항체에 의해 인식되지 않도록 유전자 변형될 수 있다(예를 들어, 세포는 a-1,3-갈락토실트랜스퍼라제 결핍임).
일부 실시형태에서, 공여자 간질 조직이 투여된다. 태아 간, 흉선, 및/또는 태아 비장에서 얻을 수 있으며, 수용자, 예를 들어 신장 캡슐에 이식될 수 있다.
8.2.1.1 면역억제 요법
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 이종이식편을 받는 환자는 면역억제 요법을 받는다. 면역억제 요법은 이식 거부를 감소시키고/시키거나 이종이식의 결과를 개선하기 위해 지시된 임의의 FDA-승인 치료일 수 있다. 면역억제 요법의 비-제한적인 예는 칼시뉴린 저해제(예를 들어, 타크로리무스 또는 사이클로스포린), 항증식제(예를 들어, 항-대사물질, 예컨대, 마이코페놀레이트, 6-머캅토퓨린 또는 이의 전구약물 아자싸이오프린), 라파마이신의 포유동물 표적(mTOR)의 저해제(예를 들어, 시롤리무스, 라파마이신), 스테로이드(예를 들어, 프레드니손), 세포 주기 저해제(아자싸이오프린 또는 마이코페놀레이트 모페틸), 림프구-고갈제(예를 들어, 항-흉선세포 글로불린 또는 항체, 예컨대, 알렘투주맙, 시플리주맙 또는 바실릭시맙) 및 공동 자극 차단제(예를 들어, 벨라타셉트)를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Chung et al (2020)., Ann Transl Med. Mar; 8(6): 409; van der Mark et al. (2020), Eur Respir Rev; 29: 190132 및 Benvenuto et al. (2018), J Thorac Dis 10:3141-3155]을 참조한다. 일부 실시형태에서, 면역억제 요법은 칼시뉴린 저해제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역억제 요법은 항증식제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역억제 요법은 mTOR의 저해제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역억제 요법은 스테로이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역억제 요법은 림프구-고갈제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역억제 요법은 공동 자극 차단제를 포함한다.
면역억제 요법은 유지 용량 또는 급성 거부에 대한 유도 요법(수술기주위, 또는 수술 직후)으로서 투여될 수 있다. 유도 요법은 일반적으로 바실릭시맙, 항-흉선세포 글로불린 또는 알렘투주맙을 포함한다. 면역억제 요법은 또한 종종 수용자의 평생 동안 지속될 필요가 있는 유지 요법으로 실시될 수 있다. 유지 면역억제 요법은 일반적으로 칼시뉴린 저해제(타크로리무스 또는 사이클로스포린), 항증식제(마이코페놀레이트 또는 아자싸이오프린), 및 코르티코스테로이드를 포함한다. 급성 거부반응에 대한 면역억제 요법은 일반적으로 티모글로불린 또는 마이코페놀레이트를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Chung et al. (2020), Ann Transl Med. Mar; 8: 409 및 Benvenuto et al., (2018) J Thorac Dis 10:3141-3155]을 참조한다.
면역억제제의 비-제한적인 예는 (1) 항대사물질, 예컨대, 퓨린 합성 저해제(예컨대, 이노신 모노포스페이트 탈수소효소(IMPDH) 저해제, 예를 들어 아자싸이오프린, 마이코페놀레이트, 및 마이코페놀레이트 모페틸), 피리미딘 합성 저해제(예를 들어, 레플루노마이드 및 테리플루노마이드), 및 엽산길항제(예를 들어, 메토트렉세이트); (2) 칼시뉴린 저해제, 예컨대, 타크로리무스, 사이클로스포린 A, 피메크롤리무스, 및 보클로스포린; (3) TNF-알파 저해제, 예컨대, 탈리도마이드 및 레날리도마이드; (4) IL-1 수용체 길항제, 예컨대, 아나킨라; (5) 라파마이신(mTOR)의 포유동물 표적 저해제, 예컨대, 라파마이신(시롤리무스), 데포로리무스, 에베로리무스, 템시롤리무스, 조타로리무스, 및 바이올리무스 A9; (6) 코르티코스테로이드, 예컨대, 프레드니손; 및 (7) 다수의 세포 또는 혈청 표적 중 임의의 하나에 대한 항체(항-림프구 글로불린 및 항-흉선세포 글로불린을 포함함)를 포함한다.
비-제한적인 예시적 세포 표적 및 이들 각각의 저해제 화합물은 보체 구성요소 5(예를 들어, 에쿨리주맙); 종양 괴사 인자(TNF)(예를 들어, 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골, 아펠리모맙 및 골리무맙); IL-5(예를 들어, 메폴리주맙); IgE(예를 들어, 오말리주맙); BAYX(예를 들어, 네렐리모맙); 인터페론(예를 들어, 파랄리모맙); IL-6(예를 들어, 엘실리모맙); IL-12 및 IL-13(예를 들어, 레브리키주맙 및 우스테키누맙); CD3(예를 들어, 무로모납-CD3, 오텔릭시주맙, 테플리주맙, 비실리주맙); CD4(예를 들어, 클레놀릭시맙, 켈릭시맙 및 자놀리무맙); CDI la(예를 들어, 에팔리주맙); CD18(예를 들어, 에를리주맙); CD20(예를 들어, 아푸투주맙, 오크렐리주맙, 파스콜리주맙); CD23(예를 들어, 루밀릭시맙); CD40(예를 들어, 테넬릭시맙, 토랄리주맙); CD62L/L-셀렉틴(예를 들어, 아셀리주맙); CD80(예를 들어, 갈릭시맙); CD147/바시긴(예를 들어, 가빌리모맙); CD154(예를 들어, 루플리주맙); BLyS(예를 들어, 벨리무맙); CTLA-4(예를 들어, 이필리무맙, 트레멜리무맙); CAT(예를 들어, 베르틸리무맙, 레르델리무맙, 메텔리무맙); 인테그린(예를 들어, 나탈리주맙); IL-6 수용체(예를 들어, 토실리주맙); LFA-1(예를 들어, 오둘리모맙); 및 IL-2 수용체/CD25(예를 들어, 바실릭시맙, 다클리주맙, 이놀리모맙)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
8.2.1.2 혈관화된 흉선 이식
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료되는 환자는 혈관화된 흉선 이식을 받는다. 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 PCT WO2020061272A1을 참조한다. 흉선 조직은 혈관재형성을 위해 자가 신장 캡슐 아래에 이식함으로써 이식을 위해 준비될 수 있다. 혈관화된 흉선 이식은, 예를 들어 "흉선신장", 즉 공여자 자신의 신장 캡슐 아래에 공여자 유래의 흉선 조직을 이식함으로써 준비된 신장일 수 있다. 예를 들어, 문헌[Yamada et. al., Transplantation 68(11):1684-1692 (1999), Yamada et al., J Immunol 164:3079-3086 (2000) 및 Yamada et al., Transplantation 76(3):530-536 (2003)]을 참조한다. 혈관화된 흉선 이식은 또한 신장과 별도로 이식된 혈관화 흉엽일 수 있다. 예를 들어, 문헌[LaMattina et al., Transplantation 73(5):826-831 (200) 및 Kamano et al., Proc Natl Acad Sci U S A 101(11):3827-3832 (2004)]을 참조한다.
8.2.1.3 조혈 줄기 세포 이식
줄기 세포 생착 및 이종 종 장벽을 가로지르는 조혈작용은 공여자 종으로부터 조혈 간질 환경을 제공함으로써 향상될 수 있다. 간질 기질은 조혈 줄기 세포와 이의 간질 환경, 예컨대, 조혈 성장 인자, 접착 분자, 및 이들의 리간드 사이의 상호작용에 필요한 종-특이적 인자를 공급한다.
간은 태아에서 주요한 조혈작용 부위이므로, 태아 간은 또한 조혈 줄기 세포의 공급원으로서 골수에 대한 대안의 역할을 할 수 있다. 흉선은 T 세포 성숙의 주요 부위이다. 각각의 장기는 숙주에 이식된 각각의 미분화 줄기 세포의 분화를 지원할 수 있는 장기 특이적 간질 기질을 포함한다. 흉선 간질 조직은 이식 전에 방사선조사될 수 있다. 이식에 대한 대안 또는 부속물로서, 태아 간 세포는 유체 현탁액으로 투여될 수 있다.
