CN110373426A - 非肥胖性糖尿病动物模型、构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种产生非肥胖性糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病)的动物模型的方法，所述方法包括在动物的胰岛β细胞中过表达NIK基因。与现有的非肥胖糖尿病小鼠模型NOD小鼠相比，本发明的β‑NIK‑OE雄性小鼠具有稳定性好、周期短和花费少等优点，可用于糖尿病发病机制研究、糖尿病并发症研究和糖尿病药物筛选。

Description

非肥胖性糖尿病动物模型、构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种产生非肥胖性糖尿病(也称为1型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病)的动物模型的方法，这种动物模型可用于糖尿病发病机制研究、糖尿病并发症研究和糖尿病药物筛选。

背景技术

糖尿病是威胁人类健康的重大疾病之一，其重要特征是高血糖和胰岛素分泌相对不足(2型糖尿病或肥胖型糖尿病或非胰岛素依赖性糖尿病)或绝对不足(1型糖尿病或非肥胖性糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病)。我国2型糖尿病发病率已到11.6％，1型糖尿病发病率也在持续增加，国家对糖尿病的基础研究和药物开发投入越来越多。研究糖尿病发病机制以及药物研发需要很好的糖尿病小鼠模型。

目前使用最多的1型糖尿病小鼠模型是NOD(non-obese diabetes)小鼠。2012年以来，每年使用NOD小鼠发表的学术论文在1200篇左右，每年用NOD小鼠筛选药物发表的文章在500篇左右。NOD小鼠具有以下特点：NOD小鼠在6-8周出现小鼠胰岛炎、免疫细胞浸润和非空腹高血糖(Delovitch TL et.al.Immunity.1997；7:727-38)。NOD小鼠在30周龄后逐渐出现自发糖尿病，雌鼠发病率为60-80％，雄鼠发病率仅为20-30％。NOD小鼠发病率差异很大，主要与环境和年龄密切相关。有研究表明NOD小鼠只在SPF级动物房出现自发糖尿病，NOD小鼠年龄越大发病率越高，雌鼠发病率远高于雄鼠发病率。上述数据可以提示：NOD小鼠模型具有很多缺点比如建模周期长(需要30周以上)、发病率低、饲养环境苛刻、雄鼠很少发病等。因此，需要建立新的更稳定、更廉价的1型糖尿病动物(小鼠)模型。

发明内容

针对上述问题，本发明人经过深入研究，利用转基因手段建立了一个新型的、更稳定、更廉价的1型糖尿病动物(小鼠)模型——β-NIK-OE小鼠。本发明人通过在胰岛β细胞里高表达NF-κB inducing kinase(NIK，又名MAP3K14)建立了这一小鼠模型(即在胰岛β细胞里高/过表达NIK基因的小鼠，β-NIK-OE小鼠)。

NIK作为MAP3K家族中的一员，在一些生理过程的形态发生中起控制作用，同时也是促炎信号转导通路的重要分子，在IKK/NF-κB、JNK、ERK、p38MAPK通路以及AP-1的活化过程中扮演重要角色，并且可以调控介导炎症反应的基因的表达。NIK在自身免疫及获得性免疫反应过程中发挥着关键作用。

有报道显示，胰岛β细胞特异性敲除NIK的负调控因子TRAF2(肿瘤坏死因子受体相关因子2)或TRAF3(肿瘤坏死因子受体相关因子3)，可以激活NIK，导致胰岛β细胞功能损伤，但是并不能引起1型糖尿病，药理学手段激活NIK也不能引起1型糖尿病(Malle EK et.al.JExp Med.2015；212(8):1239-54)。本发明人出人意料地发现，通过转基因手段直接在(特别是雄性)动物(特别是小鼠)胰岛β细胞中过表达NIK才能够导致动物1型糖尿病，从而获得了1型糖尿病小鼠模型。

这一模型具有以下特点：1)发病率高：全部β-NIK-OE雄性小鼠出现自发1型糖尿病；2)发病率早：β-NIK-OE雄性小鼠血糖从5周龄开始升高，到第8周血糖升高到14mM，8周以后就出现1型糖尿病表型，体重随年龄和血糖升高而降低，高血糖伴随着极低胰岛素水平，胰岛β细胞和胰岛素总量显著减少；3)糖尿病病情稳定：全部β-NIK-OE雄性小鼠9周以后的平均血糖在20mM以上，病情非常稳定；4)雄鼠发病，雌鼠不发病(去除雌激素(如通过摘除卵巢)后可发病)；5)对饲养环境要求不高：β-NIK-OE雄性小鼠在任何饲养环境均能出现自发1型糖尿病。

本发明提供了一种新型的1型糖尿病小鼠模型的构建方法，与现有的非肥胖糖尿病小鼠模型NOD小鼠相比，β-NIK-OE雄性小鼠具有稳定性好、周期短和花费少等优点，可用于1型糖尿病发病机制研究、糖尿病并发症研究和糖尿病药物筛选。

因此，本发明的一个目的在于提高一种产生非肥胖性糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病)的动物模型的方法，所述方法包括(特异性地)在动物的胰岛β细胞中过表达NIK基因。

在一个优选的实施方案中，所述动物是(非人)哺乳动物，优选反刍动物、犬科动物、兔科、猫科或啮齿科，更优选鼠、猪、猴(猕猴或食蟹猴)、熊、绵羊、山羊、马、驴、兔、猫、牛、狐狸或狗，最优选小鼠或大鼠。

在一个优选的实施方案中，所述非肥胖性糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病)的动物模型是雄性或雌性动物，优选雄性动物。

在一个优选的实施方案中，所述动物是小鼠或大鼠，更优选C57小鼠或Wistar大鼠或SD大鼠，最优选C57BL/6J小鼠。

在一个优选的实施方案中，在所述动物的胰岛β细胞中NIK基因的表达水平(mRNA水平)是对照动物的2倍以上，优选3倍以上，更优选4倍以上(例如，5、6、7、8、9或10倍)，最优选10倍以上。例如，在所述动物模型的胰岛β细胞中NIK基因的表达水平(mRNA水平)是对照动物的2-100倍(例如，20、30、40、50、60、70、80、90或100倍)，5-50倍，10-30倍，或15-20倍。

在一个优选的实施方案中，其中通过如下方式在小鼠的胰岛β细胞中过表达NIK基因：

将NIK基因通过同源重组的方式整合到小鼠染色体(如六号染色体ROSA26)位点，所述NIK基因处于胰岛β细胞特异性启动子(如RIP)的控制之下以在胰岛β细胞中表达，和/或利用TRE启动子/rtTA蛋白诱导调控表达系统(可用四环素类似物多西环素(Doxcycline，简称Dox)诱导)来控制所述NIK基因的表达。

更优选地，通过如下方式在小鼠的胰岛β细胞中过表达NIK基因：

1)将ROSA26Stop^FLNIK小鼠和RIP-Cre小鼠杂交，得到ROSA26Stop^FLNIK^+/+RIP-Cre^+/-小鼠，即为β-NIK-OE小鼠；

2)构建Rosa26-pTRE(3G)-LSL-NIK-3×Flag-CAG-rTTA(3G)Cas9-KI小鼠，然后使其跟RIP-Cre小鼠杂交，得到ROSA26Stop^FLNIK^+/+RIP-Cre^+/-小鼠，即为β-NIK-OE小鼠，在Dox诱导下，NIK在胰岛β细胞中过表达；或

3)RIP启动子过表达NIK转基因小鼠。

在一个优选的实施方案中，所述方法还包括以下步骤中的一个或多个：

1)测量所述动物的血糖水平；

2)测量所述动物的胰岛素水平；

3)测量所述动物的胰岛β细胞的数量；

4)确定所述动物是否出现免疫细胞浸润；和/或

5)确定所述动物是否具有糖尿病并发症。

本发明的另一个目的在于提供通过以上方法产生的非肥胖性糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病)的动物模型。

本发明的另一个目的在于提供一种鉴别和/或测试用于治疗非肥胖性糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病)和/或其并发症的化合物的方法，包括向由以上所述的方法产生的动物模型给予目的化合物和确定糖尿病和/或至少一种其并发症是否由所述化合物逆转的步骤。

