JP5642729B2 - 線維性疾患のためのモデルとしての遺伝子導入動物 - Google Patents
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Description
病理学的には、該疾患は、肺の線維芽細胞病巣内の慢性炎症及びコラーゲン生成を特徴とする。線維芽細胞病巣の顕著な特徴である筋線維芽細胞は、形質転換成長因子β(TGF-β)の刺激による実質性線維芽細胞の局所的活性から生じると考えられ、歴史的には線維性障害におけるコラーゲン生成細胞であると考えられている(Selman and Pardo, 2003);さらに、CTGF(結合組織成長因子)は非常に重要な因子であると考えられており、分化及びコラーゲン遺伝子発現に必要である。しかし、最近の知見はこの基本的な考え方に疑問を呈しており、病理学的線維芽細胞の造血由来を提案している(Hashimoto et al., 2004)。
該疾患は、典型的には肺の瘢痕化及び線維性組織によって線が引かれる肺胞を進行させる。瘢痕が形成されると該組織は厚くなり、酸素を血流に運ぶ該組織の能力効率に不可逆的な損失を引き起こす(Gross and Hunninghake, 2001)。
現在、肺性線維症のための有効な処置又は治療はない。肺の瘢痕を治療するための薬理学的試薬は、依然として実験段階である。従来の理論はそれが自己免疫障害であろうことを前提としていたが、炎症を抑えるための処置は線維性進行を減少させる限定された成功のみを有する(Giri, 2003)。肺性線維症は非常に複雑な疾患であるため、診断後の患者の寿命予測は非常に変化する。
従って、本発明の目的は、線維性疾患、例えば強皮症様疾患に関連して発生する肺性線維症(全身性線維症)、又は他の線維性疾患のための動物モデルを提供することである。
本発明による問題の解決策は、転写調節因子AP-1に結合した分子機構に基づく。
転写調節因子AP-1は、Fos、Jun、及びCREB/ATF蛋白質群の一連の二量体生成物(Eferl and Wagner, 2003)、並びに他のbZip蛋白質によって生成される。さらに、Fos又はJunとNFκBのp65サブユニットとの間(Stein et al., 1993)、及びATF-2とp50-NFκBとの間(Du et al., 1993)に結合が観察された。組み合わせの結合は、3種のJun遺伝子(c-jun、junB、junD)、4種のFos遺伝子(c-fos、fosB、fra-1、fra-2)及び数種のCREB/ATF遺伝子(Eferl and Wagner, 2003)で引き出すことができる。全構造上の特徴における高度の相同性にも関わらず、Fos、Jun及びCREB群の種々の要素は著しい違いを示し、これらは個々の二量体のための遺伝子調節における特定の機能を示唆するDNA結合及び転写活性にわずかな違いを導く(Jochum et al., 2001)。AP-1群の要素は、細胞増殖並びに種々のタイプの分化の制御に関与し、神経機能及びストレス反応にも関与する。AP-1は、外部刺激を遺伝子発現の短期間及び長期間変化の両方に変換する主要因子の1種である(Jochum et al., 2001)。
本発明を導く実験では、Fra-2の遺伝子座が遺伝子導入マウス(fra-2tg)に広く過剰発現し、これは本来、骨芽細胞及び破骨細胞機能において増加したFra-2活性の結果を調査するためのものである。fra-2tgマウスのための遺伝子導入ベクターは、c-fostg及びfra1tgマウスと同様の方法で設計され(Grigoriadis et al., 1993; Jochum et al., 2000)、3種の遺伝子導入マウスモデルの有意義な比較を可能にする。
従って、本発明は、線維性疾患の表現型で発現を示すfra-2の広範な又は細胞タイプに特異的な異所性発現を有するヒトではない遺伝子導入哺乳動物、特に齧歯動物を含む、線維性疾患のための動物モデルに関する。
好ましい実施態様では、線維性疾患は肺性疾患、特に肺性線維症である。
本発明の意味では、“肺性疾患”という用語は、肺(肺性)線維症及び突発性肺性疾患から選択される線維性成分を伴う肺性疾患、他の間質性肺炎(IP)、例えば巨細胞性間質性肺炎、非特異性IP、突発性組織化肺炎、膠原血管病関連IP、及び薬剤誘発IP、さらにサルコイドーシス、嚢胞性線維症、呼吸窮迫症候群、肉芽腫症、ケイ肺症、石綿症、肺を含む全身性強皮症、並びに線維症及び喘息又はCOPDにおける再構築を含む。
