KR20150025218A - 폐 섬유증 동물모델 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 호흡기 염증 동물모델 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 동물에 구아니딘계 화합물을 투여하여 폐 섬유증을 유발하는 단계를 포함하는 폐 섬유증 동물모델의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 폐 섬유증을 갖는 동물모델 및 이를 이용한 폐 섬유증 예방용 또는 치료용 약물 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 폐 섬유증 동물모델은 정확한 폐 섬유증 연구를 위한 동물모델을 제공할 수 있는 효과가 있으며, 호흡기 예방 또는 치료약제의 스크리닝을 위한 검증으로 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 폐 섬유증 동물모델 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 동물에 구아니딘계 화합물을 투여하여 폐 섬유증을 유발하는 단계를 포함하는 폐 섬유증 동물모델의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 폐 섬유증을 갖는 동물모델 및 이를 이용한 폐 섬유증 예방용 또는 치료용 약물 스크리닝 방법에 관한 것이다.
폐 섬유증은 폐염증에서 발생하는 질병으로, 아직 그 원인이 알려지지 않았다. 병원균 또는 화학물질들이 폐로 들어가면, 폐의 상피세포들 및 폐포의 대식세포들이 단핵구, 호중구 및 림프구와 같은 여러 면역세포들을 손상부위로 불러 모아 인터류킨 및 케모카인들을 방출하여 몸에서 병원균 및 화학물질을 제거하고자 한다. 폐 섬유증은 이러한 폐염증이 치유되지 않고 계속적으로 재발하여 발생하는 병으로, 폐 실질세포가 점차 수축되고 딱딱하게 굳어져 폐 기능을 잃게 되어 호흡 부전으로 사망에 이르는 병이다 (Coker et al., 1998). 폐 섬유증 환자의 평균 생존기간은 진단 후 4년에서 6년 정도로 알려져 있으며(American Thoracic Society, 5), 폐 섬유증 치료제 개발이 절실히 요구되고 있으나, 현재 효과있는 치료제는 없는 실정이다. 미 식품의약국(FDA)으로부터 폐섬유증 치료제로 승인을 받은 약물이 전무한 상태이며, 현재는 단지 상태를 호전시키거나 생활의 질을 향상시키기 위한 대증적 치료 방법만이 사용되고 있다.
한편, 구아니딘계 화합물의 하나인 폴리헥사메틸렌구아니딘 포스페이트는(PHMG-P, C7H18N3O4P)m (C7H15N3)n))는 구아니딘기를 가지는 수용성 화합물로, 독성이 적지만, 강한 살균효과로 널리 사용되고 있다(Lee et al.,2009; Chang et al., 2006). PHMG-P는 FDA에서 의료장비의 소독제로 승인 받았으며, 일본, 호주 및 중국을 포함하는 여러 국가에서 살균제로 등록 받아 판매되고 있다.
정확한 폐 섬유증 연구를 위한 동물모델을 제공하기 위하여, 본 발명은 의약적으로 폐 섬유증 연구를 위해 사용될 수 있는 동물모델 및 그 제조방법을 제공하고자 한다.
또한, 페 섬유증 예방 또는 치료약제의 스크리닝을 위하여, 본 발명은 상기 동물모델을 이용한 폐 섬유증 예방용 또는 치료용 약물 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 국한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 폐 섬유증 동물모델, 그 제조방법 및 이를 이용한 폐 섬유증 예방용 또는 치료용 약물 스크리닝 방법에 관한 것으로 본 발명자들은 호흡을 통한 노출시에 구아니딘계 화합물의 일례인 폴리헥사메틸렌구아니딘 포스페이트는 농도에 비례하여 폐 섬유증을 유발한다는 결과를 기초로 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 구현예는 정상 동물에 구아닌딘계 화합물을 투여하여 폐 섬유증을 유발하는 단계를 포함하는 폐 섬유증 동물모델의 제조방법을 제공한다.
다른 일 구현예는 상기 방법에 의해 제조된 폐 섬유증을 갖는 동물모델을 제공하며, 상기 동물모델은 정상동물과 비교하여 (a) 체중의 감소 및 폐 질량의 증가; (b) IL-1β, IL-6, 또는 CXCL1의 농도 증가; (c) IFN-γ의 농도 감소; (d) 피브로넥틴(fibronectin) 유전자, MMP(metalloproteinases) 2, MMP 12 또는 MCP-1 유전자 발현량의 증가; (e) 피브로넥틴(fibronectin) 또는 MMP 9 단백질 발현량의 증가; (f) TIMP(tissue inhibitor of metalloproteinases)-1 단백질 발현량 감소; 및 (g) 폐의 염증세포 침윤 및 콜라겐 침착;으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 특성을 가질 수 있다.
또 다른 일 구현예는 상기 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계; 상기 후보물질이 처리된 동물모델에서 폐 섬유증의 개선 또는 치료 정도를 평가하여 후보물질을 폐 섬유증 치료용 약물로 결정하는 단계를 포함하는, 폐 섬유증 치료용 약물 스크리닝 방법을 제공한다.
또 다른 일 구현예는 정상 동물에 후보물질을 처리하는 단계; 상기 동물에 구아니딘계 화합물을 투여하는 단계; 및 상기 구아니딘계 화합물이 투여 된 동물의 폐 섬유화 정도를 평가하여 후보물질을 폐 섬유증 예방용 약물로 결정하는 단계를 포함하는 폐 섬유증 예방용 약물 스크리닝 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 명세서에서의 "정상동물"은 폐 섬유증이 발생하지 않은 동물을 의미한다. 예컨대, 폐 섬유증 모델과 같은 종이며 동일 또는 유사한 환경에서 사육된 폐 섬유증이 발생하지 않은 동물일 수 있다.
폐는 많은 화학작용제 및 병원균들이 들어올 수 있는 주요 통로 중 하나이다. 게다가, 폐는 표면적이 넓고 혈관생성이 좋아 흡입이 빠른 흡수통로의 하나이다. 이러한 관점에서 흡입은 독성 측정의 중요한 경로이다.
본 발명자들은 이를 기초로 하여 기관내 점적투여를 통한 마우스에서의 PHMG-P의 독성을 확인하여 실험 경과에 따른 체중 및 폐 질량의 변화와 사이토카인들을 측정하였다. 그 결과 마우스에서 PHMG-P가 폐 섬유증을 야기시킨다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 일 구현예는 정상 동물에 구아니딘계 화합물을 투여하여 폐 섬유증을 유발하는 단계를 포함하는 폐 섬유증 동물모델의 제조방법을 제공한다.
상기 구아니딘계 화합물은 폴리헥사메틸렌구아니딘 포스페이트(PHMG-P), 폴리헥사메틸렌구아니딘 클로라이드, 폴리-[2-(2-에톡시)-에톡시에틸]-구아니디니움-클로라이드](PGH), 및 폴리헥사메틸렌 바이구아니딘 히드로클로라이드(PHMB)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 예컨대, 구아니딘계 화합물은 폴리헥사메틸렌구아니딘 포스페이트 또는 폴리-[2-(2-에톡시)-에톡시에틸]-구아니디니움-클로라이드](PGH)일 수 있다.
상기 구아니딘계 화합물을 투여하는 방식은, 기도내 투여, 비부 흡입, 또는 전신노출 흡입의 방식으로 수행될 수 있다. 예컨대, 상기 구아니딘계 화합물은 비부노출 흡입장치 또는 전신노출 흡입장치를 통해 흡입될 수 있다.
구아니딘계 화합물의 투여량은 적절히 조절될 수 있다. 예컨대, PHMG-P의 기도내 투여의 경우, 투여량은 투여대상 동물의 단위체중(kg)당 0.2 mg/kg 미만이면 폐 섬유증이 유발되기 어려우며, 3 mg/kg 초과하면 동물이 사망을 하게 되므로, PHMG-P의 투여량은 0.2 내지 3 mg/kg, 또는 0.6 내지 0.9 mg/kg일 수 있다.