本发明的还一个目的在于提供根据以上所述的动物模型用于鉴别和/或测试治疗非肥胖性糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病)和/或治疗与非肥胖性糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病)相关的并发症的化合物的用途。

附图说明

图1：β-NIK-OE(胰岛β细胞中过表达NIK基因的)小鼠构建的三种策略；

图2：策略二的打靶载体图谱；

图3：Southern blot鉴定F0代小鼠；

图4：F1代小鼠鉴定策略；

图5：F1代小鼠基因鉴定结果；

图6：β-NIK-OE雄鼠和对照小鼠血糖随年龄的变化；

图7：β-NIK-OE雌鼠和对照小鼠血糖随年龄的变化；

图8：β-NIK-OE雄鼠和对照小鼠体重随年龄的变化；

图9：β-NIK-OE雄鼠和对照小鼠非肥胖糖尿病发病率；

图10：β-NIK-OE雄鼠和对照小鼠在8周龄时的葡萄糖耐受水平；

图11：β-NIK-OE雄鼠和对照小鼠在8周龄时的胰岛素耐受水平；

图12：β-NIK-OE雄鼠和对照小鼠在18周龄时的血清胰岛素水平；

图13：β-NIK-OE雄鼠和对照小鼠在18周龄时的胰腺胰岛素总量；

图14：β-NIK-OE雄鼠和对照小鼠在18周龄时的胰岛大小和形态；

图15：β-NIK-OE雄鼠和对照小鼠在18周龄时的胰岛素阳性区域面积；

图16：β-NIK-OE雄鼠和对照小鼠在18周龄时胰高血糖素占胰岛的相对面积；

图17：β-NIK-OE雄鼠在8周龄出现胰岛炎；

图18：β-NIK-OE雄鼠在8周龄时胰岛出现免疫细胞浸润；和

图19：RT-qPCR检测β-NIK-OE雄鼠和对照小鼠胰岛炎症相关基因和胰岛素分泌相关基因的表达。

具体实施方式

除非另外定义，否则在本文中使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。

术语“非肥胖性糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病)”即为1型糖尿病—胰岛B细胞破坏导致胰岛素绝对缺乏的疾病。与之相对的2型糖尿病是胰岛素抵抗为主伴胰岛素相对性缺乏或胰岛素分泌受损为主伴胰岛素抵抗的疾病。

在本发明中，非肥胖性糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病)的动物模型的判断标准一般为连续2次随机血糖检测值大于或等于14mM。通过本发明的方法构建的β-NIK-OE雄鼠在10周及10周以后的非肥胖糖尿病发病率为100％。

优选地，本发明的动物模型中的动物是哺乳动物，优选反刍动物、犬科动物、兔科、猫科或啮齿科，更优选鼠、猪、猴(猕猴或食蟹猴)、熊、绵羊、山羊、马、驴、兔、猫、牛、狐狸或狗，例如小鼠、大鼠、仓鼠。

本领域已知各种哺乳类动物基因转移方法，包括将改建后的目的基因(或基因组片段)用显微注射等方法注入实验动物的受精卵(或着床前的胚胎细胞)，然后将此受精卵(或着床前的胚胎细胞)再植入受体动物的输卵管(或子宫)中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物。可以通过传代来筛选目标杂合子和纯合子。根据外源基因导入的方法和对象的不同，目前制作转基因动物的方法主要有显微注射法、反转录病毒法、胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)法、电脉冲法、精子载体导入法等。

为了特异性地在动物的胰岛β细胞中过表达NIK基因，通常可以采用胰岛β细胞特异性启动子来表达NIK基因。该胰岛β细胞特异性启动子优选为大鼠胰岛素基因的启动子RIP(Rat Insulin Promoter)。

在本发明的一个优选的实施方案中，通过如下策略获得在小鼠的胰岛β细胞中特异性过表达NIK基因的非肥胖性糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病)的动物模型：

将NIK基因通过同源重组的方式整合到小鼠染色体(如六号染色体ROSA26)位点，以获得稳定遗传，所述NIK基因处于胰岛β细胞特异性启动子(如RIP)的控制之下以在胰岛β细胞中表达。优选地，将NIK基因通过同源重组的方式整合到小鼠染色体(如六号染色体ROSA26)位点，利用TRE启动子/rtTA蛋白诱导调控表达系统(可用四环素类似物多西环素(Doxcycline，简称Dox)诱导)来控制所述NIK基因的表达。

更优选地，通过如下策略获得所述非肥胖性糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病)的动物模型：

1)将ROSA26Stop^FLNIK小鼠和RIP-Cre小鼠杂交；

2)构建Rosa26-pTRE(3G)-LSL-NIK-3×Flag-CAG-rTTA(3G)Cas9-KI小鼠，然后使其跟RIP-Cre小鼠杂交(其后通过传代获得纯合子)；或

3)RIP启动子过表达NIK转基因小鼠。

对于第一种策略，如图1，A所示，ROSA26Stop^FLNIK小鼠在构建时将中止序列(STOPsequence)加到两个LoxP位点之间，在正常情况下没有NIK的高表达。当ROSA26Stop^FLNIK小鼠与RIP-Cre小鼠杂交后(用大鼠胰岛素基因的启动子控制Cre酶表达，可以做到只在胰岛β细胞里表达Cre酶)，Cre酶在大鼠胰岛素基因的启动子RIP(Rat Insulin Promoter)的作用下在胰岛β细胞中表达，Cre酶可以将LoxP位点切除，从而启动NIK基因在胰岛β细胞里的特异性高表达/过表达。动物传代和杂交技术是本领域技术人员公知的常规技术。

对于第二种策略，如图1，D所示，构建

Rosa26-pTRE(3G)-LSL-NIK-3×Flag-CAG-rTTA(3G)Cas9-KI小鼠，然后使其跟RIP-Cre小鼠杂交(见图1，D)，经过传代和纯合子筛选，得到Rosa26-NIK-KI^+/+RIP-Cre^+/-小鼠，即β-NIK-OE小鼠，然后注射不同剂量四环素类似物多西环素(Doxcycline，简称Dox)，Dox与rtTA蛋白结合，然后结合TRE启动子，诱导NIK高表达。跟第一种策略相比，这种方法优点是可以在任何年龄诱导NIK高表达，也可以通过Dox的剂量控制NIK在胰岛β细胞内的特异性高表达/过表达。

对于第三种策略，如图1，E所示，可以直接将NIK基因与大鼠胰岛素基因启动子(Rat insulin promoter，简称RIP)可操作连接而构建表达载体，通过本领域已知各种哺乳类动物基因转移方法，构建NIK高表达转基因小鼠(见图1，E)。此种策略的优点是步骤少，技术成熟，时间较短，缺点在于基因插入随机性强和表达可控性较差。

第二和第三种策略的具体做法参考已发表文章(Quadros RM et.al.FEBS OpenBio.2015；5:191-7；Yang H,et.al.Cell.2013Sep 12；154(6):1370-9.)。

如本文所用，术语“过表达NIK基因”是指在所述动物模型的胰岛β细胞中NIK基因的表达水平(mRNA水平)是对照动物(同性(雄性或雌性)的、未过表达NIK基因的对应动物，或非转基因动物或野生型动物)的2倍以上，优选3倍以上，更优选4倍以上(例如，5、6、7、8、9或10倍)，最优选10倍以上。例如，在所述动物模型的胰岛β细胞中NIK基因的表达水平(mRNA水平)是对照动物的2-100倍(例如，20、30、40、50、60、70、80、90或100倍)，5-50倍，10-30倍，或15-20倍。

如本文所用，术语“NIK(NF-κB inducing kinase，又名MAP3K14)基因”是指(哺乳)动物中各类同源基因及其各种功能变体。对于小鼠而言，NIK(Map3k14)基因有4个转录本，其中1个有完整的编码区(CDS)，在本发明中优选选择Map3k14-001(ENSMUST00000021324.2)。

本发明还涉及通过本发明所述的方法产生的非肥胖性糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病)的动物模型。