また、本発明の実験では、fra2tgマウスが、過剰な治癒に関連する皮膚の線維性障害を患うことが示された。皮膚のケロイド及び肥大性瘢痕は、該線維性皮膚障害の例である。
マウスの背中の皮膚の全層創傷治癒実験は、創縫合がfra-2tgマウスで遅れることを実証し、これは閉じている創傷における肉芽組織の過剰な生成によるものであり、過剰な瘢痕形成を導く。
従って、さらなる特徴では、本発明の動物モデルは線維性皮膚障害のためのモデルとしても有用である。
好ましい実施態様では、齧歯動物がマウスである。
異種Fra-2核酸は、例えば、標準プロトコルに従う宿主動物の胚又は胚幹細胞の遺伝子操作によってそのような動物の生殖細胞系に導入される。
以下では、fra-2遺伝子導入齧歯動物/マウスを“fra-2tg”齧歯動物/マウスと呼ぶ。
“fra-2”(又は“Fra-2”)によって、関心のある表現型、すなわち線維性疾患、特に肺性線維症でそれ自体を示すような適切な濃度及び位置における好適なプロモーターの制御下で発現するときに起因する、任意の哺乳類種からのfra-2 DNA(又はFra-2蛋白質)を意味する。
選択されたfra-2 DNAは、選択された動物種(例えば、マウスがマウスfra-2 DNA導入遺伝子を有し、ラットがラットfra-2導入遺伝子を有する)の同種fra-2遺伝子と同一でよく、又は異なっていてもよく、例えば特にヒト疾患のためのモデル及びヒト疾患のための阻害剤をスクリーニング又は特徴付けるためのモデルとしての動物の使用を考慮して、ヒトfra-2でよい。
本発明の実験では、成分H2-Kb(プロモーター)、IRES-EGFP(レポーター遺伝子)及びLTR(エンハンサー)を遺伝子導入構築に用いた;これらの成分は他の成分と置き換えることができるが、但し体内の濃度及び場所における導入遺伝子の発現は、それ自体を関心のある表現型で示すようなものである。導入遺伝子発現に好適な偏在性プロモーターの例は、ユビキチンCプロモーター、CMVプロモーター/エンハンサー、Pgk1プロモーター又はニワトリβ-アクチンプロモーターである(Schorpp et al., 1996)。導入遺伝子発現を監視するのに好適なレポーターシステムの例は、β-ガラクトシターゼ、EGFP、EYFP、ERFPである。fra-2の広範な発現を保証するための構築物に任意に存在してよい好適なエンハンサー成分の例は、FBJマウス骨肉腫ウィルスからの長い末端反復(LTR)である。
あるいは関心のある細胞を遺伝子導入動物から単離するために、各主要な細胞又は細胞系をfra-2 DNAで移入することができる。
fra-2tgマウス及びそこから生じる細胞は、肺性疾患のような線維性疾患の治療のための薬剤を試験するのに有用である。
本発明の動物モデルは、治療計画、例えば薬理学的介入によって異常な瘢痕形成を回避するための化合物を試験するのにも用いることができる。特に、fra-2tgマウス又はfra-2tg細胞を、過剰な治癒における瘢痕形成の阻害剤をスクリーニングするための検定に用いることができる。本発明の実験は、Fra-2自体が、過剰な瘢痕形成を含む線維性障害の薬理学的介入のための標的であることを示した。従って、Fra-2阻害剤は、そのような疾患のための阻害剤として有用となり得る。
本発明のさらなる特徴では、遺伝子導入動物及びそこから生じる細胞系はまた、例えば、Fra-2活性に依存する未だ特定されていない線維形成性経路を阻害することにより、線維性疾患、特に肺性線維症の治療に有効な候補化合物を特定又は試験するのに用いることができる。
用量は、用いた投与形態及び用いた投与経路に依存してこの範囲内で変化する。いかなる化合物でも、治療上有効量は、最初に細胞培養検定から評価することができる。用量は動物モデルで処方し、細胞培養液で測定してIC50以上(すわなち、症候群の半値阻害を達成する試験化合物の濃度)異常を含む循環血漿濃度範囲を達成してよい(作用薬では、IC50値以上の値(又は作用薬ではED50値)が好ましい)。
そのような情報を用いて、ヒトに有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中濃度は公知の方法によって測定してよく、例えば高性能液体クロマトグラフィーによる。