구아니딘계 화합물의 투여용량은 적절히 조절될 수 있다. 예컨대, PHMG-P의 투여용량은 30 내지 250 ul일 수 있다. 기도를 통해 폐내로 액체인 물질을 투여하는 것은 동물에게 스트레스로 작용할 수 있으므로 최대 투여용량은 70 ul 내지 250 ul 일 수 있으며, 바람직하게는 하루 1회 PHMG-P을 최대 50 내지 100 ul까지 투여할 수 있다.
구아니딘계 화합물을 투여하는 횟수는 1회 또는 2회 이상일 수 있으나, 이는 구아니딘계 화합물의 투여량에 따라 적절히 조절될 수 있다. 예컨대, 기도내 투여 시 동물의 마취가 필수적이므로 하루 1회 또는 2회 투여하며, 투여량에 따라 투여간격 및 투여횟수를 조절할 수 있다.
상기 동물은 인간을 제외한 포유류, 예를 들어 마우스, 래트 및 햄스터를 포함하는 설치류; 토끼; 말, 소, 개, 고양이, 원숭이, 기니피그; 및 기타 등을 포함한다. 예컨대, 상기 동물은 마우스, 더 구체적으로 C57BL/7일 수 있으며, C57BL/6는 폐 섬유증을 잘 일으키는 종으로 많은 논문에서 언급이 되고 있다(Rossi et al., 1987; Down et al., 1983; Ward et al., 1989; Schrier et al., 1983; Daly et al., 1997).
상기 폐 섬유증은 폐에 섬유성 결합조직의 증식이 일어나 정상 폐구조의 파괴, 폐조직의 경화, 황폐를 초래한 상태를 모두 포함한다.
다른 일 구현예는 상기 방법에 의해 제조된 폐 섬유증을 갖는 동물모델을 제공한다.
본 발명자들은 구아니딘계 화합물의 투여로 인해 정상동물과 비교하여 폐 섬유증 동물모델은 아래의 (a) 내지 (f)의 결과를 보이는 것을 실험을 통해 확인하였다:
(a) 체중의 감소 및 폐 질량의 증가;
(b) IL-1β, IL-6, 또는 CXCL1의 농도 증가;
(c) IFN-γ의 농도 감소;
(d) 피브로넥틴 유전자, MMP 2 유전자, MMP 12 유전자, 또는 MCP-1 유전자 발현량의 증가;
(e) 피브로넥틴 또는 MMP 9 단백질 발현량의 증가;
(f) TIMP-1 단백질 발현량의 감소;
(g) 폐의 염증세포 침윤 및 콜라겐 침착.
따라서 상기 폐 섬유증 동물모델은 정상동물과 비교하여 (a) 체중의 감소 및 폐 질량의 증가; (b) IL-1β, IL-6, 또는 CXCL1의 농도 증가; (c) IFN-γ의 농도 감소; (d) 피브로넥틴 유전자, MMP 2 유전자, MMP 12 유전자, 또는 MCP-1 유전자 발현량의 증가; (e) 피브로넥틴 또는 MMP 9 단백질 발현량의 증가; (f) TIMP-1 단백질 발현량의 감소; 및 (g) 폐의 염증세포 침윤 및 콜라겐 침착;으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 특성을 가질 수 있다.
상기 (a) 내지 (g)은 구아니딘계 화합물의 투여 후 1 내지 10주 후에 정상동물과 비교되는 특성일 수 있다.
상기 (a)와 관련하여, 폐 섬유증 동물모델의 체중은 정상동물의 체중과 비교하여 체중대비 5 내지 40% 감소를 가지며, 폐 질량은 10 내지 200% 증가를 가질 수 있다.
상기 (b)와 관련하여, 폐 섬유증 동물모델의 IL-1β, IL-6, 또는 CXCL1의 농도는 정상동물의 농도와 비교하여 150 내지 1000% 증가된 수치를 가질 수 있다.
상기 (c)와 관련하여, 폐 섬유증 동물모델의 IFN-γ의 농도는 정상동물의 농도와 비교하여 10 내지 60% 감소된 수치를 가질 수 있다.
상기 (b), (c)에서, IL-1β, IL-6, CXCL1, 및 IFN-γ의 수치는 사이토카인이나 케모카인을 측정할 수 있는 공지된 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예컨대, 효소면역측정법(ELISA)를 통해 상기 IL-1β, IL-6, CXCL1, 및 IFN-γ의 수치가 측정될 수 있다.
상기 (d)와 관련하여, 폐 섬유증 동물모델의 피브로넥틴 유전자, MMP 2 유전자, MMP 12 유전자, 또는 MCP-1 유전자 발현량은 정상동물의 피브로넥틴 유전자, MMP 2 유전자, MMP 12 유전자, 또는 MCP-1 유전자 발현량과 비교하여 150 내지 5000% 증가된 수치를 가질 수 있다. 상기 (d)에서, 피브로넥틴 유전자, MMP 2 유전자, MMP 12 유전자, 또는 MCP-1 유전자의 발현량은 유전자의 발현량 분석방법으로 공지된 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예컨대, real-time PCR로 측정될 수 있다.
상기 (e)와 관련하여, 폐 섬유증 동물모델의 피브로넥틴 또는 MMP 9 단백질 발현량은 정상동물의 피브로넥틴 또는 MMP 9 단백질 발현량과 비교하여 10 내지 1000 % 증가된 수치를 가질 수 있다. 상기 (e)에서, 피브로넥틴 또는 MMP 9 단백질 발현량은 단백질 발현량 분석방법으로 공지된 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예컨대, 웨스턴 블롯(western blot)으로 측정될 수 있다.
상기 (f)와 관련하여, 폐 섬유증 동물모델의 TIMP-1 단백질 발현량은 정상동물의 TIMP-1 단백질 발현량은 정상동물의 TIMP-1 단백질 발현량과 비교하여 10 내지 80 % 감소된 수치를 가질 수 있다. 상기 (f)에서, TIMP-1 단백질 발현량은 단백질 분석방법으로 공지된 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예컨대, 웨스턴 블롯(western blot)으로 측정될 수 있다.
상기 (g)와 관련하여, 폐 섬유증 동물모델의 폐의 염증세포 침윤 및 콜라겐 침착이 정상동물의 폐의 염증세포 침윤 및 콜라겐 침착과 비교하여 10 내지 1000% 증가된 수치를 가질 수 있다. 상기 (g)에서 폐의 염증세포 침윤 및 콜라겐 침착은 세포 또는 조직의 병리학적 관찰방법으로 공지된 방법을 이용하여 관찰될 수 있다. 예컨대, 폐의 조직슬라이드를 헤마톡시린-에오진 염색(hematoxylin- eosin stain) 및 Masson's trichrome 염색을 한 후 광학 현미경으로 관찰될 수 있다.
상기 폐 섬유증 동물모델은 정확한 폐 섬유증 연구를 위한 동물모델로 사용이 될 수 있지만, 또한 폐 섬유증 예방 또는 치료약제의 스크리닝을 위한 검증으로 유용하게 사용될 수 있다.
따라서 또 다른 일 구현예는 상기 폐 섬유증 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계; 상기 후보물질이 처리된 동물모델에서 폐 섬유증의 개선 또는 치료 정도를 평가하여 후보물질을 폐 섬유증 치료용 약물로 결정하는 단계를 포함하는 폐 섬유증 치료용 약물 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 후보물질은 폐 섬유증을 치료할 수 있는 물질로 화학물질, 올리고뉴클레오타이드, 펩티드, 유전자, 단백질 등의 물질을 제한 없이 포함한다.
상기 폐 섬유증의 개선 또는 치료 정도의 평가는 하기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나 이상의 지표를 대조군의 그것과 비교하는 것일 수 있다:
(1) 체중 및 폐 질량;
(2) IL-1β, IL-6, 또는 CXCL1의 농도;
(3) IFN-γ의 농도;
(4) 피브로넥틴 유전자, MMP 2 유전자, MMP 12 또는 MCP-1 유전자의 발현량;
(5) 피브로넥틴 또는 MMP 9 단백질 발현량;
(6) TIMP-1 단백질 발현량; 및
(7) 폐의 염증세포 침윤 및 콜라겐 침착 상태.
