KR101547283B1 - 호흡기 염증 동물모델 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 호흡기 염증 동물모델 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 동물에 구아니딘계 화합물을 투여하여 호흡기 염증을 유발하는 단계를 포함하는 호흡기 염증 동물모델의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 호흡기 염증을 갖는 동물모델 및 이를 이용한 호흡기 염증 예방용 또는 치료용 약물 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 호흡기 염증 동물모델은 정확한 호흡기 염증 연구를 위한 동물모델을 제공할 수 있는 효과가 있으며, 호흡기 예방 또는 치료약제의 스크리닝을 위한 검증으로 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 호흡기 염증 동물모델 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 동물에 구아니딘계 화합물을 투여하여 호흡기 염증을 유발하는 단계를 포함하는 호흡기 염증 동물모델의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 호흡기 염증을 갖는 동물모델 및 이를 이용한 호흡기 염증 예방용 또는 치료용 약물 스크리닝 방법에 관한 것이다.
염증은 병원균, 화학물질을 포함하는 어떠한 신체상의 손상이 일어나는 경우 신체에서 이를 제거하고자 하는 비특이적 면역 반응이다(L. Ferrero-Miliani et al.,2006). 병원균 또는 화학물질들이 폐로 들어가면, 폐의 상피세포 및 폐포의 대식세포들이 단핵구, 호중구 및 림프구와 같은 여러 면역세포들을 손상부위로 불러 모아 인터류킨 및 케모카인들을 방출하여 몸에서 병원균 및 화학물질을 제거하게 한다.
한편, 구아니딘계 화합물의 하나인 폴리헥사메틸렌구아니딘 포스페이트는(PHMG-P, C7H18N3O4P)m (C7H15N3)n))는 구아니딘기를 가지는 수용성 화합물로, 독성이 적지만, 강한 살균효과로 널리 사용되고 있다(Lee et al.,2009; Chang et al., 2006). PHMG-P는 FDA에서 의료장비의 소독제로 승인 받았으며, 일본, 호주 및 중국을 포함하는 여러 국가에서 살균제로 등록 받아 판매되고 있다.
정확한 호흡기 염증 연구를 위한 동물모델을 제공하기 위하여, 본 발명은 의약적으로 호흡기 염증 질환 연구를 위해 사용될 수 있는 동물모델 및 그 제조방법을 제공하고자 한다.
또한, 호흡기 예방 또는 치료약제의 스크리닝을 위하여, 본 발명은 상기 동물모델을 이용한 호흡기 염증 예방용 또는 치료용 약물 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 국한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 호흡기 염증 동물모델, 그 제조방법 및 이를 이용한 호흡기 염증 예방용 또는 치료용 약물 스크리닝 방법에 관한 것으로, 본 발명자들은 호흡을 통한 노출시에 구아니딘계 화합물의 일례인 폴리헥사메틸렌구아니딘 포스페이트가 농도에 비례하여 폐염증을 유발한다는 결과를 기초로 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 구현예는 정상 동물에 구아닌딘계 화합물을 투여하여 호흡기 염증을 유발하는 단계를 포함하는 호흡기 염증 동물모델의 제조방법을 제공한다.
다른 일 구현예는 상기 방법에 의해 제조된 호흡기 염증을 갖는 동물모델을 제공하며, 상기 동물모델은 정상동물과 비교하여 (a) 체중의 감소 및 폐 질량의 증가; (b) IL-1β, IL-6, 또는 CXCL1의 농도 증가; (c) IFN-γ 농도 감소; (d) MCP-1 유전자 발현량의 증가; 및 (e) 폐의 염증세포 침윤;으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 특성을 가질 수 있다.
또 다른 일 구현예는 상기 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계; 상기 후보물질이 처리된 동물모델에서 호흡기 염증의 개선 또는 치료 정도를 평가하여 후보물질을 호흡기 염증 치료용 약물로 결정하는 단계를 포함하는, 호흡기 염증 치료용 약물 스크리닝 방법을 제공한다.
또 다른 일 구현예는 정상 동물에 후보물질을 처리하는 단계; 상기 동물에 구아니딘계 화합물을 투여하는 단계; 및 상기 구아니딘계 화합물이 투여 된 동물의 호흡기 염증 정도를 평가하여 후보물질을 호흡기 염증 예방용 약물로 결정하는 단계를 포함하는 호흡기 염증 예방용 약물 스크리닝 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 명세서에서의 "정상동물"은 호흡기 염증이 발생하지 않은 동물을 의미한다. 예컨대, 호흡기 염증 모델과 같은 종이며 동일 또는 유사한 환경에서 사육된 호흡기 염증이 발생하지 않은 동물일 수 있다.
폐는 많은 화학작용제 및 병원균들이 들어올 수 있는 주요 통로 중 하나이다. 게다가, 폐는 표면적이 넓고 혈관생성이 좋아 흡입이 빠른 흡수통로의 하나이다. 이러한 관점에서 흡입은 독성 측정의 중요한 경로이다.
본 발명자들은 이를 기초로 하여 기관내 점적투여를 통한 마우스에서의 PHMG-P의 흡입독성을 확인하여 실험 경과에 따른 체중 및 폐 질량의 변화와 사이토카인들을 측정하였다. 그 결과 마우스에서 PHMG-P가 호흡기 염증을 야기시킨다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 일 구현예는 정상 동물에 구아니딘계 화합물을 투여 하여 호흡기 염증을 유발하는 단계를 포함하는 호흡기 염증 동물모델의 제조방법을 제공한다.