공여자의 골수 세포(BMC), 또는 조혈 줄기 세포의 다른 공급원, 예를 들어 태아 간 현탁액은 혼합 키메라 현상을 유도하기 위하여 수용자에게 주사될 수 있다. 조혈 줄기 세포는 임의의 공급원으로부터, 예를 들어 골수 또는 말초 혈액 줄기 세포로부터 채취될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sachs et al. (2014), Cold Spring Harb Perspect Med 2014;4:a015529]을 참조한다. 공여자 BMC는 수용자의 적절한 부위로 유도되고 나머지 숙주 세포와 함께 연속적으로 성장하고 증식하여, 키메라 림프구 조혈 세포 집단을 형성한다. 이 과정에 의해, 새로 형성된 B 세포(및 이들이 생산한 항체)는 공여자 항원에 노출되어, 이식된 장기는 자신의 것으로 인식될 것이다. 공여자에 대한 내성은 또한 조혈 줄기 세포, 예를 들어 골수 세포 생착이 달성된 동물의 T 세포 수준에서도 관찰된다. 흉선 조직(예를 들어, 혈관화된 흉선 또는 흉선신장)의 이식은 이종이식편에 반응하지 않는 T 세포 레퍼토리를 생성함으로써 T 세포 내성을 유도할 수 있다. 이종발생 공여자의 사용은 동일한 동물, 또는 유전적으로 일치하는 동물 유래의 골수 세포 및 장기를 사용할 수 있게 한다. 골수 이식의 경우, 수용자는 저선량 방사선을 투여받을 수 있다. 일부 경우에, 수용자는 보체를 고갈시키는 작용제, 예컨대, 코브라독 인자로 처리될 수 있다(예를 들어, 제-1일에).
8.2.1.4 복합 섬-신장 이식편
본 명세서에서 제공되는 바와 같이, 인간 CD47이 신장의 신세뇨관보다 더 높은 수준으로 신장의 사구체에서 발현되는 유전자 변형된 돼지 유래의 신장은 인간 환자로의 이종이식을 위한 이종이식편으로서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종이식편은 섹션 8.1에 기재된 신장과 같은 신장과, 랑게르한스섬 세포의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 섬 세포는 본 개시내용의 신장과 조합되어 복합 섬-신장 이식편을 생성할 수 있다.
복합 섬-신장 이식편의 생성은 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 예로서, 부분적인 췌장절제술을 수행하고 섬 세포를 분리할 수 있다. 그 후, 섬 세포를 신장과 조합하여 이후에 이종이식에 사용될 수 있는 복합 섬-신장 세포를 형성할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Pomposelli et al., Front Endocrinol (Lausanne). May 12, 12:632605 (2021)]을 참조한다.
따라서, 특정 실시형태에서, 이종이식편은 비-인간 종 유래의 이종이식편이며, 여기서 이종이식편은 (a) 신장; 및 (b) 랑게르한스섬 세포를 포함하고, 신장은 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현하는 사구체를 포함한다.
8.2.2. 치료 효과
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 이식 방법은 단백뇨의 위험 또는 강도를 감소시킨다(하기 섹션 8.2.4 참조). 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 이식 방법은 공여자 신장의 사구체가 공여자 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현하지 않는 이식 방법과 비교하여 공여자 신장의 거부 발생을 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 방법은 공여자 신장의 사구체가 공여자 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현하지 않는 공여자 신장의 수용자와 비교하여 수용자에 대한 면역억제 요법의 투여 감소(예를 들어, 약 10%, 10 내지 20%, 20 내지 30%, 30 내지 40%, 40 내지 50%, 50 내지 60%, 60 내지 70%, 70 내지 80%, 80 내지 90% 만큼 또는 90% 초과만큼의 투여 감소)를 초래한다. 특정 실시형태에서, 방법은 전형적으로 비슷한 수용자(예를 들어, 동일한 성별 및 비슷한 연령, 신장, 및/또는 체중의 사람)에게 투여되는 면역억제 요법의 양과 비교하여 수용자에 대한 면역억제 요법의 투여 감소(예를 들어, 약 10%, 10 내지 20%, 20 내지 30%, 30 내지 40%, 40 내지 50%, 50 내지 60%, 60 내지 70%, 70 내지 80%, 80 내지 90% 만큼 또는 90% 초과만큼의 투여 감소)를 초래하며, 여기서 비슷한 수용자는 공여자 신장의 사구체가 공여자 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현하지 않는 공여자 신장을 받았다. 다른 실시형태에서, 방법은 공여자 신장의 사구체가 공여자 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현하지 않는 이전 공여자 신장을 받은 후 수용자가 필요로 한 면역억제 요법의 양과 비교하여 수용자에 대한 면역억제 요법의 투여 감소(예를 들어, 약 10%, 10 내지 20%, 20 내지 30%, 30 내지 40%, 40 내지 50%, 50 내지 60%, 60 내지 70%, 70 내지 80%, 80 내지 90% 만큼 또는 90% 초과만큼의 투여 감소)를 초래한다. 일부 실시형태에서, 방법은 수용자가 면역억제 요법, 예를 들어 하기 섹션 8.2.1.1에 기재된 면역억제 요법의 추가 투여를 필요로 하지 않는 결과를 초래한다.
일부 실시형태에서, 방법은 면역억제 요법의 약 10% 감소를 초래한다. 일부 실시형태에서, 방법은 면역억제 요법의 약 10% 내지 약 20% 감소를 초래한다. 일부 실시형태에서, 방법은 면역억제 요법의 약 20% 내지 약 30% 감소를 초래한다. 일부 실시형태에서, 방법은 면역억제 요법의 약 30% 내지 약 40% 감소를 초래한다. 일부 실시형태에서, 방법은 면역억제 요법의 약 40% 내지 약 50% 감소를 초래한다. 일부 실시형태에서, 방법은 면역억제 요법의 약 50% 내지 약 60% 감소를 초래한다. 일부 실시형태에서, 방법은 면역억제 요법의 약 60% 내지 약 70% 감소를 초래한다. 일부 실시형태에서, 방법은 면역억제 요법의 약 70% 내지 약 80% 감소를 초래한다. 일부 실시형태에서, 방법은 면역억제 요법의 약 80% 내지 약 90% 감소를 초래한다. 일부 실시형태에서, 방법은 면역억제 요법의 약 90% 초과의 감소를 초래한다.
일부 실시형태에서, 방법은 공여자 신장의 사구체가 공여자 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현하지 않는 공여자 신장과 비교하여, 공여자 신장의 생존력 연장을 초래한다. 일부 실시형태에서, 방법은 공여자 신장의 사구체가 비슷한 수용자(예를 들어, 동일한 성별 및 비슷한 연령, 신장, 및/또는 체중의 환자)에게 이식된 공여자 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현하지 않는 공여자 신장과 비교하여 공여자 신장의 생존력 연장(예를 들어, 약 10%, 10 내지 20%, 20 내지 30%, 30 내지 40%, 40 내지 50%, 50 내지 75%, 75 내지 100%, 100 내지 200%, 200 내지 300% 또는 300% 초과만큼의 생존력 연장; 또는 1 내지 2년, 2 내지 3년, 3 내지 4년, 4 내지 5년, 5 내지 6년, 6 내지 8년, 8 내지 10년, 10 내지 15년 또는 15 내지 20년만큼의 연장)을 초래한다. 일부 실시형태에서, 방법은 공여자 신장의 사구체가 공여자 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현하지 않는, 수용자가 이전에 받은 공여자 신장의 생존력과 비교하여 공여자 신장의 생존력 연장(예를 들어, 약 10%, 10 내지 20%, 20 내지 30%, 30 내지 40%, 40 내지 50%, 50 내지 75%, 75 내지 100%, 100 내지 200%, 200 내지 300% 또는 300% 초과 만큼의 생존력 연장; 또는 1 내지 2년, 2 내지 3년, 3 내지 4년, 4 내지 5년, 5 내지 6년, 6 내지 8년, 8 내지 10년, 10 내지 15년 또는 15 내지 20년만큼의 연장)을 초래한다.