另一方面，本发明还提供一种鉴别和/或测试用于治疗非肥胖性糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病)和/或其并发症的化合物的方法，包括向由本发明的方法产生的动物模型给予目的化合物和确定糖尿病和/或至少一种其并发症是否由所述化合物逆转的步骤。

优选地，本发明提供一种鉴别能够减轻糖尿病进展的药剂的方法，所述方法包括：

a)制备本发明的非肥胖性糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病)的动物模型；

b)将所述药剂施用给所述动物模型；和

c)基于所述动物模型的糖尿病的病理学表型，评估糖尿病的进展；

其中与未施用所述药剂的动物模型相比更低发展的糖尿病将所述药剂鉴别为能够减轻糖尿病进展。

糖尿病并发症主要包括：①大血管并发症，如脑血管、心血管和下肢血管的病变等。②微血管并发症，如肾脏病变和眼底病变。③神经病变，包括负责感官的感觉神经，支配身体活动的运动神经，以及司理内脏、血管和内分泌功能的自主神经病变等等。确定动物糖尿病并发症的方法和实验步骤是本领域技术人员公知的。

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：β-NIK-OE小鼠构建方法。

[材料与方法]：

三种策略可以构建β-NIK-OE小鼠，分别为：

(1)将ROSA26Stop^FLNIK小鼠跟RIP-Cre小鼠杂交(见图1，A)。ROSA26Stop^FLNIK小鼠详见已发表的文章(Ren X.et.al.FASEB J.2017；31(2):711-718；LiX.et.al.Theranostics 2018；8(21):5960-5971；Sasaki Y.et.al.PNAS 2008；105(31):10883-10888.)。大鼠胰岛素启动子Cre转基因小鼠即RIP-Cre小鼠详见已发表的文章(Manuel BR et.al.Nat Commun.2017；8:16014.)。

如图1，A所示，ROSA26Stop^FLNIK小鼠在构建时将中止序列(STOP sequence)加到两个LoxP位点之间，在正常情况下没有NIK的高表达。当ROSA26Stop^FLNIK小鼠与RIP-Cre小鼠杂交后(用大鼠胰岛素基因的启动子控制Cre酶表达，可以做到只在胰岛β细胞里表达Cre酶)，Cre酶在大鼠胰岛素基因的启动子RIP(Rat Insulin Promoter)的作用下在胰岛β细胞中表达，Cre酶可以将LoxP位点切除，从而启动NIK基因在胰岛β细胞里的特异性高表达/过表达。具体杂交策略为：ROSA26Stop^FLNIK^+/+小鼠与RIP-Cre^+/-小鼠杂交一次，得到ROSA26Stop^FLNIK^+/-RIP-Cre^+/-小鼠，ROSA26Stop^FLNIK^+/-RIP-Cre^+/-小鼠跟ROSA26Stop^FLNIK^+/+小鼠回交一次，得到ROSA26Stop^FLNIK^+/+RIP-Cre^+/-小鼠即为β-NIK-OE小鼠，ROSA26Stop^FLNIK^+/+RIP-Cre^+/-小鼠与ROSA26Stop^FLNIK^+/+杂交，可以得到等量的β-NIK-OE小鼠和对照小鼠(基因型为ROSA26Stop^FLNIK^+/+)。

基因鉴定方式如下：

β-NIK-OE小鼠(基因型为：ROSA26Stop^FLNIK^+/+RIP-Cre^+/-)：ROSA26Stop^FLNIK引物PCR反应未获得单一475bp条带，并且RIP-cre引物PCR获得单一的250bp条带；

对照小鼠(基因型为：ROSA26Stop^FLNIK^+/+)：ROSA26Stop^FLNIK引物PCR反应未获得单一475bp条带，并且RIP-cre引物PCR未获得单一的250bp条带；

ROSA26Stop^FLNIK^+/-RIP-Cre^+/-小鼠：ROSA26Stop^FLNIK引物PCR反应获得单一475bp条带，并且RIP-cre引物PCR获得单一的250bp条带。

ROSA26Stop^FLNIK小鼠基因鉴定引物为：

ROSA26Stop^FLNIK-F:TCCCAAAGTCGCTCTGAGT

ROSA26Stop^FLNIK-R:TGAGCATGTCTTTAATCTACC

这对引物针对基因组的ROSA26位点，以这对引物做PCR，可以在杂合子小鼠(ROSA26Stop^FLNIK^+/-)和野生型小鼠得到单一的475bp，由于纯合子小鼠(ROSA26Stop^FLNIK^+/+RIP-Cre^+/-或ROSA26Stop^FLNIK^+/+)的ROSA26位点遭到破坏，以这对引物做PCR时得不到任何条带。

RIP-cre小鼠基因鉴定引物为：

Cre-F:GCATAACCAGTGAAACAGCATTGCTG；

Cre-R:GGACATGTTCAGGGATCGCCAGGCG

基因鉴定结果如图1，B所示：2679为ROSA26Stop^FLNIK^+/+对照小鼠；2697为β-NIK-OE小鼠(基因型为：ROSA26Stop^FLNIK^+/+RIP-Cre^+/-)；2669为ROSA26Stop^FLNIK^+/-RIP-Cre^+/-小鼠；2671为ROSA26Stop^FLNIK^+/-小鼠。

NIKqPCR引物序列为：

NIK-qF：TCTCTGGAGGAACAGGAACAA

NIK-qR：GCCATTGAGAGACTGGATCTG

如图1，C所示：与ROSA26Stop^FLNIK^+/+对照小鼠相比，NIK mRNA在β-NIK-OE小鼠胰岛中增加了10倍。

(2)构建Rosa26-pTRE(3G)-LSL-NIK-3×Flag-CAG-rTTA(3G)Cas9-KI小鼠，然后使其跟RIP-Cre小鼠杂交(见图1，D)，经过传代和纯合子筛选，得到Rosa26-NIK-KI^+/+RIP-Cre^+/-小鼠，即β-NIK-OE小鼠。在获得的Rosa26-NIK-KI^+/+RIP-Cre^+/-小鼠(即β-NIK-OE小鼠)中，通过注射不同剂量四环素类似物多西环素(Doxcycline，简称Dox)，Dox与rtTA蛋白结合，然后结合TRE启动子，可诱导NIK高表达。跟第一种策略相比，这种方法优点是可以在任何年龄诱导NIK高表达，也可以通过Dox的剂量控制NIK在胰岛β细胞内的特异性高表达/过表达。

(3)大鼠胰岛素基因启动子(Rat insulin promoter，简称RIP)介导的NIK高表达转基因小鼠(见图1，E)。

第二和第三种策略的具体实验方法参考已发表文章(Quadros RM et.a1.FEBSOpen Bio.2015；5：191-7；Yang H，et.al.Cell.2013Sep 12；154(6)：1370-9.)。

第二种策略基本步骤如下：

(1)利用CRISPR/Cas9技术，通过同源重组的原理，对靶位点进行基因修饰。具体过程如下：设计并体外转录gRNA，同时构建同源重组载体(Donor vector)。将Cas9、gRNA和打靶载体质粒(Donor vector)同时注射到小鼠的受精卵中。Cas9蛋白在gRNA引导下结合到靶位点进而造成DNA双链断裂，Donor vector通过同源重组修复断裂的双链，从而实现对靶位点的基因修饰。

gRNA序列信息

gRNA名称	gRNA序列(5′→3′)	PAM
			Rosa26-S2	GGCAGGCTTAAAGGCTAACC	TGG

NIK(Map3k14)基因有4个转录本，其中1个有完整的编码区(CDS)，我们选择Map3k14-001(ENSMUST00000021324.2)进行模型制作，长度为2829bp。序列信息如下：

