CN116322587A

CN116322587A - 用于异种移植的基因修饰

Info

Publication number: CN116322587A
Application number: CN202180068410.8A
Authority: CN
Inventors: M·赛克斯; R·J·霍利; K·山田; D·H·萨克斯
Original assignee: Columbia University in the City of New York
Current assignee: Columbia University in the City of New York
Priority date: 2020-09-07
Filing date: 2021-09-03
Publication date: 2023-06-23
Also published as: KR20230066376A; AU2021336912A1; BR112023004099A2; WO2022051594A1; EP4210490A1; US20230414664A1; JP2023540351A; IL301138A; MX2023002706A; CA3191806A1

Abstract

本文提供了以组织特异性方式表达人CD47的重组小型猪。还提供了从小型猪分离的肾脏，其中所述肾脏的肾小球的人CD47表达水平高于所述肾脏的肾小管中的人CD47表达水平。此外，本文提供了将来自重组小型猪的此类具有人CD47的肾小球特异性表达的猪肾脏移植到人接受者中的方法。在某些方面，本文提供了移植方法，所述方法包括将来自第一供体动物(例如，小型猪)的表达人CD47的造血干细胞和来自第二供体动物(例如，小型猪)的在肾小球中表达人CD47的肾脏移植给接受者(例如，人接受者)。

Description

用于异种移植的基因修饰

1.政府许可权

本发明是根据美国国家过敏和传染病研究所(NIAID)、美国国立卫生研究院(NIH)授予的资助号P01 AI045897在政府支持下完成的。政府对本发明具有一定权利。

2.相关申请的交叉引用

本申请要求2020年9月7日提交的美国序列号63/075,285和2020年11月3日提交的美国序列号63/108,986的权益，所述申请各自的公开内容以引用的方式整体并入本文。

3.以电子方式提交的序列表的引用

本申请含有序列表，所述序列表以ASCII格式以电子方式提交并且据此以引用的方式整体并入。所述ASCII副本创建于2021年8月26日，名称为14648-015-228_Sequence_Listing.txt，且大小为42,743字节。

4.技术领域

本文提供了以组织特异性方式表达人CD47的重组小型猪(例如，GalT敲除小型猪)。还提供了从小型猪分离的肾脏，其中肾脏的肾小球的人CD47表达水平高于肾脏的肾小管中的人CD47表达水平。此外，本文提供了将来自重组小型猪的此类具有人CD47的肾小球特异性表达的猪肾脏移植到人接受者中的方法。在某些方面，本文提供了移植方法，所述方法包括将来自第一供体动物(例如，小型猪)的表达人CD47的造血干细胞和来自第二供体动物(例如，小型猪)的在肾小球中表达人CD47的肾脏移植给接受者(例如，人接受者)。

5.背景技术

目前，同种异体供体的严重短缺限制了进行器官移植的数量。可通过使用来自其他物种的器官(异种移植物)来纠正此供需差距。鉴于与使用非人灵长类动物相关的伦理问题和不切实际，猪被认为是最适合人类的供体物种。除器官大小和生理上与人相似以外，猪快速繁殖和近亲繁殖的能力使它们特别适合进行基因修饰，从而提高它们作为人类移植物供体的能力。参见，例如，Sachs(1994),Path.Biol.42:217-219和Piedrahita等人(2004),Am.J.Transplant,4增刊6:43-50。

虽然移植联合非特异性免疫抑制疗法与高的早期移植物接受率相关，但临床器官移植成功的主要限制因素是晚期移植物丢失，这主要是由移植的慢性排斥所致。因此，免疫耐受是移植的主要目标，而且对于成功的临床异种移植更为重要，因为预防异种移植物排斥所需的终生免疫抑制水平可能毒性太大无法接受。此外，尚未鉴定出能可靠指示患者是否已实现免疫耐受的标志物，导致缺乏实验室参数来作为取消免疫抑制的依据。

因此，异种移植的目标包括实现耐受。这可以通过异种胸腺移植或通过优化源自供体动物的混合嵌合细胞在移植到异种接受者后的耐久性，以及维持供体动物的健康和存活时间来实现。

混合嵌合可以诱导接受者在T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞水平上的对供体的耐受。参见，例如，Griesemer等人(2014),Immunol.Rev.258:241-258；Sachs等人(2014),Cold Spring Harb.Perspect.Med.4:a015529。

CD47，也称为整联蛋白相关蛋白(IAP)，是一种泛表达的50kDa细胞表面糖蛋白，可作为信号调节蛋白(SIRP)α(也称为CD172a和SHPS-1)的配体。参见，例如，Brown(2002),Curr.Opin.Cell.Biol.,14:603-7；以及Brown和Frazier(2001),Trends Cell Biol.,111130-5。CD47和SIRPα构成细胞-细胞通讯系统，在包括细胞迁移、B细胞粘附和T细胞激活在内的多种细胞过程中发挥重要作用。参见，例如，Liu等人(2002),J.Biol.Chem.277:10028；Motegi等人(2003),EMBO 122:2634；Yoshida等人(2002),J.lmmunol.168:3213；以及Latour等人(2001),J.lmmunol.167:2547。此外，CD47-SIRPα系统与巨噬细胞吞噬作用的负调控有关。某些细胞类型(即，红细胞、血小板或白细胞)表面上的CD47会抑制巨噬细胞的吞噬作用。CD47-SIRPα相互作用在抑制吞噬作用中的作用已通过以下观察得到说明：原代野生型小鼠巨噬细胞快速吞噬从CD47缺陷型小鼠而非野生型小鼠获得的未经调理作用的红细胞(RBC)。参见，例如，Oldenborg等人(2000),Science288:2051。也有报道称，CD47通过其受体SIRPα抑制Fcγ和补体受体介导的吞噬作用。参见，例如，Oldenborg等人(2001),J.Exp.Med.193:855。

CD47KO细胞在输注到同基因野生型(WT)小鼠中后被巨噬细胞强烈排斥，表明CD47向巨噬细胞发出“不要吃我”的信号。参见，例如，Oldenborg PA,等人(2000),Science,288:2051-4；以及Wang等人(2007),Proc Natl Acad Sci U S A.104:13744。使用猪作为移植源的异种移植有可能解决人体器官供体严重短缺这一临床移植的主要限制因素。参见，例如，Yang等人(2007),Nature Reviews Immunology.7:519-31。巨噬细胞对异种细胞的强烈排斥(参见，例如，Abe(2002),The Journal of Immunology 168:621)主要是由供体CD47与接受者SIRPα之间缺乏功能性相互作用引起的(参见，例如，Wang等人(2007),Blood；109:836-42；Ide等人(2007),Proc Natl Acad Sci USA 104:5062-6；以及Navarro-Alvarez(2014),Cell transplantation,23:345-54)，导致人CD47转基因猪的发展(参见，例如，Tena等人(2017),Transplantation 101:316-21；以及Nomura等人(2020),Xenotransplantation2020；27:e12549)。除巨噬细胞以外，DC的一个亚群也表达SIRPα(参见，例如，Wang等人(2007),Proc Natl Acad Sci U S A.104:13744-9；以及Guilliams等人(2016),Immunity.45:669-84)。CD47-SIRPα信号传导还抑制DC的激活及其启动T细胞的能力，并在通过供体特异性输注(DST)或肝细胞移植诱导T细胞耐受方面发挥重要作用。参见，例如，Wang等人(2007),Proc Natl Acad Sci U S A.104:13744-9；Wang等人(2014),Celltransplantation 23:355-63；以及Zhang等人.(2016),Sci Rep.6:26839。

6.发明内容

在一方面，本文提供了一种用于预防肾脏移植接受者中的蛋白尿或减轻蛋白尿的严重程度的方法，其中所述方法包括：(i)将肾脏移植到所述接受者中，其中所述肾脏获自α-1,3半乳糖基转移酶缺陷型小型猪，并且所述肾脏的肾小球以足以预防或减轻所述接受者中的蛋白尿的严重程度的水平表达人CD47；以及(ii)将猪造血干细胞移植到所述接受者中，其中所述猪造血干细胞表达人CD47并且获自α-1,3半乳糖基转移酶缺陷型小型猪。

在一些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平高于肾脏的肾小管中的人CD47表达水平。在一些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的2倍至10倍。在一些实施方案中，所述α-1,3半乳糖基转移酶缺陷型小型猪是MHC近交的Columbia/Sachs小型猪。在一些实施方案中，人CD47表达水平通过实时聚合酶链反应来测量。

在一些实施方案中，接受者是哺乳动物。在一些实施方案中，接受者是人。

在一些实施方案中，猪造血干细胞获自骨髓、外周血、脐带血或胎肝细胞。

在一些实施方案中，人CD47在与内源性猪CD47相同的调控元件下表达。在一些实施方案中，人CD47替代α-1,3半乳糖基转移酶缺陷型小型猪中的内源性猪CD47。在一些实施方案中，人CD47在肾小球特异性启动子下表达。在一些实施方案中，肾小球特异性启动子是肾病蛋白。

在一些实施方案中，蛋白尿是肾性蛋白尿。在一些实施方案中，蛋白尿降至每24小时少于3g。在一些实施方案中，蛋白尿降至每24小时500mg。在一些实施方案中，蛋白尿降至每24小时300mg。在一些实施方案中，蛋白尿降至每24小时150mg。在一些实施方案中，蛋白尿在移植后两周内消退。在一些实施方案中，蛋白尿在移植后一个月内消退。在一些实施方案中，蛋白尿在移植后两个月内消退。在一些实施方案中，蛋白尿在移植后四个月内消退。

在一些实施方案中，肾脏是胸腺肾。

在另一方面，本文提供了一种从小型猪分离的肾脏，其中肾脏的肾小球的人CD47表达水平高于肾脏的肾小管中的人CD47表达水平。在一些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的2倍至10倍。在一些实施方案中，人CD47表达水平通过实时聚合酶链反应来测量。在一些实施方案中，人CD47在与内源性猪CD47相同的调控元件下表达。在一些实施方案中，人CD47在肾小球特异性启动子下表达。在一些实施方案中，肾小球特异性启动子是肾病蛋白。在一些实施方案中，肾脏是胸腺肾。在一些实施方案中，小型猪是α-1,3半乳糖基转移酶缺陷型小型猪。在一些实施方案中，所述α-1,3半乳糖基转移酶缺陷型小型猪是MHC近交的Columbia/Sachs小型猪。

在另一方面，本文提供了一种将来自小型猪的肾脏移植到人接受者中的方法，其中所述方法包括：(i)经由骨内移植将来自第一小型猪的骨髓移植给所述接受者；以及(ii)将来自第二小型猪的肾脏移植给所述接受者。在一些实施方案中，移植来自第二小型猪的肾脏的所述第二步骤在移植来自第一小型猪的骨髓的第一步骤后至少28天进行。

在一些实施方案中，来自第一小型猪的骨髓表达人CD47。在一些实施方案中，来自第二小型猪的肾脏表达人CD47。在一些实施方案中，来自第一小型猪的骨髓和来自第二小型猪的肾脏表达人CD47。

在一些实施方案中，人CD47在与内源性猪CD47相同的调控元件下表达。在一些实施方案中，人CD47在肾小球特异性启动子下表达。在一些实施方案中，肾小球特异性启动子是肾病蛋白。

在一些实施方案中，骨髓和肾脏来自同一小型猪。在一些实施方案中，第一小型猪和第二小型猪来自相同的高度近交的小型猪群。在一些实施方案中，第一小型猪和第二小型猪是α-1,3半乳糖基转移酶缺陷型小型猪。在一些实施方案中，所述α-1,3半乳糖基转移酶缺陷型小型猪是MHC近交的Columbia/Sachs小型猪。在一些实施方案中，第一小型猪和第二小型猪是基因匹配的小型猪。在一些实施方案中，第一小型猪和第二小型猪是MHC匹配的。

在一些实施方案中，所述方法还包括向接受者施用一种或多种另外的治疗。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的治疗选自包括以下的组：全身辐照、胸腺辐照、利妥昔单抗、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)、他克莫司、吗替麦考酚酯(MMF)、抗CD154抗体、眼镜蛇毒因子(CVF)、肝素、前列环素、重组猪细胞因子、猪干细胞因子(pCSF)、猪白介素3(pIL-3)、更昔洛韦、甲泼尼龙、抗IL6受体抗体和抗CD40抗体。在一些实施方案中，所述方法还包括将来自小型猪的朗格汉斯岛细胞移植给接受者。

在另一方面，本文提供了来自非人物种的异种移植物，其中所述异种移植物包含：(a)肾脏；和(b)朗格汉斯岛细胞，其中肾脏包含肾小球，肾小球的人CD47表达水平高于肾脏的肾小管中的人CD47表达水平。在一些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的2倍至10倍。在一些实施方案中，人CD47表达水平通过实时聚合酶链反应来测量。在一些实施方案中，人CD47在与内源性猪CD47相同的调控元件下表达。在一些实施方案中，人CD47在肾小球特异性启动子下表达。在一些实施方案中，肾小球特异性启动子是肾病蛋白。在一些实施方案中，肾脏是胸腺肾。

附图说明

图1A至图1C示出了人巨噬细胞(图1A)或狒狒巨噬细胞(图1B)对猪内皮细胞(“EC”)的吞噬作用，以及狒狒巨噬细胞对足细胞的吞噬作用(图1C)。

图2A至图2D：示出了使用人(图2A)、狒狒(图2B)、恒河猴(图2C)和食蟹猴(图2D)巨噬细胞对GalT-KO EC的吞噬作用。

图3A和图3B：示出了肾脏移植后的血清Cre水平(图3A)和肾脏移植物的组织学(图3B)。

图4示出了用于人CD47的足细胞特异性表达的载体构建体。猪肾病蛋白基因的基因组区段(以红色描绘)包含启动子区域和另外的基因组序列，一直到外显子2中肾病蛋白前导序列的末端。人CD47基因(以绿色描绘)作为混合蛋白编码序列引入/基因组区段引入，其由外显子2-7的成熟蛋白质编码部分(第一个绿色区域)和从内含子7开始一直到外显子11的基因组区域组成。这种混合结构将允许产生CD47的所有4种可变剪接同种型。包括PKG-GFP盒(以橙色描绘)，用于阳性选择已将载体整合到转录允许位点中的转染成纤维细胞。

具体实施方式

本文提供了将来自供体小型猪的表达人CD47的肾脏移植给人接受者的方法。具体地说，这种供体小型猪的肾脏的肾小球中的人CD47表达水平高于肾小管中的表达水平。可以如第8.1节中描述的那样产生转基因供体小型猪。可以使用第8.1节中描述的技术将基因修饰引入供体小型猪中。这些供体小型猪可以携带如第8.1.4节中描述的另外的基因修饰(诸如α-1,3半乳糖基转移酶缺陷)。可以使用第8.1.1节中描述的方法实现肾小球特异性表达。可以使用第8.1.3节中描述的方法证明人CD47的表达水平。移植程序可以包括如第8.2节中描述的另外的步骤，诸如骨髓移植、复合胰岛-肾脏移植物，或将来自小型猪的胸腺组织移植给接受者。如第8.2节中描述的免疫抑制和另外的调节可以是移植的一部分。因此，本公开提供了转基因小型猪、其制备方法、其使用方法，以及本文提供的组分的任何组合或排列。不受理论的束缚，本文提供的移植方法使得移植接受者中的肾性蛋白尿的风险和/或严重程度降低。

8.1转基因小型猪的产生

本文提供了基因修饰的猪，其中肾脏的肾小球中的人CD47表达水平高于肾脏的肾小管中的表达水平。这种基因修饰的猪的肾脏可用于移植到人接受者中。不受任何特定理论的束缚，人CD47在移植物中的这种表达模式防止或减少移植后肾脏接受者中的蛋白尿。下文第8.2.4节提供了评价蛋白尿的方法。

可以使用第8.1.1节中描述的方法实现人CD47的肾小球特异性表达。可以使用第8.1.3节中描述的方法证明人CD47的表达水平。可以使用第8.1节中描述的技术将基因修饰引入供体小型猪中。这些供体小型猪可以携带如第8.1.4节中描述的另外的基因修饰(诸如α-1,3半乳糖基转移酶缺陷)。

8.1.1.组织特异性人CD47表达

可以经由以细胞类型特异性方式控制基因表达来实现转基因猪中人CD47转基因的组织特异性表达(例如，人CD47于肾小球中的表达)。一般来说，可以使用包含表达盒、用于基因组整合和选择的元件的构建体对动物进行基因修饰。表达盒包含启动子和编码转基因(例如，人CD47)的核苷酸序列。在下文详细描述这些元件中的每一个。实现组织特异性表达的其他方法，诸如不涉及基因组整合的方法，也可以与本文提供的方法和组合物一起使用。

在某些实施方案中，人CD47在内皮组织中可检测到。在某些实施方案中，人CD47在猪的内皮组织中可检测到，但在任何其他组织中检测不到。在某些实施方案中，人CD47在猪的内皮组织中可检测到，但在猪的肾脏的肾小管检测不到。在某些实施方案中，使用下文第8.1.3节中描述的技术，人CD47在猪的肾脏的小球中可检测到，但在肾小管中检测不到。例如，可以在一种、两种或更多种肾小球细胞类型中检测到人CD47。肾小球细胞类型的实例包括足细胞、肾小球内皮细胞和系膜细胞。