일부 실시형태에서, 공여자 신장의 생존력은 공여자 신장의 사구체가 공여자 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현하지 않는 공여자 신장과 비교하여, 약 10% 더 연장된다. 일부 실시형태에서, 생존력은 약 10 내지 20% 연장된다. 일부 실시형태에서, 생존력은 약 20 내지 30% 연장된다. 일부 실시형태에서, 생존력은 약 30 내지 40% 연장된다. 일부 실시형태에서, 생존력은 약 40 내지 50% 연장된다. 일부 실시형태에서, 생존력은 약 50 내지 75% 연장된다. 일부 실시형태에서, 생존력은 약 75 내지 100% 연장된다. 일부 실시형태에서, 생존력은 약 100 내지 200% 연장된다. 일부 실시형태에서, 생존력은 약 200 내지 300% 연장된다. 일부 실시형태에서, 생존력은 300% 초과로 연장된다.
일부 실시형태에서, 공여자 신장의 생존력은 공여자 신장의 사구체가 공여자 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현하지 않는 공여자 신장과 비교하여, 1 내지 2년만큼 연장된다. 일부 실시형태에서, 공여자 신장의 생존력은 2 내지 3년 연장된다. 일부 실시형태에서, 공여자 신장의 생존력은 3 내지 4년 연장된다. 일부 실시형태에서, 공여자 신장의 생존력은 4 내지 5년 연장된다. 일부 실시형태에서, 공여자 신장의 생존력은 5 내지 6년 연장된다. 일부 실시형태에서, 공여자 신장의 생존력은 6 내지 8년 연장된다. 일부 실시형태에서, 공여자 신장의 생존력은 8 내지 10년 연장된다. 일부 실시형태에서, 공여자 신장의 생존력은 10 내지 15년 연장된다. 일부 실시형태에서, 공여자 신장의 생존력은 15 내지 20년 연장된다.
일부 실시형태에서, 방법은 공여자 신장의 사구체가 공여자 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현하지 않는 공여자 신장의 수용자와 비교하여, 수용자에 대한 더 나은 삶의 질을 초래한다. 다른 실시형태에서, 방법은 비슷한 수용자(예를 들어, 동일한 성별 및 비슷한 연령, 신장, 및/또는 체중의 사람)와 비교하여, 수용자에 대한 더 나은 삶의 질을 초래하며, 여기서 비슷한 수용자는 공여자 신장의 사구체가 공여자 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현하지 않는 공여자 신장을 받았다. 다른 실시형태에서, 방법은 공여자 신장의 사구체가 공여자 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현하지 않는 공여자 신장으로의 이전 이식 후 경험한 수용자의 삶의 질과 비교하여 수용자에 대한 더 나은 삶의 질을 초래한다.
일부 실시형태에서, 방법은 공여자 신장의 사구체가 공여자 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현하지 않는 공여자 신장의 수용자와 비교하여, 이식 수용자의 더 긴(예를 들어, 10 내지 20%, 20 내지 30%, 40 내지 50%, 50 내지 60%, 60 내지 70%, 70 내지 80%, 80 내지 90%, 또는 90 내지 100% 더 긴; 또는 2 내지 3배, 3 내지 5배, 5 내지 7배, 7 내지 10배 또는 10 내지 15배 더 긴) 생존을 초래한다. 다른 실시형태에서, 방법은 비슷한 수용자(예를 들어, 동일한 성별 및 비슷한 연령, 신장, 및/또는 체중의 사람)의 생존과 비교하여, 이식 수용자의 더 긴(예를 들어, 10 내지 20%, 20 내지 30%, 40 내지 50%, 50 내지 60%, 60 내지 70%, 70 내지 80%, 80 내지 90%, 또는 90 내지 100% 더 긴; 또는 2 내지 3배, 3 내지 5배, 5 내지 7배, 7 내지 10배 또는 10 내지 15배 더 긴) 생존을 초래하며, 여기서 비슷한 수용자는 공여자 신장의 사구체가 공여자 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현하지 않는 공여자 신장을 받았다.
일부 실시형태에서, 방법은 공여자 신장의 사구체가 공여자 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현하지 않는 공여자 신장의 수용자와 비교하여, 이식 수용자의 10 내지 20% 더 긴 생존을 초래한다. 일부 실시형태에서, 방법은 이식 수용자의 20 내지 30% 더 긴 생존을 초래한다. 일부 실시형태에서, 방법은 이식 수용자의 30 내지 40% 더 긴 생존을 초래한다. 일부 실시형태에서, 방법은 이식 수용자의 50 내지 60% 더 긴 생존을 초래한다. 일부 실시형태에서, 방법은 이식 수용자의 60 내지 70% 더 긴 생존을 초래한다. 일부 실시형태에서, 방법은 이식 수용자의 70 내지 80% 더 긴 생존을 초래한다. 일부 실시형태에서, 방법은 이식 수용자의 80 내지 90% 더 긴 생존을 초래한다. 일부 실시형태에서, 방법은 이식 수용자의 90 내지 100% 더 긴 생존을 초래한다.
일부 실시형태에서, 방법은 공여자 신장의 사구체가 공여자 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현하지 않는 공여자 신장의 수용자와 비교하여, 이식 수용자의 2 내지 3배 더 긴 생존을 초래한다. 일부 실시형태에서, 방법은 이식 수용자의 3 내지 5배 더 긴 생존을 초래한다. 일부 실시형태에서, 방법은 이식 수용자의 5 내지 7배 더 긴 생존을 초래한다. 일부 실시형태에서, 방법은 이식 수용자의 7 내지 10배 더 긴 생존을 초래한다. 일부 실시형태에서, 방법은 이식 수용자의 10 내지 15배 더 긴 생존을 초래한다.
8.2.3. 환자 집단
바람직한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료된 환자(예를 들어, 하나 이상의 공여자 이식편의 수용자)는 인간 환자이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체" 및 "환자"는 호환 가능하게 사용되고 임의의 인간 또는 비-인간 포유동물을 포함한다. 비-제한적인 예는 인간, 말, 돼지, 소, 개트, 마우스, 개 및 고양이 종의 구성원을 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 비-인간 영장류이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시형태에서, 대상체는 인간 성인이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간 어린이이다. 특정 실시형태에서, 대상체는 인간이고 돼지 공여자로부터 하나 이상의 공여자 이식편을 받는다. 다른 특정 실시형태에서, 대상체는 비-인간 영장류(예를 들어, 개코원숭이, 사이노몰구스 원숭이 또는 붉은털원숭이)이고 돼지 공여자로부터 하나 이상의 이식편을 받는다.
일 양태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료된 환자는 신장 이식이 필요하다. 환자는 신부전 또는 공여자 신장의 거부로 인해 신장 이식이 필요할 수 있다. 신부전은 높은 혈압(고혈압), 신체적 손상, 당뇨병, 신장 질환(다낭성 신장 질환, 사구체 질환) 및 자가면역 장애, 예컨대, 루푸스를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 원인이 있을 수 있다. 신부전은 급성 또는 만성일 수 있다. 신부전은 또한 실험실 테스트, 예컨대, 사구체 여과율, 혈액 요소 질소, 및 혈청 크레아티닌에 의해, 영상화 테스트(초음파, 컴퓨터 단층촬영) 또는 신장 생검에 의해 진단될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료된 환자는 1기 신장 질환을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료된 환자는 2기 신장 질환을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료된 환자는 3기 신장 질환을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료된 환자는 4기 신장 질환을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료된 환자는 5기 신장 질환을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료된 환자는 사구체 여과율(GFR)이 약 90 이상이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료된 환자는 GFR이 약 60 내지 90이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료된 환자는 GFR이 약 30 내지 60이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료된 환자는 GFR이 약 15 내지 30이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료된 환자는 GFR이 약 15 이하이다.
8.2.4. 단백뇨를 예방하고 이의 중증도를 감소시키는 방법
단백뇨는 소변 중 단백질의 수준 증가를 특징으로 하며, 신장 기능 감소 및 잠재적으로 신부전의 증상일 수 있다. 단백뇨는 일반적으로 소변 중 알부민 및 면역글로불린의 손실을 초래하는 사구체 질환에 의해 유발된다. 단백뇨는 또한 세뇨관 질환 및 기타 신장 질환뿐만 아니라, 특정 약물에 의해서도 유발될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Carroll and Temte, Am Fam Physician 62(6):1333-1340 (2000) 및 BMJ Best Practice: Evaluation of Proteinuria [온라인] [2020년 8월 26일에 검색], 인터넷:<URL: https://bestpractice.bmj.com/topics/en-us/875>에서 검색]을 참조한다. 추가적으로, 단백뇨는 종종 신장 이식 후 발생한다. 이식 후 1년째에 하루 500㎎ 이하(예를 들어, 하루 200 내지 500㎎)의 단백뇨는 좋지 않은 결과(예를 들어, 이식 거부)와 상관관계가 있다. 예를 들어, 문헌[Diena et al.(2019), BMC Nephrology 20:443 및 Kang et al.(2009) J Korean Med Sci. 24 (Suppl 1): S129-34]을 참조한다.