상기 (1)의 지표와 관련하여, 후보물질을 처리한 군과 대조군의 체중 및 폐 질량의 변화를 비교하여 폐 섬유증의 개선 또는 치료 정도를 평가할 수 있다. 후보물질을 처리한 군이 대조군과 비교하여 체중이 증가하고 폐 질량이 감소하는 경우 폐 섬유증 치료용 약물로 판단될 수 있다.
상기 (2)의 지표와 관련하여, 농도 측정은 앞서 설명한 (b)와 같으며, 후보물질을 처리한 군과 대조군의 IL-1β, IL-6, 또는 CXCL1의 농도를 비교하여 폐 섬유증의 개선 또는 치료 정도를 평가할 수 있다. 후보물질을 처리한 군이 대조군과 비교하여 IL-1β, IL-6, 또는 CXCL1 농도가 감소하는 경우 폐 섬유증 치료용 약물로 판단될 수 있다.
상기 (3)의 지표와 관련하여, 농도 측정은 앞서 설명한 (c)와 같으며, 후보물질을 처리한 군과 대조군의 IFN-γ의 농도를 비교하여 폐 섬유증의 개선 또는 치료 정도를 평가할 수 있다. 후보물질을 처리한 군이 대조군과 비교하여 IFN-γ의 농도가 감소하는 경우 폐 섬유증 치료용 약물로 판단될 수 있다.
상기 (4)의 지표와 관련하여, 발현량 측정은 앞서 설명한 (d)와 같으며, 후보물질을 처리한 군과 대조군의 피브로넥틴 유전자, MMP 2 유전자, MMP 12 유전자, 또는 MCP-1 유전자 발현량을 비교하여 폐 섬유증의 개선 또는 치료 정도를 평가할 수 있다. 후보물질을 처리한 군이 대조군과 비교하여 피브로넥틴 유전자, MMP 2 유전자, MMP 12 유전자, 또는 MCP-1 유전자 발현량이 감소한 경우 폐 섬유증 치료용 약물로 판단될 수 있다.
상기 (5)의 지표와 관련하여, 발현량 측정은 앞서 설명한 (e)와 같으며, 후보물질을 처리한 군과 대조군의 피브로넥틴 또는 MMP 9 단백질의 발현량을 비교하여 폐 섬유증의 개선 또는 치료 정도를 평가할 수 있다. 후보물질을 처리한 군이 대조군과 비교하여 피브로넥틴 또는 MMP 9 단백질의 발현량이 감소한 경우 폐 섬유증 치료용 약물로 판단될 수 있다.
상기 (6)의 지표와 관련하여, 발현량 측정은 앞서 설명한 (f)와 같으며, 후보물질을 처리한 군과 대조군의 TIMP-1 단백질의 발현량을 비교하여 폐 섬유증의 개선 또는 치료 정도를 평가할 수 있다. 후보물질을 처리한 군이 대조군과 비교하여 TIMP-1 단백질의 발현량이 증가한 경우 폐 섬유증 치료용 약물로 판단될 수 있다.
상기 (7)의 지표와 관련하여, 관찰은 앞서 설명한 (g)와 같으며, 후보물질을 처리한 군과 대조군의 폐의 염증세포 침윤 및 콜라겐 침착 상태를 비교하여 폐 섬유증의 개선 또는 치료 정도를 평가할 수 있다. 후보물질을 처리한 군이 대조군과 비교하여 폐의 염증세포 침윤 및 콜라겐 침착이 감소한 경우 폐 섬유증 치료용 약물로 판단될 수 있다.
따라서, 상기 결정하는 단계는 후보물질을 처리한 군이 대조군과 비교하여, 체중의 증가 및 폐 질량의 감소; IL-1β, IL-6, 또는 CXCL1의 농도 감소; IFN-γ의 농도 증가; 피브로넥틴 유전자, MMP 2 유전자, MMP 12 유전자 또는 MCP-1 유전자의 발현량 감소; 피브로넥틴 또는 MMP 9 단백질 발현량 증가; TIMP-1 단백질 발현량 증가; 및 폐의 염증세포 침윤 및 콜라겐 침착 상태 감소; 로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 결과인 경우, 상기 후보물질을 폐 섬유증 치료용 약물로 결정할 수 있다.
상기 대조군이란 후보물질 대신 폐 섬유증 치료용 약물의 부형제를 처리한 군을 말하며, 예컨대 상기 대조군은 생리식염수, 멸균증류수, 카르복시메틸셀룰로스 또는 PBS(phosphate buffered saline)를 처리한 군일 수 있다.
또 다른 일 구현예는 정상 동물에 후보물질을 처리하는 단계; 상기 동물에 구아니딘계 화합물을 투여하는 단계; 및 상기 구아니딘계 화합물이 투여 된 동물의 폐 섬유화 정도를 평가하여 후보물질을 폐 섬유증 예방용 약물로 결정하는 단계를 포함하는 폐 섬유증 예방용 약물 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 후보물질은 앞선 설명과 같다.
상기 폐 섬유화 정도의 평가는 하기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나 이상의 지표를 대조군의 그것과 비교하는 것일 수 있다:
(1) 체중 및 폐 질량;
(2) IL-1β, IL-6, 또는 CXCL1의 농도;
(3) IFN-γ의 농도;
(4) 피브로넥틴 유전자, MMP 2 유전자, MMP 12 유전자, 또는 MCP-1 유전자의 발현량;
(5) 피브로넥틴 또는 MMP 9 단백질 발현량;
(6) TIMP-1 단백질 발현량;
(7) 폐의 염증세포 침윤 및 콜라겐 침착.
상기 (1)의 지표와 관련하여, 후보물질을 처리한 군과 대조군의 체중 및 폐 질량을 비교하여 폐 섬유화 정도를 평가할 수 있다. 후보물질을 처리한 군이 대조군과 비교하여 체중이 증가하고 폐 질량이 감소한 경우 폐 섬유증 예방용 약물로 판단할 수 있다.
상기 (2)의 지표와 관련하여, 농도 측정은 앞서 설명한 (b)와 같으며, 후보물질을 처리한 군과 대조군의 IL-1β, IL-6, 또는 CXCL1의 농도를 비교하여 폐 섬유화 정도를 평가할 수 있다. 후보물질을 처리한 군이 대조군과 비교하여 IL-1β, IL-6, 또는 CXCL1 농도가 감소한 경우 폐 섬유증 예방용 약물로 판단할 수 있다.
상기 (3)의 지표와 관련하여, 농도 측정은 앞서 설명한 (c)와 같으며, 후보물질을 처리한 군과 대조군의 IFN-γ의 농도를 비교하여 폐 섬유화 정도를 평가할 수 있다. 후보물질을 처리한 군이 대조군과 비교하여 IFN-γ의 농도가 증가한 경우 폐 섬유증 예방용 약물로 판단될 수 있다.
상기 (4)의 지표와 관련하여, 발현량 측정은 앞서 설명한 (d)와 같으며, 후보물질을 처리한 군과 대조군의 피브로넥틴 유전자, MMP 2 유전자, MMP 12 유전자, 또는 MCP-1 유전자 발현량을 비교하여 폐 섬유화 정도를 평가할 수 있다. 후보물질을 처리한 군이 대조군과 비교하여 피브로넥틴 유전자, MMP 2 유전자, MMP 12 유전자, 또는 MCP-1 유전자 발현량이 감소한 경우 폐 섬유증 예방용 약물로 판단될 수 있다.