従来のブレオマイシン誘発肺性線維症モデルでは、この目的を妨害する骨髄移植研究などの実験が可能でなかった。さらに、fra-2tgマウスをRag2欠乏又はTNF-α受容体p55機能を損失したマウスなどの異なる遺伝的背景に繁殖させ、それぞれの肺性線維症に対する自己反応性T-細胞及びTNF-情報伝達の寄与を評価することができる。本発明の動物モデルで得ることのできる信頼のある細胞タイプ及び主要な情報伝達経路に関する知識は、肺性線維症の治療のために試験する薬剤の一般的な指導に中心的な影響を有する。
fra-2tgマウスの生成
fra-2全長遺伝子座は、ゲノムλDNAライブラリーから単離し、配列を決定し、及びpBS IIベクターにクローン化する。主要な組織適合性の複雑な分類Iの抗原H2-Kbのためのプロモーター(Grigoriadis et al., 1993)を、fra-2遺伝子座の前にクローン化して、偏在的な導入遺伝子発現を可能にする。導入遺伝子活性を監視するために、IRES-EGFP(Zhu et al., 1999)配列を、FBJ-マウスサルコーマウィルスの長い末端反復(LTR)配列の後に続いているfra-2遺伝子座の後にクローン化する(Grigoriadis et al., 1993)。さらに、loxP部位を、エキソン2の前及びエキソン4の後ろに配置し、導入遺伝子多量体のCre-媒介欠乏、及び異なる導入遺伝子のコピー数を有する数種の遺伝子導入系統の生成、を可能にする。遺伝子導入構築物を、受精したC57Bl76卵母細胞の前核に注入し、3種の独立性遺伝子導入系統を確立する。
fra-2サザンブロットでは、10μgのテールDNAをHind IIIで温浸し、野生タイプのfra-2対立遺伝子のための12.5kbの断片、及び導入遺伝子のための7.5kbの断片を得る。バンドの欠乏では、fra-2のエキソン2に対応する0.6kbのKpnI断片をプローブとして用いる。RNase保護検定では、全肺RNAをTRIZOLプロトコル(Sigma)で単離する。RNase保護検定は、製造者のプロトコルに従うRiboQuantマルチ-プローブRNase保護検定システムmCK-2b及びmCK-5c(PharMingen)を用いて行う。
組織は4℃で中性緩衝された4% PFAで終夜固定し、パラフィンに組み込む。5μmの切片を、ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)又はクロマニリンブルーのいずれかで染色するか、又はさらに処理する。抗CD3のための免疫組織化学的染色(Santa Cruz)を、製造者の推奨に従い、MultiLink Dakoシステム(Dako E0453)による抗原検索(Dako S1699)の後に行う。
6〜10ヶ月目の老いた雌のレシピエントマウスに致死量の放射線を照射し、20時間後に雄のドナーマウスからの骨髄で再構築する。骨髄をドナーマウスの大腿骨及び脛骨から流し、カウントし、及び5x106個の細胞をレシピエントの尾の静脈に注入する。組織学的検査のために屠殺した後に、レシピエントから骨髄及び脾臓細胞を定期的に採取し、再構築の効率をサザンブロット及びEGFP-蛍光のためのFACS分析によって評価する。
fra-2tgマウスの生成及びキャラクタリゼーション
ゲノムfra-2遺伝子座を、遺伝子導入ベクター上に広範な活性H2Kbプロモーターの前且つIRES-EGFPレポーター遺伝子の後に配置する(図1A)。FBJ-マウスサルコーマウィルスの長い末端反復(LTR)配列をfra-2 mRNAの安定化のため、且つ間葉細胞における導入遺伝子発現を保証するために含ませる。エキソン2の前及びエキソン4の後ろに配置されるさらなるloxP部位により、導入遺伝子マルチマーのCre-媒介欠失、並びに異なる導入遺伝子コピー数及び異なる導入遺伝子発現量を有する複数の遺伝子導入系統の生成、が可能となる。異なる導入遺伝子コピー数を有する3種の別個の遺伝子導入系統が生成されている(図1B)。系統12及び13は高濃度の導入遺伝子を発現し(図1C)、それぞれ4、60(4コピー、60コピー)の導入遺伝子コピーを有する。系統15は2(コピー)の導入遺伝子コピーのみを有し、いかなる顕在的導入遺伝子発現も示さない(図1C)。かなりの導入遺伝子発現が、脳を除く系統12及び13の全ての組織で観察することができる(図1D)。
fra-2tgマウスにおける肺性線維症発生