상기 구아니딘계 화합물은 폴리헥사메틸렌구아니딘 포스페이트(PHMG-P), 폴리헥사메틸렌구아니딘 클로라이드, 폴리-[2-(2-에톡시)-에톡시에틸]-구아니디니움-클로라이드(PGH), 및 폴리헥사메틸렌 바이구아니딘 히드로클로라이드(PHMB)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 예컨대, 구아니딘계 화합물은 폴리헥사메틸렌구아니딘 포스페이트 또는 폴리-[2-(2-에톡시)-에톡시에틸]-구아니디니움-클로라이드(PGH)일 수 있다.
상기 구아니딘계 화합물을 투여하는 방식은, 기도내 투여, 비부 흡입, 또는 전신노출 흡입의 방식으로 수행될 수 있다. 예컨대, 상기 구아니딘계 화합물은 비부노출 흡입장치 또는 전신노출 흡입장치를 통해 흡입될 수 있다.
구아니딘계 화합물의 투여량은 적절히 조절될 수 있다. 예컨대, PHMG-P의 기도내 투여의 경우, 투여량은 투여대상 동물의 단위체중(kg)당 0.2 mg/kg 미만이면 호흡기 염증이 유발되기 어려우며, 2 mg/kg 초과하면 동물이 사망을 하게 되므로, PHMG-P의 투여량은 0.2 내지 2 mg/kg, 또는 0.6 내지 0.9 mg/kg일 수 있다.
구아니딘계 화합물의 투여용량은 적절히 조절될 수 있다. 예컨대, PHMG-P의 투여용량은 30 내지 250 ul일 수 있다. 기도를 통해 폐내로 액체인 물질을 투여하는 것은 동물에게 스트레스로 작용할 수 있으므로 최대 투여용량은 70 ul 내지 250 ul 일 수 있으며, 바람직하게는 하루 1회 PHMG-P을 최대 50 내지 100 ul까지 투여할 수 있다.
구아니딘계 화합물을 투여하는 횟수는 1회 또는 2회 이상일 수 있으나, 이는 구아니딘계 화합물의 투여량에 따라 적절히 조절될 수 있다. 예컨대, 기도내 투여 시 동물의 마취가 필수적이므로 하루 1회 또는 2회 투여하며, 투여량에 따라 투여간격 및 투여횟수를 조절할 수 있다.
상기 동물은 인간을 제외한 포유류, 예를 들어 마우스, 래트 및 햄스터를 포함하는 설치류; 토끼; 말, 소, 개, 원숭이, 기니피그, 고양이; 및 기타 등을 포함한다. 예컨대, 상기 동물은 마우스, 더 구체적으로 C57BL/7일 수 있으며, C57BL/6는 폐 염증을 잘 일으키는 종으로 많은 논문에서 언급이 되고 있다(Rossi et al., 1987; Down et al., 1983; Ward et al., 1989; Schrier et al., 1983; Daly et al., 1997).
상기 호흡기 염증은 공기 중의 산소를 흡수하고 에너지 대사의 결과로 발생한 이산화탄소를 배출하는 기능을 하는 계통에 관련된 기관들의 염증을 말한다. 예컨대 세기관지염, 폐염증 등이 상기 호흡기 염증에 해당된다.
다른 일 구현예는 상기 방법에 의해 제조된 호흡기 염증을 갖는 동물모델을 제공한다.
본 발명자들은 구아니딘계 화합물의 투여로 인해 정상동물과 비교하여 호흡기 염증 동물모델은 아래의 (a) 내지 (e)의 결과를 보이는 것을 실험을 통해 확인하였다:
(a) 체중의 감소 및 폐 질량의 증가;
(b) IL-1β, IL-6, 또는 CXCL1의 농도 증가;
(c) IFN-γ농도 감소;
(d) MCP-1 유전자 발현량의 증가;
(e) 폐의 염증세포 침윤.
따라서 상기 호흡기 염증 동물모델은 정상동물과 비교하여 (a) 체중의 감소 및 폐 질량의 증가; (b) IL-1β, IL-6, 또는 CXCL1의 농도 증가; (c) IFN-γ 농도 감소; (d) MCP-1 유전자 발현량의 증가; 및 (e) 폐의 염증세포 침윤;으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 특성을 가질 수 있다.
상기 (a) 내지 (e)은 구아니딘계 화합물의 투여 후 1 내지 10주 후에 정상동물과 비교되는 특성일 수 있다.
상기 (a)와 관련하여, 호흡기 염증 동물모델의 체중은 정상동물의 체중과 비교하여 체중대비 5 내지 40% 감소를 가지며, 폐 질량은 10 내지 200% 증가를 가질 수 있다.
상기 (b)와 관련하여, 호흡기 염증 동물모델의 IL-1β, IL-6, 또는 CXCL1의 농도는 정상동물의 농도와 비교하여 150 내지 1000% 증가된 수치를 가질 수 있다.
상기 (c)와 관련하여, 호흡기 염증 동물모델의 IFN-γ 농도는 정상동물의 농도와 비교하여 10 내지 60 % 감소된 수치를 가질 수 있다.
상기 (b), (c)에서, IL-1β, IL-6, CXCL1, 및 IFN-γ 수치는 사이토카인이나 케모카인을 측정할 수 있는 공지된 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예컨대, 효소면역측정법(ELISA)를 통해 상기 IL-1β, IL-6, CXCL1, 및 IFN-γ 수치가 측정될 수 있다.
상기 (d)와 관련하여, 호흡기 염증 동물모델의 MCP-1 유전자 발현량은 정상동물의 MCP-1 유전자 발현량과 비교하여 150 내지 5000% 증가된 수치를 가질 수 있다. 상기 (d)에서, MCP-1 유전자의 발현량은 유전자의 발현량 분석방법으로 공지된 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예컨대, real-time PCR로 측정될 수 있다.