ATGGCCGTGATGGAAGTGGCCTGCCCGGGCACTCCTGGGTCAGCAGTCGGGCAGCAGAAGGAGCTTGCCAAAGCCAAGGAGAAGACACAGTCACTGGGGAAGAAGCAGAGCTGCATCTTCAAGCTTGAGGCCGTGGAGAAGAGCCCCGTGTTCTGTGGGAAGTGGGAGATCCTAAACGACGTGATCACCAAAGGCACAGCCAAGGACGGCTCTGAGGGAGGACCACCGGCCATCTCCATCATCGCCCAGGCTGAATGTGAGAATAGCCAAGAGTTCAGCCCCACCTTCTCAGAGCGCATTTTCATCGCGGGGTCACAGCAGTACAGCCAGTCTGAGAGTCTCGATCAAATCCCCAACAATGTGGCCCATGCAACTGAAGGCAAAATGGCCCGTGTGTGCCGGAGGGGAAAACGTCACGGCAAAGCCCGAAAAAAACGTAGGAAGAAGAGGTCGAAGTCACTGGCCCAGGCAGGAGTGGCCTTAGCCAAGCCCCTGCCCAGAACCCCTGAGCAAGAGAGCTGTACCATCCCAGTACAGGAAGATGAGTCTCCACTAGGCAACCTCTATGCCAGAAATGTCTCCCAGTTCACCAAGCCTCTGGGGGGACCAGGCCTTGGCCACCTGTGCTTTAAGAAACAAGATGAAGGCCTGCGACCGGTACTGCCTCGACCAGAACTCCACAAACTGATCAGCCCCTTGCAATGTCTAAACCACGTGTGGAAACTCCACCACCCCCAGGCCACAGGCCCCCGGCCCCACCCGACTCACCCCTTCCCCTACAGCGGAATGCCCCATCCTTTCCCATTCTACCCCCTGGAGCCCTGGAAACCCTATATGCTGGACTCTGCCGTCCTGGACAAACTAGCCGGTGTCAGCGGCCAGCGGCCTCTGCCTGGCCCACCGCATCTAAGCCAACTGGCCCATGGAGACAGTCAGAAGCCGCTGCCTGGCCCACACCTGGAGTCCAGCTGCCCGTCTCGGGGTGCCCTAGAAAAGGTTCCCGTGGAGGAATACCTGGTGCATGCGCTCCAAGGAAGTGTGAGCTCAGGCCAGGCCCACAGCCTGGCCAGCCTGGCTAAGACATGGTCCTCGGGAAGCGCCAAGCTGCAGAGGCTCGGCCCCGAAACTGAGGACAACGAGGGGGTCCTGCTTACTGAGAAACTCAAGCCAGTGGATTATGAGTATCGAGAAGAGGTCCACTGGATGACACACCAGCCTCGGGTGGGCAGAGGCTCCTTCGGCGAGGTCCACAGAATGAAGGACAAGCAGACAGGCTTCCAGTGTGCTGTCAAAAAGGTACGACTCGAGGTGTTTCGGGTAGAGGAACTAGTGGCCTGTGCTGGTCTGAGCTCGCCCAGAATCGTCCCTCTCTATGGAGCTGTGAGAGAAGGCCCGTGGGTGAACATCTTCATGGAACTGCTAGAAGGTGGCTCGCTGGGTCAGCTCATAAAGCAAATGGGCTGTCTGCCAGAAGACCGAGCCCTTTACTACCTGGGCCAGGCCCTGGAGGGGCTGGAGTACCTCCACACACGCAGGATTCTGCATGGCGATGTCAAAGCTGACAACGTGCTCCTGTCCAGTGATGGAAGCCGAGCGGCCCTCTGCGACTTTGGCCACGCCTTGTGCCTGCAACCTGACGGCCTAGGGAAATCCTTGCTCACAGGGGACTACATTCCTGGCACGGAGACCCACATGGCACCAGAAGTGGTGATGGGAAAGCCCTGCGATGCCAAGGTGGACATCTGGAGCAGCTGCTGCATGATGCTCCACATGCTCAACGGCTGCCACCCCTGGACTCAGTACTTCCGAGGCCCGCTTTGTCTCAAGATTGCCAGCGAGCCTCCACCGATCAGGGAGATCCCACCTTCCTGCGCACCCCTCACAGCCCAGGCCATCCAAGAGGGGCTGAGGAAAGAGCCCGTCCACCGAGCATCTGCCATGGAGCTTCGGAGGAAAGTGGGCAAGGCACTACAGGAAGTGGGAGGTCTGAAAAGCCCTTGGAAAGGAGAATATAAAGAACCAAGACCTCCACCCCAAGACCAAGCCACCTGCCACCAGACCCTACCTACTCCGCCGAGAGAGAACCCACCAGCCAAGGCCAACACAGACGGGGCTCCTGAGCCTCAGCCTCCTCTACCGCCAGAACCACCAGAACCGAGCAAAGCGCCAGCCCTGAACCTGAGCAAGGAGGAGTCTGGCACATGGGAACCCCTGCCTCTGTCCTCCCTGGACCCAGCCACTGCCAAAGGCCCCAGCTTCCCAGACCGGAGGGCAACCTTGCCAGAGCTGGAGCTACAGCAACTGGAGATAGAACTGTTTCTCAACAGCCTGTCCCAGCCGTTCTCTCTGGAGGAACAGGAACAAATCCTCTCCTGCCTCAGCATCGACAGCCTCTCGCTGTCAGATGACAGTGAAAAGAATCCATCGAAGGCCTCTCAGAGCTCACGGGACACCCTGAGTTCTGGCGTGCACTCTTGGAACAGCCAAGCTGAGGCAAGAACCTGCAGCTGCAGCACGGCGCTGGCCCGGGGGCGGCCTACTGACATCCCGAGCTACTTCAACGGGGTCAAGGTCCAGATCCAGTCTCTCAATGGCGAACACCTGCATATCCGGGAATTCCACCGCGTCAAGGTGGGAGACATTGCCACCGGCATCAGCAGCCAGATCCCAGCCACAGCTTTCAGCCTGGTGACCAAAGATGGACAGCCTGTTTGCTATGACATGGAGGTGCCAGACTCGGGCATCGACCTGCAGTGCACCCTGGCCCCTGATGGCAGCTTTGCTTGGACCTGGAGGGTCAAGCATGGTCAGCTGGAGAACCGACCCTAG

打靶载体的结构示意图如图2所示。

(1)F0代小鼠的获得和鉴定；

经受精卵显微注射，胚胎移植，获得F0小鼠。通过PCR、测序和Southern blot酶切图谱确认(见图3)，获得同源重组阳性F0代小鼠，分别为10、16、28、50和53号小鼠。

探针引物信息：

Rosa26-p5-F1:CCTAGATGCTCTAGACCTGGTCCAC

Rosa26-p5-R1:TCCCTTATTATGCCTCCAGTAGGC

产物长度398bp，为5端探针

Rosa26-p3-F1:CAGAAGATGCCAGCCATCTGG

Rosa26-p3-R1:GCATCAGGATAAAGTTCTTGCTCATC

产物长度417bp，为3端探针

探针序列：

P5-1

CCTAGATGCTCTAGACCTGGTCCACTAAGGAGGCAACTTACATTTATAAGGACAGGGAACATGGAACTCACTTTAATCCATACAAAGCTTTGGGGCCTCCCCACTCCTCAGAAGATAGGATAGGTTCTTTCTGATTTCTAGACCGTATGAAATTTGGGTTTTAAAAGTATGTGCTTGACATAAATTAAAGGCGTAAGTGAAAACTAAAAACAGTTTCTTTAATTGTAAACCAAAGTGAATACTCTCCTAGGGGGAAAAAAAAATCTCTTTCCTTCCCTACCTCCGGCCCCTCCCCCACCAACACTGCCTCCCTGCTGTGCAAAGAGCCCTTTGTCCTGCCCCGCACTTATCTAGCTGTTTGGCCATATTGACAGGCCTACTGGAGGCATAATAAGGGA

P3-1

CAGAAGATGCCAGCCATCTGGGCCTTTTAACCCAGAAATTTAGTTTCAAACTCCTAGGTTAGTGTTCTCACTGAGCTACATCCTGATCTAGTCCTGAAAATAGGACCACCATCACCCCCAAAAAAATCTCAAATAAGATTTATGCTAGTGTTTCAAAATTTTAGGAATAGGTAAGATTAGAAAGTTTTAAATTTTGAGAAATGGCTTCTCTAGAAAGATGTACATAGTGAACACTGAATGGCTCCTAAAGAGCCTAGAAAACTGGTACTGAGCACACAGGACTGAGAGGTCTTTCTTGAAAAGCATGTATTGCTTTACGTGGGTCACAGAAGGCAGGCAGGAAGAACTTGGGCTGAAACTGGTGTCTTAAGTGGCTAACATCTTCACAACTGATGAGCAAGAACTTTATCCTGATGC