在某些实施方案中，人CD47仅在猪的肾脏的肾小球中可检测到，但在猪的任何其他组织中均检测不到。在其他实施方案中，人CD47在猪的肾脏的肾小球和猪身体的其余部分中可检测到，但在肾小管中检测不到。在某些实施方案中，人CD47在猪的骨髓和猪的肾脏的肾小球中可检测到。在某些实施方案中，人CD47在猪的骨髓和猪的肾脏的肾小球中可检测到，但在猪的任何其他组织中均检测不到。

在一些实施方案中，如使用下文第8.1.3节中描述的技术所检测的，转基因猪的肾脏的肾小球的人CD47表达水平高于肾脏的肾小管中的人CD47表达水平。在某些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的2倍至500倍。在一些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的2倍至50倍。在一些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的51倍至100倍。在某些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的101倍至150倍。在一些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的151倍至200倍。在一些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的201倍至250倍。在某些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的251倍至300倍。在一些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的301倍至350倍。在一些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的351倍至400倍。在某些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的401倍至450倍。在某些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的451倍至500倍。

在一些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的至少2倍、5倍、10倍、25倍、50倍、75倍或至少100倍。在一些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的至少2倍。在一些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的至少5倍。在一些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的至少10倍。在一些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的至少25倍。在一些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的至少50倍。在一些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的至少75倍。在一些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的至少100倍。

在某些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是转基因猪中任何其他组织中的人CD47表达水平的2倍至500倍。在一些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是转基因猪中任何其他组织中的人CD47表达水平的2倍至50倍。在一些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是转基因猪中任何其他组织中的人CD47表达水平的51倍至100倍。在某些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是转基因猪中任何其他组织中的人CD47表达水平的101倍至150倍。在一些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是转基因猪中任何其他组织中的人CD47表达水平的151倍至200倍。在一些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是转基因猪中任何其他组织中的人CD47表达水平的201倍至250倍。在某些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是转基因猪中任何其他组织中的人CD47表达水平的251倍至300倍。在一些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是转基因猪中任何其他组织中的人CD47表达水平的301倍至350倍。在一些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是转基因猪中任何其他组织中的人CD47表达水平的351倍至400倍。在某些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是转基因猪中任何其他组织中的人CD47表达水平的401倍至450倍。在某些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是转基因猪中任何其他组织中的人CD47表达水平的451倍至500倍。

在一些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是转基因猪中任何其他组织中的人CD47表达水平的至少2倍、5倍、10倍、25倍、50倍、75倍、100倍。在一些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是转基因猪中任何其他组织中的人CD47表达水平的至少2倍。在一些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是转基因猪中任何其他组织中的人CD47表达水平的至少5倍。在一些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是转基因猪中任何其他组织中的人CD47表达水平的至少10倍。在一些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是转基因猪中任何其他组织中的人CD47表达水平的至少25倍。在一些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是转基因猪中任何其他组织中的人CD47表达水平的至少50倍。在一些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是转基因猪中任何其他组织中的人CD47表达水平的至少75倍。在一些实施方案中，肾脏的肾小球的人CD47表达水平是转基因猪中任何其他组织中的人CD47表达水平的至少100倍。

在某些实施方案中，至少10％、20％、30％、40％、50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的肾小球表达人CD47。在某些实施方案中，至少10％的肾小球表达人CD47。在某些实施方案中，至少20％的肾小球表达人CD47。在某些实施方案中，至少30％的肾小球表达人CD47。在某些实施方案中，至少40％的肾小球表达人CD47。在某些实施方案中，至少50％的肾小球表达人CD47。在某些实施方案中，至少55％的肾小球表达人CD47。在某些实施方案中，至少60％的肾小球表达人CD47。在某些实施方案中，至少65％的肾小球表达人CD47。在某些实施方案中，至少70％的肾小球表达人CD47。在某些实施方案中，至少75％的肾小球表达人CD47。在某些实施方案中，至少80％的肾小球表达人CD47。在某些实施方案中，至少85％的肾小球表达人CD47。在某些实施方案中，至少90％的肾小球表达人CD47。在某些实施方案中，至少95％的肾小球表达人CD47。

在某些实施方案中，至少10％、20％、30％、40％、50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的肾小球以高于肾脏的肾小管的水平表达人CD47。在某些实施方案中，至少10％的肾小球以高于肾脏的肾小管的水平表达人CD47。在某些实施方案中，至少20％的肾小球以高于肾脏的肾小管的水平表达人CD47。在某些实施方案中，至少30％的肾小球以高于肾脏的肾小管的水平表达人CD47。在某些实施方案中，至少40％的肾小球以高于肾脏的肾小管的水平表达人CD47。在某些实施方案中，至少50％的肾小球以高于肾脏的肾小管的水平表达人CD47。在某些实施方案中，至少55％的肾小球以高于肾脏的肾小管的水平表达人CD47。在某些实施方案中，至少60％的肾小球以高于肾脏的肾小管的水平表达人CD47。在某些实施方案中，至少65％的肾小球以高于肾脏的肾小管的水平表达人CD47。在某些实施方案中，至少70％的肾小球以高于肾脏的肾小管的水平表达人CD47。在某些实施方案中，至少75％的肾小球以高于肾脏的肾小管的水平表达人CD47。在某些实施方案中，至少80％的肾小球以高于肾脏的肾小管的水平表达人CD47。在某些实施方案中，至少85％的肾小球以高于肾脏的肾小管的水平表达人CD47。在某些实施方案中，至少90％的肾小球以高于肾脏的肾小管的水平表达人CD47。在某些实施方案中，至少95％的肾小球以高于肾脏的肾小管的水平表达人CD47。

在某些实施方案中，至少10％、20％、30％、40％、50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的肾小球以高于猪任何其他组织的水平表达人CD47。在某些实施方案中，至少10％的肾小球以高于猪任何其他组织的水平表达人CD47。在某些实施方案中，至少20％的肾小球以高于猪任何其他组织的水平表达人CD47。在某些实施方案中，至少30％的肾小球以高于猪任何其他组织的水平表达人CD47。在某些实施方案中，至少40％的肾小球以高于猪任何其他组织的水平表达人CD47。在某些实施方案中，至少50％的肾小球以高于猪任何其他组织的水平表达人CD47。在某些实施方案中，至少55％的肾小球以高于猪任何其他组织的水平表达人CD47。在某些实施方案中，至少60％的肾小球以高于猪任何其他组织的水平表达人CD47。在某些实施方案中，至少65％的肾小球以高于猪任何其他组织的水平表达人CD47。在某些实施方案中，至少70％的肾小球以高于猪任何其他组织的水平表达人CD47。在某些实施方案中，至少75％的肾小球以高于猪任何其他组织的水平表达人CD47。在某些实施方案中，至少80％的肾小球以高于猪任何其他组织的水平表达人CD47。在某些实施方案中，至少85％的肾小球以高于猪任何其他组织的水平表达人CD47。在某些实施方案中，至少90％的肾小球以高于猪任何其他组织的水平表达人CD47。在某些实施方案中，至少95％的肾小球以高于猪任何其他组织的水平表达人CD47。

在某些实施方案中，至少10％、20％、30％、40％、50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的肾小球选择性地表达人CD47。可以使用本领域已知或本文所述的技术测定肾小球中的CD47水平。在某些实施方案中，至少10％的肾小球选择性地表达人CD47。在某些实施方案中，至少20％的肾小球选择性地表达人CD47。在某些实施方案中，至少30％的肾小球选择性地表达人CD47。在某些实施方案中，至少40％的肾小球选择性地表达人CD47。在某些实施方案中，至少50％的肾小球选择性地表达人CD47。在某些实施方案中，至少55％的肾小球选择性地表达人CD47。在某些实施方案中，至少60％的肾小球选择性地表达人CD47。在某些实施方案中，至少65％的肾小球选择性地表达人CD47。在某些实施方案中，至少70％的肾小球选择性地表达人CD47。在某些实施方案中，至少75％的肾小球选择性地表达人CD47。在某些实施方案中，至少80％的肾小球选择性地表达人CD47。在某些实施方案中，至少85％的肾小球选择性地表达人CD47。在某些实施方案中，至少90％的肾小球选择性地表达人CD47。在某些实施方案中，至少95％的肾小球选择性地表达人CD47。

在某些实施方案中，转基因猪的肾脏的肾小球和骨髓均表达人CD47。在一些实施方案中，人猪的肾脏的肾小球和骨髓是仅有的其中可检测到人CD47的表达的两个组织，例如，可通过下文第8.1.3节中描述的方法检测到。

可以使用技术人员已知的任何方法来定量人CD47的水平(例如，人CD47基因或蛋白质表达水平)。在某些实施方案中，将如使用下文第8.1.3节中描述的技术检测的肾小球中的人CD47表达水平使用肾小球中一种或多种管家基因的表达水平归一化。在其他实施方案中，使用肾小球中一种或多种管家基因的历史表达水平将肾小球中的人CD47表达水平归一化。在某些实施方案中，将如使用下文第8.1.3节中描述的技术检测的肾小管中的人CD47表达水平使用肾小管中一种或多种管家基因的表达水平归一化。在其他实施方案中，使用肾小管中一种或多种管家基因的历史表达水平将肾小管中的人CD47表达水平归一化。管家基因在本领域中是众所周知的并且包括例如β-肌动蛋白、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)或组蛋白。

在一些实施方案中，肾脏中存在的所有肾小球的人CD47表达水平高于肾小管中的人CD47表达水平。在一些实施方案中，肾脏中超过75％的肾小球的人CD47表达水平高于肾小管中的人CD47表达水平。在一些实施方案中，肾脏中超过50％的肾小球的人CD47表达水平高于肾小管中的人CD47表达水平。在一些实施方案中，肾脏中超过25％的肾小球的人CD47表达水平高于肾小管中的人CD47表达水平。

8.1.2.用于产生转基因供体动物的构建体

制造转基因动物(例如，小型猪)的方法在本领域中是众所周知的。参见，例如，Hryhorowicz等人(2020),Genes 2020,11,670。此类方法的实例在下文中描述。在某些实施方案中，使用来自近交的小型猪群的小型猪。可通过本领域已知的任何合适的方法产生转基因动物。因此，可使用例如体细胞核转移(SCNT)、原核显微注射、精子介导的基因转移(SMGT)或病毒介导的转基因将基因表达构建体(例如，本文所述的构建体)引入动物的种系中，参见，例如，Yum等人(2016)J Vet Sci 2016,17:261-268；Whyte和Prather(2011),MolReprod Dev78:879-891；Sachs和Gali(2009)。

SCNT涉及将供体细胞的细胞核转移到染色体已被移除的卵母细胞或早期胚胎中。参见，例如，Wilmut和Taylor(2015),Phil.Trans.R.Soc.B 370:20140366。原核显微注射涉及将DNA直接注射到原核中。用于这些目的的卵可从超排卵母猪收集，然后通过胚胎转移转移至接受者猪。参见，例如，Whyte和Prather(2011),Mol Reprod Dev78:879-891。SMGT涉及将用于目标转基因的基因与精细胞一起孵育，这些精细胞随后用于授精。参见，例如，Lavitrano等人,(2002),Proc Nat Acad Sci USA.99:14230-14235。病毒介导的转基因依赖于用携带转基因的病毒载体感染胚胎或卵母细胞。示例性病毒载体包括腺相关病毒(AAV)、自身互补腺相关病毒(scAAV)、腺病毒、逆转录病毒、慢病毒(例如，猿猴免疫缺陷病毒、人免疫缺陷病毒或修饰的人免疫缺陷病毒)、新城疫病毒(NDV)、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)、甲病毒、牛痘病毒等)。

用于表达转基因的构建体一般包含用于基因组整合和选择的元件，以及表达盒。表达盒包含启动子和编码转基因(例如，人CD47)的核苷酸序列。病毒载体还可包含其他元件，诸如Poly(A)位点、转录终止位点或病毒特异性元件(诸如反向末端重复序列)。参见，例如Buard等人(2009),British Journal of Pharmacology 157:153–165。

8.1.2.1用于基因组整合的元件

人CD47转基因到供体小型猪的基因组中的序列特异性插入(或敲入)可以通过序列特异性核酸内切酶结合目标染色体位点与含有人CD47转基因的构建体的同源重组(HR)来实现。参见，例如，Meyer等人(2010),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 107:15022-15026；Cui等人(2010),Nat.Biotechnol.29:64-67；Moehle等人(2007),Proc Natl Acad Sci USA 104:3055-3060。该过程依赖于用核酸内切酶靶向特定基因序列，核酸内切酶识别并结合这些序列，并在小型猪细胞的核酸分子中诱导双链断裂。接着通过同源重组修复双链断裂。如果反式提供了用于同源重组的模板(例如，含有人CD47的构建体)，则可以使用提供的模板修复双链断裂。核酸内切酶的非限制性实例包括锌指核酸酶(ZFN)、ZFN二聚体、ZFNickase、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)或RNA指导的DNA核酸内切酶(例如，CRISPR/Cas9)。

序列特异性核酸内切酶的另一实例包括RNA指导的DNA核酸酶，例如CRISPR/Cas系统。Cas9/CRISPR(成簇规律间隔的短回文重复序列)系统利用RNA指导的DNA结合和靶DNA的序列特异性裂解。指导RNA(gRNA)(例如，含有20个核苷酸)与基因组PAM(原型间隔区相邻基序)位点(NNG)和恒定RNA支架区上游的靶基因组DNA序列互补。Cas(CRISPR相关)蛋白与gRNA和靶DNA(gRNA与其结合)结合，并在PAM位点上游的指定位置引入双链断裂。参见，例如，Geurts等人(2009),Science 325:433；Mashimo等人(2010),PLoS ONE 5,e8870；Carbery等人(2010),Genetics 186:451-459；Tesson等人(2011),Nat.Biotech.29:695-696；Wiedenheft等人(2012),Nature482,331-338；Jinek等人(2012),Science 337:816-821；Mali等人(2013),Science 339:823-826；Cong等人(2013),Science 339:819-823。

在一个实施方案中，可使用序列特异性重组系统来实现靶基因(例如猪CD47)的条件性敲除。重组酶是一种识别位于间插多核苷酸侧翼的特定多核苷酸序列(重组酶识别位点)并催化相互链交换，从而导致间插多核苷酸倒位或切除的酶。参见，例如，Araki等人(1995),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:160-164。

在另一方面，可以使用例如非同源性末端接合以序列非特异性方式整合转基因。

在另一实施方案中，转基因(其编码例如重组酶或人CD47转基因)的条件性表达可以通过使用可被外源性刺激诱导或灭活的调控序列来实现。例如，条件性敲除等位基因的序列特异性重组系统可以通过例如使重组酶的活性可被化学物质(药物)诱导来调节。该化学物质可激活Cre重组酶基因的转录，或激活Cre重组酶蛋白向细胞核的转运。或者，可以通过不存在施用的药物而不是通过存在施用的药物来激活重组酶。调节诱导型系统(因此，例如诱导条件性敲除)的化学物质的非限制性实例包括四环素、他莫昔芬、RU-486、多西环素等。参见，例如，Nagy A(2000),Genesis,26:99-109。参见，例如，美国专利申请第15/558,789号中描述的条件性敲除和敲入构建体。

在其他实施方案中，内源性猪CD47在内源性基因座处被人CD47替代(即，基因敲入)。本领域已知的各种技术可用于产生人CD47敲入模型。例如，一个非限制性实例包括使用CRISPR/Cas9和体细胞核转移的组合。参见，例如，Ruan J等人Sci Rep.2015Sep 18；5:14253。

8.1.2.2表达盒

表达盒一般包含调控元件和转基因。调控元件可以是例如启动子。因此，例如，为了实现肾小球中人CD47转基因的表达，将该转基因置于肾小球特异性启动子的控制之下(参见第8.1.2.4节)。

8.1.2.3转基因

人CD47的氨基酸序列可以在以下NCBI参考序列(RefSeq)登录号下找到：NP_001768；NP_001369235.1；NP_942088；和XP_005247966.1。编码人CD47的核酸序列可以在以下NCBI RefSeq登录号下找到：NM_001777；NM_198793；XM_005247909.2和NM_001382306.1。在一些实施方案中，本文提供的转基因编码人CD47的已知剪接变体。在一些实施方案中，本文提供的转基因是cDNA和基因组DNA形式的杂交体，其提供从单个转基因构建体产生多重剪接形式(图4)。

其他物种中的CD47序列也是已知的。参见，例如，在以下NCBI RefSeq编号下的氨基酸序列：XP 516636(黑猩猩)；和XP 535729(狗)；本文考虑了包括全部或部分CD47细胞外结构域的多肽。参见，例如，Motegi等人(2003),EMBO J.,22:2634-2644，其描述了人CD47-Fc融合蛋白的构建。在本文提供的一些实施方案中，使用人CD47的可变剪接形式。参见，例如，Reinhold等人(1999),Journal of Cell Science,108:3419-3425。在某些实施方案中，用于本文所述构建体中的编码人CD47的转基因是下表1中列出的转基因。在某些实施方案中，编码人CD47的转基因包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列。在其他实施方案中，编码人CD47的转基因包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列。