상기 (e)와 관련하여, 호흡기 염증 동물모델의 폐의 염증세포 침윤 이 정상동물의 폐의 염증세포 침윤과 비교하여 10 내지 1000 % 증가된 수치를 가질 수 있다. 상기 (e)에서 폐의 염증세포 침윤은 세포 또는 조직의 병리학적 관찰방법으로 공지된 방법을 이용하여 관찰될 수 있다. 예컨대, 폐의 조직슬라이드를 헤마톡시린-에오진 염색(hematoxylin- eosin stain)을 한 후 광학 현미경으로 관찰될 수 있다.
상기 호흡기 염증 동물모델은 정확한 호흡기 염증 연구를 위한 동물모델로 사용이 될 수 있지만, 또한 호흡기 염증 예방 또는 치료약제의 스크리닝을 위한 검증으로 유용하게 사용될 수 있다.
따라서 또 다른 일 구현예는 상기 호흡기 염증 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계; 상기 후보물질이 처리된 동물모델에서 호흡기 염증의 개선 또는 치료 정도를 평가하여 후보물질을 호흡기 염증 치료용 약물로 결정하는 단계를 포함하는 호흡기 염증 치료용 약물 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 후보물질은 호흡기 염증을 치료할 수 있는 물질로 화학물질, 올리고뉴클레오타이드, 펩티드, 유전자, 단백질 등의 물질을 제한 없이 포함한다.
상기 호흡기 염증의 개선 또는 치료 정도의 평가는 하기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나 이상의 지표를 대조군의 그것과 비교하는 것일 수 있다:
(1) 체중 및 폐 질량;
(2) IL-1β, IL-6, 또는 CXCL1의 농도;
(3) IFN-γ농도;
(4) MCP-1 유전자의 발현량; 및
(5) 폐의 염증세포 침윤 상태.
상기 (1)의 지표와 관련하여, 후보물질을 처리한 군과 대조군의 체중 및 폐 질량을 비교하여 호흡기 염증의 개선 또는 치료 정도를 평가할 수 있다. 후보물질을 처리한 군이 대조군과 비교하여 체중이 증가하고 폐 질량이 감소하는 경우 호흡기 염증 치료용 약물로 판단될 수 있다.
상기 (2)의 지표와 관련하여, 농도 측정은 앞서 설명한 (b)와 같으며, 후보물질을 처리한 군과 대조군의 IL-1β, IL-6, 또는 CXCL1의 농도를 비교하여 호흡기 염증의 개선 또는 치료 정도를 평가할 수 있다. 후보물질을 처리한 군이 대조군과 비교하여 IL-1β, IL-6, 또는 CXCL1 농도가 감소하는 경우 호흡기 염증 치료용 약물로 판단될 수 있다.
상기 (3)의 지표와 관련하여, 농도 측정은 앞서 설명한 (c)와 같으며, 후보물질을 처리한 군과 대조군의 IFN-γ 농도를 비교하여 호흡기 염증의 개선 또는 치료 정도를 평가할 수 있다. 후보물질을 처리한 군이 대조군과 비교하여 IFN-γ 농도가 증가하는 경우 호흡기 염증 치료용 약물로 판단될 수 있다.
상기 (4)의 지표와 관련하여, 발현량 측정은 앞서 설명한 (d)와 같으며, 후보물질을 처리한 군과 대조군의 MCP-1 유전자 발현량을 비교하여 호흡기 염증의 개선 또는 치료 정도를 평가할 수 있다. 후보물질을 처리한 군이 대조군과 비교하여 MCP-1 유전자 발현량이 감소한 경우 호흡기 염증 치료용 약물로 판단될 수 있다.
상기 (5)의 지표와 관련하여, 관찰은 앞서 설명한 (e)와 같으며, 후보물질을 처리한 군과 대조군의 폐의 염증세포 침윤 상태를 비교하여 호흡기 염증의 개선 또는 치료 정도를 평가할 수 있다. 후보물질을 처리한 군이 대조군과 비교하여 폐의 염증세포 침윤이 감소한 경우 호흡기 염증 치료용 약물로 판단될 수 있다.
따라서, 상기 결정하는 단계는 후보물질을 처리한 군이 대조군과 비교하여, 체중의 증가 및 폐 질량의 감소; IL-1β, IL-6, 또는 CXCL1의 농도 감소; IFN-γ 농도 증가; MCP-1 유전자의 발현량 감소; 및 폐의 염증세포 침윤 감소; 로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 결과인 경우, 상기 후보물질을 호흡기 염증 치료용 약물로 결정할 수 있다.
상기 대조군이란 후보물질 대신 호흡기 염증치료용 약물의 부형제를 처리한 군을 말하며, 예컨대 상기 대조군은 생리식염수, 멸균증류수, 카르복시메틸셀룰로스 또는 PBS(phosphate buffered saline)를 처리한 군일 수 있다.
또 다른 일 구현예는 정상 동물에 후보물질을 처리하는 단계; 상기 동물에 구아니딘계 화합물을 투여하는 단계; 및 상기 구아니딘계 화합물이 투여된 동물의 호흡기 염증 정도를 평가하여 후보물질을 호흡기 염증 예방용 약물로 결정하는 단계를 포함하는 호흡기 염증 예방용 약물 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 후보물질은 앞선 설명과 같다.
상기 호흡기 염증의 정도의 평가는 하기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나 이상의 지표를 대조군의 그것과 비교하는 것일 수 있다:
(1) 체중 및 폐 질량;
(2) IL-1β, IL-6, 또는 CXCL1의 농도;
(3) IFN-γ 농도;
(4) MCP-1 유전자의 발현량; 및
(5) 폐의 염증세포 침윤 상태.
