TWI664290B - 非肥胖型糖尿病鼠及其應用 - Google Patents

Abstract

本發明係關於新穎非肥胖型糖尿病(NOD)鼠及其應用。具體而言，本發明係關於NOD鼠，其特異性表現該NOD鼠中之抗聚乙二醇膜抗體報導基因(抗PEG報導基因)。

Description

非肥胖型糖尿病鼠及其應用

本發明係關於新穎非肥胖型糖尿病(NOD)鼠及其應用。具體而言，本發明係關於NOD鼠，其特異性表現NOD鼠中之抗聚乙二醇膜抗體報導基因(抗PEG報導基因)。

據報導，轉基因鼠以與野生型對照相似或更高之比率及動力學發生糖尿病。轉基因鼠可用於糖尿病及胰臟β胰島細胞生物學之研究中。使用NOD鼠作為1型糖尿病之動物模型。NOD鼠展現對自發發生自體免疫胰島素依賴性糖尿病(IDDM)之敏感性。已藉助同源異基因鼠品系之發展在NOD鼠品系中鑑別與IDDM之敏感性相關聯之基因座，該等同源異基因鼠品系已鑑別若干個胰島素依賴性糖尿病(Idd)基因座。鑒於NOD鼠之獨特遺傳因子及病理機制與人類1型糖尿病類似之事實，NOD鼠係探索IDDM機制及評估各種治療策略之重要動物模型。

然而，為探索細胞凋亡在胰臟β-細胞中是否進展(胰島炎)，應處死多隻NOD鼠以在連續時間點獲得一系列胰島切片。因此，研究不能在一隻鼠中連續觀察病理過程並使用監測NOD鼠之血糖之方法以評估糖尿病進展；僅晚期糖尿病可量測。此外，NOD鼠中自發糖尿病之發病率在雌性中係60-80%且在雄性中係20-30%。糖尿病之發作在雄性與雌性之間亦不 同：一般在雄性中發作延遲數週。因此，動物性別以及環境及實驗條件之變化將影響糖尿病之研究結果。舉例而言，NOD.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/QtngJ(亦稱為：MIP-GFP(系1)，NOD.B6-MIP-GFP)係對於MIP-GFP轉基因呈半合子之同源異基因NOD鼠，該MIP-GFP轉基因在通常檢測到胰島素I之組織中、尤其在胰臟β-細胞中具有EGFP螢光。然而，此NOD轉基因鼠僅可用於光學成像系統中且僅在處死鼠之後才可實施對糖尿病之觀察。此外，當將NOD鼠之胰島移植至正常鼠時，源自海蜇之GFP可導致免疫排斥。US 8,507,207提供報導基因系統，且特定而言係關於使用編碼抗聚乙二醇重組單鏈膜抗體之重組核苷酸序列作為報導基因，以監測基因及細胞之存在及分佈之方法。

然而，需要研發可用於連續觀察糖尿病病理進展及評估I型糖尿病之藥物治療之NOD鼠。

在非肥胖型糖尿病鼠(NOD鼠)之胰島中表現報導基因容許研究者藉由非侵入性成像系統即時監測胰島損失之過程，克服了傳統方法中研究者需要處死大量NOD鼠以觀察胰島切片中之胰島炎之缺陷。本發明藉由使用胰島素啟動子，成功地研發出在其胰島中穩定表現抗PEG報導基因之NOD/pIns-αPEG鼠。PEG-NIR797螢光探針可在NOD/pIns-αPEG鼠，而非對照NOD鼠之胰島區域特異性累積，協助研究者藉由光學成像系統便捷地且精確地示蹤胰島損失之過程，並進一步研究藥物或基因之胰島保護性效應。重要地，在NOD/pIns-αPEG鼠之胰島中表現抗PEG報導基因不影響胰島大小、胰島素分泌及1型糖尿病之疾病進展。NOD/pIns-αPEG鼠可幫助研究者藉由非侵入性成像系統，容易地示蹤1型糖尿病之疾病進 展，進一步為全世界醫藥公司及藥物研究所提供有價值的工具，以篩選並評估糖尿病藥物。

本發明提供編碼抗PEG報導基因之轉基因構築體，其包含多核苷酸，該多核苷酸自5’至3’序列包含具有SEQ ID NO：1之核苷酸序列或其大體上相同之核苷酸序列之人類胰島素啟動子、具有SEQ ID NO：2之核苷酸序列或其大體上相同核苷酸序列之人類胰島素基因之第一外顯子、具有SEQ ID NO：3之核苷酸序列或其大體上相同核苷酸序列之人類胰島素基因之第一內含子、具有SEQ ID NO：4之核苷酸序列或其大體上相同之核苷酸序列之人類胰島素基因之第二外顯子、具有SEQ ID NO：5之核苷酸序列或其大體上相同之核苷酸序列之兔β球蛋白基因之第二內含子、具有SEQ ID NO：6之核苷酸序列或其大體上相同之核苷酸序列之抗PEG報導基因及具有SEQ ID NO：7或其大體上相同之核苷酸序列之兔β球蛋白基因之第三內含子，其可操作地彼此連接。

本發明亦提供包含本發明之轉基因構築體之載體或包含上文所提及載體之細胞。

本發明亦提供嵌合NOD鼠，其中NOD鼠之基因體包含本發明之轉基因構築體，其經併入至鼠之染色體11之位點。在一個實施例中，該位點係鼠之染色體11之chr11：14970958。