在某些实施方案中，编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:3至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一的核苷酸序列。在某些实施方案中，编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:3至少70％同一的核苷酸序列。在某些实施方案中，编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:3至少75％同一的核苷酸序列。在某些实施方案中，编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:3至少80％同一的核苷酸序列。在某些实施方案中，编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:3至少85％同一的核苷酸序列。在某些实施方案中，编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:3至少90％同一的核苷酸序列。在某些实施方案中，编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:3至少95％同一的核苷酸序列。在某些实施方案中，编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:3至少98％同一的核苷酸序列。

在其他实施方案中，编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:4至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一的核苷酸序列。在某些实施方案中，编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:4至少70％同一的核苷酸序列。在某些实施方案中，编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:4至少75％同一的核苷酸序列。在某些实施方案中，编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:4至少80％同一的核苷酸序列。在某些实施方案中，编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:4至少85％同一的核苷酸序列。在某些实施方案中，编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:4至少90％同一的核苷酸序列。在某些实施方案中，编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:4至少95％同一的核苷酸序列。在某些实施方案中，编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:4至少98％同一的核苷酸序列。

在某些实施方案中，转基因编码SEQ ID NO:1的多肽。在某些实施方案中，转基因编码与SEQ ID NO:1至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一的多肽。在某些实施方案中，编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:1至少70％同一的核苷酸序列。在某些实施方案中，编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:1至少75％同一的核苷酸序列。在某些实施方案中，编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:1至少80％同一的核苷酸序列。在某些实施方案中，编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:1至少85％同一的核苷酸序列。在某些实施方案中，编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:1至少90％同一的核苷酸序列。在某些实施方案中，编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:1至少95％同一的核苷酸序列。在某些实施方案中，编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:1至少98％同一的核苷酸序列。

在其他实施方案中，转基因编码SEQ ID NO:2的多肽。在某些实施方案中，转基因编码与SEQ ID NO:2至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一的多肽。在某些实施方案中，编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:2至少70％同一的核苷酸序列。在某些实施方案中，编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:2至少75％同一的核苷酸序列。在某些实施方案中，编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:2至少80％同一的核苷酸序列。在某些实施方案中，编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:2至少85％同一的核苷酸序列。在某些实施方案中，编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:2至少90％同一的核苷酸序列。在某些实施方案中，编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:2至少95％同一的核苷酸序列。在某些实施方案中，编码人CD47的转基因包含与SEQ ID NO:2至少98％同一的核苷酸序列。

在一个实施方案中，将人CD47转基因插入转基因供体动物中除猪CD47基因的天然基因座外的基因座中。

8.1.2.4调控元件

在某些实施方案中，人CD47转基因处于肾小球特异性启动子的控制之下。在一些实施方案中，肾小球特异性启动子对一种或多种肾小球细胞类型具有特异性。肾小球细胞类型的实例包括足细胞、系膜细胞和肾小球内皮细胞。在某些实施方案中，肾小球特异性启动子是足细胞特异性启动子。在某些实施方案中，肾小球特异性启动子是肾病蛋白启动子。在某些实施方案中，肾小球特异性启动子是足蛋白启动子。在某些实施方案中，肾小球特异性启动子是FGF1启动子。在某些实施方案中，肾小球特异性启动子是系膜细胞特异性启动子。在某些实施方案中，肾小球特异性启动子是内皮细胞特异性启动子。在某些实施方案中，肾小球特异性启动子是CD31启动子。在某些实施方案中，肾小球特异性启动子是vWF启动子。

启动子可控制不止一种细胞类型中的基因表达。在某些实施方案中，启动子控制肾小球细胞中的基因表达。在某些实施方案中，启动子控制肾小球细胞类型足细胞中的基因表达。

在某些实施方案中，可以分析在肾小球中表达的任何基因的启动子，并且赋予在肾小球中表达的调控元件可以与本文提供的方法和组合物一起使用。一般来说，可以通过将报告基因(诸如荧光蛋白)重组置于目标基因片段的调控下来进行这种启动子分析。接着可以对所得构建体进行检查以获知报告基因在肾小球中的表达。

在某些实施方案中，启动子可以是诱导型的。具体地，启动子可以是诱导型的和组织特异性的。许多诱导型启动子和基因表达系统在本领域中是已知的。例如，启动子可以由化学物质诱导，例如由四环素、他莫昔芬或cumate诱导。基因表达还可以通过蛋白质-蛋白质相互作用(例如，FKBP12和mTOR之间的相互作用，它由雷帕霉素控制)来控制。参见，例如，Kallunki等人(2019),Cells 8:796。

8.1.3.测量人CD47水平的方法

在某些实施方案中，可以如下文第8.1.3.1节中讨论的在RNA(例如，mRNA水平)上测定人CD47表达的水平。在某些实施方案中，可以如第8.1.3.2节中讨论的在蛋白质水平上测定人CD47表达的水平。

在某些实施方案中，本文提供的方法包括检测和测量供体小型猪的肾小球组织与肾小管组织中的差异基因表达的方法。在某些实施方案中，本文提供的方法包括检测和测量供体小型猪的肾小球组织与肾小管组织中的差异人CD47 mRNA水平的方法。在其他实施方案中，本文提供的方法包括检测和测量供体小型猪的肾小球组织与肾小管组织中的差异人CD47蛋白质水平的方法。

组织特异性表达可以通过以下方式来测定：在测量人CD47蛋白质或mRNA水平之前物理分离目标组织(例如，通过肾活检或通过对例如肾小球特异性细胞的基于流式细胞术的分离)，以及应用测量人CD47蛋白质或mRNA水平的方法，诸如下文的体外方法。或者，可使用成像技术诸如荧光显微术来可视化和测量特定组织(例如，肾小球或肾小管)中的人CD47蛋白质表达。可使用单细胞qPCR测量特定组织中的人CD47基因表达。

在一些实施方案中，本文提供的方法包括(i)对供体小型猪进行肾活检；(ii)从供体小型猪的肾脏中分离肾小球；和/或(iii)从供体小型猪的肾脏中分离肾小管。在其他实施方案中，本文提供的方法包括(i)对供体小型猪进行肾活检；以及(ii)将供体小型猪的肾脏解剖至单个或一组肾单位的水平。在一些实施方案中，组合进行上述方法。

8.1.3.1检测样本中的mRNA水平的方法

在某些实施方案中，通过本文所述的技术在猪肾脏的肾小球中检测到人CD47的mRNA但在肾小管中未检测到。在一些实施方案中，如使用本文所述的技术所检测的，肾脏的肾小球的人CD47 mRNA水平高于肾脏的肾小管中的人CD47 mRNA水平。

检测或定量mRNA水平的若干方法在本领域中是已知的。示例性方法包括但不限于RNA印迹、核糖核酸酶保护测定、基于PCR的方法(例如，定量PCR)、RNA测序、

分析等。可以使用人CD47的mRNA序列来制备与mRNA序列至少部分互补的探针。接着可以使用探针利用任何合适的测定诸如基于PCR的方法、RNA印迹、试纸条测定、TaqMan^TM测定等来检测样本中的mRNA。

在其他实施方案中，可以制备用于检查生物样本中的人CD47表达的核酸测定。测定通常包含固体支持物和至少一种与支持物接触的核酸，其中核酸对应于mRNA的至少一部分。该测定还可以具有检测样本中的mRNA表达改变的方法。测定方法可以根据所需mRNA信息的类型而变化。示例性方法包括但不限于RNA印迹和基于PCR的方法(例如，qRT-PCR)。诸如qRT-PCR的方法还可以准确定量样本中mRNA的量。

典型的mRNA测定方法可以包括以下步骤：(1)获得表面结合的受试探针；(2)在足以提供特异性结合的条件下，将mRNA群体与表面结合的探针杂交；(3)进行杂交后洗涤，以去除未特异性结合表面结合探针的核酸；以及(4)检测杂交后的mRNA。在这些步骤中每一步使用的试剂及其使用条件可根据具体应用而变化。

还可以使用其他方法诸如基于PCR的方法来检测人CD47的表达。PCR方法的实例可见于美国专利第6,927,024号中，所述专利以引用的方式整体并入本文。RT-PCR方法的实例可见于美国专利第7,122,799号中，所述专利以引用的方式整体并入本文。荧光原位PCR的方法描述于美国专利第7,186,507号中，所述专利以引用的方式整体并入本文。

在一些实施方案中，可以使用定量逆转录PCR(qRT-PCR)来进行RNA靶标的检测和定量(Bustin等人,Clin.Sci.2005,109:365-379)。在一些实施方案中，在基于细胞的测定期间可以使用基于qRT-PCR的测定测量mRNA水平。基于qRT-PCR的方法的实例可见于例如美国专利第7,101,663号中，所述专利以引用的方式整体并入本文。

与常规逆转录酶PCR和通过琼脂糖凝胶的分析相比，qRT-PCR给出了定量结果。qRT-PCR的另一个优点是使用相对简单和方便。用于qRT-PCR的仪器(诸如AppliedBiosystems 7500)可在市场上买到，试剂(诸如

Sequence DetectionChemistry)也是如此。例如，可以按照制造商的说明使用/>

Gene ExpressionAssays。这些试剂盒是预先配制的基因表达测定，用于快速可靠地检测和定量人、小鼠和大鼠的mRNA转录物。例如，示例性qRT-PCR程序是50℃2分钟，95℃10分钟，40个95℃15秒循环，接着是60℃1分钟。

8.1.3.2检测样本中的多肽或蛋白质水平的方法

在本文提供的某些实施方案中，通过本文所述的技术在猪肾脏的肾小球中检测到人CD47多肽或蛋白质但在肾小管中未检测到。在一些实施方案中，如使用本文所述的技术所检测的，肾脏的肾小球的人CD47多肽或蛋白质水平高于肾脏的肾小管中的人CD47多肽或蛋白质水平。

可以使用若干蛋白质检测和定量方法来测量人CD47的水平。可以使用任何合适的蛋白质定量方法。在一些实施方案中，使用基于抗体的方法。可以使用的示例性方法包括但不限于免疫印迹(蛋白质印迹)、ELISA、免疫组织化学、免疫荧光、流式细胞术、细胞术珠阵列、质谱法等。常用的ELISA有若干类型，包括直接ELISA、间接ELISA和夹心ELISA。

8.1.4.其他基因修饰

本文提供的重组小型猪(例如，本文所述的移植方法中使用的第一小型猪和/或第二小型猪)可经另外的方式修饰以表达人CD47。这种另外的修饰包括，例如，α-1,3-半乳糖基转移酶的敲除和细胞因子受体的修饰。在一些实施方案中，本文提供的小型猪不表达α-1,3-半乳糖基转移酶。在一些实施方案中，本文提供的小型猪另外表达人CD55、人CD46、人CD59、IL-3R或它们的一些组合。参见，例如，Nomura等人(2020),Xenotransplantation.2020；27:e12549；美国专利第9,883,939号和美国专利第9,980,471B2号。

参照第8.2节中的移植方法，此类另外的基因修饰可以与作为肾脏移植供体的小型猪结合使用，并且此类另外的修饰也可以与作为造血干细胞(例如，用于骨髓移植)的供体的小型猪结合使用。

8.2移植方法

可以在移植方法(例如，异种移植)中使用转基因供体小型猪的细胞、组织、器官或体液。

可以给接受者移植来自一只或两只动物的第一和第二移植物。在一些实施方案中，在移植来自供体动物的第一移植物后至少7天移植从供体动物收获的第二移植物。在一些实施方案中，在移植来自供体动物的第一移植物后至少14天移植从供体动物收获的第二移植物。在一些实施方案中，在移植来自供体动物的第一移植物后至少21天移植从供体动物收获的第二移植物。在一些实施方案中，在移植来自供体动物的第一移植物后至少28天移植从供体动物收获的第二移植物。在一些实施方案中，在移植来自供体动物的第一移植物后至少35天移植从供体动物收获的第二移植物。在一些实施方案中，在移植来自供体动物的第一移植物后至少49天移植从供体动物收获的第二移植物。在一些实施方案中，在移植来自供体动物的第一移植物后至少54天移植从供体动物收获的第二移植物。

在一个实施方案中，本文提供的移植方法包括移植来自供体动物的具有第8.1节中描述的基因修饰的肾脏。在某些方面，本文提供的移植方法包括诱导接受者耐受的步骤，例如通过诱导混合嵌合来诱导耐受。“混合嵌合”通常被理解为描述一种状态，其中同种异体造血干细胞的接受者的淋巴造血系统包含宿主细胞和供体细胞的混合物。这种状态通常通过骨髓或动员后外周血干细胞移植获得。混合嵌合可能是短暂的或稳定的。参见，例如，Sachs等人(2014),Cold Spring Harb Perspect Med 2014；4:a015529；美国专利第6,296,846号和美国专利第6,306,651号。还可以通过同时移植来自供体动物的胸腺组织来实现混合嵌合。参见，例如，国际专利申请公布第WO2020/061272号。

在一个实施方案中，本公开包括将来自第二供体动物的肾脏移植到人接受者中的方法，其中所述方法包括：(a)将来自第一供体动物的造血干细胞移植给接受者；以及(b)将来自第二供体动物的肾脏移植给接受者，其中第一供体动物在造血干细胞中表达人CD47，并且第二供体动物在肾脏的肾小球中选择性表达人CD47。在具体实施方案中，第一供体动物是小型猪。在具体实施方案中，第二供体动物是小型猪。在具体实施方案中，第一供体动物和第二供体动物都是小型猪。在其他具体实施方案中，第二供体动物是小型猪而第一供体动物不是小型猪。在一些实施方案中，移植方法任选地包括移植来自第三供体动物的胸腺组织。

在一个实施方案中，本公开包括将来自第二供体动物的肾脏移植到人接受者中的方法，其中所述方法包括：(a)将来自第一供体动物的造血干细胞和胸腺组织移植给接受者；以及(b)将来自第二供体动物的肾脏移植给接受者，其中第一供体动物在造血干细胞中表达人CD47，并且第二供体动物在肾脏的肾小球中选择性表达人CD47。在具体实施方案中，第一供体动物是小型猪。在具体实施方案中，第二供体动物是小型猪。在具体实施方案中，第一供体动物和第二供体动物都是小型猪。在其他具体实施方案中，第二供体动物是小型猪而第一供体动物不是小型猪。在一些实施方案中，来自第一供体动物的胸腺组织表达人CD47。胸腺组织的实例包括血管化胸腺组织和胸腺肾(参见第8.2.1.2节)。在一个实施方案中，本公开包括将来自小型猪的肾脏移植到人接受者中的方法，其中所述方法包括：(a)将来自第一小型猪的造血干细胞移植给接受者；以及(b)将来自第二小型猪的肾脏移植给接受者，其中第一猪在造血干细胞中表达人CD47，并且第二猪在肾脏的肾小球中选择性表达人CD47。第一猪还可能在除造血干细胞外的组织中表达人CD47。

在所述方法的某些实施方案中，移植来自第二小型猪的肾脏的所述第二步骤在移植来自第一小型猪的造血干细胞的第一步骤后至少28天进行。本公开包括Watanabe等人,Xenotransplantation,2020,27:e12552以及Nomura等人,Xenotransplantation,2020,27:e12549中描述的用于在供体细胞中转基因表达人CD47的方法和技术。

造血干细胞可以是任何类型的细胞。在某些实施方案中，细胞是造血干细胞、淋巴细胞或骨髓细胞。在一些实施方案中，将来自第一供体动物(例如，小型猪)的混合造血细胞群体移植到接受者中。在某些实施方案中，猪造血干细胞获自骨髓、外周血、脐带血、胎肝细胞或胚胎干细胞。可以通过本领域已知的任何合适的方法，例如通过下文第8.2.1.3节中描述的方法移植造血干细胞。在一些实施方案中，通过骨髓内移植将造血干细胞移植给接受者，例如，如Watanabe等人(2019),Xenotransplantation.2019；00:e12552中所述。

在一些实施方案中，造血干细胞和供体肾脏取自同一供体动物。在造血干细胞和肾脏取自同一供体的一些实施方案中，供体造血干细胞和供体肾脏的肾小球表达人CD47。在造血干细胞和肾脏取自同一供体的一些实施方案中，供体造血干细胞和供体肾脏的肾小球以高于肾小管的水平表达人CD47。在造血干细胞和肾脏取自同一供体的一些实施方案中，供体造血干细胞和供体肾脏的肾小球以高于供体动物任何其他组织的水平表达人CD47。

在一些实施方案中，造血干细胞和供体肾脏取自两只不同但基因匹配的供体动物。如本文所用，“基因匹配”可以指基因，例如MHC基因之间的同源性。在一些实施方案中，基因匹配的供体动物的MHC完美匹配。在一些实施方案中，造血干细胞和供体肾脏取自同一高度近交群的两只不同动物。

8.2.1.另外的治疗

另外的治疗可以在本文所述的移植方法之前、同时或之后使用。另外的治疗一般意图提高接受者对异种移植物的耐受，但也考虑其他治疗。因此，本文提供的移植方法可以包括施用一种或多种另外的治疗，例如抑制T细胞、阻断补体或以其他方式下调接受者对移植物的免疫应答的治疗。

在一些实施方案中，接受者是胸腺切除和/或脾切除的。

在一些实施方案中，接受者接受放射，例如全身辐照。在具体实施方案中，接受者接受5-10Gy或10-15Gy的辐照。在一些实施方案中，可以使用胸腺辐照。在一些实施方案中，向接受者施用低剂量放射(例如，100拉德和400拉德之间的亚致死剂量全身放射)。还可以使用局部胸腺放射。