상기 (1)의 지표와 관련하여, 후보물질을 처리한 군과 대조군의 체중 및 폐 질량을 비교하여 호흡기 염증 정도를 평가할 수 있다. 후보물질을 처리한 군이 대조군과 비교하여 체중이 증가하고 폐 질량이 감소한 경우 호흡기 염증 예방용 약물로 판단할 수 있다.
상기 (2)의 지표와 관련하여, 농도 측정은 앞서 설명한 (b)와 같으며, 후보물질을 처리한 군과 대조군의 IL-1β, IL-6, 또는 CXCL1의 농도를 비교하여 호흡기 염증 정도를 평가할 수 있다. 후보물질을 처리한 군이 대조군과 비교하여 IL-1β, IL-6, 또는 CXCL1 농도가 감소한 경우 호흡기 염증 예방용 약물로 판단할 수 있다.
상기 (3)의 지표와 관련하여, 농도 측정은 앞서 설명한 (c)와 같으며, 후보물질을 처리한 군과 대조군의 IFN-γ 농도를 비교하여 호흡기 염증 정도를 평가할 수 있다. 후보물질을 처리한 군이 대조군과 비교하여 IFN-γ 농도가 증가한 경우 호흡기 염증 예방용 약물로 판단될 수 있다.
상기 (4)의 지표와 관련하여, 발현량 측정은 앞서 설명한 (d)와 같으며, 후보물질을 처리한 군과 대조군의 MCP-1 유전자 발현량을 비교하여 호흡기 염증 정도를 평가할 수 있다. 후보물질을 처리한 군이 대조군과 비교하여 MCP-1 유전자 발현량이 감소한 경우 호흡기 염증 예방용 약물로 판단될 수 있다.
상기 (5)의 지표와 관련하여, 관찰은 앞서 설명한 (e)와 같으며, 후보물질을 처리한 군과 대조군의 폐의 염증세포 침윤 상태를 비교하여 호흡기 염증 정도를 평가할 수 있다. 후보물질을 처리한 군이 대조군과 비교하여 폐의 염증세포 침윤이 감소하는 경우 호흡기 염증 예방용 약물로 판단될 수 있다.
따라서, 상기 결정하는 단계는 후보물질을 처리한 군이 후보물질 대신에 생리식염수, 멸균증류수, 카르복시메틸셀룰로스 또는 PBS(phosphate buffered saline)를 처리한 대조군과 비교하여, 체중의 증가 및 폐 질량의 감소; IL-1β, IL-6, 또는 CXCL1의 농도 감소; IFN-γ 농도 증가; MCP-1 유전자의 발현량 감소; 및 폐의 염증세포 침윤 상태 감소;로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 결과인 경우, 상기 후보물질을 호흡기 염증 예방용 약물로 결정할 수 있다.
상기 대조군이란 후보물질 대신 호흡기 염증예방용 약물의 부형제를 처리한 군을 말하며, 예컨대 상기 대조군은 생리식염수, 멸균증류수, 카르복시메틸셀룰로스 또는 PBS(phosphate buffered saline)를 처리한 군일 수 있다.
본 발명에 따른 호흡기 염증 동물모델은 정확한 호흡기 염증 연구를 위한 동물모델을 제공할 수 있는 효과가 있으며, 호흡기 예방 또는 치료약제의 스크리닝을 위한 검증으로 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 PHMG-P를 기도내 투여한 후, 마우스의 체중과 폐 질량의 변화를 나타낸 것이다 (control: 생리식염수를 투여한 군(대조군). *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 2는 PHMG-P를 비부노출로 흡입시킨 후, 래트의 체중과 폐 질량의 변화를 나타낸 것이다 (control: 깨끗한 공기(clean air)를 흡입시킨 군 (대조군). *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 3은 대조군과 0.3 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG-P를 기도내로 투여한 7일 및 14일째의 폐에서 측정한 MCP-1의 mRNA 발현 결과를 나타낸 것이다 (control: 생리식염수를 투여한 군(대조군). *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 4는 대조군과 0.3 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG-P를 기도내로 투여한 후 7일 및 14일째의 폐에서 측정한 IL-1β, IL-6, CXCL1, IFN-γ의 농도를 나타낸 것이다(control: 생리식염수를 투여한 군(대조군, *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 5는 대조군과 0.28 mg/kg PHMG-P를 흡입 투여한 후 44일째의 폐에서 측정한 IL-1β, IL-6, IFN-γ의 농도를 나타낸 것이다(control: 깨끗한 공기(clean air)를 흡입시킨 군(대조군, *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 6은 대조군과 0.48 mg/kg PGH를 흡입 투여한 후 4주와 7주째의 폐에서 측정한 IL-1β농도를 나타낸 것이다(control: 깨끗한 공기(clean air)를 흡입시킨 군(대조군, *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 7a는 control과 0.3 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG-P를 기도내로 투여한 7일째의 폐를 헤마톡실린과 에오진(H&E) 염색한 조직 사진이며, 도 7b는 14일째의 폐를 헤마톡실린과 에오진(H&E) 염색한 조직 사진이다.