杂交获得F1代小鼠，F1代小鼠鉴定结果和小鼠信息。

鉴定策略示意图见图4，图中的KI片段表示插入的NIK(MAP3K14)基因，具体鉴定方法如下：

野生型：①②PCR反应未获得阳性条带；③PCR反应可以获得单一的479bp条带

杂合子：①②PCR反应可以获得阳性条带；③PCR反应可以获得单一的479bp条带

纯合子：①②PCR反应可以获得阳性条带；③PCR反应未获得单一的479bp条带

PCR引物信息：

基因鉴定结果如图5所示(图中的P表示阳性对照和N表示阴性对照)，58、67、71和72为F1代阳性小鼠。

F1小鼠可跟RIP-Cre小鼠杂交，得到STOP-NIK^+/+RIP-Cre^+/-小鼠，即β-NIK-OE小鼠。与第一种策略构建的β-NIK-OE小鼠相比，第二种策略构建的β-NIK-OE小鼠在注射不同剂量的四环素类似物多西环素(Doxcycline，简称Dox)时，Dox与rtTA蛋白结合，然后结合TRE启动子，可以诱导NIK高表达。这种方法优点是可以在任何年龄诱导NIK高表达，也可以通过Dox的剂量控制NIK的高表达水平。

[方法和结果见图1至图5]

[结果]：三种策略均可构建β-NIK-OE小鼠，其中第一种策略构建的β-NIK-OE小鼠胰岛中NIK表达量增加了10倍。

以下实施例，以第一种策略构建的β-NIK-OE小鼠进行糖尿病相关表型检测。

实施例2：β-NIK-OE对雄性小鼠血糖的影响。

正常饲料(大小鼠维持饲料MD17121，江苏美迪森)饲养实施例1中获得的β-NIK-OE雄鼠和对照小鼠(β-NIK-OE雄鼠9只，对照雄性小鼠11只，P<0.01)，每周检测一次血糖(非饥饿状态，早上8：00-9：00)。

[材料与方法]：

β-NIK-OE(基因型：ROSA26Stop^FLNIK^+/+RIP-Cre^+/-)雄鼠和对照小鼠(基因型：ROSA26Stop^FLNIK^+/+)

血糖仪(ONETOUCH UltraEasy，强生)和血糖试纸(ONETOUCH Ultra稳豪型,强生)

[结果见图6]

[结果]：与对照小鼠相比，所有β-NIK-OE雄性小鼠从5周龄开始血糖开始升高，8周龄血糖到14mM，9周龄到18周龄，血糖维持在20mM左右。

实施例3：β-NIK-OE对雌性小鼠血糖的影响。

正常饲料(大小鼠维持饲料MD17121，江苏美迪森)饲养β-NIK-OE雌鼠和对照小鼠，每周检测一次血糖(非饥饿状态早上8：00-9：00)。

[材料与方法]：

β-NIK-OE(基因型：ROSA26Stop^FLNIK^+/+RIP-Cre^+/-)雌鼠和对照雌性小鼠(基因型：ROSA26Stop^FLNIK^+/+)

血糖仪(ONETOUCH UltraEasy，强生)和血糖试纸(ONETOUCH Ultra稳豪型,强生)

[结果见图7]

[结果]：与对照小鼠相比，β-NIK-OE雌鼠血糖略高于对照雌鼠，并没有到达14mM，β-NIK-OE雌鼠不能出现非肥胖糖尿病。

本发明人有数据显示雌激素对于NIK过表达发展糖尿病有抑制作用，通过去除雌激素(如通过摘除卵巢)或抑制雌激素作用仍然可以在β-NIK-OE雌鼠中发展非肥胖糖尿病(数据未显示)，建立β-NIK-OE雌鼠非肥胖糖尿病模型。

实施例4：β-NIK-OE对雄性小鼠体重的影响。

按照实施例2的方法，正常饲料饲养β-NIK-OE雄鼠和对照雄性小鼠，每周检测一次血糖和体重。

[材料与方法]：

β-NIK-OE雄鼠和对照雄性小鼠

天平

[结果见图8]

[结果]：β-NIK-OE雄鼠跟对照雄性小鼠比无明显差异，但是从11周开始降低。

实施例5：β-NIK-OE对雄性小鼠非肥胖糖尿病发病率的影响。

按照实施例2的方法，正常饲料饲养β-NIK-OE雄鼠和对照雄性小鼠，每周检测一次血糖，以连续2次检测血糖达到14mM为标准，统计糖尿病发病率。

[材料与方法]：

β-NIK-OE(基因型：ROSA26Stop^FLNIK^+/+RIP-Cre^+/-)雄鼠和对照雄性小鼠(基因型：ROSA26Stop^FLNIK^+/+)

血糖仪和血糖试纸

[结果见图9]

[结果]：β-NIK-OE雄鼠10周以及10周以后的非肥胖糖尿病发病率为100％。

实施例6：β-NIK-OE对雄性小鼠糖耐量的影响。

按照实施例2的方法，正常饲料饲养β-NIK-OE雄鼠和对照雄性小鼠在8周龄检测葡萄糖耐受实验(GTT)，以1g/kg注射葡萄糖，在0,15,30,60,120min测血糖。

[材料与方法]：

β-NIK-OE(基因型：ROSA26Stop^FLNIK^+/+RIP-Cre^+/-)雄鼠和对照雄性小鼠(基因型：ROSA26Stop^FLNIK^+/+)

血糖仪和血糖试纸

[结果见图10]

[结果]：β-NIK-OE雄性小鼠8周葡萄糖耐受水平显著降低。

实施例7：β-NIK-OE对雄性小鼠胰岛素耐受水平的影响。

按照实施例2的方法，正常饲料饲养β-NIK-OE雄鼠和对照雄性小鼠在8周龄检测胰岛素耐受实验(ITT)，以0.75U/kg注射胰岛素(优泌林重组人胰岛素100U/ml礼来)，在0,15,30,60min测血糖。

[材料与方法]：

β-NIK-OE(基因型：ROSA26Stop^FLNIK^+/+RIP-Cre^+/-)雄鼠和对照雄性小鼠(基因型：ROSA26Stop^FLNIK^+/+)

血糖仪和血糖试纸

[结果见图11]

[结果]：β-NIK-OE雄鼠血清胰岛素耐受水平没有明显变化。

实施例8：β-NIK-OE对雄性小鼠血清胰岛素水平的影响。

按照实施例2的方法，正常饲料饲养β-NIK-OE雄鼠和对照雄性小鼠，收集18周龄血清，ELISA检测血清胰岛素水平。

[材料与方法]：

β-NIK-OE(基因型：ROSA26Stop^FLNIK^+/+RIP-Cre^+/-)雄鼠和对照雄性小鼠(基因型：ROSA26Stop^FLNIK^+/+)

Insulin ELISA试剂盒(Millipore Corporation EZRMI-13K)

严格按照试剂盒说明书所列方法进行检测，在检测之前先将所有试剂恢复室温

稀释Wash Buffer：将一瓶50mL的10×Wash Buffer加入至450mL去离子水中混匀；

取出所需数量的酶标板条安装至检测板上，其余板条放回原包装并保存于4℃冰箱。用排枪向每孔加入300μL Wash Buffer洗涤，倒扣甩去，在层叠的纸巾上用力拍打几次，重复洗涤3次。在进行下一步操作之前避免晾干；