상기 (5)의 지표와 관련하여, 발현량 측정은 앞서 설명한 (e)와 같으며, 후보물질을 처리한 군과 대조군의 피브로넥틴 또는 MMP 9 단백질 발현량을 비교하여 폐 섬유화 정도를 평가할 수 있다. 후보물질을 처리한 군이 대조군과 비교하여 피브로넥틴 또는 MMP 9 단백질 발현량이 감소한 경우 폐 섬유증 예방용 약물로 판단될 수 있다.
상기 (6)의 지표와 관련하여, 발현량 측정은 앞서 설명한 (f)와 같으며, 후보물질을 처리한 군과 대조군의 TIMP-1 단백질 발현량을 비교하여 폐 섬유화 정도를 평가할 수 있다. 후보물질을 처리한 군이 대조군과 비교하여 TIMP-1 단백질 발현량이 증가한 경우 폐 섬유증 예방용 약물로 판단될 수 있다.
상기 (7)의 지표와 관련하여, 관찰은 앞서 설명한 (g)와 같으며, 후보물질을 처리한 군과 대조군의 폐의 염증세포 침윤 및 콜라겐 침착 상태를 비교하여 폐 섬유화 정도를 평가할 수 있다. 후보물질을 처리한 군이 대조군과 비교하여 폐의 염증세포 침윤 및 콜라겐 침착 상태가 감소한 경우 폐 섬유증 예방용 약물로 판단될 수 있다.
따라서, 상기 결정하는 단계는 후보물질을 처리한 군이 후보물질 대신에 생리식염수, 멸균증류수, 카르복시메틸셀룰로스 또는 PBS(phosphate buffered saline)를 처리한 대조군과 비교하여, 체중의 증가 및 폐 질량의 감소; IL-1β, IL-6, 또는 CXCL1의 농도 감소; IFN-γ의 농도 증가; 피브로넥틴 유전자, MMP 2 유전자, MMP 12 유전자, 또는 MCP-1 유전자의 발현량 감소; 피브로넥틴 또는 MMP 9 단백질 발현량 감소; TIMP-1 단백질 발현량 증가; 및 폐의 염증세포 침윤 상태 감소;로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 결과인 경우, 상기 후보물질을 폐 섬유증 예방용 약물로 결정할 수 있다.
상기 대조군이란 후보물질 대신 폐 섬유증 예방용 약물의 부형제를 처리한 군을 말하며, 예컨대 상기 대조군은 생리식염수, 멸균증류수, 카르복시메틸셀룰로스 또는 PBS(phosphate buffered saline)를 처리한 군일 수 있다.
본 발명에 따른 폐 섬유증 동물모델은 정확한 폐 섬유증 연구를 위한 동물모델을 제공할 수 있는 효과가 있으며, 호흡기 예방 또는 치료약제의 스크리닝을 위한 검증으로 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 PHMG-P를 기도내 투여한 후, 마우스의 체중과 폐 질량의 변화를 나타낸 것이다 (control: 생리식염수를 투여한 군(대조군). *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 2는 PHMG-P를 비부노출로 흡입시킨 후, 래트의 체중과 폐 질량의 변화를 나타낸 것이다 (control: 깨끗한 공기(clean air)를 흡입시킨 군 (대조군). *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 3은 대조군과 0.3 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG-P를 기도내로 투여한 7일 및 14일째의 폐에서 측정한 fibronectin, MCP-1의 mRNA 발현 결과를 나타낸 것이다 (control: 생리식염수를 투여한 군(대조군). *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 4는 대조군과 0.48 mg/kg PGH를 진신노출로 투여한 4주와 7주째의 폐에서 측정한 fibronectin의 mRNA 발현 결과를 나타낸 것이다(control: 깨끗한 공기(clean air)를 투여한 군(대조군). *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 5는 대조군과 0.3 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG-P를 기도내로 투여한 후 7일 및 14일째의 폐에서 측정한 IL-1β, IL-6, CXCL1, IFN-γ의 농도를 나타낸 것이다(control: 생리식염수를 투여한 군(대조군, *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 6은 대조군과 0.28 mg/kg PHMG-P를 흡입 투여한 후 44일째의 폐에서 측정한 IL-1β, IL-6, IFN-γ의 농도를 나타낸 것이다(control: 깨끗한 공기(clean air)를 흡입시킨 군(대조군, *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 7은 대조군과 0.48 mg/kg PGH를 흡입 투여한 후 4주와 7주째의 폐에서 측정한 IL-1β농도를 나타낸 것이다(control: 깨끗한 공기를 흡입시킨 군(대조군, *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 8은 대조군과 0.3 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG-P를 기도내로 투여한 7일 및 14일째의 폐에서 측정한 fibronectin, MMP 9, TIMP-1의 단백질 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 9a는 control과 0.3 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG-P를 기도내로 투여한 7일째의 폐를 헤마톡실린과 에오진(H&E)으로 염색한 조직 사진이며, 도 9b는 14일째의 폐를 헤마톡실린-에오진 염색 (H&E) 염색한 조직 사진이다. 도 9c는 control과 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG-P를 기도내로 투여한 14일째의 폐를 트리크롬 염색(Masson’s trichorme)한 폐의 조직사진이다.
도 10a는 control과 0.28 mg/kg PHMG-P를 비부로 흡입시킨 후 44일째의 폐의 H&E 염색 조직 사진이며, 도 10b는 44일째의 폐의 Trichrome 염색 조직 사진으로, 각각 왼쪽은 control, 오른쪽은 PHMG-P 처리군을 나타낸다.
도 2는 PHMG-P를 비부노출로 흡입시킨 후, 래트의 체중과 폐 질량의 변화를 나타낸 것이다 (control: 깨끗한 공기(clean air)를 흡입시킨 군 (대조군). *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 3은 대조군과 0.3 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG-P를 기도내로 투여한 7일 및 14일째의 폐에서 측정한 fibronectin, MCP-1의 mRNA 발현 결과를 나타낸 것이다 (control: 생리식염수를 투여한 군(대조군). *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 4는 대조군과 0.48 mg/kg PGH를 진신노출로 투여한 4주와 7주째의 폐에서 측정한 fibronectin의 mRNA 발현 결과를 나타낸 것이다(control: 깨끗한 공기(clean air)를 투여한 군(대조군). *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 5는 대조군과 0.3 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG-P를 기도내로 투여한 후 7일 및 14일째의 폐에서 측정한 IL-1β, IL-6, CXCL1, IFN-γ의 농도를 나타낸 것이다(control: 생리식염수를 투여한 군(대조군, *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 6은 대조군과 0.28 mg/kg PHMG-P를 흡입 투여한 후 44일째의 폐에서 측정한 IL-1β, IL-6, IFN-γ의 농도를 나타낸 것이다(control: 깨끗한 공기(clean air)를 흡입시킨 군(대조군, *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 7은 대조군과 0.48 mg/kg PGH를 흡입 투여한 후 4주와 7주째의 폐에서 측정한 IL-1β농도를 나타낸 것이다(control: 깨끗한 공기를 흡입시킨 군(대조군, *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 8은 대조군과 0.3 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG-P를 기도내로 투여한 7일 및 14일째의 폐에서 측정한 fibronectin, MMP 9, TIMP-1의 단백질 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 9a는 control과 0.3 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG-P를 기도내로 투여한 7일째의 폐를 헤마톡실린과 에오진(H&E)으로 염색한 조직 사진이며, 도 9b는 14일째의 폐를 헤마톡실린-에오진 염색 (H&E) 염색한 조직 사진이다. 도 9c는 control과 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG-P를 기도내로 투여한 14일째의 폐를 트리크롬 염색(Masson’s trichorme)한 폐의 조직사진이다.
도 10a는 control과 0.28 mg/kg PHMG-P를 비부로 흡입시킨 후 44일째의 폐의 H&E 염색 조직 사진이며, 도 10b는 44일째의 폐의 Trichrome 염색 조직 사진으로, 각각 왼쪽은 control, 오른쪽은 PHMG-P 처리군을 나타낸다.
이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예
1.