도 8은 control과 0.28 mg/kg PHMG-P를 비부흡입시킨 후 44일째의 폐의 조직 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 PHMG-P를 비부노출로 흡입시킨 후, 래트의 체중과 폐 질량의 변화를 나타낸 것이다 (control: 깨끗한 공기(clean air)를 흡입시킨 군 (대조군). *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 3은 대조군과 0.3 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG-P를 기도내로 투여한 7일 및 14일째의 폐에서 측정한 MCP-1의 mRNA 발현 결과를 나타낸 것이다 (control: 생리식염수를 투여한 군(대조군). *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 4는 대조군과 0.3 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG-P를 기도내로 투여한 후 7일 및 14일째의 폐에서 측정한 IL-1β, IL-6, CXCL1, IFN-γ의 농도를 나타낸 것이다(control: 생리식염수를 투여한 군(대조군, *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 5는 대조군과 0.28 mg/kg PHMG-P를 흡입 투여한 후 44일째의 폐에서 측정한 IL-1β, IL-6, IFN-γ의 농도를 나타낸 것이다(control: 깨끗한 공기(clean air)를 흡입시킨 군(대조군, *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 6은 대조군과 0.48 mg/kg PGH를 흡입 투여한 후 4주와 7주째의 폐에서 측정한 IL-1β농도를 나타낸 것이다(control: 깨끗한 공기(clean air)를 흡입시킨 군(대조군, *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 7a는 control과 0.3 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG-P를 기도내로 투여한 7일째의 폐를 헤마톡실린과 에오진(H&E) 염색한 조직 사진이며, 도 7b는 14일째의 폐를 헤마톡실린과 에오진(H&E) 염색한 조직 사진이다.
도 8은 control과 0.28 mg/kg PHMG-P를 비부흡입시킨 후 44일째의 폐의 조직 사진을 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예
1.
PHMG
-P를
기도내
투여한 마우스의 제조
1.1 재료
PHMG-P는 SK 케미칼에서 제공하였으며, 생리식염수(Saline)은 대한약품에서 구입하였다.
1.2 동물
실험동물로 사용된 7주령의 수컷 C57BL/7 마우스는 오리엔트 바이오에서 구입하였으며 마우스는 동물시설에 사육하였다. 온도 22±3℃, 상대습도 50±10%, 환기는 1시간에 10번 내지 20번, 오전 8시와 오후 8시를 기준으로 12시간 주기로 명암을 바꾸어 주었으며, 빛은 150-300 Lux로 유지하였다. 실험에 사용하기 전 마우스는 5일 이상 동물 시설에 적응시켰다. 실험동물의 먹이 (PM Nutrition International, Richmond, Indiana, USA), 자외선 살균(Steritron SX-1, 대영설비 주식회사) 및 여과된(1 um) 수돗물을 자유식으로 제공하였다. 각 그룹마다 동물의 체중이 비슷하도록 하였고, 한 그룹은 총 5마리씩의 마우스로 구성되었다.
1.3
폐염증
동물 모델 제작
마우스는 동물용 흡입마취기를 이용해 아이소플루레인(isoflurane)으로 충분히 마취하였다. 마취된 마우스를 아크릴 슬라이드판에 올려 놓고 윗니를 이용하여 고정하였다. 혀를 포셉으로 이용하여 입 밖으로 뺀 후 자동비디오점적기(automatic video instillator, 두배)를 이용하여 마우스에 0.3 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG-P 을 각각 50 μl씩 기도내로 천천히 투여하였다(Kim et al.,2010). 대조군의 마우스는 같은 경로로 생리식염수를 투여하였으며, 이하 실시예에서의 대조군의 실험방법은 PHMG-P를 투여한 실험군의 실험방법과 동일하게 진행하였다.
실시예
2.
PHMG
-P를
비부흡입한
래트의
제조
2.1 재료
PHMG-P는 SK 케미칼에서 제공하였다.
2.2 동물
실험동물로 사용된 6주령의 수컷 SD 래트는 오리엔트 바이오에서 구입하였으며 래트는 동물시설에 사육하였다. 온도 22±3℃, 상대습도 50±10%, 환기는 1시간에 10번 내지 20번, 오전 8시와 오후 8시를 기준으로 12시간 주기로 명암을 바꾸어 주었으며, 빛은 150-300 Lux로 유지하였다. 실험에 사용하기 전 래트는 5일 이상 동물 시설에 적응시켰고, 그 후 일주일 간 하루 1시간 이상 3회 홀더적응훈련을 시켰다. 실험동물의 먹이 (PM Nutrition International, Richmond, Indiana, USA), 자외선 살균(Steritron SX-1, 대영설비 주식회사) 및 여과된(1 um) 수돗물을 자유식으로 제공하였다. 각 그룹마다 동물의 체중이 비슷하도록 하였고, 한 그룹은 총 6마리씩의 래트로 구성되었다.
2.3
폐염증
동물 모델 제작
비부노출 흡입장치(nose only inhalation chamber, HCT, Korea)에 래트를 장착한 후, 나노입자발생장치(nebulizer)를 이용하여 PHMG-P를 에어로졸 상태로 발생시킨 후 희석공기와 혼합하여 래트에게 흡입시켰다. 이 때 PHMG-P의 농도는 0.28 mg/kg 였다. 대조군의 실험방법은 PHMG-P를 투여한 실험군의 실험방법과 동일하게 진행하였고, PHMP-P 에어로졸 대신에 깨끗한 공기 (clean air)를 노출하였다.
실시예
3.
PGH
를 전신노출한
래트의
제조
3.1 재료
PGH는 Shanghi Scunder Industrial co., LTD에서 구매하였다.
3.2 동물
실험동물로 사용된 6주령의 수컷과 암컷의 SD 래트는 오리엔트 바이오에서 구입하였으며 래트는 동물시설에 사육하였다. 온도 22±3℃, 상대습도 50±10%, 환기는 1시간에 10번 내지 20번, 오전 8시와 오후 8시를 기준으로 12시간 주기로 명암을 바꾸어 주었으며, 빛은 150-300 Lux로 유지하였다. 실험에 사용하기 전 래트는 5일 이상 동물 시설에 적응시켰다. 실험동물의 먹이 (PM Nutrition International, Richmond, Indiana, USA), 자외선 살균(Steritron SX-1, 대영설비 주식회사) 및 여과된(1 um) 수돗물을 자유식으로 제공하였다. 각 그룹마다 동물의 체중이 비슷하도록 하였고, 한 그룹은 총 5마리씩의 래트로 구성되었다.