向调零孔及样品孔加入10μL Assay Buffer；

如果样品是血清，向调零孔、标准孔、对照孔及样品孔加入10μL MatrixSolution，如果无血清成分则用Assay Buffer代替；

按浓度由低到高的顺序向相应的标准孔中加入10μL Standard Insulin；

向相应的对照孔中分别加入QC1和QC2溶液10μL；

向相应的样品孔中依次加入样品10μL；

向所有孔中加入80μL Detection Antibody。用封板膜封板，放于水平摇床上以400～500rpm的转速室温孵育2h；

撕去封板膜，甩去孔内液体，并在纸巾上拍干；

每孔用300μL Wash Buffer洗板3次，方法同步骤(2)；

向所有孔中加入100μL Enzyme Solution，盖上封板膜，以适当转速室温孵育30min；

撕去封板膜，甩去孔内液体，并在纸巾上拍干；

每孔用300μL Wash Buffer洗板6次，方法同步骤(2)；

向每孔中加入100μL Substrate Solution，封板，室温摇床孵育5～20min；

待标准孔变蓝，并呈浓度依赖性变化时，终止反应。向每孔中加入100μL StopSolution，用手轻拍板边，确保孔内液体完全混匀，此时蓝色应该完全全变成黄色。5min之内测定OD 450和OD 590；

以Insulin Standard浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线并求得公式。将样品OD值带入标准曲线公式，计算样品中胰岛素浓度。

[结果见图12]

[结果]：β-NIK-OE雄性小鼠血清胰岛素显著降低。

实施例9：β-NIK-OE对雄性小鼠胰腺胰岛素总量的影响。

按照实施例2的方法，正常饲料饲养β-NIK-OE雄鼠和对照雄性小鼠，收集18周龄胰腺，检测胰腺胰岛素总量。

[材料与方法]：

β-NIK-OE(基因型：ROSA26Stop^FLNIK^+/+RIP-Cre^+/-)雄鼠和对照雄性小鼠(基因型：ROSA26Stop^FLNIK^+/+)

Insulin ELISA试剂盒(Millipore Corporation EZRMI-13K)

小鼠胰腺在乙醇盐酸溶液中匀浆，使胰岛中的胰岛素游离出来，根据ELISA试剂盒说明书检测胰岛素浓度，BCA法检测蛋白浓度，详细步骤参考已发表的论文(LiX.et.al.Theranostics 2018；8(21):5960-5971.)。胰岛素检测方法见实施例7。

[结果见图13]

[结果]：β-NIK-OE小鼠胰腺胰岛素显著降低。

实施例10：β-NIK-OE对雄性小鼠胰腺胰岛大小和形态的影响。

按照实施例2的方法，正常饲料饲养β-NIK-OE雄鼠和对照雄性小鼠，收集18周龄胰腺，冰冻切片，免疫荧光做胰岛素和胰高血糖素染色。

[材料与方法]：

β-NIK-OE(基因型：ROSA26Stop^FLNIK^+/+RIP-Cre^+/-)雄鼠和对照雄性小鼠(基因型：ROSA26Stop^FLNIK^+/+)

抗小鼠胰岛素抗体(A0564,Dako,1:1000dilution)

抗小鼠胰高血糖素抗体(G2654,Sigma,1:1000dilution)

荧光标记二抗(中杉金桥,1:1000dilution)

冰冻切片机(Leica CM 1950)切片

研究级倒置荧光显微镜成像仪(IX71+DP74，Olympus)拍照

1)切片

胰腺在4％多聚甲醛固定3h后，放于30％蔗糖溶液脱水过夜。包埋，切片(10μm)，室温晾干后放于-80℃冰箱保存待用；

2)封闭及一抗

从-80摄氏度冰箱取出切片，室温晾干2h，用PBS洗涤5min。再以0.5％Triton X-100/0.05％SDS(在PBS中)的透化液室温孵育20min，PBS洗涤3min。甩去玻片上的PBS，室温稍加晾干，用免疫组化笔在组织切片周围画出完整的圆圈并放置于湿盒中，向圆圈内滴加适量封闭液(含有5％山羊血清和1％BSA的PBS溶液)，以覆盖组织切片为宜(如20μL)，室温孵育3h。封闭结束后，甩去封闭液并放回湿盒，用封闭液按一定比例稀释一抗后，滴加到圆圈内的组织切片上，50μL/样品，4℃孵育过夜。

3)二抗及拍照

甩掉一抗，于PBST中洗涤2次，每次5min，PBS洗涤1次，5min，甩掉PBS，室温稍加晾干(<5min)，用封闭液按一定比例稀释二抗后，滴加到样品上，50μL/样品，放于湿盒中室温孵育2h(若以DAPI染细胞核，可与二抗共同孵育，也可在二抗结束后单独孵育10min)。分别用PBST，PBS避光各洗涤两次，5min/次。甩去玻片上的液体，并用滤纸尽量吸干，此过程要快，放置样品晾干。向每个样品上滴加少量的防荧光猝灭剂，盖上盖玻片，挤出多余的液体，并用纸巾擦干，沿盖玻片四周涂抹少量的指甲油封片，避光放置10min晾干。立即拍照或避光保存在4℃。拍照过程中，相同滤光片各组间使用相同曝光时间。

[结果见图14]

[结果]：β-NIK-OE雄性小鼠胰岛大小显著降低，丧失正常胰岛形状。

实施例11：β-NIK-OE对雄性小鼠胰腺胰岛β细胞数量的影响。

按照实施例2的方法，正常饲料饲养β-NIK-OE雄鼠和对照雄性小鼠，收集18周龄胰腺，冰冻切片，免疫荧光做胰岛素染色，Image J统计胰岛素阳性区域面积。

[材料与方法]：详见实施例10

[结果如图15]

[结果]：β-NIK-OE雄性小鼠胰岛β细胞数量显著降低，胰岛素阳性区域面积显著降低。

实施例12：β-NIK-OE对雄性小鼠胰腺胰岛α细胞相对数量的影响。

按照实施例2的方法，正常饲料饲养β-NIK-OE雄鼠和对照雄性小鼠，收集18周龄胰腺，冰冻切片，免疫荧光做胰岛素和胰高血糖素染色，Image J统计胰高血糖素阳性区域面积和胰岛面积，计算胰高血糖素占胰岛的相对面积。

[材料与方法]：详见实施例10

[结果见图16]

[结果]：β-NIK-OE雄性小鼠胰岛中α细胞占胰岛的相对面积显著升高。

实施例13：β-NIK-OE对雄性小鼠胰岛炎的影响。

按照实施例2的方法，正常饲料饲养β-NIK-OE雄鼠和对照雄性小鼠，收集8周龄胰腺，冰冻切片，免疫荧光做胰岛素和巨噬细胞标志物F4/80染色。

[材料与方法]：详见实施例10

[结果见图17]

[结果]：在荧光显微镜下观察发现，发现β-NIK-OE雄性小鼠胰岛中存在巨噬细胞和胰岛炎。

实施例14：β-NIK-OE对雄性小鼠胰岛T细胞浸润的影响。

按照实施例13的方法，正常饲料饲养β-NIK-OE雄鼠和对照雄性小鼠，收集8周龄胰腺，冰冻切片，免疫荧光做胰岛素和T细胞标志物CD3e染色。

[材料与方法]：详见实施例10

[结果见图18]

[结果]：在荧光显微镜下观察发现，发现β-NIK-OE雄性小鼠胰岛中存在CD3e阳性T细胞，这说明β-NIK-OE雄鼠胰岛中存在T细胞浸润。

实施例15：荧光定量PCR检测β-NIK-OE对雄性小鼠胰岛基因表达的影响。

[材料与方法]：

按照实施例2的方法，正常饲料饲养β-NIK-OE(基因型：ROSA26Stop^FLNIK^+/+RIP-Cre^+/-)雄鼠和对照雄性小鼠(基因型：ROSA26Stop^FLNIK^+/+)，分离收集8周龄小鼠胰岛，2只对照小鼠胰岛合在一起作为一个样品，4只β-NIK-OE小鼠胰岛合在一起作为一个样品，提取RNA，做RT-qPCR，检测胰岛素分泌和炎症相关基因的表达，详细方法参考已发表的论文(LiX.et.al.Theranostics 2018；8(21):5960-5971.)。具体方法如下：