PHMG
-P를
기도내
투여한 마우스의 제조
1.1 재료
PHMG-P는 SK 케미칼에서 제공하였으며, 생리식염수(Saline)은 대한약품에서 구입하였다.
1.2 동물
실험동물로 사용된 7주령의 수컷 C57BL/7 마우스는 오리엔트 바이오에서 구입하였으며 마우스는 동물시설에 사육하였다. 온도 22±3℃, 상대습도 50±10%, 환기는 1시간에 10번 내지 20번, 오전 8시와 오후 8시를 기준으로 12시간 주기로 명암을 바꾸어 주었으며, 빛은 150-300 Lux로 유지하였다. 실험에 사용하기 전 마우스는 5일 이상 동물 시설에 적응시켰다. 실험동물의 먹이 (PM Nutrition International, Richmond, Indiana, USA), 자외선 살균(Steritron SX-1, 대영설비 주식회사) 및 여과된(1 um) 수돗물을 자유식으로 제공하였다. 각 그룹마다 동물의 체중이 비슷하도록 하였고, 한 그룹은 총 5마리씩의 마우스로 구성되었다.
1.3
페섬유증
동물 모델 제작
마우스는 동물용 흡입마취기를 이용해 아이소플루레인(isoflurane)으로 충분히 마취하였다. 마취된 마우스를 아크릴 슬라이드판에 올려 놓고 윗니를 이용하여 고정하였다. 혀를 포셉으로 이용하여 입 밖으로 뺀 후 자동비디오점적기(automatic video instillator, 두배)를 이용하여 마우스에 0.3 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG-P 을 각각 50 μl씩 기도내로 천천히 투여하였다(Kim et al.,2010). 대조군의 마우스는 같은 경로로 생리식염수를 투여하였으며, 이하 실시예에서의 대조군의 실험방법은 PHMG-P를 투여한 실험군의 실험방법과 동일하게 진행하였다.
실시예
2.
PHMG
-P를
비부흡입한
래트의
제조
2.1 재료
PHMG-P는 SK 케미칼에서 제공하였다.
2.2 동물
실험동물로 사용된 6주령의 수컷 SD 래트는 오리엔트 바이오에서 구입하였으며 래트는 동물시설에 사육하였다. 온도 22±3℃, 상대습도 50±10%, 환기는 1시간에 10번 내지 20번, 오전 8시와 오후 8시를 기준으로 12시간 주기로 명암을 바꾸어 주었으며, 빛은 150-300 Lux로 유지하였다. 실험에 사용하기 전 래트는 5일 이상 동물 시설에 적응시켰고, 그 후 일주일 간 하루 1시간 이상 3회 홀더적응훈련을 시켰다. 실험동물의 먹이 (PM Nutrition International, Richmond, Indiana, USA), 자외선 살균(Steritron SX-1, 대영설비 주식회사) 및 여과된(1 um) 수돗물을 자유식으로 제공하였다. 각 그룹마다 동물의 체중이 비슷하도록 하였고, 한 그룹은 총 6마리씩의 래트로 구성되었다.
2.3 폐 섬유증 동물 모델 제작
비부노출 흡입장치(nose only inhalation chamber, HCT, Korea)에 래트를 장착한 후, 나노입자발생장치(nebulizer)를 이용하여 PHMG-P를 에어로졸 상태로 발생시킨 후 희석공기와 혼합하여 래트에게 흡입시켰다. 이 때 PHMG-P의 농도는 1.6 ug/L 였다. 대조군의 실험방법은 PHMG-P를 투여한 실험군의 실험방법과 동일하게 진행하였고, PHMP-P 에어로졸 대신에 깨끗한 공기 (clean air)를 노출하였다.
실시예
3.
PGH
를 전신노출한
래트의
제조
3.1 재료
PGH는 Shanghi Scunder Industrial co., LTD에서 구매하였다.
3.2 동물
실험동물로 사용된 6주령의 수컷과 암컷의 SD 래트는 오리엔트 바이오에서 구입하였으며 래트는 동물시설에 사육하였다. 온도 22±3℃, 상대습도 50±10%, 환기는 1시간에 10번 내지 20번, 오전 8시와 오후 8시를 기준으로 12시간 주기로 명암을 바꾸어 주었으며, 빛은 150-300 Lux로 유지하였다. 실험에 사용하기 전 래트는 5일 이상 동물 시설에 적응시켰다. 실험동물의 먹이 (PM Nutrition International, Richmond, Indiana, USA), 자외선 살균(Steritron SX-1, 대영설비 주식회사) 및 여과된(1 um) 수돗물을 자유식으로 제공하였다. 각 그룹마다 동물의 체중이 비슷하도록 하였고, 한 그룹은 총 5마리씩의 래트로 구성되었다.
3.3 폐 섬유증 동물 모델 제작
전신노출 흡입장치(Whole body inhalation chamber, HCT, Korea)에 래트를 장착한 후, Constant Atomizer(HCT, Korea)를 이용하여 PGH를 에어로졸 상태로 발생시킨 후 희석공기와 혼합하여 전신노출 시켰다. 이 때 PGH의 농도는 0.48 mg/kg 였다. 대조군의 실험방법은 PGH를 투여한 실험군의 실험방법과 동일하게 진행하였고, PGH 에어로졸 대신에 깨끗한 공기 (clean air)를 노출하였다.
실시예
4. 체중과 폐 질량 측정
4.1
PHMG
-P를
기도내
투여한 마우스
체중은 기도내 투여 직전과 투여 후 정해진 날짜에 관찰하였다. 투여 후 7일 및 14일 후에 아이소플루레인 과마취시켜 마우스를 안락사시키고 부검하였다. 폐를 꺼낸 후 즉시 폐 질량을 측정하였고, 왼쪽 폐는 10% 중성 완충포르말린에 고정시켰다. 오른쪽 폐는 유전자 발현 및 사이토카인을 측정하기 위해 스냅-프로즌(snap-frozen) 시켰다.
마우스의 체중은 기도내 투여 직전과 투여 후에 매일 관찰하였으며, 폐를 적출 후 바로 질량을 측정하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1은 PHMG-P를 기도내 투여한 후, 마우스의 체중과 폐 질량의 변화를 나타낸 것이다 (control: 생리식염수를 투여한 군(대조군). *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 1에 나타난 바와 같이, 0.9 mg/kg 투여량의 PHMG-P와 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG-P의 마우스는 노출 2일째부터 급격하게 체중이 감소하였다. 8일부터는 천천히 체중이 증가하였지만 실험이 끝날 때까지 정상수준으로는 도달하지 못했다. 그러나 0.3 mg/kg 투여량의 PHMG-P 그룹에서는 체중 감소가 발견되지 않았다. 폐의 질량은 7일 및 14일째 투여량에 비례하여 증가하였다.
4.2.
PHMG
-P를
비부흡입한
래트
체중은 투여 후 일주일에 3번씩 측정하였다. 44일 후에 아이소플루레인 과마취시켜 래트를 안락사시키고 부검하였다. 폐를 꺼낸 후 즉시 폐 질량을 측정하였고, 왼쪽 폐는 10% 중성 완충포르말린에 고정시켰다. 오른쪽 폐는 유전자 발현 및 사이토카인을 측정하기 위해 스냅-프로즌(snap-frozen) 시켰다.
래트의 체중과 폐 질량은 도 2에 나타내었다.
도 2는 PHMG-P를 비부노출로 흡입시킨 후, 래트의 체중과 폐 질량의 변화를 나타낸 것이다 (control: 깨끗한 공기를 흡입시킨 군 (대조군). *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 2에 나타난 바와 같이, 17일째부터 체중이 유의하게 감소하기 시작하여 43일까지 계속 체중이 급격하게 감소하였다. 21일 마지막 노출 이후에도 계속 체중이 감소하였고 부검일까지 회복하지 못했다. 폐의 질량은 44일째 대조군에 비하여 약 1.5배 정도 증가하였다.
실시예
5. 유전자 발현 변화
5.1.