本發明亦提供多種應用，其包括使用本發明之嵌合NOD鼠篩選用於治療或預防1型糖尿病之候選藥劑或基因療法，並篩選抵抗胰島移植排斥之候選藥劑或基因。

圖1顯示本發明之完整轉基因構築體之示意圖。完整轉基因自5’至3’ 序列包括人類胰島素啟動子、人類胰島素基因之第一外顯子、人類胰島素基因之第一內含子、人類胰島素基因之第二外顯子、兔β-球蛋白基因之第二內含子、抗PEG報導基因(自5’至3’序列包括免疫球蛋白信號肽、抗PEG抗體AGP3之VL-Ck片段、內部核糖體進入位點、免疫球蛋白信號肽、抗PEG抗體AGP3之VH-CH1片段及鼠B7-1抗原之C形細胞外-跨膜-胞質結構域)及兔β-球蛋白基因之第三內含子。

圖2 A及B顯示pIns-抗PEG報導基因之活體外表現及其功能。將抗PEG報導基因轉移至具有人類胰島素啟動子之質體中，以構築pIns-抗PEG質體(對照組係CMV啟動子-抗PEG質體)。將基因轉移至(A)鼠胰島β細胞(NIT-1)或(B)鼠纖維母細胞(3T3)中。藉由PEG-量子點檢測該兩種細胞中抗PEG報導基因之表現及功能。

圖3顯示用於鑑別NOD/pIns-αPEG鼠之基因分型PCR檢查之結果。基因分型引子(正向)經設計以結合至人類胰島素基因之第二內含子。基因分型引子(反向)經設計以結合至抗PEG報導基因之VL-CK片段。藉由將PCR方法與該等基因分型引子組合使用，可在NOD/pIns-αPEG鼠(第354號、第353號、第352號、第258號)中而不在野生型NOD鼠(第347號、第349號)中產生具有845bp之預期大小之DNA片段。

圖4顯示在NOD/pIns-αPEG鼠之基因體中轉基因構築體之插入位點。將本發明之轉基因構築體併入鼠之染色體11之位點。在一個實施例中，該位點係鼠之染色體11之chr11：14970958。

圖5顯示用於鑑別pIns-αPEG基因在NOD/pIns-αPEG鼠中之插入位點之定位PCR檢查之結果。定位引子(正向)經設計以結合至NOD鼠之染色體11。定位引子(反向)經設計以結合至人類胰島素啟動子。藉由將PCR方法 與該等定位引子組合使用，可在NOD/pIns-αPEG鼠(第354號、第353號、第352號、第258號)中而不在野生型NOD鼠(第347號、第349號)中產生大小約為650bp之DNA片段。

圖6 A及B顯示在NOD/pIns-αPEG鼠中抗PEG報導基因及其蛋白質之表現。藉由顯微注射技術將pIns-αPEG基因轉移至NOD/ShiLtJ鼠之胚胎中(胚胎係來自傑克遜實驗室(Jackson Laboratory)，庫存編號：001976)，以產生NOD/pIns-αPEG鼠。(A)藉由基因分型PCR鑑別並篩選表現抗PEG報導基因之轉基因鼠。(B)分析編號為4-1、5-2及5-4之NOD/pIns-αPEG鼠之後代(F0)，以觀察其胰島是否穩定表現抗PEG報導基因之蛋白質；獲得轉基因鼠之胰島細胞，並利用山羊抗鼠IgM Fc抗體使其經受西方墨點分析(藉由鼠IgM抗體構築抗PEG報導基因)。

圖7顯示pIns-抗PEG報導基因之活體內功能(在NOD/pIns-αPEG鼠之胰島細胞中)。自NOD/pIns-αPEG鼠(編號為5-2之轉基因鼠之後代)或5週齡之NOD鼠獲得胰島細胞。使用PEG-FITC螢光探針及螢光顯微鏡觀察胰島細胞與PEG探針之結合能力。

圖8顯示關於PEG-¹³¹I在NOD/pIns-αPEG鼠或NOD鼠之胰臟中累積之差異之比較。將PEG-¹³¹I放射性探針靜脈內注射至NOD/pIns-αPEG鼠(n=3)或NOD鼠(n=3)中，且分別在24小時及48小時後獲取其胰臟。利用γ計數器檢測胰臟周圍區域之放射性值。

圖9顯示NOD/pIns-αPEG鼠之胰臟之光學成像。藉助胰臟注射將4-臂PEG-NIR797(5μg/20μL/鼠)注射至NOD/pIns-αPEG鼠或NOD鼠中。24小時後，藉由3D活體內成像系統(IVIS 200)檢測胰臟區域周圍之抗PEG報導基因之特定螢光信號。

圖10 A至C顯示藉由非侵入性成像檢測之NOD/pIns-αPEG鼠之胰島之存活率。藉助腹膜內注射將4-臂PEG-NIR797(50μg/100μL/鼠)注射至健康NOD鼠(10週齡，作為陰性對照，左側)中及NOD/pIns-αPEG鼠(10週齡，右側)中。避光24小時後，藉由3D活體內成像系統(IVIS 200)觀察NOD/pIns-αPEG鼠之胰臟中胰島之存活率。(A)非侵入性成像之結果。(B)打開NOD鼠及NOD/pIns-αPEG鼠之腹腔並評估其中4-臂PEG-NIR797之累積。(C)使NOD鼠及NOD/pIns-αPEG鼠之胰臟中之4-臂PEG-NIR797成像之結果。