3.3
폐염증
동물 모델 제작
전신노출 흡입장치(Whole body inhalation chamber, HCT, Korea) 에 래트를 장착한 후, Constant Atomizer(HCT, Korea)를 이용하여 PGH를 에어로졸 상태로 발생시킨 후 희석공기와 혼합하여 전신노출 시켰다. 이 때 PGH의 농도는 0.48 mg/kg 였다. 대조군의 실험방법은 PGH를 투여한 실험군의 실험방법과 동일하게 진행하였고, PGH 에어로졸 대신에 깨끗한 공기 (clean air)를 노출하였다.
실시예
4. 체중과 폐 질량 측정
4.1
PHMG
-P를
기도내
투여한 마우스
체중은 기도내 투여 직전과 투여 후 정해진 날짜에 관찰하였다. 투여 후 7일 및 14일 후에 아이소플루레인 과마취시켜 마우스를 안락사시키고 부검하였다. 폐를 꺼낸 후 즉시 폐 질량을 측정하였고, 왼쪽 폐는 10% 중성 완충포르말린에 고정시켰다. 오른쪽 폐는 유전자 발현 및 사이토카인을 측정하기 위해 스냅-프로즌(snap-frozen) 시켰다.
마우스의 체중은 기도내 투여 직전과 투여 후에 매일 관찰하였으며, 폐를 적출 후 바로 질량을 측정하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1은 PHMG-P를 기도내 투여한 후, 마우스의 체중과 폐 질량의 변화를 나타낸 것이다 (control: 생리식염수를 투여한 군(대조군). *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 1에 나타난 바와 같이, 0.9 mg/kg 투여량의 PHMG-P와 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG-P의 마우스는 노출 2일째부터 급격하게 체중이 감소하였다. 8일부터는 천천히 체중이 증가하였지만 실험이 끝날 때까지 정상수준으로는 도달하지 못했다. 그러나 0.3 mg/kg 투여량의 PHMG-P 그룹에서는 체중 감소가 발견되지 않았다. 폐의 질량은 7일 및 14일째 투여량에 비례하여 증가하였다.
4.2.
PHMG
-P를
비부흡입한
래트
체중은 투여 후 일주일에 3번씩 측정하였다. 44일 후에 아이소플루레인 과마취시켜 래트를 안락사시키고 부검하였다. 폐를 꺼낸 후 즉시 폐 질량을 측정하였고, 왼쪽 폐는 10% 중성 완충포르말린에 고정시켰다. 오른쪽 폐는 유전자 발현 및 사이토카인을 측정하기 위해 스냅-프로즌(snap-frozen) 시켰다.
래트의 체중과 폐 질량은 도 2에 나타내었다.
도 2는 PHMG-P를 비부노출로 흡입시킨 후, 래트의 체중과 폐 질량의 변화를 나타낸 것이다 (control: 깨끗한 공기를 흡입시킨 군 (대조군). *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 2에 나타난 바와 같이, 17일째부터 체중이 유의하게 감소하기 시작하여 43일까지 계속 체중이 급격하게 감소하였다. 21일 마지막 노출 이후에도 계속 체중이 감소하였고 부검일까지 회복하지 못했다. 체중 및 장기의 질량은 독성평가에 중요한데, 폐의 질량은 44일째 대조군에 비하여 약 1.5배 정도 증가하였다.
실시예
5. 유전자 발현 변화(
PHMG
-P를 투여한 마우스)
0.3 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG-P를 마우스의 기도내 투여를 한 지 7일, 14일째 부검을 실시하여 폐를 적출하였다. 적출한 폐로부터 RNeasy Mini kit (Qiagen)를 이용하여 total RNA들을 분리하였다. Total RNA의 1 ug을 Improm-II TM Reverse Transcription System (Promega, city, country)을 이용하여 cDNA로 역전사시켰다. 피브로넥틴, MCP-1(monocyte chemoattractant protein-1)의 발현은 SYBR Green master mix (Applied Biosystems, city, country)를 이용하여 측정하였고, HPRT는 인터널컨트롤(internal control)로 사용하였으며, 구체적인 프라이머의 시퀀스는 하기 표 1과 같다.
| 유전자 | 구분 | 서열 | 서열번호 |
| fibronectin | 센스 | 5-CACGATGCGGGTCACTTG-3 | 서열번호 1 |
| 안티센스 | 5-CTGCAACGTCCTCTTCATTCTTC-3 | 서열번호 2 | |
| MCP-1 | 센스 | 5-AGGTGTCCCAAAGAAGCTGTA-3 | 서열번호 3 |
| 안티센스 | 5-ATGTCTGGACCCATTCCTTCT-3 | 서열번호 4 | |
| HPRT | 센스 | 5-TTATGGACAGGACTGAAAGAC-3 | 서열번호 5 |
| 안티센스 | 5-GCCATCTCCTGCTCGAAGTC-3 | 서열번호 6 |
상기 실험결과를 도 3에 나타내었으며, 도 3은 대조군과 0.3 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG-P를 기도내로 투여한 7일 및 14일째의 폐에서 측정한 MCP-1의 mRNA 발현 결과를 나타낸 것이다(control: 생리식염수를 투여한 군(대조군). *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 3에 나타난 바와 같이, Neutroophil atrractant(호중구 유인물질)로 알려진 케모카인 MCP-1 mRNA((Hogaboam et al. 1999; Gharaee-Kermani et al., 1996)이 7일째와 14일째 0.9 mg/kg, 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG-P 처리군에서 증가하였다.