PHMG
-P를
기도내
투여한 마우스
0.3 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG-P를 마우스의 기도내 투여를 한 지 7일, 14일째 부검을 실시하여 폐를 적출하였다. 적출한 폐로부터 RNeasy Mini kit (Qiagen)를 이용하여 total RNA들을 분리하였다. Total RNA의 1 ug을 Improm-II TM Reverse Transcription System (Promega, city, country)을 이용하여 cDNA로 역전사시켰다. 피브로넥틴, MCP-1(monocyte chemoattractant protein-1), MMP 2, MMP 12의 발현은 SYBR Green master mix (Applied Biosystems, city, country)를 이용하여 측정하였고, HPRT는 인터널컨트롤(internal control)로 사용하였으며, 구체적인 프라이머의 시퀀스는 하기 표 1과 같다.
| 유전자 | 구분 | 서열 | 서열번호 |
| fibronectin | 센스 | 5'-CACGATGCGGGTCACTTG-3' | 서열번호 1 |
| 안티센스 | 5'-CTGCAACGTCCTCTTCATTCTTC-3' | 서열번호 2 | |
| MCP-1 | 센스 | 5'-AGGTGTCCCAAAGAAGCTGTA-3' | 서열번호 3 |
| 안티센스 | 5'-ATGTCTGGACCCATTCCTTCT-3' | 서열번호 4 | |
| HPRT | 센스 | 5'-TTATGGACAGGACTGAAAGAC-3' | 서열번호 5 |
| 안티센스 | 5'-GCCATCTCCTGCTCGAAGTC-3' | 서열번호 6 | |
| MMP 2 | 센스 | 5'-CAAAGAGTTGGCAGTGCAATA-3' | 서열번호 7 |
| 안티센스 | 5'-GATGGTGTTCTGGTCAAGGT-3' | 서열번호 8 | |
| MMP 12 | 센스 | 5'-CACAACAGTGGGAGAGAAAA-3' | 서열번호 9 |
| 안티센스 | 5'-AGCTTGAATACCAGATGGGATG-3' | 서열번호 10 |
상기 실험결과를 도 3에 나타내었으며, 도 3은 대조군과 0.3 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG-P를 기도내로 투여한 7일 및 14일째의 폐에서 측정한 fibronectin, MCP-1의 mRNA 발현 결과를 나타낸 것으로, 대조군의 mRNA 수준에 대한 상대적인 값을 나타내었다(control: 생리식염수를 투여한 군(대조군). *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 3에 나타난 바와 같이, PHMG-P를 기도내로 투여 시 폐섬유증의 한 특징인 세포외기질(Extracellular matrix)이 증가함을 확인하였다. 세포외 기질(ECM)의 하나인 fibronectin mRNA 발현이 7일째에는 3가지 모든 투여량의 PHMG-P 처리군에서 증가하였고, 14일째에는 0.9 mg/kg, 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG-P 처리군에서 증가하는 것을 확인하였다. 섬유화를 촉진한다고 알려진 케모카인 MCP-1 mRNA((Hogaboam et al. 1999; Gharaee-Kermani et al., 1996) 또한 7일째와 14일째 0.9 mg/kg, 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG-P 처리군에서 증가하였다. 그리고 폐섬유증에서 증가한다고 알려진 세포외기질을 분해하는 MMP 2와 MMP 12는 7일과 14일째 PHMG-P 처리군에서 증가하는 하는 것을 확인하였고, 특히 MMP 12는 14일째 크게 증가하였다.
5.2.
PGH
를 전신 노출한
래트
0.48 mg/kg PGH를 래트에 전신노출한 지 4주와 7주째 부검을 실시하여 폐를 적출하였다. 폐로부터 RNeasy Mini kit (Qiagen)를 이용하여 total RNA들을 분리하였다. Total RNA의 1 ug을 Improm-II TM Reverse Transcription System (Promega, city, country)을 이용하여 cDNA로 역전사시켰다. 피브로넥틴의 발현은 SYBR Green master mix (Applied Biosystems, city, country)를 이용하여 측정하였고, β-actin 은 인터널컨트롤(internal control)로 사용하였으며, 구체적인 프라이머의 시퀀스는 하기 표 2과 같다.
| 유전자 | 구분 | 서열 | 서열번호 |
| fibronectin | 센스 | 5'-CCCGGAACAGATGCAATGATC-3' | 서열번호 11 |
| 안티센스 | 5'-TGCTCCATGTGTCTCCAATTCT-3' | 서열번호 12 | |
| β-actin | 센스 | 5'-GCCTCACTGTCCACCTTCCA-3' | 서열번호 13 |
| 안티센스 | 5'-GGGCCGGACTCACGTACT-3' | 서열번호 14 |
상기 실험결과를 도 4에 나타내었으며, 도 4는 대조군과 0.48 mg/kg PGH를 진신노출로 투여한 4주와 7주째의 폐에서 측정한 fibronectin의 mRNA 발현 결과를 나타낸 것이다(control: clean air를 투여한 군(대조군). *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 4에 나타난 바와 같이, 0.48 mg/kg PGH를 전신노출로 투여 시 폐섬유증의 한 특징인 세포외기질(Extracellular matrix)이 증가함을 확인하였다. 세포외 기질(ECM)의 하나인 fibronectin mRNA 발현이 4주와 7주째에 암수 모두에서 증가하였다.
실시예
6. 사이토카인 및
케모카인의
변화 확인
6.1
PHMG
-P를
기도내
투여한 마우스
사이토카인들은 질병의 진행에 있어 결정적인 요인이다. 사이토카인들의 패턴 및 지속기간은 호흡기 염증 및 폐섬유화의 진행상황을 보여준다.
실시예 4.1에 따라 동결된 폐를 PBS (1% Triton X-100)에 넣고 호모게나이저를 이용하여 균질화한 후, 30분간 4℃에서 쉐이커(shaker) 위에 두었다. 폐 용해액 (lysate)을 13000rpm로 원심분리하여 상층액만 따로 모았다. 제조사의 프로토콜에 따라, IL-1β, IL-6, CXCL1, IFN-γ ELISA kit (R&D systems)를 이용하여 상층액내의 IL-1β, IL-6, CXCL1, IFN-γ의 농도를 측정하였다. 폐용해액의 상층액의 단백질량은 BCA protein assay (Sigma Aldrich)로 측정한 후, IL-1β, IL-6, CXCL1, IFN-γ의 농도를 보정하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5는 대조군과 0.3 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG-P를 기도내로 투여한 후 7일 및 14일째의 폐에서 측정한 IL-1β, IL-6, CXCL1, IFN-γ의 농도를 나타낸 것이다(control: 생리식염수를 투여한 군(대조군, *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 5에 나타난 바와 같이, 0.9 mg/kg, 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG-P 처리군의 염증성 사이토카인(cytokine) IL-1β, IL-6와 케모카인(chemokine) CXCL1의 농도는 7일 및 14일째에 대조군과 비교하여 상당히 증가하는 것을 확인하였으며, PHMG-P에 노출된 후 7일째에 가장 높은 농도를 보였고, 14일째까지 상기 IL-1β, IL-6, CXCL1의 농도는 계속 유지되었다. 7일째 0.3 mg/kg 투여량의 PHMG-P 처리군을 포함한 모든 그룹에서 anti-fibrotic cytokine인 IFN-γ 농도는 상당히 감소하였다. 그러나 14일째에는 정상범위로 회복되었다.