圖11 A及B顯示藉由非侵入性成像示蹤之NOD/pIns-αPEG鼠之胰島之細胞凋亡。(A)在9週齡後，每兩週將4-臂PEG-NIR797(50μg/100μL/鼠)注射至NOD/pIns-αPEG鼠中。在避光24小時後，藉由3D活體內成像系統(IVIS 200)觀察不同週齡之NOD/pIns-αPEG鼠之胰島之細胞凋亡過程。(B)量測9、13及17週齡之NOD/pIns-αPEG鼠之胰島之螢光信號且將其經量化之值在圖中表示為條形。另外，為評估藉由成像系統所展示之NOD/pIns-αPEG鼠之胰島之細胞凋亡過程是否與代謝葡萄糖之能力相關(胰島中螢光信號愈弱，代謝葡萄糖/血糖之能力愈差)，將1.5g/kg/BW之葡萄糖經口投與已禁食8小時之NOD/pIns-αPEG鼠。在投與1小時後，自鼠之尾部獲得血液並檢測血糖濃度。高血糖濃度代表胰島素分泌不足(即，胰島數不足)，其可代表I型糖尿病之嚴重性。

圖12 A及B顯示野生型NOD鼠及NOD/pIns-αPEG鼠中胰島大小及數目之比較。收集野生型NOD鼠及NOD/pIns-αPEG鼠(n=5)在10週齡時之胰臟組織。(A)藉由H&E染色法將胰臟組織染色並比較野生型NOD鼠及NOD/pIns-αPEG鼠之胰島。(B)量測胰島之平均大小。(C)量測胰島之平 均數目。條形：SD。

圖13 A及B顯示野生型NOD鼠及NOD/pIns-αPEG鼠中胰島之免疫細胞浸潤。收集野生型NOD鼠及NOD/pIns-αPEG鼠(n=5)在20週齡時之胰臟組織。(A)藉由H&E染色法將胰臟組織染色。觀察野生型NOD鼠及NOD/pIns-αPEG鼠中胰島間免疫細胞浸潤之差異。具有實線之箭頭指示胰島，且具有虛線之箭頭指示免疫細胞。(B)將胰島之免疫細胞浸潤量化。

圖14顯示NOD/pIns-αPEG鼠之胰島β細胞分泌胰島素之能力。使野生型NOD鼠及NOD/pIns-αPEG鼠(n=5)禁食8小時，並將1.5g/kg/BW之葡萄糖經口投與鼠。在投與後0分鐘、30分鐘、60分鐘、90分鐘及120分鐘自鼠之尾部獲得血液並檢測血糖濃度，以評估表現於胰島β細胞之細胞膜上之抗PEG報導基因是否可影響胰島素之分泌。條形：SD。

圖15 A及B顯示NOD/pIns-αPEG鼠及NOD鼠中糖尿病之發病率及抗胰島素自體抗體反應。(A)自出生5週後每週監測NOD/pIns-αPEG鼠(n=20)及NOD鼠(n=20)之血糖值；若所檢測之血糖在連續兩週內超過200mg/L，則將其確定為糖尿病之發病率。(B)自出生5週後每週獲得NOD/pIns-αPEG鼠(n=10)及NOD鼠(n=10)之血液；藉由抗GAD65 ELISA套組檢測在血液中是否產生抗GAD65自體抗體。

本發明提供非肥胖型糖尿病鼠及其在使其中之胰島損失過程非侵入性成像中之應用。

除非另有指示，如本文所用術語具有科學俗語中通常所使用之意義，可與口語習慣用法不同。

基因應廣義解釋為包括轉錄以及非轉錄之區域。

關於指定核酸，「編碼」或「經編碼」意指包含轉譯至指定蛋白質中之資訊。編碼蛋白質之核酸可包含核酸之轉譯區內之非轉譯序列(例如，內含子)，或可缺少此等介入之非轉譯序列(例如，如在cDNA中)。藉由其編碼蛋白質之資訊藉由使用密碼子來詳細說明。

如本文所用術語「轉基因齧齒類動物」意欲包括鼠，其中該鼠之一或多個細胞含有編碼抗PEG報導基因之異源核酸。藉助人類介入，例如藉由業內所熟知之轉基因技術，將異源核酸引入齧齒類動物中。較佳地，將異源核酸整合於細胞之染色體內。

如本文所用術語「轉基因」意指編碼抗PEG報導基因之核酸序列。

如本文所用術語「核酸」包括提及呈單鏈或雙鏈形式之去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，且除非另外限制，其涵蓋由於以類似於天然核苷酸之方式與單鏈核酸雜交而具有天然核苷酸之基本性質之已知類似物。

如本文所用術語「簡併序列」係指具有密碼子之簡併性(其係遺傳密碼之冗餘性)之序列，展現為指定胺基酸之三鹼基對密碼子組合之多重性。遺傳密碼之簡併性解釋同義突變之存在。