실시예
6. 사이토카인 및
케모카인의
변화 확인
6.1
PHMG
-P를
기도내
투여한 마우스
사이토카인들은 질병의 진행에 있어 결정적인 요인이다. 사이토카인들의 패턴 및 지속기간은 호흡기 염증의 진행상황을 보여준다.
실시예 4.1에 따라 동결된 폐를 PBS (1% Triton X-100)에 넣고 호모게나이저를 이용하여 균질화한 후, 30분간 4℃에서 쉐이커(shaker) 위에 두었다. 폐 용해액 (lysate)을 13000rpm로 원심분리하여 상층액만 따로 모았다. 제조사의 프로토콜에 따라, IL-1β IL-6, CXCL1, IFN-γ ELISA kit (R&D systems)를 이용하여 상층액내의 IL-1β IL-6, CXCL1, IFN-γ 농도를 측정하였다. 폐용해액의 상층액의 단백질량은 BCA protein assay (Sigma Aldrich)로 측정한 후, IL-1β, IL-6, CXCL1, IFN-γ농도를 보정하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4은 대조군과 0.3 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG-P를 기도내로 투여한 후 7일 및 14일째의 폐에서 측정한 IL-1β, IL-6, CXCL1, IFN-γ의 농도를 나타낸 것이다(control: 생리식염수를 투여한 군(대조군, *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 4에 나타난 바와 같이, 0.9 mg/kg, 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG-P 처리군의 염증성 사이토카인(cytokine) IL-1, IL-6와 케모카인(chemokine) CXCL1의 농도는 7일 및 14일째에 대조군과 비교하여 상당히 증가하는 것을 확인하였으며, PHMG-P에 노출된 후 7일째에 가장 높은 농도를 보였고, 14일째까지 상기 IL-1, IL-6, CXCL1의 농도는 계속 유지되었다. 7일째 0.3 mg/kg 투여량의 PHMG-P 처리군을 포함한 모든 그룹에서 anti-fibrotic cytokine인 IFN-γ 농도는 상당히 감소하였다. 그러나 14일째에는 정상범위로 회복되었다.
6.2
PHMG
-P를
비부흡입한
래트
실시예 4.2에 따라 동결된 폐를 PBS (1% Triton X-100)에 넣고 호모게나이저를 이용하여 균질화한 후, 30분간 4℃에서 쉐이커(shaker) 위에 두었다. 폐 용해액 (lysate)을 13000rpm로 원심분리하여 상층액만 따로 모았다. 제조사의 프로토콜에 따라, IL-1β IL-6, IFN-γ ELISA kit (R&D systems)를 이용하여 상층액내의 IL-1β IL-6, IFN-γ 농도를 측정하였다. 폐용해액의 상층액의 단백질량은 BCA protein assay (Sigma Aldrich)로 측정한 후, IL-1β IL-6, IFN-γ 농도를 보정하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5는 대조군과 0.28 mg/kg PHMG-P를 흡입 투여한 후 44일째의 폐에서 측정한 IL-1β, IL-6, IFN-γ의 농도를 나타낸 것이다(control: 깨끗한 공기(clean air)를 흡입시킨 군(대조군, *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 5에 나타난 바와 같이, 0.28 mg/kg PHMG-P를 흡입 투여한 PHMG-P 처리군의 염증성 사이토카인(cytokine) IL-1β와 IL-6의 농도는 대조군과 비교하여 상당히 증가하는 것을 확인하였다.
6.3
PGH
를 전신노출한
래트
실시예 4.2와 동일한 방법으로 44일 후에 아이소플루레인 과마취시켜 래트를 안락사시키고 부검하였고, 오른쪽 폐는 유전자 발현 및 사이토카인을 측정하기 위해 스냅-프로즌(snap-frozen) 시켰다.
동결된 폐를 PBS (1% Triton X-100)에 넣고 호모게나이저를 이용하여 균질화한 후, 30분간 4℃에서 쉐이커(shaker) 위에 두었다. 폐 용해액 (lysate)을 13000rpm로 원심분리하여 상층액만 따로 모았다. 제조사의 프로토콜에 따라, IL-1β ELISA kit (R&D systems)를 이용하여 상층액내의 IL-1β 농도를 측정하였다. 폐용해액의 상층액의 단백질량은 BCA protein assay (Sigma Aldrich)로 측정한 후, IL-1β 농도를 보정하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6은 대조군과 0.48 mg/kg PGH를 흡입 투여한 후 4주와 7주째의 폐에서 측정한 IL-1β농도를 나타낸 것이다(control: 깨끗한 공기(clean air)를 흡입시킨 군(대조군, *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 6에 나타난 바와 같이, 0.48 mg/kg PGH를 흡입 투여한 PGH 처리군의 염증성 사이토카인(cytokine) IL-1β의 농도는 대조군과 비교하여 암수 모두에서 상당히 증가하는 것을 확인하였다.
실시예
7. 병리조직학적 시험
7.1
PHMG
-P를
기도내
투여한 마우스
폐 샘플은 병리조직학적 시험을 위해 헤마톡실린-에오진 염색 (Hematoxylin-Eosin stain)을 하여 현미경으로 관찰하였으며, 그 결과를 도 7a 및 도 7b에 나타내었다.
도 7a는 control과 0.3 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG-P를 기도내로 투여한 7일째의 폐의 조직 사진이며, 도 7b는 14일째의 폐의 조직 사진이다.