6.2
PHMG
-P를
비부흡입한
래트
실시예 4.2에 따라 동결된 폐를 PBS (1% Triton X-100)에 넣고 호모게나이저를 이용하여 균질화한 후, 30분간 4℃에서 쉐이커(shaker) 위에 두었다. 폐 용해액 (lysate)을 13000rpm로 원심분리하여 상층액만 따로 모았다. 제조사의 프로토콜에 따라, IL-1β, IL-6, IFN-γ ELISA kit (R&D systems)를 이용하여 상층액내의 IL-1β, IL-6, IFN-γ의 농도를 측정하였다. 폐용해액의 상층액의 단백질량은 BCA protein assay (Sigma Aldrich)로 측정한 후, IL-1β, IL-6, IFN-γ의 농도를 보정하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6은 대조군과 0.28 mg/kg PHMG-P를 흡입 투여한 후 44일째의 폐에서 측정한 IL-1β, IL-6, IFN-γ의 농도를 나타낸 것이다(control: 깨끗한 공기(clean air)를 흡입시킨 군(대조군, *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 6에 나타난 바와 같이, 0.28 mg/kg PHMG-P를 흡입 투여한 PHMG-P 처리군의 염증성 사이토카인(cytokine) IL-1β와 IL-6의 농도는 대조군과 비교하여 상당히 증가하는 것을 확인하였다.
6.3
PGH
를 전신노출한
래트
실시예 4.2와 동일한 방법으로 44일 후에 아이소플루레인 과마취시켜 래트를 안락사시키고 부검하였고, 오른쪽 폐는 유전자 발현 및 사이토카인을 측정하기 위해 스냅-프로즌(snap-frozen) 시켰다.
동결된 폐를 PBS (1% Triton X-100)에 넣고 호모게나이저를 이용하여 균질화한 후, 30분간 4℃에서 쉐이커(shaker) 위에 두었다. 폐 용해액 (lysate)을 13000rpm로 원심분리하여 상층액만 따로 모았다. 제조사의 프로토콜에 따라, IL-1β ELISA kit (R&D systems)를 이용하여 상층액내의 IL-1β를 측정하였다. 폐용해액의 상층액의 단백질량은 BCA protein assay (Sigma Aldrich)로 측정한 후, IL-1β 농도를 보정하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7은 대조군과 0.48 mg/kg PGH를 흡입 투여한 후 4주와 7주째의 폐에서 측정한 IL-1β농도를 나타낸 것이다(control: 깨끗한 공기(clean air)를 흡입시킨 군(대조군, *: 대조군과 비교하여 p<0.05, **: 대조군과 비교하여 p<0.01).
도 7에 나타난 바와 같이, 0.48 mg/kg PGH를 흡입 투여한 PGH 처리군의 염증성 사이토카인(cytokine) IL-1β의 농도는 대조군과 비교하여 암수 모두에서 상당히 증가하는 것을 확인하였다.
실시예
7.
PHMG
-P
기도내
투여를 통한 단백질 발현 변화
용해 버퍼(lysis buffer)로 폐들을 균질화하였고 30분간 4℃에서 쉐이커(shaker) 위에 두었다. 폐 용해액 (lysate)을 30분간 4℃ 14000rpm으로 원심분리하였다. 상층액을 모았고, 단백질들의 농도는 BCA protein assay (Sigma Aldrich)를 통해 확인하였다. 같은 양의 샘플을 SDS-PAGE 젤에 걸어 분리한 후, nitrocellulose membrane에 transfer 시켰다. 상기 membrane을 0.05% TBST+ 5% skim milk에 넣어 2시간 배양 후, 1차 항체를 TBST+ 5% 소혈청알부민(BSA)으로 희석시켜 4℃에서 하룻밤 배양하였다. membrane을 0.05% TBST로 3차례 세척하였으며, 적절한 horseradish peroxides가 표지된 2차 항체와 함께 45분간 실온에서 배양하였다. 3차례 세척한 후, membrane을 웨스턴 블롯 검출 시약으로 band를 확인하였다. anti-Fibronectin 항체는 Abcam에서 구입하였고, MMP9, TIMP-1은 Santa Cruz에서, anti-α-tubulin항체는 Cell Signaling에서 구입하였다. 시료 중 단백질 함량의 동질성은 anti-α-tubulin 항체 (Cell Signaling)를 사용하여 확인하였다.
상기 결과를 도 8에 나타내었으며, 도 8은 대조군과 0.3 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG-P를 기도내로 투여한 7일 및 14일째의 폐에서 측정한 fibronectin, MMP 9, TIMP-1의 단백질 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 8에 나타난 바와 같이, 모든 3가지 투여량(0.3 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.5 mg/kg)의 PHMG-P 처리군에서 fibronectin과 MMP9가 증가하는 것을 확인하였고, TIMP-1은 감소하는 것을 확인하였다. fibronectin과 MMP9, TIMP-1은 폐 섬유증의 마커/지표(marker)로서, fibronectin과 MMP9의 증가 또는 TIMP-1의 감소는 PHMG-P가 폐 내의 폐섬유증를 유발한다는 것을 의미한다.
실시예
8. 병리조직학적 시험
8.1
PHMG
-P를
기도내
투여한 마우스
폐 샘플은 병리조직학적 시험을 위해 헤마톡실린-에오진 염색 (Hematoxylin-Eosin stain) 및 Masson? trichrome 염색을 하여 현미경으로 관찰하였으며, 그 결과를 도 9a, 도 9b, 및 도 9c에 나타내었다.
도 9a는 control과 0.3 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG-P를 기도내로 투여한 7일째의 폐의 조직 사진이며, 도 9b는 14일째의 폐의 조직 사진이다. 도 9c는 Masson’s trichrome 염색을 한 14일째의 폐의 조직 사진이다.
도 9a 내지 도 9c에 나타난 바와 같이, 모든 3가지 투여량의 PHMG-P 처리군에서 7일째에 폐에 많은 염증세포가 혈관주위, 세기관지주위, 흉막아래, 폐의 간질(interstitial) 내에 침윤되었고, 14일째에는 염증이 더 악화된 것을 확인하였다. 상기 결과로부터 PHMG-P가 급성 염증과 만성염증을 유발하였음을 확인하였다. 7일째는 상피세포의 과형성이, 14일째는 상피세포의 괴사 혹은 위축이 관찰되었다. Masson? trichrome 염색에서는 세포외기질의 하나인 콜라겐(collagen)이 폐의 실질(parenchyma)에 침착되어 있음을 확인하였다.
8.2
PHMG
-P를
비부흡입한
래트
폐 샘플은 병리조직학적 시험을 위해 헤마톡실린-에오진 염색 (Hematoxylin-Eosin stain)을 하여 현미경으로 관찰하였으며, 그 결과를 도 10a 및 도 10b에 나타내었다.
도 10a는 control과 0.28 mg/kg PHMG-P를 비부로 흡입시킨 후 44일째의 폐의 H&E 염색 조직 사진이며, 도 10b는 44일째의 폐의 Trichrome 염색 조직 사진으로, 각각 왼쪽은 control, 오른쪽은 PHMG-P 처리군을 나타낸다.
도 10a 내지 도 10b에 나타난 바와 같이, 폐에서 만성 염증(Chronic Inflammation), 공포상 대식세포(Foamy macrophages), 기관지폐포 과형성(Bronchioloalveolar Hyperplasia) 및 폐의 섬유화가 관찰되었다.
실시예
9. 통계 분석
9.1
PHMG
-P를
기도내
투여한 마우스
0.3 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.5 mg/kg 투여량의 PHMG에 노출된 마우스들로부터의 데이터를 ANOVA(one-way analysis of variance)를 이용하여 생리식염수에 노출된 마우스들과 비교하였다 (SPSS Ver15.0.0, SPSS Inc.). p value가 0.05보다 작은 값을 통계적으로 유의하다고 평가하였다. 모든 데이터는 평균±표준오차(SE)로 나타냈다.
9.2
PHMG
-P를
비부흡입한
래트
T-test를 이용하여 0.28 mg/kg PHMG-P를 흡입 투여한 래트로부터의 데이터를 깨끗한 공기에 노출된 래트의 데이터와 비교하였다 (SPSS Ver15.0.0, SPSS Inc.). p value가 0.05보다 작은 값을 통계적으로 유의하다고 평가하였다. 모든 데이터는 평균±표준오차(SE)로 나타냈다.