如本文所用術語「啟動子」係指當連接至目標核苷酸序列時，能控制目標核苷酸序列轉錄為mRNA之DNA序列。

如本文所用術語「可操作地連接」意指DNA序列及調節序列係以使得允許基因在適當分子(例如，轉錄活化蛋白)結合至調節序列時表現之方式連接。

如本文所用術語「轉基因構築體」係指含有以能在宿主細胞中表現基因之方式可操作連接之標的基因(例如，抗PEG報導基因轉基因)之核酸 分子，例如載體。如本文所用術語「核酸」係指多核苷酸，例如去氧核糖核酸(DNA)及(若適當)核糖核酸(RNA)。如本文所用術語亦涵蓋自核苷酸類似物製得之RNA或DNA之類似物，及如適用於所述實施例，單鏈(例如正義或反義)及雙鏈多核苷酸。

如本文所用術語「重組載體」，其闡述能在適宜宿主細胞中表現目標蛋白質或RNA之載體，係指包含基因插入物以使得在宿主細胞中表現之方式可操作連接之必要調節元件之基因構築體。

如本文所用術語「轉錄調節序列」係指DNA序列，例如起始信號、增強子及啟動子，其誘導或控制與其可操作連接之蛋白質編碼序列之轉錄。

如本文所用術語「嵌合」(例如，「嵌合動物」或「嵌合胰臟」)欲闡述包含異種基因組織或細胞之器官或動物。

如本文所用術語「候選藥劑」欲包括合成的、天然的或重組產生之分子(例如，小分子；藥物；肽；抗體(包括抗原結合抗體片段)或其他免疫治療劑；存在於真核或原核細胞中之內源因子(例如，多肽、植物提取物及諸如此類)等)。尤其受關注者係對人類細胞具有低毒性之藥劑之篩選試驗。

在一態樣中，本發明提供編碼抗PEG報導基因之轉基因構築體，其包含多核苷酸，該多核苷酸自5’至3’序列包含具有SEQ ID NO：1之核苷酸序列或其大體上相同之核苷酸序列之人類胰島素啟動子、具有SEQ ID NO：2之核苷酸序列或其大體上相同之核苷酸序列之人類胰島素基因之第一外顯子、具有SEQ ID NO：3之核苷酸序列或其大體上相同之核苷酸序列之人類胰島素基因之第一內含子、具有SEQ ID NO：4之核苷酸序列或其 大體上相同之核苷酸序列之人類胰島素基因之第二外顯子、具有SEQ ID NO：5之核苷酸序列或其大體上相同之核苷酸序列之兔β球蛋白基因之第二內含子、具有SEQ ID NO：6之核苷酸序列或其大體上相同之核苷酸序列之抗PEG報導基因及具有SEQ ID NO：7或其大體上相同之核苷酸序列之兔β球蛋白基因之第三內含子，其可操作地彼此連接。

本發明之轉基因構築體包含人類胰島素啟動子(1620 bp)、第一外顯子(部分人類胰島素基因，42bp)、第一內含子(人類胰島素基因，178 bp)、第二外顯子(部分人類胰島素基因，50bp)、第二內含子(兔β球蛋白基因，573 bp)、抗PEG報導基因及第三內含子(兔β球蛋白基因，449 bp)。

在一個實施例中，抗PEG報導基因包含SEQ ID NO：6之核苷酸基因。

在一個實施例中，大體上相同之核苷酸序列係簡併序列。

人類胰島素啟動子、第一外顯子、第一內含子、第二外顯子、第二內含子、抗PEG報導基因及第三內含子之序列列示於下文中。

人類胰島素啟動子(1620 bp) (SEQ ID NO：1)

第一外顯子(部分人類胰島素基因，42bp)

agccctccaggacaggctgcatcagaagaggccatcaagcag(SEQ ID NO：2)

第一內含子(人類胰島素基因，178 bp) (SEQ ID NO：3)

第二外顯子(部分人類胰島素基因，50bp)

atcactgtccttctgcacctgcagggatcggggatcctgagaacttcagg(SEQ ID NO：4)

第二內含子(兔β球蛋白基因，573 bp) (SEQ ID NO：5)

抗PEG報導基因(2574 bp) (SEQ ID NO：6)

第三內含子(兔β球蛋白基因，449 bp) (SEQ ID NO：7)

如本文中所採用之術語「大體上相同之核苷酸序列」係指與參考多核苷酸具有足夠一致性之DNA，使得其將在中度嚴格或較高度嚴格之雜交條件與參考核苷酸雜交。具有與參考核苷酸序列「大體上相同之核苷酸序列」之DNA可相對於參考核苷酸序列具有至少60%至至少95%範圍內之一致性。

中度嚴格雜交係指允許靶核酸結合互補核酸之條件。經雜交之核酸通常將具有在至少約60%至至少約95%範圍內之一致性。中度嚴格條件係等效於在約42℃下在50%甲醯胺、5×Denhart溶液、5×鹽水磷酸鈉EDTA緩衝液(SSPE)、0.2% SDS(Aldrich)中雜交，隨後在約42℃下在 0.2 SSPE、0.2% SDS(Aldrich)中洗滌之條件。高度嚴格之雜交係指允許僅彼等在約65℃下在0.018M NaCl中形成穩定雜合體之核酸序列雜交之條件，例如，若雜合體在約65℃下在0.018M NaCl中不穩定，則其在高度嚴格條件下將不穩定，如本文所預期。高度嚴格條件可(例如)藉由在約42℃下在50%甲醯胺、5×Denhart溶液、5×SSPE、0.2% SDS中雜交，隨後在約65℃下在0.1×SSPE及0.1% SDS中洗滌而提供。