하루 150㎎ 초과의 단백질 배출이 일반적으로 단백뇨에 대한 진단으로 사용된다. 딥스틱 분석은 종종 소변 중 단백질 농도를 측정하는 데 사용된다. 이는 반-정량적 방법이며, 그 결과는 음성, 미량, 1+, 2+, 3+ 또는 4+로 표현된다. 예를 들어, 문헌[Carroll and Temte, Am Fam Physician 62(6):1333-1340 (2000)]을 참조한다. 총 단백질 수준 또는 알부민 단독 수준을 측정하여 정량적 테스트를 제공할 수 있다. 결과는 총 단백질 또는 알부민 수준, 또는 알부민 대 크레아틴 비율 또는 단백질 대 크레아틴 비율로 표현될 수 있다. 3개월을 초과하여 지속되는 단백뇨는 만성 신장 질환의 진단 기준이다. 반대로, 단백뇨의 감소는 만성 신장 질환 관리에서 대용 마커로 사용된다. 예를 들어, 문헌[BMJ Best Practice: Evaluation of Proteinuria [온라인] [2020년 8월 26일에 검색], 인터넷:<URL: https://bestpractice.bmj.com/topics/en-us/875>에서 검색]을 참조한다.
일 양태에서, 본 명세서에 기재된 이식 방법(예컨대, 상기 섹션 8.2에 기재된 바와 같은, 제1 공여자 돼지 유래의 골수, 제2 공여자 돼지 유래의 신장을 이식하는 방법, 또는 1마리 공여자 돼지 유래의 골수 및 신장을 이식하는 방법)은 단백뇨의 위험, 중증도 또는 지속기간을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 공여자 신장의 사구체가 공여자 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현하는 본 명세서에 기재된 이식 방법(예를 들어, 상기 섹션 8.2에 기재된 방법)은 단백뇨의 중증도를 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 공여자 신장의 사구체가 공여자 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현하는 본 명세서에 기재된 이식 방법(예를 들어, 상기 섹션 8.2에 기재된 방법)은 단백뇨의 지속기간을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 공여자 신장의 사구체가 공여자 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현하는 본 명세서에 기재된 이식 방법(예를 들어, 상기 섹션 8.2에 기재된 방법)은 치료받은 집단에서 단백뇨의 위험을 감소시킨다. 예를 들어, 본 명세서의 방법에 따라 치료받은 환자의 단백뇨 중증도는 공여자 신장의 사구체가 공여자 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현하지 않는 공여자 신장을 받은 환자에서 관찰되는 단백뇨 중증도와 비교하여 감소될 수 있다.
일부 실시형태에서, 소변 중 단백질 수준에 의해 측정된 단백뇨의 중증도는 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 95% 초과만큼 감소된다. 일부 실시형태에서, 소변 중 단백질 수준에 의해 측정된 단백뇨의 중증도는 10%만큼 감소된다. 일부 실시형태에서, 소변 중 단백질 수준에 의해 측정된 단백뇨의 중증도는 20%만큼 감소된다. 일부 실시형태에서, 소변 중 단백질 수준에 의해 측정된 단백뇨의 중증도는 30%만큼 감소된다. 일부 실시형태에서, 소변 중 단백질 수준에 의해 측정된 단백뇨의 중증도는 40%만큼 감소된다. 일부 실시형태에서, 소변 중 단백질 수준에 의해 측정된 단백뇨의 중증도는 50%만큼 감소된다. 일부 실시형태에서, 소변 중 단백질 수준에 의해 측정된 단백뇨의 중증도는 60%만큼 감소된다. 일부 실시형태에서, 소변 중 단백질 수준에 의해 측정된 단백뇨의 중증도는 70%만큼 감소된다. 일부 실시형태에서, 소변 중 단백질 수준에 의해 측정된 단백뇨의 중증도는 80%만큼 감소된다. 일부 실시형태에서, 소변 중 단백질 수준에 의해 측정된 단백뇨의 중증도는 90%만큼 감소된다. 일부 실시형태에서, 소변 중 단백질 수준에 의해 측정된 단백뇨의 중증도는 95% 초과만큼 감소된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 방법에 따라 치료받은 환자는 하루에 150㎎ 초과의 단백질이 소변으로 배출되는 것으로 정의되는 단백뇨를 경험하지 않을 것이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 방법에 따라 치료받은 환자는 이식 후 1, 2, 3, 3 내지 7, 7 내지 10, 10 내지 14일, 또는 1 내지 2, 2 내지 3, 3 내지 4, 4 내지 5, 5 내지 6, 6 내지 7, 7 내지 8주, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6개월 후에 해소되는 일시적인 단백뇨를 경험할 수 있다.
일부 실시형태에서, 단백뇨가 발생한 본 명세서에 기재된 방법으로 치료받은 수용자의 소변 중 총 단백질의 농도는 하루에 약 60㎎ 미만, 하루에 약 80㎎ 미만, 하루에 약 100㎎ 미만, 하루에 약 120㎎ 미만, 하루에 약 140㎎ 미만, 하루에 약 160㎎ 미만, 하루에 약 200㎎ 미만, 하루에 약 220㎎ 미만, 하루에 약 240㎎ 미만, 하루에 약 260㎎ 미만, 하루에 약 280㎎ 미만, 하루에 약 300㎎ 미만, 하루에 약 320㎎ 미만, 하루에 약 340㎎ 미만, 하루에 약 360㎎ 미만, 하루에 약 380㎎ 미만 또는 하루에 약 400㎎ 미만이다. 일부 실시형태에서, 단백뇨가 발생한 본 명세서에 기재된 방법으로 치료받은 수용자의 소변 중 총 단백질의 농도는 하루에 약 60㎎ 미만이다. 일부 실시형태에서, 단백뇨가 발생한 본 명세서에 기재된 방법으로 치료받은 수용자의 소변 중 총 단백질의 농도는 하루에 약 80㎎ 미만이다. 일부 실시형태에서, 단백뇨가 발생한 본 명세서에 기재된 방법으로 치료받은 수용자의 소변 중 총 단백질의 농도는 하루에 약 100㎎ 미만이다. 일부 실시형태에서, 단백뇨가 발생한 본 명세서에 기재된 방법으로 치료받은 수용자의 소변 중 총 단백질의 농도는 하루에 약 120㎎ 미만이다. 일부 실시형태에서, 단백뇨가 발생한 본 명세서에 기재된 방법으로 치료받은 수용자의 소변 중 총 단백질의 농도는 하루에 약 140㎎ 미만이다. 일부 실시형태에서, 단백뇨가 발생한 본 명세서에 기재된 방법으로 치료받은 수용자의 소변 중 총 단백질의 농도는 하루에 약 160㎎ 미만이다. 일부 실시형태에서, 단백뇨가 발생한 본 명세서에 기재된 방법으로 치료받은 수용자의 소변 중 총 단백질의 농도는 하루에 약 200㎎ 미만이다. 일부 실시형태에서, 단백뇨가 발생한 본 명세서에 기재된 방법으로 치료받은 수용자의 소변 중 총 단백질의 농도는 하루에 약 220㎎ 미만이다. 일부 실시형태에서, 단백뇨가 발생한 본 명세서에 기재된 방법으로 치료받은 수용자의 소변 중 총 단백질의 농도는 하루에 약 240㎎ 미만이다. 일부 실시형태에서, 단백뇨가 발생한 본 명세서에 기재된 방법으로 치료받은 수용자의 소변 중 총 단백질의 농도는 하루에 약 260㎎ 미만이다. 일부 실시형태에서, 단백뇨가 발생한 본 명세서에 기재된 방법으로 치료받은 수용자의 소변 중 총 단백질의 농도는 하루에 약 280㎎ 미만이다. 일부 실시형태에서, 단백뇨가 발생한 본 명세서에 기재된 방법으로 치료받은 수용자의 소변 중 총 단백질의 농도는 하루에 약 300㎎ 미만이다. 일부 실시형태에서, 단백뇨가 발생한 본 명세서에 기재된 방법으로 치료받은 수용자의 소변 중 총 단백질의 농도는 하루에 약 320㎎ 미만이다. 일부 실시형태에서, 단백뇨가 발생한 본 명세서에 기재된 방법으로 치료받은 수용자의 소변 중 총 단백질의 농도는 하루에 약 340㎎ 미만이다. 일부 실시형태에서, 단백뇨가 발생한 본 명세서에 기재된 방법으로 치료받은 수용자의 소변 중 총 단백질의 농도는 하루에 약 360㎎ 미만이다. 일부 실시형태에서, 단백뇨가 발생한 본 명세서에 기재된 방법으로 치료받은 수용자의 소변 중 총 단백질의 농도는 하루에 약 380㎎ 미만이다. 일부 실시형태에서, 단백뇨가 발생한 본 명세서에 기재된 방법으로 치료받은 수용자의 소변 중 총 단백질의 농도는 하루에 약 400㎎ 미만이다.