通过本文所述的方法进行移植的受试者的血液可能含有靶向异种移植物的抗体。可以通过器官灌注和/或诱导耐受的骨髓移植来消除此类抗体。可以通过供体物种肝脏的血液灌流从接受者血液中吸收天然抗体。类似地，接受者体内可能存在产生抗体的细胞。可以通过例如辐照或药物治疗消除此类产生抗体的细胞。在某些实施方案中，可对用于移植的移植物、细胞、组织或器官进行基因修饰，使得它们不被宿主(例如，α-1,3-半乳糖基转移酶缺陷型细胞)中存在的抗体识别，参见第8.1.4节。

在一些实施方案中，施用供体基质组织。其可从胎肝、胸腺和/或胎脾中获得，可以植入接受者中，例如肾囊中。

8.2.1.1免疫抑制疗法

在一些实施方案中，根据本文所述的方法接受异种移植物的患者接受免疫抑制疗法。免疫抑制疗法可以是用以减少移植排斥和/或改善异种移植的结果的任何获FDA批准的治疗。免疫抑制疗法的非限制性实例包括钙调磷酸酶抑制剂(例如，他克莫司或环孢菌素)、抗增殖剂(例如，抗代谢物诸如麦考酚酯、6-巯基嘌呤或其前药硫唑嘌呤)、哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)抑制剂(例如，西罗莫司、雷帕霉素)、类固醇(例如，强的松)、细胞周期抑制剂(硫唑嘌呤或吗替麦考酚酯)、淋巴细胞耗竭剂(例如，抗胸腺细胞球蛋白或抗体，诸如阿仑单抗(alemtuzumab)、西利珠单抗(siplizumab)或巴利昔单抗(basiliximab))和共刺激阻断剂(例如，belatacept)。参见，例如，Chung等人(2020).,Ann Transl Med.Mar；8(6):409；van der Mark等人(2020),Eur Respir Rev；29:190132以及Benvenuto等人(2018),JThorac Dis 10:3141-3155。在一些实施方案中，免疫抑制疗法包括钙调磷酸酶抑制剂。在一些实施方案中，免疫抑制疗法包括抗增殖剂。在一些实施方案中，免疫抑制疗法包括mTOR抑制剂。在一些实施方案中，免疫抑制疗法包括类固醇。在一些实施方案中，免疫抑制疗法包括淋巴细胞耗竭剂。在一些实施方案中，免疫抑制疗法包括共刺激阻断剂。

免疫抑制疗法可以作为诱导疗法(在围手术期或在手术后立即)作为维持剂量或用于急性排斥施用。诱导疗法通常包括巴利昔单抗、抗胸腺细胞球蛋白或阿仑单抗。免疫抑制疗法也可以作为维持疗法施用，通常需要维持疗法在接受者的生命中持续。维持免疫抑制疗法通常包括钙调磷酸酶抑制剂(他克莫司或环孢菌素)、抗增殖剂(麦考酚酯或硫唑嘌呤)和皮质类固醇。对急性排斥的免疫抑制疗法通常包括胸腺球蛋白或麦考酚酯。参见，例如，Chung等人(2020),Ann Transl Med.Mar；8:409以及Benvenuto等人(2018)J ThoracDis 10:3141-3155。

免疫抑制剂的非限制性实例包括(1)抗代谢物，诸如嘌呤合成抑制剂(诸如肌苷一磷酸脱氢酶(IMPDH)抑制剂，例如硫唑嘌呤、麦考酚酯和吗替麦考酚酯)、嘧啶合成抑制剂(例如，来氟米特和特立氟胺)和抗叶酸剂(例如甲氨蝶呤)；(2)钙调磷酸酶抑制剂，诸如他克莫司、环孢菌素A、吡美莫司和伏环孢素(voclosporin)；(3)TNF-α抑制剂，诸如沙利度胺(thalidomide)和来那度胺(lenalidomide)；(4)IL-1受体拮抗剂，诸如阿那白滞素(anakinra)；(5)哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)抑制剂，诸如雷帕霉素(西罗莫司)、地福莫司(deforolimus)、依维莫司、替西罗莫司(temsirolimus)、佐他莫司(zotarolimus)和优美莫司(biolimus)A9；(6)皮质类固醇，诸如强的松；以及(7)针对多种细胞或血清靶标中的任何一种的抗体(包括抗淋巴细胞球蛋白和抗胸腺细胞球蛋白)。

非限制性的示例性细胞靶标及其各自的抑制剂化合物包括但不限于补体组分5(例如依库丽单抗(eculizumab))；肿瘤坏死因子(TNF)(例如，英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、阿非莫单抗(afelimomab)和戈利木单抗(golimumab))；IL-5(例如美泊利单抗(mepolizumab))；IgE(例如奥马珠单抗(omalizumab))；BAYX(例如，奈瑞莫单抗(nerelimomab))；干扰素(例如，法拉莫单抗(faralimomab))；IL-6(例如，艾西莫单抗(elsilimomab))；IL-12和IL-13(例如，来瑞组单抗(lebrikizumab)和优特克单抗(ustekinumab))；CD3(例如，莫罗单抗(muromonab)-CD3、奥昔组单抗(otelixizumab)、替利组单抗(teplizumab)、维西珠单抗(visilizumab))；CD4(例如，克立昔单抗(clenoliximab)、凯利昔单抗(keliximab)和扎木单抗(zanolimumab))；CDI la(例如，依法珠单抗(efalizumab))；CD18(例如，厄利珠单抗(erlizumab))；CD20(例如，阿夫土珠单抗(afutuzumab)、奥克莱珠单抗(ocrelizumab)、帕考珠单抗(pascolizumab))；CD23(例如，鲁昔单抗(lumiliximab))；CD40(例如，替奈昔单抗(teneliximab)、托拉珠单抗(toralizumab))；CD62L/L-选择素(例如，阿塞珠单抗(aselizumab))；CD80(例如，加利昔单抗(galiximab))；CD147/basigin(例如，加维莫单抗(gavilimomab))；CD154(例如，卢利珠单抗(ruplizumab))；BLyS(例如，贝利木单抗(belimumab))；CTLA-4(例如，伊匹单抗(ipilimumab)、曲美木单抗(tremelimumab))；CAT(例如，柏替木单抗(bertilimumab)、乐德木单抗(lerdelimumab)、美替木单抗(metelimumab))；整联蛋白(例如,那他珠单抗(natalizumab))；IL-6受体(例如，托珠单抗(tocilizumab))；LFA-1(例如，奥度莫单抗(odulimomab))；和IL-2受体/CD25(例如，巴利昔单抗、达克珠单抗(daclizumab)、伊诺莫单抗(inolimomab))。

8.2.1.2血管化胸腺移植

在一些实施方案中，根据本文所述的方法治疗的患者接受血管化胸腺移植。参见，例如，国际专利申请公布第PCT WO2020061272A1号。胸腺组织可以通过植入自体肾囊下进行血管重建来制备用于移植。血管化胸腺移植物可以是例如“胸腺肾”，即通过将来自供体的胸腺组织移植到供体自己的肾囊下制备的肾脏。参见，例如，Yamad a等人,Transplantation 68(11):1684-1692(1999)；Yamada等人,J Immunol 164:3079-3086(2000)以及Yamada等人,Transplantation 76(3):530-536(2003)。血管化胸腺移植物也可以是与肾脏分开移植的血管化胸腺叶。参见，例如，LaMattina等人,Transplantation 73(5):826-831(200)以及Kamano等人,Proc Natl Acad Sci U S A 101(11):3827-3832(2004)。

8.2.1.3造血干细胞移植

通过提供来自供体物种的造血基质环境，可以增强跨越不同物种屏障的干细胞植入和造血作用。基质基体提供造血干细胞与其基质环境之间的相互作用所需的物种特异性因子，诸如造血生长因子、粘附分子以及它们的配体。

由于肝脏是胎儿造血的主要部位，胎肝也可以替代骨髓作为造血干细胞的来源。胸腺是T细胞成熟的主要部位。每个器官都包含一个器官特异性基质基体，可以支持植入宿主的各个未分化干细胞的分化。可以在移植前对胸腺基质组织进行辐照。作为植入的替代或辅助，胎肝细胞可以呈液体悬浮液施用。

可以将供体的骨髓细胞(BMC)或造血干细胞的另一种来源例如胎肝悬浮液注射到接受者中以诱导混合嵌合。造血干细胞可以取自任何来源，例如取自骨髓或外周血干细胞。参见，例如，Sachs等人(2014),Cold Spring Harb Perspect Med 2014；4:a015529。供体BMC归巢至接受者的适当部位，并与其余的宿主细胞一起连续生长并增殖，形成嵌合淋巴造血细胞群体。通过这个过程，新形成的B细胞(及其产生的抗体)暴露于供体抗原，因此移植物将被识别为自身。在已实现造血干细胞(例如，骨髓细胞)植入的动物中，还在T细胞水平上观察到对供体的耐受。胸腺组织(例如，血管化胸腺或胸腺肾)的移植可以通过产生对异种移植物无反应的T细胞库来诱导T细胞耐受。异种供体的使用使得使用来自同一动物或基因匹配动物的骨髓细胞和器官成为可能。对于骨髓移植，可以向接受者施用低剂量放射。在一些情况下，接受者可以用耗竭补体的剂，诸如眼镜蛇毒因子(例如，在第-1天)来治疗。

8.2.1.4复合胰岛-肾脏移植物

如本文所提供，来自基因修饰的猪的肾脏(其中人CD47在肾脏的肾小球中的表达水平高于在肾脏的肾小管中的表达水平)可用作异种移植物，用于异种移植到人患者中。在一些实施方案中，异种移植物可以包括肾脏(诸如第8.1节中描述的肾脏)和朗格汉斯岛细胞的组合。例如，胰岛细胞可以与本公开的肾脏组合以产生复合胰岛-肾脏移植物。

复合胰岛-肾脏移植物的产生可以通过本领域已知的任何方法进行。举例来说，可以进行部分胰腺切除术并分离胰岛细胞。此后，胰岛细胞可与肾脏组合形成复合胰岛-肾脏细胞，其接着可用于异种移植。参见，例如，Pomposelli等人,Front Endocrinol(Lausanne).5月12日,12:632605(2021)。

因此，在具体实施方案中，异种移植物是来自非人物种的异种移植物，其中异种移植物包含：(a)肾脏；和(b)朗格汉斯岛细胞，其中肾脏包含肾小球，肾小球的人CD47表达水平高于肾脏的肾小管中的人CD47表达水平。

8.2.2.治疗效果

在一些实施方案中，本文所述的移植方法导致蛋白尿的风险或强度降低，参见下文第8.2.4节。在一些实施方案中，与其中供体肾脏的肾小球的人CD47表达水平不高于供体肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的移植方法相比，本文所述的移植方法导致对供体肾脏的排斥反应的发生率降低。

在一些实施方案中，与其中供体肾脏的肾小球的人CD47表达水平不高于供体肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的供体肾脏的接受者相比，所述方法导致向接受者施用减少(例如，施用减少约10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％或超过90％)的免疫抑制疗法。在具体实施方案中，与通常施用于可比接受者(例如，相同性别和可比年龄、身高和/或体重的人)的免疫抑制疗法的量相比，所述方法导致向接受者施用减少(例如，施用减少约10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％或超过90％)的免疫抑制疗法，其中所述可比接受者已经接受了其中供体肾脏的肾小球的人CD47表达水平不高于供体肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的供体肾脏。在其他实施方案中，与接受者在接受其中供体肾脏的肾小球的人CD47表达水平不高于供体肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的先前供体肾脏后所需的免疫抑制疗法的量相比，所述方法导致向所述接受者施用减少(例如，施用减少约10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％或超过90％)的免疫抑制疗法。在一些实施方案中，所述方法导致接受者不需要进一步施用免疫抑制疗法，例如下文第8.2.1.1节中描述的免疫抑制疗法。

在一些实施方案中，所述方法导致免疫抑制疗法减少约10％。在一些实施方案中，所述方法导致免疫抑制疗法减少约10％至约20％。在一些实施方案中，所述方法导致免疫抑制疗法减少约20％至约30％。在一些实施方案中，所述方法导致免疫抑制疗法减少约30％至约40％。在一些实施方案中，所述方法导致免疫抑制疗法减少约40％至约50％。在一些实施方案中，所述方法导致免疫抑制疗法减少约50％至约60％。在一些实施方案中，所述方法导致免疫抑制疗法减少约60％至约70％。在一些实施方案中，所述方法导致免疫抑制疗法减少约70％至约80％。在一些实施方案中，所述方法导致免疫抑制疗法减少约80％至约90％。在一些实施方案中，所述方法导致免疫抑制疗法减少超过约90％。

在一些实施方案中，与其中供体肾脏的肾小球的人CD47表达水平不高于供体肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的供体肾脏相比，所述方法导致供体肾脏的存活时间延长。在一些实施方案中，与移植到可比接受者(例如，相同性别和可比年龄、身高和/或体重的患者)中的其中供体肾脏的肾小球的人CD47表达水平不高于供体肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的供体肾脏相比，所述方法导致供体肾脏的存活时间延长(例如，存活时间延长约10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-75％、75％-100％、100％-200％、200％-300％或超过300％；或延长1-2年、2-3年、3-4年、4-5年、5-6年、6-8年、8-10年、10-15年或15-20年)。在一些实施方案中，与所述接受者先前已接受的供体肾脏的存活时间相比，所述方法导致供体肾脏的存活时间延长(例如，存活时间延长约10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-75％、75％-100％、100％-200％、200％-300％或超过300％；或延长1-2年、2-3年、3-4年、4-5年、5-6年、6-8年、8-10年、10-15年或15-20年)，其中供体肾脏的肾小球的人CD47表达水平不高于供体肾脏的肾小管中的人CD47表达水平。

在一些实施方案中，与其中供体肾脏的肾小球的人CD47表达水平不高于供体肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的供体肾脏相比，供体肾脏的存活时间延长约10％。在一些实施方案中，存活时间延长约10％-20％。在一些实施方案中，存活时间延长约20％-30％。在一些实施方案中，存活时间延长约30％-40％，在一些实施方案中，存活时间延长约40％-50％。在一些实施方案中，存活时间延长约50％-75％。在一些实施方案中，存活时间延长约75％-100％。在一些实施方案中，存活时间延长约100％-200％。在一些实施方案中，存活时间延长约200％-300％。在一些实施方案中，存活时间延长超过约300％。

在一些实施方案中，与其中供体肾脏的肾小球的人CD47表达水平不高于供体肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的供体肾脏相比，供体肾脏的存活时间延长1-2年。在一些实施方案中，供体肾脏的存活时间延长2-3年。在一些实施方案中，供体肾脏的存活时间延长3-4年。在一些实施方案中，供体肾脏的存活时间延长4-5年。在一些实施方案中，供体肾脏的存活时间延长5-6年。在一些实施方案中，供体肾脏的存活时间延长6-8年。在一些实施方案中，供体肾脏的存活时间延长8-10年。在一些实施方案中，供体肾脏的存活时间延长10-15年。在一些实施方案中，供体肾脏的存活时间延长15-20年。

在一些实施方案中，与其中供体肾脏的肾小球的人CD47表达水平不高于供体肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的供体肾脏的接受者相比，所述方法导致接受者的生活质量更佳。在其他实施方案中，与可比接受者(例如，相同性别和可比年龄、身高和/或体重的人)相比，所述方法导致接受者的生活质量更佳，其中所述可比接受者已经接受了其中供体肾脏的肾小球的人CD47表达水平不高于供体肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的供体肾脏。在其他实施方案中，与在先前移植其中供体肾脏的肾小球的人CD47表达水平不高于供体肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的供体肾脏之后接受者经历的生活质量相比，所述方法导致所述接受者的生活质量更佳。

在一些实施方案中，与其中供体肾脏的肾小球的人CD47表达水平不高于供体肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的供体肾脏的接受者相比，所述方法导致移植接受者的存活时间更长(例如，长10％-20％、20％-30％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％或90％-100％；或长2至3倍、3至5倍、5至7倍、7至10倍或10至15倍)。在其他实施方案中，与可比接受者(例如，相同性别和可比年龄、身高和/或体重的人)的存活时间相比，所述方法导致移植接受者的存活时间更长(例如，长10％-20％、20％-30％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％或90％-100％；或长2至3倍、3至5倍、5至7倍、7至10倍或10至15倍)，其中所述可比接受者已经接受了其中供体肾脏的肾小球的人CD47表达水平不高于供体肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的供体肾脏。

在一些实施方案中，与其中供体肾脏的肾小球的人CD47表达水平不高于供体肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的供体肾脏的接受者相比，所述方法导致移植接受者的存活时间长10％-20％。在一些实施方案中，所述方法导致移植接受者的存活时间长20％-30％。在一些实施方案中，所述方法导致移植接受者的存活时间长30％-40％。在一些实施方案中，所述方法导致移植接受者的存活时间长50％-60％。在一些实施方案中，所述方法导致移植接受者的存活时间长60％-70％。在一些实施方案中，所述方法导致移植接受者的存活时间长70％-80％。在一些实施方案中，所述方法导致移植接受者的存活时间长80％-90％。在一些实施方案中，所述方法导致移植接受者的存活时间长90％-100％。