도 7a 내지 도 7b에 나타난 바와 같이, 모든 3가지 투여량의 PHMG-P 처리군에서 7일째에 폐에 많은 염증세포가 혈관주위, 세기관지주위, 흉막아래, 폐의 간질(interstitial) 내에 침윤되었고, 14일째에는 염증이 더 악화된 것을 확인하였다. 상기 결과로부터 PHMG-P가 급성 염증과 만성염증을 유발하였음을 확인하였다. 7일째는 상피세포의 과형성이, 14일째는 상피세포의 괴사 혹은 위축이 관찰되었다.
7.2
PHMG
-P를
비부흡입한
래트
폐 샘플은 병리조직학적 시험을 위해 헤마톡실린-에오진 염색 (Hematoxylin-Eosin stain)을 하여 현미경으로 관찰하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8은 control과 0.28 mg/kg PHMG-P를 비부흡입시킨 후 44일째의 폐의 조직 사진으로, 왼쪽은 control 이며, 오른쪽은 PHMG-P의 처리군을 나타낸다.
도 8에 나타난 바와 같이, 폐에서 만성 염증(Chronic Inflammation), 공포상 대식세포(Foamy macrophages), 기관지폐포 과형성(Bronchioloalveolar Hyperplasia) 이 관찰되었다.
실시예
8. 통계 분석
8.1
PHMG
-P를
기도내
투여한 마우스
0.3 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG에 노출된 마우스들로부터의 데이터를 ANOVA(one-way analysis of variance)를 이용하여 생리식염수에 노출된 마우스들과 비교하였다 (SPSS Ver15.0.0, SPSS Inc.). p value가 0.05보다 작은 값을 통계적으로 유의하다고 평가하였다. 모든 데이터는 평균±표준오차(SE)로 나타냈다.
8.2
PHMG
-P를
비부흡입한
래트
T-test를 이용하여 0.28 mg/kg PHMG-P를 흡입 투여한 래트로부터의 데이터를 깨끗한 공기에 노출된 래트의 데이터와 비교하였다 (SPSS Ver15.0.0, SPSS Inc.). p value가 0.05보다 작은 값을 통계적으로 유의하다고 평가하였다. 모든 데이터는 평균±표준오차(SE)로 나타냈다.
8.3
PGH
를 전신 노출한
래트
T-test를 이용하여 0.48 mg/kg PGH를 흡입 투여한 래트로부터의 데이터를 깨끗한 공기에 노출된 래트의 데이터와 비교하였다 (SPSS Ver15.0.0, SPSS Inc.). p value가 0.05보다 작은 값을 통계적으로 유의하다고 평가하였다. 모든 데이터는 평균±표준오차(SE)로 나타냈다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY
<120> ANIMAL MODEL HAVING RESPIRATORY ORGAN INFLAMMATION AND USES
THEREOF
<130> DPP20126642KR
<160> 6
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for fibronectin
<400> 1
cacgatgcgg gtcacttg 18
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for fibronectin
<400> 2
ctgcaacgtc ctcttcattc ttc 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for MCP-1
<400> 3
aggtgtccca aagaagctgt a 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for MCP-1
<400> 4
atgtctggac ccattccttc t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for HPRT
<400> 5
ttatggacag gactgaaaga c 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for HPRT
<400> 6
gccatctcct gctcgaagtc 20
Claims (14)
- 정상 동물에 구아니딘계 화합물을 투여하여 호흡기 염증을 유발하는 단계를 포함하는 호흡기 염증 동물모델의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 구아니딘계 화합물의 투여는 기도내 투여, 비부 흡입, 또는 전신노출 흡입의 방식으로 수행되는 것인, 동물모델의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 구아니딘계 화합물은 폴리헥사메틸렌구아니딘 포스페이트(PHMG-P), 폴리헥사메틸렌구아니딘 클로라이드, 폴리-[2-(2-에톡시)-에톡시에틸]-구아니디니움-클로라이드(PGH), 및 폴리헥사메틸렌 바이구아니딘 히드로클로라이드(PHMB)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 동물모델의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 구아니딘계 화합물은 폴리헥사메틸렌구아니딘 포스페이트인 것인, 동물모델의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 구아니딘계 화합물의 투여량은 동물의 단위체중(kg)당 0.2 내지 2 mg/kg인, 동물모델의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 구아니딘계 화합물의 투여용량은 30 내지 250 ul인, 동물모델의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 동물은 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 말, 소, 개, 원숭이, 기니피그 또는 고양이인 것인, 동물모델의 제조방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 정상 동물에 후보물질을 처리하는 단계; 상기 동물에 구아니딘계 화합물을 투여하는 단계; 및 상기 구아니딘계 화합물이 투여된 동물의 호흡기 염증 정도를 평가하여 후보물질을 호흡기 염증 예방용 약물로 결정하는 단계를 포함하는 호흡기 염증 예방용 약물 스크리닝 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 결정하는 단계는 후보물질을 처리한 군이 후보물질 대신에 생리식염수, 멸균증류수, 카르복시메틸셀룰로스 또는 PBS(phosphate buffered saline)를 처리한 대조군과 비교하여,
체중의 증가 및 폐 질량의 감소;
IL-1β, IL-6, 또는 CXCL1의 농도 감소;
IFN-γ 농도 증가;
MCP-1 유전자의 발현량 감소; 및
폐의 염증세포 침윤 상태 감소;인 경우, 상기 후보물질을 호흡기 염증 예방용 약물로 결정하는 것인, 약물 스크리닝 방법.
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| KR1020130102569A KR101547283B1 (ko) | 2013-08-28 | 2013-08-28 | 호흡기 염증 동물모델 및 이의 용도 |
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2013
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