抗PEG報導基因係根據「Kuo-Hsing Chuang等人，The Journal of Nuclear medicine，2010，第51卷，第6期，第933-941頁」構築。抗PEG報導基因係由融合至鼠B7-1受體之C形細胞外-跨膜-胞質結構域之鼠抗PEG單株抗體AGP3之Fab片段組成。

本發明之轉基因構築體係根據一般選殖技術所構築。保存第一非編碼外顯子、隨後第一內含子及50 bp之第二非編碼外顯子，以確保胰島素啟動子之嚴格性。毗鄰第二外顯子引入兔β-球蛋白基因之內含子。位於兔β球蛋白基因之第二內含子中之正向引子及抗PEG報導基因之VL-CK片段之編碼區中之反向引子經設計以測定RT PCR中轉基因之轉錄並自基因體PCR檢測抗PEG報導基因轉基因之存在。僅抗PEG報導基因可表現抗PEG報導基因蛋白質。

若期望，本發明之轉基因構築體可經改造以可操作連接至適當表現元件，例如增強子，以容許在適當細胞或組織中之DNA構築體中表現遺傳元件。使用表現控制機制容許靶向遞送及表現目標基因。舉例而言，本發明之構築體可使用表現盒來構築，該表現盒在5'-3'轉錄方向上包括與組織中基因表現相關聯之轉錄及轉譯起始區、編碼抗PEG報導基因之DNA以及在宿主動物中起作用之轉錄及轉譯終止區。轉錄起始區對宿主動物可 係內源的或者對宿主動物係外來的或外源的。可將本文中所述之轉基因構築體併入用於傳播或轉染至適當細胞中以生成之載體中。

在另一態樣中，本發明提供包含本發明之轉基因構築體之載體或包含上文所提及載體之細胞。

載體可含有提供可操作連接之核酸之組織特異性或可誘導表現之調節元件。熟習此項技術者可容易地確定容許在期望之基因體中表現抗PEG報導基因之適當增強子。

舉例而言，藉由一般選殖技術將包含抗PEG報導基因之轉基因構築體選殖至載體中，以形成具有編碼人類胰島素啟動子之多核苷酸之pIns-αPEG質體；例如，參見pLNCX-eB7反轉錄病毒載體；例如，參見「Kuo-Hsiang Chuang等人，The Journal of Nuclear Medicine，2010，第51卷，第6期，第933-941頁」；例如，pIns載體；例如，參見「Hsiang-Hsuan Sung等人，The Journal of Experimental Medicine，2004，第199卷，第8期，第1143-1151頁。」

在另一態樣中，本發明提供嵌合NOD鼠，其中NOD鼠之基因體包含本發明之轉基因構築體。在一個實施例中，將本發明之轉基因構築體併入鼠之染色體11之位點。在一個實施例中，將本發明之轉基因構築體併入鼠之染色體11之位點chr11：14970958。

可藉由任何熟習此項技術者已知之方法，將轉基因構築體整合至轉基因NOD鼠之基因體中。可藉由任何將允許經引入之分子在其同源區域經歷重組之方法，將轉基因構築體引入多潛能細胞，例如ES細胞。可使用之技術包括(但不限於)磷酸鈣/DNA共沈澱、將DNA顯微注射至細胞核中、電穿孔、細菌原生質體與完整細胞融合、轉染及聚陽離子(例如，聚 凝胺、聚鳥胺酸等)。

舉例而言，合子係用於顯微注射之良好靶標且顯微注射合子之方法為人所熟知。使用業內已知之顯微注射技術將含有轉基因構築體之載體顯微注射至受精卵中，以產生NOD/pIns-αPEG鼠；例如，參見Marjeta Grzech等人，Molecular and Cellular Endocrinology，315(2010)，第219-224頁。

具體而言，轉基因鼠係如下產生：利用Nsi I及Not I酶消化pIns-αPEG質體。然後將含有人類胰島素啟動子、抗PEG報導基因及多聚腺苷酸化信號之片段凝膠純化。藉由標準前核注射至鼠胚胎中來生成轉基因鼠。簡言之，在前核顯微注射期間，將抗PEG報導基因盒DNA直接引入剛受精後之鼠卵子中。通常在已發生一或兩次細胞分裂後，DNA傾向於在基因體中之隨機位置作為許多串聯排列之拷貝整合。因此，所得鼠僅係部分轉基因的。若轉基因細胞有助於生殖細胞系，則將產生一些轉基因卵子或精子且下一代鼠將係轉基因的。

在另一態樣中，本發明提供測定靶基因對本發明之NOD鼠中之胰島細胞凋亡之效應之方法，該方法包含：使本發明之NOD鼠與攜帶靶基因之NOD轉基因鼠雜交；在第一時間點檢測由NOD轉基因鼠發射之信號；將PEG-成像劑之劑量投與NOD鼠；及在隨後的不同時間點測定由NOD鼠發射之信號之變化；其中若由NOD鼠發射之信號之變化顯著不同於在第一時間點發射之信號，則確定基因具有對胰島細胞凋亡之效應。

生成表現抗PEG報導基因之轉基因鼠。在該等動物中，將報導基因(抗PEG報導基因)連接至人類胰島素啟動子，由此驅動抗PEG報導基因在胰島細胞中之表現。全身性注射PEG成像劑自活鼠生成可檢測且可量化之 信號。此模型成功地量化監測胰島細胞凋亡。