9.3
PGH
를 전신 노출한
래트
T-test를 이용하여 0.48 mg/kg PGH를 흡입 투여한 래트로부터의 데이터를 깨끗한 공기에 노출된 래트의 데이터와 비교하였다 (SPSS Ver15.0.0, SPSS Inc.). p value가 0.05보다 작은 값을 통계적으로 유의하다고 평가하였다. 모든 데이터는 평균±표준오차(SE)로 나타냈다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY
<120> ANIMAL MODEL HAVING LUNG FIBROSIS AND USES THEREOF
<130> DPP20131552KR
<160> 14
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for fibronectin
<400> 1
cacgatgcgg gtcacttg 18
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for fibronectin
<400> 2
ctgcaacgtc ctcttcattc ttc 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for MCP-1
<400> 3
aggtgtccca aagaagctgt a 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for MCP-1
<400> 4
atgtctggac ccattccttc t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for HPRT
<400> 5
ttatggacag gactgaaaga c 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for HPRT
<400> 6
gccatctcct gctcgaagtc 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for MMP2
<400> 7
caaagagttg gcagtgcaat a 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for MMP2
<400> 8
gatggtgttc tggtcaaggt 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for MMP 12
<400> 9
cacaacagtg ggagagaaaa 20
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for MMP 12
<400> 10
agcttgaata ccagatggga tg 22
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for fibronectin
<400> 11
cccggaacag atgcaatgat c 21
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for fibronectin
<400> 12
tgctccatgt gtctccaatt ct 22
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for B-actin
<400> 13
gcctcactgt ccaccttcca 20
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for B-actin
<400> 14
gggccggact cacgtact 18
Claims (14)
- 정상 동물에 구아니딘계 화합물을 투여하여 폐 섬유증을 유발하는 단계를 포함하는 폐 섬유증 동물모델의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 구아니딘계 화합물의 투여는 기도내 투여, 비부 흡입, 또는 전신노출 흡입의 방식으로 수행되는 것인, 동물모델의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 구아니딘계 화합물은 폴리헥사메틸렌구아니딘 포스페이트(PHMG-P), 폴리헥사메틸렌구아니딘 클로라이드, 폴리-[2-(2-에톡시)-에톡시에틸]-구아니디니움-클로라이드(PGH) 및 폴리헥사메틸렌 바이구아니딘 히드로클로라이드(PHMB)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 동물모델의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 구아니딘계 화합물은 폴리헥사메틸렌구아니딘 포스페이트인 것인, 동물모델의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 구아니딘계 화합물의 투여량은 동물의 단위체중(kg)당 0.2 내지 2 mg/kg인, 동물모델의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 구아니딘계 화합물의 투여용량은 30 내지 250 ul인, 동물모델의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 동물은 인간을 제외한 포유동물인 것인, 동물모델의 제조방법.
- 제1항의 방법에 의해 제조된 폐 섬유증을 갖는 동물모델.
- 제8항에 있어서, 상기 폐 섬유증 동물모델은 정상동물과 비교하여,
체중의 감소 및 폐 질량의 증가;
IL-1β(interleukin-1β, IL-6(interleukin-6), 또는 CXCL1(Chemokine (C-X-C motif) ligand 1) 의 농도 증가;
IFN-γ(Interferon-gamma)의 농도 감소;
피브로넥틴 유전자, MCP-1(monocyte chemoattractant protein-1) 유전자, MMP(metalloproteinases) 2 유전자, 또는 MMP 12 유전자 발현량의 증가;
피브로넥틴 또는 MMP 9 단백질 발현량의 증가;
TIMP(tissue inhibitor of metalloproteinases)-1 단백질 발현량의 감소; 및
폐의 염증세포 침윤 및 콜라겐 침착; 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 특성을 갖는 동물모델. - 제8항에 있어서, 상기 폐 섬유증 동물모델은 정상동물과 비교하여,
체중의 5 내지 40 % 감소 및 폐 질량의 10 내지 200 % 증가;
IL-1β, IL-6, 또는 CXCL1의 150 내지 1000% 농도 증가;
IFN-γ의 10 내지 60% 농도 감소;
피브로넥틴 유전자, MCP-1 유전자, MMP 2 유전자, 또는 MMP 12 유전자 발현량의 150 내지 5000 % 증가;
피브로넥틴 또는 MMP 9 단백질 발현량의 10 내지 1000 % (단위 특정)증가;
TIMP-1 단백질 발현량의 10 내지 80 % 감소; 및
폐의 염증세포 침윤 및 콜라겐 침착의 10 내지 1000% 증가; 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 특성을 갖는 동물모델. - 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계; 상기 후보물질이 처리된 동물모델에서 폐 섬유증의 개선 또는 치료 정도를 평가하여 후보물질을 폐 섬유증 치료용 약물로 결정하는 단계를 포함하는 폐 섬유증 치료용 약물 스크리닝 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 결정하는 단계는 후보물질을 처리한 군이 생리식염수, 멸균증류수, 카르복시메틸셀룰로스 또는 PBS(phosphate buffered saline)를 처리한 대조군과 비교하여,
체중의 증가 및 폐 질량의 감소;
IL-1β, IL-6, 또는 CXCL1의 농도 감소;
IFN-γ의 농도 증가;
피브로넥틴 유전자, MMP 2 유전자, MMP 12 유전자 또는 MCP-1 유전자의 발현량 감소;
피브로넥틴 또는 MMP 9 단백질 발현량 감소;
TIMP-1 단백질 발현량 증가; 및
폐의 염증세포 침윤 및 콜라겐 침착 상태 감소; 로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 결과인 경우, 상기 후보물질을 폐 섬유증 치료용 약물로 결정하는 것인, 약물 스크리닝 방법. - 정상 동물에 후보물질을 처리하는 단계; 상기 동물에 구아니딘계 화합물을 투여하는 단계; 및 상기 구아니딘계 화합물이 투여된 동물의 폐 섬유화 정도를 평가하여 후보물질을 폐 섬유증 예방용 약물로 결정하는 단계를 포함하는 폐 섬유증 예방용 약물 스크리닝 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 결정하는 단계는 후보물질을 처리한 군이 후보물질 대신에 생리식염수, 멸균증류수, 카르복시메틸셀룰로스 또는 PBS(phosphate buffered saline)를 처리한 대조군과 비교하여,
체중의 증가 및 폐 질량의 감소;
IL-1β, IL-6, 또는 CXCL1의 농도 감소;
IFN-γ의 농도 증가;
피브로넥틴 유전자, MMP 2 유전자, MMP 12 유전자 또는 MCP-1 유전자의 발현량 감소;
피브로넥틴 또는 MMP 9 단백질 발현량 감소;
TIMP-1 단백질 발현량 증가; 및
폐의 염증세포 침윤 및 콜라겐 침착 상태 감소;인 경우, 상기 후보물질을 폐 섬유증 예방용 약물로 결정하는 것인, 약물 스크리닝 방법.
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| KR20130102571A KR20150025218A (ko) | 2013-08-28 | 2013-08-28 | 폐 섬유증 동물모델 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR20130102571A KR20150025218A (ko) | 2013-08-28 | 2013-08-28 | 폐 섬유증 동물모델 및 이의 용도 |
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| KR1020160110708A Division KR101759346B1 (ko) | 2016-08-30 | 2016-08-30 | 폐 섬유증 동물모델 및 이의 용도 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| KR20150025218A true KR20150025218A (ko) | 2015-03-10 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR20130102571A KR20150025218A (ko) | 2013-08-28 | 2013-08-28 | 폐 섬유증 동물모델 및 이의 용도 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20150025218A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110692590A (zh) * | 2019-11-04 | 2020-01-17 | 青岛大学 | 一种肺纤维化哺乳动物模型的构建及应用 |
-
2013
- 2013-08-28 KR KR20130102571A patent/KR20150025218A/ko active Search and Examination
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110692590A (zh) * | 2019-11-04 | 2020-01-17 | 青岛大学 | 一种肺纤维化哺乳动物模型的构建及应用 |
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