在一些实施方案中，与其中供体肾脏的肾小球的人CD47表达水平不高于供体肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的供体肾脏的接受者相比，所述方法导致移植接受者的存活时间长2至3倍。在一些实施方案中，所述方法导致移植接受者的存活时间长3至5倍。在一些实施方案中，所述方法导致移植接受者的存活时间长5至7倍。在一些实施方案中，所述方法导致移植接受者的存活时间长7至10倍。在一些实施方案中，所述方法导致移植接受者的存活时间长10至15倍。

8.2.3.患者群体

在优选的实施方案中，根据本文所述的方法治疗的患者(例如，一个或多个供体移植物的接受者)是人患者。如本文所用，术语“受试者”和“患者”可互换使用并且包括任何人或非人哺乳动物。非限制性实例包括人、马、猪、牛、家鼠、鼠、犬和猫物种的成员。在一些实施方案中，受试者是非人灵长类动物。在一些实施方案中，受试者是人。在具体实施方案中，受试者是人类成人。在一些实施方案中，受试者是人类儿童。在具体实施方案中，受试者是人并且接受来自猪供体的一个或多个供体移植物。在其他具体实施方案中，受试者是非人灵长类动物(例如，狒狒、食蟹猴或恒河猴)并且接受来自猪供体的一个或多个移植物。

在一方面，根据本文所述的方法治疗的患者需要肾脏移植。由于肾衰竭或供体肾脏排斥，患者可能需要肾脏移植。肾衰竭可能有多种原因，包括但不限于高血压(highblood pressure/hypertension)、身体损伤、糖尿病、肾病(多囊性肾病、肾小球疾病)和自身免疫性疾病(诸如狼疮)。肾衰竭可能是急性的或慢性的。肾衰竭也可以通过实验室检查诸如肾小球滤过率、血尿素氮和血清肌酐、影像学检查(超声波、计算机断层扫描)或肾活检来诊断。

在一些实施方案中，根据本文所述的方法治疗的患者患有1期肾病。在一些实施方案中，根据本文所述的方法治疗的患者患有2期肾病。在一些实施方案中，根据本文所述的方法治疗的患者患有3期肾病。在一些实施方案中，根据本文所述的方法治疗的患者患有4期肾病。在一些实施方案中，根据本文所述的方法治疗的患者患有5期肾病。

在一些实施方案中，根据本文所述的方法治疗的患者具有约90或更高的肾小球滤过率(GFR)。在一些实施方案中，根据本文所述的方法治疗的患者具有约60-90的GFR。在一些实施方案中，根据本文所述的方法治疗的患者具有约30-60的GFR。在一些实施方案中，根据本文所述的方法治疗的患者具有约15-30的GFR。在一些实施方案中，根据本文所述的方法治疗的患者具有约15或更低的GFR。

8.2.4.预防蛋白尿或减轻其严重程度的方法

蛋白尿的特征是尿液中蛋白质水平升高，可能是肾功能下降和潜在肾衰竭的症状。它通常由肾小球疾病引起，肾小球疾病导致尿液中白蛋白和免疫球蛋白缺失。蛋白尿也可能由肾小管疾病和其他肾脏疾病以及某些药物引起。参见例如，Carroll和Temte,Am FamPhysician62(6):1333-1340(2000)以及BMJ Best Practice:Evaluation of Proteinuria[在线][检索于2020年8月26日]，检索自互联网：<URL:https://bestpractice.bmj.com/topics/en-us/875>。此外，蛋白尿通常发生在肾脏移植后。移植后一年的每天500mg或更少(例如，每天200-500mg)的蛋白尿与不良结果(例如，移植物排斥)相关。参见，例如，Diena等人(2019),BMC Nephrology 20:443以及Kang等人(2009)J Korean Med Sci.24(增刊1):S129-34。

每天超过150mg的蛋白质排泄通常被用作蛋白尿的诊断。试纸条分析通常用于测量尿液中的蛋白质浓度。这是一种半定量方法，其结果表示为阴性、痕量、1+、2+、3+或4+。参见例如，Carroll和Temte,Am Fam Physician 62(6):1333-1340(2000)。可测量总蛋白水平或仅测量白蛋白水平以提供定量检查。结果可以表示为总蛋白或白蛋白水平，或表示为白蛋白与肌酸的比率或蛋白质与肌酸的比率。持续三个月以上的蛋白尿是慢性肾病的诊断标准。相反，蛋白尿减少被用作慢性肾病管理的替代指标。参见，例如，BMJ Best Practice:Evaluation of Proteinuria[在线][检索于2020年8月26日]，检索自互联网：<URL:https://bestpractice.bmj.com/topics/en-us/875>。

在一方面，本文所述的移植方法(诸如上文第8.2节中描述的移植来自第一供体猪的骨髓来自第二供体猪的肾脏的方法，或移植来自一个供体猪的骨髓和肾脏的方法)导致蛋白尿的风险、严重程度或持续时间降低。在特定实施方案中，其中供体肾脏的肾小球的人CD47表达水平高于供体肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的本文所述的移植方法(例如，上文第8.2节中描述的方法)导致蛋白尿的严重程度降低。在特定实施方案中，其中供体肾脏的肾小球的人CD47表达水平高于供体肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的本文所述的移植方法(例如，上文第8.2节中描述的方法)导致蛋白尿的持续时间降低。在特定实施方案中，其中供体肾脏的肾小球的人CD47表达水平高于供体肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的本文所述的移植方法(例如，上文第8.2节中描述的方法)导致治疗群体中蛋白尿的风险降低。例如，与在接受其中供体肾脏的肾小球的人CD47表达水平不高于供体肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的供体肾脏的患者中观察到的蛋白尿严重程度相比，根据本文方法治疗的患者的蛋白尿严重程度可降低。

在一些实施方案中，如通过尿液中的蛋白质水平所测量的，蛋白尿的严重程度降低了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或超过95％。在一些实施方案中，如通过尿液中的蛋白质水平所测量的，蛋白尿的严重程度降低了10％。在一些实施方案中，如通过尿液中的蛋白质水平所测量的，蛋白尿的严重程度降低了20％。在一些实施方案中，如通过尿液中的蛋白质水平所测量的，蛋白尿的严重程度降低了30％。在一些实施方案中，如通过尿液中的蛋白质水平所测量的，蛋白尿的严重程度降低了40％。在一些实施方案中，如通过尿液中的蛋白质水平所测量的，蛋白尿的严重程度降低了50％。在一些实施方案中，如通过尿液中的蛋白质水平所测量的，蛋白尿的严重程度降低了60％。在一些实施方案中，如通过尿液中的蛋白质水平所测量的，蛋白尿的严重程度降低了70％。在一些实施方案中，如通过尿液中的蛋白质水平所测量的，蛋白尿的严重程度降低了80％。在一些实施方案中，如通过尿液中的蛋白质水平所测量的，蛋白尿的严重程度降低了90％。在一些实施方案中，如通过尿液中的蛋白质水平所测量的，蛋白尿的严重程度降低了超过95％。

在一些实施方案中，根据本文提供的方法治疗的患者将不会经历蛋白尿，蛋白尿定义为每天从尿液中排出或超过150mg蛋白质。在一些实施方案中，根据本文提供的方法治疗的患者可能经历短暂性蛋白尿，所述蛋白尿在移植后1天、2天、3天、3-7天、7-10天、10-14天或1-2周、2-3周、3-4周、4-5周、5-6周、6-7周、7-8周或1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月后消退。

在一些实施方案中，用本文所述的方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中的总蛋白浓度为小于约60mg/天、小于约80mg/天、小于约100mg/天、小于约120mg/天、小于约140mg/天、小于约160mg/天、小于约200mg/天、小于约220mg/天、小于约240mg/天、小于约260mg/天、小于约280mg/天、小于约300mg/天、小于约320mg/天、小于约340mg/天、小于约360mg/天、小于约380mg/天或小于约400mg/天。在一些实施方案中，用本文所述的方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中的总蛋白浓度为小于约60mg/天。在一些实施方案中，用本文所述的方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中的总蛋白浓度为小于约80mg/天。在一些实施方案中，用本文所述的方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中的总蛋白浓度为小于约100mg/天。在一些实施方案中，用本文所述的方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中的总蛋白浓度为小于约120mg/天。在一些实施方案中，用本文所述的方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中的总蛋白浓度为小于约140mg/天。在一些实施方案中，用本文所述的方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中的总蛋白浓度为小于约160mg/天。在一些实施方案中，用本文所述的方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中的总蛋白浓度为小于约200mg/天。在一些实施方案中，用本文所述的方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中的总蛋白浓度为小于约220mg/天。在一些实施方案中，用本文所述的方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中的总蛋白浓度为小于约240mg/天。在一些实施方案中，用本文所述的方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中的总蛋白浓度为小于约260mg/天。在一些实施方案中，用本文所述的方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中的总蛋白浓度为小于约280mg/天。在一些实施方案中，用本文所述的方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中的总蛋白浓度为小于约300mg/天。在一些实施方案中，用本文所述的方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中的总蛋白浓度为小于约320mg/天。在一些实施方案中，用本文所述的方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中的总蛋白浓度为小于约340mg/天。在一些实施方案中，用本文所述的方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中的总蛋白浓度为小于约360mg/天。在一些实施方案中，用本文所述的方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中的总蛋白浓度为小于约380mg/天。在一些实施方案中，用本文所述的方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中的总蛋白浓度为小于约400mg/天。

在一些实施方案中，用本文所述的方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中的白蛋白浓度为小于约5mg/天、小于约10mg/天、小于约20mg/天、小于约30mg/天、小于约40mg/天、小于约50mg/天、小于约60mg/天、小于约70mg/天、小于约80mg/天、小于约90mg/天或小于约100mg/天。在一些实施方案中，用本文所述的方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中的白蛋白浓度为小于约5mg/天。在一些实施方案中，用本文所述的方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中的白蛋白浓度为小于约10mg/天。在一些实施方案中，用本文所述的方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中的白蛋白浓度为小于约20mg/天。在一些实施方案中，用本文所述的方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中的白蛋白浓度为小于约30mg/天。在一些实施方案中，用本文所述的方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中的白蛋白浓度为小于约40mg/天。在一些实施方案中，用本文所述的方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中的白蛋白浓度为小于约50mg/天。在一些实施方案中，用本文所述的方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中的白蛋白浓度为小于约60mg/天。在一些实施方案中，用本文所述的方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中的白蛋白浓度为小于约70mg/天。在一些实施方案中，用本文所述的方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中的白蛋白浓度为小于约80mg/天。在一些实施方案中，用本文所述的方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中的白蛋白浓度为小于约90mg/天。在一些实施方案中，用本文所述的方法治疗的出现蛋白尿的接受者的尿液中的白蛋白浓度为小于约100mg/天。

在一些实施方案中，根据本文所述的方法治疗的患者的24小时尿液样本中蛋白质与肌酐的比率为小于约0.2、小于约0.4、小于约0.6、小于约0.8或小于约1。在一些实施方案中，根据本文所述的方法治疗的患者的24小时尿液样本中白蛋白与肌酐的比率为小于约0.02、小于约0.04、小于约0.06、小于约0.08或小于约0.1。在一些实施方案中，根据本文所述的方法治疗的患者的24小时尿液样本中蛋白质与肌酐的比率为小于约0.2。在一些实施方案中，根据本文所述的方法治疗的患者的24小时尿液样本中蛋白质与肌酐的比率为小于约0.4。在一些实施方案中，根据本文所述的方法治疗的患者的24小时尿液样本中蛋白质与肌酐的比率为小于约0.6。在一些实施方案中，根据本文所述的方法治疗的患者的24小时尿液样本中蛋白质与肌酐的比率为小于约0.8。在一些实施方案中，根据本文所述的方法治疗的患者的24小时尿液样本中蛋白质与肌酐的比率为小于约1.0。在一些实施方案中，根据本文所述的方法治疗的患者的24小时尿液样本中白蛋白与肌酐的比率为小于约0.02。在一些实施方案中，根据本文所述的方法治疗的患者的24小时尿液样本中白蛋白与肌酐的比率为小于约0.04。在一些实施方案中，根据本文所述的方法治疗的患者的24小时尿液样本中白蛋白与肌酐的比率为小于约0.06。在一些实施方案中，根据本文所述的方法治疗的患者的24小时尿液样本中白蛋白与肌酐的比率为小于约0.08。在一些实施方案中，根据本文所述的方法治疗的患者的24小时尿液样本中白蛋白与肌酐的比率为小于约0.1。

在一些实施方案中，与其中供体肾脏的肾小球的人CD47表达水平不高于供体肾脏的肾小管中的人CD47表达水平的供体肾脏的接受者的风险相比，用本文所述的方法治疗的接受者出现蛋白尿的风险降低了约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，风险降低了约10％。在一些实施方案中，风险降低了约20％。在一些实施方案中，风险降低了约30％。在一些实施方案中，风险降低了约40％。在一些实施方案中，风险降低了约50％。在一些实施方案中，风险降低了约60％。在一些实施方案中，风险降低了约70％。在一些实施方案中，风险降低了约80％。在一些实施方案中，风险降低了约90％。在一些实施方案中，风险降低了约95％。

表1：序列表

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

/>

9.实施例

本节(即，第9节)中的实施例以说明的方式提供，而不是以限制的方式提供。

9.1实施例1：肾小球细胞上的人CD47表达与经由人CD47-SIRPα通路避免蛋白尿相关

检查狒狒巨噬细胞是否以与人巨噬细胞相似的方式吞噬猪内皮细胞(EC)。我们发现人和狒狒巨噬细胞均以相似的方式吞噬猪EC。引人注目的是，当猪EC和足细胞表达人CD47/人CD55而不是表达人CD46/人CD55而不表达人CD47时，这种应答显著降低(图1A至图1C)。使用来自人CD47/人CD55 Tg GalT-KO供体的移植物，我们发现即使不进行CTLA4-Ig治疗，在肾小球细胞上高度表达人CD47的GalT-KO猪肾脏也能最大限度地减少蛋白尿的出现。

我们使用人、狒狒、恒河猴和食蟹猴巨噬细胞进一步检验了对GalT-KO EC的吞噬作用。人和狒狒巨噬细胞以相似且具攻击性的方式吞噬猪EC和足细胞，而恒河猴和食蟹猴巨噬细胞对GalTKO EC的吞噬明显低于所观察到的狒狒或人巨噬细胞的吞噬(图2A至图2D)。

上文讨论的结果表明，猪和狒狒之间的物种不相容性在异种KTx后蛋白尿的出现中起着至关重要的作用，且将与人类有关，预防蛋白尿出现的策略对于猪到人异种移植的成功至关重要。

9.2实施例2：人CD47在肾小管细胞上的高表达导致与TSP-1上调相关的水肿：

虽然已知CD47结合SIRPα并阻断其激活，但CD47也结合TSP1(CD47-TSP-1通路)，TSP1抑制血管细胞中的一氧化氮信号传导并诱导先天免疫应答和细胞增殖或凋亡的激活。在血管化胸腺叶加肾脏异种移植(“VT+K XTx”)模型中，狒狒接受了具有人CD47肾小球细胞特异性表达的GalT-KO肾脏，在没有CTLA4-Ig的情况下维持肾异种移植物达128天(直至移植物生长超出了可用空间)，没有排斥或蛋白尿的迹象。相比之下，接受在所有细胞(包括肾小管细胞)上都高表达人CD47的VT+K移植物的狒狒由于全身性皮下和气管水肿而被安乐死，血清Cre或蛋白尿没有增加。这些狒狒在术后第一周还进一步表现出高水平的嵌合(15％-30％T细胞嵌合)。随后，出现全身性水肿，并且血清中IL-6水平升高。在POD 50和53时切除的肾脏移植物显示肾小管萎缩和间质细胞浸润，表明TSP-1介导了肾脏移植物的炎症应答。值得注意的是，肾脏移植物的血管的中层显示出TSP-1的上调。还发现全身性水肿伴随血清中IL-6水平升高。

基于这些结果，我们每周添加一次抗IL6r抗体，直至POD 42。抗IL-6R抗体似乎抑制了炎症变化并延长了狒狒的存活时间，而没有早期炎症事件或蛋白尿。虽然猪移植物的指数生长或药物相关的副作用触发了对接受者狒狒的安乐死，但我们证实在上述时间点没有明显的移植物排斥、体外猪特异性无应答性和新狒狒T细胞发育的体征。图3示出了在POD187时切除的肾脏移植物的sCre水平(图3A)和组织学结果(图3B)。

9.3实施例3–人CD47基因在小型猪中的足细胞特异性表达

该实施例提供了构建在足细胞特异性启动子(即肾病蛋白启动子)控制下表达人CD47的小型猪的方法。

将选择含有随机整合的载体的成纤维细胞，该载体由从猪肾病蛋白启动子表达的人CD47组成(图4)。该载体的启动子区域将包括相邻Kirrel2启动子的上游部分，因此将含有组织特异性表达所需的所有元件。为了增加特异性表达的可能性，还将肾病蛋白基因的外显子2的短区段和内含子1包括在内，其中编码成熟形式的人CD47的序列接合至所得的肾病蛋白前导肽。已将载体整合到转录允许的基因组位置中的细胞的选择将基于由泛PGK启动子的GFP表达。