マウスが発生する主要な表現型を、肺組織上で強調されている全身性線維症である。肺性線維症は、fra-2tgマウスの大部分の早期致死性に関与している(図2A)。マウスは生後12ヶ月目辺りで病気になり、肺の重さ(図2B、3A)及び肺組織の線維症の劇的な増加による息切れに苦しむ。肺性線維症は、しばしば環境汚染物質に応じて又は症候群に関連して発生する。数種の組織のコラーゲン染色は、fra-2tgマウスにおける肺性線維症が数種の組織における全身性線維症を特徴とする強皮症様疾患に関連して発生することを説明している(図4A)。肺の線維形成性コラーゲンの生成増加は、即時のPCR分析で確認される。
炎症は肺性線維症における第一のイベントの一つである
10〜14週目の老いたマウスの肺を分析し、fra-2tgマウスにおける肺性線維症の始動イベントを特定する。この分析は、血管及び血管周囲領域における炎症が肺性線維症の第一のイベントの一つであることを説明している(図5A)。免疫組織化学的及び組織化学的染色は、肺を浸潤する主要な細胞集合を特定する。これらはCD3-陽性T-細胞及びエステラーゼ-陽性骨髄細胞である(図5A)。これらの細胞の存在は、ケモカイン及びサイトカインの増加した濃度と関連しており(図5B)、これが肺の線維形成性の変化に寄与し、またさらなる炎症性細胞を誘引し得る。
炎症及び肺性線維症は、気道上皮細胞の微細な損傷によって誘発される
肺性線維症は主に自己免疫疾患であるのか否か、又は免疫システムの多かれ少なかれ重要な寄与を伴う気道上皮の微細な損傷によって誘発されるのか否かは、依然として議論のある問題である。これらの疑問は、骨髄移植実験によって取り組まれる。一方で、該疾患は、fra-2tgマウスが肺損傷及び肺性線維症に関与する自己反応性免疫細胞を発生する場合はfra-2tg骨髄で移植可能であるべきである。他方で、該疾患はまた、気道上皮の微細な損傷が線維症の主要な引金である場合に、野生タイプの骨髄細胞で再構築されるfra-2tgマウスで発生すべきである。予備データは、肺性線維症がfra-2tg骨髄細胞で容易に移植できないことを示唆しており、主要な原因として自己免疫疾患を除外する(図6)。しかし、深刻な肺性線維症は、野生タイプの骨髄で再構築されたfra2tgマウスで発生しているように思われる(図7)。これらのデータは、おそらく肺胞上皮細胞のアポトーシスによって引き起こされる微細な損傷プロセスが肺性線維症の主要な原因であることを示唆している。
Fra-2tgマウスは、極度の瘢痕形成を示す。
Fra-2tgマウスは、背中の皮膚の全層皮膚生検パンチ創傷後に遅れた創傷閉鎖を示す(図8A,C)。コラーゲンからなる肉芽組織の増加量は、創傷後にfra-2tgマウスの創傷で現れる(図8B)。創傷時及び創傷後3日目に採取した皮膚生検によるRNase保護検定は、AP-1要素(fra-2を除く)、基質メタロプロテイナーゼ、TIMPs、サイトカイン、TGF-β群要素及びケモカインの発現に違いがないことを説明している(図8D-G)。これらのデータは、増加したFra-2活性が創傷閉鎖における遅れ及び過剰な瘢痕形成を導くことを説明している。これは、Fra-2活性の阻害剤を異所的に投与して損傷又は外科処置後の瘢痕形成を回避できることを示唆している。
Claims (5)
- 遺伝子導入齧歯動物から得られた、fra−2を過剰発現する試験細胞を試験化合物と接触させ、前記試験細胞における前記試験化合物の効果を測定し、及び前記効果を対照細胞における前記試験化合物の効果と比較することを含む、線維性疾患における試験化合物の効果を決定する方法であって、
前記遺伝子導入齧歯動物は、遺伝子導入ベクターを含み、前記遺伝子導入ベクターは、(i)ゲノムfra−2遺伝子座、(ii)H2K b プロモーター、及び(iii)FBJ−マウスサルコーマウイルスの長い末端反復(LTR)配列を含み、
前記遺伝子導入齧歯動物は、線維性疾患の表現型を示すfra−2の広範な発現を有し、
前記齧歯動物はマウスであり、
前記試験細胞は、遺伝子導入ベクターを含み、前記遺伝子導入ベクターは、(i)ゲノムfra−2遺伝子座、(ii)H2K b プロモーター、及び(iii)FBJ−マウスサルコーマウイルスの長い末端反復(LTR)配列を含み、且つ
前記試験細胞は、線維芽細胞又は筋線維芽細胞である、前記方法。 - 線維性疾患が、強皮症様全身性線維症である、請求項1記載の方法。
- 線維性疾患が、肺性線維症である、請求項1記載の方法。
- 線維性疾患が、線維性皮膚障害である、請求項1記載の方法。
- 線維性皮膚障害が、過剰な瘢痕形成である、請求項4記載の方法。
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