檢測器技術之進步已導致靈敏度及成像品質之顯著改良。PEG-成像劑可係PEG-NIR797、PEG-SPIO或PEG-124I。信號檢測可係光學成像、MRI或微型PET。

在可用之成像方式中，已出現基於生物發光或螢光之光學技術作為最可及且容易操作者。由於來自組織之背景發光(雜訊)極低，生物發光成像(BLI)之特徵在於極高靈敏度。

已闡述使用非侵入性完整動物成像對表現盒之表現之監測(Contag,P.等人，Nature Medicine 4(2)：245-247，1998)。此成像通常使用至少一個光檢測器裝置元件，例如，電荷耦合裝置(CCD)照相機。

在另一態樣中，本發明提供篩選用於治療或預防1型糖尿病之候選藥劑或基因療法之方法，其包含將候選藥劑或基因投與本發明之NOD鼠；在不同時間點將PEG-成像劑之劑量投與NOD鼠；及在不同時間點測定由NOD鼠發射之信號；其中由NOD鼠發射之信號相對於候選藥劑投與之前之信號不變或隨時間增加指示候選藥劑或基因具有對1型糖尿病之治療或預防之效應。

在另一態樣中，本發明提供篩選抵抗胰島移植排斥之候選藥劑或基因之方法，其包含將自本發明之NOD鼠獲得之胰島移植至接受鼠，將抵抗排斥之候選藥劑或基因投與接受鼠；將PEG-成像劑之劑量在不同時間點投與NOD鼠；及在不同時間點測定由NOD鼠發射之信號；其中由NOD鼠發射之信號相對於候選藥劑投與之前之信號不變或隨時間增加指示候選藥劑或基因具有抵抗移植排斥之效應。

本發明之NOD鼠可用於多種其他篩選試驗。舉例而言，多種懷疑治 療或預防1型糖尿病之候選藥劑之任一者以及適當拮抗劑及阻斷治療劑、或抵抗胰島移植排斥之候選藥劑或基因可藉由投與NOD鼠及評價該等藥劑之效應而篩選。

候選藥劑涵蓋眾多化學類型，但其通常為有機分子、較佳小型有機化合物。候選藥劑亦發現於生物分子中，其包括但不限於：肽、醣、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶、其衍生物、結構類似物或組合。

候選藥劑係自眾多種來源獲得，包括合成或天然化合物之庫。舉例而言，眾多手段可用於隨機或定向合成眾多種有機化合物及生物分子，包括表現隨機化寡核苷酸及寡肽。另外，天然或合成產生之庫及化合物易於藉助習用化學、物理及生物化學手段修飾，且可用於產生組合庫。

候選藥劑可以任何期望及/或適當之方式投與，用於遞送藥劑以影響期望之結果。舉例而言，候選藥劑可藉由注射(例如，藉由靜脈內、肌內、皮下或直接注射至欲在其中達成期望影響之組織中)、經口或藉由任何其他合意之方式來投與。通常地，活體內篩選將涉及許多動物，其接受不同量及濃度之候選藥劑(自無藥劑至接近可成功遞送至動物之量之上限之藥劑之量)，且該活體內篩選可包括以不同調配物及途徑遞送藥劑。藥劑可單獨投與或可以兩種或更多種藥劑組合之方式組合，尤其在投與藥劑之組合可產生協同效應時。

在又一態樣中，本發明提供評估經移植之胰島之存活之方法，其包含將自本發明之NOD鼠獲得之胰島移植至接受鼠，將PEG-成像劑之劑量在不同時間點投與NOD鼠；及在不同時間點測定由NOD鼠發射之信號；其中若由NOD鼠發射之信號隨時間減少，則經移植之胰島之存活較差。

基於上文所述之本發明之NOD鼠之使用或除彼等以外，熟習此項技 術者閱讀本說明書後將易於明瞭其變化形式。

提出以下實例以便為熟習此項技術者全面揭示並說明如何製備及使用本發明，且該等實例不意欲限制本發明者視為其發明之範圍，亦不意欲表示以下實驗係所實施之所有或唯一實驗。

實例 實例1 本發明之轉基因構築體之製備

為構築如圖1中所示之pIns-抗PEG報導基因，藉由內部核糖體進入位點(IRES)接合抗PEG報導基因之VL-Ck及VH-CH1基因並融合至編碼鼠B7.1抗原(B7)之C形細胞外-跨膜-胞質結構域之互補DNA序列，以形成抗PEG報導基因。將抗PEG報導基因切片並連接至具有人類胰島素啟動子之載體中，以構築pIns-αPEG質體。圖1顯示本發明之完整轉基因構築體之示意圖。

實例2 在鼠胰臟β細胞中本發明之特異性表現之評估

為評估功能性抗PEG報導基因是否可在鼠胰島β細胞上特異性表現，將pIns-αPEG質體轉染至鼠胰島β細胞(NIT-1)或鼠纖維母細胞(3T3)中。使用藉由PEG(PEG-Qdot)修飾之螢光探針驗證在人類胰島素啟動子之調節下，功能性抗PEG報導基因可在鼠胰島β細胞(NIT-1)上特異性表現(圖2A)，同時其不能在鼠纖維母細胞(3T3)上特異性表現(參見圖2B)。