将在中期妊娠克隆胎儿中进行人CD47基因适当表达的筛选。预期GFP会广泛表达。然而，人CD47表达(如在细胞表面上和/或通过RNA分析所测量)将仅限于所需克隆的肾脏。从具有所需表达谱的胎儿分离的成纤维细胞将用于在第二轮核转移中产生猪。

将在狒狒移植中对来自这些猪的肾脏进行评价。检查这些动物的TSP1激活(如通过RT-PCR所测量)。还检查这些动物的蛋白尿。

9.4实施例4–肾小球特异性表达对蛋白尿的影响

为了显示人CD47的肾小球特异性表达对异种移植物耐受的影响，产生了在肾脏的肾小球中特异性表达人CD47的小型猪。将来自这些猪的肾脏，连同来自不同小型猪的也表达人CD47的骨髓移植到狒狒中。作为比较，将广泛表达人CD47的猪的肾脏和骨髓，或在骨髓中而不是在肾脏中表达人CD47的猪的肾脏和骨髓移植到狒狒中。通过测量移植后的尿蛋白浓度来评估蛋白尿。

10.等效方案

虽然参照本发明的具体实施方案详细描述了本发明，但应当理解功能等效的变型在本发明的范围内。实际上，根据前面的描述和附图，除本文示出和描述的那些以外对本发明的各种修改对于本领域的技术人员将变得显而易见。此类修改旨在落入所附权利要求书的范围内。本领域技术人员仅仅使用常规试验将认识到或者能够确定本文所述的发明的具体实施方案的很多等效方案。此类等效方案意图由所附权利要求书涵盖。

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均在本文以引用的方式并入说明书中，其程度如同每个单独出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指示以引用的方式整体并入本文一样。

序列表

<110> 纽约市哥伦比亚大学理事会(The Trustees of Columbia University inthe City of New York)

<120> 用于异种移植的基因修饰

<130> 14648-015-228

<140>

<141>

<150> US 63/108,986

<151> 2020-11-03

<150> US 63/075,285

<151> 2020-09-07

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 323

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<223> 人白细胞表面抗原CD47同种型1前体

<300>

<308> NP_001768.1

<309> 2020-08-30

<313> (1)..(323)

<400> 1

Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly

1 5 10 15

Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe

20 25 30

Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala

35 40 45

Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp

50 55 60

Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp

65 70 75 80

Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala

85 90 95

Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr

100 105 110

Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu

115 120 125

Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu

130 135 140

Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe

145 150 155 160

Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr

165 170 175

Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val

180 185 190

Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr

195 200 205

Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His

210 215 220

Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala

225 230 235 240

Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu

245 250 255

Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile

260 265 270

Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr

275 280 285

Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys

290 295 300

Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu Ser Lys Gly Met Met

305 310 315 320

Asn Asp Glu

<210> 2

<211> 305

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<223> 人CD47蛋白

<300>

<308> NP_942088

<309> 2020-08-31

<313> (1)..(305)

<400> 2

Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly

1 5 10 15

Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe

20 25 30

Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala

35 40 45

Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp

50 55 60

Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp

65 70 75 80

Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala

85 90 95

Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr

100 105 110

Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu

115 120 125

Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu

130 135 140

Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe

145 150 155 160

Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr

165 170 175

Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val

180 185 190

Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr

195 200 205

Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His

210 215 220

Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala

225 230 235 240

Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu

245 250 255

Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile

260 265 270

Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr

275 280 285

Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Asn

290 295 300

Asn

305

<210> 3

<211> 5292

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<223> 人CD47转录变体1 (mRNA)

<300>

<308> NM_001777

<309> 2020-08-30

<313> (1)..(5292)

<400> 3

gcagcctggg cagtgggtcc tgcctgtgac gcgcggcggc ggtcggtcct gcctgtaacg 60

gcggcggcgg ctgctgctcc ggacacctgc ggcggcggcg gcgaccccgc ggcgggcgcg 120

gagatgtggc ccctggtagc ggcgctgttg ctgggctcgg cgtgctgcgg atcagctcag 180

ctactattta ataaaacaaa atctgtagaa ttcacgtttt gtaatgacac tgtcgtcatt 240

ccatgctttg ttactaatat ggaggcacaa aacactactg aagtatacgt aaagtggaaa 300

tttaaaggaa gagatattta cacctttgat ggagctctaa acaagtccac tgtccccact 360

gactttagta gtgcaaaaat tgaagtctca caattactaa aaggagatgc ctctttgaag 420

atggataaga gtgatgctgt ctcacacaca ggaaactaca cttgtgaagt aacagaatta 480

accagagaag gtgaaacgat catcgagcta aaatatcgtg ttgtttcatg gttttctcca 540

aatgaaaata ttcttattgt tattttccca atttttgcta tactcctgtt ctggggacag 600

tttggtatta aaacacttaa atatagatcc ggtggtatgg atgagaaaac aattgcttta 660

cttgttgctg gactagtgat cactgtcatt gtcattgttg gagccattct tttcgtccca 720

ggtgaatatt cattaaagaa tgctactggc cttggtttaa ttgtgacttc tacagggata 780

ttaatattac ttcactacta tgtgtttagt acagcgattg gattaacctc cttcgtcatt 840

gccatattgg ttattcaggt gatagcctat atcctcgctg tggttggact gagtctctgt 900

attgcggcgt gtataccaat gcatggccct cttctgattt caggtttgag tatcttagct 960

ctagcacaat tacttggact agtttatatg aaatttgtgg cttccaatca gaagactata 1020

caacctccta ggaaagctgt agaggaaccc cttaatgcat tcaaagaatc aaaaggaatg 1080

atgaatgatg aataactgaa gtgaagtgat ggactccgat ttggagagta gtaagacgtg 1140

aaaggaatac acttgtgttt aagcaccatg gccttgatga ttcactgttg gggagaagaa 1200

acaagaaaag taactggttg tcacctatga gacccttacg tgattgttag ttaagttttt 1260

attcaaagca gctgtaattt agttaataaa ataattatga tctatgttgt ttgcccaatt 1320

gagatccagt tttttgttgt tatttttaat caattagggg caatagtaga atggacaatt 1380

tccaagaatg atgcctttca ggtcctaggg cctctggcct ctaggtaacc agtttaaatt 1440

ggttcagggt gataactact tagcactgcc ctggtgatta cccagagata tctatgaaaa 1500

ccagtggctt ccatcaaacc tttgccaact caggttcaca gcagctttgg gcagttatgg 1560

cagtatggca ttagctgaga ggtgtctgcc acttctgggt caatggaata ataaattaag 1620

tacaggcagg aatttggttg ggagcatctt gtatgatctc cgtatgatgt gatattgatg 1680

gagatagtgg tcctcattct tgggggttgc cattcccaca ttcccccttc aacaaacagt 1740

gtaacaggtc cttcccagat ttagggtact tttattgatg gatatgtttt ccttttattc 1800

acataacccc ttgaaaccct gtcttgtcct cctgttactt gcttctgctg tacaagatgt 1860

agcacctttt ctcctctttg aacatggtct agtgacacgg tagcaccagt tgcaggaagg 1920

agccagactt gttctcagag cactgtgttc acacttttca gcaaaaatag ctatggttgt 1980

aacatatgta ttcccttcct ctgatttgaa ggcaaaaatc tacagtgttt cttcacttct 2040

tttctgatct ggggcatgaa aaaagcaaga ttgaaatttg aactatgagt ctcctgcatg 2100

gcaacaaaat gtgtgtcacc atcaggccaa caggccagcc cttgaatggg gatttattac 2160

tgttgtatct atgttgcatg ataaacattc atcaccttcc tcctgtagtc ctgcctcgta 2220

ctccccttcc cctatgattg aaaagtaaac aaaacccaca tttcctatcc tggttagaag 2280

aaaattaatg ttctgacagt tgtgatcgcc tggagtactt ttagactttt agcattcgtt 2340

ttttacctgt ttgtggatgt gtgtttgtat gtgcatacgt atgagatagg cacatgcatc 2400

ttctgtatgg acaaaggtgg ggtacctaca ggagagcaaa ggttaatttt gtgcttttag 2460

taaaaacatt taaatacaaa gttctttatt gggtggaatt atatttgatg caaatatttg 2520

atcacttaaa acttttaaaa cttctaggta atttgccacg ctttttgact gctcaccaat 2580

accctgtaaa aatacgtaat tcttcctgtt tgtgtaataa gatattcata tttgtagttg 2640

cattaataat agttatttct tagtccatca gatgttcccg tgtgcctctt ttatgccaaa 2700

ttgattgtca tatttcatgt tgggaccaag tagtttgccc atggcaaacc taaatttatg 2760

acctgctgag gcctctcaga aaactgagca tactagcaag acagctcttc ttgaaaaaaa 2820

aaatatgtat acacaaatat atacgtatat ctatatatac gtatgtatat acacacatgt 2880

atattcttcc ttgattgtgt agctgtccaa aataataaca tatatagagg gagctgtatt 2940

cctttataca aatctgatgg ctcctgcagc actttttcct tctgaaaata tttacatttt 3000

gctaacctag tttgttactt taaaaatcag ttttgatgaa aggagggaaa agcagatgga 3060

cttgaaaaag atccaagctc ctattagaaa aggtatgaaa atctttatag taaaattttt 3120

tataaactaa agttgtacct tttaatatgt agtaaactct catttatttg gggttcgctc 3180

ttggatctca tccatccatt gtgttctctt taatgctgcc tgccttttga ggcattcact 3240

gccctagaca atgccaccag agatagtggg ggaaatgcca gatgaaacca actcttgctc 3300

tcactagttg tcagcttctc tggataagtg accacagaag caggagtcct cctgcttggg 3360

catcattggg ccagttcctt ctctttaaat cagatttgta atggctccca aattccatca 3420

catcacattt aaattgcaga cagtgttttg cacatcatgt atctgttttg tcccataata 3480

tgctttttac tccctgatcc cagtttctgc tgttgactct tccattcagt tttatttatt 3540

gtgtgttctc acagtgacac catttgtcct tttctgcaac aacctttcca gctacttttg 3600

ccaaattcta tttgtcttct ccttcaaaac attctccttt gcagttcctc ttcatctgtg 3660

tagctgctct tttgtctctt aacttaccat tcctatagta ctttatgcat ctctgcttag 3720

ttctattagt tttttggcct tgctcttctc cttgatttta aaattccttc tatagctaga 3780

gcttttcttt ctttcattct ctcttcctgc agtgttttgc atacatcaga agctaggtac 3840

ataagttaaa tgattgagag ttggctgtat ttagatttat cactttttaa tagggtgagc 3900

ttgagagttt tctttctttc tgtttttttt ttttgttttt tttttttttt tttttttttt 3960

tttttttgac taatttcaca tgctctaaaa accttcaaag gtgattattt ttctcctgga 4020

aactccaggt ccattctgtt taaatcccta agaatgtcag aattaaaata acagggctat 4080

cccgtaattg gaaatatttc ttttttcagg atgctatagt caatttagta agtgaccacc 4140

aaattgttat ttgcactaac aaagctcaaa acacgataag tttactcctc catctcagta 4200

ataaaaatta agctgtaatc aaccttctag gtttctcttg tcttaaaatg ggtattcaaa 4260

aatggggatc tgtggtgtat gtatggaaac acatactcct taatttacct gttgttggaa 4320

actggagaaa tgattgtcgg gcaaccgttt attttttatt gtattttatt tggttgaggg 4380

atttttttat aaacagtttt acttgtgtca tattttaaaa ttactaactg ccatcacctg 4440

ctggggtcct ttgttaggtc attttcagtg actaataggg ataatccagg taactttgaa 4500

gagatgagca gtgagtgacc aggcagtttt tctgccttta gctttgacag ttcttaatta 4560

agatcattga agaccagctt tctcataaat ttctcttttt gaaaaaaaga aagcatttgt 4620

actaagctcc tctgtaagac aacatcttaa atcttaaaag tgttgttatc atgactggtg 4680

agagaagaaa acattttgtt tttattaaat ggagcattat ttacaaaaag ccattgttga 4740

gaattagatc ccacatcgta taaatatcta ttaaccattc taaataaaga gaactccagt 4800

gttgctatgt gcaagatcct ctcttggagc ttttttgcat agcaattaaa ggtgtgctat 4860

ttgtcagtag ccattttttt gcagtgattt gaagaccaaa gttgttttac agctgtgtta 4920

ccgttaaagg tttttttttt tatatgtatt aaatcaattt atcactgttt aaagctttga 4980

atatctgcaa tctttgccaa ggtacttttt tatttaaaaa aaaacataac tttgtaaata 5040

ttaccctgta atattatata tacttaataa aacattttaa gctattttgt tgggctattt 5100

ctattgctgc tacagcagac cacaagcaca tttctgaaaa atttaattta ttaatgtatt 5160

tttaagttgc ttatattcta ggtaacaatg taaagaatga tttaaaatat taattatgaa 5220

ttttttgagt ataataccca ataagctttt aattagagca gagttttaat taaaagtttt 5280

aaatcagtcc aa 5292

<210> 4

<211> 5288

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<223> 人CD47转录变体2 (mRNA)

<300>

<308> NM_198793.3

<309> 2020-08-31

<313> (1)..(5234)