일부 실시형태에서, 단백뇨가 발생한 본 명세서에 기재된 방법으로 치료받은 수용자의 소변 중 알부민의 농도는 하루에 약 5㎎ 미만, 하루에 약 10㎎ 미만, 하루에 약 20㎎ 미만, 하루에 약 30㎎ 미만, 하루에 약 40㎎ 미만, 하루에 약 50㎎ 미만, 하루에 약 60㎎ 미만, 하루에 약 70㎎ 미만, 하루에 약 80㎎ 미만, 하루에 약 90㎎ 미만 또는 하루에 약 100㎎ 미만이다. 일부 실시형태에서, 단백뇨가 발생한 본 명세서에 기재된 방법으로 치료받은 수용자의 소변 중 알부민의 농도는 하루에 약 5㎎ 미만이다. 일부 실시형태에서, 단백뇨가 발생한 본 명세서에 기재된 방법으로 치료받은 수용자의 소변 중 알부민의 농도는 하루에 약 10㎎ 미만이다. 일부 실시형태에서, 단백뇨가 발생한 본 명세서에 기재된 방법으로 치료받은 수용자의 소변 중 알부민의 농도는 하루에 약 20㎎ 미만이다. 일부 실시형태에서, 단백뇨가 발생한 본 명세서에 기재된 방법으로 치료받은 수용자의 소변 중 알부민의 농도는 하루에 약 30㎎ 미만이다. 일부 실시형태에서, 단백뇨가 발생한 본 명세서에 기재된 방법으로 치료받은 수용자의 소변 중 알부민의 농도는 하루에 약 40㎎ 미만이다. 일부 실시형태에서, 단백뇨가 발생한 본 명세서에 기재된 방법으로 치료받은 수용자의 소변 중 알부민의 농도는 하루에 약 50㎎ 미만이다. 일부 실시형태에서, 단백뇨가 발생한 본 명세서에 기재된 방법으로 치료받은 수용자의 소변 중 알부민의 농도는 하루에 약 60㎎ 미만이다. 일부 실시형태에서, 단백뇨가 발생한 본 명세서에 기재된 방법으로 치료받은 수용자의 소변 중 알부민의 농도는 하루에 약 70㎎ 미만이다. 일부 실시형태에서, 단백뇨가 발생한 본 명세서에 기재된 방법으로 치료받은 수용자의 소변 중 알부민의 농도는 하루에 약 80㎎ 미만이다. 일부 실시형태에서, 단백뇨가 발생한 본 명세서에 기재된 방법으로 치료받은 수용자의 소변 중 알부민의 농도는 하루에 약 90㎎ 미만이다. 일부 실시형태에서, 단백뇨가 발생한 본 명세서에 기재된 방법으로 치료받은 수용자의 소변 중 알부민의 농도는 하루에 약 100㎎ 미만이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료받은 환자의 24시간 소변 샘플에서 크레아티닌에 대한 단백질의 비율은 약 0.2 미만, 약 0.4 미만, 약 0.6 미만, 약 0.8 미만 또는 약 1 미만이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료받은 환자의 24시간 소변 샘플에서 크레아티닌에 대한 알부민의 비율은 약 0.02 미만, 약 0.04 미만, 약 0.06 미만, 약 0.08 미만 또는 약 0.1 미만이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료받은 환자의 24시간 소변 샘플에서 크레아티닌에 대한 단백질의 비율은 약 0.2 미만이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료받은 환자의 24시간 소변 샘플에서 크레아티닌에 대한 단백질의 비율은 약 0.4 미만이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료받은 환자의 24시간 소변 샘플에서 크레아티닌에 대한 단백질의 비율은 약 0.6 미만이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료받은 환자의 24시간 소변 샘플에서 크레아티닌에 대한 단백질의 비율은 약 0.8 미만이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료받은 환자의 24시간 소변 샘플에서 크레아티닌에 대한 단백질의 비율은 약 1.0 미만이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료받은 환자의 24시간 소변 샘플에서 크레아티닌에 대한 알부민의 비율은 약 0.02 미만이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료받은 환자의 24시간 소변 샘플에서 크레아티닌에 대한 알부민의 비율은 약 0.04 미만이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료받은 환자의 24시간 소변 샘플에서 크레아티닌에 대한 알부민의 비율은 약 0.06 미만이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료받은 환자의 24시간 소변 샘플에서 크레아티닌에 대한 알부민의 비율은 약 0.08 미만이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료받은 환자의 24시간 소변 샘플에서 크레아티닌에 대한 알부민의 비율은 약 0.1 미만이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법으로 치료받은 수용자의 단백뇨 발생 위험은 공여자 신장의 사구체가 공여자 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현하지 않는 공여자 신장의 수용자의 위험과 비교하여 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%만큼 감소된다. 일부 실시형태에서, 위험은 약 10%만큼 감소된다. 일부 실시형태에서, 위험은 약 20%만큼 감소된다. 일부 실시형태에서, 위험은 약 30%만큼 감소된다. 일부 실시형태에서, 위험은 약 40%만큼 감소된다. 일부 실시형태에서, 위험은 약 50%만큼 감소된다. 일부 실시형태에서, 위험은 약 60%만큼 감소된다. 일부 실시형태에서, 위험은 약 70%만큼 감소된다. 일부 실시형태에서, 위험은 약 80%만큼 감소된다. 일부 실시형태에서, 위험은 약 90%만큼 감소된다. 일부 실시형태에서, 위험은 약 95%만큼 감소된다.
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9. 실시예
이 섹션(즉, 섹션 9)의 실시예는 예시에 의해 제공되며, 제한에 의한 것이 아니다.
9.1 실시예 1: 사구체 세포에서의 인간 CD47 발현은 인간 CD47-SIRPα 경로를 통한 단백뇨의 회피와 상관관계가 있다
개코원숭이 대식세포가 인간 대식세포와 유사하게 돼지 내피 세포(EC)에 대해 식세포작용하는지 여부를 조사하였다. 본 발명자들은 인간 및 개코원숭이 대식세포가 둘 다 돼지 EC에 대해 유사하게 식세포작용을 한다는 것을 발견하였다. 놀랍게도, 이러한 반응은 돼지 EC 및 족세포가 인간 CD47/인간 CD55를 발현할 때 상당히 감소되지만 인간 CD47 없이 인간 CD46/인간 CD55를 발현할 때는 그렇지 않았다(도 1A 내지 도 1C). 인간 CD47/인간 CD55 Tg GalT-KO 공여자 유래의 이식편을 사용하여, 본 발명자들은 사구체 세포에서 인간-CD47의 발현이 높은 GalT-KO 돼지 신장이 심지어 CTLA4-Ig 처리 없이도 단백뇨 발생을 최소화한다는 것을 발견하였다.
본 발명자들은 인간, 개코원숭이, 붉은털원숭이, 및 사이노몰구스 대식세포를 사용하여 GalT-KO EC의 식세포작용을 추가로 조사하였다. 인간 및 개코원숭이 대식세포가 돼지 EC 및 족세포에 대해 유사하게 그리고 공격적으로 식세포작용하는 반면, 붉은털원숭이 및 사이노몰구스 마카크 대식세포는 개코원숭이 또는 인간 대식세포에 대해 관찰된 것보다 현저하게 적게 GalTKO EC에 대해 식세포작용하였다(도 2A 내지 도 2D).
상기 논의된 결과는 돼지와 개코원숭이 사이의 종 부적합성은 이종 KTx 후(post-xeno KTx) 단백뇨의 발생에 필수적인 역할을 하고 인간에서 관련이 있을 것임을 나타내며 단백뇨의 발생을 예방하기 위한 전략이 돼지에서 인간으로의 이종이식의 성공에 필수적임을 나타낸다.