實例3 本發明之NOD/pIns-αPEG鼠之製備

為構築具有特異性表現抗PEG報導基因之胰島細胞之NOD鼠(NOD/pIns-αPEG鼠)，利用Nsi 1及Not 1酶消化pIns-αPEG質體，以分離pIns-αPEG基因片段，及然後使用顯微注射技術將pIns-αPEG基因片段轉染至NOD鼠之受精卵中，以產生NOD/pIns-αPEG鼠(F0)。

使用基因分型檢查以確定NOD鼠攜帶pIns-αPEG基因。藉由簡易組織及細胞基因體DNA純化套組(GeneMark DP021E)分離NOD鼠之基因體DNA。藉由PCR技術使用2×Taq PCR Mix Red試劑(Bioman,RT803R)，使用以下定位引子，即正向引子5’-TCATGCCTTCTTCTCTTTCCTACAG-3及反向引子5’-TCGTTTTGCTCGCTCGAGACACTC-3確定NOD鼠攜帶pIns-αPEG基因。PCR條件顯示如下：(1)初步變性：在94℃下3分鐘；(2)基因擴增(重複35個循環)，a.變性：在94℃下30秒，b.貼合：在62℃下30秒，c.延伸：在72℃下60秒；(3)最後延伸：在72℃下10分鐘；(4)在4℃下儲存。僅NOD/pIns-αPEG鼠具有850 bp之PCR產物，而野生型NOD鼠無該產物。圖3顯示NOD/pIns-αPEG鼠具有850 bp之PCR產物。

使用定位PCR檢查確定實例1之轉基因構築體插入NOD鼠基因體之位點。藉由簡易組織及細胞基因體DNA純化套組(GeneMark DP021E)分離NOD鼠之基因體DNA。藉由PCR技術使用SuperRed PCR混合母液試劑(2×)(TOOLS TE-SR01)，使用以下定位引子，即正向引子5’-CCCAATATTCTGGGTTCCAGGATGAAAG-3及反向引子5’-CATGGGTGCCTCCTTGAGAGG-3確定pIns-αPEG基因定位於NOD鼠之染色體11之chr11：14970958位點(參見圖5)。PCR條件顯示如下：(1)初步變性：在95℃下2分鐘；(2)基因擴增(重複35個循環)，a.變性：在95℃下35秒，b.貼合：在55℃下35秒，c.延伸：在72℃下2.5分鐘；(3)最後延伸：在72℃下10分鐘；(4)在4℃下儲存。PCR結果顯示NOD/pIns-αPEG鼠具有650 bp之PCT產物，故其確定pIns-αPEG基因插入NOD鼠之染色體11中(chr11：14970958)。轉基因構築體在NOD鼠之基因體中之插入位點 顯示於圖4中。

在基因型分析之後，其顯示NOD轉基因鼠攜帶抗PEG報導基因(圖6A)。此外，藉由西方墨點分析，NOD/pIns-αPEG鼠之後代之胰島細胞可穩定表現抗PEG報導基因蛋白質(參見圖6B)。以上結果顯示F0轉基因鼠之抗PEG報導基因可成功遺傳至後代。

進一步使用螢光顯微鏡以證明PEG-FITC螢光探針可特異性結合至NOD/pIns-αPEG鼠之胰島細胞，而非對照NOD鼠之彼等(參見圖7)。使用PEG-¹³¹I及γ計數器檢測三隻NOD/pIns-αPEG鼠之抗PEG報導基因表現程度。結果顯示在將PEG-¹³¹I投與鼠後24小時及48小時，NOD/pIns-αPEG鼠之胰臟之輻射值係對照NOD鼠之1.96倍及2.48倍(參見圖8)。

實例4 PEG-成像劑至表現抗PEG報導基因之胰島細胞之特異性結合

為測試PEG-成像劑是否可特異性結合至表現抗PEG報導基因之胰島細胞，將螢光成像劑4-臂PEG-NIR797分別注射至患有1型糖尿病(T1D)之NOD/pIns-αPEG鼠及未患T1D之NOD/pIns-αPEG鼠之胰臟中。在24小時後，使用光學成像系統(IVIS200光學成像系統)評估胰島細胞之細胞凋亡。圖9顯示4-臂PEG-NIR797成像劑可在未患T1D之NOD/pIns-αPEG鼠中特異性累積，同時其不能在患有T1D之NOD/pIns-αPEG鼠中累積。此外，由於野生型NOD鼠不表現抗PEG報導基因，故在胰島細胞中不累積4-臂PEG-NIR797成像劑。

進一步證明在將4-臂NIR797成像劑腹膜內注射至健康NOD/pIns-αPEG鼠及野生型NOD鼠中後，4-臂NIR797成像劑僅在NOD/pIns-αPEG鼠之健康胰島細胞中累積，而不在野生型NOD鼠中累積(參見圖10)。最終，證明腹膜內注射4-臂NIR797成像劑與光學成像系統組合可精確並持 續示蹤不同週之NOD/pIns-αPEG鼠之胰島之細胞凋亡進展(參見圖11A)，且自胰島發射之螢光信號之強度與T1D之進展高度相關(參見圖11B)。