<400> 4

ggggagcagg cgggggagcg ggcgggaagc agtgggagcg cgcgtgcgcg cggccgtgca 60

gcctgggcag tgggtcctgc ctgtgacgcg cggcggcggt cggtcctgcc tgtaacggcg 120

gcggcggctg ctgctccaga cacctgcggc ggcggcggcg accccgcggc gggcgcggag 180

atgtggcccc tggtagcggc gctgttgctg ggctcggcgt gctgcggatc agctcagcta 240

ctatttaata aaacaaaatc tgtagaattc acgttttgta atgacactgt cgtcattcca 300

tgctttgtta ctaatatgga ggcacaaaac actactgaag tatacgtaaa gtggaaattt 360

aaaggaagag atatttacac ctttgatgga gctctaaaca agtccactgt ccccactgac 420

tttagtagtg caaaaattga agtctcacaa ttactaaaag gagatgcctc tttgaagatg 480

gataagagtg atgctgtctc acacacagga aactacactt gtgaagtaac agaattaacc 540

agagaaggtg aaacgatcat cgagctaaaa tatcgtgttg tttcatggtt ttctccaaat 600

gaaaatattc ttattgttat tttcccaatt tttgctatac tcctgttctg gggacagttt 660

ggtattaaaa cacttaaata tagatccggt ggtatggatg agaaaacaat tgctttactt 720

gttgctggac tagtgatcac tgtcattgtc attgttggag ccattctttt cgtcccaggt 780

gaatattcat taaagaatgc tactggcctt ggtttaattg tgacttctac agggatatta 840

atattacttc actactatgt gtttagtaca gcgattggat taacctcctt cgtcattgcc 900

atattggtta ttcaggtgat agcctatatc ctcgctgtgg ttggactgag tctctgtatt 960

gcggcgtgta taccaatgca tggccctctt ctgatttcag gtttgagtat cttagctcta 1020

gcacaattac ttggactagt ttatatgaaa tttgtggctt ccaatcagaa gactatacaa 1080

cctcctagga ataactgaag tgaagtgatg gactccgatt tggagagtag taagacgtga 1140

aaggaataca cttgtgttta agcaccatgg ccttgatgat tcactgttgg ggagaagaaa 1200

caagaaaagt aactggttgt cacctatgag acccttacgt gattgttagt taagttttta 1260

ttcaaagcag ctgtaattta gttaataaaa taattatgat ctatgttgtt tgcccaattg 1320

agatccagtt ttttgttgtt atttttaatc aattaggggc aatagtagaa tggacaattt 1380

ccaagaatga tgcctttcag gtcctagggc ctctggcctc taggtaacca gtttaaattg 1440

gttcagggtg ataactactt agcactgccc tggtgattac ccagagatat ctatgaaaac 1500

cagtggcttc catcaaacct ttgccaactc aggttcacag cagctttggg cagttatggc 1560

agtatggcat tagctgagag gtgtctgcca cttctgggtc aatggaataa taaattaagt 1620

acaggcagga atttggttgg gagcatcttg tatgatctcc gtatgatgtg atattgatgg 1680

agatagtggt cctcattctt gggggttgcc attcccacat tcccccttca acaaacagtg 1740

taacaggtcc ttcccagatt tagggtactt ttattgatgg atatgttttc cttttattca 1800

cataacccct tgaaaccctg tcttgtcctc ctgttacttg cttctgctgt acaagatgta 1860

gcaccttttc tcctctttga acatggtcta gtgacacggt agcaccagtt gcaggaagga 1920

gccagacttg ttctcagagc actgtgttca cacttttcag caaaaatagc tatggttgta 1980

acatatgtat tcccttcctc tgatttgaag gcaaaaatct acagtgtttc ttcacttctt 2040

ttctgatctg gggcatgaaa aaagcaagat tgaaatttga actatgagtc tcctgcatgg 2100

caacaaaatg tgtgtcacca tcaggccaac aggccagccc ttgaatgggg atttattact 2160

gttgtatcta tgttgcatga taaacattca tcaccttcct cctgtagtcc tgcctcgtac 2220

tccccttccc ctatgattga aaagtaaaca aaacccacat ttcctatcct ggttagaaga 2280

aaattaatgt tctgacagtt gtgatcgcct ggagtacttt tagactttta gcattcgttt 2340

tttacctgtt tgtggatgtg tgtttgtatg tgcatacgta tgagataggc acatgcatct 2400

tctgtatgga caaaggtggg gtacctacag gagagcaaag gttaattttg tgcttttagt 2460

aaaaacattt aaatacaaag ttctttattg ggtggaatta tatttgatgc aaatatttga 2520

tcacttaaaa cttttaaaac ttctaggtaa tttgccacgc tttttgactg ctcaccaata 2580

ccctgtaaaa atacgtaatt cttcctgttt gtgtaataag atattcatat ttgtagttgc 2640

attaataata gttatttctt agtccatcag atgttcccgt gtgcctcttt tatgccaaat 2700

tgattgtcat atttcatgtt gggaccaagt agtttgccca tggcaaacct aaatttatga 2760

cctgctgagg cctctcagaa aactgagcat actagcaaga cagctcttct tgaaaaaaaa 2820

aatatgtata cacaaatata tacgtatatc tatatatacg tatgtatata cacacatgta 2880

tattcttcct tgattgtgta gctgtccaaa ataataacat atatagaggg agctgtattc 2940

ctttatacaa atctgatggc tcctgcagca ctttttcctt ctgaaaatat ttacattttg 3000

ctaacctagt ttgttacttt aaaaatcagt tttgatgaaa ggagggaaaa gcagatggac 3060

ttgaaaaaga tccaagctcc tattagaaaa ggtatgaaaa tctttatagt aaaatttttt 3120

ataaactaaa gttgtacctt ttaatatgta gtaaactctc atttatttgg ggttcgctct 3180

tggatctcat ccatccattg tgttctcttt aatgctgcct gccttttgag gcattcactg 3240

ccctagacaa tgccaccaga gatagtgggg gaaatgccag atgaaaccaa ctcttgctct 3300

cactagttgt cagcttctct ggataagtga ccacagaagc aggagtcctc ctgcttgggc 3360

atcattgggc cagttccttc tctttaaatc agatttgtaa tggctcccaa attccatcac 3420

atcacattta aattgcagac agtgttttgc acatcatgta tctgttttgt cccataatat 3480

gctttttact ccctgatccc agtttctgct gttgactctt ccattcagtt ttatttattg 3540

tgtgttctca cagtgacacc atttgtcctt ttctgcaaca acctttccag ctacttttgc 3600

caaattctat ttgtcttctc cttcaaaaca ttctcctttg cagttcctct tcatctgtgt 3660

agctgctctt ttgtctctta acttaccatt cctatagtac tttatgcatc tctgcttagt 3720

tctattagtt ttttggcctt gctcttctcc ttgattttaa aattccttct atagctagag 3780

cttttctttc tttcattctc tcttcctgca gtgttttgca tacatcagaa gctaggtaca 3840

taagttaaat gattgagagt tggctgtatt tagatttatc actttttaat agggtgagct 3900

tgagagtttt ctttctttct gttttttttt tttgtttttt tttttttttt tttttttttt 3960

ttttttgact aatttcacat gctctaaaaa ccttcaaagg tgattatttt tctcctggaa 4020

actccaggtc cattctgttt aaatccctaa gaatgtcaga attaaaataa cagggctatc 4080

ccgtaattgg aaatatttct tttttcagga tgctatagtc aatttagtaa gtgaccacca 4140

aattgttatt tgcactaaca aagctcaaaa cacgataagt ttactcctcc atctcagtaa 4200

taaaaattaa gctgtaatca accttctagg tttctcttgt cttaaaatgg gtattcaaaa 4260

atggggatct gtggtgtatg tatggaaaca catactcctt aatttacctg ttgttggaaa 4320

ctggagaaat gattgtcggg caaccgttta ttttttattg tattttattt ggttgaggga 4380

tttttttata aacagtttta cttgtgtcat attttaaaat tactaactgc catcacctgc 4440

tggggtcctt tgttaggtca ttttcagtga ctaataggga taatccaggt aactttgaag 4500

agatgagcag tgagtgacca ggcagttttt ctgcctttag ctttgacagt tcttaattaa 4560

gatcattgaa gaccagcttt ctcataaatt tctctttttg aaaaaaagaa agcatttgta 4620

ctaagctcct ctgtaagaca acatcttaaa tcttaaaagt gttgttatca tgactggtga 4680

gagaagaaaa cattttgttt ttattaaatg gagcattatt tacaaaaagc cattgttgag 4740

aattagatcc cacatcgtat aaatatctat taaccattct aaataaagag aactccagtg 4800

ttgctatgtg caagatcctc tcttggagct tttttgcata gcaattaaag gtgtgctatt 4860

tgtcagtagc catttttttg cagtgatttg aagaccaaag ttgttttaca gctgtgttac 4920

cgttaaaggt tttttttttt atatgtatta aatcaattta tcactgttta aagctttgaa 4980

tatctgcaat ctttgccaag gtactttttt atttaaaaaa aaacataact ttgtaaatat 5040

taccctgtaa tattatatat acttaataaa acattttaag ctattttgtt gggctatttc 5100

tattgctgct acagcagacc acaagcacat ttctgaaaaa tttaatttat taatgtattt 5160

ttaagttgct tatattctag gtaacaatgt aaagaatgat ttaaaatatt aattatgaat 5220

tttttgagta taatacccaa taagctttta attagagcag agttttaatt aaaagtttta 5280

aatcagtc 5288

<210> 5

<211> 324

<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<220>

<223> 白细胞表面抗原CD47同种型4前体

<300>

<308> NP_034711.1

<309> 2020-08-27

<313> (1)..(324)

<400> 5

Met Trp Pro Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Cys Cys Cys Gly

1 5 10 15

Ser Ala Gln Leu Leu Phe Ser Asn Val Asn Ser Ile Glu Phe Thr Ser

20 25 30

Cys Asn Glu Thr Val Val Ile Pro Cys Ile Val Arg Asn Val Glu Ala

35 40 45

Gln Ser Thr Glu Glu Met Phe Val Lys Trp Lys Leu Asn Lys Ser Tyr

50 55 60

Ile Phe Ile Tyr Asp Gly Asn Lys Asn Ser Thr Thr Thr Asp Gln Asn

65 70 75 80

Phe Thr Ser Ala Lys Ile Ser Val Ser Asp Leu Ile Asn Gly Ile Ala

85 90 95

Ser Leu Lys Met Asp Lys Arg Asp Ala Met Val Gly Asn Tyr Thr Cys

100 105 110

Glu Val Thr Glu Leu Ser Arg Glu Gly Lys Thr Val Ile Glu Leu Lys

115 120 125

Asn Arg Thr Ala Phe Asn Thr Asp Gln Gly Ser Ala Cys Ser Tyr Glu

130 135 140

Glu Glu Lys Gly Gly Cys Lys Leu Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu

145 150 155 160

Lys Ile Leu Ile Val Ile Phe Pro Ile Leu Ala Ile Leu Leu Phe Trp

165 170 175

Gly Lys Phe Gly Ile Leu Thr Leu Lys Tyr Lys Ser Ser His Thr Asn

180 185 190

Lys Arg Ile Ile Leu Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Leu Thr Val Ile

195 200 205

Val Val Val Gly Ala Ile Leu Leu Ile Pro Gly Glu Lys Pro Val Lys

210 215 220

Asn Ala Ser Gly Leu Gly Leu Ile Val Ile Ser Thr Gly Ile Leu Ile

225 230 235 240

Leu Leu Gln Tyr Asn Val Phe Met Thr Ala Phe Gly Met Thr Ser Phe

245 250 255

Thr Ile Ala Ile Leu Ile Thr Gln Val Leu Gly Tyr Val Leu Ala Leu

260 265 270

Val Gly Leu Cys Leu Cys Ile Met Ala Cys Glu Pro Val His Gly Pro

275 280 285

Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gly Ile Ile Ala Leu Ala Glu Leu Leu Gly

290 295 300

Leu Val Tyr Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Arg Thr Ile Gln Pro

305 310 315 320

Pro Arg Asn Arg

<210> 6

<211> 312

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<223> 白细胞表面抗原CD47同种型3

<300>

<308> NP_001369235.1

<309> 2020-10-04

<313> (1)..(312)

<400> 6

Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly

1 5 10 15

Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe

20 25 30

Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala

35 40 45

Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp

50 55 60

Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp

65 70 75 80

Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala

85 90 95

Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr

100 105 110

Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu

115 120 125

Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu

130 135 140

Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe

145 150 155 160

Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr

165 170 175

Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val

180 185 190

Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr

195 200 205

Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His

210 215 220

Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala

225 230 235 240

Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu

245 250 255

Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile

260 265 270

Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr

275 280 285

Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys

290 295 300

Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Glu

305 310

<210> 7

<211> 293

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<223> 白细胞表面抗原CD47同种型X2

<300>

<308> XP_005247966.1

<309> 2020-08-17

<313> (1)..(293)

<400> 7

Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly

1 5 10 15

Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe

20 25 30

Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala

35 40 45

Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp

50 55 60

Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp

65 70 75 80

Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala

85 90 95

Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr

100 105 110

Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu

115 120 125

Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu

130 135 140

Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe

145 150 155 160

Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr

165 170 175

Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val

180 185 190

Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr

195 200 205

Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His

210 215 220

Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala

225 230 235 240

Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu

245 250 255

Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile

260 265 270

Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr

275 280 285

Met Lys Phe Val Glu

290

<210> 8

<211> 5008

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<223> 预测：智人CD47分子(CD47)，转录变体X11, mRNA

<300>

<308> XM_005247909.2

<309> 2020-08-17

<313> (1)..(5008)

<400> 8

gtgcgcgcgg ccgtgcagcc tgggcagtgg gtcctgcctg tgacgcgcgg cggcggtcgg 60

tcctgcctgt aacggcggcg gcggctgctg ctccggacac ctgcggcggc ggcggcgacc 120

ccgcggcggg cgcggagatg tggcccctgg tagcggcgct gttgctgggc tcggcgtgct 180

gcggatcagc tcagctacta tttaataaaa caaaatctgt agaattcacg ttttgtaatg 240

acactgtcgt cattccatgc tttgttacta atatggaggc acaaaacact actgaagtat 300

acgtaaagtg gaaatttaaa ggaagagata tttacacctt tgatggagct ctaaacaagt 360

ccactgtccc cactgacttt agtagtgcaa aaattgaagt ctcacaatta ctaaaaggag 420

atgcctcttt gaagatggat aagagtgatg ctgtctcaca cacaggaaac tacacttgtg 480

aagtaacaga attaaccaga gaaggtgaaa cgatcatcga gctaaaatat cgtgttgttt 540

catggttttc tccaaatgaa aatattctta ttgttatttt cccaattttt gctatactcc 600

tgttctgggg acagtttggt attaaaacac ttaaatatag atccggtggt atggatgaga 660

aaacaattgc tttacttgtt gctggactag tgatcactgt cattgtcatt gttggagcca 720

ttcttttcgt cccaggtgaa tattcattaa agaatgctac tggccttggt ttaattgtga 780

cttctacagg gatattaata ttacttcact actatgtgtt tagtacagcg attggattaa 840

cctccttcgt cattgccata ttggttattc aggtgatagc ctatatcctc gctgtggttg 900

gactgagtct ctgtattgcg gcgtgtatac caatgcatgg ccctcttctg atttcaggtt 960

tgagtatctt agctctagca caattacttg gactagttta tatgaaattt gtggaataac 1020

tgaagtgaag tgatggactc cgatttggag agtagtaaga cgtgaaagga atacacttgt 1080

gtttaagcac catggccttg atgattcact gttggggaga agaaacaaga aaagtaactg 1140

gttgtcacct atgagaccct tacgtgattg ttagttaagt ttttattcaa agcagctgta 1200

atttagttaa taaaataatt atgatctatg ttgtttgccc aattgagatc cagttttttg 1260

ttgttatttt taatcaatta ggggcaatag tagaatggac aatttccaag aatgatgcct 1320

ttcaggtcct agggcctctg gcctctaggt aaccagttta aattggttca gggtgataac 1380

tacttagcac tgccctggtg attacccaga gatatctatg aaaaccagtg gcttccatca 1440

aacctttgcc aactcaggtt cacagcagct ttgggcagtt atggcagtat ggcattagct 1500

gagaggtgtc tgccacttct gggtcaatgg aataataaat taagtacagg caggaatttg 1560

gttgggagca tcttgtatga tctccgtatg atgtgatatt gatggagata gtggtcctca 1620

ttcttggggg ttgccattcc cacattcccc cttcaacaaa cagtgtaaca ggtccttccc 1680

agatttaggg tacttttatt gatggatatg ttttcctttt attcacataa ccccttgaaa 1740

ccctgtcttg tcctcctgtt acttgcttct gctgtacaag atgtagcacc ttttctcctc 1800

tttgaacatg gtctagtgac acggtagcac cagttgcagg aaggagccag acttgttctc 1860

agagcactgt gttcacactt ttcagcaaaa atagctatgg ttgtaacata tgtattccct 1920

tcctctgatt tgaaggcaaa aatctacagt gtttcttcac ttcttttctg atctggggca 1980

tgaaaaaagc aagattgaaa tttgaactat gagtctcctg catggcaaca aaatgtgtgt 2040

caccatcagg ccaacaggcc agcccttgaa tggggattta ttactgttgt atctatgttg 2100

catgataaac attcatcacc ttcctcctgt agtcctgcct cgtactcccc ttcccctatg 2160

attgaaaagt aaacaaaacc cacatttcct atcctggtta gaagaaaatt aatgttctga 2220

cagttgtgat cgcctggagt acttttagac ttttagcatt cgttttttac ctgtttgtgg 2280

atgtgtgttt gtatgtgcat acgtatgaga taggcacatg catcttctgt atggacaaag 2340

gtggggtacc tacaggagag caaaggttaa ttttgtgctt ttagtaaaaa catttaaata 2400

caaagttctt tattgggtgg aattatattt gatgcaaata tttgatcact taaaactttt 2460

aaaacttcta ggtaatttgc cacgcttttt gactgctcac caataccctg taaaaatacg 2520

taattcttcc tgtttgtgta ataagatatt catatttgta gttgcattaa taatagttat 2580

ttcttagtcc atcagatgtt cccgtgtgcc tcttttatgc caaattgatt gtcatatttc 2640

atgttgggac caagtagttt gcccatggca aacctaaatt tatgacctgc tgaggcctct 2700

cagaaaactg agcatactag caagacagct cttcttgaaa aaaaaaatat gtatacacaa 2760

atatatacgt atatctatat atacgtatgt atatacacac atgtatattc ttccttgatt 2820

gtgtagctgt ccaaaataat aacatatata gagggagctg tattccttta tacaaatctg 2880

atggctcctg cagcactttt tccttctgaa aatatttaca ttttgctaac ctagtttgtt 2940

actttaaaaa tcagttttga tgaaaggagg gaaaagcaga tggacttgaa aaagatccaa 3000

gctcctatta gaaaaggtat gaaaatcttt atagtaaaat tttttataaa ctaaagttgt 3060

accttttaat atgtagtaaa ctctcattta tttggggttc gctcttggat ctcatccatc 3120

cattgtgttc tctttaatgc tgcctgcctt ttgaggcatt cactgcccta gacaatgcca 3180

ccagagatag tgggggaaat gccagatgaa accaactctt gctctcacta gttgtcagct 3240

tctctggata agtgaccaca gaagcaggag tcctcctgct tgggcatcat tgggccagtt 3300

ccttctcttt aaatcagatt tgtaatggct cccaaattcc atcacatcac atttaaattg 3360

cagacagtgt tttgcacatc atgtatctgt tttgtcccat aatatgcttt ttactccctg 3420

atcccagttt ctgctgttga ctcttccatt cagttttatt tattgtgtgt tctcacagtg 3480

acaccatttg tccttttctg caacaacctt tccagctact tttgccaaat tctatttgtc 3540

ttctccttca aaacattctc ctttgcagtt cctcttcatc tgtgtagctg ctcttttgtc 3600

tcttaactta ccattcctat agtactttat gcatctctgc ttagttctat tagttttttg 3660

gccttgctct tctccttgat tttaaaattc cttctatagc tagagctttt ctttctttca 3720

ttctctcttc ctgcagtgtt ttgcatacat cagaagctag gtacataagt taaatgattg 3780

agagttggct gtatttagat ttatcacttt ttaatagggt gagcttgaga gttttctttc 3840

tttctgtttt ttttttttgt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tgactaattt 3900

cacatgctct aaaaaccttc aaaggtgatt atttttctcc tggaaactcc aggtccattc 3960

tgtttaaatc cctaagaatg tcagaattaa aataacaggg ctatcccgta attggaaata 4020

tttctttttt caggatgcta tagtcaattt agtaagtgac caccaaattg ttatttgcac 4080

taacaaagct caaaacacga taagtttact cctccatctc agtaataaaa attaagctgt 4140

aatcaacctt ctaggtttct cttgtcttaa aatgggtatt caaaaatggg gatctgtggt 4200

gtatgtatgg aaacacatac tccttaattt acctgttgtt ggaaactgga gaaatgattg 4260

tcgggcaacc gtttattttt tattgtattt tatttggttg agggattttt ttataaacag 4320

ttttacttgt gtcatatttt aaaattacta actgccatca cctgctgggg tcctttgtta 4380

ggtcattttc agtgactaat agggataatc caggtaactt tgaagagatg agcagtgagt 4440

gaccaggcag tttttctgcc tttagctttg acagttctta attaagatca ttgaagacca 4500

gctttctcat aaatttctct ttttgaaaaa aagaaagcat ttgtactaag ctcctctgta 4560

agacaacatc ttaaatctta aaagtgttgt tatcatgact ggtgagagaa gaaaacattt 4620

tgtttttatt aaatggagca ttatttacaa aaagccattg ttgagaatta gatcccacat 4680

cgtataaata tctattaacc attctaaata aagagaactc cagtgttgct atgtgcaaga 4740

tcctctcttg gagctttttt gcatagcaat taaaggtgtg ctatttgtca gtagccattt 4800

ttttgcagtg atttgaagac caaagttgtt ttacagctgt gttaccgtta aaggtttttt 4860

tttttatatg tattaaatca atttatcact gtttaaagct ttgaatatct gcaatctttg 4920

ccaaggtact tttttattta aaaaaaaaca taactttgta aatattaccc tgtaatatta 4980

tatatactta ataaaacatt ttaagcta 5008

<210> 9

<211> 5259

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 智人CD47分子(CD47)，转录变体3，mRNA

<300>

<308> NM_001382306.1

<309> 2020-10-04

<313> (1)..(5259)