1)提取组织RNA：

取约120个胰岛，加入0.5mL Tripure(Roche)，1ml枪头吹打10次，室温静置2min。加入100μL三氯甲烷，Vortex 15s，室温静置2min。以12000rpm 4摄氏度离心10min，上清转移至新的EP管中，要避免吸到中间层的白色沉淀。向EP管中加入相同体积的异丙醇，充分混匀后，室温静置10min。12000rpm 4摄氏度离心10min，此时EP管管底应有一小块白色沉淀为RNA。将上层液体倒掉，加入1mL 75％乙醇(DEPC水配制)，上下颠倒数次，洗涤沉淀，12000rpm 4摄氏度离心5min，倒掉上层液体，并在室温将残余液体晾干。向EP管中加入10μLDEPC水，Vortex使全部沉淀溶解。

2)反转录

取全部RNA，1μL Random Primer(Promega)，加DEPC水至14.5μL，70摄氏度孵育10min(PCR仪)，立即冰浴5min。加入14.5μL反转录Mix液，42摄氏度孵育1h，99摄氏度孵育5min(PCR仪)。反转结束后，加入30μL DEPC水(总体积为59μL)。取1μL作为模板做PCR。剩余cDNA可长期保存在-20摄氏度冰箱。

RNA反转录体系

3)qPCR

所有PCR引物的退火温度均设计为60摄氏度，以便不同基因能够一起扩增。PCR反应体系均为10μL，反应体系如下表：

qPCR反应体系(10μL)

引物序列：

Glut2-F:CGGAACCTTGGCTTTCACTGTCTT；

Glut2-R:GGTGCATTGATCACACCGATGTCA.

GCK-F:AAGCCGCAGTGAGGACGTGATG；

GCK-R:AGGTGATTTCGCAGTTGGGTGTCA.

Hnf1a-F:GGAAGACTTCGCGCCACCCATTCT；

Hnf1a-R:AGTGACTCCACCACGGCTTTCTGG.

Hnf4a–F:GCCCTCTCACCTCAGCAATGGACA；

Hnf4a–R:TGACGATGGTGGTGATGGCTCCTG.

Pdx1-F:CCGAATGGAACCGAGACTGG；

Pdx1-R:TGTAGGCTGTACGGGTCCTC.

Insulin1-F:GTCTGAAGGTCCCCGGGGCT；

Insulin1-R:TCAGAGACCATCAGCAAGCAG.

Hnf1b-F:CGGATCTCGACACCAAGCCGGTTT；

Hnf1b-R:TGTCATAGTCGTCGCCGTCCTCTG.

Neurod1-F:TGTCCCGAGGCTCCAGGGTTATGA；

Neurod1-R:GCCCGCTCTCGCTGTATGATTTGG.

IFNγ-F:GCTACACACTGCATCTTGGC；

IFNγ-R:CATGTCACCATCCTTTTGCCAG.

TNFa-F:CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA；

TNFa-R:TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC.

CD19-F:AGGCAATGTTGTGCTGCCA；

CD19-R:AATCACTAGCAAGATGCCCAGG.

CD3e-F:AGGTGGACCTGACAGCAGTA；

CD3e-R:GGCTCATAGTCTGGGTTGGG.

[结果见图19]

[结果]：β-NIK-OE雄性小鼠胰岛胰岛素分泌相关基因显著下调，炎症相关基因显著升高。

本领域技术人员应该理解，尽管参照上述实施例对本发明进行了具体的描述，但是本发明并不限于这些具体的实施例。基于本发明所教导的方法和技术方案，在不背离本发明的精神的前提下，本领域技术人员能够进行适当的修改或改进，由此所得的等价实施方案都在本发明的范围内。

序列表

<110> 哈尔滨工业大学

<120> 非肥胖性糖尿病动物模型、构建方法及其应用

<130> 20190427

<160> 37

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> ROSA26StopFLNIK -F

<400> 1

tcccaaagtc gctctgagt 19

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> ROSA26StopFLNIK -R

<400> 2

tgagcatgtc tttaatctac c 21

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> Cre-F

<400> 3

gcataaccag tgaaacagca ttgctg 26

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> Cre-R

<400> 4

ggacatgttc agggatcgcc aggcg 25

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> NIK-qF

<400> 5

tctctggagg aacaggaaca a 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> NIK-qR