9.2 실시예 2: 세뇨관 세포에서 높은 인간 CD47 발현은 TSP-1 상향조절과 연관된 부종을 초래한다:
CD47은 SIRPα에 결합하여 이의 활성화를 차단하는 것으로 알려져 있는 한편, CD47은 또한 혈관 세포에서 산화질소 신호전달을 저해하고 선천적 면역 반응의 활성화 및 세포 증식 또는 아폽토시스를 유도하는 TSP1(CD47-TSP-1 경로)에 결합한다. 본 발명자들의 혈관화된 흉엽 및 신장 이종이식("VT+K XTx") 모델에서, 인간 CD47의 사구체 세포-특이적 발현이 있는 GalT-KO 신장을 받은 개코원숭이는 거부 또는 단백뇨의 증거 없이 (이식편이 이용 가능한 공간보다 커질 때까지) 128일 동안 CTLA4-Ig 없이 신장 이종이식편을 유지하였다. 대조적으로, 신세뇨관 세포를 포함한 모든 세포에서 인간 CD47의 발현이 높은 VT+K 이식편을 받은 개코원숭이는 혈청 Cre 또는 단백뇨의 증가 없이 전신 피하 및 장기 부종으로 인해 안락사되었다. 이들 개코원숭이는 또한 수술(op) 후 첫 주에 높은 수준의 키메라 현상(15 내지 30% T 세포 키메라 현상)을 추가로 보였다. 후속적으로, 전신 부종이 발생하고, IL-6 수준이 혈청에서 증가하였다. POD 50 및 53에서 절제된 신장 이식편은 세뇨관 위축, 및 간질 세포 침윤을 나타내었으며, 이는 TSP-1이 신장 이식편에서 염증 반응을 매개함을 시사한다. 특히, 신장 이식편 혈관 중막층은 TSP-1의 상향조절을 나타내었다. 전신 부종은 또한 혈청에서 IL-6 수준의 상승을 동반하는 것으로 밝혀졌다.
이들 소견에 기반하여, 본 발명자들은 POD 42까지 1주에 한 번 항-IL6r 항체를 추가하였다. 항-IL-6R ab는 초기 염증 사건 또는 단백뇨 없이 염증 변화를 저해하고 개코원숭이의 생존을 연장시키는 것으로 보인다. 돼지 이식편의 기하급수적인 성장 또는 약물-관련 부작용이 수용자인 개코원숭이의 안락사를 촉발하였지만, 본 발명자들은 상기 시점에서 이식 거부, 시험관내 돼지-특이적 무반응, 및 새로운 개코원숭이 T 세포의 발달에 대한 어떠한 명백한 징후도 확인하지 못했다. 도 3은 POD 187에서 절제된 신장 이식편의 sCre 수준(도 3A) 및 조직학적 소견(도 3B)을 나타낸다.
9.3 실시예 3 - 미니 돼지에서 인간 CD47 유전자의 족세포-특이적 발현
이 실시예는 족세포-특이적 프로모터, 즉 네프린 프로모터의 제어 하에 인간 CD47을 발현하는 미니 돼지의 작제 방법을 제공한다.
돼지 네프린 프로모터로부터 발현된 인간 CD47로 이루어진 벡터(도 4)의 무작위 통합을 포함하는 섬유아세포가 선택될 것이다. 이러한 벡터의 프로모터 영역은 인접한 Kirrel2 프로모터의 상류 부분을 포함할 것이며 따라서 조직-특이적 발현으로부터 필요한 모든 요소를 포함할 것이다. 특이적 발현의 가능성을 증가시키기 위해, 네프린 유전자의 인트론 1 및 엑손 2의 짧은 단편도 또한 포함될 것이며, 이 때 인간 CD47의 성숙한 형태를 코딩하는 서열이 생성된 네프린 리더 펩타이드에 연결된다. 전사적으로 허용되는 게놈 위치에 벡터를 통합한 세포에 대한 선택은 유비쿼터스 PGK 프로모터로부터의 GFP 발현에 기초할 것이다.
인간 CD47 유전자의 적절한 발현에 대한 스크리닝은 임신 중기 클로닝된 태아에서 수행될 것이다. GFP의 광범위한 발현이 예상된다. 그러나, 인간 CD47 발현(세포 표면에서, 및/또는 RNA 분석에 의해 측정됨)은 원하는 클론에서 신장으로 제한될 것이다. 원하는 발현 프로파일을 가지는 태아로부터 분리된 섬유아세포는 2번째 라운드의 핵 이식에서 돼지를 생성하는 데 사용될 것이다.
이들 돼지 유래의 신장을 개코원숭이 이식에서 평가할 것이다. 이들 동물을 TSP1 활성화에 대해 테스트한다(RT-PCR에 의해 측정됨). 이들 동물을 또한 단백뇨에 대해 테스트한다.
9.4 실시예 4 - 단백뇨에 대한 사구체-특이적 발현의 효과
이종이식편 내성에 대한 인간 CD47의 사구체-특이적 발현의 효과를 나타내기 위해, 신장의 사구체에서 인간 CD47을 특이적으로 발현하는 미니 돼지를 생성한다. 이들 돼지 유래의 신장을, 또한 인간 CD47을 발현하는 상이한 미니 돼지 유래의 골수와 함께, 개코원숭이에게 이식한다. 비교로서, 인간 CD47을 편재적으로 발현하는 돼지 유래의 신장 및 골수, 또는 인간 CD47을 골수에서는 발현하지만 신장에서는 발현하지 않는 돼지 유래의 신장 및 골수를 개코원숭이에게 이식한다. 이식 후 소변 단백질 농도를 측정함으로써 단백뇨를 평가한다.
10. 등가물
본 발명은 이의 특정 실시형태를 참조하여 상세하게 설명되어 있지만, 기능적으로 등가인 변형이 본 발명의 범주 내에 있음이 이해될 것이다. 실제로, 본 명세서에 나타내고 기재된 것에 추가적으로 본 발명의 다양한 변형이 상기 설명 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범주에 속하는 것으로 의도된다. 당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본 명세서에 기재된 발명의 특정 실시형태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 본 명세서에서 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용되는 것으로 구체적이고 개별적으로 나타낸 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
SEQUENCE LISTING <110> The Trustees of Columbia University in the City of New York <120> GENETIC MODIFICATIONS FOR XENOTRANSPLANTATION <130> WO/2022/051594 <140> PCT/US2021/049019 <141> 2021-09-03 <150> US 63/108,986 <151> 2020-11-03 <150> US 63/075,285 <151> 2020-09-07 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 323 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> human leukocyte surface antigen CD47 isoform 1 precursor <300> <308> NP_001768.1 <309> 2020-08-30 <313> (1)..(323) <400> 1 Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly 1 5 10 15 Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe 20 25 30 Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala 35 40 45 Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp 50 55 60 Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp 65 70 75 80 Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala 85 90 95 Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr 100 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660 ggtattaaaa cacttaaata tagatccggt ggtatggatg agaaaacaat tgctttactt 720 gttgctggac tagtgatcac tgtcattgtc attgttggag ccattctttt cgtcccaggt 780 gaatattcat taaagaatgc tactggcctt ggtttaattg tgacttctac agggatatta 840 atattacttc actactatgt gtttagtaca gcgattggat taacctcctt cgtcattgcc 900 atattggtta ttcaggtgat agcctatatc ctcgctgtgg ttggactgag tctctgtatt 960 gcggcgtgta taccaatgca tggccctctt ctgatttcag gtttgagtat cttagctcta 1020 gcacaattac ttggactagt ttatatgaaa tttgtggctt ccaatcagaa gactatacaa 1080 cctcctagga ataactgaag tgaagtgatg gactccgatt tggagagtag taagacgtga 1140 aaggaataca cttgtgttta agcaccatgg ccttgatgat tcactgttgg ggagaagaaa 1200 caagaaaagt aactggttgt cacctatgag acccttacgt gattgttagt taagttttta 1260 ttcaaagcag ctgtaattta gttaataaaa taattatgat ctatgttgtt tgcccaattg 1320 agatccagtt ttttgttgtt atttttaatc aattaggggc aatagtagaa tggacaattt 1380 ccaagaatga tgcctttcag gtcctagggc ctctggcctc taggtaacca gtttaaattg 1440 gttcagggtg ataactactt agcactgccc tggtgattac ccagagatat ctatgaaaac 1500 cagtggcttc catcaaacct ttgccaactc aggttcacag cagctttggg cagttatggc 1560 agtatggcat tagctgagag gtgtctgcca cttctgggtc aatggaataa taaattaagt 1620 acaggcagga atttggttgg gagcatcttg tatgatctcc gtatgatgtg atattgatgg 1680 agatagtggt cctcattctt gggggttgcc attcccacat tcccccttca acaaacagtg 1740 taacaggtcc ttcccagatt tagggtactt ttattgatgg atatgttttc cttttattca 1800 cataacccct tgaaaccctg tcttgtcctc ctgttacttg cttctgctgt acaagatgta 1860 gcaccttttc tcctctttga acatggtcta gtgacacggt agcaccagtt gcaggaagga 1920 gccagacttg ttctcagagc actgtgttca cacttttcag caaaaatagc tatggttgta 1980 acatatgtat tcccttcctc tgatttgaag gcaaaaatct acagtgtttc ttcacttctt 2040 ttctgatctg gggcatgaaa aaagcaagat tgaaatttga actatgagtc tcctgcatgg 2100 caacaaaatg tgtgtcacca tcaggccaac aggccagccc ttgaatgggg atttattact 2160 gttgtatcta tgttgcatga taaacattca tcaccttcct cctgtagtcc tgcctcgtac 2220 tccccttccc ctatgattga aaagtaaaca aaacccacat ttcctatcct ggttagaaga 2280 aaattaatgt tctgacagtt gtgatcgcct ggagtacttt tagactttta gcattcgttt 2340 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tggatctcat ccatccattg tgttctcttt aatgctgcct gccttttgag gcattcactg 3240 ccctagacaa tgccaccaga gatagtgggg gaaatgccag atgaaaccaa ctcttgctct 