<400> 9

gcagcctggg cagtgggtcc tgcctgtgac gcgcggcggc ggtcggtcct gcctgtaacg 60

gcggcggcgg ctgctgctcc ggacacctgc ggcggcggcg gcgaccccgc ggcgggcgcg 120

gagatgtggc ccctggtagc ggcgctgttg ctgggctcgg cgtgctgcgg atcagctcag 180

ctactattta ataaaacaaa atctgtagaa ttcacgtttt gtaatgacac tgtcgtcatt 240

ccatgctttg ttactaatat ggaggcacaa aacactactg aagtatacgt aaagtggaaa 300

tttaaaggaa gagatattta cacctttgat ggagctctaa acaagtccac tgtccccact 360

gactttagta gtgcaaaaat tgaagtctca caattactaa aaggagatgc ctctttgaag 420

atggataaga gtgatgctgt ctcacacaca ggaaactaca cttgtgaagt aacagaatta 480

accagagaag gtgaaacgat catcgagcta aaatatcgtg ttgtttcatg gttttctcca 540

aatgaaaata ttcttattgt tattttccca atttttgcta tactcctgtt ctggggacag 600

tttggtatta aaacacttaa atatagatcc ggtggtatgg atgagaaaac aattgcttta 660

cttgttgctg gactagtgat cactgtcatt gtcattgttg gagccattct tttcgtccca 720

ggtgaatatt cattaaagaa tgctactggc cttggtttaa ttgtgacttc tacagggata 780

ttaatattac ttcactacta tgtgtttagt acagcgattg gattaacctc cttcgtcatt 840

gccatattgg ttattcaggt gatagcctat atcctcgctg tggttggact gagtctctgt 900

attgcggcgt gtataccaat gcatggccct cttctgattt caggtttgag tatcttagct 960

ctagcacaat tacttggact agtttatatg aaatttgtgg cttccaatca gaagactata 1020

caacctccta ggaaagctgt agaggaaccc cttaatgaat aactgaagtg aagtgatgga 1080

ctccgatttg gagagtagta agacgtgaaa ggaatacact tgtgtttaag caccatggcc 1140

ttgatgattc actgttgggg agaagaaaca agaaaagtaa ctggttgtca cctatgagac 1200

ccttacgtga ttgttagtta agtttttatt caaagcagct gtaatttagt taataaaata 1260

attatgatct atgttgtttg cccaattgag atccagtttt ttgttgttat ttttaatcaa 1320

ttaggggcaa tagtagaatg gacaatttcc aagaatgatg cctttcaggt cctagggcct 1380

ctggcctcta ggtaaccagt ttaaattggt tcagggtgat aactacttag cactgccctg 1440

gtgattaccc agagatatct atgaaaacca gtggcttcca tcaaaccttt gccaactcag 1500

gttcacagca gctttgggca gttatggcag tatggcatta gctgagaggt gtctgccact 1560

tctgggtcaa tggaataata aattaagtac aggcaggaat ttggttggga gcatcttgta 1620

tgatctccgt atgatgtgat attgatggag atagtggtcc tcattcttgg gggttgccat 1680

tcccacattc ccccttcaac aaacagtgta acaggtcctt cccagattta gggtactttt 1740

attgatggat atgttttcct tttattcaca taaccccttg aaaccctgtc ttgtcctcct 1800

gttacttgct tctgctgtac aagatgtagc accttttctc ctctttgaac atggtctagt 1860

gacacggtag caccagttgc aggaaggagc cagacttgtt ctcagagcac tgtgttcaca 1920

cttttcagca aaaatagcta tggttgtaac atatgtattc ccttcctctg atttgaaggc 1980

aaaaatctac agtgtttctt cacttctttt ctgatctggg gcatgaaaaa agcaagattg 2040

aaatttgaac tatgagtctc ctgcatggca acaaaatgtg tgtcaccatc aggccaacag 2100

gccagccctt gaatggggat ttattactgt tgtatctatg ttgcatgata aacattcatc 2160

accttcctcc tgtagtcctg cctcgtactc cccttcccct atgattgaaa agtaaacaaa 2220

acccacattt cctatcctgg ttagaagaaa attaatgttc tgacagttgt gatcgcctgg 2280

agtactttta gacttttagc attcgttttt tacctgtttg tggatgtgtg tttgtatgtg 2340

catacgtatg agataggcac atgcatcttc tgtatggaca aaggtggggt acctacagga 2400

gagcaaaggt taattttgtg cttttagtaa aaacatttaa atacaaagtt ctttattggg 2460

tggaattata tttgatgcaa atatttgatc acttaaaact tttaaaactt ctaggtaatt 2520

tgccacgctt tttgactgct caccaatacc ctgtaaaaat acgtaattct tcctgtttgt 2580

gtaataagat attcatattt gtagttgcat taataatagt tatttcttag tccatcagat 2640

gttcccgtgt gcctctttta tgccaaattg attgtcatat ttcatgttgg gaccaagtag 2700

tttgcccatg gcaaacctaa atttatgacc tgctgaggcc tctcagaaaa ctgagcatac 2760

tagcaagaca gctcttcttg aaaaaaaaaa tatgtataca caaatatata cgtatatcta 2820

tatatacgta tgtatataca cacatgtata ttcttccttg attgtgtagc tgtccaaaat 2880

aataacatat atagagggag ctgtattcct ttatacaaat ctgatggctc ctgcagcact 2940

ttttccttct gaaaatattt acattttgct aacctagttt gttactttaa aaatcagttt 3000

tgatgaaagg agggaaaagc agatggactt gaaaaagatc caagctccta ttagaaaagg 3060

tatgaaaatc tttatagtaa aattttttat aaactaaagt tgtacctttt aatatgtagt 3120

aaactctcat ttatttgggg ttcgctcttg gatctcatcc atccattgtg ttctctttaa 3180

tgctgcctgc cttttgaggc attcactgcc ctagacaatg ccaccagaga tagtggggga 3240

aatgccagat gaaaccaact cttgctctca ctagttgtca gcttctctgg ataagtgacc 3300

acagaagcag gagtcctcct gcttgggcat cattgggcca gttccttctc tttaaatcag 3360

atttgtaatg gctcccaaat tccatcacat cacatttaaa ttgcagacag tgttttgcac 3420

atcatgtatc tgttttgtcc cataatatgc tttttactcc ctgatcccag tttctgctgt 3480

tgactcttcc attcagtttt atttattgtg tgttctcaca gtgacaccat ttgtcctttt 3540

ctgcaacaac ctttccagct acttttgcca aattctattt gtcttctcct tcaaaacatt 3600

ctcctttgca gttcctcttc atctgtgtag ctgctctttt gtctcttaac ttaccattcc 3660

tatagtactt tatgcatctc tgcttagttc tattagtttt ttggccttgc tcttctcctt 3720

gattttaaaa ttccttctat agctagagct tttctttctt tcattctctc ttcctgcagt 3780

gttttgcata catcagaagc taggtacata agttaaatga ttgagagttg gctgtattta 3840

gatttatcac tttttaatag ggtgagcttg agagttttct ttctttctgt tttttttttt 3900

tgtttttttt tttttttttt tttttttttt ttttgactaa tttcacatgc tctaaaaacc 3960

ttcaaaggtg attatttttc tcctggaaac tccaggtcca ttctgtttaa atccctaaga 4020

atgtcagaat taaaataaca gggctatccc gtaattggaa atatttcttt tttcaggatg 4080

ctatagtcaa tttagtaagt gaccaccaaa ttgttatttg cactaacaaa gctcaaaaca 4140

cgataagttt actcctccat ctcagtaata aaaattaagc tgtaatcaac cttctaggtt 4200

tctcttgtct taaaatgggt attcaaaaat ggggatctgt ggtgtatgta tggaaacaca 4260

tactccttaa tttacctgtt gttggaaact ggagaaatga ttgtcgggca accgtttatt 4320

ttttattgta ttttatttgg ttgagggatt tttttataaa cagttttact tgtgtcatat 4380

tttaaaatta ctaactgcca tcacctgctg gggtcctttg ttaggtcatt ttcagtgact 4440

aatagggata atccaggtaa ctttgaagag atgagcagtg agtgaccagg cagtttttct 4500

gcctttagct ttgacagttc ttaattaaga tcattgaaga ccagctttct cataaatttc 4560

tctttttgaa aaaaagaaag catttgtact aagctcctct gtaagacaac atcttaaatc 4620

ttaaaagtgt tgttatcatg actggtgaga gaagaaaaca ttttgttttt attaaatgga 4680

gcattattta caaaaagcca ttgttgagaa ttagatccca catcgtataa atatctatta 4740

accattctaa ataaagagaa ctccagtgtt gctatgtgca agatcctctc ttggagcttt 4800

tttgcatagc aattaaaggt gtgctatttg tcagtagcca tttttttgca gtgatttgaa 4860

gaccaaagtt gttttacagc tgtgttaccg ttaaaggttt ttttttttat atgtattaaa 4920

tcaatttatc actgtttaaa gctttgaata tctgcaatct ttgccaaggt acttttttat 4980

ttaaaaaaaa acataacttt gtaaatatta ccctgtaata ttatatatac ttaataaaac 5040

attttaagct attttgttgg gctatttcta ttgctgctac agcagaccac aagcacattt 5100

ctgaaaaatt taatttatta atgtattttt aagttgctta tattctaggt aacaatgtaa 5160

agaatgattt aaaatattaa ttatgaattt tttgagtata atacccaata agcttttaat 5220

tagagcagag ttttaattaa aagttttaaa tcagtccaa 5259

Claims

1.一种预防肾脏移植接受者中的蛋白尿或减轻蛋白尿的严重程度的方法，其中所述方法包括：

(a)将肾脏移植到所述接受者中，其中所述肾脏获自α-1,3半乳糖基转移酶缺陷型小型猪，并且所述肾脏的肾小球以足以预防或减轻所述接受者中的蛋白尿的严重程度的水平表达人CD47；以及

(b)将猪造血干细胞移植到所述接受者中，其中所述猪造血干细胞表达人CD47并且获自α-1,3半乳糖基转移酶缺陷型小型猪。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述肾脏的所述肾小球的人CD47表达水平高于所述肾脏的肾小管中的人CD47表达水平。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述肾脏的所述肾小球的人CD47表达水平是所述肾脏的所述肾小管中的人CD47表达水平的2倍至10倍。

4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述α-1,3半乳糖基转移酶缺陷型小型猪是MHC近交的Columbia/Sachs小型猪。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中通过实时聚合酶链反应测量所述人CD47表达水平。

6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述接受者是哺乳动物。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述接受者是人。

8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述猪造血干细胞获自骨髓、外周血、脐带血或胎肝细胞。

9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述人CD47在与内源性猪CD47相同的调控元件下表达。

10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述人CD47替代所述α-1,3半乳糖基转移酶缺陷型小型猪中的内源性猪CD47。

11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述人CD47在肾小球特异性启动子下表达。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述肾小球特异性启动子是肾病蛋白。

13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述蛋白尿是肾性蛋白尿。

14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述蛋白尿降至每24小时少于3g。

15.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述蛋白尿降至每24小时500mg。

16.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述蛋白尿降至每24小时300mg。

17.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述蛋白尿降至每24小时150mg。

18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述蛋白尿在所述移植后两周内消退。

19.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述蛋白尿在所述移植后一个月内消退。

20.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述蛋白尿在所述移植后两个月内消退。

21.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述蛋白尿在所述移植后四个月内消退。

22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述肾脏是胸腺肾。

23.一种从小型猪分离的肾脏，其中所述肾脏的肾小球的人CD47表达水平高于所述肾脏的肾小管中的人CD47表达水平。

24.如权利要求23所述的肾脏，其中所述肾脏的所述肾小球的人CD47表达水平是所述肾脏的所述肾小管中的人CD47表达水平的2倍至10倍。

25.如权利要求23或24所述的肾脏，其中所述人CD47表达水平通过实时聚合酶链反应来测量。

26.如权利要求23至25中任一项所述的肾脏，其中所述人CD47在与内源性猪CD47相同的调控元件下表达。

27.如权利要求23至26中任一项所述的肾脏，其中所述人CD47在肾小球特异性启动子下表达。

28.如权利要求27所述的肾脏，其中所述肾小球特异性启动子是肾病蛋白。

29.如权利要求23至28中任一项所述的肾脏，其中所述肾脏是胸腺肾。

30.如权利要求23至29中任一项所述的肾脏，其中所述小型猪是α-1,3半乳糖基转移酶缺陷型小型猪。

31.如权利要求30所述的肾脏，其中所述α-1,3半乳糖基转移酶缺陷型小型猪是MHC近交的Columbia/Sachs小型猪。

32.一种将来自小型猪的肾脏移植到人接受者中的方法，其中所述方法包括：

(a)经由骨内移植将来自第一小型猪的骨髓移植给所述接受者；以及

(b)将来自第二小型猪的肾脏移植给所述接受者。

33.如权利要求32所述的方法，其中移植来自第二小型猪的肾脏的所述第二步骤在移植来自第一小型猪的骨髓的第一步骤后至少28天进行。

34.如权利要求32或33所述的方法，其中来自所述第一小型猪的所述骨髓表达人CD47。

35.如权利要求32至34中任一项所述的方法，其中来自所述第二小型猪的所述肾脏表达人CD47。

36.如权利要求32至35中任一项所述的方法，其中来自所述第一小型猪的所述骨髓和来自所述第二小型猪的所述肾脏表达人CD47。

37.如权利要求34至36中任一项所述的方法，其中所述人CD47在与内源性猪CD47相同的调控元件下表达。

38.如权利要求34至37中任一项所述的方法，其中所述人CD47在肾小球特异性启动子下表达。

39.如权利要求38所述的方法，其中所述肾小球特异性启动子是肾病蛋白。

40.如权利要求32至39中任一项所述的方法，其中所述骨髓和所述肾脏来自相同的小型猪。

41.如权利要求32至40中任一项所述的方法，其中所述第一小型猪和所述第二小型猪来自相同的高度近交的小型猪群。

42.如权利要求32至41中任一项所述的方法，其中所述第一小型猪和所述第二小型猪是α-1,3半乳糖基转移酶缺陷型小型猪。

43.如权利要求42所述的方法，其中所述α-1,3半乳糖基转移酶缺陷型小型猪是MHC近交的Columbia/Sachs小型猪。

44.如权利要求32至43中任一项所述的方法，其中所述第一小型猪和所述第二小型猪是基因匹配的小型猪。

45.如权利要求44所述的方法，其中所述第一小型猪和所述第二小型猪是MHC匹配的。

46.如权利要求32至43中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述接受者施用一种或多种另外的治疗。

47.如权利要求46所述的方法，其中所述一种或多种另外的治疗选自包括以下的组：全身辐照、胸腺辐照、利妥昔单抗、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)、他克莫司、吗替麦考酚酯(MMF)、抗CD154抗体、眼镜蛇毒因子(CVF)、肝素、前列环素、重组猪细胞因子、猪干细胞因子(pCSF)、猪白介素3(pIL-3)、更昔洛韦、甲泼尼龙、抗IL6受体抗体和抗CD40抗体。

48.如权利要求32至47中任一项所述的方法，所述方法还包括将来自小型猪的朗格汉斯岛细胞移植给所述接受者。

49.一种来自非人物种的异种移植物，其中所述异种移植物包含：

(a)肾脏；和

(b)朗格汉斯岛细胞，

其中所述肾脏包含肾小球，所述肾小球的人CD47表达水平高于所述肾脏的肾小管中的人CD47表达水平。

50.如权利要求49所述的异种移植物，其中所述肾脏的所述肾小球的人CD47表达水平是所述肾脏的所述肾小管中的人CD47表达水平的2倍至10倍。

51.如权利要求49或50所述的异种移植物，其中所述人CD47表达水平通过实时聚合酶链反应来测量。

52.如权利要求50至51中任一项所述的异种移植物，其中所述人CD47在与内源性猪CD47相同的调控元件下表达。

53.如权利要求49至52中任一项所述的异种移植物，其中所述人CD47在肾小球特异性启动子下表达。

54.如权利要求53所述的异种移植物，其中所述肾小球特异性启动子是肾病蛋白。

55.如权利要求49至54中任一项所述的异种移植物，其中所述肾脏是胸腺肾。