<400> 6

gccattgaga gactggatct g 21

<210> 7

<211> 2829

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 7

atggccgtga tggaagtggc ctgcccgggc actcctgggt cagcagtcgg gcagcagaag 60

gagcttgcca aagccaagga gaagacacag tcactgggga agaagcagag ctgcatcttc 120

aagcttgagg ccgtggagaa gagccccgtg ttctgtggga agtgggagat cctaaacgac 180

gtgatcacca aaggcacagc caaggacggc tctgagggag gaccaccggc catctccatc 240

atcgcccagg ctgaatgtga gaatagccaa gagttcagcc ccaccttctc agagcgcatt 300

ttcatcgcgg ggtcacagca gtacagccag tctgagagtc tcgatcaaat ccccaacaat 360

gtggcccatg caactgaagg caaaatggcc cgtgtgtgcc ggaggggaaa acgtcacggc 420

aaagcccgaa aaaaacgtag gaagaagagg tcgaagtcac tggcccaggc aggagtggcc 480

ttagccaagc ccctgcccag aacccctgag caagagagct gtaccatccc agtacaggaa 540

gatgagtctc cactaggcaa cctctatgcc agaaatgtct cccagttcac caagcctctg 600

gggggaccag gccttggcca cctgtgcttt aagaaacaag atgaaggcct gcgaccggta 660

ctgcctcgac cagaactcca caaactgatc agccccttgc aatgtctaaa ccacgtgtgg 720

aaactccacc acccccaggc cacaggcccc cggccccacc cgactcaccc cttcccctac 780

agcggaatgc cccatccttt cccattctac cccctggagc cctggaaacc ctatatgctg 840

gactctgccg tcctggacaa actagccggt gtcagcggcc agcggcctct gcctggccca 900

ccgcatctaa gccaactggc ccatggagac agtcagaagc cgctgcctgg cccacacctg 960

gagtccagct gcccgtctcg gggtgcccta gaaaaggttc ccgtggagga atacctggtg 1020

catgcgctcc aaggaagtgt gagctcaggc caggcccaca gcctggccag cctggctaag 1080

acatggtcct cgggaagcgc caagctgcag aggctcggcc ccgaaactga ggacaacgag 1140

ggggtcctgc ttactgagaa actcaagcca gtggattatg agtatcgaga agaggtccac 1200

tggatgacac accagcctcg ggtgggcaga ggctccttcg gcgaggtcca cagaatgaag 1260

gacaagcaga caggcttcca gtgtgctgtc aaaaaggtac gactcgaggt gtttcgggta 1320

gaggaactag tggcctgtgc tggtctgagc tcgcccagaa tcgtccctct ctatggagct 1380

gtgagagaag gcccgtgggt gaacatcttc atggaactgc tagaaggtgg ctcgctgggt 1440

cagctcataa agcaaatggg ctgtctgcca gaagaccgag ccctttacta cctgggccag 1500

gccctggagg ggctggagta cctccacaca cgcaggattc tgcatggcga tgtcaaagct 1560

gacaacgtgc tcctgtccag tgatggaagc cgagcggccc tctgcgactt tggccacgcc 1620

ttgtgcctgc aacctgacgg cctagggaaa tccttgctca caggggacta cattcctggc 1680

acggagaccc acatggcacc agaagtggtg atgggaaagc cctgcgatgc caaggtggac 1740

atctggagca gctgctgcat gatgctccac atgctcaacg gctgccaccc ctggactcag 1800

tacttccgag gcccgctttg tctcaagatt gccagcgagc ctccaccgat cagggagatc 1860

ccaccttcct gcgcacccct cacagcccag gccatccaag aggggctgag gaaagagccc 1920

gtccaccgag catctgccat ggagcttcgg aggaaagtgg gcaaggcact acaggaagtg 1980

ggaggtctga aaagcccttg gaaaggagaa tataaagaac caagacctcc accccaagac 2040

caagccacct gccaccagac cctacctact ccgccgagag agaacccacc agccaaggcc 2100

aacacagacg gggctcctga gcctcagcct cctctaccgc cagaaccacc agaaccgagc 2160

aaagcgccag ccctgaacct gagcaaggag gagtctggca catgggaacc cctgcctctg 2220

tcctccctgg acccagccac tgccaaaggc cccagcttcc cagaccggag ggcaaccttg 2280

ccagagctgg agctacagca actggagata gaactgtttc tcaacagcct gtcccagccg 2340

ttctctctgg aggaacagga acaaatcctc tcctgcctca gcatcgacag cctctcgctg 2400

tcagatgaca gtgaaaagaa tccatcgaag gcctctcaga gctcacggga caccctgagt 2460

tctggcgtgc actcttggaa cagccaagct gaggcaagaa cctgcagctg cagcacggcg 2520

ctggcccggg ggcggcctac tgacatcccg agctacttca acggggtcaa ggtccagatc 2580

cagtctctca atggcgaaca cctgcatatc cgggaattcc accgcgtcaa ggtgggagac 2640

attgccaccg gcatcagcag ccagatccca gccacagctt tcagcctggt gaccaaagat 2700

ggacagcctg tttgctatga catggaggtg ccagactcgg gcatcgacct gcagtgcacc 2760

ctggcccctg atggcagctt tgcttggacc tggagggtca agcatggtca gctggagaac 2820

cgaccctag 2829

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> Rosa26-p5-F1

<400> 8

cctagatgct ctagacctgg tccac 25

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> Rosa26-p5-R1

<400> 9

tcccttatta tgcctccagt aggc 24

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> Rosa26-p3-F1

<400> 10

cagaagatgc cagccatctg g 21

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> Rosa26-p3-R1

<400> 11

gcatcaggat aaagttcttg ctcatc 26

<210> 12

<211> 398

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> P5-1

<400> 12

cctagatgct ctagacctgg tccactaagg aggcaactta catttataag gacagggaac 60

atggaactca ctttaatcca tacaaagctt tggggcctcc ccactcctca gaagatagga 120

taggttcttt ctgatttcta gaccgtatga aatttgggtt ttaaaagtat gtgcttgaca 180

taaattaaag gcgtaagtga aaactaaaaa cagtttcttt aattgtaaac caaagtgaat 240

actctcctag ggggaaaaaa aaatctcttt ccttccctac ctccggcccc tcccccacca 300

acactgcctc cctgctgtgc aaagagccct ttgtcctgcc ccgcacttat ctagctgttt 360

ggccatattg acaggcctac tggaggcata ataaggga 398

<210> 13

<211> 417

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> P3-1

<400> 13

cagaagatgc cagccatctg ggccttttaa cccagaaatt tagtttcaaa ctcctaggtt 60

agtgttctca ctgagctaca tcctgatcta gtcctgaaaa taggaccacc atcaccccca 120

aaaaaatctc aaataagatt tatgctagtg tttcaaaatt ttaggaatag gtaagattag 180

aaagttttaa attttgagaa atggcttctc tagaaagatg tacatagtga acactgaatg 240

gctcctaaag agcctagaaa actggtactg agcacacagg actgagaggt ctttcttgaa 300

aagcatgtat tgctttacgt gggtcacaga aggcaggcag gaagaacttg ggctgaaact 360

ggtgtcttaa gtggctaaca tcttcacaac tgatgagcaa gaactttatc ctgatgc 417

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> Glut2-F

<400> 14

cggaaccttg gctttcactg tctt 24

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> Glut2-R

<400> 15

ggtgcattga tcacaccgat gtca 24

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> GCK-F

<400> 16

aagccgcagt gaggacgtga tg 22

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> GCK-R

<400> 17

aggtgatttc gcagttgggt gtca 24

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> Hnf1a-F

<400> 18

ggaagacttc gcgccaccca ttct 24

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> Hnf1a-R

<400> 19

agtgactcca ccacggcttt ctgg 24

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> Hnf4a -F

<400> 20

gccctctcac ctcagcaatg gaca 24

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> Hnf4a -R

<400> 21

tgacgatggt ggtgatggct cctg 24

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> Pdx1-F

<400> 22

ccgaatggaa ccgagactgg 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> Pdx1-R

<400> 23

tgtaggctgt acgggtcctc 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> Insulin1-F

<400> 24

gtctgaaggt ccccggggct 20

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> Insulin1-R

<400> 25

tcagagacca tcagcaagca g 21

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> Hnf1b-F

<400> 26

cggatctcga caccaagccg gttt 24

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> Hnf1b-R

<400> 27

tgtcatagtc gtcgccgtcc tctg 24

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> Neurod1-F

<400> 28

tgtcccgagg ctccagggtt atga 24

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> Neurod1-R

<400> 29

gcccgctctc gctgtatgat ttgg 24

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> IFNγ-F

<400> 30

gctacacact gcatcttggc 20

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> IFNγ-R

<400> 31

catgtcacca tccttttgcc ag 22

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> TNFa-F

<400> 32

catcttctca aaattcgagt gacaa 25

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> TNFa-R

<400> 33

tgggagtaga caaggtacaa ccc 23

<210> 34

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> CD19-F

<400> 34

aggcaatgtt gtgctgcca 19

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> CD19-R

<400> 35

aatcactagc aagatgccca gg 22

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> CD3e-F

<400> 36

aggtggacct gacagcagta 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> CD3e-R

<400> 37

ggctcatagt ctgggttggg 20

Claims (10)

1.一种产生非肥胖性糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病)的动物模型的方法，所述方法包括在动物的胰岛β细胞中过表达NIK基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述动物是哺乳动物，优选反刍动物、犬科动物、兔科、猫科或啮齿科，更优选鼠、猪、猴、熊、绵羊、山羊、马、驴、兔、猫、牛、狐狸或狗，最优选小鼠或大鼠。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述动物是雄性或雌性动物，优选雄性动物。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述动物是小鼠、大鼠或豚鼠，更优选C57小鼠、Wistar大鼠或SD大鼠，最优选C57BL/6J小鼠。

5.根据权利要求1所述的方法，其中在所述动物的胰岛β细胞中NIK基因的表达水平(mRNA水平)是对照动物的2倍以上，优选3倍以上，更优选4倍以上，最优选10倍以上。

6.根据权利要求4所述的方法，其中通过如下方式在小鼠的胰岛β细胞中过表达NIK基因：

将NIK基因通过同源重组的方式整合到小鼠染色体(如六号染色体ROSA26)位点，所述NIK基因处于胰岛β细胞特异性启动子(如RIP)的控制之下以在胰岛β细胞中表达，和/或利用TRE启动子/rtTA蛋白诱导调控表达系统(可用四环素类似物多西环素(Doxcycline，简称Dox)诱导)来控制所述NIK基因的表达，

优选地通过如下方式在小鼠的胰岛β细胞中过表达NIK基因：

1)将ROSA26Stop^FLNIK小鼠和RIP-Cre小鼠杂交，得到ROSA26Stop^FLNIK^+/+RIP-Cre^+/-小鼠，即为β-NIK-OE小鼠；

2)构建Rosa26-pTRE(3G)-LSL-NIK-3×Flag-CAG-rTTA(3G)Cas9-KI小鼠，然后使其跟RIP-Cre小鼠杂交，经过传代和纯合子筛选，得到STOP-NIK^+/+RIP-Cre^+/-小鼠，即β-NIK-OE小鼠；或

3)RIP启动子过表达NIK转基因小鼠。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，所述方法还包括以下步骤中的一个或多个：

1)测量所述动物的血糖水平；

2)测量所述动物的胰岛素水平；

3)测量所述动物的胰岛β细胞的数量；

4)确定所述动物是否出现免疫细胞浸润；和/或

5)确定所述动物是否具有糖尿病并发症。

8.通过权利要求1-7中任一项所述的方法产生的非肥胖性糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病)的动物模型。

9.一种鉴别和/或测试用于治疗非肥胖性糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病)和/或其并发症的化合物的方法，包括向由权利要求1至7中任一项所述的方法产生的动物模型给予目的化合物和确定糖尿病和/或至少一种其并发症是否由所述化合物逆转的步骤。

10.根据权利要求8所述的动物模型用于鉴别和/或测试治疗非肥胖性糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病)和/或治疗与非肥胖性糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病)相关的并发症的化合物的用途。