3300 cactagttgt cagcttctct ggataagtga ccacagaagc aggagtcctc ctgcttgggc 3360 atcattgggc cagttccttc tctttaaatc agatttgtaa tggctcccaa attccatcac 3420 atcacattta aattgcagac agtgttttgc acatcatgta tctgttttgt cccataatat 3480 gctttttact ccctgatccc agtttctgct gttgactctt ccattcagtt ttatttattg 3540 tgtgttctca cagtgacacc atttgtcctt ttctgcaaca acctttccag ctacttttgc 3600 caaattctat ttgtcttctc cttcaaaaca ttctcctttg cagttcctct tcatctgtgt 3660 agctgctctt ttgtctctta acttaccatt cctatagtac tttatgcatc tctgcttagt 3720 tctattagtt ttttggcctt gctcttctcc ttgattttaa aattccttct atagctagag 3780 cttttctttc tttcattctc tcttcctgca gtgttttgca tacatcagaa gctaggtaca 3840 taagttaaat gattgagagt tggctgtatt tagatttatc actttttaat agggtgagct 3900 tgagagtttt ctttctttct gttttttttt tttgtttttt tttttttttt tttttttttt 3960 ttttttgact aatttcacat gctctaaaaa ccttcaaagg tgattatttt tctcctggaa 4020 actccaggtc cattctgttt aaatccctaa gaatgtcaga attaaaataa cagggctatc 4080 ccgtaattgg aaatatttct tttttcagga tgctatagtc aatttagtaa gtgaccacca 4140 aattgttatt tgcactaaca aagctcaaaa cacgataagt ttactcctcc atctcagtaa 4200 taaaaattaa gctgtaatca accttctagg tttctcttgt cttaaaatgg gtattcaaaa 4260 atggggatct gtggtgtatg tatggaaaca catactcctt aatttacctg ttgttggaaa 4320 ctggagaaat gattgtcggg caaccgttta ttttttattg tattttattt ggttgaggga 4380 tttttttata aacagtttta cttgtgtcat attttaaaat tactaactgc catcacctgc 4440 tggggtcctt tgttaggtca ttttcagtga ctaataggga taatccaggt aactttgaag 4500 agatgagcag tgagtgacca ggcagttttt ctgcctttag ctttgacagt tcttaattaa 4560 gatcattgaa gaccagcttt ctcataaatt tctctttttg aaaaaaagaa agcatttgta 4620 ctaagctcct ctgtaagaca acatcttaaa tcttaaaagt gttgttatca tgactggtga 4680 gagaagaaaa cattttgttt ttattaaatg gagcattatt tacaaaaagc cattgttgag 4740 aattagatcc cacatcgtat aaatatctat taaccattct aaataaagag aactccagtg 4800 ttgctatgtg caagatcctc tcttggagct tttttgcata gcaattaaag gtgtgctatt 4860 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<309> 2020-08-17 <313> (1)..(293) <400> 7 Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly 1 5 10 15 Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe 20 25 30 Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala 35 40 45 Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp 50 55 60 Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp 65 70 75 80 Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala 85 90 95 Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr 100 105 110 Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu 115 120 125 Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu 130 135 140 Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe 145 150 155 160 Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr 165 170 175 Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val 180 185 190 Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn 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tacgtgattg ttagttaagt ttttattcaa agcagctgta 1200 atttagttaa taaaataatt atgatctatg ttgtttgccc aattgagatc cagttttttg 1260 ttgttatttt taatcaatta ggggcaatag tagaatggac aatttccaag aatgatgcct 1320 ttcaggtcct agggcctctg gcctctaggt aaccagttta aattggttca gggtgataac 1380 tacttagcac tgccctggtg attacccaga gatatctatg aaaaccagtg gcttccatca 1440 aacctttgcc aactcaggtt cacagcagct ttgggcagtt atggcagtat ggcattagct 1500 gagaggtgtc tgccacttct gggtcaatgg aataataaat taagtacagg caggaatttg 1560 gttgggagca tcttgtatga tctccgtatg atgtgatatt gatggagata gtggtcctca 1620 ttcttggggg ttgccattcc cacattcccc cttcaacaaa cagtgtaaca ggtccttccc 1680 agatttaggg tacttttatt gatggatatg ttttcctttt attcacataa ccccttgaaa 1740 ccctgtcttg tcctcctgtt acttgcttct gctgtacaag atgtagcacc ttttctcctc 1800 tttgaacatg gtctagtgac acggtagcac cagttgcagg aaggagccag acttgttctc 1860 agagcactgt gttcacactt ttcagcaaaa atagctatgg ttgtaacata tgtattccct 1920 tcctctgatt tgaaggcaaa aatctacagt gtttcttcac ttcttttctg atctggggca 1980 tgaaaaaagc aagattgaaa tttgaactat gagtctcctg catggcaaca aaatgtgtgt 2040 caccatcagg ccaacaggcc agcccttgaa tggggattta ttactgttgt atctatgttg 2100 catgataaac attcatcacc ttcctcctgt agtcctgcct cgtactcccc ttcccctatg 2160 attgaaaagt aaacaaaacc cacatttcct atcctggtta gaagaaaatt aatgttctga 2220 cagttgtgat cgcctggagt acttttagac ttttagcatt cgttttttac ctgtttgtgg 2280 atgtgtgttt gtatgtgcat acgtatgaga taggcacatg catcttctgt atggacaaag 2340 gtggggtacc tacaggagag caaaggttaa ttttgtgctt ttagtaaaaa catttaaata 2400 caaagttctt tattgggtgg aattatattt gatgcaaata tttgatcact taaaactttt 2460 aaaacttcta ggtaatttgc cacgcttttt gactgctcac caataccctg taaaaatacg 2520 taattcttcc tgtttgtgta ataagatatt catatttgta gttgcattaa taatagttat 2580 ttcttagtcc atcagatgtt cccgtgtgcc tcttttatgc caaattgatt gtcatatttc 2640 atgttgggac caagtagttt gcccatggca aacctaaatt tatgacctgc tgaggcctct 2700 cagaaaactg agcatactag caagacagct cttcttgaaa aaaaaaatat gtatacacaa 2760 atatatacgt atatctatat atacgtatgt atatacacac atgtatattc ttccttgatt 2820 gtgtagctgt ccaaaataat 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tttaaaattc cttctatagc tagagctttt ctttctttca 3720 ttctctcttc ctgcagtgtt ttgcatacat cagaagctag gtacataagt taaatgattg 3780 agagttggct gtatttagat ttatcacttt ttaatagggt gagcttgaga gttttctttc 3840 tttctgtttt ttttttttgt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tgactaattt 3900 cacatgctct aaaaaccttc aaaggtgatt atttttctcc tggaaactcc aggtccattc 3960 tgtttaaatc cctaagaatg tcagaattaa aataacaggg ctatcccgta attggaaata 4020 tttctttttt caggatgcta tagtcaattt agtaagtgac caccaaattg ttatttgcac 4080 taacaaagct caaaacacga taagtttact cctccatctc agtaataaaa attaagctgt 4140 aatcaacctt ctaggtttct cttgtcttaa aatgggtatt caaaaatggg gatctgtggt 4200 gtatgtatgg aaacacatac tccttaattt acctgttgtt ggaaactgga gaaatgattg 4260 tcgggcaacc gtttattttt tattgtattt tatttggttg agggattttt ttataaacag 4320 ttttacttgt gtcatatttt aaaattacta actgccatca cctgctgggg tcctttgtta 4380 ggtcattttc agtgactaat agggataatc caggtaactt tgaagagatg agcagtgagt 4440 gaccaggcag tttttctgcc tttagctttg acagttctta attaagatca ttgaagacca 4500 gctttctcat aaatttctct 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aagttttaaa tcagtccaa 5259