實例5 基於NOD/pIns-αPEG鼠之胰島之生理特徵及病理特徵之評估

為評估NOD/pIns-αPEG鼠之胰島之生理特徵及病理特徵是否受抗PEG報導基因表現影響，實施組織化學染色分析。證明NOD/pIns-αPEG鼠之胰島之形態(參見圖12A)、大小(參見圖12B)及數目(參見圖8C)與對照NOD鼠之彼等無差異。對於20週齡之NOD/pIns-αPEG鼠及對照NOD鼠，胰島之免疫細胞浸潤無差異(參見圖13)。NOD/pIns-αPEG鼠之葡萄糖代謝速率與對照NOD鼠相似(參見圖14)。此外，NOD/pIns-αPEG鼠之T1D進展(參見圖15A)及其抗胰島素抗體之免疫反應之發作(參見圖15B)與對照NOD鼠之彼等相同。

<110> 臺北醫學大學

<120> 非肥胖型糖尿病鼠及其應用

<130> T54267/US5866

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1620

<212> DNA

<213> 人類

<220>

<221> misc_feature

<222> (601)..(601)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (607)..(607)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (610)..(610)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (617)..(617)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (646)..(646)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (666)..(666)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (679)..(679)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (695)..(695)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (708)..(708)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1054)..(1054)

<223> n係a、c、g或t

<400> 1

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人類

<400> 2

<210> 3

<211> 178

<212> DNA

<213> 人類

<400> 3

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 人類

<400> 4

<210> 5

<211> 573

<212> DNA

<213> 兔

<400> 5

<210> 6

<211> 2574

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 抗PEG報導基因

<400> 6

<210> 7

<211> 449

<212> DNA

<213> 兔

<400> 7

Claims (12)

1. 一種編碼抗PEG報導基因之轉基因構築體，其包含多核苷酸，該多核苷酸自5’至3’序列包含具有SEQ ID NO：1之核苷酸序列之人類胰島素啟動子、具有SEQ ID NO：2之核苷酸序列之人類胰島素基因之第一外顯子、具有SEQ ID NO：3之核苷酸序列之人類胰島素基因之第一內含子、具有SEQ ID NO：4之核苷酸序列之人類胰島素基因之第二外顯子、具有SEQ ID NO：5之核苷酸序列之兔β球蛋白基因之第二內含子、具有SEQ ID NO：6之核苷酸序列之抗PEG報導基因及具有SEQ ID NO：7之兔β球蛋白基因之第三內含子，其可操作地彼此連接。
2. 一種載體，其包含如請求項1之轉基因構築體。
3. 一種細胞，其包含如請求項2之載體。
4. 一種生成基因體包含如請求項1之轉基因構築體之嵌合NOD鼠之方法，其包含將該轉基因構築體併入該鼠之染色體11之位點之步驟。
5. 如請求項4之方法，其中該染色體11之位點係chr11：14970958。
6. 一種生成基因體包含如請求項1之轉基因構築體之嵌合NOD鼠之方法，其包含以下步驟：製備如請求項2之載體，並利用該載體轉染NOD鼠之受精卵。
7. 一種測定靶基因對基因體包含如請求項1之轉基因構築體之嵌合NOD鼠中之胰島細胞凋亡之效應之方法，該方法包含：使基因體包含如請求項1之轉基因構築體之嵌合NOD鼠與攜帶該靶基因之NOD轉基因鼠雜交；在第一時間點檢測由該雜交後所得NOD轉基因子代鼠發射之信號；將PEG-成像劑之劑量投與該NOD轉基因子代鼠；及在隨後的不同時間點測定由該NOD轉基因子代鼠發射之信號之變化；其中若由該NOD轉基因子代鼠發射之信號之該變化顯著低於在該第一時間點發射之該信號，則確定該基因具有對該胰島細胞凋亡之效應。
8. 如請求項7之方法，其中該PEG-成像劑係PEG-NIR797、PEG-SPIO或PEG-¹²⁴I。
9. 如請求項7之方法，其中信號檢測係光學成像、MRI或微型PET。
10. 一種篩選用於治療或預防1型糖尿病之候選藥劑或基因療法之方法，其包含將候選藥劑或基因投與基因體包含如請求項1之轉基因構築體之嵌合NOD鼠；將PEG-成像劑之劑量在不同時間點投與該NOD鼠；及在不同時間點測定由該NOD鼠發射之信號；其中由該NOD鼠發射之該信號相對於候選藥劑或基因投與之前之信號不變或隨時間增加指示該候選藥劑或基因具有對1型糖尿病之治療及預防之效應。
11. 一種篩選抵抗胰島移植排斥之候選藥劑或基因之方法，其包含將自 基因體包含如請求項1之轉基因構築體之嵌合NOD鼠獲得之胰島移植至接受鼠，將抵抗排斥之候選藥劑或基因投與該接受鼠；將PEG-成像劑之劑量在不同時間點投與該接受鼠；及在不同時間點測定由該接受鼠發射之信號；其中由該接受鼠發射之該信號相對於候選藥劑或基因投與之前之該信號不變或隨時間增加指示該候選藥劑或基因具有抵抗移植排斥之效應。
12. 一種評估經移植胰島之存活之方法，其包含將自基因體包含如請求項1之轉基因構築體之嵌合NOD鼠獲得之胰島移植至接受鼠，將PEG-成像劑之劑量在不同時間點投與該接受鼠；及在不同時間點測定由該接受鼠發射之信號；其中若由該接受鼠發射之該信號隨時間減少，則該經移植胰島之存活較差。