Claims (55)

  1. 신장 이식 수용자에서 단백뇨를 예방하거나 이의 중증도를 감소시키는 방법으로서,
    (a) 수용자에게 신장을 이식하는 단계로서, 상기 신장은 알파-1,3 갈락토실트랜스퍼라제-결핍 미니 돼지로부터 얻고 상기 신장의 사구체는 상기 수용자에서 단백뇨를 예방하거나 이의 중증도를 감소시키기에 충분한 수준으로 인간 CD47을 발현하는 것인, 상기 단계; 및
    (b) 상기 수용자에게 돼지 조혈 줄기 세포를 이식하는 단계로서, 상기 돼지 조혈 줄기 세포는 인간 CD47을 발현하고 알파-1,3 갈락토실트랜스퍼라제-결핍 미니 돼지로부터 얻은 것인, 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 신장의 사구체는 상기 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 신장의 사구체는 상기 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 2배 내지 10배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알파-1,3 갈락토실트랜스퍼라제-결핍 미니 돼지는 MHC-동종 번식 콜롬비아/삭스(Columbia/Sachs) 미니 돼지인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 CD47 발현 수준은 실시간 중합효소 연쇄반응에 의해 측정되는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수용자는 포유동물인, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 수용자는 인간인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돼지 조혈 줄기 세포는 골수, 말초 혈액, 제대혈 또는 태아 간 세포로부터 얻어지는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 CD47은 내인성 돼지 CD47과 동일한 조절 요소 하에 발현되는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 CD47은 알파-1,3 갈락토실트랜스퍼라제-결핍 미니 돼지에서 내인성 돼지 CD47을 대체하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 CD47은 사구체-특이적 프로모터 하에 발현되는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 사구체-특이적 프로모터는 네프린인, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백뇨는 신장 단백뇨인, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백뇨는 24시간당 3 g 미만으로 감소되는, 방법.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백뇨는 24시간당 500㎎으로 감소되는, 방법.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백뇨는 24시간당 300㎎으로 감소되는, 방법.
  17. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백뇨는 24시간당 150㎎으로 감소되는, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백뇨는 상기 이식 2주 내에 해소되는, 방법.
  19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백뇨는 상기 이식 1개월 내에 해소되는, 방법.
  20. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백뇨는 상기 이식 2개월 내에 해소되는, 방법.
  21. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백뇨는 상기 이식 4개월 내에 해소되는, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신장은 흉선신장(thymokidney)인, 방법.
  23. 미니 돼지로부터 분리된 신장이되, 상기 신장의 사구체는 신장의 세뇨관에서 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현하는, 신장.
  24. 제23항에 있어서, 상기 신장의 사구체는 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 2배 내지 10배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현하는, 신장.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 인간 CD47 발현 수준은 실시간 중합효소 연쇄반응에 의해 측정되는, 신장.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 CD47은 내인성 돼지 CD47과 동일한 조절 요소 하에 발현되는, 신장.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 CD47은 사구체-특이적 프로모터 하에 발현되는, 신장.
  28. 제27항에 있어서, 상기 사구체-특이적 프로모터는 네프린인, 신장.
  29. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신장은 흉선신장인, 신장.
  30. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미니 돼지는 알파-1,3 갈락토실트랜스퍼라제-결핍 미니 돼지인, 신장.
  31. 제30항에 있어서, 상기 알파-1,3 갈락토실트랜스퍼라제-결핍 미니 돼지는 MHC-동종 번식 콜롬비아/삭스 미니 돼지인, 신장.
  32. 미니 돼지 유래의 신장을 인간 수용자에게 이식하는 방법으로서,
    (a) 제1 미니 돼지 유래의 골수를 골내 이식을 통해 수용자에게 이식하는 단계; 및
    (b) 제2 미니 돼지 유래의 신장을 수용자에게 이식하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 제2 미니 돼지 유래의 신장을 이식하는 상기 제2 단계는 제1 미니 돼지 유래의 골수를 이식하는 제1 단계 후 적어도 28일 후에 수행되는, 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 상기 제1 미니 돼지 유래의 골수는 인간 CD47을 발현하는, 방법.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 미니 돼지 유래의 신장은 인간 CD47을 발현하는, 방법.
  36. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 미니 돼지 유래의 골수 및 제2 미니 돼지 유래의 신장은 인간 CD47을 발현하는, 방법.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 CD47은 내인성 돼지 CD47과 동일한 조절 요소 하에 발현되는, 방법.
  38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 CD47은 사구체-특이적 프로모터 하에 발현되는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 사구체-특이적 프로모터는 네프린인, 방법.
  40. 제32항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골수 및 신장은 동일한 미니 돼지로부터 유래하는, 방법.
  41. 제32항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 미니 돼지 및 제2 미니 돼지는 고도로 동종 번식된 동일한 미니 돼지 무리로부터 유래하는, 방법.
  42. 제32항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 미니 돼지 및 제2 미니 돼지는 알파-1,3 갈락토실트랜스퍼라제-결핍 미니 돼지인, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 알파-1,3 갈락토실트랜스퍼라제-결핍 미니 돼지는 MHC-동종 번식 콜롬비아/삭스 미니 돼지인, 방법.
  44. 제32항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 미니 돼지 및 제2 미니 돼지는 유전적으로 일치하는 미니 돼지인, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 제1 및 제2 미니 돼지는 MHC가 일치하는, 방법.
  46. 제32항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가적인 치료를 수용자에게 투여하는 것을 더 포함하는, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가적인 치료는 전신 방사선 조사, 흉선 방사선 조사, 리툭시맙, 항흉선세포 글로불린(anti-thymocyte globulin: ATG), 타크로리무스, 마이코페놀레이트 모페틸(tacrolimus, mycophenolate mofetil: MMF), 항-CD154 항체, 코브라독 인자(cobra venom factor: CVF), 헤파린, 프로스타사이클린, 재조합 돼지 사이토카인, 돼지 줄기 세포 인자(porcine stem cell factor: pCSF), 돼지 인터류킨-3(porcine interleukin-3: pIL-3), 간시클로버, 메틸프레드니솔론, 항-IL6 수용체 항체 및 항-CD40 항체를 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
  48. 제32항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 미니 돼지 유래의 랑게르한스섬 세포를 수용자에게 이식하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  49. 비-인간 종 유래의 이종이식편으로서, 상기 이종이식편은
    (a) 신장; 및
    (b) 랑게르한스섬 세포
    를 포함하되,
    상기 신장은 상기 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현하는 사구체를 포함하는, 이종이식편.
  50. 제49항에 있어서, 상기 신장의 사구체는 상기 신장의 세뇨관에서의 인간 CD47 발현 수준보다 2배 내지 10배 더 높은 수준으로 인간 CD47을 발현하는, 이종이식편.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 상기 인간 CD47 발현 수준은 실시간 중합효소 연쇄반응에 의해 측정되는, 이종이식편.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 상기 인간 CD47은 내인성 돼지 CD47과 동일한 조절 요소 하에 발현되는, 이종이식편.
  53. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 CD47은 사구체-특이적 프로모터 하에 발현되는, 이종이식편.
  54. 제53항에 있어서, 상기 사구체-특이적 프로모터는 네프린인, 방법.
  55. 제49항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신장은 흉선신장인, 이종이식편.
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